DD259637A1 - Verfahren zur herstellung von isozitratlyase in rekombinanten mikroorganismen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Isozitratlyase, wobei als rekombinante Mikroorganismen sowohl Bakterien- als auch Hefe-Staemme herangezogen werden. Die Erfindung verfolgt das Ziel, das genannte Enzym mit erhoehter Effektivitaet zu produzieren. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird in ihrem Grundzug in der Weise geloest, dass Mikroorganismen-Zellen, die mit einem der im Verfahren hergestellten Expressionsplasmide transformiert worden sind, welche ihrerseits in einem Insert jeweils eine von ihrer nativen Expressionseinheit regulierte, fuer die Aminosaeuresequenz von Isozitratlyase kodierende DNS (ICL1-Gen aus dem Donorstamm Yarrowia lipolytica H222-27) tragen, in einem fluessigen Naehrmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert werden und anschliessend das Genprodukt aus dem Zellextrakt isoliert wird. Im Ergebnis des Verfahrens sind als pBR322-Derivate insbesondere die shuttle-Expressionsplasmide pYLB40 und pYLB90 sowie diverse ICL1-rekombinante E. coli- und Hefe-Staemme, letztere aus den Arten Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae und Pichia pinus, verfuegbar geworden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Herstellungsverfahren für das Enzym Isozitratlyase (C 4.1.4.1) unter Einsatz gentechnisch verändert Mikroorganismen-Stämme.

Das Enzym Isozitratlyase (Kurzschreibung: ICL) — es wandelt Isozitrat in Glyoxylat und Sukzinat um —ist außer in Säugetier-Zeilen in einer Vielzahl pro- und eukaryotischer Mikroorganismen sowie pflanzlicher und weiterertierischer Zellen nachgewiesen worden. Isozitratlyase hat Bedeutung erlangt als Bio- und Feinchemikalie, sie wird in vielfältiger Form eingesetzt zum Nachweis von Isozitronensäure und -verbindungen.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit primär in der Bio- und Feinchemikalienherstellung. Darüber hinaus ist die erfinderische Lösung für die gen- und biotechnologische Forschung von Bedeutung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das Enzym Isozitratlyase wird bislang aus natürlichen mikrobiellen Produktionsstämmen mittels der allgemein bekannten Verfahren der Enzymisolierung und -reinigung gewonnen. Diese Verfahren sind im Fall der ICL-Gewinnung jedoch sehr material- und kostenaufwendig, da das Enzym in den Zellen der nätiven Bildner nur io relativ geringen Mengen synthetisiert wird. ICL-überproduzierende Mikroorganismen bzw. Zellkulturen sind bisher nicht bekannt (S.Fukui u.A.Tanaka, in: A. Flechter [Ed.], Productsfrom Alkanes, Cellulose and other Feedstocks, Akademie-Verlag, Berlin, 1981).

Eine ICL-Produktion mittels rekombinanter, d. h. gentechnisch veränderter Mikroorganismen ist bisher weder in der Patentliteratur noch in wissenschaftlichen Publikationen beschrieben worden. Bekannt ist seit kurzem lediglich die Isolierung eines für eine Isozitratlyase kodierenden Gens (Bezeichnung: ACUD-Gen) aus dem filamentösen Pilz Aspergillus nidulans (D. J. Ballance u. G. Turner, Mol. Gen. Genet., 202,1986, 271). Eine Expression dieses ACUD-Gens in heterologen Mikroorganismen-Arten wurde dabei jedoch nicht untersucht. Ebensowenig wurde bisher der Versuch unternommen, auf der Grundlage einer gentechnologischen Konstruktion, aus der für das ACUD-Gen eine erhöhte Kopiezahl pro Transformantenzelle resultiert, eine Steigerung der mikrobiellen ICL-Produktion zu erreichen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, das Enzym Isozitratlyase in gentechnisch veränderten Mikroorganismen-Zellen, wahlweise sowohl in Bakterien- als auch in Hefe-Zellen, mit erhöhter Effektivität zu produzieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnologisch-mikrobiologisches Verfahren zu beschreiben, mit dem ausgewählte Mikroorganismen-Stämme, sowohl Bakterien- als auch Hefe-Stämme, hergestellt werden, welche die Fähigkeit aufweisen, das Enzym Isozitratlyase zu synthetisieren

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Mit einem unter Anwendung von gentechnischen Standardoperationen der DNS-Verknüpfung jeweils hergestellten Expressionsplasmid der pYLB-Familie, welches eine von ihrer nativen Expressionseinheit regulierte, für die Aminosäuresequenz des Enzyms Isozitratlyase kodierende DNS trägt (Kurzbeschreibung: ICL1-Gen), werden Mikroorganismen-Zellen in an sich bekannter Weise transformiert. Die transformierten Mikroorganismen-Zellen werden in einem flüssigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, und das verfahrensgemäß synthetisierte Genprodukt, d.h. die Isozitratlyase, wird abschließend in an sich bekannterWeiseausdem Zellextrakt isoliert.

Dieser Grundzug des Verfahrens wird in seinem gentechnologischen Teil zunächst dahingehend weiter ausgeschaltet, daß als pYLB-Expressionsplasmid ein ICLI-rekombinantes shuttle-Derivat eines E.coli-Klonierungsvektors, vorzugsweise ein Derivat des Vektors pBR 322, eingesetzt wird. Für die Konstruktion solcher pYLB-shuttle-Plasmide wird auf ein ICL1-Gen-tragendes Fragment aus einem Stamm der Hefe Yarrowia lipolytica zurückgegriffen. Vorzugsweise wird als Gendonor ein Zitronensäureproduzierender Stamm dieser Hefe herangezogen

Im einzelnen werden die shuttle-Expressionsplasmide des pYLB-Typs hergestellt, indem

— genomische DNS des jeweiligen Y. lipolytica-Donors einleitend mit einer kleinschneidenden Restriktase, so beispielsweise mit BamHI, EcoRI oder BgIII, fragmentiert wird,

— das erhaltene Verdauungsgemisch sodann in einen E.coli-Klonierungsvektor, der im zugehörigen oder in einem kompatiblen Restriktase-Spaltort linearisiert worden ist, inseriert wird,

— mit dem so gewonnenen Ligationsgemisch — entweder direkt oder erforderlichenfalls nach Zwischenklonierung in einem restriktionsnegativen E.coli-Wirt— ICL-negative E. coli-Rezipienten transformiert werden,

— danach die transformierten Zellen zwecks Selektion auf ICL1-rekombinante Klonein einem Medium mit Azetat oder Ethanol als alleiniger Kohlenstoff-Quelle kultiviert werden und

— aus den vermehrungsfähigen E.coli-Transformanten die Plasmid-DNS schließlich in an sichbekannter Weise isoliert wird. Auf diesem Wege werden beispielsweise als pBR322-Derivate Expressionsplasmide von pYLB-shuttle-Typ hergestellt, deren Molekülgröße vornehmlich im Bereich von 7,0kg bis9,0kb liegt.

Mjt DNS-Proben eines nach voranstehendem Teilverfahren konstruierten ICL1-rekombinanten Expressionsplasmids der pYLB-Familie werden in Fortführung des Gesamt-Herstellungsverfahrens nunmehr sowohl ICL-negative bakterielle Produktionsstämme als auch ICL-negative Hefe-Produktionsstämme transformiert. Bevorzugt werden für diesen Teilschnitt Bakterienstämme der Art E.coli einerseits sowie Stämme?aus den Hefe-Gattungen Yarrowia, Accaromyces oder Pichia andererseits ausgewählt.

Im biotechnologischen Teil wird der Grundzug des Verfahrens noch insofern weiter ausgestaltet, daß in der einen Variante jeder mit einem ICL1-rekombinanten pYLB-Expressionsplasmid transformierte E.coli-Produktionsstamm, d.h. jeder" verfahrensgemäß gewonnene ICL1-rekombinante E.coli-Stamm, in einem Nährmedium, welches Azetat und/oder Ethanol als alleinige Kohlenstoff-Quelle enthält, bei Temperaturen von 28°C bis 4O⁰C und Aciditäten von pH 6,5 bis pH 8,5 für die Dauer von 4 Stunden bis 48 Stunden kultiviert wird.

In der anderen Variante des vorliegenden Verfahrens wird jeder verfahrensgemäß hergestellt ICLI-rekombinante Hefe-Stamm in einem Nährmedium, welches als Kohlenstoff-Quelle Alkohole, Azetat, Fettsäuren und/oder n-Alkane enthält, bei Temperaturen von 25 C bis 40C sowie Aciditäten von pH 4,5 bis pH 7,0 für die Dauer von 6 Stunden bis 48 Stunden kultiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die ICL1-gen-tragenden Fragmente aus dem Donorstamm Y.Iipolytica H 222-27, dessen genomische DNS zu diesem Zweck mit der kleinschneidenden Restriktase EcoRI verdaut wird, gewonnen. Das hierbei erhaltene Verdauungsgemisch (s. a. Abb. 1) wird in dieser bevorzugten Form dann mit EcoRI-geschnittener DNS des Plasmids pBR322 ligiert. Zur Unterdrückung der Selbstligation wird in dieser Reaktion dephösphorylierte linearisierte DNS von pBR322 eingesetzt. Im Ergebnis dieser Ligationsvariante entstehen. Rekombinantenplasmide, in denen beide Antibiotika-Resistenzmarker des Ausgangsvektors intakt sind.

Mit dem gewonnenen Ligationsgemisch werden Zellen des an sich bekannten restriktionsnegativen Rezipienten E.coli SK1590 transformiert. Aus der durch diese Zwischenklonierung erhaltenen Genbank für genomische H 222—27-DNS wird das Gesamtgemisch der rekombinanten pBR322-Derivate entnommen und auf den ICL-negativen E.coli-Stamm K8-5m umtransformiert. Die transformierten Zellen werden anschließend in einem Medium, welches sowohl Azetat (als alleinige Kohlenstoff-Quelle) als auch Tetrazyklin und/oder Ampicillin enthält, zwecks Selektion kultiviert. Diese Kultivierung kann beispielsweise auf einem Azetat-Agar vorgenommen werden.

Aus den vermehrungsfähigen Transformanten dieser Variante der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist in an sich bekannterWeise dann abschließend die DNS eines ICL1-rekombinanten neuen shuttle-Expressionsplasmids isolierbar, welches den Namen pYLB40 erhielt. Dieses Plasmid besitzt ein ca. 4,3kb großes ICLI-Gen-tragendes Insert aus dem H222-27-Genom; seine resultierende Molekülgröße beläuft sich somit auf 8,6kb.

In einer anderen Variante der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens unterbleibt die Zwischenklonierung in einem restriktionsnegativen E.coli-Rezipienten; vielmehr wird das nach der Insertion von EcoRI-fragmentierter H222-27-DNS in EcöRI-linearisierte pBR322-ÖNS angefallene Ligationsgemisch direkt zur Transformation von K8-5m-Zellen eingesetzt. Die Transformanten-Kultur wird nach einer kurzen Inkubation in Vollmedium (LB-Medium plus Ampicillin und/oder Tetrazyklin) in flüssiges Selektivmedium mit Azetat als alleiniger Kohlenstoff-Quelle sowie gleichfalls Tetrazyklin- und/oder Ampicillin-Zusatz eingebracht und kultiviert, so daß wiederum nur die rekombinanten Klone vermehrungsfähig sind.

In dieser Variante der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist aus den resultierenden Transformanten die DNS eines zweiten neuen ICLI-rekombinanten shuttle-Expressionsplasmids isolierbar. Für dieses Plasmid, welches den Namen pYLB90 erhielt, beträgt die Molekülgröße 8,3kb. Sein ca. 4,0kb großes Insert weist im Vergleich zum pYLB40-lnsertein anderes Restriktionsmuster auf (vgl. Abbn.2 und 3).

Die bevorzugte Ausführungsform ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß beim Einsatz von bakteriellen Produktionsstämmen für die technische Herstellung von Isozitratlyase die E.coli-Stämme K8-5 m sowie SM1104 herangezogen werden. Diese Stämme werden wahlweise sowohl mit pYLB40- als auch mit pYLB90-DNS transformiert. Transformatenklone der genannten E.coli-Stämme werden in der bevorzugten Ausführungsform in einem Fermentationsgefäß unter den voranstehend genannten Bedingungen, vorzugsweise jedoch bei einer Temperatur von 37 C, kultiviert.

Läuft das ICL-Herstellungsverfahren hingegen unter Einsatz von Hefe-Produktionsstämmen ab, so wird im pYLB40- wie im pYLB90-Fall die technische Gewinnung des Enzyms in den entsprechenden Transformanten der ICL-negativen Ausgangsstämme

Yarrowia lipolytica B204-12C-212, Sacaromyces cerevisiae icl 1-1A sowie PichiapinusN798

vorgenommen.

Bei dem hier genannten Y. lipolytica-Stamm handelt es sich um eine hochstabile Mutante des bekannten Ausgangsstammes Y.üpolytica B 204-12 C. Zur Erhöhung der Transformationsrate wird in dieser Variante der bevorzugten Ausführungsform hierfür linearisierte, insbesondere EcoRi- bzw. Bglll-geschnittene pYLB40- bzw. pYLB90-DNS bereitgestellt. In jedem der genannten rekombinanten Hefe-Produktionsstämme liegt eine integrative Transformation von pYLB-DNS vor.

Transformantenklone der genannten Hefe-Stämme werden in dieser bevorzugten Verfahrensform anschließend in einem Fermentationsgefäß unter den voranstehend genannten Bedingungen, insbesondere bei einer Temperatur von 28C, kultiviert.

Für die auf diese Weise fermentierten ICL1-rekombinanten E.coli-Stämme wurden Enzymaktivitäten der ICL von 50μ.ΜοΙ umgesetztes Isozitrat/Std. χ mg Protein erreicht; für die nach diesem Verfahren fermentierten Hefe-Stämme lagen die Enzymaktivitäten der ICL im Bereich von 10μ.ΜοΙ bis 120μ.ΜοΙ umgesetztes Isozitrat/Std. χ mg Protein (vgl. Tabelle).

Im Zusammenhang mit der voranstehend beschriebenen Erfindung sind in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11 folgende Stammhinterlegungen vorgenommen worden:

Stamm Registriernummer

Yarrowia lipolytica H 222-27 ZIMET43 728

Yarrowia lipolytica B 204-12C ZIMET43 834

E.coliHB101(pYLB90) ZIMET11236 .

Die Hauptvorteile der beschriebenen Erfindung werden dahin gesehen, daß

— das Genprodukt Isozitratlyase insbesondere in den eingesetzen Produktionsstämmen der Art E.coli mit im Vergleich zum Stand der Technik deutlich erhöhter Enzymmenge hergestellt werden kann und

— bei der Durchführung des Verfahrens DNS-Fragmente mit dem nativen ICL 1-Gen des Donorstammes Y. lipolytica H 222-27 für die weitere gentechnologische Forschung verfügbar geworden sind.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1)

1.1) Isolierung von chromosomaler DNS aus Stamm Y. lipolytica H 222:

10ml flüssiges YEP-G-Medium (1% Hefe extrakt, 2% Pepton, 2% Glukose, pH 6,5) werden mit einer Impföse des Stammes Y. lipolytica H222-27 beimpft und 24 Stunden bei 28°C unter Schütteln kultiviert. Mit 4ml dieser Hefezellensuspension werden 80ml flüssiges YEP-G-Medium inokuliert und 12 Stunden bei 28°C geschüttelt. 1,51 Minimalmedium mitThiamin und 0,4% Azetat als alleiniger Kohlenstoffquelle (BARTH & KUNKEL, Z.AIIg. Mikrobiol., 19,1979, 381-390) werden mit 75 ml dieser Kulturbrühe beimpft und 12 Stunden bei 28⁰C unter Schütteln inkubiert. Diese Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet, mit 50ml 0,9%iger NaCI-Lösung resuspendiert, abzentrifugiert und danach in 50ml Waschpuffer (4OmM Tris, 5OmM EDTA; pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen werden nunmehr erneut abzentrifungiert und in 25mlTES-Puffer(0,2MTris, 0,02 M EDTA, 1 M NaCI; pH 8,0) aufgenommen. Dieser Zellsuspension werden 1,5mi ß-Mercaptoethanol sowie 0,5g eines Hefe-Zellwand-auflösenden Enzympräparates zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 25 Minuten bei 37⁰C werden die entstandenen Sphäroplasten abzentrifugiert und einmal mit 50 ml TES-Puffer gewaschen. Die Zellmasse wird mit 30 ml Lyse-Puffer aufgenommen (5OmM Tris, 15OmM NaCI, 10OmM EDTA; pH 8,0); anschließend werden 10 mg Proteinase Kund 2 ml einer 20%igen Natriumdodezylsulphatlösung zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37⁰C unter gelegentlichem vorsichtigem Schütteln stehen gelassen. Mit 50 ml kaltem, wassergesättigtem Phenol wird das Lysat zweimal extrahiert, wobei die wäßrige Phase nach dem Zentrifugieren jewe.ils vorsichtig abgesammelt wird. Dieser wäßrige Überstand, der die DNS*enthält, wird mit destilliertem Ether zweimal ausgeschüttelt. Der restliche Ether wird unter Vakuum entfernt. Die wäßrige DNS-Lösung wird mit 0,1 Volumenteilen 3 M Natriumazetat (pH 8,0) versetzt und mit 2,5 Volumenteilen reinem Ethanol überschichtet. Mit einem Stab werden beide Phasen vermischt, wobei die ausfallende DNS vorsichtig um den Stab gewickelt wird.

Die mittels des Stabes gesammelte DNS wird mit70%igem Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und iiVIOmlTE-Puffer (1OmM Tris, 1 mM EDTA; pH 8,0) über Nacht im Kühlschrank gelöst. Dieser Lösung werden 100μΙ RNAse-Lösung (10 mg RNAse A/ml Aqua bidest.) zugesetzt, und danach wird erneut 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert. Durch zweimaliges Ausschütteln mit kaltem, wassergesättigtem Phenol und nachfolgender Behandlung mit Ether wird die RNAse wieder eliminiert. Anschließend werden VioVolumenteile 3M Natriumazetat; pH 8,0; und 0,54 Volumenteile Isopropanol zugesetzt. Die ausgefällte DNS wird durch Zentrifugation abgetrennt, mit70%igem Ethanol dreimal gewaschen und danach in 3ml sterilem TE-Puffer über Nacht bei 4°C gelöst. Die so isolierte DNS wird bei 260 nm und 280 nm vermessen, um den DNS-Gehalt und den Protein-Gehalt zu bestimmen. Mittels Agarose-Gelelektrophorese (0,4%) wird weiterhin die durchschnittliche Fragmentgröße der gewonnenen DNS bestimmt

Auf diese Weise wurden etwa 2,6 mg H222-27-DNS einer Fragmentgröße über 50kb gewonnen.

1.2) Spaltung der DNS von Y. lipolytica H 222-27 mit der restriktiven EndonukleaseEcoRi

2/^g der nach Punkt 1.1) gewonnenen genomischen DNS werden in TM-Puffer (1OmM Tris; pH 7,8; 1OmM MgCI₂1 mM Dithiothreitol) und 10OmM NaCI mit 10 Einheiten restriktiver Endonuklease EcoRI bei 37⁰C 1 Stunde verdaut. 15μΙ dieses Ansatzes werden mit 5μΙ Stopper (50% Glyzerin, 7,45% EDTA, 0,25% Bromphenolblau) versetzt und auf ein 0,7%iges Agarosegel aufgetragen, um die erfolgte Fragmentierung der DNS zu kontrollieren (Abb. 1).

Nach der Verdauung wird der Ansatz zweimal mit kaltem Phenol und Ether ausgeschüttelt. Anschließend wird die DNS mit Ethanol gefällt, mit70%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die DNS wird in 10μΙ sterilem Aqua bidest gelöst und bis zur weiteren Verwendung bei+4⁰C aufbewahrt.

1.3) Spaltung des Plasmids pBR322 mit der Endonuklease EcoRI und Dephosphorylierung der DNS:Enden

3μg des Plasmids pBR322 werden mit 15 Einheiten EcoRI unter den oben angegebenen Bedingungen gespalten. Die in dieser Weise linearisierte DNS wird mit Phosphatase aus Kälberdarm nach der Vorschrift von PERBAL (A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, 259,1984) behandelt, um eine Religation des Vektorsohne Hefe-DNS-Insert zu verhindern. ·

1.4) Ligation von genomischer DNS aus Y. lipolytica H 222-27 mit pBR 322, Transformation auf E.coli und Isolierung eines rekombinanten Plasmides

2/u.g der EcoRI-geschnittenen genomischen DNS von Stamm H222-27 werden mit 3^g EcoRI-linearisierter, dephosphorylierter pBR322-DNS in Ligationspuffer (25mM Tris; pH 7,8; 10MM MgCI₂,1 mM DTT, 0,4mM ATP) gemischt (Endkonzentration: 5μg DNS/ml) und nach Zusatz von 1 Einheit T4-Ligase 1.8 Stunden bei 8°C inkubiert. Der Ligationsansatz wird in Portionen von je 200/Ag DNS geteilt und auf je 200 μΙ kompetenter Zellen von Stamm E.coli K8-5m transformiert. Der Transformation dieses Stammes erfolgt nach der CaCI₂-Methode (MANIATIS et. al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1982). Das Transformationsgemisch wird in flüssigem LB-Medium (10g Bacto-Hefeextrakt, 5g NaCI; pH 7,5) mit Ampicillin (50/xg/ml) 1 Stunde bei 37°C inkubiert.

Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert und mit je 10ml Minimalmedium, versetzt mit Natriumacetat (0,4%), Methionin (25/xg/ml), Ampicillin (25^g/ml) sowie Tetrazyklin (10^g/ml) ((MMA + A + T)-Medium), aufgenommen. Diese Kulturen werden bei 37°C geschüttelt. Nach 5 Tagen Kultivierung werden die Zellen aus gewachsenen Kulturen auf (MMA + A + T)-Agarplatten ausgespatelt und erneut bei 37⁰C inkubiert. Von den auf diesen Platten gewachsenen Kolonien werden je 20 Stück pro Ansatz abgeimpft und mittels der Minipräparationsmethode von HOLMS & QUIGLEY (Anal. Biochem., 114,193-197,1981) auf Anwesenheit von rekombinanten Plasmiden geprüft.

Auf diese Weise wurde das Plasmid pYLB90 isoliert, das eine chromosomale DNS-Sequenz aus H 222-27 von etwa 4,0 kb enthält. Dieses Insert chromosomaler DNS wurde nach Standardmethoden mit verschiedenen restriktiven Endonukleasen verdaut, um die entsprechenden Schnittstellen festzustellen. Die aus diesen Untersuchungen resultierende physische Karte dieser DNS-Sequenz ist in Abb. 3 dargestellt.

1.5) Herstellung von Isozitratlyase in E.coli K8-5m — Zellen des rekombinanten Stammes E.coli-K8-5m (pYLB90) werden in 10 ml LBTetrazyklin und/oder Ampicillin 20 Stunden bei 37⁰C kultiviert. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert, einmal mit MMA gewaschen und in 11 MMA + Methionin (25μg/ml) resuspendiert. Nach 48 Stunden Kultivierung bei 37⁰C werden die E. coli-Zeilen abzentrifugiert und anschließend

mittels Homogenisation aufgeschlossen. Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der Isozitratlyase und die Isolierung sowie Reinigung dieses Enzyms erfolgt in an sich bekannter Weise. Die im Zellextrakt von E.coli K8-5m (pyLB90) nachgewiesene spezifische Aktivität der ICL ist in Tabelle 1 dargestellt.

1.6) Linearisierung des Plasmides pYLB90 und Transformation von Y. lipolytica B204-12C-212

10iig isolierter DNS von Plasmid ρYLB90 werden in TM-Puffer mit Hilfe des Enzyms BgIII (20 Einheiten) unter Anwesenheit von 10OmM NaCI linearisiert. Die so gewonnene lineare DNS wird für die Transformation von Y. lipolytica-Stämmen, speziell des Stammes B 204-12C-212, nach der modifizierten Lithiumazetat-Methode (ITO et al., J. Bacteriol. 153,1083, 163-168) eingesetzt. Dabei werden 50ml einer YEP-G-Kultur des Stammes B 204-12C-212 aus der spaten logarithmischen Wachstumsphase (5 x 10⁷Zellen/ml) abzentrifugiert, mit 25ml sterilem TE-Puffer; pH 7,5; gewaschen, erneut abzentrifugiert und mit 8ml Lithiumazetat-Lösung (0,1 M Li-Azetat in TE-Puffer; pH 7,5) aufgenommen. Die Zellsuspension wird eine Stunde bei 28°C langsam geschüttelt, danach abzentrifugiert, und die Zellen werden in 1 ml Lithiumazetat-Lösung resuspendiert. Je 300μΙ dieser Suspension werden in 2 sterile Röhrchen gegeben, denen jeweils 50/xg fraktionierte Fischspermien-DNS zugesetzt wird. Zu einem Röhrchen werden 10/xg der linearisierten DNS von pYLB90 (in 50 μΙ TE-Puffer) gegeben, während in das zweite Röhrchen (dient als Kontrolle) 50 μΙ steriler TE-Puffer eingefüllt werden. Beide Röhrchen werden bei 28°C 30 Minuten inkubiert. Danach werden jedem Ansatz 1 ml einer 40%igen Polyethylenglycol 4000 (PEG)-Lösung (in 0,1 M Li-Azetatlösung) zugegeben, gemischt und 1 Stunde bei 28T inkubiert. Anschließend werden beide Röhrchen 8 Minuten bei 37°C bebrütet und danach im Eisbad abgekühlt. Die Zellen werden abzentrifugiert, in sterilem A. dest. resuspendiert und auf MMT-Azetat + Methionin-Agar (BARTH & KUNKEL, a. a. O.) ausplattiert.

Auf diese Weise konnten pro ßg DNS 35 Transformanten isoliert werden, die die Bezeichnung Y. lipolytica B 264-12 C-121 (pYLB90) erhielten.

1.7) Herstellung von Isozitratlyase in Stamm Y. lipolytica B204-12C-212 (pYLB90)

Aus einer YEP-G-Kultur von Stamm B204-12C-212 (pYLB90) in der stationären Wachstumsphase werden 10ml entnommen, abzentrifugiert, mit sterilem A. dest. gewaschen und in 11 MMT-Azetat, versetzt mit Methionin, überführt. Die Zellkultur wird 8 Stunden bei 28°C geschüttelt. Danach werden die Zellen abzentrifugiert. Die Bestimmung der spezfischen Aktivität der Isozitratlyase erfolgt gemäß BARTH (Curr. Genet., 10,1985,119-124). Die Isolierung und Reinigung der Isozitratlyase erfolgt in an sich bekannterWeise

Die in B204-12C-212 (pYLB90) nachgewiesene spezifische Aktivität der Isozitratlyase ist in Tabelle 1 angegeben.

Beispiel 2)

2.1) Ligation von genomischer DNS aus Y. lipolytica H 222-27 mit pBR322; Transformation auf E.coli und Isolieurng eines rekombinanten Plasmides

Wie im Beispiel 1 unter 1.4 beschrieben, werden 2 jug der EcoRI-geschnittenen genomischen DNS von Stamm H222-27 mit3μg EcoRI-linearisierter, dephosphorylierter pBR322-DNS ligiert. Der Ligationsansatz wird in Portionen von je 200μ-g DNS geteilt und auf je 200 μΙ kompetenter Zellen des Stammes E.coli SK1590 in an sich bekannter Weise transformiert. Die Transformationsgemische werden auf LB-Agarplatten mit Ampicillin + Tetrazyklin ausgespatelt und 24 Stunden bei 37°C bebrütet. Danach werden alle gewaschenen Klone (etwa 20000) mit 10ml LB, versetzt mit Ampicillin und Tetrazyklin, abgeschwemmt und 16 Stunden bei 37°C in einem 50ml-Steilbrustkölbchen geschüttelt. Aus den E. coli-Zellen wird die Plasmid-DNS nach der Methode von HOLMS & QUIGLEY (a.a. 0.) isoliert.

Mit diesem Gemisch rekombinanter Plasmide wird anschließend der Stamm E.coli SM1104 transformiert. Die Transformationsgemische werden auf (MMA + A + T)-Agarplatten ausgespatelt und bei 37°C inkubiert. Die auf diesen Platten gewaschen Kolonien werden abgeimpft und mittels der Minipräparationsmethode von HOLMS & QUIGLEY (a.a.O.) auf Anwesenheit von rekombinanten Plasmiden geprüft.

Auf diese Weise wurde das Plasmid pYLB40 isoliert, das eine chromosomale DNS-Sequenz aus H 222-27 von etwa 4,3 kb enthält. .

2.2) Herstellung von Isozitratlyase in E.coli SM 1104 (pYLB40) Isozitratlyase wird aus dem Stamm SM 11ß4(pYLB40) in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 1 unter 1.5) für den Fall des Wirtsorganismus K8-5m (pYLB90) beschrieben.

Beispiel 3)

3.1) Transformation von Stamm Saccharomyces (Sacch.) cerevisiae icl1-1 A mit Plasmid pYLB90

10 ml YEP-G werden mit einer Impf öse des Stammes Sacch. cerevisiae icl 1-1 A beimpft und bei28°C24 Stunden geschüttelt. 2 ml dieser Kulturlösung werden anschließend in 100ml YEP-G überführt und erneut bei 28°C 10 Stunden unter Schüttelt inkubiert. Die Zellen dieser Suspension werden abzentrifugiert, mit 10ml TE-Puffer einmal gewaschen und in 10 ml Lithiumazetat-Lösung (0,1 M in TE-Puffer, ρ 7,5) resuspendiert, erneut abzentrifugiert und danach mit 2 ml 0,1 M Lithiumazetat-Lösung aufgenommen. Diese Zellsuspension wird 1 Stunde bei 28°C stehen gelassen. 300μΙ dieser Kultur werden ηηίίδΟμΙ pYLB90-Lösung (enthält 10μg Plasmid-DNS) und 100μΙ einer genomischen DNS aus E.coli (50μg DNS) gemischt und nachfolgend bei 28°C 30 Minuten inkubiert. 2,1 ml einer 40%igen Lösung von Polyethylenglykol 4000 in 0,1 M Lithiumazetat-Lösung werden zugesetzt und anschließend wird 5 Minuten bei 42°C eine Hitzeschock-Behandlung durchgeführt. Die Zellen werden abzentrifugiert, zweimal mit TE-Puffer gewaschen und in 0,4ml TE-Puffer aufgenommen.

Diese Suspension wird auf Azetatagarplatten (MMT-Azetat-Agar nach BARTH & KUNKEL, a.a.O.) ausgespatelt. Nach 7 Tagen Inkubation dieser Agarplatten bei 28°C werden die gewaschenen Kolonien auf Schrägargarröhrchen mit MMT-Azetat-Agar abgeimpft, zwei Tage bei 28⁰C inkubiert und danach im Kühlschrank aufbewahrt.

3.2) Herstellung von Isozitratlyase in Stamm Saccharomyces cerevisiae icl 1-1A (pYLB90)

Die Herstellung von Isozitratlyase in Saccharomyces cerevisiae icl 1-1 A(pYLB90) erfolgt wie in Beispiel 1 unter 1.7) für den Fall des Wirtsorganismus Y. lipolytica B204-12C-212 (pYLB90) beschrieben.

Legenden zu den 3 Abbildungen:

Abb. 1: Chromosomale DNS von Y. lipolytica, verdaut mit der Restriktase EcoRI Abb.2: Spaltung der Plasmide pBR322, pYLB40 und pYLB90 mit unterschiedlichen Restriktasen Abb.3: Restriktionskarte des DNS-Inserts von Y. lipolytica H 222-27 in Plasmid pYLB90

Tabelle 1: Spezifische Aktivitäten des Enzyms Isozitratlyase in E. coli und Y. lipolytica transformiert mit Plasmid pYLB90 im Vergleich zu den nichttransformierten Isozitratlyase-negativen Mutanten

Stammbezeichnung

ICL1-Gen Spezifische Aktivitäten

derlCLInMol/mgxh)

E.coliK8-5m E.colik8-5m(pYLB90) Y. lipolytica B 204-12 C-212 Y.iipolyticaB204-12C-212(pYLB90)

4 42

0 36

Claims (22)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung von Isozitratlyase in rekombinanten Mikroorganismen unter Anwendung gentechnischer Standardoperationen der DNS-Verknüpfung, gekennzeichnet dadurch, daß man

   — mit einem Expressionsplasmid der pYLB-Serie, welches eine von ihrer nativen Expressionseinheit regulierte, für die Aminosäuresequenz des Enzyms Isozitratlyase kodierende DNS (kurz: ICL1-Gen) trägt, transformierte Mikroorganismen-Zellen in einem flüssigen Nährmedium mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen sowie Mineralsalzen unter aeroben Bedingungen kultiviert und

   — das Genprodukt aus dem Zellextrakt isoliert.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Expressionsplasmid ein ICL1-rekombinantes shuttle-Derivat eines E.coli-Klonierungsvektors einsetzt.
3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß man als Expressionsplasmid ein ICL1-rekombinantes shuttle-Derivat des E.coli-Vektors pBR322 einsetzt.
4. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man das ICL1-Gen-tragende Insert für die shuttle-Expressionsplasmide aus einem Stamm der Hefe Yairrowia lipolytica bereitstellt.
5. 5. Verfahren gemäß Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß man das ICL1-Gen-tragende Insert für die shuttle-Expressionsplasmide aus einem Zitronensäure-produzierenden Y.Iipolytica-Stamm bereitstellt.
6. 6. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß man das ICL1 -Gen-tragende Insert für die shuttle-Expressionsplasmide aus dem Y. lipolytica-Stamm H 222 oder aus einem Derivat dieses Stammes bereitstellt.
7. 7. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2,4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß man ein ICL1 rekombinantes Expressionsplasmid der pYLB-Familie als shuttle-Derivat eines E. coli-Klonierungsvektors herstellt, indem man

   — genomisches DNS des jeweiligen Y. lipolytica-Donorstammes mit einer kleinschneidenden Restriktrase fragmentiert,

   — das erhaltene Verdauungsgemisch in einen im zugehörigen bzw. in einem kompatiblen Spaltort linearisierten E.coli-Klonierungsvektor inseriert,

   — mit dem gewonnenen Ligationsgemisch erforderlichenfalls nach Zwischenklonierung in einem restriktionsnegativen E.coli-Stamm ICL-negative E.coli-Rezipienten transformiert,

   — die transformierten Zellen zwecks Selektion in einem Medium mit Azetat oder Ethanol als alleiniger Kohlenstoff-Quelle kultiviert und

   — aus den vermehrungsfähigen E.coli-Transformanten die Plasmid-DNSin an sich bekannter Weise isoliert.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1,3,6 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß man das ICL1 -rekombinante Expressionsplasmid pYLB40 (Molekülgröße 8,6kb) herstellt, indem man

   — genomische DNS des Donorstammes Y. lipolytica H 222-27 mit der Restriktase EcoRi fragmentiert,

   — das erhaltene Verdauungsgemisch in den EcoRI-Ort von Plasmid pBR322 inseriert,

   — mit dem gewonnenen Ligationsgemisch nach Zwischenkolonierung im restriktionsnegativen E.coli-Rezipienten SK1590 den ICL-negativen E.coli-Stamm K8-5m transformiert,

   — die transformierten Zellen zwecks Selektion in einem Medium, welches sowohl Azetat als alleinige Kohlenstoff-Quelle als auch Tetrazyklin und/oder Ampicillin enthält, kultiviert und

   — aus den vermehrungsfähigen Transformanten die pYLB40-DNS in an sich bekannter Weise isoliert. .
9. 9. Verfahren gemäß Anspruch 1, 3, 6 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß man das ICL1- . rekombinante Expressionsplasmid pYLB90 (Molekülgröße 8,3kb) herstellt, indem man

   — genomische DNS des Donorstammes Y. lipolytica H 222-27 mit der Restriktase EcoRi fragmentiert,

   — das erhaltene Verdauungsgemisch in den EcoRI-Ort von Plasmid pBR322 inseriert,

   — mit dem gewonnenen Ligationsgemisch den ICL-negativen E.coii-Stamm K8—5m transformiert,

   — die transformierten Zellen zwecks Selektion in einem Medium, welches sowohl Azetat als alleinige Kohlenstoff-Quelle als auch Tetrazyklin und/oder Ampicillin enthält, kultiviert und

   — aus den vermehrungsfähigen Transformanten die pYLB90-DNS in an sich bekannter Weise isoliert.
10. 10. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß man mit DNS-Proben eines ICL1-rekombinanten Expressionsplasmids der pYLB-Familie ICL-negative bakterielle Produktionsstämme transformiert.
11. 11. Verfahren gemäß Anspruch 1,7 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß man mit DNS-Proben eines ICL1-rekombinanten Expressionsplasmids der pYLB-Familie ICL-negative Produktionsstämme der Art E. coli transformiert.
12. 12. Verfahren gemäß Anspruch 1 und I₁ gekennzeichnet dadurch, daß man mit DNS-Proben eines ICL1 -rekombinanten Expressionsplasmids der pYLB-Familie ICL-negative Hefe-Produktionsstämme aus den Gattungen Pichia-Saccharomyces und Yarrpwia transformiert.
13. 13. Verfahren gemäß Anspruch 1,8 und 11, gekennzeichnet dadurch, daß man mit DNS-Proben des ICL1-rekombinanten Plasmids ρYLB40 die ICL-negativen E.coli-Produktionsstämme K8-5m und SM1104 transformiert.
14. 14. Verfahren gemäß Anspruch 1, 9 und 11, gekennzeichnet dadurch, daß man mit DNS-Proben des ICL1-rekombinanten Piasmids pYLB90 die ICL-negativen E.coli-Produktionsstämme K8-5m und SM1104 transformiert.
15. 15. Verfahren gemäß Anspruch 1,8 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man mit Proben von EcoRigeschnittener DNS des ICL1-rekombinanten Plasmids pYLB40 den ICL-negativen Produktionsstamm Pichia pinus N 789 transformiert.
16. 16. Verfahren gemäß Anspruch 1, 9 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man mit Proben von BGIII-geschnittener DNS des ICL1-rekombinanten Plasmids pYLB90 den ICL-negativen Produktionsstamm Pichia pinus N 789 transformiert.
17. 17. Verfahren gemäß Anspruch 1,8 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man mit Proben von EcoRI-geschnittener DNS des ICL1-rekombinanten Plasmids pYLB40 den ICL-negativen Produktionsstamm S.cerevisiae icl-1-1 A transformiert.
18. 18. Verfahren gemäß Anspruch 1, 9 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß" man mit Proben von BgIII-geschnittener DNS des ICL1-rekombinanten Plasmids pYLB90 den ICL-negativen Produktionsstamm S.cerevisiae icl 1-1Atransformiert.
19. 19. Verfahren gemäß Anspruch 1,8 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man mit Proben von EcoRigeschnittener DNS des ICLI-rekombinanten Plasmids pYLB40 den ICL-negativen Produktionsstamm Y. lipolytica B204-12C-212, eine hochstabile Mutante aus Stamm Y. lipolytica B 204-12 C, transformiert.
20. 20. Verfahren gemäß Anspruch 1,9 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man mit Proben von BgIII-geschnittener DNS des ICLI-rekombinanten Plasmids pYLB90 den ICL-negativen Produktionsstamm Y.lipolytica B204-12C-212 transformiert.
21. 21. Verfahren gemäß Anspruch 1,11,13und14, gekennzeichnet dadurch, daß man die mit einem ICL1-rekombinaten pYLB-Plasmid transformierten E.coli-Stämme in einem Nährmedium, welches ausschließlich Azetat und/oder Ethanol als Kohlenstoff-Quelle enthält, bei Temperaturen von 28°C bis 40°C, vorzugsweise 37⁰C, und Aciditäten von pH 6,5 bis ρ 8,5 für die Dauer von 4 Stunden bis 48 Stunden kultiviert.
22. 22. Verfahren gemäß Anspruch 1,12 sowie 15 bis 20, gekennzeichnet dadurch, daß man die mit einem ICLI-rekombinanten pYLB-Plasmid transformierten Hefe-Stämme in einem Nährmedium, welches als Kohlenstoff-Quelle Alkohole, Azetat, Fettsäuren und/oder n-Alkane enthält, bei Temperaturen von 25C bis 40C, vorzugsweise 28C, und Aciditäten von pH 4,5 bis pH 7,0 für die Dauer von 6 Stunden bis 48 Stunden kultiviert.

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