DD248141A1 - Verfahren zur herstellung von proteasehaltigen enzymkonzentraten - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur Herstellung proteasehaltiger Enzymkonzentrate hat die Aufgabe, aus Kulturfiltraten von Sekundaermetabolitfermentationenvon Streptomyceten als Nebenprodukt proteasehaltige Enzymkonzentrate zu gewinnen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemaess dadurch geloest, dass die proteasehaltigen Enzymkonzentrate bei 10%- bis 15%iger Neutralsalzkonzentration unter neutralen p H-Bedingungen und Temperaturen unter 37C an Kieselgel adsorbiert und mechanisch vom Kulturfiltrat abgetrennt werden. Das proteasehaltige Enzymkonzentrat wird anschliessend mit Puffern schwach alkalischer p H-Werte und niedriger Ionenstaerken in Gegenwart von wassermischbaren organischen Loesungsmitteln eluiert, mit Neutralsalz gefaellt und nach bekannten Methoden weiter gereinigt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von pröteasehaltigen Enzymkonzentraten aus

Sekündärmetabolitfermentationen. Proteasen finden vielfältige Anwendung in verschiedenen Industriezweigen, beispielsweise der Nahrungsmittelindustrie, insbesondere in der Milchwirtschaft, der fleischverarbeitenden Industrie und bei der .

Bäckwarenherstellung. Weiterhin werden Proteasen im breiten Umfang für mikrobiologische und biochemische Untersuchungen eingesetzt. Die Erfindung erweitert das Spektrum der einsetzbaren eiweißabbauenden Enzyme.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die bekannten Konzentrierungsmethoden für Proteasen aus Kulturfiltratüberständen von Sekundärmetabolitfermentationen benutzen zumeist die Ultrafiltration (Rassulin,Yu.A., Sokovykh,V.S„ Prikl. Biochim. Mikrobiol. 17,1981,238-240; Ranke et al., Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 11,1981,136-171), die Vakuumeinengung (Belloc, A., J.C. PaIIa, Verrier, Ann. Technol

Agric. 23,1974,205-215) oder die Fällung mit Neutralsalzen oder organischen Lösungsmitteln (Microbiol. Enzymesand Bioeonversions, ed. Rose, Academic press, 1980, S.49-114). Das DD 121 522 beansprucht ein Verfahren zur Konzentrierung und Reinigung von Enzymen aus Streptokokkenkulturfiltratlösungen, das auf einer Adsorption an Magnesiumsilikat beruht. Für die Gewinnung von Proteasekonzentraten aus KuIturfi!traten des Streptomyces hygroscopicus wird in dem Patent US 3875006 die Reinigung einer neutralen Protease beschrieben, wobei die Methode eine Konzentrierung durch Vakuumeinengung und eine Reinigung durch Aceton- und Isopropanolfällung einschließt. Diese herkömmlichen Konzentrierungsverfahren sind sehr energieaufwendig oder wie die Fällungsmethoden technisch nurfür begrenzte Mengen einsetzbar. Darüber hinaus ermöglichen sienicht die gleichzeitige Gewinnung des Antibiotikums. Das in DD 121 522 beanspruchte Adsorptionsverfahren mit Magnesiumsilikat ermöglicht bei Sekundärmetabolitfermentationen nur die Adsorption geringer Proteasemengen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet als Ziel die Herstellung proteasehaltiger Enzymkonzentrate bei hoher Effektivität.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung iiegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dem auf einfache Weise proteasehaltige Ehzymkonzentrate als Nebenprodukt technischer Sekundärmetabolitfermentationen von Streptomyceten gewonnen werden können.

Eswurde in überraschender Weise gefunden, daß aus Ku Itu rf i !traten von Sekundärmetabolitfermentationen von Streptomyceten proteasehaltige Enzyme, die nach den bekannten Verfahren unter sauren wie auch bei neutralen Bedingungen entweder nur in sehr geringen Mengen oder irreversibel an feste Träger gebunden werden, zu 60% bis 80% der im Kulturfiltrat vorhandenen Enzymmenge an Kieselgel adsorbiert werden, wenn Kieselgel mit einem mittleren Porendurchmesser von 5-TDO nm, vorzugsweise ein solches mit einem mittleren Porendurchmesser von 8 nm bis 12 nm im pH-Bereich von pH 7,0 bis pH 8,0 bei Zugabe von Neutralsalz in einer Konzentration von 0,1 kg/L bis 0,15 kg/L zum Kulturfiltrat bei einer Temperatur unter 37 ⁰C zur Adsorption eingesetzt wird. Von dem mechanisch abgetrennten Adsorbat wird das proteasehaltige Enzymkonzentrat mit Puffern sehr niedriger lonenstärke (vorzugsweise Phosphat- oder Hydrogencarbonatpuffer) bei schwach alkalischen pH-Werten eluiert. Das so erhaltene Rohprodukt wird mit Neutralsalz, vorzugsweise Ammoniumsulfat, gefällt und mit an sich bekannten

Methoden, wie Phosphatfällung, DEAE-Cellulose Extraktion und Molekulargewichtschromatografie, weiter gereinigt.

Das Verfahren ist durch folgende Vorteile gekennzeichnet. Es ermöglicht bei hoher Enzymausbeute eine Enzymkonzentrierung, die im Vergleich zur Einengung mit Vakuum und/oder Ultrafiltration einen geringen Aufwand an Energie und Apparaturen erfordert.

Das Verfahren beeinträchtigt nicht die Gewinnung des Antibiotikums aus der Sekundärmetabolitfermentation.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

In 20 Liter einer separierten 120-stündigen Fermentation von Streptomyceshygroskopicus Stamm JA 5999-//R 27-158 in einem Medium, das Sojamehl, Glukose, Stärke und Salze enthält, werden 140g Dinatriumhydrogenphosphat eingerührt und der pH-Wert der Lösung mit 1 N Natronlauge konstant auf pH 7,2 gehalten. Zur Entfernung des dabei ausfallenden Calciumphosphates wird die Kulturfiltratlösung nochmals separiert. Anschließend werden zur Erhöhung der lonenstärke 2,4kg Neutralsalz, vorzugsweise Natriumchlorid, gelöst, wobei der pH-Wert bei 7,2 konstant gehalten wird. Zur Adsorption der Proteasen werden 1,4kg poröses Kieselgel mit einer Porengröße von 8nm bis 12nm zugegeben und eine Stunde gerührt. Danach wird das Kieselgel abzentriefugiert und über einen Filtertrocken gesaugt. Mit drei Litern 0,005 M Phosphatpuffer, pH 7,2, der 300ml Äthanol enthält, wird das proteasehaltige Enzymkonzentrat vom Kieselgel extrahiert. Man erhält etwa 60% bis 75% der proteolytischen Gesamtaktivität. Die drei Liter Rohenzymlösung werden durch Zusatz von 1,5kg Ammoniumsulfat gefällt. Die weitere Reinigung des proteasehaltigen Enzymkonzentrates erfolgt nach den an sich bekannten Methoden der Phosphatfällung, DEAE-Celluloseextraktion und der Molekulargewichtschromatografie.

Beispiel 2:

Gemäß Beispiel 1 wird eine Kulturlösung, die nach 140 Stunden Fermentation des Streptomyces noursei Stamm JA 3890b erhalten worden ist, aufgearbeitet. Im proteasehaltigen Enzymkonzentrat werden dabei 60% bis 80% der proteolytischen Gesamtaktivität erhalten.

Beispiel 3:

In diesem Beispiel wird ein spezielles Kulturfiltrat für das angegebene Herstellungsverfahren vorbereitet.

In 20 Liter eines separierten Kulturfiltrates aus 120-200 Stünden alten Streptomycin-Fermentationen mit Streptomyces griseus, die Sojaextraktionsschrot, Glucose und anorganische Salze als Substrate verwendeten, werden 140g Dinatriumhydrogenphosphat eingerührt und danach unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf pH 7,2 200g CaCI₂ χ 6H₂O eingerührt. Das ausfallende Calciumphosphat wird separiert. Zur Entfernung von färbenden Substanzen werden in das separierte Filtrat 200g Bentonit (Tonmineral) eingerührt und nach 30 Minuten Rühren der Feststoffanteil durch erneute Separation entfernt. Anschließend werden dem Filtrat zur Erhöhung der lonenstärke 2,4kg NaCI zugesetzttZurjAdsorption der Proteasen werden in die so behandelte Kulturfiltratlösung 1,6-2kg poröses Kieselgel mit einer Porengröße von 8-12 nm eingerührt. Nach 20 Minuten Rühren wird das Kieselgel abzentrifugiert und mit4L0,05M CaCI₂-Lösung pH 6,0 gewaschen. Zur Desorption der Proteasen wird das Kieselgel Adsorbat in 3-4 Liter 0,05 M Glycin-Puffer, pH 9,0, der 0,05M CaCI enthält, eingerührt und der pH-Wert mit Natronlauge auf pH 9,0 korrigiert. Nach 10 Minuten Rühren wird das Kieselgel abzentrifugiert und anschließend trockengesaugt. Die erhaltenen 3-4L Rohenzymlösung werden dann zur Fällung der Proteasen mit 1,5-2kg Ammoniumsulfat versetzt. Es werden etwa 40-50% der mit Ammoniumsulfat fällbaren proteolytischen Aktivität der Kulturfiltratlösung gewonnen. Die weitere Reinigung erfolgt nach einem speziellen Verfahren.

Beispiel 4:

Gemäß Beispiel 1 wird eine Kulturlösung, die nach beendeter Fermentation des Streptomyces rimousus erhalten wird, aufgearbeitet. Im proteasehaltigen Enzymkonzentrat werden dabei 40 bis 60% der proteolytischen Gesamtaktivität erhalten.

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch:

   λ) Verfahren zur Herstellung von pröteasehaltigen Enzymkonzentraten als Nebenprodukt von
   Sekundärmetabolitfermentationen mit Streptomyceten, gekennzeichnet dadurch, daß

   — nach Zugabe von Neutralsalz in Konzentrationen von 0,1 kg/L bis 0,15 kg/L poröses Kiesel gel mit einem mittleren Porendurchmesser von 5nm bis iOOnm bei pH-Werten im Bereich von pH7,0
   bis pH 8,0 sowie bei Temperaturen unter 37°C zum Kulturfiltrat zwecks Adsorption zugesetzt
   wird,

   — sodann das Adsorbat mechanisch vom Filtrat abgetrennt wird und das proteasehaltige
   Enzymkonzentrat mit Puffern sehr niedriger lonenstärke bei schwach alkalischen pH-Werten
   eluiertwird und

   — schließlich das so erhaltene Rohprodukt mit Neutralsalz gefällt und mit an sich bekannten
   Methoden weiter gereinigt wird.

   21 Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnetdadurch,daß

   — zur Adsorption poröses Kieselgel mit einem mittleren Porendurchmesser von 8nm bis 12nm

   — zur Elution Phosphatpuffer

   — zur Fällung Ammoniumsulfat
   eingesetzt wird.