DD260291A1 - PROCESS FOR PREPARING ENZYMPRAEPARATES CONTAINING GLUCOSE ISOMERASE - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase enthaltenden Enzympraeparaten, einem Produkt, welches der Gewinnung von fructosehaltigen Loesungen aus Glucose dient. Die Erfindung verfolgt das Ziel, Enzympraeparate nach einem verbesserten Verfahren herzustellen. Die technische Aufgabe wird in der Weise geloest, dass unter Verwendung von Mikroorganismen der Art Streptomyces chrysomallus, vorzugsweise der Staemme Streptomyces chrysomallus XK10 oder Streptomyces chrysomallus XK12, eine sterile Fermentation fuer die Dauer von 24 Stunden bis 48 Stunden unter Einsatz eines Mediums durchgefuehrt wird, welches Glucose oder Glucosepolymere als ausschliessliche C-Substrate oder im Verhaeltnis zu D-Xylose - als Reinsubstanz oder neutralisiertes mineralisches Maisspelzenhydrolysat zugefuegt - im Ueberschuss enthaelt und organische und anorganische N-Substrate und Mineralsalze aufweist, wobei Magnesiumsalze und/oder Na2SO4 eingesetzt werden.The invention relates to a process for the preparation of glucose isomerase-containing enzyme preparations, a product which is used to obtain fructose-containing solutions from glucose. The invention aims to produce enzyme preparations according to an improved process. The technical object is achieved by carrying out a sterile fermentation for 24 hours to 48 hours using a medium using microorganisms of the species Streptomyces chrysomallus, preferably the strain Streptomyces chrysomallus XK10 or Streptomyces chrysomallus XK12, which medium Contains glucose or glucose polymers as exclusive C-substrates or in proportion to D-xylose - added as pure substance or neutralized mineral maize fission hydrolyzate - in excess and contains organic and inorganic N-substrates and mineral salts, magnesium salts and / or Na2SO4 are used.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Glucose-Isomerase enthaltenden Enzympräparaten, einem Produkt, das der Herstellung fructosehaltiger Lösungen aus D-Glucose dient. Anwendung finden diese Fructosesirupe in der Lebensmittel-und Getränkeindustrie aufgrund ernäherungsphysiologischer Vorteile. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der technisch-mikrobiologischen Forschung und Industrie.The invention relates to a process for the microwave production of glucose-isomerase-containing enzyme preparations, a product which is used to prepare fructose-containing solutions of D-glucose. These fructose syrups find application in the food and beverage industry due to nutritional physiological benefits. The field of application of the invention is thus in the technical-microbiological research and industry.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Die mikrobielle Herstellung von Glucose-Isomerase bzw. Glucose-Isomerase enthaltenden Enzympräparaten ist seit Ende der 50er Jahre bekannt. Dabei erfolgt die Gewinnung der enzymatisch aktiven Biomasse auf fermentativem Wege mit Hilfe von Hochleistungsverfahren, deren ökonomische Effizienz auf zwei verfahrenstechnischen Besonderheiten beruht: Zum einen handelt es sich um die Verwendung von preiswerten Rohstoffen, wie Xylan enthaltende Materialien (Brit. Pat. 1410569) oder D-Sorbit (Biotechnol. Lett. 7,1985, 597) anstelle von D-Xylose, die als Induktor der Enzymbildung nötig sind, zum anderen werden Bakterienstämme der Gattungen Bacillus, Actinoplanes, Arthrobacter oder Streptomyces eingesetzt, die D-Xylose zur Induktion der Glucose-Isomerase-Bildung nicht benötigen (US 3645848; US 834988; DE OS 2400323; US 4315103; US 3813318; US 4532208; Brit. Pat. 1411763,1411764,1411765; US 4511430; US 4551430; US 4355103).The microbial production of glucose-isomerase or glucose-isomerase-containing enzyme preparations has been known since the end of the 1950s. The enzymatically active biomass is obtained by fermentation with the aid of high-performance processes whose economic efficiency is based on two process-specific features: On the one hand, the use of inexpensive raw materials, such as xylan-containing materials (British Patent 1410569) or D. Sorbitol (Biotechnol. Lett., 7, 1985, 597) instead of D-xylose, which are necessary as an inducer of enzyme formation, on the other bacterial strains of the genera Bacillus, Actinoplanes, Arthrobacter or Streptomyces are used, the D-xylose for the induction of glucose Do not require isomerase formation (US 3645848, US 834988, DE 2400323, US 4315103, US 3813318, US 4532208, British Patent 1411763, 1411764, 1411765, US 4511430, US 4551430, US 4355103).

Es wurden bereits auch Verfahren zur Herstellung Glucose-Isomerase enthaltender Enzympräparate in der DDR vorgeschlagen (DD 244145; DD 241427), in denen Mikroorganismen der Gattungen Chainia bzw. Streptomyces verwendet werden. Darunter sind Stämme der Art Streptomyces chrysomallus (ZIMET 43774, ZIMET 43775), die aus einem Antibiotika produzierenden Wildstamm alsantibiotisch inaktive Mutanten selektiert wurden (ZIMET 43774,43775). In diesem Verfahren werden Co⁺⁺-freie Nährmedien benutzt, die — neben Glucose oder Stärke als übliche C-Quellen — D-Xylose sowie Mg-Salze als wesentliche Bestandteile für die Induktion der Glucose-Isomerase-Synthese und die Enzymstabilität enthalten.Processes for the preparation of glucose-isomerase-containing enzyme preparations in the GDR have also been proposed (DD 244145, DD 241427), in which microorganisms of the genera Chainia or Streptomyces are used. Among them are strains of the species Streptomyces chrysomallus (ZIMET 43774, ZIMET 43775), which were selected from an antibiotic-producing wild strain as antibiotic inactive mutants (ZIMET 43774.43775). Co ⁺⁺ -free nutrient media are used in this process which, in addition to glucose or starch as common C sources, contain D-xylose as well as Mg salts as essential components for the induction of glucose isomerase synthesis and enzyme stability.

Der Nachteil der angegebenen Verfahren besteht darin, daß entweder konstitutiv Glucose-Isomerase bildende Mikroorganismen eingesetzt werden, die hinsichtlich der organischen N-Substrate anspruchsvoll sind (Fleischprotein) und Mg-Salze als ausschließliche enzymstabilisierende Zusätze im Fermentationsprozeß verlangen bzw. im Falle eines nicht mycelartigen Wachstums eine aufwendige Abtrennungstechnologie zur Gewinnung der Biomasse erfordern, daß bei der Anwendung kostengünstiger Rohstoffe der Einsatz von Xylan hydrolysierenden Stämmen oder Enzymen bzw. bei mineralischer Hydrolyse die Vorschaltung spezieller Reinigungsverfahren hinsichtlich der D-Xylose notwendig sind, oder daß Leistungsminderung durch erhöhte lonenbelastung der Medien eintritt.The disadvantage of the specified method is that either constitutively constituting glucose isomerase-forming microorganisms are used, which are demanding in terms of organic N-substrates (meat protein) and Mg salts as exclusive enzyme stabilizing additives in the fermentation process or in the case of non-mycelial growth an elaborate separation technology for recovering the biomass require that when using cost-effective raw materials of the use of xylan hydrolyzing strains or enzymes or in mineral hydrolysis, the upstream special cleaning procedures with respect to the D-xylose are necessary, or that performance degradation occurs by increased ion contamination of the media.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung verfolgt das Ziel, Glucose-Isomerase enthaltende Enzympräparate nach einem verbesserten Verfahren herzustellen.The invention aims to produce glucose isomerase-containing enzyme preparations by an improved process.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe — unter Verwendung preiswerter Einsatzstoffe und gestützt auf den Einsatz neuen Stammaterials — Glucose-Isomerase enthaltende Enzympräparate mit leicht zugänglichen Nährmedien in guten Ausbeuten hergestellt werden können. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Mikroorganismen der Art Streptomyces chrysomallus, die durch Mutagenese aus dem Stamm Streptomyces chrysomallus PL45 gewonnen wurden, vorzugsweise der Stamm Streptomyces chrysomallus XK10, hinterlegt in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena, Beutenbergstraße 11, unter der Registriernummer ZIMET 43808, oder der Stamm Streptomyces chrysomallus XK12, hinterlegt in o.g. Hinterlegungsstelle unter der Registriernummer ZIMET 43809, verwendet wird und eine sterile und aerobe Fermentation für die Dauer von 24 Stunden bis 48 Stunden, bevorzugt von 24 Stunden bis 36 Stunden, unter Einsatz eines Mediums durchgeführt wird, welches Glucose oder Glucosepolymere als ausschließliche oder im Verhältnis zu D-Xylose überwiegende C-Substrate enthält, wobei D-Xylose als Reinsubstanz oder als neutralisiertes mineralisches Maisspelzenhydrolysat zugegeben wird. Dem Medium werden außerdem organische und anorganische N-Substrate und Mineralsalze zugesetzt, wobei Magnesiumsalze und/oder Na₂SO₄ verwendet werden. Die Fermentationsbedingungen werden durch folgende Parameter charakterisiert:The invention has for its object to describe a microbiological process by means of which - using inexpensive starting materials and based on the use of new parent material - glucose-isomerase-containing enzyme preparations can be prepared with readily available nutrient media in good yields. According to the invention, the object is achieved in that microorganisms of the species Streptomyces chrysomallus, which were obtained by mutagenesis from the strain Streptomyces chrysomallus PL45, preferably the strain Streptomyces chrysomallus XK10, deposited in the depository for microorganisms of the Central Institute of Microbiology and Experimental Therapy AdW of the GDR , Jena, Beutenbergstrasse 11, under the registration number ZIMET 43808, or the strain Streptomyces chrysomallus XK12, deposited in the above-mentioned depository under the registration number ZIMET 43809, and a sterile and aerobic fermentation for a period of 24 hours to 48 hours, preferably 24 Hours to 36 hours using a medium containing glucose or glucose polymers as exclusive or predominantly C-substrate relative to D-xylose, with D-xylose added as a pure substance or as a neutralized mineral corn syrup hydrolyzate n becomes. In addition, organic and inorganic N-type substrates and mineral salts are added to the medium using magnesium salts and / or Na ₂ SO ₄ . The fermentation conditions are characterized by the following parameters:

Rührung: 120 bis 800U/min; Belüftungsrate (v/v): 0,5:1 bis 1:1; Temperatur: 25 bis 35⁰C; Acidität des Mediums: pH 5,5 bis 8,5. Die Abtrennung des Mycels und die Gewinnung des Glucose-Isomerase enthaltenden Enzympräparat^ erfolgt in an sich bekannterWeise.Stirring: 120 to 800rpm; Aeration rate (v / v): 0.5: 1 to 1: 1; Temperature: 25 to 35 ^° C .; Acidity of the medium: pH 5.5 to 8.5. The separation of the mycelium and the recovery of the glucose isomerase enzyme preparation ^ takes place in a conventional manner.

Die Vorteile dieser Vorgehensweise bestehen darin, daß die Herstellung von Glucose-Isomerase enthaltender Biomasse auf fermentativem Wege durch den Einsatz der oben genannten Streptomyces-Stämme auf komplexen Nährmedien gelingt, ohne oder nur in geringem Umfang den kostenintensiven Induktor D-Xylose zu benötigen sowie verschiedene Mineralsalze als Enzymstabilisatoren einsetzen zu können. Die verwendeten Streptomyces-Stämme besitzen die günstige Eigenschaft, Glucose-Isomerase entweder in glucosefreien Nährmedien in einer ökonomisch akzeptablen Menge zu synthetisieren oder bei Anwesenheit geringer D-Xylose-Konzentrationen im Medium wesentlich höhere volumenbezogene Leistungen bei spezifischen Enzymaktivitäten von mindestens 1,2GIU/mg Mycelproteinzu erreichen.The advantages of this approach are that the production of glucose isomerase-containing biomass succeeds by fermentation by the use of the above Streptomyces strains on complex nutrient media, without or only to a small extent the cost-intensive inductor D-xylose and various mineral salts to use as enzyme stabilizers. The Streptomyces strains used have the beneficial property of either synthesizing glucose isomerase in glucose-free culture media in an economically acceptable amount or, in the presence of low levels of D-xylose in the medium, significantly higher volume-related performances at specific enzyme activities of at least 1.2 μg / mg mycelial protein to reach.

Ausführungsbeispieleembodiments Beispiel 1:Example 1:

Aus Konserven des Stammes S. chrysomallus ZIMET 43808 werden Oberflächenkulturen in Form von Schrägagarröhrchen angelegt, die jeweils 5ml Hafermehlagar enthalten. Nach 4- bis 5tägiger Bebrütung bei 28°C werden ca. 2cm² große Stücke aus dem Rasen herausgeschnitten und auf 500-ml-Anzuchtkolben übertragen, die jeweils 50 ml Vorzuchtmedium S2g enthaltenFrom preserves of the strain S. chrysomallus ZIMET 43808, surface cultures are prepared in the form of slanting agar tubes, each containing 5 ml of oatmeal agar. After incubation for 4 to 5 days at 28 ° C, approximately ² cm ² pieces are cut out of the lawn and transferred to 500 ml culture flasks, each containing 50 ml pre-breeding medium S2g

Sojamehl (entölt) 15 ·Soy meal (de-oiled) 15 ·

Glucose 15Glucose 15

KH₂PO₄ 0,3KH ₂ PO ₄ 0.3

NaCI 5NaCl 5

CaCO₃ 1CaCO ₃ 1

Leitungswasser ad 11Tap water ad 11

pH vor Sterilisation 6,5 bis 6,9, Sterilisation 30 min bei 120°C.pH before sterilization 6.5 to 6.9, sterilization for 30 min at 120 ° C.

Nach 48stündiger Kultivierung bei 28⁰C auf einem Rundschwingtisch (200 U/min) dienen diese Kulturen als Impfmaterial für eine Hauptkultur. Sie besteht aus 500-ml-Steilbrustflaschen, die wiederum 50 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung enthalten (g/l):After 48 hours of culturing at 28 ⁰ C on an orbital oscillating table (200 U / min) these cultures as inoculum for main culture. It consists of 500 ml steep-breasted bottles, which in turn contain 50 ml of nutrient medium of the following composition (g / l):

Maisquellwasser (50%Trockensubstanz) 40 Maisstärke 30Corn steep liquor (50% dry substance) 40 Corn starch 30

(NH₄I₂SO₄ 2(NH ₄ I ₂ SO ₄ 2

KH₂PO₄ 2KH ₂ PO ₄ 2

D-Xy lose 10D-Xy loose 10

Leitungswasser ad 1 ITap water ad 1 I

pH vor Sterilisation 6,5 bis 6,9, Sterilisation 30min bei 120°C.pH before sterilization 6.5 to 6.9, sterilization 30min at 120 ° C.

Bei der Zubereitung des Mediums ist darauf zu achten, daß zum einen der pH-Wert des Maisquellwassers vor der Zumengung auf 6 bis 7 mit 1 bis 2 N NaOH gebracht wird, zum anderen vor der Mediumabfüllung eine Aufquellung der Stärke durch Erhitzung vorgenommen wird, um eine homogene Verteilung zu erreichen und die Bildung eines gelierenden Bodensatzes beim Sterilisieren zu vermeiden. Die Impfmenge beträgt 5% des Hauptkulturvolumens. Die Kulturbedingungen sind: Temperatur 28°C; Rundschwingtisch mit200U/min.When preparing the medium, it must be ensured that, on the one hand, the pH of the corn steep liquor is brought to 6 to 7 with 1 to 2 N NaOH before concentration, and, secondly, that the starch is swollen by heating before the medium is filled to achieve a homogeneous distribution and to avoid the formation of a gelling sediment during sterilization. The inoculum is 5% of the main culture volume. The culture conditions are: temperature 28 ° C; Round swing table with 200rpm.

Nach 48stündiger Kultivierung werden die Kulturen geerntet und in an sich bekannter Weise für die Gewinnung eines Glucose-Isomerase enthaltenden Enzympräparates verwendet. Zur Aktivitätsbestimmung der Biomasse wird eine repräsentative Mischprobe entnommen, aus der das Mycel von 25ml Kulturlösung durch Zentrifugation (3000 U/min, 10 bis 15 min) und Waschen (2 bis 3x mit aqua dest.) gewonnen wird. Dieses Material dient nach Ultraschallaufschluß (100W, 3 χ 3sec) der Aktivitätsbestimmung.After 48 hours of cultivation, the cultures are harvested and used in a manner known per se for obtaining an enzyme preparation containing glucose isomerase. To determine the activity of the biomass, a representative mixed sample is taken, from which the mycelium of 25 ml of culture solution is obtained by centrifugation (3000 rpm, 10 to 15 minutes) and washing (2 to 3 times with distilled water). This material is used after ultrasonic disruption (100W, 3 χ 3sec) of activity determination.

Unter den genannten Bedingungen beträgt die Leistung 4400GIU/I Kulturlösung bei einer spezifischen Leistung von 1,35GIU/ mg Protein.Under the conditions mentioned, the power is 4400GIU / l culture solution at a specific power of 1.35GIU / mg protein.

Beispiel 2Example 2

Konserven des Stammes S. chrysomallus ZIMET 43809 werden auf Hafermehlagar zur Gewinnung von Schrägagarkulturen aufgebracht, die nach 4 bis 5tägiger Kultivierung bei 28°C in ausgereiftem Zustand vorliegen. Die Herstellung geeigneter Vorkulturen folgt der Beschreibung des Beispiels Die Hauptkulturen bestehen aus 500-ml-Steilbrustflaschen, die jeweils 50ml des nachfolgenden Mediums enthalten (g/l):Preserves of the strain S. chrysomallus ZIMET 43809 are applied to oatmeal agar to obtain slants cultivated after maturation at 28 ° C. for 4 to 5 days in a mature state. The preparation of suitable precultures follows the description of the example. The main cultures consist of 500 ml steep breast bottles, each containing 50 ml of the following medium (g / l):

Maisquellwasser(50%Trockensubstanz) 40Corn steep liquor (50% dry matter) 40

Maisstärke 30Cornstarch 30

(NH₄I₂SO₄ 2(NH ₄ I ₂ SO ₄ 2

KH₂PO₄ 2KH ₂ PO ₄ 2

Na₂SO₄ 2Na ₂ SO ₄ 2

D-Xy lose 10D-Xy loose 10

Leitungswasser ad 11Tap water ad 11

pH vor Sterilisation 6,5 bis 6,9, Sterilisation 30min bei 120⁰C.pH before sterilization 6.5 to 6.9, sterilization for 30 min at 120 ^° C.

Nach Übertragung von 10% Vorkultur (v/v) auf die Hauptkulturkolben werden diese 48Std. bei 28°C auf einem Rundschwingtisch (200 U/min) geschüttelt. Das geerntete Mycel wird in an sich bekannter Weise für die Gewinnung von Glucose-Isomerase enthaltendem Enzympräparat eingesetzt und die Aktivität der Biomasse gemäß Beispiel 1 bestimmt. Die ermittelten Werte betragen:After transfer of 10% preculture (v / v) to the main culture flasks, these are 48h. shaken at 28 ° C on a rotary table (200 U / min). The harvested mycelium is used in a conventional manner for the recovery of glucose isomerase-containing enzyme preparation and determines the activity of the biomass according to Example 1. The determined values are:

Kulturl 5556 GIU/I Kulturlösung 1,46 GlU/mg ProteinCulture 5556 GIU / I culture solution 1.46 GlU / mg protein

Kultur 2 5222 GJU/I Kulturlösung 1,50 GlU/mg ProteinCulture 2 5222 GJU / I culture solution 1.50 GlU / mg protein

Kultur3 5889 gIu/I Kulturlösung 1,43 GlU/mg ProteinCulture3 5889 gIu / l culture solution 1.43 GlU / mg protein

Mittelwert 5556 GIU/I Kulturlösung 1,46 GlU/mg ProteinMean 5556 GIU / I culture solution 1.46 GlU / mg protein

Beispiel 3:Example 3:

Aus Konserven des Stammes S. chrysomallus ZIMET 43808 werden Oberflächenkulturen in Form von schrägagarröhrchen angelegt, die jeweils 5ml Medium AL53 enthalten. Dieses besteht aus (g/l: Saccharose 3; Dextrin 15; Harnstoff 0,1; NaCI 0,5; KH₂PO₄0,5; Hefeextrakt 1,0; Pepton (bakt.) 5,0; FeSO₄ (1%ige Lsg.) 1,0ml; Agar 15; ad 1 000ml aqua dest.From conserves of the strain S. chrysomallus ZIMET 43808 surface cultures are applied in the form of slanting tubes, each containing 5 ml of medium AL53. This consists of (g / l: sucrose 3, dextrin 15, urea 0.1, NaCl 0.5, KH ₂ PO ₄ 0.5, yeast extract 1.0, peptone (bact.) 5.0, FeSO ₄ (1 % solu.) 1.0 ml; agar 15; ad 1 000 ml distilled water.

pH 7,2; Sterilisation 35min bei 120⁰C.pH 7.2; Sterilization 35 min at 120 ⁰ C.

Nach 7tägiger Bebrütung bei 28°C dient der Mycelrasen als Impfmaterial der submersen Anzuchtstufe, indem ca. 2cm² große Flächen auf 500-ml-Steilbrustflaschen übertragen werden, die je 50ml Medium S2g gemäß Beispiel 1 enthalten. Nach 48stündiger Kultivierung bei 28⁰C auf einem Rundschwingtisch (220 U/min) werden Schüttelkolben (500-ml-Steilbrustflaschen) mit je 10% Impfkultur beimpft, wobei pro Kolben 50 ml des nachfolgenden Mediums vorgelegt werden (g/l):After 7 days of incubation at 28 ° C, the mycelium lawn serves as a seed material of the submerged cultivation stage by about 2cm ² large areas are transferred to 500 ml Steilbrustflaschen, each containing 50ml medium S2g according to Example 1. After 48 hours of culture at 28 ⁰ C on a rotary table (220 U / min) shake flasks (500 ml Steil breast bottles) are inoculated with 10% seed culture, per flask 50 ml of the following medium are submitted (g / l):

Maisquellwasser (50 % Trockenmasse) 40Corn steep liquor (50% dry matter) 40

Maisstärke 30Cornstarch 30

(NH₄J₂SO₄ 2(NH ₄ J ₂ SO ₄ 2

KH₂PO₄ 2KH ₂ PO ₄ 2

Na₂SO₄ 10Na ₂ SO ₄ 10

D-Xy lose 10D-Xy loose 10

Leitungswasser ad 11Tap water ad 11

pH vor Sterilisation 6,5 bis 6,9, Sterilisation 30min bei 120°C.pH before sterilization 6.5 to 6.9, sterilization 30min at 120 ° C.

Nach 48stündiger Kultivierung bei 29°C auf einem Rundschwingtisch wird das Mycel aus der Kulturlösung in an sich bekannter Weise abgetrennt und für die Gewinnung von Glucose-Isomerase enthaltendem Enzympräparat verwendet. Die gemäß Beispiel 1 durchgeführten Aktivitätsbestimmungen in der Biomasse lieferten als Meßwerte:After culturing for 48 hours at 29 ° C on a rotary table, the mycelium is separated from the culture solution in a conventional manner and used for the production of glucose isomerase-containing enzyme preparation. The activity determinations carried out in the biomass according to Example 1 provided as measured values:

Kulturl 6000 GIU/I Kulturlösung 1,34GlU/mg ProteinCulture 6000 GIU / l culture solution 1.34GlU / mg protein

Kultur2 5167 GIU/I Kulturlösung 1,20 GlU/mg ProteinCulture2 5167 GIU / l culture solution 1.20 GlU / mg protein

Kultur3 4444 GIU/I Kulturlösung 1,09 GlU/mg ProteinCulture3 4444 GIU / I culture solution 1.09 GlU / mg protein

Mittelwert 5204 GIU/I Kulturlösung 1,21 GlU/mg ProteinMean 5204 GIU / L culture solution 1.21 GlU / mg protein

-4- Ζ60Ζ9Ί-4- Ζ60Ζ9Ί

Beispiel 4:Example 4:

Die Herstellung geeigneter Vorkulturen des Stammes S. chrysomallus ZIMET 43808 erfolgt wie in Beispiel 1. Die Hauptkulturen bestehen aus 500-ml-Steilbrustflaschen, die jeweils 50 ml des folgenden Mediums enthalten (g/l):The preparation of suitable precultures of the strain S. chrysomallus ZIMET 43808 is carried out as in Example 1. The main cultures consist of 500 ml steep breast bottles, each containing 50 ml of the following medium (g / l):

Maisquellwasser (50%Trockensubstanz) 40Corn steep liquor (50% dry matter) 40

Maisstärke 30Cornstarch 30

(NH₄I₂SO₄ 2(NH ₄ I ₂ SO ₄ 2

KH₂PO₄ 2KH ₂ PO ₄ 2

MgSO₄ -7 H₂O 2MgSO ₄ -7H ₂ O 2

CaCO₃ 5CaCO ₃ 5

Leitungswasser ad 11Tap water ad 11

pH vor Sterilisation 6,5 bis 6,8, Sterilisation 30min bei 12O⁰C.pH before sterilization 6.5 to 6.8, sterilization for 30 min at 12O ⁰ C.

Die Hauptkulturen werden mit 10% Vorkultur beimpft und gemäß Beispiel 1 kultiviert, wobei nach 48 Std. die Biomasse in an sich bekannter Weise abgetrennt und zur Herstellung von Glucose-Isomerase enthaltendem Enzympräparat verwendet wird. Die Aktivitätsbestimmung der Biomasse liefert gemäß Beispiel 1 einen Wert von 3574GIU/I Kulturlösung (1,23GIU/mg Mycelprotein).The main cultures are inoculated with 10% preculture and cultured according to Example 1, wherein after 48 hours, the biomass is separated in a conventional manner and used to produce glucose isomerase-containing enzyme preparation. The activity determination of the biomass provides according to Example 1 a value of 3574GIU / l culture solution (1.23GIU / mg mycelial protein).

Beispiel 5:Example 5:

Die Herstellung geeigneter Vorkulturen des Stammes S. chrysomallus ZIMET 43 808 erfolgt wie in Beispiel 1. Die Hauptkulturen bestehen aus 500-ml-Steilbrustflaschen, die 50ml des folgenden Mediums enthalten (g/l):The preparation of suitable precultures of the strain S. chrysomallus ZIMET 43 808 is carried out as in Example 1. The main cultures consist of 500 ml steep breast bottles containing 50 ml of the following medium (g / l):

Maisquellwasser (50 %Trockensubstanz) 40Corn steep liquor (50% dry matter) 40

Maisstärke 30Cornstarch 30

(NH₄)₂SO₄ 1,4(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 1.4

KH₂PO₄ 1,4,KH ₂ PO ₄ 1.4,

CaCO₃ 5CaCO ₃ 5

Maisspelzenhydrolysat 450 mlCorn husk hydrolyzate 450 ml

Leitungswasser ad 11Tap water ad 11

pH vor Sterilisation 6,5 bis 6,8, Sterilisation 30 min bei 12O⁰C.pH before sterilization 6.5 to 6.8, sterilization for 30 min at 12O ⁰ C.

Das Hydrolysat wird zubereitet, indem Maisspelzen zunächst bei Raumtemperatur mit stark verdünnter Ammoniaklösung gemsicht und anschließend abgepreßt werden. Die nachfolgend mitO,25N Schwefelsäure imprägnierten Spelzen (100g Spelzen/l Schwefelsäure) werden 3 Stunden bei 119,6⁰C (= 1 kp) im Autoklaven hydrolysiert und nach Abtrennung der Flüssigkeit nochmals mit heißem Wasser gewaschen, wobei das Waschwasser mit dem Hydrolysat vereinigt wird. Die resultierende saure Lösung weist eine Konzentration von 22g D-Xylose/I und 6g Glucose/I auf. Nach Neutralisation auf pH 6,5 mit Natronlage wird nochmals filtriert und mit dem Ritrat das Medium zubereitet.The hydrolyzate is prepared by corn husking first carefully at room temperature with strongly diluted ammonia solution and then squeezed. The following impregnated with O, 25N sulfuric acid husks (100 g husk / l sulfuric acid) are hydrolyzed for 3 hours at 119.6 ⁰ C (= 1 kp) in an autoclave and washed after separation of the liquid again with hot water, the wash water combined with the hydrolyzate becomes. The resulting acidic solution has a concentration of 22g D-xylose / I and 6g glucose / l. After neutralization to pH 6.5 with sodium hydroxide is filtered again and prepared with the ritrat the medium.

Die Hauptkulturen werden mit 10% Vorkultur beimpft und gemäß Beispiel 1 kultiviert, wobei nach 48 Std. die Biomasse in an sich bekannter Weise abgetrennt und zur Herstellung von Glucose-Isomerase enthaltenden Enzympräparaten verwendet wird.The main cultures are inoculated with 10% preculture and cultured according to Example 1, wherein after 48 hours, the biomass is separated in a conventional manner and used for the preparation of glucose isomerase-containing enzyme preparations.

Die Aktivitätsbestimmung der Biomasse liefert gemäß Beispiel 1 einen Wert von 5644GIU/I Kulturlösung (1,76GIU/mg Protein).The activity determination of the biomass provides according to Example 1 a value of 5644GIU / l culture solution (1.76GIU / mg protein).

Beispiel 6:Example 6:

Die Herstellung geeigneter Vorkulturen des Stammes S. chrysomallus ZIMET 43 808 erfolgt wie im Beispiel 1. Die Hauptkulturen, bestehend aus 500-ml-Steilbrustflaschen, enthalten je 50 ml des folgenden Mediums (g/l):The preparation of suitable precultures of the strain S. chrysomallus ZIMET 43 808 is carried out as in Example 1. The main cultures, consisting of 500 ml Steil breast bottles, each containing 50 ml of the following medium (g / l):

Maisquellwasser (40% Trockensubstanz) 40Corn steep liquor (40% dry matter) 40

Maisstärke 30Cornstarch 30

(NH₄J₂SO₄ 1,4(NH ₄ J ₂ SO ₄ 1.4

KH₂PO₄ 1,4KH ₂ PO ₄ 1.4

MgSO₄-7 H₂O 2 MgSO ₄ -7H ₂ O 2

Maisspelzenhydrolysat 1), 2) 500 mlCorn husk hydrolyzate 1), 2) 500 ml

Leitungswasser ad 11Tap water ad 11

pH vor Sterilisation 6,5 bis 6,8, Sterilistion 30min bei 12O⁰C.pH before sterilization 6.5 to 6.8, sterilization for 30 min at 12O ⁰ C.

Das gemäß Beispiel 5 zubereitete Maisspelzenhydrolysat wird nach Neutralisation mit NaOH auf pH 6,5 in 25-ml-Portionen in 100-ml-Flaschen separat sterilisiert, indem 1) 30 Minuten bei 120°C autoklaviertwird, bzw. 2) Zusatz von 0,0025% Peressigsäure (Wofasteril—36% Peressigsäure) erfolgt. Diese Fraktionen werden getrennt zu jeweils 25 ml Hauptkulturmedium zugegeben, welches in 50% des Gesamtvolumens separat in den 500-ml-Flaschen vorgelegt wird. Die resultierenden 50-ml-Hauptkulturmedien werden mit 10ml 48Std. Vorkultur beimpft und 43Std. bei 27⁰C auf einem Rundschwingtisch geschüttelt.The corn husk hydrolyzate prepared according to Example 5 is separately sterilized after neutralization with NaOH to pH 6.5 in 25 ml portions in 100 ml bottles by autoclaving 1) at 120 ° C. for 30 minutes, or 2) Addition of 0, 0025% peracetic acid (Wofasteril-36% peracetic acid) takes place. These fractions are added separately to each 25 ml of main culture medium, which is presented in 50% of the total volume separately in the 500 ml bottles. The resulting 50 ml main culture media are mixed with 10 ml 48 hrs. Seed culture inoculated and 43h. Shaken at 27 ⁰ C on a rotary table.

Die Biomasse wird in an sich bekannter Weise abgetrennt und für die Enzymbestimmung eingesetzt. Die Aktivitätsbestimmungen gemäß Beispiel 1 lieferten als Werte:The biomass is separated in a conventional manner and used for the determination of the enzyme. The activity determinations according to Example 1 gave as values:

Medium 1): 7644GIU/I Medium2): 8829GIU/IMedium 1): 7644GIU / I Medium2): 8829GIU / I

(1,64GIU/mg (1,77GIU/mg(1.64GIU / mg (1.77GIU / mg

Mycelprotein) Mycelprotein)Mycelial protein) mycelial protein)

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase enthaltenden Enzympräparaten auf mikrobiellem Wege durch Fermentation unter aeroben und sterilen Bedingungen in einem Medium, welches neben Kohlenstoffquellen Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, und Abtrennung des enzymhaltigen Mycels durch Separation am Ende der Fermentation, gekennzeichnet dadurch, daß unter Verwendung von Mikroorganismen der Art Streptomyces chrysomallus, die durch Mutagenese aus dem Stamm Streptomyces chrysomallus PL45 gewonnen wurden, eine Fermentation für die Dauer von 24 Stunden bis48 Stunden unter Rührung mit 120 U/min bis 800 U/min, bei einer Belüftung (v/v) von 0,5:1 bis 1:1, einer Temepratur von 25⁰C bis 35⁰C und einer Acidität des Mediums von pH 5,5 bis pH 8,5 durchgeführt wird unter Verwendung eines Nährmediums, welches Glucose oder Glucosepolymere als ausschließliche oder im Verhältnis zu D-Xylose überwiegende C-Substrate enthält, wobei D-Xylose als Reinsubstanz oder als neutralisiertes mineralisches Maisspelzenhydrolysat zugegeben wird, sowie organische und anorganische N-Substrate und Mineralsalze, wobei Magnesiumsalze und/ oder Na₂SCu zugesetzt werden, und die Abtrennung des Mycels und die Gewinnung des Glucose-Isomerase enthaltenden Enzympräparates in an sich bekannter Weise erfolgt.1. A process for the preparation of glucose isomerase enzyme preparations by microbial route by fermentation under aerobic and sterile conditions in a medium containing carbon sources in addition to sources of nitrogen and mineral salts, and separation of the enzyme-containing mycelium by separation at the end of the fermentation, characterized in that Using microorganisms of the species Streptomyces chrysomallus, which were obtained by mutagenesis from the strain Streptomyces chrysomallus PL45, a fermentation for a period of 24 hours to 48 hours with stirring at 120 rev / min to 800 rev / min, with aeration (v / v ) of 0.5: 1 to 1: 1, a temperature of 25 ⁰ C to 35 ⁰ C and an acidity of the medium of pH 5.5 to pH 8.5 is carried out using a nutrient medium, which glucose or glucose polymers as exclusive or contains predominantly C-substrates relative to D-xylose, with D-xylose being pure or neutral Isiertes mineral Maisspelzenhydrolysat is added, and organic and inorganic N-substrates and mineral salts, wherein magnesium salts and / or Na ₂ SCu are added, and the separation of the mycelium and the recovery of the glucose isomerase-containing enzyme preparation in a conventional manner. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation der Mikroorganismus Streptomyces chrysomallus XK10 (Stamm ZIMET 43808) eingesetzt wird.2. The method according to item 1, characterized in that the fermentation of the microorganism Streptomyces chrysomallus XK10 (strain ZIMET 43808) is used. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation der Mikroorganismus Streptomyces chrysomallus XK12 (Stamm ZIMET 43809) eingesetzt wird.3. The method according to item 1, characterized in that the fermentation of the microorganism Streptomyces chrysomallus XK12 (strain ZIMET 43809) is used. 4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Glucosepolymeres Stärke eingesetzt wird.4. The method according to item 1, characterized in that is used as the glucose polymer starch. 5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß D-Xylose in Form eines schwefelsauren, mit MgO oder NaOH neutralisierten Maisspelzenhydrolysates eingesetzt wird.5. The method according to item 1 to 4, characterized in that D-xylose is used in the form of a sulfuric acid, neutralized with MgO or NaOH Maisspelzenhydrolysates. 6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Kartoffel- oder Getreidestärke direkt oder nach hydrolytischer Spaltung eingesetzt werden.6. The method according to item 1 to 5, characterized in that potato or corn starch are used directly or after hydrolytic cleavage. 7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration von Glucose bzw. Glucosepolymeren im Medium im Bereich von 25g/l bis 60g/l liegt.7. The method according to item 1 to 6, characterized in that the concentration of glucose or glucose polymers in the medium in the range of 25g / l to 60g / l. 8. Verfahren nach Punkt 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration von Glucose bzw. Glucosepolymeren im Medium im Bereich von 25g/l bis 40g/l liegt.8. The method according to item 1 to 7, characterized in that the concentration of glucose or glucose polymers in the medium in the range of 25g / l to 40g / l. 9. Verfahren nach Punkt 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration von Glucosepolymeren im Medium 30g/l beträgt.9. The method according to item 1 to 8, characterized in that the concentration of glucose polymers in the medium is 30g / l. 10. Verfahren nach Punkt 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß im Falle einer D-Xylose-Zumischung als Reinsubstanz oder in Form von Maisspelzenhydrolysat deren Konzentration höchstens 40% der Konzentration von Glucose bzw. Glucosepolymeren beträgt.10. The method according to item 1 to 9, characterized in that in the case of a D-xylose admixture as a pure substance or in the form of Maisspelzenhydrolysat whose concentration is at most 40% of the concentration of glucose or glucose polymers. 11. Verfahren nach Punkt 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß der eingesetzte Mikroorganismus in der Hauptkultivierung vorzugsweise für 24 Stunden bis 36 Stunden bei einer Temperatur von 27⁰C bis 32°C gezüchtet wird.11. The method according to item 1 to 10, characterized in that the microorganism used in the main cultivation is preferably grown for 24 hours to 36 hours at a temperature of 27 ⁰ C to 32 ° C.