DD279962B5 - Confocal laser scanning microscope - Google Patents

Description

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Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung ist für die Anwendung in Laserrastermikroskopen vorgesehen. Im Gegensatz zur konventionellen Lichtmikroskopie wird bei der Laser-Raster-Mikroskopie das Objekt mit einem fokussierten Laserstrahl beleuchtet. Jede durch punktförmige Bestrahlung des Objektes ausgelöste physikalische Wechselwirkung kann mit einem geeigneten Empfänger erfasst und ortsabhängig zum Aufbau eines digitalen Bildes der Objekteigenschaften (z. B. Reflexion, Fluoreszenz, ausgelöster Photostrom) verwendet werden.The invention is intended for use in laser scanning microscopes. In contrast to conventional light microscopy, laser scanning microscopy illuminates the object with a focused laser beam. Each physical interaction triggered by punctiform irradiation of the object can be detected with a suitable receiver and used in a location-dependent manner to build up a digital image of the object properties (eg reflection, fluorescence, triggered photocurrent).

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Laserrastermikroskope können in ihrer allgemeinen Form als optische Systeme aufgefasst werden, die eine punktförmige Lichtquelle auf das Objekt abbilden. Das vom Objektpunkt ausgehende Signal wird durch einen geeigneten Detektor erfasst. Ein entsprechendes Bild wird durch rasterförmige Abtastung des Objektes (Relativbewegung zwischen Objekt und Beleuchtungsstrahl) aufgenommen (Wilson, Sheppard: „Theory and Practice of Scanning optical Microscopy", Academic Press 1984).Laser scanning microscopes, in their general form, can be understood as optical systems that image a point source of light onto the object. The signal originating from the object point is detected by a suitable detector. A corresponding image is taken by scanning the object (relative movement between the object and the illumination beam) (Wilson, Sheppard: "Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy", Academic Press 1984).

Ein hervorstechendes Merkmal sogenannter konfokaler Anordnungen ist die hohe Tiefenauflösung. Bei diesen Anordnungen wird die wirksame Empfängerfläche kleiner als der Durchmesser des bei Abbildung eines punktförmigen Objektes entstehenden Beugungsscheibchens gehalten. Man kann von einem Punktdetektor sprechen. Damit wird eine kohärente Übertragung gewährleistet.A salient feature of so-called confocal arrangements is the high depth resolution. In these arrangements, the effective receiver area is kept smaller than the diameter of the diffraction disk resulting from imaging a point-like object. One can speak of a point detector. This ensures a coherent transmission.

Anordnungen dieser Art werden auch als Laserrastermikroskope vom Typ Il bezeichnet.Arrangements of this type are also referred to as type II laser scanning microscopes.

Der grundlegende Aufbau einer solchen Anordnung ist in dem US-Patent 3 013 467 beschrieben. Nachteilig bei allen derartigen Einrichtungen ist die hohe Empfindlichkeit der Justierung der drei ineinander abzubildenden Punkte: Punktlichtquelle - Objektpunkt - Punktdetektor. Bereits geringste laterale Verlagerungen besonders der Punktlichtquelle gegenüber dem Punktdetektor verändern einschneidend die Bildinformation. Das dabei angewandte Objektscanning ist relativ langsam und erfordert an die Scanningeinrichtung und deren Parameter angepasste Objekte.The basic structure of such an arrangement is described in U.S. Patent 3,013,467. A disadvantage of all such devices is the high sensitivity of the adjustment of the three points to be imaged in each other: point light source - object point - point detector. Even the slightest lateral displacements, in particular of the point light source in relation to the point detector, drastically change the image information. The object scanning used is relatively slow and requires objects adapted to the scanning device and its parameters.

In einer weiteren bekannten Anordnung (DE 3 422 143 A1) sind bereits erste praktische Ansätze erkennbar, durch geeignete Strahlführung das sog. Strahlscanning durchzufahren und dabei die Empfindlichkeit des Mikroskopaufbaues gegenüber Instabilitäten zu reduzieren. In dieser Anordnung wird das zu untersuchende Licht erst kurz vor der Ebene, in der der Punktdetektor angeordnet ist, vom beleuchtenden getrennt, so dass Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlengang die gleichen Elemente durchlaufen und aufgrund der Umkehrbarkeit des Lichtweges sich Auswirkungen geringer Instabilität wieder kompensieren. Erst nach einem Teilungselement (in Untersuchungsrichtung gesehen) werden unterschiedliche Wege durchlaufen, in denen Abweichungen von der exakten Zentrierung auftreten.In a further known arrangement (DE 3 422 143 A1), the first practical approaches are already recognizable by passing through the so-called beam scanning by means of suitable beam guidance and thereby reducing the sensitivity of the microscope setup to instabilities. In this arrangement, the light to be examined is not separated from the illuminating light until shortly before the plane in which the point detector is located, so that illumination and observation beam paths pass through the same elements and due to the reversibility of the light path compensate for effects of low instability again. Only after a dividing element (seen in the examination direction) are different paths through which deviations from the exact centering occur.

Die genannte Anordnung verwendet beleuchtungsseitig eine Punktlichtquelle (Punktblende, Lasertaille), die als „Sonde" in das Objekt und von dort auf dem Abbildungsweg in eine Punktblende abgebildet wird. Das Bild der beleuchtungsseitigen Blende, dessen Durchmesser wenige μιτι beträgt, muss konstant auf Bruchteile seines Durchmessers zur abbildungsseitigen Blende justiert bleiben. Dabei ist der Justiervorgang recht aufwendig und die Sicherung der exakten Justierung über längere Zeiträume auch aufgrund von Umwelteinflüssen, äußerst schwierig, da die beiden von der Strahlenteilung aus getrennt laufenden Strahlengänge durch Alterung von Bauteilen, thermische Veränderungen, Luftschlieren zeitweilig oder ständig dejustiert werden.The said arrangement uses on the illumination side a point light source (point stop, laser waist), which is imaged as a "probe" into the object and from there on the imaging path into a point stop The image of the illumination side stop, whose diameter is a few μm, must be constant to fractions of its The adjustment process is quite complicated and the adjustment of the exact adjustment over longer periods due to environmental influences, extremely difficult, since the two separated from the beam splitting of continuous beam paths by aging of components, thermal changes, air streaks temporarily or be constantly misaligned.

Weiterhin wirkt sich ein anderer Umstand ebenfalls nachteilig aus. Verändert sich z. B. durch Höhenunterschiede im Objekt die Lage der Objektebene, so entsteht auf dem Objekt ein Zerstreuungskreis des Bildpunktes der beleuchtungsseitigen Punktblende. In die beobachtungsseitige Blende fällt dann ein geringerer Lichtstrom, woraus eine hohe Tiefenauflösung resultiert. Um wieder optimale Abbildungsverhältnisse zu erzeugen, muss das Objekt selbst axial so verschoben werden, bis es seine alte Lage wieder einnimmt. Die dazu erforderlichen Feinbewegungen im Ο,Ι-μΓη-Bereich sind mit hohem technischen Aufwand verbunden. Mit Hilfe eines aktiven Spiegels wird die Auswirkung der Defokussierung bezüglich der Intensität kompensiert. Es wird ein Fokus der beleuchtungsseitigen Blende in der beobachtungsseitigen Punktblende bzw. auf dem Punktdetektor erzeugt. Das Objekt liegt dabei aber nicht mehr im Fokus, so dass die laterale Auflösung reduziert wird.Furthermore, another circumstance also has a disadvantageous effect. If z. B. by differences in height in the object, the position of the object plane, so arises on the object a circle of confusion of the pixel of the lighting side point aperture. In the observation-side aperture then falls to a lesser flux, resulting in a high depth resolution. In order to produce optimal reproduction ratios, the object itself must be moved axially until it returns to its old position. The required fine movements in the Ο, Ι-μΓη range are associated with high technical complexity. With the help of an active mirror, the effect of the defocusing on the intensity is compensated. A focus of the illumination-side diaphragm is generated in the observation-side point diaphragm or on the point detector. The object is no longer in focus, so that the lateral resolution is reduced.

In US Re32660 ist ein konfokales Abbildungssystem mit einer Lochplatte beschrieben, wobei mit Polarisationsmitteln unerwünschte Reflexe unterdrückt werden.In US Re32,660 a confocal imaging system is described with a perforated plate, which are suppressed with polarizing agents unwanted reflections.

US 3 013 467 beschreibt die Bilderzeugung über eine bewegte Rasterplatte.US Pat. No. 3,013,467 describes the image formation via a moving grid plate.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit geringem Aufwand eine automatische Fokussierung zu erreichen, ohne dabei in das Mikroskopsystem einzugreifen.The invention has for its object to achieve an automatic focusing with little effort, without interfering with the microscope system.

Die Aufgabe wird bei einem konfokalen Laserrastermikroskop gemäß dem Oberbegriff des ersten Anspruchs durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.The object is achieved in a confocal laser scanning microscope according to the preamble of the first claim by the characterizing features of claim 1.

Vorteilhafte erfindungsgemäße Ausführungsformen bestehen darin, dass Mittel, wie Polarisatoren, ein Chopper, mindestens ein Sperrfilter, zur Trennung der Signalstrahlung von der Störstrahlung vorgesehen sind.Advantageous embodiments according to the invention are that means, such as polarizers, a chopper, at least one blocking filter, are provided for separating the signal radiation from the interfering radiation.

Durch die Trennung von beleuchtender und abbildender Strahlung in Abbildungsrichtung gesehen hinter der Blende, sind eine Modenblende im Beleuchtungsstrahlengang und die Empfängerblende identisch. Lageveränderungen der Blende gegenüber der Optik führt das Blendenbild in gleicher Größe und Richtung mit aus, so dass das Bild der Modenblende zwangsläufig zur Punktblende zentriert bleibt. Dadurch ist stets eine exakte räumliche Zuordnung von Punktlichtquelle, Objektpunkt und Punktdetektor gegeben. Zur erforderlichen Trennung der Signalstrahlung von Strahlungskomponenten, die durch Reflexion an der Blende oder Streuung an Elementen im Strahlengang entstehen, werdenDue to the separation of illuminating and imaging radiation seen in the imaging direction behind the aperture, a mode aperture in the illumination beam path and the receiver aperture are identical. Changes in position of the diaphragm with respect to the optics carries out the aperture image in the same size and direction, so that the image of the mode diaphragm inevitably remains centered to the point diaphragm. As a result, an exact spatial assignment of point light source, object point and point detector is always given. For the necessary separation of the signal radiation of radiation components, which arise by reflection at the diaphragm or scattering of elements in the beam path are

• polarisationsoptische Elemente (Pol-Filter, λ/4-Platten),Polarization-optical elements (pole filters, λ / 4 plates),

• interferenzoptische Methoden,• interference optical methods,

• ein Choppern des Signalstrahlenganges, zeitempfindliche Signaldetektoren (gating, Laufzeit) oder• chopping the signal beam path, time-sensitive signal detectors (gating, running time) or

• spektrale Filter bei Fluoreszenzverfahren vorgesehen.• Spectral filters designed for fluorescence.

Die axiale Verstellung einer zweiten verschiebbaren Linse im Strahlengang wird zur Fokussierung auf die Objektebene bzw. zur Aufnahme des Höhenprofils des Objektes verwendet. Das konfokale Laserrastermikroskop wird im folgenden näher erläutert, es ist zur Aufnahme von Auflicht- oder Fluoreszenzbildern geeignet.The axial adjustment of a second displaceable lens in the beam path is used for focusing on the object plane or for recording the height profile of the object. The confocal laser scanning microscope is explained in more detail below, it is suitable for recording incident light or fluorescence images.

Beleuchtungsseitig ist eine körperliche Blende angeordnet, die gegebenenfalls im Fokus eines Teleskopsystems steht und als Mittel zur K-Raum-Filterung dient. Diese Blende entspricht der punktförmigen Lichtquelle, die über eine entsprechende Optik auf das Objekt abgebildet wird. Ein in der Erfindung wahlweise vorgesehener Referenzdetektor ermittelt die Intensität des beleuchtenden Laserlichtes. Das bei der Beleuchtung des Objektes vom Objekt ausgehende Signallicht (Reflexion, Streuung, Fluoreszenz) durchläuft alle optischen Elemente des Beleuchtungsstrahlenganges in entgegengesetzter Richtung wie der Beleuchtungsstrahl selbst. Im Unterschied zu bekannten konfokalen Anordnungen trifft das Signallicht auf die erwähnte, im Beleuchtungsstrahlengang stehende Blende, die aufgrund der Anordnung stets zentriert bleibt. Nur das Zentrum des Beugungsscheibchens des Signallichts kann die Blende passieren. Das durch die Blende tretende Signallicht wird durch geeignete Mittel vom Beleuchtungsstrahlengang separiert (Strahlteiler) und auf den Signaldetektor gerichtet. Eine Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses wird durch die in der Erfindung wahlweise vorgesehene Unterdrückung ungewünschter Polarisationskomponenten, durch Intensitätsmodulation und damit Lock-in-Nachweis, durch langzeitempfindliche Signaldetektoren (gating), oder durch Wellenlängsenelektion bei Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Zur automatischen Fokussierung auf die Objektebene kann in der erfindungsgemäßen Lösung eine der zwischen Blende und Objekt stehenden Linsen, im einfachsten Fall die der Blende am nächsten stehende, eingesetzt werden. Hierfür ist in der Erfindung eine Lösung zur axialen Translation der entsprechenden Linsen vorgesehen. Der Abstand Linse - Blende wird damit so eingestellt, dass die jeweils am Signaldetektor ankommende Lichtintensität maximal ist, womit eine Scharfstellung auf die Objektebene automatisch gewährleistet ist. Wird zusätzlich der Abstand zwischen Blende und der zweiten verschiebbaren Linse bei der Abtastung des Objektes an jedem Punkt ermittelt, erhält man das Höhenprofil des Objektes. Im Gegensatz zu bisher bekannten konfokalen Anordnungen tritt bei der erfindungsgemäßen Lösung bei dieser Vorgehensweise der Ermittlung von Höhenprofilen des Objektes kein lateraler Auflösungsveriust ein, da Punktlichtquelle und Punktempfänger zusammen fallen und, sobald die Lichtquelle in die Objektebene abgebildet wird, der Punktempfänger automatisch in der konjugierten Ebene liegt.On the illumination side, a physical diaphragm is arranged, which optionally stands in the focus of a telescope system and serves as a means for K-space filtering. This aperture corresponds to the punctiform light source, which is imaged on the object via a corresponding optical system. A reference detector optionally provided in the invention determines the intensity of the illuminating laser light. The signal light emanating from the object when the object is illuminated (reflection, scattering, fluorescence) passes through all the optical elements of the illumination beam path in the opposite direction as the illumination beam itself. In contrast to known confocal arrangements, the signal light strikes the abovementioned aperture in the illumination beam path always remains centered due to the arrangement. Only the center of the diffraction disk of the signal light can pass through the aperture. The signal light passing through the diaphragm is separated from the illumination beam path by suitable means (beam splitter) and directed to the signal detector. An increase in the signal-to-noise ratio is made possible by the optionally provided in the invention suppression of unwanted polarization components, by intensity modulation and thus lock-in detection, by long-term sensitive signal detectors (gating), or by wavelength selection in fluorescence measurements. For automatic focusing on the object plane, in the solution according to the invention one of the lenses standing between the diaphragm and the object can be used, in the simplest case the lenses closest to the diaphragm. For this purpose, a solution for the axial translation of the corresponding lenses is provided in the invention. The lens - aperture distance is thus adjusted so that the respective incoming light intensity at the signal detector is maximum, whereby a focus on the object plane is automatically guaranteed. If, in addition, the distance between the diaphragm and the second displaceable lens is determined during the scanning of the object at each point, the height profile of the object is obtained. In contrast to previously known confocal arrangements occurs in the inventive solution in this approach, the determination of height profiles of the object no loss of resolution, since point light source and point receiver coincide and, as soon as the light source is imaged in the object plane, the point receiver automatically in the conjugate plane lies.

Ausführungsbeispielembodiment

Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. In der Zeichnung ist schematisch das konfokale Laserrastermikroskop dargestellt. Ein Laser 1 wird über einen ersten Polarisator 2, einen ersten Strahlteiler 3 und die erste λ/4-Platte 4 mit Hilfe der ersten Linse 5 auf eine körperliche Blende 6 fokussiert. Diese Blende dient in der erfindungsgemäßen Lösung gleichzeitig als K-Raum-Filter und als Modenblende. Mit der zweiten verschiebbaren Linse 7 wird die Strahlung kollimiert und durch das Laserrastermikroskop auf die Objektebene 11 fokussiert. Um die vom Objekt den gleichen Lichtweg zurückkommende Signalstrahlung, die über den ersten Strahlenteiler 3 auf den Signaldetektor 13 gelangt, von der an der K-Raumblende zurückgesteuerten Störstrahlung zu unterscheiden, sind aufgabenabhängig verschiedene Mittel vorgesehen: Die Polarisationsrichtung der Signalstrahlung wird mit der λ/4-Platte 4 so gedreht, dass sie den zweiten Polarisator 14 passieren kann. Da sich die λ/4-Platte 4 unmittelbar über dem Objektiv 8 befindet, erfolgt für die Störstrahlung zwischen erstem Strahlteiler 3 und λ/4-Platte 4 keine Drehung der Polarisationsrichtung, so dass diese Störstrahlung am Polarisator 14 unterdrückt wird.The invention will be explained in more detail with reference to an embodiment. In the drawing, the confocal laser scanning microscope is shown schematically. A laser 1 is focused on a physical diaphragm 6 via a first polarizer 2, a first beam splitter 3 and the first λ / 4 plate 4 with the aid of the first lens 5. This aperture serves in the inventive solution simultaneously as a K-space filter and as a mode aperture. With the second displaceable lens 7, the radiation is collimated and focused by the laser scanning microscope on the object plane 11. In order to differentiate the signal radiation coming back from the object, the same light path, which passes through the first beam splitter 3 on the signal detector 13, from the backscattered at the K-space aperture interfering means, various means are provided depending on the task: The polarization direction of the signal radiation is λ / 4 Plate 4 is rotated so that it can pass through the second polarizer 14. Since the λ / 4 plate 4 is located directly above the objective 8, there is no rotation of the polarization direction for the interference radiation between the first beam splitter 3 and λ / 4 plate 4, so that this interference radiation is suppressed at the polarizer 14.

Ein Chopper 15 im Abbildungsstrahlengang A ermöglicht einen Lock-in-Nachweis des Signales.A chopper 15 in the imaging beam path A allows lock-in detection of the signal.

Bei Fluoreszenz der Probe wird das Fluoreszenzsignal durch ein Sperrfilter 17, das die Laserwellenlänge sperrt, vor dem Signaldetektor 13 unterdrückt. Zur Korrektur von Schwankungen der Laserleistung im Laserrastermikroskop ist der zweite Strahlteiler 9 und der Referenzdetektor 12 vorgesehen. Eine automatische Fokussierung des Laserrastermikroskopes lässt sich durch Registrieren der maximalen Signalintensität bei axialer Verschiebung beispielsweise der zweiten verschiebbaren Linse 7 erreichen. Damit ist auch eine Betriebsart zur Vermessung der Höhenstruktur der Proben möglich, indem die Lage der zweiten verschiebbaren Linse 7 bei maximaler Signalintensität in Abhängigkeit vom Objektort aufgetragen wird.When fluorescence of the sample, the fluorescence signal is suppressed by a blocking filter 17, which blocks the laser wavelength, in front of the signal detector 13. To correct fluctuations in the laser power in the laser scanning microscope, the second beam splitter 9 and the reference detector 12 are provided. An automatic focusing of the laser scanning microscope can be achieved by registering the maximum signal intensity with axial displacement of, for example, the second displaceable lens 7. Thus, an operating mode for measuring the height structure of the samples is possible by the position of the second displaceable lens 7 is applied at maximum signal intensity as a function of the object location.

Claims (2)

Patentansprüche:claims: 1. Konfokales Laserrastermikroskop mit einer Laserlichtquelle (1) zur punktförmigen Beleuchtung der Objektebene (11), mit einem Strahlaufweitungssystem (5, 7), bestehend aus einer ersten Linse (5) zur Fokussierung des Laserlichtes auf eine Lochblende (6) und einer dieser Lochblende (6) im Strahlengang nachgeordneten zweiten Linse (7) zur Erzeugung eines der Objektivlinse (8) zugeführten Parallellichtbündels und mit einem Strahlteiler (3) zwischen der Laserlichtquelle (1) und der ersten Linse (5), der das Objektlicht reflektierend zu einem Detektor (13) auskoppelt, dadurch gekennzeichnet, dass die der Lochblende (6) nachgeordnete zweite Linse (7) in Strahlrichtung verschiebbar ausgebildet ist und eine Einstellung der Lage des Laserfokus senkrecht zur Objektebene (11) gewährleistet.1. Confocal laser scanning microscope with a laser light source (1) for spot illumination of the object plane (11), comprising a beam expansion system (5, 7), consisting of a first lens (5) for focusing the laser light on a pinhole (6) and one of these pinhole (6) in the beam path downstream second lens (7) for generating a the objective lens (8) supplied parallel light beam and with a beam splitter (3) between the laser light source (1) and the first lens (5) reflecting the object light to a detector ( 13) decoupled, characterized in that the pinhole (6) downstream second lens (7) is designed to be displaceable in the beam direction and ensures an adjustment of the position of the laser focus perpendicular to the object plane (11). 2. Kofokales Laserrastermikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Trennung des Objektlichtes von reflektiertem oder gestreutem Störlicht alternativ zwei Polarisatoren (2, 14) mit einer zugehörigen λ/4-Platte (4) oder ein Chopper (15) oder ein Sperrfilter (17) vorgesehen sind.2. Cofocal laser scanning microscope according to claim 1, characterized in that for the separation of the object light of reflected or scattered stray light alternatively two polarizers (2, 14) with an associated λ / 4 plate (4) or a chopper (15) or a blocking filter ( 17) are provided.