DD295167A5 - Method for producing monoclonal antibodies against sperm-specific antigens in the molecular weight range around 30 km kDa - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen spermaspezifische Antigene im Molekulargewichtsbereich um 30 kDa. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Kriminalistik, Gerichtsmedizin und medizinische Diagnostik. Das erfindungsgemaesze Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz man zunaechst in an sich bekannter Weise Milzzellen von BALB/c-Maeusen, die mit Spermaplasmaantigenen immunisiert wurden, mit BALB/c-Myelomzellen fusioniert, die antikoerperproduzierenden Hybridome mit einem Enzymimmunoassay selektioniert und erfindungsgemaesz zur Produktion der monoklonalen Antikoerper durch Kultivierung oder Transplantation einsetzt. Die spezifischen Hybridom-Zellinien wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle am 13. 2. 1990 unter den Nummern{Antigene, spermaspezifische; Antikoerper, monoklonale ; Enzymimmunoassay; Spermanachweis; Differentialdiagnose; Prostatakarzinom; Kriminalistik; Gerichtsmedizin; Diagnostik, medizinische}The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies against sperm-specific antigens in the molecular weight range by 30 kDa. Areas of application of the invention are criminalistics, forensic medicine and medical diagnostics. The method according to the invention is characterized in that, in a manner known per se, spleen cells of BALB / c mice immunized with sperm plasma antigens are fused with BALB / c myeloma cells, the antibody-producing hybridomas are selected with an enzyme immunoassay and according to the invention for the production of the monoclonal antibodies Antibodies through cultivation or transplantation. The specific hybridoma cell lines were identified at the ZIM Depository on February 13, 1990 as {antigens, sperm-specific; Antibodies, monoclonal; enzyme immunoassay; Semen evidence; Differential diagnosis; prostate cancer; forensics; Forensic Medicine; Diagnostics, medical}

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen epermaspez'fische Antigene. Awendungsgebiete der Erfindung sind die Kriminalistik, Gerichtsmedizin und die medizinische Diagnostik.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies against epermaspez'fische antigens. Areas of application of the invention are forensics, forensic medicine and medical diagnostics.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Seit längerem sind Versuche zur Herstellung von Anti-Sperma-Seren bekannt, die im Sperma vorhandene, für dieses Material spezifische Antigene in angetrocknetem denaturiertem Material nachweisen (H. Suyama, H. Sawada, Dtsch. Zschr. gerichtl. Med.For some time now, attempts have been made to produce anti-sperm sera which detect sperm-specific antigens which are specific for this material in dried denatured material (H. Suyama, H. Sawada, Dsch. Zschr. Gerichtl. Med.

1963,53,175-185; W. Klumpen, Diss. Marburg, 1967; A.Rambow, Diss., Mainz, 1978). Derartige polygonale Antiseren ergeben jedoch Kreuzreaktionen mit anderen Körpersekreten, wie Nasensekret oder Speichel, die auf das Vorhandensein ubiquitär verbreiteter Proteine im menschlichen Organismus zurückzuführen sind (H. Schmechta, B. Kopetz, H. Schlosser, Krimin, for Wiss., 1982,47,75-85; H. Wissel, W. Frigin, Krimin, for Wies., 1986,63/64,237). Die wesentliche Voraussetzung für die Erzeugung monospezifischer polyklonaler Antiseren wurde mit der Isolierugn des spermaspezifischen Proteins „P30", einem aus dem Prostatasekret stammenden Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 30000, geschaffen (G.F.Sensabaugh, J. For.1963,53,175-185; W. Klumpen, Diss. Marburg, 1967; A. Rambow, Diss., Mainz, 1978). However, such polygonal antisera give cross-reactions with other body secretions, such as nasal secretions or saliva, which are due to the presence of ubiquitous proteins in the human body (H. Schmechta, B. Kopetz, H. Schlosser, Krimin, for Wiss., 1982, 47, 75-85, H. Wissel, W. Frigin, Krimin, for Wies., 1986, 63/64, 237). The essential prerequisite for the generation of monospecific polyclonal antisera has been provided by the isolation of the sperm specific protein "P30", a prostatic gastrin-derived glycoprotein having a molecular weight of about 30,000 (G.F.Sensabaugh, J. For.

Sei., 1978,23,106-115). „P30" ist, bezogen auf andere Organismen, nur noch im Sperma subhumaner Primaten vorhanden. Im weiblichen Organismus wurde es bisher nicht nachgewiesen. Seine Konzentration im humanen Spermaplasma wurde im Bereich zwischen 0,15mg/ml und 5,9mg/ml bestimmt (E.T. Blake, M.Gibbons. G.F.Sensabaugh, J.Bashinski, 1981, J. For. Sei.Sci., 1978, 23, 106-115). "P30", relative to other organisms, is present only in the semen of subhuman primates, but has not been detected in the female organism and its concentration in the human seminal plasma has been determined to be between 0.15 mg / ml and 5.9 mg / ml (ET Blake, M. Gibbons, GFSensabaugh, J.Bashinski, 1981, J. For.

Soc.,22,318).Soc., 22.318).

Im Serum gesunder Männerwurden Konzentrationen um 0,5ng/ml, bei Prostata-Tumoren um 25ng/ml bestimmt (M.Kuriyama, )/ Prostate, 1986,8,301-311).Concentrations of 0.5ng / ml were determined in the serum of healthy men and 25ng / ml in prostate tumors (M.Kuriyama,) / Prostate, 1986, 8, 311-311).

Im Urin soll es auf Grund des Gehaltes geringer Mengen an Prostatasekret in Konzentrationen von durchschnittlich 260ng/ml vorhanden sein (H.C.Graves, G.F.Sensabaugh, E.T.Blake, N. Engl. J. Med!, 1985,312-338-343).It should be present in the urine due to the content of small amounts of prostatic fluid at an average concentration of 260ng / ml (H.C. Graves, G.F.Sensabaugh, E.T.Blake, N. Engl. J. Med !, 1985, 313-338-343).

Es ist dabei nicht sicher auszuschließen, daß eine Reihe von Proteinen, die von anderen Autoren beschrieben werden und ein ähnliches Molekulargewicht aufweisen, wie das „Gamma-Seminoprotein" (M. Hara, Y. Koyanagi, T. Inoue, T. Fukuyama, Jpn. J.It is not certain that a number of proteins that are described by other authors and have a similar molecular weight, such as the "gamma-seminoprotein" (M.Hara, Y. Koyanagi, T. Inoue, T. Fukuyama, Jpn J.

Leg. Med., 1971,25,322-324), das „Protein E₁" (T. S. Li, C. Behling, Fertil. Steril., 1973,24,134-144) oder das »Prostataspezifische Antigen/PSA" (M.C.Wang, L.A.Valenzuela, G.P.Murphy, T.M.Chu, Invest. Urol., 1979,159-163), mit dem „P30"-Antigen identisch sind.Leg. Med., 1971, 25, 322-324), the "Protein E ₁ " (TS Li, C. Behling, Fertil. Sterile., 1973, 24, 134-144) or the "Prostate-Specific Antigen / PSA" (MCWang, LAValenzuela, GP Murphy, TMChu, Invest., Urol., 1979, 1559-163), are identical to the "P30" antigen.

Weitere spermaspezifische Proteine wurden im Molekulargewichtsbereich zwischen 10000 und 17000 beschrieben (H.Lilja, P.A.Abrahamson, Prostate, 1988,12,29-38).Additional sperm specific proteins have been described in the molecular weight range between 10,000 and 17,000 (H. Lilja, P.A. Abrahamson, Prostate, 1988, 12, 29-38).

Monoklonal Antikörper gegen verschiedene Spermaantigene wurden bereits gewonnen und vor allem in der Tumorforschung eingesetzt. Zum Teil konnte ihre prinzipielle Eignung auch für spurenkundliche Untersuchungen bestätigt werden. Die Spezifität derartiger Antikörper wurca mit „Anti-PSA" (Amersham Product Specification, DA. 112620, Nov. 1985), .Anti-PA" (A.Tsutsumi, Y.Yamamoto, H.lshizu, Act. Crim. Japan 1988,54,239-246) bzw. „Anti-P30" (Firma Hybritech/USA L.Kamenev, M.Leclerg, Ch. Francois-Gerard, J. For. Sei. Scr 1989,29,233-241) bezeichnet.Monoclonal antibodies to various sperm antigens have already been obtained and used primarily in tumor research. In part, their basic suitability could also be confirmed for cognitive investigations. The specificity of such antibodies has been termed "anti-PSA" (Amersham Product Specification, DA, 112620, Nov. 1985), "anti-PA" (A.Tsutsumi, Y. Yamamoto, H. Lshizu, Act., Crim., Japan, 1988; 54,239-246) or "Anti-P30" (Hybritech / USA L.Kamenev, M.Leclerg, Ch. Francois-Gerard, J. For. Sci. 1989,29,233-241).

Es steht heute außer Zweifel, daß & erschiedene monoklonal Antikörper gleicher nomineller Spezifität, d. h. selbst wenn sie gegen ein und dasselbe Antigen gerichtet sind, in der Feinstruktur ihrer Epitope sowie in ihren weiteren Eigenschaften, die für ihre Eignung in einem bestimmten Test wichtig sein können, unterscheiden. Ein kommerziell vertriebenes Testsystem zum Nachweis spermaspezifischer Antigene im Molekulargewichtsbereich um 3OkDa aus kriminalistisch relevanten biologischen Spuren gibt es bisher nicht.It is beyond doubt today that & that different monoclonal antibodies of the same nominal specificity, i. H. even if they are directed against one and the same antigen, differing in the fine structure of their epitopes as well as in their further properties, which may be important for their suitability in a particular test. A commercially distributed test system for the detection of sperm-specific antigens in the molecular weight range around 3OkDa from kriminalistisch relevant biological traces are not yet.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, monoklonal Antikörper gegen spermaspezifische Antigene im Molekulargewichtsbereich um 30000 zu erzeugen. Diese monoklonalen Antikörper sollen für den Aufbau von Enzymlmmu.n^ssays zum Nachweis von Antigenen in denaturiertem, angetrocketem Sperma und somit zur Identifizierung kriminalistisch relevanter Spermaspuren geeignet sein. Darüber hinaus sollen die Antikörper zur Differentialdiagnose von Prostatakarzinomen geeignet sein.The aim of the invention is to generate monoclonal antibodies against sperm-specific antigens in the molecular weight range around 30,000. These monoclonal antibodies should be suitable for the construction of enzyme immunoassays for the detection of antigens in denatured, dry semen and thus for the identification of cristally relevant sperm traces. In addition, the antibodies should be suitable for the differential diagnosis of prostate cancer.

Darlegung de* We»ent der ErfindungPresentation of the invention

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellug von monoklonalen Antikörpern gegen spermaspezifische Antigene ist dadurch gekennzeichnet, daß man (in bekannter Weise) zunächst Milzzellen von BALB/c-Mäusen, die mit durch Ammoniumsulfatfällung fraktioniertem Spermaplasma immunisiert wurden, mit Zellen der Maus-Myelorruellinie X63-Ag 8.653 fusioniert und die erhaltenen Hybridome in einem geeigneten Selektivmedium selektioniert.The method according to the invention for the production of monoclonal antibodies against sperm-specific antigens is characterized in that (1) spleen cells of BALB / c mice immunized with ammonium sulfate precipitated sperm plasma (in known manner) with cells of the mouse myelorruceline X63-Ag 8.653 fused and the resulting hybridomas selected in a suitable selective medium.

Die antikörperproduzierenden Hybridome werden mit einem Enzymimmunoassay nachgewiesen, der folgendermaßen durchgeführt wird:The antibody-producing hybridomas are detected by an enzyme immunoassay, which is carried out as follows:

Aus auf Baumwollappen angetrocknetem Sperma, 4-10 Wochen als Spermaflecken gelagert, wird mit Bicarbonatpuffer (pH - 9,6) ein Eluat hergestellt. Das Eluat, dem eine Verdünnung des Nativspermas von etwa 1:1000 entspricht, wird an Mikrotestplatten gebunden. Danach erfolgt eine Inkubation mit dem Kulturüberetand der Hybridome,·. ine weitere Inkubation mit phosphatase-konjugiertem Anti-Maus-Ig und anschließende Farbreaktion mit p-Nitrophenylphosphat. Die Extinktion wird bei 405 nm gemessen. Parallel dazu werden die antikörperproduzierenden Hybridome in Enzymimmunoassays, bei denen Eluate aus Speichel-, Vaginal- und Nasensekretflecken und aus angetrocknetem humanen Serum an Mikrotestplatten gebunden sind, geprüft.From sperm dried on cotton cloth, stored as sperm stains for 4-10 weeks, an eluate is prepared with bicarbonate buffer (pH - 9.6). The eluate, which is approximately 1: 1000 dilution of native sperm, is bound to microtest plates. This is followed by incubation with the culture Überetand the hybridomas, ·. further incubation with phosphatase-conjugated anti-mouse Ig and subsequent color reaction with p-nitrophenyl phosphate. The absorbance is measured at 405 nm. In parallel, the antibody-producing hybridomas are tested in enzyme immunoassays in which eluates from salivary, vaginal and Nasensekretflecken and dried on human serum are bound to microplates.

Die nur mit Sperma reagierenden Hybridome werden kloniert, weitervermehrt, zur Reserve in flüssigem Stickstoff gelagert und erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper durch Kultivierung oder nach Transplantation herangezogen.The only sperm-responsive hybridomas are cloned, propagated, stored for reserve in liquid nitrogen and used according to the invention for the production of monoclonal antibodies by cultivation or after transplantation.

Die für die erfindungsgemäße Antikörperproduktion eingesetzten Hybridome wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle am 13.2.1990 unter folgenden NummernThe hybridomas used for antibody production according to the invention were in the ZIM depository on 13.2.1990 under the following numbers

ZIM-0510IA67-B/E3)ZIM-0510IA67-B / E3)

ZIM0509(A67-C/F10)ZIM0509 (A67-C / F10)

hinterlegt.deposited.

Durch die Erfindung wird die Produktion von zwei monoklonalen Antikörpern möglich, die mit spermaspezifischen Antigenen reagieren. Die Spezifität der Antikörper wurde nachgewiesen durch Enzymimmunoassays unter der Verwendung von potentiell kreuzreagierenden Materialien als Zielantigene, Inhibitionstests mit Antikörpern definierter Spezifität, Immuno-Blot-Tests und ir.^Tiunhistochemischen Untersuchungen.The invention enables the production of two monoclonal antibodies that react with sperm specific antigens. The specificity of the antibodies has been demonstrated by enzyme immunoassays using potential cross-reactive materials as target antigens, specificity antibody-specific inhibition assays, immunoblot assays, and immunohistochemistry assays.

Die von den Hybridomen A 67-B/E 3 und A67-C/F10 produzierten monoklonalen Antikörper reagieren im Enzymimmunoassay nicht mit kriminalistisch relevanten Materialien wie Speichel, Vaginalsekret, Nasensekret, Blut oder Gemischen aus diesen Materialien.The monoclonal antibodies produced by the hybridomas A 67-B / E 3 and A67-C / F10 do not react in the enzyme immunoassay with criminally relevant materials such as saliva, vaginal secretions, nasal secretions, blood or mixtures of these materials.

Im Immunoblot wurde festgestellt, daß beide monoklonale Antikörper mit einem in Sparmaplasma auftretenden 30kDa-Protein reagieren. Der vom Hybridom A67-C/F10 produzierte mAK reagiert außerdem noch mit weiteren Proteinen.In the immunoblot it was found that both monoclonal antibodies react with a 30 kDa protein occurring in sparmaplasma. The mAb produced by the hybridoma A67-C / F10 also reacts with other proteins.

Die Isotypen der beiden monoklonalen Antikörper wurden ale IgG 1 (A 67 - B/E 3) bzw. IgM (A67 - C/F10) ermittelt.The isotypes of the two monoclonal antibodies were all IgG 1 (A 67 - B / E 3) or IgM (A67 - C / F10) determined.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind für den Aufbau eines Enzymimmunoassays zum Spermanachweis in kriminalistisch relevanten Spuren gut geeignet. Außerdem sind sie zur immunhistologischen Verifizierung der Gewebsherkunft von Prostatatumoren und zum Nachweis von prostataspezifischen Antigenen im Serum von Patienten mit Prostatakarzinom einsetzbar.The monoclonal antibodies of the invention are well suited for the construction of an enzyme immunoassay for sperm detection in criminally relevant lanes. In addition, they can be used for immunohistological verification of the tissue origin of prostate tumors and for the detection of prostate-specific antigens in the serum of patients with prostate cancer.

Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail by an embodiment.

Ausführungsbeispielembodiment

1. Herstellung der Hybridome1. Preparation of hybridomas

BALB/c-Mäuse wurden mit dem durch Ammoniumsulfatfällung aus geporitem Spermaplasma hergestellten Antigonpräparat immunisiert. Milzzellen dieser Mäuse wurden mit Maus-Myelomzellen der Zellinie X63-Ag'8.653 (Karney, J. F. et al.; J. Immunol. 123,1548,1979) mittels Polyethylenglykol fusioniert (Peters, H. H., et al.: .Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Springer, Berlin, 1985).BALB / c mice were immunized with the antisense preparation prepared by ammonium sulfate precipitation from geporitized seminal plasma. Spleen cells of these mice were fused with mouse myeloma cells of the cell line X63-Ag'8.653 (Karney, JF et al., J. Immunol., 123, 1548, 1979) using polyethylene glycol (Peters, HH, et al .: Monoclonal Antibody, Preparation and Characterization ", Springer, Berlin, 1985).

2. Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome erfolgte in einem Enzymimmunoassay. Dazu wurden Mikrotiterplatten mit Eluaten aus angetrockneten Spermaflecken, entsprechend einer Natlvspermaverdünnung von etwa 1:1000 sowie Fleckeneluaten potentiell kreuzreagierender Körpermsterlalien wie Speichel und Blut mit Bicarbonatpuffer (pH = 9,6) über Nacht beladen. Danach wurde mit PBS-Tween-20 Lösung gewaschen und die Kulturüberstände unverdünnt sowie 1:2 verdünnt zugegeben (Inkubationszeit: 90 Minuten, 25⁰C). Nach erneutem Waschen wurde 90 Minuten bei 25°C mit phosphatasekonjugiertem Anti-Maus-Ig inkubiert. An ein weiteres Waschen schloß sich die Zugabe von 50μΙ Substratlösung (1 mg P-Nitrophenylphosphat/1 ml Diethanolamin-Pufferlösung) zu jedem Napf an.2. Selection of antibody-producing hybridomas was carried out in an enzyme immunoassay. For this purpose, microtiter plates were loaded with eluates from dried-on sperm stains, corresponding to a Natlvspermaverdünnung of about 1: 1000 and Fleckeneluaten potentially cross-reacting Körpermsterlialien such as saliva and blood with bicarbonate buffer (pH = 9.6) overnight. It was then washed with PBS-Tween-20 solution and the culture supernatants undiluted and diluted 1: 2 added (incubation time: 90 minutes, 25 ⁰ C). After washing again, it was incubated with phosphatase-conjugated anti-mouse Ig for 90 minutes at 25 ° C. Further washing was followed by the addition of 50μΙ substrate solution (1 mg P-nitrophenyl phosphate / 1 ml diethanolamine buffer solution) to each well.

Die resultierende Extinktion wurde nach 30 Minuten bei 405 nm gemessen (SUMAL PE 1, VEB Carl-Zeiss Jena).The resulting absorbance was measured after 30 minutes at 405 nm (SUMAL PE 1, VEB Carl Zeiss Jena).

3. Spezifitätsnachwels der selektionierten monoklonalen A ntikörper.3. Specificity detection of the selected monoclonal antibodies.

Die Spezifität der selektierten monoklonalen Antikörper wurde weiterhin durch Inhibitionstests mit einem monoklonalen Antikörper der definierten nominellen Spezifität „Anti-PSA" (Prostataspezifisches Antigen, Firma Amershom) geprüft. Wurde beim Enzymimmunoassay in der unter Punkt 2 genannten Art und Welse gleichzeitig beim Beschichten der Mikrotiterplatten mit Spermaantigen 50 μΙ des monoklonalen Anti-PSA-Antikörpers zugegeben, so wurde die Bindung des monoklonalen Antikörpers vom Hybridom A67 - C/F 10 abhängig vom Titer des Inhibitations-Antikörpers gehemmt.The specificity of the selected monoclonal antibodies was further tested by inhibition tests with a monoclonal antibody of the defined nominal specificity "anti-PSA" (Prostate Specific Antigen, Amershom Company) at the same time with the enzyme immunoassay in the species and catfish mentioned under point 2 when coating the microtiter plates with Sperm antigen 50 μΙ of the monoclonal anti-PSA antibody added, so the binding of the monoclonal antibody from the hybridoma A67 - C / F 10 was inhibited depending on the titer of the inhibitory antibody.

In ähnlicherWeise wurde eine Inhibition der Bindung der monoklonalen Antikörper der Hybridome A67-B/E3 und A67-C/F10 mittels eines polyklonalen Anti-p30-Antiserums erzielt.Similarly, inhibition of the binding of the monoclonal antibodies of the hybridomas A67-B / E3 and A67-C / F10 was achieved by means of a polyclonal anti-p30 antiserum.

Im Immunoblot reagierten die von den Hybridomen A67- B/E 3 und A67- C/F 10 produzierten mAk mit einem in Spermaplasma auftretenden Protein mit einem Molekulargewicht von 30 kDa, der vom Hybridom A67- C/F 10 produzierte mAk außerdem noch mit weiteren Proteinen.In the immunoblot, the mAbs produced by the hybridomas A67-B / E 3 and A67-C / F 10 reacted with a protein occurring in seminal plasma with a molecular weight of 30 kDa, and the mAb produced by the hybridoma A67-C / F 10 also with others proteins.

4. Isotypen4. Isotypes

Die Isotypen der beiden monoklor.alen Antikörper wurden als IgGI (A 67-B/E 3) bzw. IgM (A67-C/F10) ermittelt.The isotypes of the two monoclonal antibodies were determined as IgGI (A 67-B / E 3) or IgM (A67-C / F10).

5. Gewinnung der Antikörper5. Obtaining the antibodies

Die Gewinnung der monoklonalen Antikörper erfolgte gemäß üblichen Techniken (Peters, H. H., et al.. Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung", Springer, Berlin, 1985) in vitro sowie aus Ascites.The recovery of the monoclonal antibodies was carried out in accordance with conventional techniques (Peters, H.H., et al .. Monoclonal antibodies, production and characterization ", Springer, Berlin, 1985) in vitro and from ascites.

Claims (1)

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen spermaspezifische Antigene im Molekulargewichtsbereich um 3OkDa, erzeugt durcrr Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit ammoniumsulfatfraktioniertem Spermaplasma, Fusion ihrer Milzzellen, Selektion der antikörperproduzierenden Hybridome in einem Selektivmedium, Klonierung und Weitervermehrung der reaktiven Hybridome durch Kultivierung oder Transplantation in Mäuse in der Ascitesform, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung oder Transplantation die Klone A67-B/E3 (ZIM-0510) und A67-C/F10 (ZIM-0509) eingesetzt werden.A method for producing monoclonal antibodies against sperm specific antigens in the molecular weight range around 3OkDa, generated by immunization of BALB / c mice with ammonium sulfate fractionated sperm, fusion of their spleen cells, selection of antibody-producing hybridomas in a selective medium, cloning and propagation of the reactive hybridomas by culturing or transplantation into mice in the form of ascites, characterized in that the clones A67-B / E3 (ZIM-0510) and A67-C / F10 (ZIM-0509) are used for the cultivation or transplantation. Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention