DD249712B1 - PROCESS FOR PREPARING LIPASE - Google Patents

Abstract

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren anzugeben, das ein Enzym hoher spezifischer Aktivität und Anreicherung liefert. Die Aufgabe wird darin gesehen, durch Züchtung eines Bakterienstammes auf einem bisher nicht verwendeten Kultursubstrat das gewünschte Enzym herzustellen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, den Stamm Acinetobacter calcoaceticus auf wasseriöslichen Fettsäureestern als einziger C-Queile zu züchten, bei deren Abbau Fettsäuren entstehen.The object of the invention is to provide a method which provides an enzyme of high specific activity and enrichment. The object is seen to produce the desired enzyme by culturing a bacterial strain on a previously unused culture substrate. The essence of the invention is to breed the strain Acinetobacter calcoaceticus on water-soluble fatty acid esters as the only C-Queile, in whose degradation fatty acids are formed.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lipase, die in der Praxis zur Hydrolyse von Fettsäureestern verwendet werden kann.The invention relates to a process for the preparation of lipase which can be used in practice for the hydrolysis of fatty acid esters.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Es ist bereits bekannt, Lipase herzustellen. Zu diesem Zweck werden verschiedene Bakterien- und Hefestämme bzw. Pilze auf komplexen Medien (u.a. Bouillon, Molke, Maisquellwasser) kultiviert, die Bakterien durch Zentrifugation separiert und die Kulturüberstände zur Lipasegewinnung aufbereitet (Literatur z, B. Lipases, ed. B. Borgström und H. Brockmann, Elsevier, Amsterdam, 1984; 0.Haferburg, H.P.Kleber, Acta Blotechnol. 2,1982,4, S.337-342; dies., a.a.O.,3,1983,2, S. 185-186). Zur Lipasegewinnung eingesetzte Stämme sind z. B. solche der Gattung Rhizopus (Rh. spec.), Candida (C. cylindrical, Pseudomonas, Mucor, Aspergillus, Acinetobacter u. a. Die dargestellten Verfahren haben den Nachteil, daß durch Züchtung auf komplexen Medien die Lipase stark verunreinigt ist und zu ihrer Isolierung mehrere aufwendige Reinigungsstufen notwendig sind.It is already known to produce lipase. For this purpose, various bacterial and yeast strains or fungi on complex media (including bouillon, whey, corn steep liquor) are cultured, the bacteria separated by centrifugation and the culture supernatants for lipase production prepared (Literature z, B. Lipases, ed. B. Borgström and H. Brockmann, Elsevier, Amsterdam, 1984; 0 .Herbburg, HP Kleber, Acta Blotechnol. 2,1982,4, p.337-342; this, supra, 3,1983,2, pp. 185-186). Strains used for lipase production are e.g. Those of the genus Rhizopus (Rh. Spec.), Candida (C. cylindrical, Pseudomonas, Mucor, Aspergillus, Acinetobacter and others. The presented methods have the disadvantage that by culturing on complex media, the lipase is heavily contaminated and several to their isolation elaborate purification steps are necessary.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Enzymproduktion anzugeben, das es gestattet, ein Enzym mit wesentlich höherer Reinheit und spezifischer Aktivität zu gewinnen und so die Isolierung aus dem Kulturüberstand zu vereinfachen.The invention aims to provide a process for enzyme production which allows to obtain an enzyme of substantially higher purity and specific activity and thus to facilitate the isolation from the culture supernatant.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Erfindung hat die Aufgabe, wesentliche bekannte Merkmale der bisherigen Verfahrensweise zu verändern und durch den Einsatz eines bisher kommerziell nicht verwendeten Stammes sowie spezieller Kultivierungssubstrate das gewünschte Enzym mit hoher spezifischer Aktivität zur Verfügung zu stellen.The object of the invention is to modify essential known features of the previous procedure and to provide the desired enzyme with high specific activity by using a hitherto commercially unused strain and special cultivation substrates.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß das Enzym Lipase aus dem Stamm Acinetobacter calcoaceticus hergestellt wird. Die Stammhaltung geschieht bevorzugt auf 3%igem Bouillon-Agar bei 4°C im Dunklen.The object is achieved in that the enzyme lipase from the strain Acinetobacter calcoaceticus is produced. The stock is preferably on 3% bouillon agar at 4 ° C in the dark.

Die Kultivierung von Acinetobacter calcoaceticus erfolgt nach Beimpfen bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C, vorzugsweise bei 3O⁰C, in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium. Die Züchtung wird erfindungsgemäß auf wasserlöslichen Fettsäureestern als einziger C-Quelle durchgeführt, bei deren Abbau Fettsäuren gebildet werden. Solche C-Quellen sind z. B. Polyoxyethylen-sorbitan-laurat, -plamitat oder -oleat u.a. Als N-Quelle wird NH₄CI, (NH₄I₂ SO₄ o.dgl. verwendet. Nach einer Wachstumszeit von 5 bis 40 Stunden —je nach physiologischem Zustand und Menge des Impfmaterials—werden die Bakterien z.B. durch Zentrifugation separiert und der zellfreie Kulturüberstand gewonnen. Das im zellfreien Kulturüberstand bei erfindungsgemäßer Züchtung erhaltene Enzym ist im Gegensatz zu Kultivierungen auf komplexen Medien nur gering mit Fremdstoffen verunreinigt und besitzt eine hohe spezifische Aktivität (Tabelle 1).The cultivation of Acinetobacter calcoaceticus takes place after seeding at a temperature of 20 to 40 ° C, preferably at 3O ⁰ C, in submerged culture in a liquid minimal medium. The cultivation is carried out according to the invention on water-soluble fatty acid esters as the sole C source, in the degradation fatty acids are formed. Such C sources are z. B. Polyoxyethylene sorbitan laurate, -plamitat or oleate, inter alia, as the N-source NH ₄ Cl, (NH ₄ I ₂ SO ₄ or the like.) After a growth time of 5 to 40 hours - depending on the physiological state and The amount of seed material is separated by centrifugation and the cell-free culture supernatant obtained The enzyme obtained in the cell-free culture supernatant in cultivation according to the invention is in contrast to cultivations on complex media contaminated only slightly with foreign substances and has a high specific activity (Table 1).

Die Isolierung des Enzyms aus dem Kulturüberstand erfolgt an einem hydrophoben Trägermaterial, wie z.B. Octyl-Sepharose, wie folgt: Der gewonnene zellfreie Kutturüberstand wird bei 4°C mit kristallinem NaCI zu einer Konzentration von 1 mmol/l versetzt. Die Lösung wird auf eine mit Octyl-Sepharose gefüllte Glassäule gegeben. Die Lipase adsorbiert dabei an dem hydrophoben Träger. Fremdproteine werden nur gering gebunden. Nacheinander wird die Säule mit 1 mol/l NaCI in Phosphatpuffer (50mmol/l, pH7,5) und 50mmol/l Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen. Die Lipase wird durch eine 0,5%ige Lösung von Triton X-100 in 50 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,5, von der Octyl-Sepharose abgelöst 60% der ursprünglichen Lipase werden dabei 1Ofach angereichert gefunden. Das so erhaltene Lipasepräparat ist diskelektrophoretisch rein. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.The isolation of the enzyme from the culture supernatant is carried out on a hydrophobic support material, e.g. Octyl-Sepharose, as follows: The obtained cell-free Kuttur supernatant is added at 4 ° C with crystalline NaCl to a concentration of 1 mmol / l. The solution is placed on a glass column filled with octyl-Sepharose. The lipase adsorbs to the hydrophobic carrier. Foreign proteins are bound only slightly. Successively, the column is washed with 1 mol / l NaCl in phosphate buffer (50 mmol / l, pH 7.5) and 50 mmol / l phosphate buffer (pH 7.5). The lipase is replaced by a 0.5% solution of Triton X-100 in 50 mmol / l phosphate buffer, pH 7.5, of the Octyl-Sepharose. 60% of the original lipase are found doubly enriched. The lipase preparation thus obtained is diskelectrophoretically pure. The invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment.

Ausführungsbeispielembodiment

Acinetobacter calcoaceticus (69 V) wird bei 30⁰C in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium gezüchtet. Das Medium enthält pro Liter: 6,97K₂HPO₄,1,5g NaH₂PO₄,0,2g MgSO₄ · 7H₂0,7,5mg FeSO₄ 7H₂0,0,75mg MnSO₄ · 4H₂0,0,75mg ZnSO₄ · 7H₂0,0,15mg CuSO₄ · 5H₂0,0,15mg CoCI₂ · 6H₂O und 0,15mg Borsäure.Acinetobacter calcoaceticus (69 V) is grown at 30 ⁰ C in submerged culture in a liquid minimal medium. The medium contains per liter: 6.97K ₂ HPO ₄ , 1.5g NaH ₂ PO ₄ , 0.2g MgSO ₄ .7H ₂ 0.7.5mg FeSO ₄ 7H ₂ 0.075mg MnSO ₄ .4H ₂ 0, 0.75 mg of ZnSO ₄ .7H ₂ .0.15 mg of CuSO ₄ .5H ₂ .0.15 mg of CoCl ₂ .6H ₂ O and 0.15 mg of boric acid.

Ats Impfsuspension dient eine Abschwemmung von Bouillon-Agar. Als C-Quelle wird Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat in einer Konzentration von ЮтІ/І als einziger Kohlenstoffquelle und NH₄CI (3g/l) als N-Ouelle verwendet. Nach einer Wachstumszeit von 12h werden die Bakterien durch Zentrifugation (2000 χ g, 20 min) separiert und der zellfreie Kulturüberstand gewonnen. Zu diesem Kulturüberstand wird NaCI zu einer Konzentration von 1 mol/l zugegeben und die Lösung bei 4 "C auf eine Octyl-Sepharose-Säule aufgetragen. Die Lipaseaktivität verbleibt am Trägermaterial. Nacheinander wird der Träger mit 1 mol/l Natriumchloridlösung (in 50mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,5) und Phosphatpuffer, pH 7,5 gewaschen, bis kein Protein im Eluat nachweisbar ist. Das Enzym wird anschließend mit Triton X-100 (5g/l in 50mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,5) vom Träger gelöst. Das gewonnene Enzym ist diskelektrophoretisch rein. Die Isolierung der Lipase ist in Tabelle 2 dargestellt.Ats vaccine suspension is a flush of bouillon agar. The C source used is polyoxyethylene sorbitan monooleate in a concentration of ЮTІ / І as sole carbon source and NH ₄ Cl (3 g / l) as N source. After a growth time of 12 h, the bacteria are separated by centrifugation (2000 g, 20 min) and the cell-free culture supernatant is recovered. NaCl is added to this culture supernatant to a concentration of 1 mol / l and the solution is applied to an octyl-Sepharose column at 4 ° C. The lipase activity remains on the carrier material. l phosphate buffer, pH 7.5) and phosphate buffer, pH 7.5 until no protein is detectable in the eluate The enzyme is then treated with Triton X-100 (5 g / l in 50 mmol / l phosphate buffer, pH 7.5) from The enzyme obtained is tablet-electrophoretically pure The isolation of the lipase is shown in Table 2.

Tabelle 1Table 1

Volumenaktivität, Proteinkonzentration und spezifische Aktivität der Lipase im Kulturüberstand von Acinetobacter calcoaceticus nach Wachstum auf verschiedenen KultursubstratenVolume activity, protein concentration and specific activity of the lipase in the culture supernatant of Acinetobacter calcoaceticus after growth on different culture substrates

spezifische Aktivitätspecific activity

(цтоі/тіп/тд Protein) _(цтоі / тіп / тд protein) _

26 24 7826 24 78

KultursubstratCulture substrate Volumenaktivitätvolume activity Proteinprotein (pmol/min/ml)(Pmol / min / ml) (mg/ml)(Mg / ml) Bouillonbouillon 0,30.3 9,59.5 Polyoxy ethylen-sorbitan-Polyoxyethylene sorbitan monolauratmonolaurate 6,56.5 0,250.25 Polyoxyethylen-sorbitan-Polyoxyethylene sorbitan monopalmitatmonopalmitate β,οβ, ο 0,250.25 Polyoxyethylen-sorbitan-Polyoxyethylene sorbitan monooleatmonooleate 26,626.6 0,340.34

Tabelle 2Table 2

Reinigung der Lipase (Kultursubstrat: Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat) von Acinetobacter calcoaceticusPurification of the lipase (growing medium: polyoxyethylene sorbitan monooleate) of Acinetobacter calcoaceticus

Reinig.-stufeReinig.-stage Volumen (ml)Volume (ml) Protein (mg/ml)Protein (mg / ml) Gesamtakt, (цтоі/тіп)Total act, (цтоі / тіп) spez. Aktivität (цтоі/тіп/тд Protein)spec. Activity (цтоі / тіп / тд protein) Reinig, (-fach)Clean, (-fold) Ausbeute (%)Yield (%) Kulturüberstand Triton X-100 FraktionCulture supernatant Triton X-100 fraction 190 30190 30 0,34 0,130.34 0.13 5054 30405054 3040 78,2 779,278.2 779.2 9,969.96 6060

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von Lipase durch Züchten des Stammes Acinetobacter calcoaceticus, dadurch gekennzeichnet, daß als einzige C-Quelle wasserlösliche Fettsäureester eingesetzt werden.1. A process for the preparation of lipase by culturing the strain Acinetobacter calcoaceticus, characterized in that water-soluble fatty acid esters are used as the sole C source. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium kultiviert wird, nach einer Wachstumszeit von 5 bis 40 Stunden die Bakterien separiert werden und das Enzym aus dem Kulturüberstand abetrennt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that is cultivated at temperatures of 20 to 40 ⁰ C in submerged culture in a liquid minimal medium, after a growth time of 5 to 40 hours, the bacteria are separated and the enzyme is separated from the culture supernatant. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliche Fettsäureester Polyqxyethylensorbitanmonooleat, -laurat -pal mi at, -öleat od. dgl. verwendet werden.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the water-soluble fatty acid esters Polyqxyethylensorbitanmonooleat, laurate-pal mi at, -öleat od. Like. Be used. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem zellfreien Kulturüberstand durch Chromatographie an einem hydrophoben Träger wie z. B. Octylsepharose eine Isolierung des Enzyms bis zur diskelektrophoretischen Reinheit erfolgt.4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that from the cell-free culture supernatant by chromatography on a hydrophobic support such. B. Octylsepharose an isolation of the enzyme takes place up to the disk electrophoretic purity.