DD285370A5 - PROCESS FOR IMMOBILIZING MICROORGANISMS OR COIMMOBILIZATION OF MICROORGANISMS AND ENZYMES - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen, das sehr stabile Biokatalysatoren liefert, die auch in Langzeitverfahren und stoffwandelnden Prozessen in der Biotechnologie, chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sowie in der Medizin eingesetzt werden koennen. Die Mikroorganismen werden zunaechst durch Einschlusz in Gelnetzwerke vorimmobilisiert. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden die Enzyme an ein Traegermaterial gebunden und die Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme zur Vorimmobilisierung in Gelnetzwerke eingeschlossen. Nach Separation und Sedimentation der vorimmobilisierten Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme im Falle der Coimmobilisierung werden diese in Mikrokapseln eingeschlossen und nach UEberfuehrung in ein fuer die Zuechtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu der gewuenschten Verwendung zugefuehrt.{Immobilisierung von Mikroorganismen; Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen; Vorimmobilisierung; Einkapselung; Polyelektrolytkomplexe; Stoffwandlung}The invention relates to a process for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes, which provides very stable biocatalysts, which can also be used in long-term processes and material-converting processes in biotechnology, chemical, pharmaceutical and food industries and in medicine. The microorganisms are initially preimmobilized by inclusion in gel networks. In the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, the enzymes are bound to a carrier material and the microorganisms and carrier-bound enzymes are included in gel networks for preimmobilization. After separation and sedimentation of the pre-immobilized microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes in the case of coimmobilization, these are enclosed in microcapsules and, after conversion to a suitable environment for the cultivation of the immobilized or coimmobilized biocatalysts, the desired use is brought {immobilization of microorganisms; Coimmobilization of microorganisms and enzymes; Vorimmobilisierung; encapsulation; polyelectrolyte complexes; Material conversion}

Description

Titel der ErfindungTitle of the invention

Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und EnzymenProcess for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen zur Herstellung von Biokatalysatoren, die zur Durchführung stoffwandelnder Prozesse in der Biotechnologie, in der pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie sowie für den Einsatz in der Medizin geeignet sind. Sie finden z. B. Verwendung für die Biosynthese von Medikamenten, hochwertigen Chemikalien, Enzymen usw.The invention relates to a process for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes for the production of biocatalysts, which are suitable for carrying out stoffwandelnder processes in biotechnology, in the pharmaceutical, chemical and food industries and for use in medicine. You will find z. B. Use for the biosynthesis of drugs, high quality chemicals, enzymes, etc.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Zur Durchführung biochemischer Reaktionen in der Biotechnologie, pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie werden verstärkt Mikroorganismen eingesetzt. In zunehmendem Ma/3e werden die Mikroorganismen in immobilisierter Form verwendet, um den Einsatz derselben ökonomisch und effektiv zu gestalten. Mit Hilfe der Immobilisierung wird eine Erhöhung der mikrobiellen Produktivität im Verhältnis zum Reaktorvolumen, eine leichtere Abtrennbarkeit des Biokatalysators vom Produkt und damit eine v/es-entliche Senkung des Aufwands zur Isolierung der gewünschten Produkte ermöglicht.To carry out biochemical reactions in the biotechnology, pharmaceutical, chemical and food industries, microorganisms are increasingly used. Increasingly, the microorganisms are used in immobilized form to make their use economical and effective. Immobilization allows for increased microbial productivity relative to reactor volume, easier separability of the biocatalyst from the product, and thus a reduction in the cost of isolating the desired products.

Zur Immobilisierung von Mikroorganismen ist eine Reihe von Methoden beschrieben worden, wie z. B. der Einschluß in Netzwerke und in Schaumstoffe, die Fixierung an porösen Trägermaterialien und die Verkapselung. Daneben sind einige Methoden und Materialien in Kombination getostet worden.For the immobilization of microorganisms, a number of methods have been described, such as. As the inclusion in networks and in foams, the fixation on porous substrates and the encapsulation. In addition, some methods and materials have been used in combination.

Beim Einschluß in Netzwerke aus Gelen ist neben einer relativ geringen mechanischen Festigkeit häufig ein Auswaschen der Zellen aus den Gelen zu beobachten (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol. Lett. 5(10), 703 (1983)).When included in networks of gels, in addition to a relatively low mechanical strength, washing out of the cells from the gels is frequently observed (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol., Lett., 5 (10), 703 (1983)).

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Urn die Gefahr des Auswachsens vor. Zellen in das Medium herabzusetzen und daraus resultierende Störungen des Prozesses zu vermeiden, wird in DE OS 34 32 932 ein Verfahren beschrieben, das das Auswachsen von Zellen auch bei Tiangzeitversuchen sicher verhindern soll. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Oberfläche des Biokatalysators durch eine zcllenfreie Schutzschicht aus einem vernetzten, keine Durchlässigkeit für die Zellen aufweisenden den zellcnhaltigen Kern umschließenden Gel gebildet wird. Dieses Verfahren liefert Gelkörper, die im allgemeinen eine begrenzte mechanische Haltbarkeit ;.uf weisen. Für den beschriebenen Verwendungszweck, die Sektherstellung, ist jedoch die mechanische Festigkeit von untergeordneter Bedeutung, da der Biokatalysator nicht stark beansprucht wird, in anderen stoffwandelnden Prozessen spielt die mechanische Festigkeit eine bedeutende Rolle.Urn the danger of outgrowth. To reduce cells in the medium and to avoid the resulting disturbances of the process, a method is described in DE OS 34 32 932, which is intended to prevent the outgrowth of cells, even in Tiang-time experiments safely. This object is achieved in that the surface of the biocatalyst is formed by a cell-free protective layer of a cross-linked, no permeability to the cells having the cell-containing core enclosing gel. This process provides gel bodies that generally have limited mechanical durability. However, for the described purpose, the sparkling, the mechanical strength is of minor importance, since the biocatalyst is not heavily stressed, in other material-converting processes, the mechanical strength plays an important role.

In dieser Patentschrift wird zudem festgestellt, daß sich das Verfahren der Mikrokapselung für die Immobilisierung von Zellen nicht eignet aufgrund der Toxizität der zu verwendenden Lösungsmittel und der daraus resultierenden geringen Katalysatoraktivität, und daß auch bei dieser Methode das Auswachsen von Zellen nicht sicher verhindert v/erden kann.This patent also states that the method of microencapsulation is not suitable for the immobilization of cells due to the toxicity of the solvents to be used and the resulting low catalyst activity, and that also in this method the outgrowth of cells is not reliably prevented can.

Von Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B300, 355 (1933)) wird ebenfalls festgestellt, daß bei der Einkapselung von Mikroorganismen im Vergleich zum Einschluß in Netzwerken die Anzahl Zellen, die ins Medium wachsen können, weiter reduziert ist, daß aber dennoch die in die Membran inkorporierten Zellen Biomasse nach außen abgeben können.Mosbach (Phil Trans. R. Soc.Lond.B300, 355 (1933)) also states that in the encapsulation of microorganisms as compared to inclusion in networks, the number of cells that can grow into the medium is further reduced, but that nevertheless the cells incorporated in the membrane can deliver biomass to the outside.

In DE-OS 30 12 233 wird ein Verfahren zur Immobilisierung von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe und Einzelzellen beschrieben, bei dem zunächst die Materialien in einem Gel eingeschlossen und anschließend die sauren Gruppen an der Oberfläche der Gelmatrix mit einem aminogruppenhaltigen Polymer umgesetzt werden, se daß sich eine Membran ausbildet. Als nachteilig sind die geringe Widerstandsfähigkeit der so gebildeten Membran gegenüber proteolytischem Angriff anzusehen, die eine begrenzte [lebensdauer der Kapseln bedingt, und die Anwesenheit einer großen Anzahl freier Aminogruppen an der Oberfläche, die neben der Verklumpungsgefahr der Kapseln bei Einsatz anionischer Substrate zu einer Akkumulation derselben an derDE-OS 30 12 233 describes a process for the immobilization of chemically or biologically active substances, living tissue and single cells, in which first the materials are enclosed in a gel and subsequently the acidic groups on the surface of the gel matrix are reacted with an amino group-containing polymer , se that forms a membrane. A disadvantage is the low resistance of the membrane thus formed to proteolytic attack, which requires a limited [life of the capsules, and the presence of a large number of free amino groups on the surface, in addition to the risk of clogging of the capsules when using anionic substrates to an accumulation thereof at the

Oberfläche führt.Surface leads.

In den letzten Jahren wurden in zunehmendem Maße Mikroorganismen verschiedener Species und/oder Enzyme zusammen immobilisiert (Coimmobilisierung), nachdem anfangs jeweils nur ein bestimmter Mikroorganismus bzw. ein bestimmtos Enzym an oder in einer Matrix immobilisiert worden war, von denen einige in einer weitorentwickelten Form zusammen in einem Reaktor eingesetzt wurden. Die Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen ermöglicht es, den Einsatzbereich immobilisierter Mikroorganismen zu verbreitern, indem andere, normalerweise nicht durch den betrachteten Mikroorganismus verwertete Substrate mit Hilfe der coimmobilisierten Enzyme in eine Form überführt werden, die vom betreffenden Mikroorganismus umgesetzt v/erden kann. Bei Auswahl einer geeigneten Sequenz von Enzymen können auf diese V/eise mehrstufige Reaktionen katalysiert werden.In recent years, microorganisms of various species and / or enzymes have been increasingly immobilized together (co-immobilization) after initially immobilizing only one particular microorganism or enzyme at or in a matrix, some of which are in a more advanced form were used in a reactor. The co-immobilization of microorganisms and enzymes makes it possible to broaden the scope of use of immobilized microorganisms by converting other substrates, which are not normally utilized by the microorganism under consideration, into a form which can be converted by the microorganism concerned with the aid of the coimmobilized enzymes. By choosing an appropriate sequence of enzymes, multi-step reactions can be catalyzed.

Nach einem Verfahren von B. Hägerdal und K. Mosbach (US 4,524,137 zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen wird das Enzym kovalent an das Trägermaterial gebunden, das zum Einschluß der Mikroorganismen dient. Als nachteilig sind bei dieser Methode die rel'ativ geringe mechanische Festigkeit der Gelperlen und das Problem des Auswaschens von Zellen aus den Gelen beim Einsatz in Langzeitversuchen anzusehen.According to a method of B. Hägerdal and K. Mosbach (US 4,524,137 for the coimmobilization of microorganisms and enzymes, the enzyme is covalently bound to the carrier material which serves to enclose the microorganisms Gel beads and the problem of washing out cells from the gels when used in long-term experiments.

In Ε]? O 041 610 wird von C. H. Bochringer Sohn, Ingelheim die Bindung des Enzyms an Hefezellen vorgeschlagen. Diese Methode ist jedoch nicht bei allen Mikroorganismen-Species anwendbar, da die meisten Mikroorganismen durch die Immobilisierungspr izedur •des Enzyms inaktiviert werden. Darüber hinaus wird die Größe der Zellen nicht wesentlich verändert, so daß die Rückhaltung des Coimmobilisats in kontinuierlichen Fermentationsprozessen sehr schwierig ist.In Ε]? O 041 610 is proposed by C. H. Bochringer son, Ingelheim the binding of the enzyme to yeast cells. However, this method is not applicable to all species of microorganisms, as most microorganisms are inactivated by the immobilization protein of the enzyme. In addition, the size of the cells is not significantly changed, so that the retention of coimmobilisate in continuous fermentation processes is very difficult.

Von V/. Hartmeier und A. Heinrichs wird in DE 35 34 983 ein Verfahren zur Coimrncbilisierung von Mikroorganismen und Enzymen beschrieben, bei dem die Mikroorganismen und Enzyme zugleich in einer polymeren Matrix eingeschlossen werden, die in situ mit einer entgegengesetzt geladenen, semipermeabler! Membran überzogen wird. Bei diesem Verfahren wird die Anzahl Zellen, die bei Langzeitfermentationcn ins Medium auswachsen können, gegenüber dem alleinigen Einschluß in ein Gelnetzwerk reduziert. Es kann aber dennoch nicht verhindert werden, daß beim Eintropfen derFrom V/. Hartmeier and A. Heinrichs DE 35 34 983 a method for Coimrncbilisierung of microorganisms and enzymes is described in which the microorganisms and enzymes are included at the same time in a polymeric matrix, in situ with an oppositely charged, semipermeable! Membrane is coated. In this method, the number of cells which can grow into the medium in the case of long-term fermentation is reduced compared to the sole inclusion in a gel network. However, it can not be prevented that when dripping the

Mikroorganismen/Enzym/Alginatlösung in die Calciumchlorid/ Methacrylat/Acrylat-Copolymer-Lösung Mikroorganismen in die Membran inkorporiert werden, die Ursache für das Auswachsen von Mikroorganismen ins Außenmedium sein können. Bei den an dieser Stelle dargestellten Methoden zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen ist festzustellen, daß sie im Falle des Geleinschlussos von vornherein eine geringe mechanische Festigkeit besitzen und daß bei den bekannten Verfahren zur Einkapselung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen dieselben in die Kapselmembran inkorporiert werden und durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge der vitalen Objekte eine beträchtliche Verminderung der Kapselfestigkeit verursacht wird.Microorganisms / enzyme / alginate solution in the calcium chloride / methacrylate / acrylate copolymer solution microorganisms are incorporated into the membrane, which may be the cause of the outgrowth of microorganisms in the outer medium. In the case of the methods described herein for the immobilization of microorganisms or microorganisms and enzymes is to be noted that in the case of Geleinschlussos from the outset have a low mechanical strength and that in the known methods for encapsulation of microorganisms or microorganisms and enzymes in the same Capsule membrane are incorporated and caused by growth and cell division processes of vital objects, a significant reduction in capsule strength.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung sind stabil^ ankapsulierte Biokatalysatoren, deren Stabilität auch im Falle der Einkapselung proliferierender Systeme nicht durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge derselben herabgesetzt wird und die in biotechnologischen Verfahren eingesetzt werden können.The aim of the invention are stably encapsulated biocatalysts whose stability, even in the case of the encapsulation of proliferating systems, is not diminished by growth and cell division processes of the same and which can be used in biotechnological processes.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter oder coimir.obilisiertor Biokatalysatoren mit hoher Operationsstabilität auf dem Wege der Enkapsulierung von Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzymen zu finden, das den Einbau der zu immobilisierenden Biokatalysatoren in die Kapselwand verhindert und Kapseln mit hoher Membranfestigkeit erzeugt.The invention has for its object to find a method for producing immobilized or coimir.obilisiertor biocatalysts with high operational stability by way of encapsulation of microorganisms or microorganisms and enzymes that prevents the incorporation of immobilized biocatalysts in the capsule wall and capsules with high membrane strength generated.

Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß das Enzym/die Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen an ein Trägermaterial gebunden v/erden, die zu immobilisierenden Mikroorganismen, beispielsweise Hefen und Bakterien, bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme zur Vorimmobilisierung in einer wäßrigen Losung aus gelierfähigen Materialien suspendiert werden, diese Suspension zum Gelieren gebracht wird, an schließend die sedimentierten und separierten Gelpartikel (Vorirnmobilisate) in einer wäßrigen Lösung aus Cellulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniurnchlorid-Lösung eingetropft wird, und die immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren nach Abschluß des Einkapselungsprozesses in bekannter Weise abgetrennt und in ein für die Züchtung der Mikroorganismen geeignetes Milieu eingebracht werden.According to the invention, this is achieved by binding the enzyme (s) in the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes to a support material containing microorganisms to be immobilized, for example yeasts and bacteria, or microorganisms and carrier-bound enzymes for preimmobilization in an aqueous solution be suspended from gellable materials, this suspension is made to gel, then the sedimented and separated gel particles (Vorirnmobilisate) are suspended in an aqueous solution of cellulose sulfate, the suspension is dropped into an aqueous polydimethyldiallylammonium chloride solution, and the immobilized or coimmobilisierten biocatalysts after completion of the encapsulation process separated in a known manner and introduced into a suitable for the cultivation of microorganisms environment.

Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen erfolgt die Bindung des Enzyms/der Enzyme entweder adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstellt, in einer wäßrigen Losung bei pH-Werten zwischen 3,5 und 8, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer vonIn the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, the binding of the enzyme (s) is either adsorptive or covalent to a support material, preferably an insoluble material, in an aqueous solution at pHs between 3.5 and 8, at temperatures of 277 K up to the stability limit of the enzymes and at a reaction time of

min bis 24 Stunden. Als Kupplungsreagens wird vorzugsweise GIutarclialdehyd mit einer Konzentration zwischen Ü, 1 bis 10 %, vorzugsweise jedoch 2,5 %. Ms unlösliches Trägermaterial werden vorzugsweise aminogruppenhaltige Polystyrencerivate mit einem Partikeldurchmesser von 5 bis 200 yum vorwendet.min to 24 hours. The coupling reagent is preferably glutarclialdehyde with a concentration of between 0.1 and 10%, but preferably 2.5%. M is insoluble support material preferably amino-containing Polystyrencerivate with a particle diameter of 5 to 200 yum vorwärts.

Zur Vorimmobilisierung der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenon Enzyme im Falle der Coimmobilisierung werden sowohl GeIo, die durch Temperaturerniedrigung, beispielsweise Agar, Agarose, Gelatine, gebildet werden, als auch Gele, .die durch ionotrope Gelierung, beispielsweise Alginat, Carrageenan, Pullulan, Pektinat, mit Hilfe eines Vernetzungsmittels gebildet werden, verwendet.For the pre-immobilization of the microorganisms or carrier-bound enzymes in the case of coimmobilization, both GeIo formed by lowering the temperature, for example agar, agarose, gelatin, and gels produced by ionotropic gelation, for example alginate, carrageenan, pullulan, pectinate , be formed with the aid of a crosslinking agent used.

Die Konzentration des gelier fähigen "jaterials liegt zwischen 1 und 100 g/l, bei Verwendung von Agar, Agarose und Alginat vorzugsweise bei 30 g/l.The concentration of gellable material is between 1 and 100 g / l, and when using agar, agarose and alginate, preferably at 30 g / l.

Bei Einsatz ionotrop gelierender Materialien wird eine Vernetzerlösung mit 1 bis 100 g Vornetzungsmittel/l verwendet. Als Vernetzungsmittel kommen im Falle von Alginat Erdalkalisalzlösungen, vorzugsweise Calciumchlorid, und im Falle von Carrageenan Alkalisalzlösungen, vorzugsweise Kaliumchlorid, zum Einsatz .When ionotropic gelling materials are used, a crosslinker solution containing from 1 to 100 g of prewetting agent / l is used. In the case of alginate, alkaline earth salt solutions, preferably calcium chloride, and in the case of carrageenan, alkali metal salt solutions, preferably potassium chloride, are used as crosslinking agents.

Die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses durch ionotrope Gelierung reicht von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Mikroorganismen und Enzyme. Bei Einsatz von Materialien, die durch Temperaturerniedrigung Gele bilden, v/ird das gelierfähige Material bei einer Temperatur von 29'3 bis 373 K gelöst, die Lösung bei-Einsatz von Temperaturen größer als 313 K auf 313 K abgekühlt und mit einer Suspension der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme versetzt. Durch Abkühlen der Suspension auf 273 bis 283 K v/ird das Vorimmobilisat erhalten.The temperature during the pre-immobilization process by ionotropic gelation ranges from 273 K to the stability limit of the microorganisms and enzymes to be immobilized. When using materials which form gels by lowering the temperature, the gelable material is dissolved at a temperature of 29'3 to 373 K, the solution is cooled to 313 K when using temperatures greater than 313 K and with a suspension of the microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes. By cooling the suspension to 273 to 283 K v / ird the Vorimmobilisat obtained.

Die Temperatur bei der sich anschließenden Einkapselung der sedimentierten und separierten Vorimmobilisate v/ird ebenfalls zwischen 273 K und der Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Biokatalysatoren gewählt.The temperature during the subsequent encapsulation of the sedimented and separated preimmobilisates is also chosen between 273 K and the stability limit of the biocatalysts to be immobilized.

Die Cellulosesulfatkonzentration für die Einkapselung der Vorimrnobilisate liegt zwischen 5 und 100 g/l, die Konzentration der Polydimethyldiallylammoniumchlorid-fjösung gleichfalls zwischen 5 und 100 g/l.The cellulose sulfate concentration for the encapsulation of the Vorimrnobilisate is between 5 and 100 g / l, the concentration of Polydimethyldiallylammoniumchlorid-fjösung also between 5 and 100 g / l.

Die Verweilzeit der immobilisierten Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Cnzymc liegt zwischen 30 Sekunden und 12 Stunden. Nach. Abtrennung der orfindungsgemäß hergestellten immobilisierten Diokatalysatorcn von der Pclydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung werden diese in ein für die Züchtung der immobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu überführt und anschließend der gewünschten Verwendung zugeführt.The residence time of the immobilized microorganisms or microorganisms and Cnzymc is between 30 seconds and 12 hours. To. Separation of the orally prepared immobilized Diokatalysatorcn of the Pclydimethyldiallylammoniumchlorid solution they are converted into a suitable for the cultivation of the immobilized biocatalyst environment and then fed to the desired use.

Somit liefert das erfindungsgemäße Verfahren immobilisierte Biokatalysatoren, die sich durch eine hohe Vitalität, Aktivität und Oporationsstabilität auszeichnen, die auch i:i Falle der Einkapselung vitaler, proliferiendor Systeme bei Langzeitversuchen nicht durch Wachstums- und Zeil'ceilungssvorgänge derselben oder Auswaschen vermindert wird. Die Bindung des Snzyms/der Enzyme schützt dieses vor Abbauprozessen und Inaktivierung. Die Vorimmobilisierung gewährleistet, daß keine Mikroorganismen oder tragergebundenen Enzyme in die Kapselwand inkorporiert werden und die Oberfläche des immobilisierten Biokatalysators frei von Mikroorganismen und trägergebundenen Enzymen ist. Somit ist das Risiko des Auswachsens von Mikroorganismen in das Kulturmedium, das beim Einschluß von Mikroorganismen in Golnetzwerke nicht verhindert werden kann und zu Störuncjen des Prozesses führt, ausgeschlossen. Von Vorteil ist weiterhin eine erhöhte mechanische Stabilität der Biokatalysatoren gegenüber der von Gelnetzwerken .Thus, the inventive method provides immobilized biocatalysts which are characterized by a high vitality, activity and Oporationsstabilität, which is also i: i case of encapsulation of vital, proliferiendor systems in long-term experiments not by growth and Zeil'ceilungssbense the same or washing is reduced. The binding of the enzyme (s) protects it from degradation and inactivation. Preimmobilization ensures that no microorganisms or carrier-bound enzymes are incorporated into the capsule wall and the surface of the immobilized biocatalyst is free of microorganisms and carrier-bound enzymes. Thus, the risk of outgrowth of microorganisms in the culture medium, which can not be prevented by the inclusion of microorganisms in Golnetwerke and leads to Störuncjen the process is excluded. Another advantage is an increased mechanical stability of the biocatalysts over that of gel networks.

Im Falle der Coimmobilisierung von Invertase und Yarrowia lipolytica-Zellen wird es möglich, Saccharose als Substrat einzusetzen, die normalerweise nicht von diesen Zellen verwertet v/erden kann, jedoch ein wesentlich · preiswerteres Substrat als das eigentliche Substrat Glucose darstellt.In the case of the coimmobilization of invertase and Yarrowia lipolytica cells, it becomes possible to use sucrose as a substrate, which normally can not be utilized by these cells, but represents a substantially less expensive substrate than the actual substrate glucose.

Das erfindungsgemäßo Verfahren soll anhand nachfolgender Beispiele erläutert werden.The process according to the invention will be explained by means of the following examples.

Ausführungsbcispiele Seispiel 1Exemplary embodiments Example 1

0,1 y Agar werden unter . Erwärmen auf 353 K in 10 ml V/asser gelöst. Nach Abkühlen auf 313 K wird 1 ml einer Zc.llsuspension der Hefe Yarrowia lipol tica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/mi zugegeben, schnell suspendiert und in Wasser eingetropft, das eine Temperatur von 283 K aufweist. Das in groben Klumpen erhaltene Gel wird in 10 ml Wssser mit einer Temperatur von 283 K gegeben und nach bekannten Methoden auf eine Fartikelgröße von 100 bis 200 ρ zerkleinert. Das partikuläre Gel wird sedimentiert und, wie in Beispiel 4 beschrieben, verwendet.0.1 y agar are under. Heating to 353 K dissolved in 10 ml V / asser. After cooling to 313 K, 1 ml of a Zc.llsuspension of the yeast Yarrowia lipol tica containing 1 mg HTM / mi is added, quickly suspended and dripped into water having a temperature of 283 K. The gel obtained in coarse lumps is placed in 10 ml of water at a temperature of 283 K and comminuted by known methods to a particle size of 100 to 200 ρ. The particulate gel is sedimented and used as described in Example 4.

Beispiel 2Example 2

0,5 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml v/erden in 5 ml 3%iger Na-Alginöt-Lösung suspendiert. Durch Eintropfen der so erhaltenen Zell-Alginat-Suspension mit Hilfe üblicher Methoden in eine 2%ige Calciumchlorid-Lösung unter leichtem Rühren werden Gelperlen erhalten, die weitere 30 min in dieser Lösung gerührt v/erden. Die Gelperlen werden sediment.! er t und, wie in Beispiel 4 beschrieben, verwendet.0.5 ml of a cell suspension of the yeast Yarrowia lipolytica containing 1 mg HTM / ml v / earth suspended in 5 ml of 3% Na-Alginöt solution. By dropping the thus obtained cell alginate suspension by means of conventional methods in a 2% calcium chloride solution with gentle stirring gel beads are obtained, the stirred for a further 30 min in this solution v / earth. The gel beads will sediment.! he t and, as described in Example 4, used.

Beispiel 3Example 3

Durch Lösen von 0,3 g Agaroso in 10 ml Kasser bei 373 K wird eine 3%ige Agarose-Lösung hergestellt. Mach Abkühlen der Lösung auf 313 K wird 1 ml einer ^ellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml zugegeben, schnell suspendiert und in Wasser mit einer Temperatur von 2S3 K eingetropft. Das in groben Klumpen erhaltene Gel wird in 10 ml Wasser mit einer Temperatur von 283 K ge-By dissolving 0.3 g of Agaroso in 10 ml of Kasser at 373 K, a 3% agarose solution is prepared. After cooling the solution to 313 K, 1 ml of a suspension of the yeast Yarrowia lipolytica containing 1 mg HTM / ml is added, rapidly suspended and dripped into water at a temperature of 2S3K. The gel obtained in coarse lumps is dissolved in 10 ml of water at a temperature of 283 K.

geben und nach bekannten Methoden auf eine Partikelgröße von 100 bis 200 yiim zerkleinert. Das partikuläre Gel wird sedimentiert und, v/ie in Beispiel 4 beschrieben, verwendet.give and crushed by known methods to a particle size of 100 to 200 yiim. The particulate gel is sedimented and used as described in Example 4.

He ispiel 4He is playing 4

0,5 ml dos Sediments der vorimmobilisierton Hefe Yarrowia Iipolytica gemäß Beispiel 1, 2 und 3 werden in 5 ml 2,2%iger Celluloscsulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt.0.5 ml sediment sediments of vorimmobilisierton yeast Yarrowia Iipolytica according to Example 1, 2 and 3 are suspended in 5 ml of 2.2% Celluloscsulfatlösung (cellulose sulfate with a DS of 0.43) and distributed as homogeneously as possible.

Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Lösung von l,2^?oigem Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.Then this suspension is dissolved in 50 ml of a solution of l, 2 ^? Dropped polydimethyldiallylammonium chloride with a molecular weight of 40,000 with gentle stirring and stirred slowly for at least 5 min.

Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeten Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillier ton Wasser gewaschen.After separation of the precipitation bath from the microcapsules formed, they are washed twice with 50 ml of sterile distilled ton of water.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Formenter eingesetzt; Mach einer Kultivierungsdauer von 24 h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine Konzentration von 15 mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nicht getrübt, d. h. frei von Hefezellen. Diese Kapseln v/erden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion von Citronensäure eingesetzt.For cultivation, 20 g of the capsules thus obtained are used in a 500 ml formenter; After culturing for 24 h, the culture medium is consumed and cell growth is complete. The cell mass in the capsule interior has grown to a concentration of 15 mg HTM / ml immobilizate. The external medium is not clouded, d. H. free of yeast cells. These capsules are used in a continuous fermentation process for the production of citric acid.

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde analog mit Bakterien der Species Pseuciomonas aerucjinosa ausgeführt.The inventive method was carried out analogously with bacteria of the species Pseuciomonas aerucjinosa.

Beispiel 5Example 5

0,2 g Polystyron Wofatit UF 93 (Partikeldurchmcsser 5 bis ICO um) werden mit 3 ml 2,5%iger Glutardialdehyd-Lösung in SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das aktivierte Trägermaterial wird anschließend mit V/asser bis zur völligen Entfernung des überschüssigen GIu-0.2 g of Polystyron Wofatit UF 93 (particle diameter 5 to ICO um) are stirred with 3 ml of 2.5% glutaraldehyde solution in SÖRENSEN phosphate buffer pH 7.0 for 2 hours at room temperature. The activated carrier material is then mixed with water until complete removal of the excess GIu.

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tardialdohyds gewaschen. Anschließend wird das aktivierte Polyscyren mit 800 U Invertaso in 3 ml SÖRENSEH-Phosphafcpuffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und danach mit 25 mM blatriumacetatpuf f er pil 5,0/1 M KaCl und 2 5 int'i Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasscr nachweisbar war.tardialdohyds washed. The activated polysaccharene is then stirred with 800 U invertase in 3 ml of SÖRENSEH Phosphafc buffer pH 7.0 for 4 h at room temperature and then with 25 mM sodium acetate acetate buffer 5.0 / 1 M KaCl and 2 ml of sodium acetate buffer pH 5, 0 washed until no protein was detectable in Waschwasscr.

Der Invertase-Polys tyren-Komolex wird, wie in 'Beispiel 7 bis 10 beschrieben, verwendet.The invertase polystyrene Komolex is used as described in Examples 7 to 10.

Beispiel GExample G

0,2 g Pol^ytyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100 p) werden mit 800 U Invertase in 3 ml SÖREiISEN-Phosphatpuff er pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 25 mM Matriumacetatpuffer pH 5,0/1 W NaCl und 25 mW Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasscr nachweisbar war. Der Invertase-Polystyren-Komplex wird, wie in Beispiel 7 bis 10 beschrieben, verwendet.0.2 g polystyrene Wofatit UF 93 (particle diameter 5 to 100 p) are stirred with 800 U invertase in 3 ml SÖREiISEN Phosphatpuff er pH 7.0 for 4 h at room temperature and then with 25 mM Matriumacetatpuffer pH 5.0 / 1 W NaCl and 25 mW sodium acetate buffer pH 5.0 until no more protein was detectable in the wash water. The invertase polystyrene complex is used as described in Examples 7-10.

Beispiel 7Example 7

0,1g Agar v/erden unter Erwärmen auf 353 K in 10 ml V/asser gelöst. Nach Abkühlen auf 313 K v/erden 1 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml und 0,5 ml Invertase-Polystyren-Komplex zugegeben, schnell suspendiert und in Wasser eingetropft, das eine Temperatur von 283 K aufweist. Das in groben Klumpen erhaltene Gel wird in 10 ml Wasser mit einer Temperatur von 283 K gegeben und nach bekannten Methoden auf eine Partikelgröße von 100 bis 200 pm zerkleinert. Das partikuläre Gel wird sedimentiert und, wie in Beispiel 10 beschrieben, verwendet.0.1 g of agar dissolved with warming to 353 K in 10 ml of water. After cooling to 313 K v / erden 1 ml of a cell suspension of the yeast Yarrowia lipolytica containing 1 mg HTM / ml and 0.5 ml invertase-polystyrene complex was added, quickly suspended and dripped into water, which has a temperature of 283 K. having. The gel obtained in coarse lumps is added to 10 ml of water at a temperature of 283 K and comminuted by known methods to a particle size of 100 to 200 pm . The particulate gel is sedimented and used as described in Example 10.

Beispiel 8Example 8

0,5 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTM/ml und 0,25 ml Invertase-Polysty-0.5 ml of a cell suspension of the Yarrowia lipolytica yeast containing 1 mg HTM / ml and 0.25 ml invertase polystyrene.

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ren-Komplex werden in 5 ml 3%iger Na-Alginat-Lösung suspendiert. Durch Eintropfen der so erhaltenen Zcll-Alginat-iJuspension mit lixlfe üblicher Methoden in eine 2%ige Calciumchlorid-Lösung unter leichtem Rühren v/erden Gelporlen erhalhen, die v/eitere 30 min in dieser Lösung gerührt werden. Die Gelperlen werden sedimentiert und, wie in Beispiel 10 beschrieben, verwendet.ren complex are suspended in 5 ml of 3% Na alginate solution. By dropping the thus obtained Zcll alginate iJuspension with lixlfe conventional methods in a 2% calcium chloride solution with gentle stirring v / erdenhen ge gelen, which are stirred for more than 30 min in this solution. The gel beads are sedimented and used as described in Example 10.

Beispiel 9Example 9

Durch Lösen von 0,3 g Agaroso in 10 ml Wasser bei 373 K wird eine 3%ige Agarose-Lösung hergestellt. Mach Abkühlen der Lösung auf 313 K werden 1 ml einer Zellsuspension der Hefe Yarrowia lipolytica mit: einem Gehalt von 1 mg ΗΤίΊ/ml zu- und 0,5 ml Invertase-Polystyren-Komplex zugegeben, schnell suspendiert und in Wasser mit einer Temperatur von 283 K eingetropft. Das in groben Klumpen erhaltene Gel wird in 10 ml Wasser mit einer Temperatur von 283 K gegeben und nach bekannten Methoden auf eine Partikelgröße von 100 bis 200 urn zerkleinert. Das partikuläre Gel wird sedimentiert und, wie in Beispiel 10 beschrieben, verwendet.By dissolving 0.3 g of agaroso in 10 ml of water at 373 K, a 3% agarose solution is prepared. After cooling the solution to 313 K, add 1 ml of a cell suspension of Yarrowia lipolytica yeast containing: 1 mg / ml and 0.5 ml of invertase-polystyrene complex, rapidly suspended and dissolved in water at 283 ° C K dripped. The gel obtained in coarse lumps is added to 10 ml of water at a temperature of 283 K and comminuted by known methods to a particle size of 100 to 200 urn. The particulate gel is sedimented and used as described in Example 10.

Beispiel 10Example 10

0,5 ml des Sediments der zusammen mit Invertase-Polystyren-Komplex vorimmobilisierten Hefe Yarrowia lipolytica gemäß Beispiel 7, 8 und 9 werden in 5 ml 2,2%iger Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt. Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Lösung von l,2%igem Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt. Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeten !Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillierten Wasser gewaschen.0.5 ml of the sediment of Yarrowia lipolytica yeast preimmobilized together with invertase polystyrene complex according to Example 7, 8 and 9 are suspended in 5 ml of 2.2% strength cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) and distributed as homogeneously as possible , Then, this suspension is added dropwise in 50 ml of a solution of l, 2% polydimethyldiallylammonium chloride having a molecular weight of 40,000 with gentle stirring and stirred slowly for at least 5 min. After separation of the precipitation bath from the microcapsules formed, they are washed twice with 50 ml of sterile distilled water.

Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Formenter eingesetzt. Nach einer Kultivierungsdauer von 24 h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zeil-For cultivation, 20 g of the capsules thus obtained are used in a 500 ml formenter. After a culture period of 24 h, the culture medium is eaten and the cell culture

wachstum abcjeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine Konzentration von 15 mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmediui.i ist nicht getrübt, d. h. frei von Uefezellen. Diese Kapseln v/erden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion vor Citronensäure einge-growth abcjeschlossen. The cell mass in the capsule interior has grown to a concentration of 15 mg HTM / ml immobilizate. The external mediuii is not clouded, d. H. free of yeast cells. These capsules are used in a continuous fermentation process for the production of citric acid.

Beispiel 11Example 11

50 ml einer 2,2%igen Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden 10 min bei 121 C autoklaviert. Dann Dann werden 0,5 ml des Sediments gemäß Beispiel 1, 2 und 3 bzw. 7, 8 und 9 in 5 ml des autoklavieren Cellulosesulfats suspendiert und homogen verteilt. Diese Suspension wird in 50 ml einer Lösung von 0,25 % Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 40 min gerührt. Danach wird das Fällbad 1 : 1 mit Wasser verdünnt. Die Kapseln werden weitere 80 min unter leichtem Rühren im Fällbad bewegt.50 ml of a 2.2% strength cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) are autoclaved at 121 ° C. for 10 minutes. Then 0.5 ml of the sediment according to Example 1, 2 and 3 or 7, 8 and 9 are suspended in 5 ml of the autoclave cellulose sulfate and homogeneously distributed. This suspension is added dropwise in 50 ml of a solution of 0.25% polydimethyldiallylammonium chloride with a molecular weight of 40,000 with gentle stirring and stirred for at least 40 min. Thereafter, the precipitating bath is diluted 1: 1 with water. The capsules are stirred for a further 80 minutes with gentle stirring in the precipitation bath.

Mach Abtrennung des Fällbades werden die Kapseln ohne weitere Behandlung sofort dem Kultivierungsprozeß zugeführt, wie es in Beispiel 4 und 10 beschrieben v/urde.If the precipitation bath is separated off, the capsules are immediately added to the cultivation process without further treatment, as described in Examples 4 and 10.

Claims (18)

Patentansprücheclaims 1. Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorcjonismon und Enzymen durch Geleinbettung und Polyolektrolytcinkapsolung, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikroorganismen bzw. die Mikroorganismen und das Enzym/die Enzyme, die an ein Trägermaterial gebunden wurden, zur Vorimmobilisierung in einer wäßrigen Lösung aus gelierfähigen Materialien suspendiert v/erden, diese Suspension zum Gelieren gebracht wird, anschließend die sedimentierten und separierten Gelpartikel (Vorimmo'oilisate) in einer wäßrigen Tiösung aus Cellulosesulfat .suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Tiösung eingetropft wird, und die immobilisierten Mikroorganismen bzw. die erhaltenen komplexen (coimuiobilisierten) Biokatalysatoren in bekannter Weise abgetrennt werden und in ein für die Züchtung der immobilisierten bzw. coimmobilisiertcn Biokatalysatoren geeignetes Milieu eingebracht werden.1. A method for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of Mikroorcjonismon and enzymes by gel embedding and Polyolektrolytcinkapsolung, characterized in that the microorganisms or the microorganisms and the enzyme / enzymes which have been bonded to a support material for preimmobilization in an aqueous solution gellable materials are suspended, this suspension is gelled, then the sedimented and separated gel particles (pre-mixed) are suspended in an aqueous solution of cellulose sulfate, the suspension is dripped into an aqueous polydimethyldiallyl ammonium chloride solution, and the immobilized microorganisms or the obtained complex (coimuiobilisierte) biocatalysts are separated in a known manner and introduced into a suitable for the cultivation of the immobilized or coimmobilisiertcn biocatalyst environment. 2. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß das L'nzym/die Enzyme adsorptiv oder kovalont an einem Trägermaterial in einer wäßrigen Lösung bei pH-Werten zwischen 3,5 und S, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer vcn 30 min bis 24 Stunden gebunden v/erden.2. The method according to claim 1, characterized in that the L'enzyme / enzymes adsorptively or kovalont on a support material in an aqueous solution at pH values between 3.5 and S, at temperatures of 277 K to the stability limit of the enzymes and in a reaction time of 30 minutes to 24 hours bound. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß zur kovalonten Bindung der Enzyme an das Trägermaterial vorzugsweise Glutardialdehyd als Kupplungsreagens verwendet wird .3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that for the covalent binding of the enzymes to the support material preferably glutaric dialdehyde is used as a coupling reagent. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Glutardialdehyds 0,1 bis 10 %, vorzugsweise 2,5 % beträgt. 4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the concentration of glutaric dialdehyde is 0.1 to 10%, preferably 2.5%. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 gekennzeichnet dadurch, daß vorzugsweise ein unlösliches Trägermaterial zur Bindung der Enzyms verwendet wird.5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that preferably an insoluble carrier material is used for binding of the enzyme. -/ν- 2 Ö 5 3 7 0- / ν- 2 Ö 5 3 7 0 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5 gekennzeichnet dadurch, daß als unlösliches Trägermaterial vorzugsweise Arninomethylpolystyren verwendet wird.6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that is preferably used as insoluble support material Arninomethylpolystyren. 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6 gekennzeichnet dadurch, daß der Partikeldurchmesser der Polystyrenkugeln von 5 bis 200 yiim gewählt wird.7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that the particle diameter of the polystyrene beads of 5 to 200 yiim is selected. 8. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur Vorimmobilisierung der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme ein gelierfähiges Material, beispielsweise Alginat, Carrageenan, Pektinat, verwendet wird, das durch Einwirkung eines Vernetzungsmittels, beispielsweise Erdalkali- oder Alkalisalzlösungen, Gele bildet.8. The method according to claim 1, characterized in that for pre-immobilization of the microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes, a gellable material, such as alginate, carrageenan, pectinate, is used, which forms gels by the action of a crosslinking agent, for example, alkaline earth or alkali salt solutions. 9. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des gelier fähigen Materials zwischen 1 und 100 g/l liegt.9. The method according to claim 1 and 3, characterized in that the concentration of the gellable material is between 1 and 100 g / l. 10. Verfahren nach Anspruch 1, S und'9 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Vernetzungsmittols 1 bis 100 g/l beträgt.10. The method of claim 1, S and'9 characterized in that the concentration of the crosslinking agent is 1 to 100 g / l. 11. Verfahren nach Anspruch 1 und S bis 10 gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme reicht.11. The method of claim 1, and S to 10 characterized in that the temperature ranges during the Vorimmobil i sierungsprozesses from 273 K up to the stability limit to be immobilized microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes. 12. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur VoL-o-mmobilisierung der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme ein gelierfähiges Material, beispielsweise Agar, Agarose, Gelatine verwendet wird, das durch Temperaturerniedrigung Gele bildet.12. The method according to claim 1, characterized in that for VoL-o-mmobilisierung the microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes, a gelierfähiges material, such as agar, agarose, gelatin is used, which forms by lowering the temperature gels. 13. Verfahren nach Anspruch 1 und 12 gekennzeichnet dadurch, daß das gelierfähige Material bei einer Temperatur von 293 bis 373 K gelöst wird, die Lösung bei Temperaturen von 320 bis 373 K auf 313 K abgekühlt wird, mit einer Suspension der Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen13. The method according to claim 1 and 12, characterized in that the gellable material is dissolved at a temperature of 293 to 373 K, the solution is cooled at temperatures of 320 to 373 K to 313 K, with a suspension of microorganisms or microorganisms and carrier-bound Enzyme versetzt wird und durch Abkühlen der Guspension auf 273 bis 23? K in die vorirnmobilisier te Form überführt wird.Enzymes is added and by cooling the suspension to 273 to 23? K is transferred to the vorirnmobilisier te form. 14. Verfahren nach /Anspruch 1, 12 und 13 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des gelierfähigen Material von 3. bis 100 g/l beträgt.14. The method according to / claim 1, 12 and 13, characterized in that the concentration of gellable material is from 3 to 100 g / l. 15. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur Einkapselung der Vorimmobilisate eine Konzentration des CeI-lulosesulfats von 5 bis 100 g/l eingesetzt wird.15. The method according to claim 1, characterized in that a concentration of CeI-lulosesulfats of 5 to 100 g / l is used for encapsulation of Vorimmobilisate. 16. Vorfahren nach Anspruch 1 und 15 gekennzeichnet dadurch, daß zur Einkapselung der Vorimmobilisate eine Konzentration dee Polydirnethylallylammoniumchlorids zwischen 5 und 100 g/l verwendet wird.16 ancestors according to claim 1 and 15, characterized in that a concentration dee Polydirnethylallylammoniumchlorids between 5 and 100 g / l is used for encapsulation of Vorimmobilisate. 17. Verfahren nach Anspruch 1, 15 und 16 gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur bei der Einkapselung der Vorimmobilisate von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der einzukapselnden Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme reicht.17. The method according to claim 1, 15 and 16, characterized in that the temperature in the encapsulation of Vorimmobilisate of 273 K to the stability limit of the encapsulated microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes ranges. 18. Verfahren nach Anspruch 1, 15 bis 17 gekennzeichnet dadurch, daß die Verweilzeit der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren in der Polydimothyldiallylammoniumchlorid-Iiösung von 30 Sekunden bis 12 Stunden gewählt wird.18. The method of claim 1, 15 to 17, characterized in that the residence time of the immobilized or co-immobilized biocatalysts in the polydimethyldiallylammonium chloride solution from 30 seconds to 12 hours is selected.