DD289203A5 - Verfahren zur herstellung von adsorbentien fuer immunglobuline - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von selektiven hydrophilen Adsorbentien mit primaeren, sekundaeren oder tertiaeren Aminogruppen. Die Adsorbentien werden durch Copolymerisation von Acrylnitril, Vinylacetat und einem Vernetzer und nachfolgender Umsetzung mit einem Polyalkylenpolyamin hergestellt. Sie koennen zur Abtrennung und/oder Gewinnung von Immunglobulinen der Klasse M aus waesserigen Loesungen eingesetzt werden.{Adsorbens, selektiv; Immunglobulin M; Copolymerisate; Acrylnitril; Vinylacetat; Vernetzer; Polyalkylenpolyamin}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von selektiven Adsorbentien für Immunglobuline der Klasse M (IgM). Diese Adsorbentien können zur Abtrennung und/oder Gewinnung von IgM aus wässerigen Lösungen, insbesondere Blutplasma oder Blutserum in der Medizin, Medizintechnik und IgM-Präpaiation eingesetzt werden.

Charakterisierung des bekannten Standes der Technik

In der Literatur werden Immunadsorbention beschrieben, die zur Bindung bzw. Entfernung von IgM aus Blutplasma bzw. Blutserum geeignet sind (Bensinger, W. I. et al.: „Immunadsorption for removal of A and B bloodgroup antibodies" New Engl. J. Med. 304,160-162 [1981]; Banned, A.D. et al.: „Immunadsorption and renal transplant in two patients with an major ABO incompatibility.". Transplantation 43,909-911 [1987); Osterwalder, B. et al.: .Immunadsorption for removal of anti-A and anti-B bloodgroup antibodies in ABO-incompatible bone marrow transplantation". Blut 53,379-390 [1986]).

Hierbei werden Immunadsorbentien eingesetzt, die durch Kopplung von entsprechenden Antigenen für IgM an Silikatg.anula hergestellt werden. An diesen Adsorbentien binden dann die ,passenden" IgM. Die Herstellung der Adsorbentien ist jedoch kompliziert und aufwendig, so daß diese teuer sind.

Weiterhin ist bekannt, daß Adsorbentien auf Dextranbasis mit Anionenaustauschercharakter, wie z. B. DEAE-Sephadex, zur Präparation von IgM eingesetzt werden können. Diese Adsorbentien zeigen jedoch nur eine geringe Selektivität für IgM, so daß die Präparation von reinem IgM aus Blutserum zusätzlich zur Bindung an die Adsorbentien noch drei weitere Verfahrensschritte umfaßt. Das bekannte Verfahren zur Präparation von IgM ist somit arbeitsaufwendig und kostenintensiv.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein einfacheres und kostengünstigeres Verfahren zur Herstellung von !mmunadsorbentien für IgM aufzuzeigen, wobei die Adsorbentien eine hohe Selektivität für diese Species besitzen sollen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von selektiven Adsorbentien für IgM auf Kunststoff basis zu entwickeln.

Es wurde gefunden, daß die Aufgabe gelöst werden kann, wenn poröse Copolymerisate aus Acrylnitril und Vinylacetat sowie einem Vernetzer hergestellt werden, die dann mit einem α,ω-Polyalkylendiamin der Formel

R₁ = H odor Alkylgruppe, wie CH₃-oder C₂H₅-

umgesetzt werden. Die Umsetzung mit dem Polyalkylendiamin muß dabei so gesteuert werden, daß der Polyacrylnitrilanteil im Copolymerisat nur partiell mit dem Amin reagiert und der Polyvinylacetatanteil gleichzeitig zum Polyvinylalkohol verseift wird. Hierbei entsteht ein Träger mit den folgenden funktioneilen Gruppen:

-CH₂-CH- -CH₀-CH- -CH₂-CH-

/ OH

C=N

Die Matrix des Trägers besitzt demnach ausgeprägte hydrophile Eigenschaften. Ausgangsprodukt für die erfindungsgemäße Lösung war die Feststellung, daß geeignete poröse vernetzte Copolymerisate aus Acrylnitril und Vinylacetat, deren Polyvinylacetat-Anteil zum Polyvinylalkohol verseift wurde, kaum eine unspezifische Adsorption von bioaktiven Materialien aufweisen. Überraschenderweise wurde gefunden, daß selbst bei Einsatz eines polyvinylaromatischen Vernetzers, wie Divinylbenzen, der Träger keine unspezifische Adsorption aufweist, obwohl beispielsweise Styren-Divinylbenzen-Copolymerisate oine ausgeprägte

hydrophobe Wechselwirkung mit bioaktiven Materialien zeigen, die ihrer Natur nach unspezifisch sind.

Als Vernetzer für die erfindungsgemäßen Polymeren können somit alle Polyvinylverbindungen eingesetzt werden, die mit Acrylnitril und Vinylacetat copolymerisieren. Neben den aromatischen Polyvinylverbindungen, wie Divinylbenzen, werden

bevorzugt Derivate der Methacrylsäure wie Ethylenglykoldimethacrylat oder Trimethylolpropantrimethacrylat sowie Derivateder Acrylsäure wie Triacryolyl-S-trihydrotriazin angewendet. Es können jedoch auch Gemische dieser Vernetzer benutztwerden.

Der Vernetzeranteil kann in breiten Grenzen variiert werden. Bevorzugt werden 1-20Ma.-%, bezogen auf die

polyrnerisationsfähige Phase, eingesetzt.

Die Porosität der Matrix kann in bekannter Weise durch Zusatz von Fäll- und/oder Quellmitteln bei der Polymerisation, die sich

inert verhalten, erzeugt werden. Bewährt haben sich als Fällmittel aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Benzingemischeoder längerkettige Alkohole, wie z. B. n-Octylalkohol sowie als Quellmittel aromatische Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Toluen.

Die Menge des verwendeten Inertmittels beträgt bevorzugt 10 bis 60Ma.-%, bezogen auf die Gesamtölphase von Monomeren

und Inertmitteln. Die Porosität dos Copolymerisates kann in weiten Grenzen durch Art und Menge des Inertmittels sowie durchden Varnetzeranteil gesteuert werden.

Durch die Anteile der eingesetzten Comonomeren Acrylnitril und Vinylacetat kann die Hydrophilie der Matrix sowie die Kapazität

der funktioneilen Aminogruppe des Trägers variiert werden. Die polymerisationsfähige Phase enthält bevorzugt 20-89 Ma.-%

Acrylnitril, 10-60Ma.-% Vinylacetat und 1-20Ma.-% Vernetzer. Im Falle des Einsatzes von technischem Divinylbenzen tritt als

weiteres Monomeres Ethylstyren auf. Die Polymerisation wird nach der Methode der Suspensionspolymerisation in bekannter

Weise durchgeführt. Als Suspensionsstabilisator können beispielsweise Zellulosederivate eingesetzt werden. Das Polymerisationsverfahren wird so gesteuert, daß Polymerisatkugeln mit einem Durchmesser von 0,1-0,3 mm erhalten werden. Als Polyalkylendiamine zur Umsetzung des Copolymerisates kommen, ausgehend von der allgemeinen Formel

< . R₁

Ri = H oder Alkylgruppe, wie CHj-oder C₂Hs-

die Verbindungen von Ethylendiamin bis zum Hexamethylendiamin sowie deren Alkylderivate, wie z. B. 3-Dimethylamino-ipropylamin oder 3-Diethylamino-1 -propylamin eingesetzt werden. Die dabei entstehenden schwach basischen Anionenaustauscher besitzen somit als funktioneile Gruppen primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen. Als Reaktionstemperaturen werden bevorzugt 90-140⁰C eingestellt. Die Reaktionszeit liegt, in Abhängigkeit von Porosität, Verneuungsgrad und eingesetztem Amin, bei 2-20 Stunden. Reaktionstemperatur und Zeit werden so gewählt, daß der Acrylnitrilanteil im Copolymerisat maximal nur bis zu 95% umgesetzt wird, d. h., im Infrarotspektrum ist in jedem Falle die C^N-Valenzschwingung bei der Wellenzahl von ca. 2200cm~¹, noch deutlich nachweisbar.

Zum Komplettierung der bei der Behandlung mit dem Polyalkylendiamin ablaufenden hydrolytischen Raktionen wird das Harz lüsgiebig mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen oder im Wechsel mit HCI/NaOH bei Raumtemperatur behandelt und anschließend ebenfalls mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen.

Vor der Anwendung sind die Adsorbentien auf pH-Werte von 5,5 bis 7,5 einzustellen. Zur Entfernung der Proteine aus dem Blutserum oder -plasma können die Adsorbentien darin direkt suspendiert oder als Packung in einer Chromatographiesäule angewendet werden. In beiden Fällen werden die Adsorbentien zunächst mehrfach mit Aqua dest. gewaschen und die Waschflüssigkeit, ζ. B. durch Zentrifugieren, weitgehend entfernt. Danach werden sie mit 0,1 M Glycin-HCI-Puffer, pH 2,8 oder mit 0,01 M HCI in Kontakt gebracht, nach Entfernen der sauren Lösungen mit phosphatgepufferter 0,15 M NaCI-Lösung (PBS), pH 7,4 mehrfach gewaschen, bis der Adsorber im gewünschten pH-Bereich äquilibriert ist. Vor Gebrauch wird die PBS möglichst restlos entfernt und die restfeuchten Adsorbersubstanzen mit der proteinhaltigen wäßrigen Flüssigkeit, z. B. Serum, in Kontakt gebracht. Dieses kann in einfacher Weise so erfolgen, daß man die Adsorbentien im Serum suspendiert und unter leichtem Schütteln 10 bis 120min z.B. bei Raumtemperatur oder 37°C inkubiert. Dieses Verfahren kann Anwendung finden, um IgM zu präparieren. Zu diesem Zweck werden die Adsorbentien nach dem Kontakt mit Serum mit 0,15M NaCI-Lösung gewaschen und anschließendste Desorption mit sauren Lösungen oder höher konzentrierten Salzlösungen, pH 4,5 bis 6,5, vorgenommen. Die Eluate enthalten neben dem hochmolekularen IgM noch einige Plasmaproteine mit Molekulargewichten unter 200000 Dalton

wie die Komplementfaktoren C3, C4 und C9, Präalbumin, O₁- und dj-Glycoprotein sowie Coeruloplasmin. Sie können in einem Nachreinigungsschritt, z. B. mittels Gelchromatographie an Sephadex G 200, abgetrennt werden. Das beschriebene Verfahren zur IgM-Präparation stellt eine wesentliche Vereinfachung der bisher üblichen Verfahren dar, da statt der gemäß des Standes der Technik benötigten 4 Verfahrensschritte nur noch 2 Schritte bis zur Gewinnung von reinem IgM erforderlich sind. Der entscheidende Schritt ist dabei die Anreicherung des IgM am erfindungsgemäß hergestellten Adsorber.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Polymerisation

In einem Planschliffbecher werden 1,51 dest. H₂O vorgelegt und hierin 2g Methylzellulose unter Rühren gelöst.

Zur wäßrigen Phase wird die Ölphase, bestehend aus 170g Acrylnitril, 90 g Vinylacetat, 40g techn. Divinylbenzen (ca. 50%ig), 1 g Porofor N und 200g Toluen hinzugefügt und durch Regelung der Rührgeschwindigkeit eine Tröpfchengröße von 0,1-3,0mm eingestellt. Die Polymerisation wird bei 60°C durchgeführt und das Copolymerisat danach 8 Std. bei 85⁰C ausgehärtet.

Anschließend wird das Copolymerisat mit Wasser ausgewaschen und nach Austreiben des Inertmittels Toluen (durch Behandlung mit Wasserdampf) getrocknet und auf eine Korngröße von 0,1-3,0 mm gesiebt.

Beispiel 2

Herstellung eines Adsorbers mit primären Aminogruppen

00g Copolymerisat, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden mit 350ml 1,3-Diaminopropan versetzt und die Suspension 8 Std. bei 11O⁰C gerührt.

Das Harz wird mit dest. H₂O gewaschen und danach bei Raumtemperatur zweimal im Wechsel mit HCI/NaOH, 5%ig, behandelt.

Nach der letzten NaOH-Behandlung wird der Adsorber mit dest. H₂O neutral gewaschen.

Es werden 170 ml Adsorber mit folgenden Kennwerten erhalten:

Anionenaustauschkapazität (mmol/g trockener Adsorber): 2,86

Wassergehalt (g/g trockener Adsorber): 3,0

Quellung (ml/g trockener Adsorber): 4,4

Beispiel 3

Herstellung eines Adsorbers mit teritären Aminogruppen

75g Copolymerisat, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden mit 600ml 3-Dimethylamino-i-propylamin 8Std. bei 11O⁰C gerührt.

Das Harz wird mit dest. H₂O gewaschen und danach bei Raumtemperatur zweimal im Wechsel mit HCI/NaOH, 5%ig, behandelt.

Nach der letzten NaOH-Behandlung wird der Adsorber mit. dest. H₂O neutral gewaschen.

Es werden 350 ml Adsorber mit folgenden Kennwerten erhalten:

Gesamtgewichtskapazität (mmol/g trockener Adsorber): 2,76

Wassergehalt (g/gtrockener Adsorber): 3,6

Quellung (ml/g trockener Adsorber): 7,4

Beispiel 4

Proteinmengen im Plasma nach Inkubation mit den Adsorbern 1 und 2.. bezogen auf die Eiweißmengen vor der Adsorption des Plasmas (= 100, angegeben in %).

Protein	Adsorber 1	Adsorber 2
Präalbumin	0
Albumin	73 + 0	67 ±6
α,-Glykoprotein	40 ±6	-
0.2-Glykoprotein	30 + 6	-
Haptoglobin	67 ±1	53±4
Hämopexin	79 ±7	88±3
Coeruloplasmin	0	0
a2-Makroglobulin	78 + 5	84 + 4
Transferrin	86 + 5	81 ±3
ß-Lipoprotein	85±3	80 ±1
IgG	79 ±5	84 ±3
IgA	70±4	72 + 4
IgM	17 + 0	20 ±2
IgD	90 ±10	90±2
IgE	79 ±3	85±3
C,q	76±4	76±9
C4	0	-
C3	32 ±6	5±0
C9	0	—
C 1INA	26±4	—
C3-Aktivator	85±4	-

Adsorber 1: hergestellt gemäß Beispiel 2 Adsorber 2: hergestellt gemäß Beispiel 3

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Adsorbentien für Immunglobuline der Klasse M, gekennzeichnet dadurch, daß aus Acrylnitril, Vinylacetat und einem Vernetzer in Gegenwart eines Fäll- und/oder Quellmittels für das Copolymere nach dem Verfahren der Suspensionspolymerisation ein Copolymerisat mit poröser Struktur und einer Korngröße von 0,1-0,3 mm hergestellt wird und dieses anschließend mit einem α,ω-Polyalkylenpolyamin der Formel

Ri = H oder Alkylgruppe

η = 2-8

bei Temperaturen von 90-140⁰C eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Vernetzer für das Copolymerisat Divinylbenzen oder Derivate der Acryl- bzw. Methacrylsäure oder Gemische dieser Vernetzer eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Behandlung mit dem Polyalkylenpolyamin der Acrylnitrilanteil nur partiell, maximal bis zu 95Ma.-%, aminolysiert und der Vinylacetatanteil dabei gleichzeitig zum Polyvinylalkohol verseift wird.