DD278359A1 - METHOD FOR OBTAINING CELLULASE ENZYME COMPLEXES - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cellulase-Enzymkomplexen. Moegliche Anwendungen bestehen in Produktionsanlagen, wo solche Enzyme erzeugt werden. Die hergestellten Cellulase-Enzymkomplexe sind beispielsweise fuer den Einsatz in der Nahrungsgueter- und Getraenkeindustrie, der Landwirtschaft und Textilindustrie geeignet. Die Gewinnung der Cellulase-Enzymkomplexe erfolgt durch aerobe Submerszuechtung einer neuen Penicillium verruculosum-Mutante, welche eine reduzierte Katabolitrepression der Cellulasebildung aufweist. Als Kohlenstoffquelle bei der Fermentation dienen induzierende Substrate allein oder in Kombination mit nichtinduzierenden Substraten. Durch Wahl des Substrates sowie des p H-Profiles wird die Zusammensetzung des Cellulase-Enzymkomplexes gezielt beeinflusst. Mittels einer fed-batch-Technik werden insbesondere loesliche Substrate fuer die Cellulasegewinnung dem Fermentationsmedium zugegeben.The invention relates to a method for obtaining cellulase enzyme complexes. Possible applications exist in production plants where such enzymes are produced. The produced cellulase enzyme complexes are suitable, for example, for use in the food and beverage industry, agriculture and textile industry. The recovery of the cellulase enzyme complexes is carried out by aerobic submergence of a new mutant Penicillium verruculosum, which has a reduced catabolite repression of cellulase formation. As a carbon source in fermentation, inducing substrates are used alone or in combination with non-inducing substrates. By choosing the substrate and the p H profile, the composition of the cellulase enzyme complex is specifically influenced. In particular soluble substrates for cellulase production are added to the fermentation medium by means of a fed-batch technique.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cellulase-Enzymkomplexen und/oder zellwandlytischen Enzymen durch aerobe Submerszüchtung von Pilzmutanten. Die gewonnenen Enzymkomplexe können zum teilweisen oder vollständigen Abbau von Cellulose sowie Hemicellulose in industriellen Produkten, Abfallstoffen, Abwässern oder beim Abbau von lebenden oder toten pflanzlichen Zellwänden verwendet werden.The present invention relates to a process for the recovery of cellulase enzyme complexes and / or cell wall lytic enzymes by aerobic submerse cultivation of fungal mutants. The enzyme complexes obtained can be used for the partial or complete degradation of cellulose and hemicellulose in industrial products, waste, waste water or in the degradation of living or dead plant cell walls.

Mögliche Anwendungsgebiete betreffen beispielsweise die Obst- und Gemüseverarbeitungsindustrie, die Brennerei- und Brauereiindustrie, die Extraktion pflanzlicher Zellinhaltsstoffe sowie die Silierung von Futtermitteln in der Landwirtschaft. Die gewonnenen Cellulase-Enzymkomplexe können auch als Biochemikalie Anwendung finden, beispielsweise bei der Herstellung von Protoplasten, der Behandlung oder analytischen Bewertung von Futtermitteln.Possible areas of application include, for example, the fruit and vegetable processing industry, the distillery and brewing industry, the extraction of plant cell ingredients and the ensiling of animal feed in agriculture. The obtained cellulase enzyme complexes can also be used as a biochemical, for example in the production of protoplasts, the treatment or analytical evaluation of feed.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Es ist bekannt, Enzyme des Cellulasekomplexes durch aerobe Submerszüchtung von Pilzen herzustellen. Die bekannten Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich in bezug auf die eingesetzten Pilzstämme, die verwendeten Substrate beim Fermentationsprozeß sowie die Prozeßführung. Die Wirtschaftlichkeit bei der Cellulasegewinnung wird wesentlich bestimmt durch die im Fermentationsmedium erzielte Enzymaktivität, durch die p>o Zeiteinheit gebildete Enzymmenge (Enzymproduktivität), durch die bezogen auf das eingesetzte Substrat gebildete Enzymmenge (Enzymausbeute) sowie durch die Zusammensetzung des Enzymkomplexes. Als geeignete Cellulasebildner sind besonders Pilzstämme der Gattungen Aspergillus, Penicillum und Trichoderma bekannt.It is known to produce enzymes of the cellulase complex by aerobic Submerszüchtung of fungi. The known methods differ mainly with respect to the fungi strains used, the substrates used in the fermentation process and the process control. The efficiency in the cellulase production is essentially determined by the enzyme activity achieved in the fermentation medium, the amount of enzyme formed by the time unit (enzyme productivity), the amount of enzyme formed based on the substrate used (enzyme yield) and the composition of the enzyme complex. As a suitable cellulase are particularly fungal strains of the genera Aspergillus, Penicillum and Trichoderma known.

Die aus Patent- und Fachliteratur bekannten Cellulasebildner mit dem bisher höchsten Cellulasebildungsvermögen gehören zur Art Trichoderma reesei. Die Cellulose-Enzymkomplexe von T. reesei sind durch einen besonders hohen Anteil an Cellobiohydrolase gekennzeichnet und sind besonders für den Abbau mikrokristalliner Cellulose geeignet. Mit dem Ziel einer Verbesserung des Cellulasebildungsvermögens wurden verschiedene T.reesei-Mutanten hergestellt. So wird in der Patentschrift WO 80/01080 die Cellulasebildung mit der Mutante T. reesei MCG 77 beschrieben. Die Cellulasebildung wird durch Glucose reprimiert, nicht jedoch durch Glycerol; Lactose wirkt induzierend auf die Cellulasebildung. Die mit 1 % Cellulose im Nährmedium erhaltene Cellulaseaktivität beträgt 1 ...1,8 U/ml FPA, die mit 1% Lactose erhaltene Aktivität beträgt. 1,35U/ml FPA und die mit 1 % Lactose plus 1 % Cellulose beträgt 1,75U/ml FPA.The cellulase former known from patent and technical literature with the highest cellulase-forming capacity to date belong to the species Trichoderma reesei. The T. reesei cellulose enzyme complexes are characterized by a particularly high content of cellobiohydrolase and are particularly suitable for the degradation of microcrystalline cellulose. For the purpose of improving the cellulase-producing ability, various T.reesei mutants were prepared. For example, WO 80/01080 describes cellulase formation with the mutant T. reesei MCG 77. Cellulase formation is repressed by glucose, but not by glycerol; Lactose has an inducing effect on cellulase production. The cellulase activity obtained with 1% cellulose in the nutrient medium is 1 ... 1.8 U / ml FPA, which is activity obtained with 1% lactose. 1.35 U / ml FPA and those with 1% lactose plus 1% cellulose is 1.75 U / ml FPA.

In der Patentschrift US 4,472,504 wird die Cellulasebildung mit der Mutante T. reesei MCG 80 beschrieben, welche aus der Mutante T. reesei Rut C30 gewonnen wurde. Bei Verwendung eines Nährmediums mit 8% Cellulose und Zusatz von Biotin wird in diskontinuierlicher Fermentation eine Cellulaseaktivität von 17,2 U/ml FPA erreicht, was einer Ausbeute von 215U FPA/g Cellulose entspricht.US Pat. No. 4,472,504 describes cellulase formation using the mutant T. reesei MCG 80, which was obtained from the mutant T. reesei Rut C30. When using a nutrient medium with 8% cellulose and addition of biotin, a cellulase activity of 17.2 U / ml FPA is achieved in discontinuous fermentation, which corresponds to a yield of 215 U FPA / g cellulose.

Es wurden auch T. reesei-Mutanten hergestellt, welche auf Basis von Glucose als Kohlenstoffq al¹-: Cellulaso bilden können. Über das Cellulasebildungsvermögen von T. reesei-Mutanten bei Einsatz von Glucose als Substrat wurde auf dem 3.Europäischen Kongreß über Biotechnologie berichtet (München, BRD; 10.-14.Sept. 1984; M.Baily: „Cellulase Production by Mutant Strains of Trichoderma reesei on non-Cellulosic Media"): Die höchste beschriebene Cellulaseaktivität wird mit der Mutante T. reesei VTT-D-79125 auf Basis von 4% Glucose plus 4% Brennerei-Treber erhalten und beträgt 6,4U/ml FPA. Mit Cellulose anstatt Glucose wurde bei diesem Stamm etwa die gleiche Cellulaseaktivität erhalten.T. reesei mutants have also been produced which can form cellulase on the basis of glucose as carbon q al ¹ -. The cellulase-producing capacity of T. reesei mutants when using glucose as a substrate was reported at the 3rd European Congress on Biotechnology (Munich, FRG, 10-14 September 1984, M.Baily: Cellulase Production by Mutant Strains of Trichoderma reesei on non-Cellulosic Media "): The highest cellulase activity described is obtained with the mutant T. reesei VTT-D-79125 based on 4% glucose plus 4% distillate grain and is 6.4 U / ml FPA instead of glucose, about the same cellulase activity was obtained in this strain.

Es wurde auch vorgeschlagen (1986), die Mutanten T. reesei tIMET 43803 und T. reesei ZIMET43804 für die Cellulaseherstellung einzusetzen, um auch mit löslichen Substraten hohe Cellulaseaktivitäten bei gleichzeitig hohen Cellulaseproduktivitäten erzielen zu können.It has also been proposed (1986) to use the mutants T. reesei TIMET 43803 and T. reesei ZIMET43804 for cellulase production, in order to be able to achieve high cellulase activities with soluble substrates and simultaneously high cellulase productivity.

Alle bekannten Trichoderma-Cellulasekomplexe haben jedoch den Nachteil, daß der ß-Glucosidaseanteil gering ist, was beim enzymatischen Abbau von Cellulose zu einer stärkeren Inhibierung der Cellulase durch die gebildete Cellobiose führt. Dieser Nachteil ist seit langem bekannt.However, all known Trichoderma cellulase complexes have the disadvantage that the ß-Glucosidaseanteil is low, resulting in the enzymatic degradation of cellulose to a stronger inhibition of cellulase by the cellobiose formed. This disadvantage has long been known.

So wurde ein Verfahren beschrieben, wo ß-Glucosidase mit Aspergillus phoenicis hergestellt wird, um T. reesei-Cellulasekomplexe zu supplementieren (Biotechnol. Bioeng. Symp. 10 [1980), 189). Für zahlreiche Cellulaseapplikationen in der Nahrungsgüter- und Getränkeindustrie sowie der Landwirtschaft werden Cellulase-Enzymkomplexe benötigt, welche neben der cellulosespaltenden Aktivität noch Nebenaktiv'täten aufweisen, beispielsweie Hemicellulose- und Amylaseaktivität. DieThus, a method has been described where β-glucosidase is produced with Aspergillus phenicis to supplement T. reesei cellulase complexes (Biotechnol. Bioeng., Symp. 10 (1980), 189). For many cellulase applications in the food and beverage industry and agriculture cellulase enzyme complexes are needed, which in addition to the cellulose-cleaving activity still Nebenaktiv'täten have, for example hemicellulose and amylase activity. The

T. reesei-Cellulasekomplexe verfügen zwar über eine hohe Aktivität gegenüber Cellulose, jedoch sind die Nebonaktivitäten geringer als bei verschiedenen Cellulasekomplexen anderer Pilzgattungen (z. B.: Phil. Trans. R. See. Lond. B 300, "783-291,1983).Although T. reesei cellulase complexes have high activity towards cellulose, the Nebon activities are lower than in various cellulase complexes of other fungal genera (for example: Phil Trans. R. See, London B 300, 783-291, 1983 ).

Deshalb wurden · ich Verfahren entwickelt, in denen Penicillium-Stämme für die Cellulasegewinnung eingesetzt werden.Therefore, I have developed methods in which Penicillium strains are used for cellulase production.

Beispielsweise \ lemäß DD-WP 225712 Penicillium janthinellum als Cellulasebildner eingesetzt, wobei Cellulose in Kombination m.. jehandeltem Grünmehl als Substrat für die Cellulasefermentation dient. In einer fed-batch-Kultivierung wird bei Einsatz von insgesamt 6% Cellulose zuzüglich Grünmehlmedium nach 8 Tagen eine Cellulaseaktivität von 6 U/ml Filterpapieraktivität erreicht, was einer Ausbeute von 100U FPA je Gramm Cellulose entspricht; die Cellobiuse-Aktivität beträgt 2 bis4U/ml.For example, DD-WP 225712 Penicillium janthinellum is used as a cellulase former, cellulose in combination with milled green flour serving as a substrate for cellulase fermentation. In fed-batch cultivation, a total cellulase activity of 6 U / ml filter paper activity is achieved after 8 days using 6% cellulose plus green flour medium, which corresponds to a yield of 100 U FPA per gram of cellulose; the cellobius activity is 2 to 4U / ml.

Das Grünmehlmedium wird durch mechano-chemische Vorbehandlung von Grünmehl hergestellt.The green flour medium is produced by mechano-chemical pretreatment of green flour.

Darüber hinaus wurden auch andere Penicillium-Stämme für die Cellulasegewinnung eingesetzt, beispielsweise gemäß DE-OS 2133 544 und DE-OS 1767 737. All diesen Verfahren liegen batch- oder fed-batch-Techniken zugrunde, in denen Cellulose oder pflanzliche cellulosehaltige Substrate einzeln oder in Kombination als C-Quelle dienen und in denen jeweils unterschiedliche definierte pH- und Temperaturprofile zur Erzielung günstiger Enzymkomplexe eingestellt werden.In addition, other Penicillium strains were used for cellulase production, for example, according to DE-OS 2133 544 and DE-OS 1767 737. All these methods are based on batch or fed-batch techniques in which cellulose or vegetable cellulosic substrates individually or serve in combination as a C source and in each of which different defined pH and temperature profiles are set to obtain favorable enzyme complexes.

So wird mit Penicillium funiculosum (Enzyme Microb. Technol. 1983, Vol. 5, 22-24) auf Basis von 6% Cellulose eine Cellulase-Aktivität von 3,5U/ml FPA und eine ß-Glucosidase-Aktivität 12U/ml (gemessen durch Abbau von 4-Nitrophenyl-ß-D-glucosid) erzielt.For example, with Penicillium funiculosum (Enzyme Microb. Technol. 1983, Vol. 5, 22-24) based on 6% cellulose, a cellulase activity of 3.5 U / ml FPA and a β-glucosidase activity of 12 U / ml (measured by degradation of 4-nitrophenyl-.beta.-D-glucoside).

Es wird auch die Cellulasegewinnung mit einem Penicillium verruculosum Wildstamm beschrieben (Euruopean J. Appl.It also describes the cellulase production with a Penicillium verruculosum wild strain (Euruopean J. Appl.

Microbiol. 11 [1981), 2,120-124); bei Verwendung eines Nährmediums mit Zuckerrübenextraktionsrückständen sowie entfattetem Sonnenblumensamenmehl wurde die günstigste Collulasebildung beobachtet. Mit Mandels-Reese-Medium (1957) und 7,5g/l reiner Cellulose plus 1 g/l Weizenkleie wurde eine Filterpapieraktivität von 0,3 U/ml erzielt.Microbiol. 11 [1981], 2,120-124); when using a nutrient medium with sugar beet extraction residues and degraded sunflower seed meal, the most favorable collulase formation was observed. With Mandels-Reese medium (1957) and 7.5 g / l pure cellulose plus 1 g / l wheat bran, a filter paper activity of 0.3 U / ml was achieved.

Alle bekannten Verfahren zurCellulasegewinnung haben den Nachteil, daß die bezogen auf das eingesetzte Substrat erhaltenen Cellulaseausbeuten relativ niedrig sind oder daß die im Fermentationsmedium erzielten Cellulase-Aktivitäten niedrig sind oder daß eine proportionale Erhöhung der Cellulase-Aktivität mittels Substratzugabe nicht möglich ist oder aber daß der Cellulase-Enzymkomplex eine wenig günstige Zusammensetzung aufweist.All known processes for cellulase production have the disadvantage that the cellulase yields obtained based on the substrate used are relatively low or that the cellulase activities achieved in the fermentation medium are low or that a proportional increase in cellulase activity by means of substrate addition is not possible or that cellulase Enzyme complex has a little favorable composition.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Es ist das Ziel der Erfindung, hohe Cellulase-Aktivitäten im Fermentationsmedium und gleichzeitig hohe substratbezogene Enzymausbeuten zu erreichen, um somit eine effektive Ausnutzung von Fermentorvolumen und Substrat zu gewährleisten. Darüber hinaus besteht das Ziel darin, einen Cellulasekomplex zu gewinnen, welcher eine hohe Abbauleistung sowohl gegenüber reiner Cellulose als auch gegenüber cellulosehaltigen pflanzlichen Substraten aufweist.It is the object of the invention to achieve high cellulase activities in the fermentation medium and at the same time high substrate-related enzyme yields, thus ensuring effective utilization of fermentor volume and substrate. In addition, the aim is to obtain a cellulase complex which has a high degradation efficiency both against pure cellulose and against cellulose-containing plant substrates.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine leistungsverbesserte Cellulase-Mutunte zu gewinnen und in einem Kultivierungsverfehren einzusetzen, wobei in einer Fermentationsstufe mit hoher Cellulaseproduktivität und hoher Cellulase-Aktivität ein solcher Cellulase-Enzymkomplex gebildet wird, welcher über einen ausreichenden Anteil ß-Glucosidase verfügt und welcher einen höheren Anteil an Nebenaktivitäten aufweist, die für den Abbau cellulosehaltiger pflanzlicher Substanzen erforderlich sind.The invention has for its object to obtain a performance-enhanced cellulase Mutunte and use in a cultivation, wherein in a fermentation step with high cellulase productivity and high cellulase activity, such a cellulase enzyme complex is formed, which has a sufficient proportion ß-glucosidase and which has a higher proportion of side activities required for degradation of cellulosic plant substances.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß die Pilz-Mutante Penicillium verruculosum IMET 43857 aerob und submers nach an sich bekannter Weise in einem Nährmedium kultiviert wird, welches ein oder mehrere die Cellulasebildung und/oder die Bildung zellwandlytischer Enzyme induzierende Substrate allein eic in Kombination mit einem oder mehreren nichtinduzierenden Substraten enthält.According to the invention, the object is achieved in that the fungus mutant Penicillium verruculosum IMET 43857 is cultured aerobically and submerged in a conventional manner in a nutrient medium, which one or more cellulase formation and / or the formation of cell walllytischer enzymes inducing substrates alone eic in combination with one or more non-inducing substrates.

Es wurde gefunden, daß diese Mutante bei geeignetem pH bzw. geeignetem pH-Profil einen höheren Anteil ß-Glucosidase und einen höheren Anteil Nebenaktivitäten, insbesondere Hemicellulase, Pektinase und Amylase, ins Kulturmedium ausscheidet. Der Stamm verfügt über eine reduzierte Katabolitrepression der Cellulasebildung gegenüber Glycerol und Galactose. Der erfindungsgemäße Stamm wurde durch Mutation und Selektion in mehreren Stufen aus dem Wildstamm Penicillium verruculosum ltC71 gewonnen und in der Hinterlegungsstelle der ZIMET-Kultuiensammlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und unter der Nummer IMET 43857 registriert.It has been found that this mutant excretes a higher proportion of β-glucosidase and a higher proportion of side activities, in particular hemicellulase, pectinase and amylase, in the culture medium at a suitable pH or suitable pH profile. The strain has a reduced catabolite repression of cellulase formation compared to glycerol and galactose. The strain according to the invention was obtained by mutation and selection in several stages from the wild strain Penicillium verruculosum ltC71 and deposited in the depository of the ZIMET culture collection in the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the Academy of Sciences of the GDR and registered under the number IMET 43857.

Der Stamm ist durch folgende Merkmale charakterisiert: Starnmbeschreibup.g/Morphologie, PhysiologieThe strain is characterized by the following features: Starnsprreibup.g / morphology, physiology

Der Stamm weist die für Penicillium typischen morphologischen ' lerkmale auf und unterscheidet sich vom Ausgangsstamm hauptsächlich in physiologischen Eigenschaften, insbesondere in bezug auf die Cellulasebildung.The strain has the morphological characteristics typical of Penicillium and differs from the parent strain mainly in physiological properties, particularly with respect to cellulase formation.

Die Erhaltung des Stammes ist auf den für Penicillium-Stämme gebräuchlichen Nährmedien möglich. Beispielsweise sind Kartoffel-Dextrose-Agar, Czapek-Dox-Agar, Sporulationsjgar (Ammoniumsulfat 0,2%; Kaliumdihydrcgenphosphat 0,5%, Glucose 2%, Hefeextrakt 0,7%; Agar 2%) oder CM-Agar (Kaliumhydrogenphosphat 1 %, Glucose 1 %; Hefeoxtrakt 0,5%; Agar 2 %) hierfür geeignet. Die Bebrütungstemperatur beträgt zweckmäßig 28 bis 32⁰C, die Bebrütungsdauer etwa 5-71 age und weitere 5-7 Tage bei Raumtemperatur bis zur vollen Entwicklung der Stämme. Die Uberimpfung wird mittels Konidien vorgenommen; die Farbe der Konidien ist in Abhängigkeit des Nährmediums grün bis graugrün, mitunter auch gelbgrün.The preservation of the strain is possible on the common nutrient media for Penicillium strains. For example, potato dextrose agar, Czapek Dox agar, sporulation jar (ammonium sulfate 0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.5%, glucose 2%, yeast extract 0.7%, agar 2%) or CM agar (potassium hydrogen phosphate 1%). , Glucose 1%, yeast extract 0.5%, agar 2%). The incubation temperature is suitably 28 to 32 ⁰ C, the incubation period about 5-71 age and another 5-7 days at room temperature until the full development of the strains. The inoculation is carried out by conidia; The color of the conidia is green to gray-green depending on the nutrient medium, sometimes also yellow-green.

Der Stamm ist prototroph (z. B. bezügl. Wachstum auf Glucose, Fructose, Glycerol, Lactose), darüber hinaus resistant gegenüber 2-Deoxy-D-glucose und 2-Deoxy-D-galactose sowie partiell resistent gegenüber 5-Thio-D-glucoso.The strain is prototrophic (eg, growth on glucose, fructose, glycerol, lactose), moreover resistant to 2-deoxy-D-glucose and 2-deoxy-D-galactose, and partially resistant to 5-thio-D -glucoso.

Wachstum (Einzelkolonien) von P. verruculosum IMET 43857 auf Minimalmedium mit verschiedenen C-Quellen (Agarplatten): 7 Tage Qebrütung bei 3O⁰CGrowth (Single colonies) of P. verruculosum IMET 43857 on minimal medium with different carbon sources (agar plates): 7 days Qebrütung at 3O ⁰ C

Mini- (NH₄I₂SO₄:5g/lMini- (NH ₄ I ₂ SO ₄ : 5g / l

mal- KH₂PO₄:1 g/ltimes KH ₂ PO ₄ : 1 g / l

me- MgSO₄-7aq:0,5g/lme- MgSO ₄ -7aq: 0.5g / l

dium: Agar:20g/lmedium: agar: 20g / l

C-QuelleC source

Koloniedurchmesser (mm) CharakterisierungColony Diameter (mm) Characterization

1%1% Fructosefructose 2525 1%1% Lactoselactose 3030 1%1% Glycerolglycerol 3838 1%1% Glucoseglucose 4040 1%1% Glucose + 0,5%Glucose + 0.5% 3838 2-Deoxy-D-glucose2-deoxy-D-glucose 1% '1% ' Glucose + 0,5%Glucose + 0.5% 4040 2-Deoxy-D-galactose2-deoxy-D-galactose 1%1% Glucose + 0,5%Glucose + 0.5% 3535 2-Deoxy-D-ribose2-deoxy-D-ribose 1%1% Glucose + 0,5%Glucose + 0.5% 99 5-Thio-D-glucose5-thio-D-glucose 0,5%0.5% 2-Deoxy-D-glucose2-deoxy-D-glucose 1414 0,5%0.5% 2-Deoxy-D-galactose2-deoxy-D-galactose 44 0,5%0.5% 2-Deoxy-D-ribose2-deoxy-D-ribose 77 0,5%0.5% 5-Thio-D-glucose5-thio-D-glucose 00 0,5%0.5% Fructose-6-PhosphatFructose 6-phosphate 2323

weißlich-gelb; samtig, schwache radiale Faltungwhitish-yellow; velvety, weak radial folding

graugrün; dünnes Mycel, keine FaltungGray-green; thin mycelium, no folding

graugrün; dünnes Mycel, keine FaltungGray-green; thin mycelium, no folding

radiale Faltung; Sporulation gelbradial folding; Sporulation yellow

gelb, Sporulationyellow, sporulation

grau; Sporulation gelb; SporulationGray; Sporulation yellow; sporulation

gelb-braun; kompakt-koloniales Wachstumyellow-brown; compact colonial growth

grau-gelb; kompakt-koloniales Wachstum, starke radiale Faltung dünne Mycelschicht, Sektorenbildunggrey yellow; compact colonial growth, strong radial folding thin mycelium layer, sector formation

dünne Mycelschicht, keine Sporulation (kein Wachstum) dünne Mycelschicht, im Zentrum Sporulationthin mycelium layer, no sporulation (no growth) thin mycelium layer, in the center sporulation

Wachstum von Einzelkolonien auf CM-Agar, 6 Tage Bebrütung bei 3O⁰CGrowth of single colonies on CM agar, 6 days incubation at 3O ⁰ C

IMET 43857 40mm Koloniedurchmesser; grün, gelber Rand, starke Sporulation; schwache FaltungIMET 43857 40mm Column Diameter; green, yellow margin, strong sporulation; weak folding

Die Erhaltung des Stammes in lyophilisierter Form oder über bzw. in flüssigem Stickstoff ist mittels der allgemein praktizierten Methoden möglich, ohne daß ein Rückgang des Cellulasebildungsvermögens bisher beobachtet werden konnte. Der Stamm besitzt ein partiell-katabolitdereprimiertes Cellulasebildungsvermögen, d. h. in Gegenwart einiger leicht verwertbarer Substrate wie beispielsweise Glycerol oder verschiedene Zucker werden bis zu einer bestimmten Substratkonzentraiion Enzyme des Cellulase-Komplexes gebildet.The maintenance of the strain in lyophilized form or over or in liquid nitrogen is possible by means of the generally practiced methods, without a decline in the ability of cellulase to be observed hitherto. The strain has a partial catabolite-depressed cellulase-producing capacity, i. H. in the presence of some readily utilizable substrates such as glycerol or various sugars, enzymes of the cellulase complex are formed to a certain substrate concentration.

Die reduzierte Katabolitrepression des Cellulasebildungbvermögens läßt sich in Anlehnung an die Methode von B.S.Montenecourt und D.E.Eveleigh (Applied and Environmental Microbiology 33,1977,178-183) testen. Als Substrate im Agarmedium dienen säuregequollene Cellulose in Kombination mit dem jeweils untersuchten Repressor, insbesondere Glycerol, Galactose, Glucose und Xylose. Zur Begrenzung der Koloniegröße wird Bengalrosa in einer Konzentration von 30 mg/l dem Agarmedium zugesetzt. Die Dicke der Agarschicht wird auf 4mm eingestellt. Bei einem Plattendurchmesser von 9cm werden zweckmäßig 100 bis 200 Konidien je Platte aufgeimpft. In Anlehnung an die genannte Methode wird die Ausbildung der Klarzone als Folge des Celluloseabbaues durch eine an die Bebrütung sich anschließende Inkubation bei 45...47⁰C über 20 Stunden vorgenommen, wobei die Lebensfähigkeit der Konidien des erfindungsgemäßen Stammes erhalten bleibt. Der Stamm IMET 43857 bildet Klarzonen bei den Substratkombinationen 0,5% säuregequollene Cellulose plus 5% Glycerol und 0,5% säuregequollene Cellulose plus 5% Galactose.The reduced catabolite repression of cellulase formation can be tested by following the method of BS Montsencourt and DEEveleigh (Applied and Environmental Microbiology 33, 1977, 178-183). The substrates used in the agar medium are acid-swollen cellulose in combination with the particular repressor investigated, in particular glycerol, galactose, glucose and xylose. To limit the colony size, rose bengal is added to the agar medium at a concentration of 30 mg / l. The thickness of the agar layer is set to 4mm. With a plate diameter of 9 cm, it is expedient to seed 100 to 200 conidia per plate. Following the above method, the formation of the clear zone is carried out as a result of cellulose degradation by incubation at 45 ... 47 ⁰ C subsequent to incubation for 20 hours, whereby the viability of the conidia of the strain according to the invention is maintained. The strain IMET 43857 forms clear zones in the substrate combinations 0.5% acid swollen cellulose plus 5% glycerol and 0.5% acid swollen cellulose plus 5% galactose.

Der Ausgangsstamm P. verruculosum ItC 71 bildet auf keinem dieser Medien Klarzonen, da bei diesem die Cellulasebildung einer starken Katabolitrepression unterworfen ist. Mit dieser Methode kann auch die Klonselektionierung vorgenommen werden. Die Testung des katabolitdereprimierten Cellulasebildungsvermögens des beschriebenen Stammes ist auch in Röhrchen möglich. Beispielsweise werden Konidien auf ein Agarmedium mit säuregequollener Cellulose in Kombination mit dem jeweils untersuchten Repressor, jedoch ohne Zusatz von Bengalrosa, überimpft. Der Röhrchendurchmesser beträgt zweckmäßig 9 mm. Als Maß für das Cellulasebildungsvermögen dient die Tiefe der Klarzone im Röhrchen unterhalb der Mycelschicht; die Bebrütung und Inkubation bei 45°C werden wie bei dem beschriebenen Plattentest vorgenommen.The parent strain P. verruculosum ItC 71 does not form clear zones on any of these media, as cellulase formation is subject to severe catabolite repression. With this method, the clone selection can be made. The testing of the catabolite-depressed cellulase-forming capacity of the described strain is also possible in tubes. For example, conidia are inoculated on an agar medium with acid-swollen cellulose in combination with the particular repressor investigated, but without the addition of rose bengal. The tube diameter is appropriate 9 mm. As a measure of cellulase capacity, the depth of the clear zone in the tube below the mycelium layer is used; incubation and incubation at 45 ° C are performed as in the plate test described.

Cellulosebildungsvermögen im RöhrchentestCellulose-forming capacity in the tube test 1%AC1% AC C-Üuelle (Klarzonen in mm) 0,5% AC + 0,5% AC + 5% Glycerol 5% GalactoseC-standard (clear zones in mm) 0.5% AC + 0.5% AC + 5% glycerol 5% galactose 0 40 4 0,5AC + 0,5% Glucose0.5AC + 0.5% glucose -4--4- 278 359278 359 Stammtribe 2 52 5 0 60 6 0 00 0 P. v. ItC 71 P.V.IMET43857P. v. ItC 71 P.V.IMET43857

AC: Amorphe CelluloseAC: amorphous cellulose

Kultivierung und Fermentation des Cellulasebildners und Gewinnung des EnzymkomplexesCultivation and fermentation of the cellulase former and recovery of the enzyme complex

Die Kultivierungstemperatur der Mutante P. verruculosum IMET 43857 beträgt 22 bis 38°C, vorzugsweise 30 bis 35°C für das Mycelwachstum und 26 bis 32°C für die Enzymbildung. Der pH-Wert für die Kultivierung liegt im Bereich von 2 bis 7, vorzugsweise von 2,5 bis 5,5 für das Mycelwachstum und von 3,1 bis 6,2 für die Enzymbildung.The culture temperature of the mutant P. verruculosum IMET 43857 is 22 to 38 ° C, preferably 30 to 35 ° C for mycelial growth and 26 to 32 ° C for enzyme formation. The pH for culturing ranges from 2 to 7, preferably from 2.5 to 5.5, for mycelial growth and from 3.1 to 6.2 for enzyme formation.

Als Kultivierungsgefäße sind alle unter Ausschluß von Fremdinfektionen betreibbaren Fermentoren geeignet, welche eine ausreichende Versorgung mit Sauerstoff gewährleisten und in welchen keine lang andauernden extrem hohen Scherfelder auftreten, denen große Teile des Fermentationsmediums ständig ausgesetzt sind.As cultivation vessels are all operable to the exclusion of extraneous infections fermenters, which ensure an adequate supply of oxygen and in which no long-lasting extremely high shear fields occur to which large parts of the fermentation medium are constantly exposed.

Ausgangspunkt für die Kultivierung sind Konidien von Emerskulturen, insbesondere von Schrägagarkulturen auf Kartoffel-Dextrose-Agar.The starting point for the cultivation are conidia of emercultures, in particular of skew agar cultures on potato dextrose agar.

Als Inokulurn für das Fermentationsmedium dienen Konidien, vorzugsweise in einer Konzentration von 10⁷ bis 10⁹ je Liter Fermentationsmedium, oder Suspensionen vegetativen Mycels, vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 15VoI.-% des zu beimpfenden Mediums.As inoculum for the fermentation medium are conidia, preferably in a concentration of 10 ⁷ to 10 ⁹ per liter of fermentation medium, or suspensions of vegetative mycelium, preferably in an amount of 1 to 15VoI .-% of the medium to be inoculated.

Für die Beimpfung großer Fermentoren wird das Inokulum zweckmäßig in mehreren Stufen nacheinander angezogen.For inoculation of large fermentors, the inoculum is suitably grown in several stages in succession.

Die Prozeßführung bei der Züchtung der Mutante P. verruculosum IMET 43857 zur Gewinnung des Cellulase-EnzymkomplexesThe process control in the cultivation of the mutant P. verruculosum IMET 43857 to obtain the cellulase enzyme complex

ist in' Abhängigkeit der verwendeten Substrate oder Substratkombinationen und der zu erzielenden Enzymzusammensetzung verschieden.is different depending on the substrates or substrate combinations used and the enzyme composition to be obtained.

Zur Bildung des Cellulase-Enzymkomplexes ohne erhöhten Anteil an Nebenaktivitäten kann reine Cellulose als induzierendes Substrat eingesetzt werden. Bis zu einer Konzentration von etwa 2% Cellulose ist in diskontinuierlicher Fermentation die im Fermentationsmedium gebildete Cellulaseenzymmenge der eingesetzten Cellulosemenge proportional. Höhere Cellulosekonzentrationen führen zu einer höheren Cellulaseaktivität im Fermentationsmedium, wobei die Zunahme der Cellulaseaktivität dann jedoch nicht mehr der eingesetzten Cellulosemenge proportional ist, so daß die Cellulaseausbeute absinkt. Eine der eingesetzten Cellulosemenge proportionale Erhöhung der Cellulasebildung ist gemäß einer beschriebenen fed-batch-Technik möglich, bei welcher die Zuführung der Cellulose mittels einer Regeleinrichtung oder einer rechnergestützten Prozeßsteuerung von der spezifischen Kohlendioxidentwicklung des Mycels angesteuert wird.Pure cellulose can be used as the inducing substrate to form the cellulase enzyme complex without an increased amount of side activities. Up to a concentration of about 2% cellulose, the amount of cellulase enzyme formed in the fermentation medium is proportional to the amount of cellulose used in batch fermentation. Higher cellulose concentrations lead to a higher cellulase activity in the fermentation medium, but the increase in cellulase activity is then no longer proportional to the amount of cellulose used, so that the cellulase yield decreases. One of the amounts of cellulose used proportional increase of cellulase formation is possible according to a fed-batch technique described, in which the supply of cellulose by means of a control device or a computer-aided process control is driven by the specific carbon dioxide evolution of the mycelium.

Mittels Weizenkleie, Brennereischlempe oder anderer komplexor Nährmediumsbestandteile kann die Bildung von Nebenaktivitäten wie beispielsweise Hemicellulase, Amylase und Pektinase erhöht werden.By means of wheat bran, distillate pulp or other complex nutrient medium components, the formation of side activities such as hemicellulase, amylase and pectinase can be increased.

Für die Herstellung zellwandlytischer Enzyme werden zweckmäßig Pilzzellwände als induzierendes Substrat eingesetzt. Der gebildete Enzymkomplex hat eine Zusammensetzung auf Grund derer er beispielsweise zur Herstellung von lebenden Pilzprotoplasten geeignet ist.It is expedient to use fungal cell walls as the inducing substrate for the production of cell walllytic enzymes. The enzyme complex formed has a composition on the basis of which it is suitable, for example, for the production of living mushroom protoplasts.

Die Bildung des Cellulase-Enzymkomplexes kann auch auf Basis löslicher induzierender Substrate oder löslicher nichtinduzierender Substrate in Kombination mit induzierenden Substiaten erfolgen. Dafür ist eine fed-Technik geeignet, bei welcher die löslichen induzierenden Substrate oder die löslichen nichtinduzierendon Substrate oder eine Kombination löslicher induzierender und löslicher nichtinduzierender Substrate in einer solchen Weise dem Fermentationsmedium zugeführt werden, daß die nich im Fermentationsmedium einstellende aktuelle Konzentration der löslichen Substrate in einem Bereich liegt, in welchem die Cellulasebildung induziert aber nicht reprimijrt wird. Die obere Grenze dieses Bereiches wird durch die Katabolhrepression des Cellulasebildungsvermögens bestimmt, welche dem jeweils eingesetzten Substrat entspricht.The formation of the cellulase enzyme complex may also be on the basis of soluble inducing substrates or soluble non-inducing substrates in combination with inducing substiats. For this purpose, a fed technique is suitable in which the soluble inducing substrates or the soluble non-inducing substrates or a combination of soluble inducing and soluble non-inducing substrates are fed to the fermentation medium in such a way that the non-fermentation medium adjusting current concentration of the soluble substrates in a Range in which cellulase formation is induced but not repressed. The upper limit of this range is determined by the catabolic repression of the cellulase-forming capacity, which corresponds to the respective substrate used.

Der Fermentationsprozeß bei der fed-batch-Technik besteht aus einem diskontinuierlichen Abschnitt (batch) und der Substratzuführungsphase (fed-batch-Abschnitt). Die batch-Phase dient der Anzucht vor. Mycel, während in der Substratzuführungsphase vorwie- ,end die Enzymbildung erfolgt. Die Substratzuführung wird entweder mittels der Kohlendioxidkonzentra'.ion des Furmentationsabgases angesteuert oder aber nach einem empirisch ermittelten Zeitregime vorgenommen. Werden nichtinduzierte Substrate wie beispielsweise Glycerol oder Gaiuctost zugeführt, so muß das Grundnährmedium mindestens ein induzierendes Substrat enthalten, wie z. B. Cellulose, Weizenkleie oder Brennereischlempe.The fermentation process in the fed-batch technique consists of a discontinuous section (batch) and the substrate feed phase (fed-batch section). The batch phase is intended for cultivation. Mycelium, while in the substrate supply phase vorwie-, the end of the enzyme formation takes place. The substrate feed is controlled either by means of the carbon dioxide concentration of the furgeneration exhaust gas or else by an empirically determined time regime. If non-induced substrates such as glycerol or gaiuctost are added, the basic nutrient medium must contain at least one inducing substrate, such as e.g. As cellulose, wheat bran or Brennereischlempe.

Es ist möglich, das Mycel im batch-Abschnitt der Fermentation auf Basis nichtinduzierender Substrate, wie z. B. Glucose, Glycerol, Fructose, anzuziehen, da die Katabolitrepression bei der Mutante IMET 43857 nach Verbrauch des reprimierenden Substrates nicht nachwirkt.It is possible, the mycelium in the batch section of the fermentation based on non-inducing substrates such. As glucose, glycerol, fructose, because the catabolite repression in the mutant IMET 43857 after consumption of the repressive substrate does not react.

Durch gezielte Veränderung des pH-Wertes während der Fermentation läßt sich die Zusammensetzung des Collulose-Enzymkomplexes beeinflussen. Einige Nebenaktivitäten, wie beispielsweise Xylanase, Amylase und ß-Glyccsidase, werden bei höheren pH-Werten stärker gebildet; so ist es auch möglich, mittels pH-Abfall auf pH = 3,1 einen Cellulase-Enzymkomplex herzustellen, der keine ß-Glucosidase-Aktivität enthält.Targeted changes in the pH during the fermentation can influence the composition of the collulose-enzyme complex. Some minor activities, such as xylanase, amylase and β-glycollidase, are more pronounced at higher pHs; it is thus also possible to produce a cellulase enzyme complex which does not contain β-glucosidase activity by means of pH drop to pH = 3.1.

Die Abtrennung und Reinigung der gewonnenen Enzyme kann mittels bekannter Verfahren vorgenommen werden. Je nach Applikation können das nichtaufgearbeitete Fermontationsmedium, das Kulturfiltrat, getrocknete Rohenzyme oder gereinigte Enzyme eingesetzt werden.The separation and purification of the recovered enzymes can be carried out by known methods. Depending on the application, the non-processed fermontizing medium, the culture filtrate, dried crude enzymes or purified enzymes can be used.

Ausführungsbeispieleembodiments Beispiel 1:Example 1:

In einem Rührfermentor mit einem Bruttovolumen von 30 Litern wird der Stamm IMET 43857 für die Gewinnung des Cellulase-Enrymkomplexes kultiviert.In a stirred fermentor with a gross volume of 30 liters, the strain IMET 43857 is cultivated for the recovery of the cellulase enzyme complex.

Als Substrat wird der HolzzeHstoff Heweten 10Hz in Kombination mit Weizenkleie eingesetzt; die Fermentation wird mittels fed-batch-Technik durchgeführt.The substrate used is the wood oxide Heweten 10Hz in combination with wheat bran; the fermentation is carried out by fed-batch technique.

Fermentorfermentor

Der Fermentor ist mit einem allgemein gebräuchlichen Sechsblatt-Scheibenrührer versehen, dessen Gesamtdurchmesser etwa ein Drittel des Fermentorinnendurchmessers beträgt. Die Einbauhöhe des Rührers im Fermentor beträgt etwa ein Fünftel der Gesamthöhe ded Fermentorinnenraumes. Die Begasung des Fermentors erfolgt über einen unterhalb des Rührers befindlichen Ring, welcher etwa den gleichen Durchmesser wie der Rührer aufweist und mit je 1 mm breiten Öffnungen im Abstand von je 8mm versehen ist. Der Fermentor ist mit der allgemein gebräuchlichen Meß- und Regeltechnik ausgestattet, insbesondere mit einer Temperatur-, Meß- und Regeleinrichtung, einer pH-Meß- und Regeleinrichtung, einer Gelöst-Sauerstoff-Messung und einer Meßeinrichtung für die C0₂-Konzentration des Fermentorabgases gekoppelt mit einem Steuersignal, beispielsweise zur Ansteuerung von Dosierpumpen. Mittels einer automatisch geregelten Schaumbekämpfung wird eine überschüssige Entschäumerzugabe vermieden.The fermentor is provided with a commonly used six-blade disc stirrer whose total diameter is about one third of the fermentor inner diameter. The installation height of the stirrer in the fermentor is about one fifth of the total height ded fermentor interior. The gassing of the fermenter via a ring located below the stirrer, which has approximately the same diameter as the stirrer and is provided with 1 mm wide openings at a distance of 8mm. The fermenter is equipped with the commonly used measuring and control technology, in particular with a temperature, measuring and control device, a pH measuring and control device, a dissolved oxygen measurement and a measuring device for the C0 ₂ concentration of fermenter exhaust gas coupled with a control signal, for example for controlling metering pumps. By means of an automatically controlled foam control, an excess defoamer addition is avoided.

Das Anfangsvolumen beträgt 10 Liter, bestehend aus 9 Liter Grundnährmedium plus 1 Liter Inokulum.The initial volume is 10 liters, consisting of 9 liters of basic nutrient medium plus 1 liter of inoculum.

Bestandteile des Grundnährmediums:Components of the basic nutrient medium:

KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 30 g30 g (NH₄I₂SO₄ (NH ₄ I ₂ SO ₄ 50 g50 g MgSO₄-7 H₂OMgSO ₄ -7H ₂ O 3g3g CaCI₂ CaCl ₂ 3g3g Cellulosepulver'.Heweten 10Hz)Cellulose powder'.Heweten 10Hz) 180g180g Weizenkleiewheat bran 70 g70 g

Diese Bestandteile werden in geeigneter Weise in 9 Litern Leitungswasser gelöst bzw. suspendiert, sterilisiert und unter Ausschluß von Fremdkeimen in den sterilisierten Fermentor gegeben. Anschließend wird der Fermentor mit 1 Liter frischer Mycelsuspension (Inokulum) beimpft.These ingredients are conveniently dissolved or suspended in 9 liters of tap water, sterilized and added to the sterilized fermentor with the exclusion of foreign bacteria. Subsequently, the fermenter is inoculated with 1 liter of fresh mycelium suspension (inoculum).

Inokuluminoculum

Das Inokulum wird in Schüttelkulturen hergestellt. Es werden die gleichen Nährmediumsbestandteile wie für den 30-l-Fermentor verwendet, jedocn wird die Konzentration des KH₂PO₄ zweckmäßig auf 15g/l erhöht, um eine stärkere Pufferwirkung zu erzielen.The inoculum is prepared in shake cultures. The same nutrient media components are used as for the 30 L fermentor, but the concentration of KH ₂ PO _{4 is} expediently increased to 15 g / L in order to obtain a stronger buffer effect.

Die Konzentration der übrigen angegebenen Nährmediumsbestandteile ist die gleiche, wie im Nährmedium für den Fermentor.The concentration of the other specified Nährmediumsbestandteile is the same as in the nutrient medium for the fermenter.

Es werden 10 Schüttelkolben mit je 100ml dieses Nährmediums hergestellt und unter Ausschluß von Fremdkeimen wird jeder Kolben mit etwa 10⁷Konidien einer 10 bis 20 Tage alten Abimpfung des hinterlegten Stammes IMET 43857 beimpft. Die Kultivierung erfolgt auf einer für die Kultivierung von Mikroorganismen allgemein gebräuchlichen Schüttelmaschine bei 3O⁰C.10 shake flasks with 100 ml each of this nutrient medium are prepared and with the exclusion of foreign germs, each flask is inoculated with about 10 ⁷ conidia of a 10 to 20-day old vaccination of the deposited strain IMET 43857. The cultivation takes place on a commonly used for the cultivation of microorganisms shaker at 3O ⁰ C.

Die Kultivierungsdauer beträgt 30 bis 48h bis zur Beimpfung des Fermentors.The culture period is 30 to 48 hours until inoculation of the fermentor.

Fermentationfermentation

Die Kultivierungstemperatur wird zu Beginn der Fermentation auf 32°C eingestellt; die Regelgrenzen für den pH werden auf 4,0 (untere Regelgrenze) und 5,5 (obere Regelgrenze) eingestellt; die Rührerdrehzahl beträgt 500U/min und die Begasungsmenge 350 Norm-Liter-Luft je Stunde. Als Antischaummittel wird Silikonentschäumer NM40 verwendet.The cultivation temperature is set at 32 ° C at the beginning of the fermentation; the control limits for the pH are set to 4.0 (lower control limit) and 5.5 (upper control limit); the stirrer speed is 500 rpm and the gassing amount is 350 standard liters of air per hour. As antifoam agent silicone defoamer NM40 is used.

Der pH-Wert liegt zu Beginn der Fermentation innerhalb des Sollbereiches, je nach Zustand und Alter des Inokulums bei etwa 4,2 bis 5,4. Während der Fermentation tritt ein Abfall des pH ein; bei Erreichen der unteren Regelgrenze wird mittels 12%iger Ammoniaklösung der pH bei 4,0 konstant geregelt. Mitunter ist - bedingt durch den Weizenkleie-Zusatz - in der Anfangsphase ein zwischenzeitlicher Anstieg des pH zu verzeichnen, der im Falle des Erreichens der oberen Regelgronze eine Konstantregelung des pH mittels 10%iger Schwefelsäure bei 5,5 erfordert.The pH is at the beginning of the fermentation within the target range, depending on the state and age of the inoculum at about 4.2 to 5.4. During fermentation, a drop in pH occurs; when the lower control limit is reached, the pH is kept constant at 4.0 by means of 12% strength ammonia solution. Occasionally - due to the addition of wheat bran - in the initial phase an intermediate increase in the pH is recorded, which in the case of reaching the upper control grain requires a constant control of the pH by means of 10% sulfuric acid at 5.5.

Die Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas steigt mit zunehmender Mycelkonzentration an, erreicht einen Maximalwert und fällt dann wieder ab. Der Maximalwert ist nach etwa 48 h erreicht, die Temperatur wird auf 29°C abgesenkt und es werden 12g Tween 80 dem Fermentationsmedium zugesetzt. Der Maximalwert der Kohlendioxidkonzentration liegt bei etwa 0,5 bis 0,7VoI.-% im getrockneten Fermentationsabgas; ein mitunter zeitlich vorgelagertes und schwächer ausgeprägtes Maximum der Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas ist durch die Utilisation von Weizenkleiebestandteilen verursacht und wird für die Prozeßsteuerung nicht berücksichtigt.The carbon dioxide concentration in the fermentation exhaust gas increases with increasing mycelium concentration, reaches a maximum value and then drops again. The maximum value is reached after about 48 h, the temperature is lowered to 29 ° C and 12g Tween 80 are added to the fermentation medium. The maximum value of the carbon dioxide concentration is about 0.5 to 0.7VoI .-% in the dried fermentation exhaust gas; a sometimes temporally upstream and weaker pronounced maximum carbon dioxide concentration in the fermentation exhaust gas is caused by the utilization of wheat bran components and is not considered for process control.

Nachdem die Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas das Maximum überschritten hat und auf etwa 80% des Maximalwertes abgesunken ist, wird mit der Zugabe von Cellulose begonnen.After the carbon dioxide concentration in the fermentation exhaust gas has exceeded the maximum and has dropped to about 80% of the maximum value, the addition of cellulose is started.

Es werden 40g Cellulosepulver Heweten 10Hz, suspendiert in 200ml Wasser, dem Fermentationsmedium zugegebun. Die Kohlendioxidkonzentration im Fermentationsabgas steigt nach der Cellulosezugabe zunächst an und fällt dann wieder ab, nachdem die Cellulose weitgehend verbraucht ist. Nach Absinken der Kohlendioxidkonzentration auf 80% des letzten Maximalwertes erfolgt die nächste Zugabe von 40g Heweten 10 Hz (in 200 ml Wasser suspendiert). Auf die gleiche Weise werden die weiteren Zugaben von Cellulose vorgenommen. Der zeitliche Abstand der Cellulosezugaben beträgt 5 bis 10 Stunden.There are 40g cellulose powder Heweten 10Hz, suspended in 200ml of water, zugegebun the fermentation medium. The carbon dioxide concentration in the fermentation exhaust gas increases after the addition of cellulose first and then drops again after the cellulose is largely consumed. After lowering the carbon dioxide concentration to 80% of the last maximum value, the next addition of 40 g Heweten 10 Hz (suspended in 200 ml of water). The other additions of cellulose are made in the same way. The time interval of the cellulose additions is 5 to 10 hours.

Nach einer Gesamtfermentationszeit von 140 Stunden wird die Fermentation beendet. Die während der fed-batch-Periode zugeführte Cellulosemenge beträgt 400g, der Ammoniakverbrauch 330ml (12%ige Lösung) und das findvolumen des Fermentationsmediums 12 Liter.After a total fermentation time of 140 hours, the fermentation is stopped. The quantity of cellulose fed during the fed-batch period is 400 g, the consumption of ammonia 330 ml (12% solution) and the found volume of the fermentation medium 12 liters.

Die Enzymaktivität beträgt 6,5U/ml FPA und 9,0U/ml μ-Glucosidase.The enzyme activity is 6.5 U / ml FPA and 9.0 U / ml μ-glucosidase.

Mittels bekannter Verfahren der Mikrofiltration und Ultrafiltration wird der Enzymkomplex von den übrigen Nährmediumskomponenten des Fug?tes abgetrennt und gefriergetrocknet.By means of known methods of microfiltration and ultrafiltration, the enzyme complex is separated from the other nutrient medium components of the compound and freeze-dried.

Das gefriergetrocknete Rohenzym weist folgende Zusammensetzung bzw. Aktivitäten auf:The freeze-dried crude enzyme has the following composition or activity:

- Filterpapieraktivität (FPA): 0,73 U/mg Protein,Filter paper activity (FPA): 0.73 U / mg protein,

- Endoglucanase: 5,20 U/mg Protein,Endoglucanase: 5.20 U / mg protein,

- ß-Glucosidase: 1,13 U/mg Protein,β-glucosidase: 1.13 U / mg protein,

- Xylanase: 5,07 U/mg Protein,Xylanase: 5.07 U / mg protein,

- Aktivität gegenüber- Activity opposite

p-Nitrophenyl-Lactosid (p-NPL): 0,02 U/mg Proteinp-nitrophenyl lactoside (p-NPL): 0.02 U / mg protein

Die Bestimmung von FPA und ß-Giucosidase erfolgte nach den Empfehlungen der IUPAC (Pure and Appl. Chem., Vol. 59, Nr.2, pp 257-268,1987).The determination of FPA and β-glucosidase was carried out according to the recommendations of IUPAC (Pure and Appl. Chem., Vol. 59, No.2, pp 257-268, 1987).

Die Endoglucanaseaktivität wurde nach Rabinovitsch bestimmt (Rabinovi'.sch, M. L.; Klyosov, A.A.; Berezin, I. V.; Bioorg.Endoglucanase activity was determined according to Rabinovich (Rabinovi'sch, M.L., Klyosov, A.A., Berezin, I.V., Bioorg.

Chimija 3.3,405-414,1977).Chimija 3.3, 455-414, 1977).

Die Aktivität gegenüber p-NPL wurde nach Rabinovitsch et al. (Bioorg. Chimija, 12,11,1549-1560,1986) ermittelt. Die Bestimmung der Xylanaseaktivität erfolgte nach einer Methode der Universität Neu-Süd-Wales, Kensington, Australien (Pure and Appl. Chem., Vol. 59, Nr. 12, pp 1739-1752,1987).The activity towards p-NPL was according to Rabinovitsch et al. (Bioorg. Chimija, 12, 11, 1549-1560, 1986). The xylanase activity was determined by a method of the University of New South Wales, Kensington, Australia (Pure and Appl. Chem., Vol. 59, No. 12, pp 1739-1752, 1987).

Beispiel 2:Example 2:

Der Stamm IMET 43857 wird auf verschiedenen Nährmedien für die Gewinnung des Cellulase-Enzymkomplexes kultiviert. Es werden Schüttelkolben mit je 100ml des jeweiligen Nährmediums in drei Parallelversuchen hergestellt. Sämtliche Schüttelkolben werden mit der gleichen Menge einer Konidiensuspension beimpft, welche von einer 10 bis 20 Tage alten Abimpfung des Stammes IMET 4385Tgewonnen wird. Die Konidiensuspension wird unter Ausschluß von Fremdkeimen über eine G2-Glasfritte filtriert, um Reste noch vorhandenen Mycels zu entfernen.The strain IMET 43857 is cultured on various nutrient media for the recovery of the cellulase enzyme complex. Shake flasks with 100 ml each of the respective nutrient medium are prepared in three parallel experiments. All shake flasks are inoculated with the same amount of a conidia suspension, which is obtained from a 10 to 20-day old vaccination of the strain IMET 4385T. The conidia suspension is filtered with the exclusion of foreign germs on a G2 glass frit to remove residues of remaining mycelium.

Die Menge der für die Beimpfung eines jeden Schüttelkolbens verwendeten Konidiensuspension wird so bemessen, daß die Kolben mit jeweils 10⁷ Konidien beimpft werden.The amount of conidia suspension used to inoculate each shake flask is adjusted to inoculate the flasks with 10 ⁷ conidia each.

Die Kultivierung wird 7 Tage bei 3O⁰C und ohne Korrektur des pH durchgeführt.The cultivation is ⁰ carried out for 7 days at 3O C and without correcting the pH.

Nährmedienzusammensetzung:Nährmedienzusammensetzung:

Substrat:substrate: 10g/IHeweten10Hz +10g / IHeweten10Hz + Variante 1.:Version 1.: 1,5g/IPepton1.5 g / IPepton (zuzüglich 0,3 g/l Harnstoff)(plus 0.3 g / l urea) 10g/IHeweten10Hz +10g / IHeweten10Hz + Variante 2.:Variant 2.: 10 g/l Weizenkleie10 g / l wheat bran 10g/IHeweten10Hz +10g / IHeweten10Hz + Variante 3.:Variant 3 .: 10g/l(TS)Brauereitreber10g / l (TS) brewery spent grain anorganische Stickstoffquelle:inorganic nitrogen source: 3,5g/l(NH₄)₂SO₄ 3.5 g / l (NH ₄ ) ₂ SO ₄ Variantea:Option A: 4,5 g/l NaNO₃ 4.5 g / l NaNO ₃ Variante b:Variant b: Bestandteile des Grundmediums:Components of the basic medium: 15g/l15g / l KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 0,4 g/l0.4 g / l MgSO₄ -7 H₂OMgSO ₄ -7H ₂ O 0,3g/l0.3 g / l CaCI₂ CaCl ₂ 1 g/l1 g / l Tween 80 (dest. Wasser)Tween 80 (distilled water)

Es werden 6 verschiedene Nährmedien hergestellt, welche die Kombinationen der unterschiedlichen Substratvarianten mit denen der Stickstoffsalze darstellen. Nach Beendigung der Fermentation werden die Medien der Parallelversuche vereinigt. In den Kulturfiltraten wird die Enzymaktivität bestimmt. Es ergeben sich folgende Enzymaktivitäten:There are produced 6 different nutrient media, which represent the combinations of different substrate variants with those of the nitrogen salts. After completion of the fermentation, the media of the parallel experiments are combined. In the culture filtrates the enzyme activity is determined. The following enzyme activities result:

Enzymaktivität U/mlEnzyme activity U / ml La.La. 1.b.1.b. Nährmedium 2.a. 2.b.Nutrient medium 2.a. 2 B. 1,93 2,94 1,66 0,311.93 2.94 1.66 0.31 la.la. 3.b.3.b. FPA ß-Glucosidase Xylanase -AmylaseFPA β-glucosidase xylanase amylase 1,64 0,28 1,43 0,031.64 0.28 1.43 0.03 1,04 1,03 1,23 0,021.04 1.03 1.23 0.02 1,46 0,21 1,46 0,111.46 0.21 1.46 0.11 6,16.1 1,77 0,46 1,32 0,141.77 0.46 1.32 0.14 1,90 2,53 1,52 0,071.90 2.53 1.52 0.07 End-pHFinal pH 3,63.6 5,45.4 3,03.0 3,13.1 6,06.0

Der Ausgangsstamm Penicillium verruculosum ItC71 bildet bei gleichen Bedingungen mit dem Nährmedium 1.a. eine Filterpapieraktivität von 0,35 U/ml und mit dem Nährmedium 2.a. eine Filterpapieraktivität von 0,45 U/ml.The parent strain Penicillium verruculosum ItC71 forms under the same conditions with the nutrient medium 1.a. a filter paper activity of 0.35 U / ml and with the nutrient medium 2.a. a filter paper activity of 0.45 U / ml.

Beispiel 3:Example 3:

Die Stämme Penicilliumverrucolosum ltC71 und IMET 43857 werden in Schüttelkolben wie im Beispiel 2 7 Tage und ohne Korrektu des pH kultiviert.The strains Penicillium verrucolosum ltC71 and IMET 43857 are cultured in shake flasks as in Example 2 for 7 days and without correction of the pH.

Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:The nutrient medium has the following composition:

KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 15g/l15g / l (NH₄I₂SO₄ (NH ₄ I ₂ SO ₄ 4,8 g/l4.8 g / l CaCI₂ CaCl ₂ 0.3g/l0.3g / l MgSO₄ 7H₂OMgSO ₄ .7H ₂ O 0,5 g/l0.5 g / l Tween 80Tween 80 1 g/l1 g / l HewetenlOHzHewetenlOHz 10g/l10g / l Weizenkleiewheat bran 5 g/l5 g / l

Die zwei Kulturfiltrate wirden mittels Ultrafiltration etwa 10:1 aufkonzentriert. Die analytischen Uni ersuchungen der Konzentrate ergeben folgende Werte:The two culture filtrates are concentrated by ultrafiltration at about 10: 1. The analytical tests of the concentrates give the following values:

/mg/ml/ /U/mg Protein/ /U/mg Protein/ /U/mg Protein// mg / ml / / U / mg protein / / U / mg protein / / U / mg protein / IMET43857IMET43857 ItC 71ItC 71 Protein Xylanase Endo- glucanase ß-GlucosidaseProtein xylanase endoglucanase β-glucosidase 15,0 2,94 4,25 0,015.0 2.94 4.25 0.0 3,2 2,75 1,073.2 2.75 1.07 End-pHFinal pH 3,03.0 4,34.3

Der Cellulase-Enzymkomplex der hinterlegten Mutante ist in diesem Beispiel frei von ß-Glucosidase, da infolge des hohen Celluloseumsatzes während der Fermentation der pH-Wert zwischenzeitlich auf Werte kleiner pH 3 absinkt.The cellulase enzyme complex of the deposited mutant is in this example free of β-glucosidase, since, due to the high cellulose conversion during the fermentation, the pH value temporarily drops to values below pH 3.

Claims (4)

1. Verfahren zur Gewinnung von Cellulase-Enzymkomplexen und/oder zellwandtypischen Enzymen durch Pilze im Submersverfahren, gekennzeichnet dadurch, daß die neue Pilzmutante Penicillium verruculosum IMET 43857 nach an sich bekannter Weise in einem Nährmedium kultiviert wird, welches ein oder mehrere die Cellulasbildung und/oder die Bildung zellwandtypischer Enzyme induzierende Substrate allein oder in Kombination mit einem oder mehrerer nichtinduzierenden Substraten enthält.1. A process for the production of cellulase enzyme complexes and / or cell-wall-type enzymes by fungi Submersverfahren, characterized in that the new fungal mutant Penicillium verruculosum IMET 43857 is cultured in a conventional manner in a nutrient medium, which one or more Cellulasbildung and / or the formation of cell wall-specific enzyme-inducing substrates alone or in combination with one or more non-inducing substrates. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß lösliche induzierende Substrate und/ oder lösliche nichtinduzierende Substrate verwendet werden und daß die Zugabe dieser Substrate in das Fermentationsmedium mittels fed-batch-Technik in einer solchen Weise erfolgt, daß die zugeführten Substrate im Fermentationsmedium die Enzymbildung induzieren oder nicht reprimieren.2. The method according to claim 1, characterized in that soluble inducing substrates and / or soluble non-inducing substrates are used and that the addition of these substrates in the fermentation medium by means of fed-batch technique in such a manner that the substrates supplied in the fermentation medium Induce or not repress enzyme formation. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als induzierende Substrate sowohl lösliche, wie wäßriger Weizenkleie-Auszug und/oder Zuckerlösungen als auch unlösliche, wie Cellulose, cellulosehaltige Abfallprodukte oder Zellwände von Pflanzen oder Pilzen verwendet werden.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that are used as inducing substrates both soluble, such as aqueous wheat bran extract and / or sugar solutions and insoluble, such as cellulose, cellulose-containing waste products or cell walls of plants or fungi. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß Getreidekleie und/oder Brennereischlempe und/oder Brauereitreber als induzierendes Substrat in Kombination mit löslichen Kohlenhydraten wie beispielsweise Glucose, Xylose oder Lactose verwendet werden.4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that grain bran and / or Brennereischlempe and / or Brauereitreber be used as inducing substrate in combination with soluble carbohydrates such as glucose, xylose or lactose.