DD257174A3 - PROCESS FOR PREPARING THE PEPTIDES Z ALA ALA LON P NITRANILIDE OR Z ASP ASP PHE OME WITH METALOPROTEASE - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Metalloprotease. Ziel ist die Entwicklung eines oekonomischen Verfahrens zur Herstellung von Peptiden, insbesondere von Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid oder L-Asp-L-PheOMe. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Auswahl zwischen Enzym und Zielprodukt zu treffen. Erfindungsgemaess wird Metalloprotease aus B. cereus ZIMET 10 700 fuer die Herstellung des Peptides Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid oder des Peptides Z-L-Asp-L-PheOMe verwendet. Ueberraschenderweise wurde festgestellt, dass das Enzym als Kulturfiltrat oder nach Reinigung durch einmalige Affinitaetschromatographie, bevorzugt mit Bacitracin-Silochrom, verwendbar ist.The invention relates to a process for the preparation of peptides with metalloprotease. The aim is to develop an economical process for the preparation of peptides, in particular Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilide or L-Asp-L-PheOMe. The invention has for its object to make a suitable choice between the enzyme and the target product. According to the invention, metalloprotease from B. cereus ZIMET 10 700 is used for the preparation of the peptide Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide or of the peptide Z-L-Asp-L-PheOMe. Surprisingly, it has been found that the enzyme is useful as a culture filtrate or after purification by one-time affinity chromatography, preferably with bacitracin-silochrome.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, insbesondere von Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid und Z-L-Asp-L-PheOMe (Aspartam) mit Metalloprotease aus einem Bacillus cereus-Stamm.The invention relates to a process for the preparation of peptides, in particular Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide and Z-L-Asp-L-PheOMe (aspartame) with metalloprotease from a Bacillus cereus strain.

Charakterisierung der bekannten technischen LösungenCharacterization of the known technical solutions

Zur Peptidsynthese werden neben verschiedenen organisch-chemischen Methoden Verfahren angewendet, bei denen Proteasen als Katalysatoren für die Knüpfung der Peptidbindung Verwendung finden. Der Vorteil beim Einsatz proteolytischer Enzyme liegt in einer einfachen Prozeßsteuerung und in der Ausschaltung der Racemisierung sowie anderer unerwünschter Nebenreaktionen (Übersicht: ISOWA, Y. (1978) Yuki Gosei Kagaku Kyokaishi, 36,195-205 sowie insbesondere DE-PS 2647189). .For peptide synthesis, in addition to various organic-chemical methods, methods are used in which proteases are used as catalysts for the formation of the peptide bond. The advantage in the use of proteolytic enzymes lies in a simple process control and in the elimination of racemization and other undesirable side reactions (review: ISOWA, Y. (1978) Yuki Gosei Kagaku Kyokaishi, 36.195-205 and in particular DE-PS 2647189). ,

Es werden neben Serinproteasen mit Esteraseaktivität (z. B. Thermitase aus Thermoactinomyces vulgaris) vorwiegend Metalloproteasen verschiedener biologischer Herkunft verwendet, so z. B. aus Bacillus polymyxa. Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus, Streptomyces caespitosus oder Streptomyces griseus. Diese Enzyme müssen vor der Anwendung gereinigt werden, um störende Serinproteasen zu entfernen. Eine Feinreinigung laßt sich vermeiden, wenn teure Serinproteaseinhibitoren (z.B. Kartoffelinhibitor) dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, rohe Enzympräparate oder zellfreie Kulturfiltrate von Mikroorganismen zu verwenden, die nur geringe Mengen oder keine Serinproteasen produzieren, z.B. Aspergillus oryzae oder Bacillus cereus NRRL B-12315 (DE-OS 3203292). Der Nachteil des letztgenannten Verfahrens besteht in der relativ großen Menge an Kulturfiltrat, die für die Synthese von Z-L-Asp-L-PheOMe aufgewendet werden muß.In addition to serine proteases with esterase activity (eg thermitase from Thermoactinomyces vulgaris), predominantly metalloproteases of various biological origins are used, such as, for example, B. from Bacillus polymyxa. Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus, Streptomyces caespitosus or Streptomyces griseus. These enzymes must be purified before use to remove interfering serine proteases. Fine cleaning can be avoided if expensive serine protease inhibitors (e.g., potato inhibitor) are added to the reaction mixture. In addition, it is possible to use crude enzyme preparations or cell-free culture filtrates of microorganisms which produce only small amounts or no serine proteases, e.g. Aspergillus oryzae or Bacillus cereus NRRL B-12315 (DE-OS 3203292). The disadvantage of the latter method is the relatively large amount of culture filtrate which must be used for the synthesis of Z-L-Asp-L-PheOMe.

cc-L-Aspartyl-L-Phenylalaninmethylester ist als physiologisch wirksames Peptidderivat mit hoher Süßkraft bekannt. Es kann nach verschiedenen Verfahren, sowohl chemisch als auch unter Verwendung von Metalloproteasen, hergestellt werden. Eine Methode ist die Gewinnung von L-Asp-L-Phe (u.a. durch neukombinierte Gene) und die anschließende Methylierung des freien Säurerestes des Phenylalanine. Eine weitere Möglichkeit ist die Verknüpfung von Z-L-Asp und L-PheOMe mittels Metalloproteasen und anschließende Abtrennung der Carbobenzoxyschutzgruppe durch Palladiumkatalysatoren, wie sie in der DE-OS 3203292 beschrieben wird. Nach diesem Verfahren werden allerdings nur L-Aspartyl-L-Phenylalanin-alkylester durch enzymatische Kupplung einer aminogeschützten L-Asp mit einem carboxylgeschützten L-Phe-alkylester mit der Metalloprotease aus B. cereus NRRL B-12315 hergestellt.cc-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester is known as a high potency, physiologically active peptide derivative. It can be prepared by various methods, both chemically and using metalloproteases. One method is to recover L-Asp-L-Phe (inter alia by recombinant genes) and then methylate the free acid residue of the phenylalanine. Another possibility is the linking of Z-L-Asp and L-PheOMe by means of metalloproteases and subsequent separation of the carbobenzoxy protecting group by palladium catalysts, as described in DE-OS 3203292. However, according to this method only L-aspartyl-L-phenylalanine alkyl esters are prepared by enzymatic coupling of an amino-protected L-Asp with a carboxyl-protected L-Phe-alkyl ester with the metalloprotease from B. cereus NRRL B-12315.

Chromogene Peptide als Substrate für die Analytik verschiedener Proteasen nehmen ständig an Bedeutung zu. So beschreiben u.a. L.A. LJUBLINSKAJA et al. (1982) in Bioorganitscheskaja chimija 8,1620-1624, die Herstellung von p-Nitroanilinenthaltenden Peptiden mit Metalloproteasen aus Bacillus thermoproteolyticus und Bacillus subtilis. Das p-Nitroanilid verschiedener Tripeptide kann u.a. für die Bestimmung von bakteriellen Serinproteasen — z. B. von Subtilisinen, thiolabhängigen Serinproteasen, intrazellulären Serinproteasen usw. — verwendet werden. Mit guter Ausbeute läßt sich Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid produzieren, von dem Subtilisine das p-Nitroanilin durch Hydrolyse abspalten. Die Synthese von Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid aus Z-AIa-AIa und Leu-p-Nitroanilid mit Hilfe von Metalloproteasen aus B. thermoproteolyticus und B. subtilis ist jedoch nicht als bloße Umkehr der Hydrolyse anzusehen (vgl. V. M. STEPANOV [1984] Symp. Biol. Hungarica 25,49-55). Die Synthese dieses Produktes mit Metalloprotease aus B. cereus ist bisher noch nicht durchgeführt worden.Chromogenic peptides as substrates for the analysis of various proteases are becoming increasingly important. So describe u.a. L.A. LJUBLINSKAJA et al. (1982) in Bioorganicheskaja chimija 8, 1620-1624, the preparation of p-nitroaniline-containing peptides with metalloproteases from Bacillus thermoproteolyticus and Bacillus subtilis. The p-nitroanilide of various tripeptides may i.a. for the determination of bacterial serine proteases - eg. Of subtilisins, thiol-dependent serine proteases, intracellular serine proteases, etc., can be used. In good yield, Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide can be produced, from which subtilisins cleave the p-nitroaniline by hydrolysis. However, the synthesis of Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide from Z-Ala-Ala and Leu-p-nitroanilide with the aid of metalloproteases from B. thermoproteolyticus and B. subtilis should not be regarded as a mere reversal of the hydrolysis (cf. VM STEPANOV [1984] Symp. Biol. Hungarica 25: 49-55). The synthesis of this product with metalloprotease from B. cereus has not yet been carried out.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist die ökonomische Herstellung von mehreren Peptiden, insbesondere von Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid oder Z-L-Asp-L-PheOMe mit einer Metalloprotease aus Bacillus cereus.The aim of the invention is the economical production of several peptides, in particular Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide or Z-L-Asp-L-PheOMe with a metalloprotease from Bacillus cereus.

Darstellung des Wesens der ErfindungPresentation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Auswahl zwischen Enzym und Zielprodukt zu treffen.The invention has for its object to make a suitable choice between the enzyme and the target product.

Erfindungsgemäß wird Metalloprotease aus B. cereus ZIMET10700 für die Herstellung des Peptides Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid oder des Peptids Z-L-Asp-L-PheOMe verwendet.According to the invention, metalloprotease from B. cereus ZIMET10700 is used for the preparation of the peptide Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide or the peptide Z-L-Asp-L-PheOMe.

Überraschenderweise wurde fest gestellt, daß das Enzym auch als Kulturfiltrat oder nach Reinigung durch einmalige Affinitätschromatographie verwendbar ist.Surprisingly, it has been found that the enzyme is also useful as a culture filtrate or after purification by one-time affinity chromatography.

Der verwendete Mikroorganismus ist im DD-WP 226156 charakterisiert.The microorganism used is characterized in DD-WP 226156.

Es wurde festgestellt, daß sich Z-AIa-AIa mit Leu-p-Nitroanilid und Z-L-Asp mit L-PheOMe mit hoher Ausbeute bereits durchIt has been found that Z-Ala-Ala with Leu-p-nitroanilide and Z-L-Asp with L-PheOMe in high yield already by

geringe Enzymmengen verknüpfen lassen, unabhängig davon, ob das Enzym als Bestandteil des Kulturfiltrats oder in gereinigter Form vorliegt.regardless of whether the enzyme is present as part of the culture filtrate or in purified form.

Die Effektivität des Syntheseverfahrens ist verständlicherweise höher, wenn gereinigtes Enzym verwendet wird, da neben der Reaktionsgeschwindigkeit auch die Konzentration der Reaktanden pro Volumeneinheit wesentlich erhöht werden kann. Ein sehr wirksames Reinigungsverfahren für die Metalloprotease aus B. cereus ZIMET10700 ist die Affinitätschromatographie mit Bacitracin-Silochrom (US-PS 4264738). Mit ihrer Hilfe kann bereits nach einmaligem Durchlaufen des Kulturfiltrates ein fast kohlenhydrat- und fremdproteinfreies Enzym gewonnen werden, das bis zu 6fach konzentriert vorliegt. Mit diesem Enzym lassen sich pro Volumeneinheit höher konzentrierte Reaktanden bei kürzerer Reaktionsdauer mit gleicher und besserer Ausbeute umsetzen.The effectiveness of the synthesis process is understandably higher when purified enzyme is used, because besides the reaction rate, the concentration of reactants per unit volume can also be substantially increased. A very effective purification method for the B. cereus ZIMET10700 metalloprotease is bacitracin-silochrome affinity chromatography (US Pat. No. 4,264,738). With their help, even after a single pass through the culture filtrate an almost carbohydrate and foreign protein-free enzyme can be obtained, which is concentrated up to 6 times. With this enzyme can be reacted per volume unit higher concentrated reactants with a shorter reaction time with the same and better yield.

Ausführungsbeispieleembodiments Beispiel 1example 1

74mg Z-AIa-AIa und 62 mg Leu-p-Nitroanilid wurden in 250μΙ Dimethylformamid gelöst und mit 500μΙ 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat gemischt. Nach Temperierung auf 35°C wurden 180μΙ Kulturfiltrat aus Bacillus cereus ZIMET10700, das etwa 140/ig Enzym enthielt, zugegeben. Die Konzentration der Substrate betrug danach jeweils 200μΜοΙ und nach 25 Stunden rühren bei 35°C wurden 51 % Produkt erhalten. Die qualitative Bestimmung des Endproduktes erfolgte durch DC auf Kieselgelplatten im System n-Butanol:Pyridin:Essigsäure:Wasser=10:15:3:12 und die Detektion im UV-Licht, nach Ninhydrinbehandlung und durch KJ nach Chlorierung. Des weiteren wurde die HPLC zur qualitativen und quantitativen Ermittlung des Endproduktes verwendet. Die Detektion erfolgte beim Absorptionsmaximum von p-Nitroanilin (315nm) anch Trennung von Substrat und Produkt an einer Ci₈-SaUIe im Acetonitrilgradienten.74 mg of Z-Ala-Ala and 62 mg of Leu-p-nitroanilide were dissolved in 250 μM dimethylformamide and mixed with 500 μM 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, with 1 mM Ca acetate. After temperature control to 35 ° C 180μΙ culture filtrate from Bacillus cereus ZIMET10700, containing about 140 / ig enzyme added. The concentration of the substrates was then 200μΜοΙ and after stirring for 25 hours at 35 ° C 51% product were obtained. The qualitative determination of the end product was carried out by TLC on silica gel plates in the system n-butanol: pyridine: acetic acid: water = 10: 15: 3: 12 and the detection in UV light, after ninhydrin treatment and by KJ after chlorination. Furthermore, the HPLC was used for the qualitative and quantitative determination of the final product. The detection was carried out at the absorption maximum of p-nitroaniline (315 nm) and separation of substrate and product on a Ci ₈ -SaUIe in Acetonitrilgradienten.

Zusätzlich wurde die Ausbeute an Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid gravimetrisch nach mehrfachem Waschen mit NaHCO₃ und Wasser bestimmt.In addition, the yield of Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide was determined gravimetrically after multiple washes with NaHCO ₃ and water.

Beispiel 2Example 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird wiederholt, wobei jedoch 74mg Z-AIa-AIa und 62mg Leu-p-Nitroanilid 250μΙ Dimethylformamid gelöst und Γηίί300μΙ 5OmM Tris-HCI,pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat gemischt werden. Das Gesamtvolumen beträgt 900μΙ und die Konzentration der Substrate jeweils 250μΜοΙ. Nach Temperierung werden 10μg eines durch Affinitätschromatographie gereinigten Enzymsaus B.cereus ZIMET 10700 zugegeben und 18 Stunden bei 35°C gerührt. Die Ausbeute an Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitroanilid betrug 72%.The procedure of Example 1 is repeated except that 74 mg of Z-Ala-Ala and 62 mg of leu-p-nitroanilide 250 .mu.l dimethylformamide are dissolved and .mu.:300 .mu.m 5OmM Tris-HCl, pH 7.5, mixed with 1 mM Ca acetate. The total volume is 900μΙ and the concentration of the substrates 250μΜοΙ. After tempering, 10 μg of an enzyme purified from affinity chromatography from B. cereus ZIMET 10700 are added and the mixture is stirred at 35 ° C. for 18 hours. The yield of Z-Ala-Ala-Leu-p-nitroanilide was 72%.

Beispiel 3Example 3

24,4mgZ-Aspwerdenin30μl6N NaOH und 42,2mg PheOMe-HCI ίη200μΙ Dimethylformamid gelöst und ηηΗ:300μΙ 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat gemischt. Nach Temperierung auf 35°C wurden 100μΙ Kulturfiltrat, das etwa 110μg Enzym enthielt, zugegeben. Die Ausbeute betrug nach 24stündigem Rühren 38%. Die qualitative und quantitative Bestimmung des Z-Aspartams erfolgte wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß die Detektion des mittels HPLC getrennen Produktes bei 220 nm durchgeführt wurde.24.4 mg Z-Asp in 30 μL of 6N NaOH and 42.2 mg of PheOMe-HCl ίη200μΙ dimethylformamide dissolved and ηηΗ: 300μΙ 5OmM Tris-HCl, pH 7.5, mixed with 1 mM Ca-acetate. After tempering to 35 ° C., 100 μl of culture filtrate containing about 110 μg of enzyme were added. The yield was 38% after stirring for 24 hours. The qualitative and quantitative determination of the Z-aspartame was carried out as in Example 1 with the difference that the detection of the product separated by means of HPLC was carried out at 220 nm.

Beispiel 4Example 4

Das Verfahren des Beispiels 3 wird wiederholt, wobei jedoch 122 mg Z-Asp in 160μΙ 6 N NaOH und 211 mg PheOMe-HCI in 800μΙ 5OmMTHs-HCI, pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat gelöst werden. Nach Temperierung auf 35°C wurde 1 mg affinitätschromatographisch gereinigtes Enzym in 100μΙ 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, mit 1 mM Ca-Azetat zugegeben. Nach 24 Stunden Rühren konnten 54% Ausbeute an Z-Aspartam erzielt werden.The procedure of Example 3 is repeated except that 122 mg of Z-Asp in 160 μM of 6N NaOH and 211 mg of PheOMe HCl are dissolved in 800 μM 5OmMTHs-HCl, pH 7.5, with 1 mM Ca acetate. After tempering to 35 ° C., 1 mg of enzyme purified by affinity chromatography in 100 μl of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, with 1 mM Ca acetate was added. After stirring for 24 hours, 54% yield of Z-aspartame could be achieved.

Beispiel 5Example 5

Das Verfahren des Beispiels 4 wird wiederholt, wobei jedoch die vierfache Menge der Reaktanden in 2,5 ml 50 mMTris-HCI-Puffer, pH 7,0, mit 1,OmM Ca-Azetat gelöst werden. Nach Temperierung auf 35⁰C werden 3 mg affinitätschromatographisch gereinigtes Enzym zugefügt. Nach 5 h Rühren wird derfeste Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand erneut inkubiert. Nach weiteren 5 h wird der neu entstandene Niederschlag zentrifugiert und quantitativ Z-Aspartam bestimmt. Die Gesamtausbeute beträgt 85%.The procedure of Example 4 is repeated except that four times the amount of the reactants are dissolved in 2.5 ml of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, with 1, OmM Ca acetate. After tempering to 35 ⁰ C 3 mg affinity chromatography purified enzyme are added. After stirring for 5 h, the solid precipitate is removed by centrifugation and the supernatant is re-incubated. After a further 5 h, the newly formed precipitate is centrifuged and quantitated Z-aspartame. The total yield is 85%.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung der Peptide Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitranilid oder Z-Asp-Phe-OMe durch Verknüpfen von Z-AIa-AIa mit Leu-p-Nitranilid bzw. Z-L-Asp mit L-Phe-OMe-HCl mit Metalloprotease, dadurch gekennzeichnet, daß die Metalloprotease von Bacillus cereus ZIMET 10700 verwendet wird.1. A Process for the Preparation of the Peptides Z-Ala-Ala-Leu-p-Nitranilide or Z-Asp-Phe-OMe by Linking Z-Ala-Ala with Leu-p-Nitranilide or ZL-Asp with L-Phe- OMe-HCl with metalloprotease, characterized in that the metalloprotease of Bacillus cereus ZIMET 10700 is used. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Metalloprotease als Bestandteil des Kulturfiltrates oder nach affinitätschromatographischer Reinigung, bevorzugt mit Bacitracin-Silochrom, eingesetzt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the metalloprotease is used as a constituent of the culture filtrate or after affinity chromatographic purification, preferably with bacitracin-silochrome.