DD284691A5 - Verfahren zur klonierung einer c-dna-sequenz, die fuer mindestens einen teil eines s-locusspezifischen glycoproteins der pflanzenfamilie brassicaceae codiert - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Klonierung einer cDNA-Sequenz, die für mindestens einen Teil eines S-locusspezifischen Glycoproteins der Pflanzenfamilie Brassicaceae codiert. Die klonierte DNA ist nützlich für die Hybridsamenproduktion und um die Selbstunverträglichkeit bei Pflanzen zu beseitigen. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht beispielsweise darin, dass man a) eine cDNA-Bank mit Klonen, welche cDNA bis poly A + RNA aus unverträglichen Stigmas oder unverträglichen Griffeln bzw. Styli erzeugt; b) DNA aus den Klonen mit unverträglichen Stigma oder unverträglichen Griffel-cDNA-Proben und Samenmaterial bzw. Setzlingen, die sich von den cDNA-Proben ableiten, hybridiert; c) einen Klon-Untersatz mit DNA auswählt, welcher das Stigma oder die Griffel-cDNA Proben hybridisiert und welcher die Samenmaterial- bzw. Setzling-cDNA-Proben nicht hybridisiert; d) die Transvektor-DNA, welche DNA von dem Klon-Untersatz enthält, herstellt und vermehrt, und e) die Transvektor-DNA zur Abtrennung der Transfervaktor-DNA von der DNA aus dem Klon-Untersatz digeriert.{Klonierungsverfahren; cDNA-Sequenz; locusspezifisches Glycoprotein; Pflanzenfamilie Brassicaceae}

Description

L ö

Ά-

Verfahren zur Klonierung einer c-DNA-Sequenz, die für mindestens einen Teil eines S-locusspezifischen Glycoproteins der Pflanzenfamilie Brassicaceae codiert

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klonierung einer c-DNA-Sequenz, die für mindestens einen Teil eines S-locusspezifischen Glycoproteins der Pflanzenfamilie Brassicaceae codiert. Die geklonte DNA ist für die Hybridsamenproduktion nützlich.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In über 5000 Spezies, die die diversen angispermen Familien repräsentieren, ist die Selbstbefruchtung durch einen Mechanismus, welcher als "Selbstunverträglichkeit" (selfincompatibility) bezeichnet wird, blockiert (East, E. M. Proc. Am. Phil. Soc. 82, 449-518 (1940)). Nach der Selbstbestäubung ruft die Zwischenwirkung zwischen dem Stigma oder Griffel und dem Pollen eine definierte morphologische Antwort hervor und verhindert das normale Pollenschlauchwachstum. Die Befruchtung wird verhindert, da diese Pollenschläuche nicht in der Lage sind, in die volle Länge des Stigma und Griffels zu penetrieren. Die spezifische Eigenschaft dieser Zwischenwirkung wird durch eine oder mehrere genetische loci bestimmt und erfordert die Identität von Allelen, die von den männlichen und weiblichen Elternteilen getragen werden.

Die Unverträglichkeitssysteme wurden in zwei Hauptgruppen eingeteilt. Die gametophytischen Systeme, in denen der Phenotyp eines Pollenkorns durc'i den haploiden Pollengenotyp bestimmt wird und die sporophytisehen Systeme, in denen der Pollenphenotyp durch den Genotyp der diploiden Elternteilpflanze bestimmt wird. Bei der sporophytisehen Art der Unverträglichkeit, für

2 8 4 6 9 f

die ein Beispiel die crucifere Brassica ist, ist die Selbstunverträglichkeitsreaktion an der Stigmaoberfläche lokalisiert lind tritt innerhalb von Minuten nach dem Anfangskontakt zwischen dem Pollen und den papillaren Zellen an der Außenoberfläche des Stigmas auf. In diesem Genus ist die Selbstunverträglichkeit unter der Kontrolle eines einzigen genetischen Locus, des S-Locus, welcher stark polymorph ist, so daß 50 oder mehr Allele in natürlichen Populationen identifiziert wurden (Thompson, K. Ϊ. et al, Heredity 21:34-5-362 (1966); Ockendon, D. J., Heredity 33:159-171 (1974-))·

Vielleicht wird die experimentell am besten nachweisbare Route hinsichtlich der molekularen Analyse der genetischen Eontrolle der Unverträglichkeit durch den Nachweis von Antigenen nahegelegt, die für die verschiedenen S-Locus-Allele in Stigmahomogenaten von unterschiedlichen Brassica-Stäimnen spezifisch sind (Nasrallah, M. E. et al, Heredity 22, 519-527 (1967)). Es wurde gezeigt, daß diese Antigene Glycoproteinen entsprechen, die in verschiedenen elektrophoretischen Systemen aufgespalten werden können (Nasrallah, M. E. et al, Heredity, 25, 23-27 (1970); Nasrallah, M. E. et al, Genet. Rs. 20, 151-160 (1972); Nishio, T. et al, Heredity 38, 391-396 (1977); Nasrallah, M. E. et al, Experientia 40, 279-281 (1984)). Verschiedene Beweisreihen zeigen, daß diese Glycoproteine eine wichtige Hölle bei der Unverträglichkeit spielen können: (1) Die Mobilitäten dieser Moleküle variieren in Stigmaextrakten, die sich von Brassica-Stämmen ableiten, mit unterschiedlichen S-Locus-Allelen. (2) Diese Moleküle wurden exklusiv in dem Stigma und spezifisch in den Oberflächen-Papillarzellen des Stigmas gefunden, die Stelle des ursprünglichen Kontaktes zwischen dem Pollen und dem Stigma. (3) Eine erhöhte Rate der Synthese dieser S-locusspezifischen Glycoproteine ("SLSGs") in dem entwickelten Stigma steht gut in Übereinstimmung mit dem Beginn der Unverträglichkeitsreaktion in dem Stigma (Nasrallah, J. B. et al, Experientia 40, 279-281 (1984-)).

2 G A 6 9 ί

(4) Die wichtigste Eigenschaft, die Erbeigenschaften der verschiedenen Formen von SLSG, stehen mit der Segregation der S-Allelen in den F_-J- und I^<2~^Geiiera-tionen in perfekter Korrelation, was anzeigt, daß das für diesen Polymorphismus verantwortliche Gen genetisch extrem eng an den S-Locus gebunden sein muß (Nasrallah, И. E. Genet. Hs. 20, 151-160 (1972); Hinata, K. et al, Heredity 41. 93-100 (1978)).

Die Isolierung eines cDNA-Klons, welcher an S-locusspezifisches Glycoprotein codiert, ist von großem Interesse, da ein solcher Klon die Identifizierung der Selbstunverträglichkeits-gene beim Züchten eines Stocks bzw. beim Züchten von Pflanzenmaterial, die Identifizierung stabiler S-Allelen mit starken Promotern, wie auch die Einführung von Selbstunverträglichkeitsgenen in die geeigneten Pflanzenstämme durch Transformation, erlauben würde. Zusätzlich können transformierte Stämme, welche S-Allele tragen, mit Stämmen, die unterschiedliche S-Allele tragen, intergepflanzt werden, so daß der Samen, der geerntet wird, vollständig hybrid ist. Es besteht ein Bedarf nach solchen Hybridarten, da höhere Ausbeuten bzw. Ernten erzeugt werden. Solche Stämme sind ebenfalls besser für die Einführung von Resistenz gegen Krankheit, und besitzen eine bessere Anpassungsfähigkeit für extreme Umgebungswachstumsbedingungen.

Beispielsweise besitzen bei ornamentalen Nutzpflanzen selbstverträgliche Arten eine längere Haltbarkeitsdauer und blühen während einer längeren Saison.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung i.^t es, die Hybridsamenproduktion zu erleichtern durch einen wirksamen Transfer von stabilen S-Allelen in aufziehendes bzw. zu züchtendes Material.

Erfindungsgemäß soll weiterhin die Selbstunverträglichkeit von Fruchtbäumen beseitigt werden, wodurch höhere Ernten und bessere Früchte erhalten werden. Dies gilt insbesondere für Bäume in Obstgärten, wo oft nur ein Fruchtbaum vorhanden ist.

Erfindungsgemäß soll das Auftreten von Selbstunverträglichkeit s-Inzuchtlini en durch Handbefruchtung vermieden werden können.

Erfindungsgemäß soll die interspezifische Hybridisierung zwischen selbstunverträglichen Spezies aktiviert werden, wodurch ein größerer Genpool für die Pflanzenverbesserung erhalten wird.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zur Verfügung zu stellen, mit der die Hybridsamenproduktion verbessert wird, die Unverträglichkeit in Pflanzen beseitigt wird, wodurch höhere Ernten erzeugt werden und die interspezifische Hybridisierung zwischen selbstunverträglichen und selbstverträglichen Spezies aktiviert wird.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Elonierung einer cDNA-Sequenz, welche für mindestens einen Teil des S-locusspezifischen Glycoproteins codiert, aus der selbstunverträglichen Pflanzenfamilie Brassica bereitgestellt.

Das Verfahren zur Klonierung einer c-DNA-Sequenz ist gekennzeichnet durch

A) a) eine cDUA-Bank mit Klonen, welche cDNA bis poly A + KNA aus unverträglichen Stigmas oder unverträglichen Griffeln bzw. Styli erzeugt;

584691

b) DNA aus den Klonen mit unverträglichen Stigma oder unverträglichen Griffel-cDNA-Proben und Samenmaterial bzw. Setzlingen, die sich von den c-DNA-Proben ableiten, hybridiert;

c) einen Klon-Untersatz mit DNA auswählt, welcher das Stigma oder die Griffel-cDNA Proben hybridisiert und welcher die Samenmaterial- bzw. Setzling-cDNA-Proben nicht hybridisiert;

d) die Transvektor-DNA, welche DNA von dem Klon-Untersatz enthält, herstellt und vermehrt, und

e) die Transvektor-DNA zur Abtrennung der Transfervektor-DNA von der DNA aus dem Klon-Untersatz digeriert, oder

B) a) eine cDNA-Bank mit Klonen, welche cDNA bis poly A + RNA aus unverträglichen Griffeln enthalten, erzeugt;

b) die DNA von den Klonen mit cDNA-Proben, die sich von Stigma ableiten, und Samenmaterial bzw. Setzlingen, die sich von Stigma ableiten, und Samenmaterial bzw. Setzlingen, die sich von cDNA-Proben ableiten, hybridisiert;

c) einen Klon-Untersatz mit DNA, welche die cDNA-Proben, die sich von Stigma ableiten, hybridisiert und welche das Samenmaterial bzw. die Setzlinge, die sich von cDNA-Proben ableiten, nicht hybridisiert, auswählt;

6) die Transfervektor-DNA, welche DNA aus dem Klon-Untersatz enthält, herstellt und vermehrt; und

e) die Transfervektor-DNA zur Abtrennung der Transfervektor-DNA von der DNA aus dem Klon-Untersatz digeriert.

2Z469 : - 6 -

Figur 1 ist eine Restriktionskarte bzw. -Ъапк und zeigt die DNA-Sequenz Strategie von Brassiсa cDNA-Insert auf pBOS5. Die Restriktionskarte wird durch gelelektrophoretische Analyse von einfachen und doppelten Enzymdigesten von pBOS5 konstruiert. Die dicke Linie zeigt den Codierungsbereich für das S-locusspezifische Glycoprotein, und die dünne Linie zeigt den 3'-Nichtcodierungsbereich der cDNA-Sequenz. Pfeile unterhalb der Karte zeigen die Richtung und das Ausmaß der Sequenzen, die in ШЗ-Vektoren subkloniert sind und von jeder Restriktionsstelle abgelesen werden.

Figur 2 ist ein Nucleotid und leitet sich von der Aminosäure-Sequenz des cDNA-Inserts von pBOS5 ab. Die Restriktionsstellen, die in der Figur 1 aufgeführt sind, sind gezeigt. Der Kasten umrahmt die Polyadenylierungssignal-Sequenz З'

In Figur 3 wird die Subklonierung von pBOS5 cDUA-Insert in pWR59O-Reihen der Expressionsvektoren beschrieben, wobei

(A) die Zeugung der pBOS5 L- und S-Fragmente durch Bam Hi-Xhol-Digestion bedeutet. Die Pfeile zeigen die entstehende Richtung der Transkription in dem Chimärenplasmid;

(B) ist die Karte von pWR59O. Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription. Lacz' bedeutet ein verkürztes lacz-Gen, welches für etwa 590 Aminosäuren codiert. Die expandierte Region, die auf das lacz'-Gen folgt, enthält die Polylinker-Sequenz; und

(C) ist die Nucleotid-Sequenz der Expressionsvektoren an den Fusionsverbindungen und die erwarteten Translationsprodukte, "nucs" bedeutet Nucleotide, "aas" bedeutet Aminosäuren.

Verfahren zur Herstellung des Klons

Die Strategie für die Isolation von SLSG-codierenden DNA-Sequenzen wurde aufgrund der Entdeckung vorausgesagt, daß in einigen selbstunverträglichen Stämmen, wie Brassica-Stämmen,

1 bis 5 % der Proteinsynthese in dem selbstunverträglichen Keimstigma der Synthese dieses Makromoleküls gewidmet ist (Nasrallah, J. B. et al, Experientia 40, 279-281 (1984)). Es erscheint daher wahrscheinlich, daß ein hoher Anteil der Klone in der cDNA-Bank, die mit poly A + EKA aus dem reifen unverträglichen Stigma konstruiert sind, SLSG-Sequenzen enthalten. Es wurde bereits in der Vergangenheit beobachtet, daß SLSG-Moleküle in dem Stigma, jedoch nicht im Blatt oder im Samengewebe, auftreten (Nasrallah, J. B. et al, Experientia 40, 279-281 (1984)). Die Anmelderin hat daher die Hypothese aufgestellt, daß SLSG cDNA-Klone in der Fraktion der Klone in einer solchen Bank angereichert sein würden, welche stark die radioaktive сША, welche der reifen Stigma-mRNA entspricht, hybridisieren, jedoch nicht in markierter Blattoder samenspezifischer сША.

Eine erfindungsgemäße cDNA-Bank kann gebaut werden bzw. aufgestellt werden, indem man cDNA aus poly A + RNA von unverträglichen Stigmas zu dem Zeitpunkt herstellt, wenn die Maximalsynthese von SLSG auftritt, indem man mit oligo(dT)^2_i entsprechend dem zuvor beschriebenen Verfahren primiert bzw. eine Primerreaktion durchführt (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982)).

Als Pflanzenquellen für die Erhaltung unverträglicher Stigmas können natürliche Populationen und Pflanzen, die aus Züchtungs programmen in Universitäten, Versuchsstationen und Samenherstellungsfirmen erhalten werden, verwendet werden. Beispiele geeigneter Pflanzen von natürlichen Populationen umfassen Lycopersicon peruvianum und solanum. Beispiele für geeignete Pflanzen aus Züchtungsprogrammen umfassen Gemüsenutzpflanzen, wie Kartoffeln, Tomaten, Kohlnutzpflanzen, Beetenutzpflanzen, Ornamentnutzpflanzen, wie Petunia, Nicotiana, Getreidenutzpflanzen und Gräser, wie Roggen, Steinobst, wie Kirschen, Pflaumen und Äpfel, IPutternutzpflanzen, wie Klee, Khaki bzw.

'^3469 ί - 8 -

Kohl und Senf, Ülsamen, wie Traubensamen, insbesondere Brassiсa napus. Besonders bevorzugt sind selbstunverträgliche Brassica oleracea-Pflanzen, welche für verschiedene S-Allele, wie Sg, S^, und S^, und 4-7 anderer bis heute bekannter Allele homozygot sind (Thompson, K. F. et al, Heredity, 21; 345-362 (1966); Ockendon, D. J., Heredity. j£, 159-171 (1974)).

Damit eine Homozygotie von Brassica oleracea erhalten wird, können reife Pollen auf unreife und damit selbstverträgliche Stigmas der gleichen Pflanze angewendet werden.

Beispiele von geeigneten S-Homozygoten umfassen alle stabilen S-Homozygoten unter den fünfzig bekannten. Bevorzugte Homozygo ten sind die Sg- und S^-Homozygoten von Brassica oleracea.

PoIyA+ ENA kann nach per se bekannten Verfahren, wie durch oligo(dT)-Chromatographie isoliert werden (Aviv, H. et al, Proc. Natl Acad. Sei. USA 6£, 1408 (1972)).

Die aus polyA+ RNA aus unverträglichen Stigmas hergestellte cDNA wird mit S^-Nuclease behandelt und anschließend mit dem Klenow-Fragment von E^ coli DNA-Polymerase zur Erzeugung von cDNA mit glatten Enden repariert (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning;: A Laboratory Manual (1982)). Die cD&A mit glatten Enden kann an Restriktions-Endonucleaselinker ligiert werden und zur Vervollständigung mit der Restriktions-Endonuclease digeriert werden (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982)). Fragmente von cDNA größer als 500 Basenpaaren ("bp") können nach an sich bekannten Verfahren einschließlich der Elektrophorese an Agarosegel isoliert und in die geeignete Restriktionsstelle eines Plasmids kloniert werden. Die Plasmide werden dann zur Transformierung von Zellen nach an sich bekannten Verfahren, wie dem Verfahren von Hanahan, D., J. Mol. Bio!. 166, 557-580 (1983) verwendet.

Geeignete Restriktions-Endonucleaselinker umfassen irgendwelche Linker, welche Restriktionsstellen enthalten, die den einzigartigen Restriktionsstellen in dem Plasmid entsprechen.

Beispiele umfassen Eco R^-Linker, Hin D-Linker und Barn HI-Linker, und besonders bevorzugte Restriktions-Endonucleaselinker für Brassica oleracea sind Bam H1-Linker.

Geeignete Plasmide umfassen irgendwelche Plasmide, welche die einzigen ßestriktionsstellen für den Einsatz fremder DNA enthalten. Beispiele sind pBR322 und pKC7. Das Plasmid pBR322 ist bevorzugt.

Geeignete Mikroorganismen-Wirtszellen umfassen irgendwelche Zellen, welche die Vervielfältigung der Recombinantplasmide unterstützen. Beispiele sind E^ coli HB1O1-, JM1O1- und SF8-Stämme. E_1- coli SF8 ist bevorzugt.

Stigma- und Samen-cDNA-Proben können nach an sich bekannten Verfahren, wie nach der Random-Primer-Umkehrtranskription von polyA+ ENA (Taylor, J. И. et al, Biochim. Biophys., Acta 442, 324- (1976) erhalten werden. Stigma-Proben werden aus polyA+ ENA hergestellt, welche durch Reinigung von selbstunverträglichem Stigma erhalten wurden, und Samenproben werden aus polyA+ RNA hergestellt, welche durch Reinigung aus etiolierten Sämlingen erhalten wurden.

Recombinant-Klone können nach irgendwelchen bekannten Verfahren gescreened werden einschließlich des Golony-Hybridisierungsverfahrens von Grunstein & Hogness (Grunstein, И. et al, Proc. Natl Acad. Sei. USA 72, 3961 (1975)).

Nachdem einmal die cDNA-Bank konstruiert worden ist, können unabhängige Klone randomartig aus der Bank herausgegriffen werden, und die DNA dieser Kolonien kann nach an sich bekannten

Verfahren charakterisiert werden, wie durch iTbertragung auf jedes von zwei Nitrocellulosefiltern und Hybridisierung mit den geeigneten Proben. Bei Brassiсa können Kolonien, die mit von Stigma abgeleiteten cMA-Proben stark hybridisieren, jedoch nicht mit Samen-cDNA-Proben reagieren, für die weitere Verwendung ausgewählt werden.

Ein solches Plasmid, welches Stigma abgeleitete ША-Homologe zu der von Brassiсa oleracea enthält, ist pB0S5 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 40191.

Nachdem die Kolonien einmal ausgewählt wurden, kann Plasmid DNA aus jeder der Kolonien hergestellt werden, und Zersetzungen (digests) mit der geeigneten Restriktions-Endonuclease können durchgeführt werden, so daß die сША-Inserts von dem Plasmidvektor durch Gelelektrophorese abgetrennt werden können.

Die Amplifikation und Isolierung von Plasmid DNAs kann unter Verwendung von Standardverfahren (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning; a Laboratory (1982)) durchgeführt werden. Die Inserts können von dem Plasmid durch Digestion mit geeigneter Restriktions-Endonuclease und anschließender Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution abgetrennt werden (McDonald, M. W. et al, J. Mol. Biol. 110, 119 (1977))·

Die Cross-Hybridisierungsversuche können mit diesen Digests (Abbaumaterialien) durchgeführt werden, um festzustellen, ob die DNAs aus den Plasmiden homolog zu der DNA der ursprünglichen Pflanzenquelle sind.

Es werden so die Plasmide, welche homologe DNA enthalten, bestimmt.

1 В 4 6 9 ί

Bestimmung; der Nucleotid-Sequenz von dem cDNA-lnsert (Einsatz) in T)BOS 5

Zur Bestimmung der Nucleotid-Sequenz des cDNA-Inserts können Fragmente des Plasmid-Inserts, welche durch Restriktions-Endonuclease erzeugt wurden, in geeignete Vektoren subkloniert werden, und die entstehenden einsträngigen DNAs können der Sequenzanalyse nach an sich bekannten Verfahren, wie nach dem Sanger-Verfahren (1979) unterworfen werden (Sanger, F. et al, J₅. Molec. Biol., 145 161-178 (1980)).

Geeignete Vektoren für die Subklonierung sind leicht verfügbar und dem Fachmann geläufig. Besonders bevorzugte Vektoren für den pB0S5-Insert sind M13-Vektoren mp10 und mp11 (Messing, J. et al, Gene 19, 269-2766 (1982)).

Die Restriktionsbank und die DNA-Sequentierungsstrategie von Brassica cDNA-Insert von pB0S5 ist in Figur 1 dargestellt.

Die Restriktionsbank wurde durch gelelektrophoretische Analyse verschiedener einsträngiger und doppelsträngiger Enzym-Digests von pB0S5 konstruiert. Die dicke Linie stellt den Codierungsbereich, und die dünne Linie stellt den З'-Nichtcodierungsbereich von der cDNA-Sequenz dar. Pfeile unterhalb der Karte zeigen die Richtung und das Ausmaß der Sequenzen, welche in M13-Vektoren subkloniert sind und von Jeder Restriktionsstelle abgelesen werden.

Die Ergebnisse der Nucleotid-Sequenzbestimmung an einem pB0S5 BamH1-Einsatz, subkloniert in M13mp10 und M13mp11, sind in Figur 2 dargestellt. Obgleich fünf der sechs möglichen Leseraster durch mehrfache Nonsense-Codons innerhalb des gesamten 1283-Basenpaar- ("bp") Einsatzes blockiert sind, translatiert das verbleibende Leseraster in ein Polypeptid mit einer Länge von 123 Aminosäuren, wie es in Figur 2 dargestellt wird. Die

Nucleotid-Sequenz AATAAA, welche als Signal für die Polyadenylierung von mRNA angenommen wird (Proudfoodt, N. J. et al, Nature 265, 211-214 (1976)), ist stromabwärts von dem SLSG-Codierungsbereich 11 bis 16 bp vom Ende des cDNA-Einsatzes lokalisiert, von dem man annimmt, daß er von dem З'-Ende von mRNA stammt. Die cDNA-Sequenz enthält keinen poly(A)-Schwanz, welcher normalerweise 11 bis 30 bp von dem Polyadenylierungssignal entfernt ist. Eine Erklärung für die Abwesenheit des poly(A)-Trakts ist die, daß die BamH1-Sequenzen, die beide Seiten des сША-Einsatzes flankieren, nicht der BamHI-Linker-Sequenz, die bei der Konstruktion von сША alleine verwendet wird, ähnelt. Man nimmt an, obgleich dies hypothetisch ist, daß eine BamH1-Erkennungsstelle in der vollen Länge der cDNA-Sequenz zwischen dem Polyadenylierungssignal und dem poly(A)-Schwanz des Messengers lokalisiert ist, so daß diese BamH1-Stellein den pBR322-Vektor anstelle des Endes, das durch die Linker-Sequenz geliefert wird, eingesetzt werden kann.

Konstruktion der Expressionsplasmide

Geeignete Expressionsvektoren sind Vektoren, welche Sequenzen der DNA enthalten, die für die Transkription klonierter Kopien von Genen und für die Translation ihrer mRNAs in E_5- coli erforderlich sind. Beispiele sind gt11, puc8, puc9, pWR59O, pWR59O-1, pWR59O-2. Bevorzugte Vektoren für den pBOS5-Insert sind die drei Expressionsvektoren pWR59O, pWR59O-1 und pWR59O-2, welche kürzlich beschrieben wurden (Guo, L. H. et al, Gene 29 < 251-254 (1984)). In diesen Vektoren kann fremde DNA in den Poly-Linkerbereich eingesetzt werden, so daß diese exogenen Sequenzen durch E_2- coli-Zellen in ein Fusionsprotein translatiert werden können, von denen die ersten 590 Aminosäuren durch ein abgestumpftes E_j_ coli ß-Galactosidasegen geliefert werden (Guo, L. H. et al, Gene 29, 251-254 (1984) und Figur 5a). Unter Verwendung aller drei Vektoren kann ein Fragment fremder DNA an das ß-Galactosidasegen in allen drei möglichen

28

8J с 9

Translations-Leserastern gebunden werden.

Der angenommene Codierungsbereich von dem сША-Insert aus Brassiсa oleracea ist vollständig innerhalb eines Fragments aus DNA (Fragment L in Figur 3B) enthalten, welches durch Recognitionssteilen für die Enzyme BamH1 (an den Stellen 1-6) und Xho I (Nucleotide 740-745) abgegrenzt ist. Wie in Figur 3C erläutert wird, kann das Fragment L aus pB0S5 theoretisch für ein Fusionsprotein, welches Determinanten, die für ein langes offenes Leseraster codieren, das durch DNA-Sequenzdaten vorgegeben wird, codieren, nur wenn es in den Vektor pWR59O-1 eingesetzt ist. Wenn es in irgendeinem der verbleibenden zwei Vektoren, pWR59O und pWR590-2, eingesetzt wird, wäre das Fragment L nicht in dem korrekten Leseraster, bezogen auf das ß-Galactosidasegen, und würde die Synthese eines Fusionsproteins, das im wesentlichen durch Brassiсa DHA spezifiziert wird, nicht dirigieren.

Es können so sechs Expressionsplasmide konstruiert werden, wie beispielsweise die sechs Expressionsplasmide, die aus den L- und S-8tränge von Brassica konstruiert werden.

Die entstehenden sechs konstruierten Stränge können individuell in geeignete Zellen durch Transformation eingearbeitet werden, und die Plasmide in verschiedenen Kolonien, die aus jeder der Transformation hervorgehen, können durch Digestion mit geeigneten Restriktions-Endonucleasen geprüft werden.

Geeignete Zellen für die Transformation des Expressionsplasmxds umfassen irgendwelche Stämme, welche seine Vervielfältigung bzw. Vermehrung und Translation erlauben. Beispiele sind E. coli-Btämme HB101, JM101 und SF8. Besonders bevorzugt ist E. coli SF8.

Eine Kolonie aus jedem Versuch, welche das erwartete Muster von Fragmenten ergibt, wurde ausgewählt. Aus Brassica besteht das erwartete Master aus zwei Fragmenten, wovon eines in seiner Größe entweder dem Fragment L oder dem Fragment S entspricht und das andere Fragment identisch mit der Länge zu dem Vektor ist.

Extrakte können aus Kulturen der ausgewählten Transformanten hergestellt werden, und nach geeigneten Verfahren, wie gemäß einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese, fraktioniert werden. Die auf diese Art analysierten Proteine können elektrophoretisch auf Nitrocellulosefilter übertragen werden und mit Antikörpern gegenüber SLGS nach an sich bekannten Verfahren analysiert werden. Das Plasmid, welches das Fragment L gebunden an den Vektor enthält, der die Synthese von SLGS-verwandten Polypeptiden dirigiert, kann durch positive Reaktion mit SLSG-Antiserum oder nach einem anderen geeigneten Verfahren identifiziert werden. Für Brassica sollte die Größe der prominenten Bande so sein, wie man sie für ein Fusionsprotein erwartet, welches aus den Aminosäuren des Expressionsplasmids und dem Poly-Linkerbereich und den 123 Aminosäuren, die durch Brassica cDNA-Klon codiert werden, besteht.

Wie bereits erwähnt, besitzt die vorliegende Erfindung zahlreiche Anwendungen. Eine davon besteht darin, S-Gene in Samenmaterial, beispielsweise gemäß der Southern-blot-Analyse, genomischer DNA zu identifizieren. Eine andere Anwendung besteht in der Identifizierung stabiler S-Allele mit starken Promotern, beispielsweise durch isoelektrische Fokussierung oder Transformation. Zusätzlich können transformierte Stämme, welche die S-Allele tragen, in Stämme, die unterschiedliche S-Allele tragen, eingepflanzt werden, so daß der Samen, welcher geerntet wird, ein vollständiges Hybrid ist. Weitere Anwendungen umfassen: eine Erleichterung der Hybridsamenproduktion durch einen wirksameren -Transfer stabiler S-Allele in

Samenmaterialien, beispielsweise durch Transformation, das Brechen bzw. Aufhören der Selbstunverträglichkeit in Fruchtbzw. Obstbäumen, beispielsweise die in vitro Mutagenese von S-Genen, oder durch chemische und immunochemische Blockierung der selbstunverträglichen Inbred-Linien, beispielsweise durch Transformation oder in vitro Mutagenese.

Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1 Herstellung eines Klons, welcher Brassica oleracea cDNA

enthält

Brassica oleracea selbstunverträgliche Pflanzen, welche für die S^-, S-J3- und S^-Allele, die in der State University New York, Cortland, gehalten wurden, homozygot sind, wurden für das folgende Experiment verwendet.

Homozygotie wurde erhalten, indem man reife Pollen auf unreife und somit selbstverträgliche Stigmas der gleichen Pflanze anwendete.

Brassica oleracea cDNA wurde aus polyA+ ENA aus Stigmas einen Tag vor der Anthese hergestellt, indem man mit oligoidT),.^,.« entsprechend dem zuvor beschriebenen Verfahren eine Primer-Reaktion durchführte (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning & Laboratory Manual (1982)).

Nach der Behandlung mit S^-Nuclease (Bethesda Research Laboratories, BEL) und der darauffolgenden Reparatur mit dem Klenow-Fragmeat von E₁^ coli DNA-Polymerase I (BRL) (Maniatis, T. et al, Molecular Colins: A Laboratory Manual (1982)) wurde die cDNA mit glatten Enden an BamH1-Linker (BRL) nach an sich bekannten Verfahren ligiert und zur Vervollständigung mit BamH1

nach an sich bekannten Verfahren digeriert (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)). cDNA-Spezies, die größer sind als 500 bp, wurden durch Elektrophorese an einem 1%igen niedrigschmelzenden Agarose-Gel in 0,089 molarer Tris-Base, 0,089 molarer Borsäure, 0,002 molarer Ethylendiamintetraessigsäure (Dinatriumsalz) isoliert und in die Barn HI-Stelle von Plasmid pBR322 nach an sich bekannten Verfahren (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982)) kloniert. Die Transformation von E. coli-SFe-Zellen, die im Handel erhältlich sind, erfolgt nach dem Verfahren von Hanahan (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1982)).

Ungefähr 2000 unabhängige Klone wurden randomartig aus der сША-Вапк herausgenommen, und die DNA dieser Kolonien wurde dann auf jedes von zwei Kitrocellulosefiltern transferiert und mit Stigma-cDNA- und Samen-cDNA-Froben hybridisiert.

Die Stigma- und Samen-cDNA-Proben wurden durch Random-Primer-Umkehrtranskription von polyA+ RNA hergestellt (Taylor, J. M. et al, Biochim. Biophys. Acta 442, 324 (1976)). Die Stigmaproben wurden aus polyA+ RKA durch Reinigung von Brassica selbstunverträglichen Stigmas hergestellt. Samenproben wurden aus polyA+ RNA durch Reinigung von Brassica etiolierten Sämlingen hergestellt.

Die recombinanten Klone werden nach dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren von Grunstein & Hogness (Grunstein, M. et al, Proc. Katl Acad. Sei. USA 72, 3961 (1975)) gescreened.

Es wurde gefunden, daß acht Kolonien stark mit der sicL von Stigma ableitenden cDWA-Probe hybridisieren, jedoch nicht mit der sich von Samen ableitenden cDNA-Probe reagieren.

Plasmid ША wurde aus jeder der acht Kolonien nach an sich bekannten Verfahren hergestellt (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)).

Das Plasmid DNA wurde mit Sestriktions-Endonuclease BamH1 digeriert (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)).

Die cDNA-Inserts wurden aus dem Plasmidvektor durch Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution hergestellt (McDonald, M. W. et al, J₁. Ш1. biol. 110, 119 (1977)) und wurden mit P gemäß der Nick-Translation (Rigby, P. W. J. et al, J_-2. Mol. Biol. 113, 237-251 (1977)) markiert.

Cross-Hybridisierungsversuche zwischen den verschiedenen isolierten Plasmiden wurden dann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982)).

Die Cross-Hybridisierungsversuche zeigen, daß alle acht Recombinant-Plasmide zueinander homolog sind. Das Plasmid, welches den größten cDNA-Einsatz enthält, wird als pB0S5 bezeichnet und besitzt die ATCC-Hinterlegungsnummer 40191.

Ausführungsbeispiel 2 Determination der Hucleotid-Sequenz von Brassica cDNA-Insert

in pB0S5

Durch Eestriktions-Endonuclease gebildete Fragmente von ρBOS5-Insert wurden in M13-Vektoren mp10 und mp11 subkloniert (Messing, J. et al, Gene 19, 269-2766 (1982)), vergleiche Eigur 1.

Die DNA-Sequentierung erfolgte mit der entstehenden einsträngigen DNA nach dem Dideoxynucleotid-Kettenterminationsverfahren

(Sänger, F. et al, J^ Mol. Biol. 145, 161-178 (1980)) unter Verwendung von synthetischem 17-mer als Primer (New England Biolabs). Der 17-mer-Primer besitzt die folgende Sequenz:

5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-J'.

Die Ergebnisse der Nucleotid-Sequenzdetermination längs einer projezierten Aminosäure-Sequenz sind in Figur 2 dargestellt.

Ausführungsbeispiel 5 Herstellung von Fusionsproteinen

Die Plasmide pw*R59O, PWR59O-1 sind eine Familie von Expressionsvektoren, die dazu geschaffen wurden, daß sie in jeder der drei möglichen Translationsraster Gene verdeutlichen (Guo, L. H. et al, Gene 29, 251-254- (1984)).

Zur Konstruktion von Expressionsplasmiden von der Brassiса cDNA-Sequenz werden die 745 bp (L) und die 558 pb (S) Bam HI-Xhol-Fragmente von pB0S5 aus einem 1%igen niedrigschmelzenden Agarose-Gel der gleichen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, isoliert und mit Barn H1- und SaI I-Digests von pWR59O, pWR59O-1 und pWE59O-2 nach an sich bekannten Verfahren ligiert (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)). Die entstehenden sechs Plasmidkonstruktionen, die als pWR59O-L, pWR59O-1L, pWR59O-2L, pWR59O-S, pWR59O-iS und pWR590-2S bezeichnet wurden, werden zur 'Transformierung von E_;_ с о Ii SF8-Zellen verwendet.

Transformierte E^ coli SF8-Stämme werden über Nacht in Anwesenheit von 1mM IpTG gezüchtet. Die Extrakte werden durch Beschallung in 7 M Guanidinhydrochlorid (Guo, L. H. et al, Gene 29, 251-254 (1984)) hergestellt, und aliquote Äquivalente zu 300 /Ul der Kultur werden der Elektrophorese an lOfeigen SDS-Acrylamidgelen (Laemnli, U. K., Nature 227, 680-685 (197O))

I С

unterworfen. Die abgetrennten Proteine werden elektrophoretisch auf Nitrocellulosemembranen entsprechend Towbin, H. et al, Proc. Natl Acad. Sei. USA 76, 4-350-4-354 (1979) transferiert .

Die Immunomarkierung der Nitrocellulose-Flecken erfolgt wie von Symington, J., "Two-dimensional Electrophoresis of Proteins", Academic Press (1983) beschrieben. Das Antiserum der ersten Stufe wird in einem Neuseeland-Weißen-Kaninchen durch mehrfache intradermale Injektionen von Sg-spezifischem Glycoprotein, gereinigt durch präparative isoelektrische Fokussierung, in granulierten Schichten gezüchtet. Die Probe der zweiten Stufe ist ein peroxidasekonjugiertes Protein A.

Ausführungsbeispiel M-

Genomische DNAs, isoliert aus verschiedenen Brassica-Spezies, beispielsweise Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica juncea, Brassica nigra und Brassica carinata, und von anderen Arten der gleichen Familie von Cruciferae (ebenfalls bekannt als Brassicaceae), wie Raphanus, Lepidium und Histera, werden der Southern-Analyse (Southern, E. O^ Mol. Biol., 98, 503-517 (1975) unterworfen. Die Nitrocellulose-Flecken der Restriktions-Digests von diesen DNAs werden mit ^J P-markiertem pBOS5 analysiert. In allen Fällen werden Sequenzbindungen, die zu pBOS5 hybridisieren und daher homolog zu pBOS5 sind, nachgewiesen.

Claims (1)

1. 20 4 S, 9 - Ю-

   Patentansprüche

   1. Verfahren zur Klonierung einer c-DNA-Sequenz, die für mindestens einen Teil eines S-locusspezifischen Glycoproteins der Pflanzenfamilie Brassicaceae codiert, gekennzeichnet dadurch, daß man

   A) a) eine сША-Вапк mit Klonen, welche с DNA bis poly

   A + ENA aus unverträglichen Stigmas oder unverträglichen Griffeln bzw. Styli erzeugt;

   b) DNA aus den Klonen mit unverträglichen Stigma oder unverträglichen Griffel-cDNA-Proben und Samenmaterial bzw. Setzlingen, die sich von den c-DNA-Proben ableiten, hybridiert;

   c) einen Klon-Untersatz mit DNA auswählt, welcher das Stigma oder die Griffel-cDNA Proben hybridisiert und welcher die Samenmaterial'- bzw. SetzlingcDNA-Proben nicht hybridisiert;

   d) die Transvektor-DNA, welche DNA von dem Klon-Untersatz enthält, herstellt und vermehrt, und

   e) die Transvektor-DNA zur Abtrennung der Transfervaktor-DNA von der DNA aus dem Klon-Untersatz digeriert,

   oder

   B) a) eine cDNA-Bank mit Klonen, welche cDNA bis poly

   A + RNA aus unverträglichen Griffeln enthalten, erzeugt;

   b) die DNA von den Klonen mit cDNA-Proben, die sich von Stigma ableiten, und Samenmaterial bzw. Setzlingen, die sich von Stigma ableiten, und Samen-

   material bzw. Setzlingen, die sich von cDNA-Proben ableiten, hybridisiert;

   c) einen Klon-Untersatz mit DNA, welche die cDNA-Proben, die sich von Stigma ableiten, hybridisiert und welche das Samenmaterial bzw. die Setzlinge, die sich von cDNA-Proben ableiten, nicht hybridisiert, auswählt;

   d) die Transfervektor-DNA, welche DNA aus dem Kl on-Untersatz enthält, herstellt und vermehrt; und

   e) die Transfervektor-DNA zur Abtrennung der Transfervektor-DNA von der DNA aus dem Klon-Untersatz digeriert.

   Hiet lu 3 bV/r*i