DD295553A5 - VACCINE AGAINST LYME DISEASE - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen passiven Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, der einen oder mehreren fuer das 31 kD Antigen (OspA) oder/und das 34 kD Antigen (OspB) von B. burgdorferi spezifische monoklonale Antikoerper enthaelt und in immundefizienten Versuchstieren, die mit lebensfaehigen pathogenen B. burgdorferi Organismen infiziert wurden, die Ausbildung von Arthritis, Pancarditis und Hepatitis verhindert. Die Erfindung betrifft weiterhin auch ein Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemaeszen Impfstoffs, die Hybridoma-Zellinien ECACC 89 09 1302, ECACC 90050405, ECACC 90050406 und ECACC 90050407, welche erfindungsgemaesze Antikoerper sekretieren und den pathogenen B. burgdorferi Stamm ZS 7 (DSM 5527). Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Antigen aus B. burgdorferi, das mit einem erfindungsgemaeszen Antikoerper immunreagiert, ein Verfahren zur Gewinnung von erfindungsgemaeszen Antigenen sowie aktiven Impfstoffen gegen die Lyme-Krankheit, die ein erfindungsgemaeszes Antigen als wesentlichen Bestandteil enthalten. Die Erfindung betrifft schlieszlich ein Verfahren zur Isolierung und Rekultivierung von pathogenen B. burgdorferi Organismen aus immundefizienten Versuchstieren.{passiver Impfstoff; Lyme-Krankheit; monoklonale Anti-Koerper; Antigene; B. burgdorferi; Arthritis; Pancarditis; Hepatitis}The invention relates to a passive vaccine against Lyme disease which contains one or more monoclonal antibodies specific for the 31 kD antigen (OspA) or / and the 34 kD antigen (OspB) of B. burgdorferi and in immunodeficient experimental animals bearing viable pathogenic B. burgdorferi organisms were infected, preventing the formation of arthritis, pancarditis and hepatitis. The invention also relates to a method for obtaining the inventive vaccine, the hybridoma cell lines ECACC 89 09 1302, ECACC 90050405, ECACC 90050406 and ECACC 90050407, which secrete antibodies according to the invention and the pathogenic B. burgdorferi strain ZS 7 (DSM 5527). Likewise provided by the invention is an antigen from B. burgdorferi which is immunoreactive with an inventive antibody, a process for the production of novel antigens and active vaccines against Lyme disease which contain an inventive antigen as an essential component. The invention finally relates to a process for the isolation and recultivation of pathogenic B. burgdorferi organisms from immunodeficient experimental animals. {Passive vaccine; Lyme disease; monoclonal anti-bodies; Antigens; B. burgdorferi; Arthritis; pancarditis; Hepatitis}

Description

Hierzu 2 Seiten ZeichnungenFor this 2 pages drawings

PatentbeschreibungPatent Description

Die Lyme-Borreliose ist die häufigste, von Zwecken übertragene Infektionskrankheit in den gemäßigten Breiten. Sie wird durch die Spirochäte Borrelia burgdorferi hervorgerufen, die vor allem durch Zecken des Stamms Ixodes auf den Menschen übertragen wird. Die Krankheit ist eine chronische progressive Infektion, die viele Organe, wie die Haut, das zentrale und periphere Nervensystem, das Herz, die Leber, die Niere und das musculoskeletale System befällt. Da eine zuverlässige Behandlung dieser Krankheit durch Therapie mit Antibiotika schwierig ist, werden gegenwärtig große Anstrengungen unternommen, den Erreger selbst und die Immunantwort des Wirts auf Infektion mit B. burgdorferi zu erforschen. Bei von der Lyme-Krankheit betroffenen Personen wird zwar ein hoher Titer an Antikörpern gegen B. burgdorferi festgestellt, der aber keinen Schutz gegen die Infektion bewirkt. Es wird angenommen, daß der Erreger sehr rasch aus der Blutbahn in das Gewebe übertritt und dort für das Immunsystem nicht mehr unmittelbar erreichbar ist. Dies würde bedeuten, daß ein Schutz durch Antikörper nur unmittelbar nach Beginn der Infektion, solange also die Erreger sich noch in der Blutbahn befinden, möglich ist.Lyme disease is the most common infectious disease transmitted in the temperate latitudes. It is caused by the spirochete Borrelia burgdorferi, which is mainly transmitted to humans by ticks of the strain Ixodes. The disease is a chronic progressive infection that affects many organs, such as the skin, the central and peripheral nervous system, the heart, the liver, the kidney, and the musculoskeletal system. Because reliable treatment of this disease by therapy with antibiotics is difficult, great efforts are currently being made to explore the agent itself and the host's immune response to infection with B. burgdorferi. Although a high titer of antibodies to B. burgdorferi is found in individuals affected by Lyme disease, it does not provide protection against the infection. It is assumed that the pathogen very quickly passes from the bloodstream into the tissue and there is no longer directly accessible to the immune system. This would mean that protection by antibodies is only possible immediately after the beginning of the infection, so long as the pathogens are still in the bloodstream.

Die Tatsache, daß eine natürliche Infektion mit B. burgdorferi in verschiedenen Tierarten gefunden wurde, hat zum Versuch geführt, Labormodelle für die Lyme-Krankheit zu etablieren. Dies gelang auch mit begrenztem Erfolg. So wurde bei Experimenten, welche die Induzierung einer für B. burgdorferi spezifischen Immunantwort in der Maus zum Ziel hatten, gefunden, daß die Infektion von Inzucht-Mausstämmen mit einem schon lange Zeit kultivierten B. burgdorferi-lsolat zu mäßigen, aber signifikanten pathomorphologischen Veränderungen in verschiedenen Organen wie dem Gehirn, dem Herz, den Lungen und den Nieren führte, die vergleichbar mit denjenigen waren, die bei Patienten mit Lyme-Krankheit zu beobachten sind (Schaible et al., [1988] Infect. Immun. 1,41). Die Ausbildung eines ernsteren Krankheitsbildes bei Tieren wurde vermutlich entweder durch die Immunabwehr des Wirts und/oder durch die reduzierte Virulenz von für einen längeren Zeitraum in vitro kultivierten Spirochäten (Johnson et al., [1984], J. Clin. Microbiol. 20,747; Schwan et al., [1988], Infect, and Immun.56,1837) verhindert.The fact that a natural infection with B. burgdorferi has been found in various animal species has led to an attempt to establish laboratory models for Lyme disease. This also succeeded with limited success. Thus, in experiments aimed at inducing a B. burgdorferi specific immune response in the mouse, it was found that the infection of inbred mouse strains was moderate with a long-time cultivated B. burgdorferi isolate, but significant pathomorphological changes in various organs, such as the brain, heart, lungs, and kidneys, which were comparable to those seen in patients with Lyme disease (Schaible et al., [1988] Infect. Immun., 1.41). The development of a more serious disease in animals was believed to be due either to the host immune deficiency and / or to the reduced virulence of spirochetes cultured in vitro for a prolonged period of time (Johnson et al., [1984] J. Clin. Microbiol 20,747; Schwan et al., [1988] Infect, and Immun.56, 1837).

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist es, einen wirksamen Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit bereitzustellen. Dazu ist jedoch zunächst die Entwicklung eines geeigneten tierischen Labormodells erforderlich. Es wird nun vorgeschlagen, daß ein Maus-Stamm ohne funktionsfähige T- und B-Zellen, die sogenannte Scid-Maus (Bosma et al., [1983] Nature 10, 52), als Versuchstier dienen kann, da Scid-Mäuse bei Infektion mit einem pathogenen B. burgdorferi-lsolat eine multisystemische Krankheit und zwar hauptsächlich Polyarthrithis und Carditis, entwickeln. Durch dieses Tiermodell wird es erst möglich, die Wirkung von Impfstoffengegen die Lyme-Krankheit zu erproben.The object underlying the invention is to provide an effective vaccine against Lyme disease. For this, however, first the development of a suitable animal laboratory model is required. It is now proposed that a mouse strain without functional T and B cells, the so-called scid mouse (Bosma et al., [1983] Nature 10, 52), can serve as an experimental animal, since scid mice are infected with a pathogenic B. burgdorferi isolate develop a multisystemic disease, mainly polyarthrithis and carditis. This animal model will make it possible to test the effects of vaccines against Lyme disease.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein passiver Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, der einen oder mehrere für das 31 kD Antigen (OspA) oder/und das 34 kD Antigen (OspB) von B. burgdorferi, insbesondere OspA oder/und OspB von B. burgdorferi der Stämme B31 (ATCC 35210) oder/und ZS7 (DSM 5527) spezifische monoklonale Antikörper enthält. Bevorzugt ist ein Impfstoff, dereinen erfindungsgemäßen Antikörper der Klasse IgG, besonders bevorzugt der Subklasse IgG 2 b oder IgGI, enthält. Die Verabreichung des erfindungsgemäßen Antikörpers bewirkt überraschenderweise im Gegensatz zur Verabreichung eines anderen Antikörpers, z. B. gegen das 41 kD Oberflächenantigen von B. burgdorferi (Flagellin) bei immundefizienten Versuchstieren, vorzugsweise Scid-Mäusen, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi, vorzugsweise B. burgdorferi ZS7 infiziert wurden, daß die Ausbildung von Arthritis, Carditis und Hepatitis vollständig oder zumindest weitgehend verhindert wird. Gegebenenfalls kann der erfindungsgemäße Impfstoff mit dem Antikörper als Wirkstoff auch noch übliche Träger-, Füll- und Hilfsstoffe enthalten.An object of the invention is a passive vaccine against Lyme disease, one or more of B. 31 kD antigen (OspA) or / and the 34 kD antigen (OspB) of B. burgdorferi, in particular OspA or / and OspB of B. burgdorferi of strains B31 (ATCC 35210) or / and ZS7 (DSM 5527) contains specific monoclonal antibodies. Preferred is a vaccine containing an antibody of the class IgG according to the invention, particularly preferably of the subclass IgG 2 b or IgGI. The administration of the antibody of the invention surprisingly causes unlike the administration of another antibody, for. B. against the 41 kD surface antigen of B. burgdorferi (flagellin) in immunodeficient experimental animals, preferably scid mice infected with viable pathogenic B. burgdorferi, preferably B. burgdorferi ZS7, that complete the formation of arthritis, carditis and hepatitis is at least largely prevented. Optionally, the vaccine according to the invention with the antibody as the active ingredient may also contain customary carriers, fillers and auxiliaries.

Weiterhin beinhaltet die Erfindung auch ein Verfahren zur Gewinnung eines passiven Impfstoffs gegen die Lyme-Krankheit aus Lymphozyten oder Milzzellen eines Versuchstieres, vorzugsweise einer Maus, die mit B. burgdorferi Organismen oder Teilen davon, vorzugsweise mit kompletten B. burgdorferi B31- oder/und ZS7-Organismen, immunisiert ist, wobei man aus demFurthermore, the invention also includes a method for obtaining a passive vaccine against Lyme disease from lymphocytes or spleen cells of an experimental animal, preferably a mouse, with B. burgdorferi organisms or parts thereof, preferably with complete B. burgdorferi B31 or / and ZS7 -Organisms, is immunized, taking one from the

Lymphozyten oder Milzzellen des immunisierten Tieres durch Zellfusion em Hybridom gewinnt, das einen erfindungsgemaßen monoklonalen Antikörper produziertLymphocytes or spleen cells of the immunized animal obtained by cell fusion em hybridoma producing a monoclonal antibody according to the invention

Ein Gegenstand der Erfindung ist also auch eine Hybridoma-Zellinie (ECACC 89091302), die einen erfindungsgemaßen Antikörper LA-2 gegen OspA (lgG2b) produziert Weiterhin ein Gegenstand der Erfindung ist auch die den Antikörper LA-26 1 gegen OspA (IgGD produzierende Hybridoma-Zellinie ECACC 90050406 sowie die Antikörper LA-25 1 bzw LA-27 1 gegen OspB (IgG 2 b bzw IgGD produzierenden Hybridoma-Zellinien ECACC 90050405 bzw ECACC 90050407 Ebenso beinhaltet die Erfindung den pathogenen B burgdorfen Stamm ZS7 (DSM 5527) Ein Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Antigen, das mit einem erfindungsgemaßen monoklonalen Antikörper immunreagiert Darunter ist ein Antigen zu verstehen, welches die gesamte Aminosäuresequenz von OspA bzw OspB oder auch nur eine immunogen wirkende Teilsequenz (immunogenes Epitop) von OspA bzw OspB enthalt Potentiell immunogene Epitope dieser Proteine kann ein Fachmann ohne Schwierigkeiten durch eine Strukturanalyse des OspA Protein (z B Chou-Fassmann Analyse) ermitteln und dann experimentell auf ihre Wirksamkeit testen Ein Gegenstand der Erfindung ist auch insbesondere ein rekombinantes Antigen, das mit dem erfindungsgemaßen Antikörper immunreagiert, wobei sich die fur das Antigen kodierende DNA Sequenz auf einem rekombinanten Vektor, vorzugsweise einem prokaryontischen Vektor befindet, der geeignet zur Proteinexpression istThe invention therefore also relates to a hybridoma cell line (ECACC 89091302) which produces an antibody LA-2 according to the invention against OspA (IgG2b). Furthermore, an object of the invention is also the antibody LA-26 1 to OspA (IgGD-producing hybridoma). Cell line ECACC 90050406 and the antibodies LA-25 1 and LA-27 1 against OspB (IgG 2 b or IgGD producing hybridoma cell lines ECACC 90050405 and ECACC 90050407 Similarly, the invention includes the pathogenic B-burgdorfen strain ZS7 (DSM 5527) An object of the invention is furthermore an antigen which is immunoreacted with a monoclonal antibody according to the invention. This is to be understood as meaning an antigen which contains the entire amino acid sequence of OspA or OspB or only an immunogenic partial sequence (immunogenic epitope) of OspA or OspB. Potentially immunogenic epitopes of these proteins can be Expert without difficulty by a structural analysis of the OspA protein (eg Chou-Fassmann analysis) A subject of the invention is also in particular a recombinant antigen which immunoreacts with the antibody according to the invention, whereby the DNA sequence coding for the antigen is on a recombinant vector, preferably a prokaryotic vector, suitable for protein expression is

Insbesondere ein Gegenstand der Erfindung ist ein Antigen aus B burgdorfen ZS 7, das spezifisch mit dem erfindungsgemaßen Antikörper immunreagiert und die in Abb 1 gezeigte Aminosäuresequenz oder ein immunogenes Epitop aus dieser Sequenz enthalt Demgemäß betrifft die Erfindung auch eine rekombinante DNA, welche (D die in Abb 1 gezeigte, (2) eine, ihr im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nuklemsauresequenz oder (3) eine mit einer Sequenz aus (D oder/undIn particular, an object of the invention is an antigen from B burgdorfen ZS 7, which specifically immunoreacts with the antibody according to the invention and contains the amino acid sequence shown in Figure 1 or an immunogenic epitope from this sequence Accordingly, the invention also relates to a recombinant DNA which (D in 1, (2) a nuclear nucleic acid sequence corresponding to the degeneracy of the genetic code, or (3) one having a sequence of (D and / or

(2) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz enthalt, die fur das 31 kD Antigen von B burgdorfen ZS7 oder ein immunogenes Epitop davon kodiert Der Begriff, stringente Hybridisierungsbedingungen" ist dabei wie in Mamatisetal, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, zu verstehen Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemaßes Antigen, das ein rekombinantes Nicht Fusionsprotein oder β Galactosidase-Fusionsprotein ist(2) contains a stringent hybridizing sequence encoding the 31 kD antigen of Burgdorfen ZS7 or an immunogenic epitope thereof. The term "stringent hybridization conditions" as used in Mamatisetal, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Particularly preferred is an antigen of the invention which is a recombinant non-fusion protein or β galactosidase fusion protein

Weiterhin beinhaltet die Erfindung auch einen rekombinanten Vektor, der eine oder mehrere Kopien einer erfindungsgemaßen rekombinanten DNA enthalt Dererfindungsgemaße Vektor kann ein prokaryontischer oder/und eukaryontischer Vektor sein, er ist vorzugsweise ein prokaryontischer Vektor Der rekombinante Vektor kann ι η der Wirtszelle extrachrom osomal vorliegen (ζ Β Plasmid) oder er kann sich auch in das Genom der Wirtszelle integrieren (z B Baktenophage Lambda) Vorzugsweise ist der erfindungsgemaße Vektor ein Plasmid Besonders bevorzugt ist der rekombinante Vektor pZS 7/31 2The invention also encompasses a recombinant vector which contains one or more copies of a recombinant DNA according to the invention. The vector according to the invention can be a prokaryotic or / and eukaryotic vector; it is preferably a prokaryotic vector. The recombinant vector can be extrachromic in the host cell (ζ Β plasmid) or it can also integrate into the genome of the host cell (for example, bacteriophage lambda). Preferably, the vector according to the invention is a plasmid. The recombinant vector pZS 7/31 2 is particularly preferred

Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Gewinnung von erfindungsgemaßen Antigenen durch Untersuchung einer B burgdorfen-Genbank mit einem oder mehreren erfindungsgemaßen Antikörpern, wobei man die Klone isoliert, welche mit den verwendeten Antikörpern eine positive Immunreaktion zeigenAn object of the invention is also a method for obtaining antigens according to the invention by examination of a B burgdorfen gene bank with one or more antibodies according to the invention, wherein the clones are isolated which show a positive immune reaction with the antibodies used

Da ein erfindungsgemaßes Antigen auch selbst zur aktiven Immunisierung, d h zur Induzierung der Antikorperbildung im Organismus, eingesetzt werden kann beinhaltet die Erfindung somit auch einen aktiven Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, der als Wirkstoff ein erfindungsgemaßes Antigen, gegebenenfalls mit üblichen Trager-, Full-und Hilfsstoffen, enthalt Eine bevorzugte Ausfuhrungsform ist, wenn man das erfindungsgemaße Antigen auf gentechnologische Weise gewinnt Es konnte in der Tat gezeigt werden, daß die Verabreichung von nativem bzw rekombinantem OspA in normalen Mausen die Bildung protektiver Antikörper induziert, die nach passivem Transfer in Seid Mausen diese gegen die Lyme-Borrehose schützen Insbesondere findet man, daß rekombinantes OspA eine mit nativem OspA vergleichbare protektive Immunantwort induziert und daher einen vielversprechenden Kandidaten fur eine Vakzine gegen die Lyme-Borreliose im Menschen darstellt Ein Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung eines passiven Impfstoffs gegen die Lyme Krankheit, wobei man Versuchstiere, vorzugsweise Mause, mit einem erfindungsgemaßen Antigen immunisiert und aus dem immunisierten Versuchstier auf übliche Weise protektive, polyklonale oder monoklonale Antikörper gewinnt Schließlich beinhaltet die Erfindung noch ein Verfahren zur Isolierung und Rekultivierung von pathogenen B burgdorfen Organismen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man aus immundefizienten Versuchstieren, vorzugsweise Mausen, die zuvor mit dem Erreger infiziert werden, den Erreger gewinnt, wobei die Pathogenitat des Erregers erhalten bleibt Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem man pathogene B burgdorferei ZS7 (DSM 5527)Organismen aus Blut oder/und Gelenken von infizierten Seid Mausen gewinntSince an antigen according to the invention can also be used for active immunization, ie for inducing the formation of antibodies in the organism, the invention thus also encompasses an active vaccine against Lyme disease, which as active ingredient is an antigen according to the invention, optionally with customary carrier, filling It has indeed been shown that the administration of native or recombinant OspA in normal mice induces the formation of protective antibodies after passive transfer in mouse mice In particular, it is found that recombinant OspA induces a protective immune response comparable to native OspA and therefore represents a promising candidate for a vaccine against Lyme disease in humans. The invention further provides a process in order to obtain a passive vaccine against Lyme disease, immunizing experimental animals, preferably mice, with an antigen according to the invention and obtaining protective, polyclonal or monoclonal antibodies from the immunized animal in a conventional manner. Finally, the invention also includes a process for the isolation and recultivation of pathogenic B burgdorfen organisms, which are characterized in that from immunodeficient animals, preferably mice, which are previously infected with the pathogen, the pathogen wins, the pathogenicity of the pathogen is maintained Particularly preferred is a method in which one pathogenic Bburgdorf ZS7 (DSM 5527) Organisms derived from blood and / or joints of infected mouse mice

Die Verdeutlichung der Erfindung erfolgt durch nachfolgende Beispiele und die Abbildungen 1 und 2 Es zeigenThe illustration of the invention is made by the following examples and Figures 1 and 2 show It

Abb 1 die DNA-und Aminosäuresequenz des 31 kD Antigens (OspA) aus B burgdorfen ZS 7, Abb 2 die immunologische Charakterisierung des rekombinanten Proteins rZS7/31 2Fig. 1 shows the DNA and amino acid sequence of the 31 kD antigen (OspA) from B burgdorfen ZS 7, Fig. 2 the immunological characterization of the recombinant protein rZS7 / 31 2

Beispiel 1example 1

Induzierung von Arthritis, Carditis und Hepatitis in Scid-Mausen durch Infektion mit B burgdorfen-Stamm ZS7Induction of arthritis, carditis and hepatitis in scid mice by infection with B. burgdorfen strain ZS7

Behandlung der Mäuse mit B burgdorfenTreatment of the mice with burgdorfen

Erwachsenen Mausen der Stamme C B 17 Seid (homozygot fur dieScid-Mutation) und C B 17 wurden 1x 10⁵,5x 10⁵,1x 10⁶ oder 1 χ 10⁸ lebensfähige oder abgetötete (UV Strahlung) B burgdorfen Organismen subkutan in die Schwanzwurzel injiziertAdult mice of strain CB 17 (homozygous for the scid mutation) and CB 17 were injected subcutaneously into the tail root 1x10 ⁵ , 5x 10 ⁵ , 1x 10 ^6, or 1 × 10 ⁸ viable or killed (UV Radiation) B-born organisms

Isolierung von B burgdorfen aus Zecken und MäusenIsolation of burgdorfen from ticks and mice

Die Untersuchungen wurden mit dem schon seit langem kultivierten B burgdorfen-Stamm B31 Stamm B31 (ATCC 35210) und dem frischen IsolatB burgdorfen ZS7 (DSM 5527), das aus einer weiblichen Ixodes rizinus Zecke isoliert wurde, durchgeführt AIIeB burgdorferi-Stammewurden in modifiziertem Kellys Medium kultiviert (Barbouret al ,[1983] Switzerland Curr Microbiol 8,123) B burgdorferi-Organismen, die aus dem Mitteldarm von mit Ethanol sterilisierten Zecken oder aus Blut von infizierten Mausen gewonnen wurden, wurden anfangs in Kellys Medium unter Zusatz von 8мд/тІ Kanamycin und 230рд/тІ Fluoruracil kultiviert (Johnson et al ,[1984] J CIm Microbiol 1,81)The studies were performed on the long-cultivated B. burgdorfen strain B31 strain B31 (ATCC 35210) and the fresh isolate Bburgstorfen ZS7 (DSM 5527) isolated from a female Ixodes rizinus tick. AIIeB burgdorferi strains were prepared in modified Kelly's medium Burgdorferi organisms isolated from the midgut of ethanol-sterilized ticks or from the blood of infected mice were initially incubated in Kelly's medium supplemented with 8md / тІ kanamycin and 230rd. (Barbour et al / τІ fluorouracil cultured (Johnson et al, [1984] J CIm Microbiol 1.81)

Serologische TestsSerological tests

Die Detektion von B burgdorfen spezifischen Antikörpern wurde in einem konventionellen ELISA-Verfahren durchgeführt (Justus et al, [1988] Wehrmed Mschr. 32, 263) Die Standardkurve fur den Gehalt an Immunglobulin (Ig) wurde durch Beschichtung einer Schale mit Anti-Maus Ig (1 500 Verdünnung der Serumlosung von Paesel, Frankfurt, BRD) und Titration des Gesamt-Maus IgG- oder IgM-Gehalts (Calbiochem , LaJoIIa, USA) erhalten Gesamtserum IgM und IgG wurde ähnlich gemessen Die Konzentration von B burgdorfen spezifischen IgM- oder IgG-Antikorpern ist in μg lg/ml Serum angegeben.The detection of B burgdorfen-specific antibodies was carried out in a conventional ELISA method (Justus et al, [1988] Wehrmed Mschr. 32, 263). The standard curve for the content of immunoglobulin (Ig) was determined by coating a dish with anti-mouse Ig (1500 dilution of the serum solution of Paesel, Frankfurt, Germany) and total mouse IgG or IgM content titration (Calbiochem, LaJoIIa, USA) Total serum IgM and IgG were measured similarly The concentration of Bburg-Dorfen specific IgM or IgG -Antikorpern is given in μg lg / ml serum.

Immunfluoreszenz und Giemsa-AnfarbungImmunofluorescence and Giemsa staining

50 μΙ Blut wurden in einen Hematocrit-Rohrchen pipettiert (Becton und Dickinson, Heidelberg, BRD) und bei 5000g in einer Hematocrit-Zentnfuge (ECCO, BRD) zentrifugiert. Die Rohrchen wurden an der Interphase zwischen Serum und Erythrozyten aufgeschnitten und 5μΙ des Serums wurden auf Objektträger aufgetragen (Superior, Bad Mergentheim, BRD) Die mit den Serumproben beladenen Objektträger wurden an der Luft getrocknet und in 100% Ethanol eine Minute lang bei -20⁰C fixiert Nach einstundiger Inkubation mit Kaninchen-Anti B burgdorfen- Hypenmmunserum (1 100 Verdünnung) bei Raumtemperatur wurden die Objektträger fünfmal in PBS gewaschen und dann mit FITC konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Antiserum (1 Verdünnung, Jackson Lab , West Grove, USA) eine Stunde lang angefärbt Die Objektträger wurden gewaschen und in Kaisers Glycerin-Gelatine (Merck, Darmstadt, BRD) eingebettet und sofort fluoreszenzmikroskopisch untersucht Unbehandelte Bluttropfen wurden an der Luft getrocknet, in Methanol fixiert, mit Giemsa (0,1 % Merck, Darmstadt, BRD) angefärbt, in PBS entfärbt und in Entellan (Merck, Darmstadt, BRD) eingebettet50μl of blood was pipetted into a hematocrit tube (Becton and Dickinson, Heidelberg, Germany) and centrifuged at 5000g in a hematocrit centrifuge (ECCO, FRG). The tubules were cut at the interphase between serum and erythrocytes and 5μΙ of the serum were applied to microscope slides coated (Superior, Bad Mergentheim, BRD) The loaded with the serum samples slides were air-dried and resuspended in 100% ethanol for one minute at -20 ⁰ C Fixed After one-hour incubation with rabbit anti B burgdorfen hymeneal serum (1100 dilution) at room temperature, the slides were washed five times in PBS and then one with FITC-conjugated goat anti-rabbit antiserum (1 dilution, Jackson Lab, West Grove, USA) Stained for an hour The slides were washed and embedded in Kaiser's glycerol gelatin (Merck, Darmstadt, FRG) and immediately examined by fluorescence microscopy. Untreated blood drops were dried in air, fixed in methanol, with Giemsa (0.1% Merck, Darmstadt, FRG) stained, decolorized in PBS and embedded in Entellan (Merck, Darmstadt, FRG)

Histologische Präparationen und FärbeverfahrenHistological preparations and staining procedures

Verschiedene innere Organe (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Nieren, Milz und Gelenke) wurden von zuvor mit B burgdorfen infizierten Mausen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion entfernt und entweder in flussigem Stickstoff zur Präparation von Gefrierschnitten oder in 5% Formaldehyd (in PBS) zur Einbettung in Paraffin oder Methacrylat aufbewahrt Schnitte von 4 bis 7 μηη wurden hergestellt, mit Hematoxylin-Eosin angefärbt und in Entellan (Merck AG, Darmstadt, BRD) eingebettet Die Immunhistologie wurde unter Verwendung des Streptavidin Biotin-Peroxidase-Systems durchgeführt (Kramer etal,[1989]Eur J Immunol 19,151)Various internal organs (brain, heart, lung, liver, kidneys, spleen, and joints) were removed from mice previously infected with Burgdorfen at different times post-infection and either in liquid nitrogen for preparation of frozen sections or in 5% formaldehyde (in PBS Sections of 4 to 7 μηη were prepared, stained with hematoxylin eosin and embedded in entellan (Merck AG, Darmstadt, Germany). Immunohistology was performed using the streptavidin biotin peroxidase system (Kramer et al , [1989] Eur J Immunol 19,151)

Tabelle 1 zeigt, daß B burgdorferi-Orgamsmen der Isolate ZS7 und B31 wahrend der gesamten Versuchsdauer im Blut von Scid-Mausen nachgewiesen wurden, die zuvor mit lebensfähigen Organismen geimpft wurden Allerdings konnten nur Spirochäten vom Stamm ZS7, aber keine vom Stamm B31 in vitro rekultiviert werden Bei Vergleich der rekultivierten Organismen mit dem primären B burgdorfen ZS7-lsolat konnten keine Veränderungen im Proteingehalt oder im Plasmidprofil festgestellt werden Keine oder nur äußerst geringe Titer an irrelevanten Antikörpern wurden in mit B burgdorfen infizierten Scid-Mausen wahrend der gesamten Beobachtungsdauer nachgewiesen In diesen Tieren wurden keine fur B burgdorfen spezifische IgM-oder IgG-Antikorper gefunden (Tabelle 1) Dagegen exprimierten alle C B-17-Kontrollmause, die mit B burgdorfen infiziert wurden, große Mengen an Gesamt-lg und erhöhte Titer an fur B burgdorfen spezifischen IgM- und IgG-AntikorpernTable 1 shows that B burgdorferi orgamsms of isolates ZS7 and B31 were detected throughout the experimental period in the blood of scid mice previously vaccinated with viable organisms. However, only spirochetes of strain ZS7, but none of strain B31, could be recultured in vitro No changes in protein content or in the plasmid profile were found when the recultured organisms were compared with the primary bacterial disc ZS7 isolate. No or only extremely low titers of irrelevant antibodies were detected in B-Burgdorfen-infected scid mice during the entire observation period in these animals no B-specific IgM or IgG antibodies were found (Table 1). In contrast, all C B-17 control mice infected with B-Burgdorfen expressed large amounts of total Ig and increased titers of B-specific IgM antibodies. and IgG antibodies

Zwischen 7 und 20 Tagen nach der Infektion mit B burgdorfen ZS7 zeigten die Seid Mause erste klinische Symptome von Arthritis (Rötung und Schwellung beiderTibiotarsalgelenke), die mit der Zeit zunahmen Dagegen wurden keine Symptome von Arthritis in Scid-Mausen, die entweder mit UV-bestrahlten B burgdorfen ZS7 oder mit lebensfähigen B burgdorfen B31-Organismen infiziert wurden, und in C B-17-Kontrollmausen, die mit lebensfähigen B burgdorfen ZS7-0rgamsmen infiziert wurden, gefundenBetween 7 and 20 days after infection with B-streaked ZS7, the silk mice showed initial clinical symptoms of arthritis (redness and swelling of both tibiotarsal joints) that increased with time. In contrast, no symptoms of arthritis were detected in scid mice exposed either to UV B burgdorfen ZS7 or were infected with viable B burgdorfen B31 organisms and found in C B-17 control mice infected with viable B-dense ZS7 organisms

Auch histopathologisch wurden arthntische Gelenksveranderungen in Scid-Mausen nachgewiesen, die mit lebensfähigen B burgdorfen ZS7 infiziert wurden (Tabelle 1) Es wurden schwere Gelenkschadigungen festgestellt, gekennzeichnet durch die Anwesenheit von hyperplastisch entzündeten Synovial-Auskleidungszellen, verbunden mit Erosion und Zerstörung von Knorpelgewebe und/oder Knochen Weiterhin wurde Pancarditis mit Infiltration von Mononuklearzellen in das Endocardium, Myocardium und Pericardium festgestellt Ebenfalls wurde eine progressive Entzündung der Leber festgestellt, wobei eine Infiltration von Mononuklearzellen, die auf den Pfortaderbereich und die Zentralvene beschrankt war, granulomatose Reaktionen und schließlich das Auftreten von Leberfibrose beobachtet wurde Zusätzlich wurden geringere Schaden in den Nieren, der Lunge, dem Gehirn und der gestreiften Muskulatur festgestelltAlso, histopathologically, arthritic changes in the joints were detected in scid mice infected with viable burgdorfen ZS7 (Table 1). Severe joint damage was noted, characterized by the presence of hyperplastically inflamed synovial lining cells associated with erosion and destruction of cartilage and / or Bones Pancarditis was also observed with infiltration of mononuclear cells into the endocardium, myocardium and pericardium. Progressive liver inflammation was also observed, with infiltration of mononuclear cells confined to the portal vein and central vein, granulomatous reactions, and finally, the onset of liver fibrosis In addition, minor damage was found in the kidneys, lungs, brain, and striated muscles

Tabelle 1Table 1

Infektion von C B-17 Scid-Mausen und C B-17 Kontroll-Mausen mit B burgdorfen, Reisolierung von Spirochäten aus dem Gewebe, Antikorpertiter und Ausbildung von ArthritisInfection of C B-17 scid mice and C B-17 control mice with B-burgdorfen, reisolation of spirochetes from tissue, antibody titer, and arthritis

B. burgdorfenB. burgdorfen Anzahlnumber Tagedays B burgdorfenB burgdorfen IsolieIsolie Arthritisarthritis Histopa-Histopa- Antikörper (pg/ml)⁰⁰ Antibody (pg / ml) ⁰⁰ Mause-Mause- bei Inat In nach Into In DetekDetek rung**tion ** kli- tholo-clinolo- Sta mmTribe Stammtribe fektionfection fektionfection tion imin the __ nisch° gischnisch ° gisch Gesamt Ig spezifische IgTotal Ig specific Ig 5X10⁵ 5X10 ⁵ 77 Blut*Blood* _ __ _ μ γ μ γμ γ μ γ C B-17C B-17 ZS 7ZS 7 ++ ⁺B ⁺ B 2020 seidare 3636 ⁺B ⁺ B + ++ + (n = 1)(n = 1) 4949 ++ fflffl + ++ + 2121 5959 ++ —- + ++ + 2626 1x10⁸ 1x10 ⁸ 77 ++ ⁺B ⁺ B + ++ + 396396 ZS 7ZS 7 2323 ++ —- + ++ + 108 - -108 - - 1x10⁸ 1x10 ⁸ 2222 ++ ⁺G ⁺ G + ++ + 5454 ZS 7ZS 7 2929 ++ ⁺B/G ⁺ B / G + ++ + 4141 8787 ++ + ++ + _ _ _ __ _ _ _ ₊₊

B burgdorferiB burgdorferi Anzahlnumber Tagedays B burgdorferiB burgdorferi IsolieIsolie Arthritisarthritis Histopa-Histopa- -6--6- η bη b —- -- YY —- - 295 553- 295 553 bei Inat In nach Into In DetekDetek rung**tion ** tholo-tholo- Antikörper (цд/ті)'Antibody (цд / ті) ' η bη b 2626 -- Mause-Mause- Stammtribe fektionfection fektionfection tion imin the η bη b klicli gischcally —- 3737 Stammtribe 1x10⁶ 1x10 ⁶ __ Blut*Blood* η bη b nisch"cally " η bη b Gesamt IgTotal Ig —- —- spezifische Igspecific Ig ZS 7ZS 7 1x10⁶ 1x10 ⁶ —- η bη b ++ ++ η bη b μμ 5454 4747 μ γμγ 1x 10⁸ 1x 10 ⁸ 1616 η bη b -- ++ ++ 25152515 364364 n.b.n.d. 1x10⁸ 1x10 ⁸ 1616 ++ —- ++ -- 21452145 59635963 n.bn.d ZS 7 uv_tr ZS 7 uv _tr 1x10⁸ 1x10 ⁸ 2222 -- —- -- -- 304304 6 3746,374 - -- - B31B31 2929 ++ -- —- —- 216216 3 8043 804 -- 2222 ++ —- —- -- 1 9521 952 - -- - —- 2929 -- —- —- —- — —- - —- 1x10⁸ 1x10 ⁸ 1616 -- —- —- —- - -- - ZS 7ZS 7 2424 -- -- —- -- - -- - С 8-17С 8-17 —- -- -- -- —- —- 438 56438 56 (η = 7)(η = 7) -- -- -- —- —- -- 506 94506 94 -- -- -- - -- - - -- -

* Durch Giemsa Färbung oder Immunfluoreszenz* By Giemsa staining or immunofluorescence

** Isolierung aus Blut (B) Gelenken (G)** Isolation from blood (B) joints (G)

°+ Rötung und Schwellung dertibiotarsalen Gelenke° + redness and swelling of the tibiotarsalen joints

°°— <7 5pg/ml Serum°° - <7 5pg / ml serum

Beispiel 2Example 2

Wirkung eines für das B burgdorferi 31 kD Antigen spezifischen monoklonalen Antikörpers auf den Verlauf der Lyme-Borreliosein Scid-MausenEffect of a monoclonal antibody specific for B burgdorferi 31 kD antigen on the development of Lyme borreliosis scid mice

Herstellung des monoklonalen AntikörpersPreparation of the monoclonal antibody

Bei Immunisierung einer Maus, die ein intaktes Immunsystem besitzt, mit B burgdorferi Organismen werden polygonale Antikörper exprimiert, die fur B burgdorferi spezifisch sind (siehe Tabelle 1)Upon immunization of a mouse having an intact immune system with B burgdorferi organisms, polygonal antibodies specific for B burgdorferi are expressed (see Table 1).

Zehn Wochen alte weibliche Mause des Inzuchtstammes BALB/c wurden mit durch Beschallung homogenisierten Borrelien (B burgdorferi, Stamm B31, ATCC 35210) immunisiertTen-week-old female mice of the inbred strain BALB / c were immunized with Borrelia homogenized by sonication (Bburgdorferi, strain B31, ATCC 35210)

Immunisierungsprotokollimmunization protocol

Tag 0 200pg Borrelien-Antigen in kompletten Freunds Adjuvants subkutanDay 0 200pg Borrelia antigen in complete Freunds adjuvant subcutaneously

Tag 21,35,49,63 Challenge mit 100цд Borrelien Antigen in Phosphat gepufferter Sahne ι ρ Tag 66 Entnahme der Milz und Herstellung einer EinzelzellsuspensionDay 21, 35, 49, 63 Challenge with 100,000 Borrelia antigen in phosphate buffered cream ι ρ Day 66 Extraction of the spleen and production of a single cell suspension

Die immunen Milzzellen wurden mit der Ag8-PAI Myelom-Zellmie nach Standardmethoden unter Verwendung von Polyethylenglycol fusioniert (J H Peters, H Baumgarten, M Schulze „Monoklonale Antikörper" Springer-Verlag, Heidelberg) Die Fusionsprodukte wurden in 96 wells Gewebekulturplatten ausgesät Nach 8 Tagen wurden die Zellkulturuberstande auf die Anwesenheit von B burgdorferi spezifischen monoklonalen Antikörpern mit Hilfe eines Festphasen-ELISA, untersucht (J H Peters et al ,so) Die Hybridoma-Zellen aus Antikorper-produzierenden Kulturen wurden nach der Grenzverdunnungsmethode kloniert Die Kulturuberstande individueller Klone wurden anschließend erneut im Festphasen-ELISA sowie durch Western-Blot Analyse und durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen charakterisiert Der monoklonale Antikörper LA 2 der Subklasse lgG2b wird von einer monoklonalen Hybridoma-Linie produziert und sezerniert und reagiert im Western-Blot mit der 31 kDa-Struktur, (Osp-A)von allen untersuchten B burgdorferi Stammen (u a die Isolate ZS 7 und B31) bei Kontakt mit elektrophoretisch über ein SDS Gel aufgetrennten und mittels Westernblot auf eine Membran transferierten B burgdorferi Proteinen Die monoklonalen Antikörper LA-26 1 C(anti-ospAlgGI), LA 25 1 (anti OspB [34kDa Antigen], IgG 2 b) und LA27 1 (anti-OspB [34kDa Antigen], IgGI) wurden auf analoge Weise hergestellt und charakterisiertThe immune spleen cells were fused with the Ag8-PAI myeloma cell line by standard methods using polyethylene glycol (JH Peters, H Baumgarten, M Schulze "Monoclonal Antibody" Springer-Verlag, Heidelberg). The fusion products were seeded in 96 wells tissue culture plates after 8 days the cell culture supernatants for the presence of B burgdorferi specific monoclonal antibodies using a solid-phase ELISA, examined (JH Peters et al, supra) The hybridoma cells from antibody-producing cultures were cloned by Grenzverdunnungsmethode The culture supernatants of individual clones were then re-solid-phase ELISA and Western blot analysis and immunofluorescence studies The monoclonal antibody LA 2 of the subclass IgG2b is produced and secreted by a monoclonal hybridoma line and reacts in the Western blot with the 31 kDa structure, (Osp-A) of all examined B burgdorferi Stam (on isolates ZS 7 and B31) on contact with B burgdorferi proteins separated electrophoretically via an SDS gel and transferred to a membrane by Western blotting. The monoclonal antibodies LA-26 1 C (anti-ospAlgGI), LA 25 1 (anti OspB [ 34kDa antigen], IgG 2 b) and LA27 1 (anti-OspB [34kDa antigen], IgGI) were prepared and characterized in an analogous manner

Infektion von Mausen mit B burgdorferi ZS 7Infection of mice with B burgdorferi ZS 7

C B-17 Scid-Mause wurden mit 1 χ 10⁸ lebensfähigen B burgdorferi ZS7-Organismen subkutan in die Schwanzwurzel infiziertC B-17 scid mice were subcutaneously infected with 1 χ 10 ⁸ viable B burgdorferi ZS7 organisms in the tail root

Behandlung der Mause mit AntiserenTreatment of the mouse with antisera

Die infizierten Scid-Mause wurden zweimal pro Woche mit verschiedenen Antiseren behandelt Die eine Gruppe wurde mit NMS (normales Mausserum), eine zweite Gruppe mit IMS (immunes Mausserum) und eine dritte Gruppe mit dem monoklonalen Antikörper LA-2 (gegen ds 31 kD Antigen von B burgdorferi) behandelt Die Dosis der verabreichten Antiseren betrug in der ersten Wochen 100 μΙ bzw 100 pg bei LA 2, in der zweiten Woche 200 μΙ bzw 200 μg bei LA-2 und in der dritten Woche 300 μΙ bzw 300 μg bei LA-2The infected scid mice were treated twice a week with different antisera. One group was treated with NMS (normal mouse serum), a second group with IMS (immune mouse serum) and a third group with the monoclonal antibody LA-2 (against the 31 kD antigen The dose of administered antisera was 100 μΙ or 100 pg for LA 2 in the first weeks, 200 μΙ or 200 μg for LA-2 in the second week and 300 μΙ for the second week or 300 μg for LA-2. 2

Tabelle 2 zeigt, daß unbehandelte oder mit NMS behandelte Scid-Mause nach 12 Tagen klinische und histopathologische Anzeichen von Arthritis bzw Carditis und Hepatitis entwickelten Dagegen bewirkte die Verabreichung des monoklonalen Antikörpers LA-2 bei Seid Mausen eine deutliche Reduzierung der Symptome Klinisch waren nur leichte Rötungen der Gelenke und histopathologisch nur margmale Veränderungen festzustellen Mit IMS behandelte Mause zeigten keine klinischen ArthritisbefundeTable 2 shows that untreated or NMS-treated scid mice developed clinical and histopathological signs of arthritis or carditis and hepatitis after 12 days. On the other hand administration of the monoclonal antibody LA-2 caused a marked reduction in symptoms in mice. Clinically, only slight redness was present of the joints and only marginal changes in histopathology. Mice treated with IMS showed no clinical arthritis findings

Ein Nachweis des B burgdorfen-Erregers durch In-vitro- Kultivierung gelang nur bei Mausen, die entweder unbehandelt oder mit NMS behandelt wurden Bei den mit LA-2 oder IMS behandelten Mausen konnte B burgdorferi nicht nachgewiesen werden (Tabelle 2)In vitro bacterial detection of B burgdorfen pathogens was successful only in mice treated either untreated or treated with NMS. B burgdorferi could not be detected in mice treated with LA-2 or IMS (Table 2).

Tabelle 2Table 2 Behandlung von C.B-17 Scid-Mäusen mit B. burgdorferi und AntiserenTreatment of C.B-17 scid mice with B. burgdorferi and antisera

Mausestamm C.B-17 seidMouse strain C.B-17 Behandlung mitAntiserumTreatment with antiserum Arthritis (nach 12 Tagen) klinischArthritis (after 12 days) clinical histopatho- logischhistopathologically Carditis/ Hepatitis histopatho- logischCarditis / hepatitis histopathologic B burgdorferi Nachweis (Anzucht)B burgdorferi proof (cultivation) n = 3 n = 2 n = 3n = 3 n = 2 n = 3 NMS IMS LA-2NMS IMS LA-2 oooo ιι II+ +II + + ° leichte Rötung des Gelenks °° nur marginale Veränderung° slight redness of the joint °° only marginal change

Beispiel 3Example 3

Expressionsklonierung des 31 kD Antigens (OspA) von B burgdorferi ZS7Expression cloning of the 31 kD antigen (OspA) of B. burgdorferi ZS7

ONA-PräparationONA preparation

Hochmolekulare DNA aus dem B burgdorfen-Stamm ZS7 wurde nach Kultivierung in modifiziertem Kellys Medium gereinigt Die Spirochäten wurden durch Zentrifugation bei 10000g pelletiert und dreimal in PBS-Puffer gewaschen Das trockene Pellet wurde in 10ml TE (10mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA, pH7,4) resuspendiert, mit Lysozym (5mg/ml) 15 Minuten lang bei 30⁰C behandelt und die DNA durch Zugabe von 1 ml 20%igem SDS freigesetzt Nach Zugabe von 1,5ml NaCI (5mol/l) wurde die Losung mit einem gleichen Volumen an Phenol extrahiert, gefolgt von einer Extraktion mit Chloroform Die DNA wurde dann durch Zugabe von 2 Volumina absolutem Ethanol und Inkubation bei -20⁰C über Nacht gefallt Nach Zentrifugation wurde der Ruckstand in 0,5ml TE gelost und mit DNAse freier RNAse A (20μg/ml) 45 Minuten lang bei 55°C inkubiert, gefolgt von einer einstundigen Behandlung mit Protemase K (0,1 pg/ml) bei 37°C Die Losung wurde auf 0,3mol/l NaOAc eingestellt und mit Phenol-Chloroform wie oben beschrieben extrahiert Nach Fallung mit Ethanol wurde die DNA wieder in TE aufgenommenHigh molecular weight DNA from B. burgdorfen strain ZS7 was purified after culturing in modified Kelly's medium. The spirochetes were pelleted by centrifugation at 10,000g and washed three times in PBS buffer. The dry pellet was dissolved in 10ml TE (10mmol / l Tris, 1mmol / l EDTA , pH 7.4) resuspended with lysozyme (5 mg /) was treated for 15 minutes at 30 ⁰ C and the DNA was released by adding 1 ml of 20% SDS After the addition of 1.5 ml of NaCl (5 mol / l) ml of the solution extracted with an equal volume of phenol, followed by extraction with chloroform, the DNA was then precipitated by addition of 2 volumes of absolute ethanol and incubation at -20 ⁰ C precipitated overnight After centrifugation, the residue was dissolved in 0.5 ml TE and free DNAse RNAse A (20 μg / ml) was incubated for 45 minutes at 55 ° C, followed by one-hour treatment with Protemase K (0.1 μg / ml) at 37 ° C. The solution was adjusted to 0.3 mol / l NaOAc and phenol Chloroform as described above extrahi After ethanol precipitation, DNA was re-absorbed into TE

Herstellung der GenbankProduction of the gene bank

Hochmolekulare DNA wurde durch drei Sekunden lange Ultraschallbehandlung statistisch zerkleinert T4-DNA-Polymerase (30 Minuten bei 37°C) und Klenow-Enzym (5 Minuten bei 20⁰C) wurden dazu verwendet, um die Enden der erzeugten DNA-Fragmente zu glatten DNA mit glatten Enden wurde in die BamHI-Stelle eines Expressionsvektors pUEX1 unter Verwendung einer Adapter-Klomerungsstrategie ligiert (Bresan und Stanley [1987] Nucl Acid Res S 1056) Nach einem Großenselektionsschritt durch eine Molekularsieb-Chromatographie über Sephacryl S-1000 und Transformation von kompetenten Wirtszellen E coil (MC 1061) wurde der Anteil an rekombinanten Plaque bildenden Einheiten (pfu) wie folgt bestimmt zufällig ausgewählte Kolonien wurden gepickt und bis zur Sättigung in 2mlSelektionsmedium ^Втіі25цд/тІ Ampicillin) angezuchtet Die Plasmid-DNA wurde nach der üblichen alkalischen Lysis-Methode isoliert und anschließend mit BamHI geschnitten Mehr als 50% der analysierten Plasmide enthielten durchschnittlich > 1,5 kb lange DNA-InsertionenHigh molecular weight DNA was removed by three-second ultrasonic treatment statistically crushed T4 DNA polymerase (30 minutes at 37 ° C) and Klenow enzyme (5 minutes at 20 ⁰ C) were used, to the ends of the generated DNA fragments into smooth DNA blunt ended was ligated into the BamHI site of an expression vector pUEX1 using an adapter cleavage strategy (Bresan and Stanley [1987] Nucl Acid Res S 1056) Following a large selection step by molecular sieve chromatography on Sephacryl S-1000 and transformation of competent host cells E coil (MC 1061) was determined the proportion of recombinant plaque forming units (pfu) as follows: randomly selected colonies were picked and grown to saturation in 2 ml selection medium ^ Втіі25цд / тІ ampicillin). The plasmid DNA was prepared by the usual alkaline lysis method isolated and then cut with BamHI More than 50% of the analyzed plasmids contained by average> 1.5 kb DNA insertions

Ausplattieren und Screening der B burgdorferi ZS7-GenbankPlating and screening of the B burgdorferi ZS7 gene bank

Die Zellen wurden auf 24cm x 24cm-Platten bei einer Dichte von 7000pfu pro Platte ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert Nach dem Transfer der Kolomen auf Nitrocellulosefilter (NC) wurde die Expression von ß-Galactosidase-Fusionsprotemen durch zweistündige Inkubation bei 42⁰C induziert Die Filter wurden auf ein Whatman ЗММ-Papier transferiert, das mit 5% SDS behandelt worden war, und etwa 25 Minuten lang bei 95⁰C inkubiert Dann wurden die Proteine elektrogeblottet unter Verwendung einer üblichen Apparatur zum halbtrockenen Westernblotting Nach DNAse-Behandlung der NC-Filter wurden immunreaktive Klone durch ein Expressions-Screening unter Verwendung monoklonaler Antikörper identifiziert Unspezifische Bindungsstellen auf den NC-Filtern wurden durch vierstündige Inkubation mit PBS, enthaltend 0,2 % (Gewicht pro Volumen) Gelatine und 3 mmol/l NaN₃ bei Raumtemperatur abgesattigt Anschließend wurden die Filter mit Kulturuberstanden des Anti-31 kD monoklonalen Antikorperklons LA-2 18 Stunden lang unter andauerndem Schuttein inkubiert Nach grundlichem Waschen (PBS + 1 % [Volumen/Volumen] Triton X-100, PBS + 0,5 mol/l Natriumchlorid, PBS + 1 mol/l Natriumchlorid, jeder Schritt 10 Minuten) wurden die Filter mit der 1 10000 Verdünnung einer Peroxidase-markierten F(ab)₂-Praparation von Kaninchen-Anti-Maus-lgG-Antikorpern 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur unter andauerndem Schuttein inkubiert Die Filter wurden wieder, wie oben beschrieben, gewaschen und dann mit Diaminobenzidin als Peroxidasesubstrat inkubiert Von 10⁴ rekombinanten PFUs reagierten 20 Klone mit dem monoklonalen Antikörper LA-2The cells were plated on 24cm x 24cm plates at a density of 7000pfu per plate and grown overnight at 30 ° C incubated After transfer of the kolomen to nitrocellulose filters (NC), the expression of beta-galactosidase Fusionsprotemen by two-hour incubation at 42 ⁰ C induces the filters were transferred to a Whatman ЗММ paper, which had been treated with 5% SDS, and incubated at 95 ⁰ C for about 25 minutes Then, the proteins were electroblotted using a conventional apparatus for semi-dry Western blotting After DNAse treatment of the NC filters were identified as immunoreactive clones by expression screening using monoclonal antibodies. Nonspecific binding sites on the NC filters were determined by incubation with PBS containing 0.2% (w / v) gelatin and 3 mmol / l NaN ₃ at room temperature for four hours The filters were then incubated with culture supernatants of the anti-31 kD monoclonal antibody After washing thoroughly (PBS + 1% [volume / volume] of Triton X-100, PBS + 0.5 mol / L sodium chloride, PBS + 1 mol / L sodium chloride, each step 10 is incubated with LA-2 for 18 hours Minutes), the filters were incubated with 1,0000 dilution of a peroxidase-labeled F (ab) ₂ preparation of rabbit anti-mouse IgG antibodies for 1.5 hours at room temperature with constant debris. The filters were again as described above , washed and then incubated with diaminobenzidine as the peroxidase substrate. Out of 10 ⁴ recombinant PFUs, 20 clones reacted with monoclonal antibody LA-2

Sequenzanalyse des 31 kD Antigens (OspA)Sequence analysis of the 31 kD antigen (OspA)

Die insertierte DNA eines rekombinanten E coli-Klons mit positiver Antikorperreaktion mit LA-2 wurde auf übliche Weise isoliert Die DNA-Insertion dieses Klons enthielt das fur das B burgdorferi 31 kD Antigen kodierende ospA-Gen in voller Lange Das Plasmid, das die Insertion enthalt, wurde pZS-7/31-2 bezeichnet und wurde gemäß Budapester Vertrag bei DSM (unter der Nummer DSM 5528) hinterlegtThe inserted DNA of a recombinant E coli clone with positive antibody reaction with LA-2 was isolated in the usual way. The DNA insert of this clone contained the full-length ospA gene coding for B burgdorferi 31 kD antigen. The plasmid containing the insertion , was designated pZS-7 / 31-2 and was deposited with DSM under the Budapest Treaty (under number DSM 5528)

Das von diesem immunpositiven Klon produzierte rekombinante Protein wurde als rZS7/31-2 bezeichnet Die kodierende DNA-Sequenz des ospA-Gens wurde bestimmt Sie ist zusammen mit der davon abgeleiteten Aminosäuresequenz des OspA-Protems in Abb 1 dargestelltThe recombinant protein produced by this immunopositive clone was designated rZS7 / 31-2. The coding DNA sequence of the ospA gene was determined. It is shown together with the deduced amino acid sequence of the OspA proteme in FIG

Aus Abb 1 ist auch ersichtlich, daß das 31 kD Antigen von B burgdorferi einem Protein mit 273 Aminosäuren entsprichtIt can also be seen from Fig. 1 that the 31 kD antigen of B burgdorferi corresponds to a 273 amino acid protein

Präparation von Nicht-FusionsproteinenPreparation of non-fusion proteins

a) Der Klon, der das immunreaktive Protein rZS 7/31-2 exprimiert, wurde über Nacht bei 30⁰C in 10 ml LB mit Ampicillin gezüchtet 1 ml der Kultur wurde in 100ml Selektionsmedium eingebracht und bei 30⁰C mit guter Belüftung bis zu einer Dichte von 8x 10⁷ Zellen pro ml (A600 = 0,2) gezüchtet Die Expression des rekombinanten Proteins wurde durch einen Transfer der Wirtszellen auf 42°C erreicht Nach Abkühlen und Zentrifugation wurden die Zellen in STE-Puffer (10mmol/l Tris, lOOmmol/l Natriumchlorid, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0) gewaschen und der Ruckstand in 0,6 ml Lysispuffer (25% Sucrose, 50mmol/l Tris, pH 8,0) resuspendiert Nach Zugabe von 150μΙ Lysozym (10mg/ml) wurde die Mischung 15 Minuten lang auf Eis inkubiert, gefolgt von einer weiteren Inkubation (15 Minuten auf Eis) mit 18μΙ DNAse 1 (10 mg/ml) in Gegenwart von 5μ11 mol/l Magnesiumchlorid Schließlich wurden 250μΙ4χ Detergensmixd % Triton X100,0,5% Deoxycholat, 0,1 mol/l NaCI, 10mmol/l Tris, pH7,4) zugefugt und 5 Minuten lang auf Eis inkubiert Nach Zentrifugation wurde der Rückstand zweimal mit Puffer A (50mmol/l Tris, 50mmol/l NaCI, 1 mmol/l EDTA, pH8,0) gewaschen und in 9 Volumina Puffer A, zusätzlich 8M Harnstoff enthaltend, resuspendiert und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert Die Probe wurde verdünnt mit 9 Teilen Puffer B (50mmol/l KH₂PO₄ZK₂HPO₄, 50 mol/l NaCI, 1 mmol/l EDTA, pH 10,7) und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH Wert durch Zugabe von KOH bei 10,7 gehalten wurde Nach Einstellung eines pH-Werts der Losung auf 7,0 durch Zugabe von HCI wurde die Probe über Nacht gegen Puffer A dialysiert (bei 4°C) und 10 Minuten lang bei 4°C und 10000 Umlaufen pro Minute (Upm) meinem SS 34-Rotor zentrifugiert Der Überstand, der das rekombinante Protein enthalt, wurde bei -20⁰C aufbewahrta) The clone which expresses the immune-reactive protein RZS 7 / 31-2 was grown overnight at 30 ⁰ C in 10 ml LB grown with ampicillin 1 ml of the culture was placed in 100 ml of selection medium and incubated at 30 ⁰ C with good aeration to a density of 8 x 10 ⁷ cells per ml (A600 = 0.2) grown expression of the recombinant protein was achieved by a transfer of the host cells at 42 ° C After cooling and centrifugation, the cells were (in STE buffer 10 mmol / l Tris, 100 mmol / l sodium chloride, 1 mmol / l EDTA, pH 8.0) and the residue was resuspended in 0.6 ml lysis buffer (25% sucrose, 50 mmol / l Tris, pH 8.0). After addition of 150 μl lysozyme (10 mg / ml), the mixture was incubated on ice for 15 minutes, followed by another incubation (15 minutes on ice) with 18μΙ DNAse 1 (10 mg / ml) in the presence of 5μ11mM magnesium chloride. Finally, 250μΙ4χ detergent mix% Triton X100.0 , 5% deoxycholate, 0.1 mol / l NaCl, 10 mmol / l Tris, pH 7.4) and 5 min After centrifugation, the residue was washed twice with buffer A (50 mmol / l Tris, 50 mmol / l NaCl, 1 mmol / l EDTA, pH 8.0) and resuspended in 9 volumes of buffer A, additionally containing 8M urea, and incubated for one hour at room temperature The sample was diluted with 9 parts buffer B (50 mmol / l KH ₂ PO ₄ ZK ₂ HPO ₄ , 50 mol / l NaCl, 1 mmol / l EDTA, pH 10.7) and added for 30 minutes After adjusting the pH to 7.0 by adding HCl, the sample was dialyzed overnight against buffer A (at 4 ° C) and 10 minutes at 4 ° C and 10,000 circulation per minute (rpm) my SS 34 rotor centrifuged the supernatant containing the recombinant protein was stored at -20 ⁰ C.

b) Da der Klon das immunreaktive Protein rZS7/31 2 auch in das Kulturmedium sezermert, ist eine Reinigung (Affinitatschromatographie) direkt aus Kulturuberstand möglichb) Since the clone also secrets the immunoreactive protein rZS7 / 31 2 into the culture medium, purification (affinity chromatography) directly from culture supernatant is possible

Präparation von rekombinanten OspA (Nicht-Fusions) Protein und affinitätschromatografische Reinigung Die rekombinanten Proteine wurden anschließend affinitatschromatographisch gereinigt Zu diesem Zweck wurden gereinigte monoklonale Antikörper LA-2 an aktivierte Sepharose CL 4 B kovalent gebunden Derdialysierte Harnstoff-Extrakt mit dem rekombinanten Protein wurde an Maus IgG-Sepharose CL 4 B adsorbiert und anschließend über die LA-2-Sepharose CL 4B-Saule gegeben Nach intensivem Waschen wurde das gebundene rekombinante Protein mit 0,1 mol/l Glycin/HCI-0,1 mol/l NaCI,pH2,5eluiert Der pH-Wert der gesammelten Fraktionen wurde durch sofortige Zugabe von ¹AoVoI 0,5mol/l K₂HPO₄ neutralisiert Die proteinhaltigen Fraktionen wurden konzentriert und dialysiert Mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese wurde der Grad der Reinigung bestimmtPreparation of recombinant OspA (non-fusion) protein and affinity chromatographic purification The recombinant proteins were then purified by affinity chromatography. For this purpose, purified monoclonal antibodies LA-2 were covalently linked to activated Sepharose CL 4 B. The dialyzed urea extract with the recombinant protein was added to mouse IgG -Sepharose CL 4 B adsorbed and then passed through the LA-2 Sepharose CL 4B column After intensive washing, the bound recombinant protein was eluted with 0.1 mol / l glycine / HCl 0.1 mol / l NaCl, pH 2.5 The pH of the collected fractions was neutralized by the immediate addition of ¹ AoVoI 0.5 mol / L K ₂ HPO _4. The protein-containing fractions were concentrated and dialyzed. The degree of purification was determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis

Immunologische Charakterisierung des rekombinanten Proteins rZS7/31-2 Das rekombinante Protein rZS 7/31-2 wurde immunologisch untersucht Zum Vergleich wurde das rekombinante Protein гВЗІ/41 9 (B burgdorferi 41 kD Oberflachenantigen) herangezogenImmunological characterization of the recombinant protein rZS7 / 31-2 The recombinant protein rZS 7 / 31-2 was immunologically examined. For comparison, the recombinant protein гВЗІ / 41 9 (B burgdorferi 41 kD surface antigen) was used

Flachboden Mikrotiterplatten wurden mit Harnstoffextrakten der rekombinanten Proteine rZS7/31-2und rB31/41 9 bzw einem Harnstoffextrakt des zur Genexpression verwendeten E coil-Stamms MC 1061 beschichtet Unspezifische Bmdungsstellen wurden mitO,2%Gelatmein phosphatgepufferter Kochsalzlosung blockiert Vertiefungen der so vorbereiteten Mikrotiterplatten wurden mit den angegebenen monoklonalen Antikörpern LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), LA-1 (anti-41 kD Flagelhn) bzw ACHT 2 (anti α, Antichymotrypsin) in Ansatz gebrachtFlat-bottomed microtiter plates were coated with urea extracts of the recombinant proteins rZS7 / 31-2 and rB31 / 41 9 or a urea extract of the Ecoi strain MC 1061 used for gene expression Unspecific binding sites were blocked with O, 2% gelatin in phosphate buffered saline. Wells of the microtiter plates prepared in this way were incubated with the monoclonal antibodies LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), LA-1 (anti-41 kD Flagelhn) or ACHT 2 (anti-α, antichymotrypsin)

Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden mit peroxidasemarkierten speziesspezifischen anti Maus Immunglobulinen zur Reaktion gebracht Gebundene peroxidasemarkierte Antikörper wurden unter Verwendung des Peroxidasesubstrats Orthophenylendiamin quantifiziert Die Absorption bei 492 nm (A₄₉₂) wurde direkt in der Mikrotiterplatte mit Hilfe eines automatisierten Plattenphotometers bestimmt Die Starke der Absorption ist ein Maß fur die Menge gebundener monoklonaler AntikörperThe bound monoclonal antibodies were reacted with peroxidase-labeled species-specific anti-mouse immunoglobulins. Bound peroxidase-labeled antibodies were quantified using the peroxidase substrate orthophenylenediamine. The absorbance at 492 nm (A ₄₉₂ ) was determined directly in the microtiter plate using an automated plate photometer Measure of the amount of bound monoclonal antibody

Der monoklonale Antikörper LA-2 reagiert in spezifischer Weise mit rZS7/31 2 aber nicht mit MC 1061 bzw rB31/41-9 Die Kontrollreaktion des monoklonalen Antikörpers LA-1 ist spezifisch fur rB31/41-9 Der monoklonale Kontrollantikorper ACHT 2 (Negativkontrolle) zeigt auf keinem der Proteine eine signifikante ReaktionThe monoclonal antibody LA-2 reacts specifically with rZS7 / 31 2 but not with MC 1061 or rB31 / 41-9. The control reaction of the monoclonal antibody LA-1 is specific for rB31 / 41-9 The monoclonal control antibody ECHT 2 (negative control) shows no significant response to any of the proteins

Abbildung 2 zeigt, daß das vom monoklonalen Antikörper LA-2 in spezifischer Weise erkannte antigene Epitop auf dem rekombinanten Protein rZS7/31-2 exprimiert ist, das aus dem Genom von B burgdorferi ZS7 kloniert wurdeFigure 2 shows that the antigenic epitope specifically recognized by the monoclonal antibody LA-2 is expressed on the recombinant protein rZS7 / 31-2 cloned from the genome of B burgdorferi ZS7

Beispiel 4Example 4

Vergleich von fur das 31 kD (OspA) bzw 34 kD Antigen (OspB) spezifischen Antikörpern mit Antikörpern, die für das 41 kD Antigen (Flagelhn) spezifisch sindComparison of antibodies specific for the 31 kD (OspA) or 34 kD antigen (OspB) with antibodies specific for the 41 kD antigen (Flagelhn)

Die monoklonalen Antikörper LA-2 und LA 26 1 erkennen das 31 kD Antigen OspA und sind vom Isotyp IgG 2 b bzw IgG 1 Die monoklonalen Antikörper LA-25 1 und LA-27 1 erkennen das 34 kD Antigen OspB und sind vom Isotyp IgG 2 b bzw IgGI Die monoklonalen Antikörper LA-10 und LA-21 sind spezifisch fur das Flagellen assoziierte 41 kD periplasmatische Protein von B burgdorferi und sind vom Isotyp IgG 2 a bzw IgG 1 Alle obengenannten Antikörper wurden nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhalten Es sollte in diesem Versuch festgestellt werden, ob auch monoklonale Antikörper gegen ein anderes B burgdorferi Antigen in Scid-Mausen eine Protektion vor den klinischen Symptomen der Lyme-Borreliose bewirken Das polyklonale Anti-B31-Immunserum (IMS) wurde aus C57BL/6-Mausen 91 Tage nach einer subkutanen Inokkulation mit 1 χ 10⁸B burgdorferi ВЗІ-Organismen entnommen Das polyklonale Anti-ZS7 IMS wurde aus C57 BL/6 Mausen 68Tage nach einer subkutanen Inokulation mit 1 x 10⁸ B burgdorferi ZS7 entnommen Beide Sera enthielten 60 μg/ml spezifische Antikörper, wie in einem ELISA-System bestimmt wurde (Schaible et al ,J Exp Med 170(1989], 1427-1432) Das Normal-Maus-Serum (NMS) wurde aus nicht infizierten C57 BL/6-Mausen entnommenThe monoclonal antibodies LA-2 and LA 26 1 recognize the 31 kD antigen OspA and are of the isotype IgG 2 b or IgG 1 The monoclonal antibodies LA-25 1 and LA-27 1 recognize the 34 kD antigen OspB and are of the isotype IgG 2 b or IgGI The monoclonal antibodies LA-10 and LA-21 are specific for the flagella-associated 41 kD periplasmic protein of B burgdorferi and are of the isotype IgG 2 a and IgG 1, respectively. All abovementioned antibodies were obtained according to the method described in Example 2. It should In this experiment, it was also determined whether monoclonal antibodies to another B burgdorferi antigen in scid mice could protect them from the clinical symptoms of Lyme borreliosis. The polyclonal anti-B31 immune serum (IMS) was isolated from C57BL / 6 mice for 91 days The polyclonal anti-ZS7 IMS was isolated from C57 BL / 6 mice 68 days after subcutaneous inoculation with 1 x 10 ⁸ B burgdor after subcutaneous inoculation with 1 χ 10 ⁸ B burgdorferi ЗІЗІ organisms Both sera contained 60 μg / ml of specific antibodies as determined in an ELISA system (Schaible et al, J Exp Med 170 (1989), 1427-1432). Normal mouse serum (NMS) did not turn out taken from infected C57 BL / 6 mice

Zum Zeitpunkt der Inokulation und darauffolgend in 4-Tages-lntervallen wurden die angegebenen Antikörper, das IMS, das NMS oder PBS-Puffer passiv intraperitoneal in Scid-Mause gemäß folgendem Protokoll transferiert Tag 0 und Tag 3 100μΙ,At the time of inoculation and subsequently at 4-day intervals, the indicated antibodies, IMS, NMS or PBS buffer were passively transferred intraperitoneally to scid mice according to the following protocol day 0 and day 3 100μΙ,

Tag 7 und Tag 10 200μΙ,Day 7 and day 10 200μΙ,

Tag 13 und Tag 17 300μΙDay 13 and day 17 300μΙ

Scid-Mäuse, die entweder mit Anti-ZS7IMS, Anti-B31 IMS oder mit dem monoklonalen Antikörper LA-2 behandelt wurden, zeigten keine sichtbaren klinischen Symptome von Arthritis, d. h. es trat keine Rötung und Schwellung von Tibioltarsalgelenken während der 21 Beobachtungstage auf. Ebenso waren keine Symptome von Carditis und Hepatitis festzustellen. Histopathologische Untersuchungen ergaben keine Veränderungen in den Gelenken, dem Herzen und der Leber von Scid-Mäusen, die entweder mit Anti-ZS7-IMS, Anti-B31-IMS oder mit dem monoklonalen Antikörper LA-2 behandelt wurden. Auch der andere OspA-spezifische monoklonale Antikörper LA-26.1 vom Isotyp IgG 1 sowie die OspB spezifischen Antikörper LA-25.1 und LA-27.1 waren in der Lage, die klinischen Symptome von Arthritis, Carditis und Hepatitis zu mildern. Hier zeigten sich leichte pathologische Veränderungen in den untersuchten Organen.Scid mice treated with either anti-ZS7IMS, anti-B31 IMS or monoclonal antibody LA-2 did not show any visible clinical symptoms of arthritis, i. H. There was no redness and swelling of tibial tarsal joints during the 21 observation days. Likewise, no symptoms of carditis and hepatitis were noted. Histopathological studies revealed no changes in the joints, heart and liver of scid mice treated either with anti-ZS7-IMS, anti-B31-IMS or with the monoclonal antibody LA-2. The other OspA-specific monoclonal antibody LA-26.1 of the isotype IgG 1 and the OspB-specific antibodies LA-25.1 and LA-27.1 were also able to alleviate the clinical symptoms of arthritis, carditis and hepatitis. Here were slight pathological changes in the organs examined.

Im Gegensatz dazu zeigten Scid-Mäuse, die entweder PBS-Puffer, NMS oder monoklonale Antikörper gegen Flagellin (LA-10 oder LA-21) verabreicht bekommen hatten, klinische Zeichen von Arthritis, die für unbehandelte Scid-Mäuse typischen, pathologischen Veränderungen (Tabelle 3). Die Schwere der Symptome in den letztgenannten Tieren war mit zunehmender Zeitdauer nach der Inokulation ansteigend und schwächte sich während der gesamten Beobachtungsperiode nicht ab. Aus Scid-Mäusen, die zuvor entweder mit Anti-ZS7-IMS oder mit dem Antikörper LA-2 behandelt wurden, konnten keine Spirochäten isoliert werden. Im Gegensatz dazu war der Nachweis von Spirochäten durch Immunfluoreszenz und durch Kultivierung aus dem Blut von Scid-Mäusen möglich, die mit PBS-Puffer, NMS oder den monoklonalen Antikörpern LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 oder LA-21 behandelt worden waren.In contrast, scid mice given either PBS buffer, NMS or flagellin monoclonal antibodies (LA-10 or LA-21) showed clinical signs of arthritis, the pathological changes typical of untreated scid mice (Table 3). The severity of symptoms in the latter animals increased with increasing time after inoculation and did not decrease throughout the observation period. No spirochetes could be isolated from scid mice previously treated with either anti-ZS7-IMS or LA-2 antibody. In contrast, detection of spirochetes was possible by immunofluorescence and by culture from the blood of scid mice treated with PBS buffer, NMS or the monoclonal antibodies LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1, LA-10 or LA -21 had been treated.

Tabelle 3Table 3

Mäusestammmouse strain Behandlungtreatment IgGIgG klinischeclinical Histopathologiehistopathology Nachweis vonproof of C.B.-17ScidC. B.-17Scid mitWith Subtypsubtype Arthritisarthritis Periarthritis/periarthritis / B.burgdorferiB. burgdorferi (Anzahl der Mäuse)(Number of mice) Arthritis CarditisArthritis carditis (Kultivierung und(Cultivation and Immunfluoreszenz)Immunofluorescence)

n = 8n = 8 PBS (negative Kontrolle)PBS (negative control) 2b2 B n = 3n = 3 NMS (negative Kontrolle)NMS (negative control) 2a2a n = 3n = 3 anti-B31 IMSanti-B31 IMS 11 n = 2n = 2 anti-ZS7IMSanti-ZS7IMS 11 n = 6n = 6 LA-2 (OspA)LA-2 (OspA) 2b2 B n = 3n = 3 LA-10 (Flagellin)LA-10 (Flagellin) 11 n = 3n = 3 LA-21 (Flagellin)LA-21 (Flagellin) n = 3n = 3 LA-26.1 (OspA)LA-26.1 (OspA) n = 3n = 3 LA-25.1 (OspB)LA-25.1 (OspB) n = 3n = 3 LA-27.1 (OspB)LA-27.1 (OspB)

Der Grad der histopathologischen Veränderung ist wie folgt angegeben:-keine,-* subklinisch, +/- mäßig, + schwere. * Ein B. burgdorferi-Nachweis durch Immunfluoreszenz war nicht in allen untersuchten Individuen möglich.The degree of histopathological change is indicated as follows: - none, - * subclinical, +/- moderate, + severe. * B. burgdorferi detection by immunofluorescence was not possible in all individuals studied.

Beispiel 5Example 5

Wirkung von Antiserum aus, mit OspA immunisierten Mäusen auf den Verlauf der Lyme-Borreliose in Scid-Mäusen In diesem Experiment konnte gezeigt werden, daß eine Verabreichung von nativem OspA (isoliert aus B. burgdorferi ZS-7) oder rekombinantem OspA (isoliert aus E. coli-Bakterien, die mit dem rekombinanten Plasmid pZS-7/31-2 [DSM 5528] transformiert waren) in normalen Mäusen (Mäusestamm C57 BL/6) die Bildung von protektiven polyklonalen Antikörpern induziert. Werden diese Antikörper Scid-Mäusen verabreicht, wird ein Schutz gegen die Lyme-Borreliose bewirkt. Dabei wird festgestellt, daß rekombinantes OspA eine mit nativem OspA vergleichbare protektive Immunantwort induziert. Das Ergebnis und die Details der Versuchsdurchführung bei diesem Experiment sind in Tabelle 4 angegeben. Die Gewinnung von rekombinanten OspA ist in Beispiel 3 angegebenEffect of antiserum from OspA immunized mice on the course of Lyme disease in scid mice In this experiment, it was demonstrated that administration of native OspA (isolated from B. burgdorferi ZS-7) or recombinant OspA (isolated from E coli bacteria transformed with the recombinant plasmid pZS-7 / 31-2 [DSM 5528]) in normal mice (mouse strain C57 BL / 6) induced the formation of protective polyclonal antibodies. When these antibodies are administered to scid mice, protection is provided against Lyme disease. It is found that recombinant OspA induces a protective immune response comparable to native OspA. The result and the details of the experiment in this experiment are shown in Table 4. The recovery of recombinant OspA is given in Example 3

Die Gewinnung von nativem OspA sowie die Immunisierung der Mäuse mit OspA geschah wie folgt: The recovery of native OspA and the immunization of the mice with OspA were as follows:

Anreicherung von nativem 31 kDa OspAEnrichment of native 31 kDa OspA

3,2x 10¹⁰ Spirochäten werden für zwei Stunden bei4°Cin 5ml PBS/7,5ml n-Butanol in Gegenwart von Proteaseinhibitoren (5mmol/l EDTA, 5mmol/l Benzamidin und 0,5mmol/l PMSF) auf dem Magnetrührer gerührt. Danach wird das Gemisch für 90 Minuten bei 10000rpm und 4°C in der Sorvall-Zentrifuge (Festwinkelrotor) zentrifugiert. Die wäßrige Phase, die die Oberflächenproteine enthält, wird abgenommen und dreimal mit Chloroform gewaschen. Der Proteingehalt wird über die Extinktion bei 280 nm bzw. mit dem BCA-Test bestimmt.3.2x 10 ¹⁰ spirochetes are stirred for 2 hours at 4 ° C in 5ml PBS / 7.5ml n-butanol in the presence of protease inhibitors (5mmol / l EDTA, 5mmol / l benzamidine and 0.5mmol / l PMSF) on the magnetic stirrer. Thereafter, the mixture is centrifuged for 90 minutes at 10000rpm and 4 ° C in the Sorvall centrifuge (fixed angle rotor). The aqueous phase containing the surface proteins is taken off and washed three times with chloroform. The protein content is determined by the extinction at 280 nm or by the BCA test.

Im Silbergel bzw. Westernblot mit anti-B, burgdorferi Kaninchenserum wurden für Stamm ZS7 eine Hauptbande im Molekulargewichtsbereich von 31 kDa sowie schwache Banden bei 20, 34 und 65-68 kDa gefunden. Die Butanol/Wasser-Präparation von B. burgdorferi-Stamm B31 ergab eine Hauptbande bei 31 kDa sowie schwache Banden bei 20 und 34kDa.In the silver gel or Western blot with anti-B, burgdorferi rabbit serum, a major band in the molecular weight range of 31 kDa and weak bands at 20, 34 and 65-68 kDa were found for strain ZS7. The butanol / water preparation of B. burgdorferi strain B31 gave a major band at 31 kDa and weak bands at 20 and 34 kDa.

Immunisierung von Mäusen mit nativem und rekombinantem OspAImmunization of mice with native and recombinant OspA

C57BL6bzw. C.B-17 Mäusen wurde 3x im Abstand von 7 bis 10 Tagen 5pg (natives OspA von Stamm B31) bzw. Юцд (natives OspA von Stamm ZS7, rekombinantes OspA von ZS7) in 100μΙ Adjuvant (ABM3; Fa. Sebak, Aidenbach, BRD) subkutan in die Schwanzwurzel gegeben. Frühestens 3 Wochen nach der letzten Immunisierung konnte für 3 bis 4 Monate Serum abgenommen werden. Der Gehalt an spezifischen Antikörpern wird im ELISA-System bestimmt.C57BL6bzw. CB-17 mice were 5x 3 times at intervals of 7 to 10 days (native OspA of strain B31) or Юцd (native OspA of strain ZS7, recombinant OspA of ZS7) in 100μΙ adjuvant (ABM3, Fa. Sebak, Aidenbach, FRG). given subcutaneously in the tail root. At the earliest 3 weeks after the last immunization serum could be taken for 3 to 4 months. The content of specific antibodies is determined in the ELISA system.

Tabelle 4Table 4

Effekt von B. burgdorferi-spezifischen monoklonalen und polyklonalen Antikörpern auf die Spirochätose und Entwicklung der Arthritis in mit B. burgdorferi infizierten Scid-MäusenEffect of B. burgdorferi specific monoclonal and polyclonal antibodies on spirochetosis and development of arthritis in B. burgdorferi infected scid mice

Entwicklung von Arthritis Nachweis von nachWoche(n) B. burgdorferiDevelopment of arthritis Evidence of after-week (s) B. burgdorferi

1 21 2

- 0/3- 0/3

- 0/3- 0/3

Erster Antikörpertransfer i.p. (ΙΟΟμΙ) Tag 0 (Tag der Inokulation mit B. burgdorferi ZS-7,1x 10⁸ Organismen, s.с in die Schwanzwurzel).First antibody transfer ip (ΙΟΟμΙ) day 0 (day of inoculation with B. burgdorferi ZS-7,1x 10 ⁸ organisms, s.s in the tail root).

Weitere Antikörpertransfers Tag 4 (100μΙ), Tag 7 (200μΙ), Tag 11 (200μΙ), Tag 14 (300μΙ), Tag 18 (300μΙ), (i.p.).Further Antibody Transfers Day 4 (100μΙ), Day 7 (200μΙ), Day 11 (200μΙ), Day 14 (300μΙ), Day 18 (300μΙ), (i.p.).

Mäusestammmouse strain Behandlungtreatment C.B.-17ScidC. B.-17Scid mitWith (Anzahl der Mäuse)(Number of mice) n = 6n = 6 PBS (negative Kontrolle)PBS (negative control) n = 6n = 6 LA-2LA-2 n = 2n = 2 anti OspA(nativ) IMSanti OspA (native) IMS n = 3n = 3 anti OspA (recomb.) IMSanti OspA (recomb.) IMS

Claims (28)

1. Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, dadurch gekennzeichnet, daß er einen oder mehrere monoklonale Antikörper enthält, die spezifisch für das 31 kD Antigen (OspA) oder das 34 kD Antigen (OspB) von B. burgdorferi sind.A vaccine against Lyme disease, characterized in that it contains one or more monoclonal antibodies specific for the 31 kD antigen (OspA) or the 34 kD antigen (OspB) of B. burgdorferi. 2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper spezifisch für das 31 kD oder das 34kD Antigen von B. burgdorferi der Stämme ZS7 (DSM 5527) oder/und B31 (ATCC35210)ist.2. A vaccine according to claim 1, characterized in that the antibody is specific for the 31 kD or the 34kD antigen of B. burgdorferi strains ZS7 (DSM 5527) or / and B31 (ATCC35210). 3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er einen monoklonalen Antikörper der Klasse IgG, vorzugsweise der Subklasse IgG 2 b oder IgG 1, als Wirkstoff enthält.3. A vaccine according to claim 1 or 2, characterized in that it contains a monoclonal antibody of class IgG, preferably of the subclass IgG 2 b or IgG 1, as an active ingredient. 4. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß er in immundefizienten Versuchstieren, die mit lebensfähigen pathogenen B. burgdorferi-Organismen infiziert wurden, die Ausbildung von Arthritis, Carditis und Hepatitis verhindert.4. Vaccine according to one of claims 1 to 3, characterized in that it prevents the formation of arthritis, carditis and hepatitis in immunodeficient experimental animals that have been infected with viable pathogenic B. burgdorferi organisms. 5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er in immundefizienten Scid-Mäusen, die mit lebensfähigen B. burgdorferi-Organismen, Stamm ZS7, infiziert wurden, die Ausbildung von Arthritis, Carditis und Hepatitis weitgehend verhindert.5. A vaccine according to any one of claims 1 to 4, characterized in that in immunodeficient scid mice, which were infected with viable B. burgdorferi organisms, strain ZS7, the formation of arthritis, carditis and hepatitis largely prevented. 6. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffs gegen die Lyme-Krankheit aus Lymphozyten oder Milzzellen eines Versuchstiers, vorzugsweise einer Maus, die mit B. burgdorferi-Organismen oder Teilen davon immunisiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Lymphozyten oder Milzzellen-Zellfusion ein Hybridom gewinnt, das einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5 produziert.6. A method for obtaining a vaccine against Lyme disease from lymphocytes or spleen cells of an experimental animal, preferably a mouse, which is immunized with B. burgdorferi organisms or parts thereof, characterized in that a hybridoma is obtained from lymphocytes or spleen cell cell fusion which produces a monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 5. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung komplette B. burgdorferi B31 oder/und ZS7 Organismen verwendet werden.7. The method according to claim 6, characterized in that are used for immunization complete B. burgdorferi B31 or / and ZS7 organisms. 8. Monoklonaler Antikörper LA2 gegen OspA, sekretiert von der Hybridoma-Zellinie, ECACC 89091302.8. Monoclonal antibody LA2 against OspA secreted by the hybridoma cell line, ECACC 89091302. 9. Monoklonaler Antikörper LA26.1 gegen OspA, sekretiert von der Hybridoma-Zellinie, ECACC 90050406.9. Monoclonal antibody LA26.1 to OspA secreted by the hybridoma cell line, ECACC 90050406. 10. Monoklonaler Antikörper LA25.1 gegen OspB, sekretiert von der Hybridoma-Zellinie, ECACC 90050405.10. Monoclonal antibody LA25.1 to OspB secreted by the hybridoma cell line, ECACC 90050405. 11. Monoklonaler Antikörper LA 27.1 gegen OspB, sekretiert von der Hybridoma-Zellinie, ECACC 90050407.11. Monoclonal antibody LA 27.1 to OspB secreted by the hybridoma cell line, ECACC 90050407. 12. Pathogener B. burgdorferi Stamm ZS7, DSM 5527.12. Pathogenic B. burgdorferi strain ZS7, DSM 5527. 13. Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Antikörper gegen OspA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 immunreagiert.13. antigen, characterized in that it is immunoreacted with an antibody against OspA according to any one of claims 1 to 5. 14. Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Antikörper gegen OspB nach einem der Ansprüche 1 bis 5 immunreagiert.14. antigen, characterized in that it is immunoreacted with an antibody against OspB according to one of claims 1 to 5. 15. Antigen nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß sich die dafür kodierende DNA-Sequenz auf einem Vektor, vorzugsweise einem prokaryontischen Vektor befindet, der geeignet zur Proteinexpression ist.15. An antigen according to claim 13 or 14, characterized in that the DNA sequence coding therefor is located on a vector, preferably a prokaryotic vector, which is suitable for protein expression. 16. Antigen nach Anspruch 13 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Aminosäuresequenz oder ein immunogenes Epitop aus dieser Sequenz enthält:16. An antigen according to claim 13 or 15, characterized in that it contains the following amino acid sequence or an immunogenic epitope from this sequence: mkkyllgi gli lali ackqn
vssl deknsvsvdlpgemnv
lvskeknkdgkydli atvdk
lelkgtsdknngsgvlegvk
adkskvklti sddlgqttle
vfkedgktlvskkvtskdksmkkyllgi gli lali ackqn
vssl deknsvsvdlpgemnv
lvskeknkdgkydli atvdk
lelkgtsdknngsgvlegvk
adkskvklti sddlgqttle
vfkedgktlvskkvtskdks STEEKFNEKGEVSEKI I TRA DGTRLEYTEI KSDGSGKAKE VLKSYVLEGTLTAEKTTLVV KEGTVTLSKNI SKSGEVSVE L NDTDSSAATKKTAAWNSGT STLTI TVNSKKTKDLVFTKE NTI TVQQYDSNGTKLEGSAV El TKLDEl KNALK*STEEKFNEKGEVSEKI I TRA DGTRLEYTEI KSDGSGKAKE VLKSYVLEGTLTAEKTTLVV KEGTVTLSKNI SKSGEVSVE L NDTDSSAATKKTAAWNSGT STLTI TVNSKKTKDLVFTKE NTI TVQQYDSNGTKLEGSAV El TKLDEl KNALK * 17. Antigen nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ein ß-Galactosidase-Fusionsprotein oder ein Nicht-Fusionsprotein ist.17. An antigen according to any one of claims 13 to 16, characterized in that it is a ß-galactosidase fusion protein or a non-fusion protein. 18. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Antigen nach einem der Ansprüche 13,15,16 oder 17 kodiert und (1) die im folgenden dargestellte Nukleinsäuresequenz, (2) eine ihr im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Sequenz oder (3) eine mit einer Sequenz aus (1) oder/und (2) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Sequenz enthält:18. Recombinant DNA, characterized in that it encodes an antigen according to any one of claims 13,15,16 or 17 and (1) the nucleic acid sequence shown below, (2) a sequence corresponding thereto within the scope of the degeneracy of the genetic code or (3) a sequence which hybridizes with a sequence of (1) or / and (2) under stringent conditions: atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaat gttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaaogtt cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaag cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa gttttcaaagaagacggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagca gacggaaccagacctgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagag gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggtt aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaa cttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaa aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagtt gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataaatgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaat gttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttcagtagatttgcctggtgaaatgaaogtt cttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaag cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaa gctgacaaaagtaaagtaaaattaacaatttctgacgatctaggtcaaaccacacttgaa gttttcaaagaagacggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtca tcaacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagca gacggaaccagacctgaatacacagaaattaaaagcgatggatctggaaaagctaaagag gttttaaaaagctatgttcttgaaggaactttaactgctgaaaaaacaacattggtggtt aaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagtttcagttgaa cttaatgacactgacagtagtgctgctactaaaaaaactgcagcttggaattcaggcact tcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaa aacacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagtt gaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacgctttaaaataa 19. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine oder mehrere Kopien einer rekombinanten DNA nach Anspruch 18 enthält.19. Recombinant vector, characterized in that it contains one or more copies of a recombinant DNA according to claim 18. 20. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er ein prokaryontischer Vektor ist.20. Recombinant vector according to claim 19, characterized in that it is a prokaryotic vector. 21. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist.21. Recombinant vector according to claim 20, characterized in that it is a plasmid. 22. Rekombinanter Vektor pZS-7/31-2 (DSM 5528).22. Recombinant Vector pZS-7 / 31-2 (DSM 5528). 23. Verfahren zur Gewinnung von Antigenen nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man eine B. burgdorferi-Genbank mit einem oder mehreren Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 5 untersucht und die Klone isoliert, welche mit dem oder den Antikörpern eine positive Immunreaktion zeigen.23. A method for obtaining antigens according to any one of claims 13 to 17, characterized in that one examines a B. burgdorferi gene bank with one or more antibodies according to one of claims 1 to 5 and the clones isolated, which with the antibody or antibodies show a positive immune reaction. 24. Aktiver Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit, gekennzeichnet durch ein oder mehrere Antigene nach einem der Ansprüche 13 bis 17 als Wirkstoff, gegebenenfalls mit üblichen Träger-, Füll- und Hilfsstoffen.24. Active vaccine against Lyme disease, characterized by one or more antigens according to any one of claims 13 to 17 as active ingredient, optionally with conventional carriers, fillers and excipients. 25. Impfstoff nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen auf gentechnologische Weise gewinnt.25. A vaccine according to claim 24, characterized in that the antigen is obtained by genetic engineering. 26. Verfahren zur Gewinnung eines Impfstoffs gegen die Lyme-Krankheit, dadurch gekennzeichnet, daß man Versuchstiere, vorzugsweise Mäuse mit einem Antigen nach einem der Ansprüche 13 bis 17 immunisiert und aus dem immunisierten Versuchstier auf übliche Weise protektive, polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen OspA oder/und OspB gewinnt.26. A method for obtaining a vaccine against Lyme disease, characterized in that one immunizes experimental animals, preferably mice with an antigen according to any one of claims 13 to 17 and from the immunized animal in the usual way protective, polyclonal or monoclonal antibodies against OspA or / and OspB wins. 27. Verfahren zur isolierung und Rekultivierung von pathogenen B. burgdorferi-Organismen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus immundefizienten Versuchstieren, vorzugsweise Mäusen, die zuvor mit dem Erreger infiziert wurden, den Erreger gewinnt, wobei die Pathogenität des Erregers erhalten bleibt.27. A process for the isolation and recultivation of pathogenic B. burgdorferi organisms, characterized in that from immunodeficient animals, preferably mice, which were previously infected with the pathogen, the pathogen wins, the pathogenicity of the pathogen is maintained. 28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man pathogene B. burgdorferi ZS7-0rganismen aus Blut oder/und Gelenken von infizierten Scid-Mäusen gewinnt.28. The method according to claim 27, characterized in that one obtains pathogenic B. burgdorferi ZS7-0rganismen from blood and / or joints of infected scid mice.