DD245676A5 - Method for identifying a test sample of genomic DNA - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Testprobe genomischer DNA, wobei die Existenz von DNA-Regionen mit Hypervariabilitaet ausgenutzt wird, die sonst Minisatellitenregionen genannt werden. Es wurde gefunden, dass viele derartige Regionen gleichzeitig in einer solchen Weise sondiert werden koennen, dass diese Variabilitaet unter Verwendung einer DNA- oder anderen Polynucleotidsonde nachgewiesen wird, deren wichtigster Bestandteil eine kurze Kernsequenz ist, die tandemartig mindestens dreimal und vorzugsweise mindestens zehnmal wiederholt wird. Durch die Sondierung werden Differenzen in der Genom-DNA an mehreren stark-polymorphen Minisatellitenregionen aufgedeckt, so dass ein individuumspezifisches DNA-"Erkennungszeichen" ("finderprint") erzeugt wird, das von allgemeinem Nutzen fuer genetische Identifizierungszwecke ist.The invention relates to a method of identifying a test sample of genomic DNA exploiting the existence of hypervariability DNA regions otherwise called minisatellite regions. It has been found that many such regions can be probed simultaneously in such a manner that this variability is detected using a DNA or other polynucleotide probe whose most important component is a short core sequence which is repeated in tandem at least three times and preferably at least ten times. The probing uncovers differences in genomic DNA at several highly polymorphic minisatellite regions to produce an individual-specific DNA "finderprint" that is of general use for genetic identification purposes.
Description
Kern GGAGGTGGGCAGGAgGCore GGAGGTGGGCAGGAgG
33,6 (a)aGGGCtGGAGG33.6 (a) aGGGCtGGAGG
33,15 aGAGGTGGGCAGGtGG33.15 aGAGGTGGGCAGGtGG
33,5g GGAGGTGGGCAGGAGG33.5g GGAGGTGGGCAGGAGG
M13KernB GTGGGCAGGAAGM13KernB GTGGGCAGGAAG
M13KernC TGGGCAGM13KernC TGGGCAG
M13KernD GGTGGGCAGGtGG worin T = T oder U ist.M13KernD GGTGGGCAGGtGG where T = T or U.
Hierzu 21 Seiten ZeichnungenFor this 21 pages drawings
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Testprobe genomischer DNA durch Bezugnahme auf einen oder mehrere Standards.The invention relates to a method for identifying a test sample of genomic DNA by reference to one or more standards.
Das bisher wichtigste Verfahren zur Identifizierung genetischer Veränderungen im Genom-DNA besteht im Nachweis von Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs). Siehe beispielsweise die Identifizierung der Stelle des für Huntington-Chorea-Erkrankung verantwortlichen DNA-Defektes von J. F. Gusella, u.a., Nature 306,234-238 (1983) und die Analyse von Prädisposition für Retinoblastom von W.K.Cavanee, u.a.. Nature 305, 779-784 (19.83).To date, the most important method of identifying genetic alterations in genomic DNA has been the detection of restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). See, for example, the identification of the site of the DNA defect responsible for Huntington's chorea disease by JF Gusella, et al., Nature 306, 234-238 (1983) and the analysis of predisposition to retinoblastoma by WKCavanee, et al., Nature 305, 779-784 (1989). 19.83).
Die meisten RFLPs resultieren aus geringfügigen Veränderungen in der DNA, normalerweise Basen-Substitutionen, die spezielle Restriktions-Endonuclease-Spaltungsstellen schaffen oder zerstören. Da die durchschnittliche Heterozygotie von Human-DNA gering ist (annähernd 0,001 je Basenpaar), werden Restriktions-Endonucleasen selten einen RFLP an einer bestimmten Stelle nachweisen. Selbst wenn sie nachgewiesen werden, sind die meisten RFLPs nur dimorph (Vorhandensein und Fehlen einer Restriktions-Endonuclease-Spaltungsstelle) mit einer durch Allel-Frequenzen bestimmten Heterouygotie, die niemals 50% überschreiten kann und die gewöhnlich viel geringer ist. Infolgedessen werden alle derartigen RPLPs bei der Stammbaumanalyse uni0nformativ sein, wenn kritische Individuen homozygot sind.Most RFLPs result from minor changes in the DNA, usually base substitutions, that create or destroy particular restriction endonuclease cleavage sites. Since the average heterozygosity of human DNA is low (approximately 0.001 per base pair), restriction endonucleases will rarely detect an RFLP at a particular site. Even when detected, most RFLPs are dimorphic only (presence and absence of a restriction endonuclease cleavage site) with hetero-gayie specificity determined by allele frequencies, which can never exceed 50% and is usually much lower. As a result, all such RPLPs will be unformative in pedigree analysis when critical individuals are homozygous.
Eine genetische Analyse könnte durch zur Verfugung stehende Sonden für hypervariable Regionen der DNA, die multiallele Veränderung und entsprechend hohe Heterozygotie zeigen, beträchtlich vereinfacht werden. Die erste solche Region wurde von A. R.Wyman, u.a., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77, 6754-6758 (1980) zufällig aus einer Sammlung von wahllosen Segmenten von Human-DNA isoliert. Die strukturelle Basis für multiallele Veränderung an dieser Stelle ist noch nicht bekannt. Anschließend wurden, wieder durch Zufall, verschiedene andere stark variable Regionen nahe dem Human-Insulin-Gen (G. I. Bell, u.a., Nature 295,31-35 [1982]),Zeta-Globin-Genen (N. J.Proudfoot, u.a., Cell31,553-563 [1982]) und S. E. Y.Goodbourn u.a., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80, 5022-5026 [1983]) und c-Ha-ras-1 Onkogen (D. J.Capon, u.a., Nature 302,33-37 [1983]) entdeckt. In jedem Fall besteht die variable Region aus Tandem-Wiederholungen von einer kurzen Sequenz (einem „Minisatelliten"), und Polymorphismus ist auf Allel-Differenzen in der Anzahl der Wiederholungen zurückzuführen, die vermutlich durch mitotischen oder meiotischen ungleichmäßigen Austausch oder durch DNA-Gleiten während der Replikation verursacht werden. Die resultierende Veränderung der Minisatellitenlänge kann unter Anwendung einer beliebigen Restriktions-Endonuclease nachgewiesen werden, welche die Wiederholeinheit nicht spaltet.Genetic analysis could be considerably simplified by having probes available for hypervariable regions of the DNA showing multiallele alteration and correspondingly high heterozygosity. The first such region was reported by A. R. Wyman, et al., Proc. Nat. Acad. Be. USA 77, 6754-6758 (1980) was randomly isolated from a collection of random segments of human DNA. The structural basis for multiallele change at this point is not yet known. Subsequently, again by chance, several other highly variable regions were found near the human insulin gene (GI Bell, et al., Nature 295, 31-35 [1982]), zeta-globin genes (NJ Proudfoot, et al., Cell 31, 533 -563 [1982]) and SEYGoodbourn et al., Proc. Nat. Acad. Be. USA 80, 5022-5026 [1983]) and c-Ha-ras-1 oncogene (D.J. Capon, et al., Nature 302, 33-37 [1983]). In each case, the variable region consists of tandem repeats of a short sequence (a "minisatellite"), and polymorphism is due to allelic differences in the number of repeats that are thought to be due to mitotic or meiotic non-uniform exchange or by DNA gliding during The resulting change in minisatellite length can be detected using any restriction endonuclease that does not cleave the repeating unit.
Der Erfinder und seine Kollegen haben kürzlich einen kurzen, aus vier Tandem-Wiederholungen einer 33-BP-Sequenz bestehenden Minisatelliten in einem Intron des Human-Myoglobin-Gens beschrieben, siehe P.Weiler, u.a., EMBOJ. 3,439—446 (1983). Es wurde beobachtet, daß die 33-BP-Wiederholung eine schwache Ähnlichkeit in der Sequenz mit den oben erwähnten anderen Human-Minisatelliten zeigte, die kürzlich charakterisiert wurden. In dem Artikel wird vermutet, daß die Minisatelliten-Regionen auf Transposition zurückzuführen sein können. Wenn die 33-BP-Wiederholung im Human-Myoglobin-Gen umstellbar wäre, dann könnte sie eine Sonde für sich wiederholende Tandem-Regionen des Human-Genoms darstellen, die häufig mit multiallelem Polymorphismus infolge Veränderung der Wiederholanzahl einhergehen.The inventor and his colleagues have recently described a short minisatellite consisting of four tandem repeats of a 33-BP sequence in an intron of the human myoglobin gene, see P.Weiler, et al., EMBOJ. 3,439-446 (1983). It was observed that the 33-BP repeat showed a weak similarity in sequence with the other human mini-satellites mentioned above that have been recently characterized. The article suggests that the minisatellite regions may be due to transposition. If the 33-BP repeat in the human myoglobin gene were convertible, then it could be a probe for repeating tandem regions of the human genome, often associated with multi-allelic polymorphism due to changes in the number of replicates.
Human-Genom-DNA wurde mit einer DNA-Sonde sondiert, die Tandem-Wiederholungen der 33-BP-Sequenz von dem Myoglobin-Gen enthielt. Polymorphe Veränderung wurde an mehreren unterschiedlichen Regionen in der Genom-DNA von 3 P.ersonen (Vater, Mutter und Tochter) beobachtet, wobei die Veränderung in der Größe der größeren Fragmente (2-6 KB) auftritt. Die Werte stimmten mit gleichbleibend vererbbarem Polymorphismus infolge Längenveränderungen von mehr als einer der Minisatellitenregionen überein.Human genomic DNA was probed with a DNA probe containing tandem repeats of the 33-BP sequence from the myoglobin gene. Polymorphic alteration was observed at several different regions in the genomic DNA of 3 P. persons (father, mother and daughter), the change occurring in the size of the larger fragments (2-6 KB). The values were consistent with consistent inheritable polymorphism due to changes in length of more than one of the minisatellite regions.
Weitere Forschungsarbeiten haben ergeben, daß es möglich ist, Genom-DNA in einer solchen Weise zu sondieren, daß die Variabilität in den Minisatelliten oder hypervariablen Regionen viel wirksamer dargestellt werden kann als durch Anwendung der Myoglobin-Gen-33-BP-Wiederholungs-Sonde.Further research has shown that it is possible to probe genomic DNA in such a way that the variability in the minisatellite or hypervariable regions can be more efficiently represented than by using the myoglobin gene 33 BP repeat probe.
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß viele Minisatelliten in Human- oder Tier-Genom-DNA eine Region von DNA enthalten, die einen hohen Grad an Homologie zwischen unterschiedlichen Minisatelliten besitzt. Diese gemeinsame Kernregion hat eine geringe Länge, annähernd 16 Basenpaare. Es wurde jetzt gefunden, daß eine Sonde, die als Hauptbestandteil eine kurze Kernsequenz von mindestens dreimal tandemartig wiederholten Nucleotiden aufweist, zum Nachweis vieler unterschiedlicher Minisatellitenregionen in der Genom-DNA und mit einem so hohen Genauigkeitsgrad, daß Individuen identifiziert oder durch Bezugnahme auf Veränderungen in ihrer DNA in diesen Regionen eindeutig ermittelt werden können, dienen kann. Ein solches ausgezeichnetes Ergebnis war vollkommen unerwartet, weil durch vorhergehende Forschungsarbeiten Sonden erzeugt wurden, die nur einzelne Minisatellitenregionen in Genom-DNA nachweisen konnten. Diese bisherigen Sonden führten zu einem besseren Grad der Differenzierung als durch RFLPs möglich ist, aber nicht zu einer Charakterisierung (fingerprint), die im wesentlichen einmalig für ein Individuum ist. Bemerkenswerterweise würde gefunden, daß die erfindungsgemäße Kernsonde DNA durch Bezugnahme auf mehr als eine Minisatellitenregion oder hypervariable Stelle differenzieren kann, und es ist diese Entdeckung, die der erfinderischen Leistung einen hohen Grad von Unwahrscheinlichkeit verleiht, wodurch diese zu einer Erfindung von grundlegender wissenschaftlicher Neuartigkeit und Bedeutung wird.The invention is based on the discovery that many minisatellites in human or animal genomic DNA contain a region of DNA that has a high degree of homology between different minisatellites. This common core region is short in length, approximately 16 base pairs. It has now been found that a probe having as its major component a short core sequence of at least three tandemly repeated nucleotides, for detecting many different minisatellite regions in the genomic DNA and with such a high degree of accuracy that identifies or refers to changes in their individuals DNA in these regions can be uniquely determined. Such an excellent result was completely unexpected because previous research had generated probes that could detect only single minisatellite regions in genomic DNA. These previous probes led to a better degree of differentiation than is possible by RFLPs, but not to a characterization (fingerprint) that is essentially unique to an individual. Remarkably, it would be found that the nuclear probe of the present invention can differentiate DNA by reference to more than one minisatellite region or hypervariable site, and it is this discovery which confers a high degree of improbability on the inventive performance, thereby making it an invention of fundamental scientific novelty and importance becomes.
Ist eine Kernsequenz bekannt, dann können DNA-Sonden erzeugt werden, die die Eigenschaft zur Hybridisierung mit Minisatellitenregionen von einer Vielzahl von Stellen in dem Genom besitzen. Allerdings reicht die bloße Erkennung oder Identifikation einer bestimmten Kernsequenz selbst nicht für die Herstellung einer einsatzfähigen Sonde aus. Es ist ebenfalls erforderlich, ein Polynucleotid zu erzeugen, das Tandem-Wiederholungen der Kernsequenz oder Derivate davon enthält. Solche Sonden können als Minisatelliten von Human-oder Tier-DNA isoliert werden, oder sie können auch durch synthetische Techniken hergestellt werden. Es müssen auch die zusätzlichen Einschränkungen festgelegt werden, die eine erfolgreiche Hybridisierung beeinträchtigen. Dazu gehören Kenntnisse über den möglicherweise tolerierbaren Grad der Homologie mit dem Konsensuskern und auch über die tolerierbare Länge jeder Nicht-Kem-DNA innerhalb der sich wiederholenden Einheit als Ganzes und ohne diese.If a core sequence is known, then DNA probes can be generated which have the property of hybridizing to minisatellite regions from a variety of sites in the genome. However, the mere detection or identification of a particular core sequence itself is not sufficient for the production of a deployable probe. It is also necessary to produce a polynucleotide containing tandem repeats of the core sequence or derivatives thereof. Such probes can be isolated as minisatellites from human or animal DNA, or they can also be prepared by synthetic techniques. It is also important to define the additional constraints that hinder successful hybridization. This includes knowledge of the possibly tolerable level of homology with the consensus kernel and also about the tolerable length of each non-Kem DNA within the repeating entity as a whole and without it.
Somit betrifft die Erfindung die Erkenntnis und Entdeckung, (1) daß Kenntnisse über eine beliebige Kernsequenz in dieser Weise genutzt werden können. Das umfaßt die weitere Einschätzung;Thus, the invention relates to the discovery and discovery that (1) knowledge about any core sequence can be used in this way. This includes the further assessment;
(2) daß durch die Untersuchung verschiedener hypervariabler Stellen in einem Genom unterschiedliche Kernsequenzen mit dem erforderlichen Grad an Konsensus gefunden werden können;(2) that different core sequences with the required degree of consensus can be found by examining different hypervariable sites in a genome;
(3) daß eine Familie von DNA-Sonden zusammengestellt werden kann, die unterschiedliche Spektren vom Polymorphismus erkennen können;(3) that a family of DNA probes can be assembled that can recognize different spectra from the polymorphism;
(4) daß eine bestimmte genetische Klassifizierung mit der einen Sonde erfolgreicher als mit einer anderen vorgenommen ' werden kann;(4) that a particular genetic classification can be made more successfully with one probe than with another;
(5) daß durch die Verwendung von mehr als einer Sonde bei einer beliebigen Klassifizierung die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung erhöht wird;(5) that by using more than one probe in any classification, the probability of identification is increased;
(6) daß durch eine weitere Untersuchung einer ersten Generation von erfolgreichen Sonden einfachere und erfolgreichere Sonden erzeugt werden können, z. B. durch Synthese.(6) that further investigation of a first generation of successful probes can yield simpler and more successful probes, e.g. B. by synthesis.
So betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Polynucleotide mit polymorphen Minisatelliten-längenspezifischen Bindungsmerkmalen, das umfaßt:Thus, in a first aspect, the invention relates to a process for the preparation of a polynucleotide having polymorphic minisatellite length-specific binding features comprising:
(I) Identifizierung einer natürlichen Tandem-Wiederholsequenz in DNA, die zu einer begrenzten Hybridisierung zu anderen polymorphen DNA-Regionen fähig ist,(I) identification of a natural tandem repeat sequence in DNA capable of limited hybridization to other polymorphic DNA regions
(II) Identifizierung einer natürlichen Konsensuskernsequenz der Wiederholsequenz, die wahrscheinlich für eine derartige Bindung verantwortlich ist, und(II) identification of a natural consensus nucleotide sequence of the repeat sequence likely responsible for such binding, and
(III) Isolierung oder künstlicher Aufbau einer vollständigen oder unvollständigen Tandemwiederholsequenz, abgeleitet von der natürlichen Konsensuskernsequenz mit Minisatelliten-Bindungseigenschaften, die eine geringere Genom-Stellen-Spezifität und höhere polymorphe Fragmentakzeptierung als die natürliche Wiederholsequenz aufweist.(III) Isolation or artificial construction of a complete or incomplete tandem repeat sequence derived from the natural consensus core sequence having minisatellite binding properties, which has lower genome site specificity and higher polymorphic fragment acceptance than the natural repeat sequence.
Die Kernkomponente der Sonde kann in unterschiedlicher, auf den gleichen zugrundeliegenden Prinzipien basierender Weise definiert werden. Das wichtigste zugrundeliegende Prinzip ist, daß die Wiederholsequenz der Sonde aus einer Nucleotidsequenz von einer gemeinsamen Kern region besteht oder diese enthalten soll, die Minisatelliten sowohl von Human- als auch Tiergenom-DNA besitzt. Die gemeinsame Kernregion ist „gemeinsam" in dem Sinne, daß sie einen hohen Grad an Konsensus, z. B. mindestens 80%, wie zwischen einem Minisatelliten und einem anderen wiedergibt. Diese Minisatelliten sind nachweisbar, z. B. durch Sondierung von Genom-DNA-Fragmenten mit der Myoglobin-Gen-33-BP-Wiederholsequenz, so daß hybridisierte Fragmente entstehen, die hier als „A33-positive" Fragmente bezeichnet werden. Diese Fragmente und die 33-BP-Wiederholung des Myoglobin-Gens enthalten eine Kernsequenz von annähernd 16 gemeinsamen BP. Die X33-positiven Fragmente können inrerseits als Sonden von Genom-DNA zur Erzeugung weiterer Fragmente verwendet werden, die ebenfalls die gemeinsame Kernsequenz besitzen, allerdings möglicherweise mit einer geringen Abwandlung derselben.The core component of the probe can be defined in different ways based on the same underlying principles. The most important underlying principle is that the repeat sequence of the probe should consist of or include a nucleotide sequence from a common nuclear region that possesses minisatellites of both human and animal genomic DNA. The common core region is "shared" in the sense that it reflects a high degree of consensus, eg, at least 80%, such as between one minisatellite and another, these minisatellites are detectable, eg, by probing genome DNA fragments with the myoglobin gene 33-BP repeat sequence to give hybridized fragments, referred to herein as "A33 positive" fragments. These fragments and the 33-BP repeat of the myoglobin gene contain a core sequence of approximately 16 common BPs. The X33-positive fragments, on the other hand, can be used as probes of genomic DNA to generate additional fragments which also possess the common core sequence, but possibly with a slight modification thereof.
Ein anderes Prinzip besagt, daß die Kem-Nucleotid-Sequenz nicht so kurz sein darf, daß sie nicht wirksam zu den Minisatellitenregionen der Proben-DNA hybridisieren aber auch nicht so lang sein darf, daß die den Polymorphismus nicht gut entdecken kann, z.B. daß die der 33-BP-Tandem wiederholung in dem Myoglobin-Genzuähnlich wird. Im allgemeinen sollte der Kern 6 Nucleotide bis zu dem Maximum haben, das in dem gemeinsamen Kern von Minisatelliten gefunden wurde, annähernd 16. Die Wiederholsequenz der Sonde muß nicht gänzlich aus dem Kern bestehen, sondern kann eine geringe Anzahl von flankierenden Nucleotiden an beiden Seiten der Kernsequenz enthalten. Die sich wiederholenden Einheiten brauchen nicht genaue Wiederholungen weder hinsichtlich der Anzahl noch der Art von Nucleotiden und auch nicht hinsichtlich der Kern- oder Nicht-Kern-Komponenten der sich wiederholenden Einheiten zu sein. Es ist aber zweckmäßig, sie hier als sich wiederholende Einheiten zu beschreiben und zu definieren, wenn das auch nur eine annähernde Bezeichnung ist. Der Block von η sich wiederholenden Einheiten kann an beiden Seiten von einer Nucleotid-Sequenz flankiert sein, deren Umfang und Art gewöhnlich irrelevant istAnother principle is that the nucleotide nucleus sequence must not be so short that it does not hybridize effectively to the minisatellite regions of the sample DNA, nor may it be so long that it can not detect the polymorphism well, e.g. that the 33-BP tandem becomes repetitive in the myoglobin gene. In general, the nucleus should have 6 nucleotides to the maximum found in the core of minisatellites, approximately 16. The repeat sequence of the probe need not consist entirely of the nucleus, but may have a small number of flanking nucleotides on both sides of the nucleus Core sequence included. The repeating units need not be exact repeats neither in terms of number nor type of nucleotides, nor in terms of the core or non-core components of the repeating units. It is useful, however, to describe and define them here as repetitive units, if that is only an approximate denomination. The block of η repeating units can be flanked on both sides by a nucleotide sequence, the size and type of which is usually irrelevant
Erfindungsgemäße Polynucleotide umfassen speziell diejenigen, die in jeder der folgenden Formen definiert werden: Polynucleotides of the invention specifically include those defined in any of the following forms:
ERSTE DEFINITIONFIRST DEFINITION
Polynucleotide mit der allgemeinen Formel, gelesen in der 5' —> 3'-RichtungPolynucleotides of the general formula, read in the 5 'to 3' direction
H-(J-Kern-K)n L (1)H- (J-core-K) n L (1)
worin:wherein:
„Kern" eine Sequenz darstellt mit mindestens 6 aufeinanderfolgenden Nucleotiden, ausgewählt aus einer der folgenden Sequenzen, die in der gleichen Richtung gelesen werden:"Core" is a sequence having at least 6 contiguous nucleotides selected from one of the following sequences read in the same direction:
GGAGGTGGCAGGAXG (2)GGAGGTGGCAGGAXG (2)
AGAGGTGGGCAGGTGG (3)AGAGGTGGGCAGGTGG (3)
GGAGGYGGGCAGGAGG (4)GGAGGYGGGCAGGAGG (4)
T(C)mGGAGGAXGG(G)pC (5A)T (C) m GGAGGAXGG (G) pC (5A)
T(C)mGGAGGA(A)qGGGC (5B)T (C) m GGAGGA (A) q GGGC (5B)
worin:wherein:
X A oder G ist, Y C oderT ist, m 0,1 oder 2 ist, ρ 0 oder 1 ist, q Ooder 1 ist, η mindestens 3 ist; J und K zusammen 0 bis 15 zusätzliche Nucleotide innerhalb der sich wiederholenden Einheit darstellen; und H und L je Ooder mindestens 1 zusätzliches, die sich wiederholenden Einheiten flankierendes Nucieotid darstellen, und vorausgesetzt, daßX is A or G, Y is C or T, m is 0,1 or 2, ρ is 0 or 1, q is O or 1, η is at least 3; J and K together represent 0 to 15 additional nucleotides within the repeating unit; and H and L are each at least 1 additional nucleotide flanking repeating units, and provided that
(I) „Kern" und J und K nicht unbedingt die gleiche Sequenz oder Länge in jeder (J · Kern · K) sich wiederholenden Einheit haben;(I) "core" and J and K do not necessarily have the same sequence or length in each (J · core · K) repeating unit;
(II) „Kern" auch eine Variant-Kernsequenz darstellen kann;(II) "core" can also represent a variant core sequence;
(III) die gesamten tatsächlichen Kernsequenzen in allen η sich wiederholenden Einheiten mindestens 70% Homologie mit den gesamten „echten" Kernsequenzen, wie oben in bezug auf die Formeln 2 bis 5 definiert, in der gleichen Anzahl von η sich wiederholenden Einheiten haben;(III) the total actual core sequences in all η repeating units have at least 70% homology with the entire "true" core sequences as defined above with respect to formulas 2 to 5 in the same number of η repeating units;
und Polynucleotide mit komplementärer Sequenz zur obigen.and polynucleotides having complementary sequence to the above.
ZWEITE DEFINITIONSECOND DEFINITION
Polynucleotide mit der allgemeinen FormelPolynucleotides having the general formula
H-(J-Kern-K)n-L (1)H- (J-core-K) n -L (1)
„Kern" eine Sequenz von 6 bis 16 aufeinanderfolgenden Nucleotiden darstellt, gelesen in dergleichen 5' —* 3' Richtung, ausgewählt aus (1) oder 5'/3'gemeinsamen Kernregion eines ersten Human-oder Tierminisatelliten, gewonnen durch Sondierung von Human- oder Tier-Genom-DNA mit einer Sonden-DNA, die eine Myoglobin-Tandemwiederholsequenz von annähernd 33 NT je Wiederholeinheit enthält, (2) der 5' -» 3' gemeinsamen Kernregion eines zweiten Human- oder Tierminisatelliten, gewonnen durch Sondierung von Human- oder Tier-DNA mit einer Sonden-DNA, die eine Tandemwiederholsequenz aus der gemeinsamen Kernregion des ersten Minisatelliten enthält, und (3) der 5'—»3'gemeinsamen Kernregion eines dritten Human- oder Tierminisatelliten, gewonnen durch Sondierung von Human-oder Tier-Genom-DNA mit einer Sonden-DNA, die eine Tandemwiederholsequenz aus der gemeinsamen Kernregion des zweiten Minisatelliten enthält, wobei jede der Tandemwiederholsequenzen eine Wiederholung von mindestens 3 Einheiten ist, und Polynucleotide mit komplementärer Sequenz zu der obigen."Core" represents a sequence of 6 to 16 contiguous nucleotides, read in the same 5 ' - * 3' direction, selected from (1) or 5 '/ 3' common core region of a first human or animal minisatellite, obtained by probing human or animal genomic DNA with a probe DNA containing a myoglobin tandem repeat sequence of approximately 33 NT per repeat unit, (2) the 5 '->3' common nuclear region of a second human or animal minisatellite, obtained by probing human or animal DNA with a probe DNA containing a tandem repeat sequence from the common core region of the first minisatellite, and (3) the 5 '->3' common core region of a third human or animal minisatellite, obtained by probing human or animal Genomic DNA with probe DNA containing a tandem repeat sequence from the common core region of the second minisatellite, each of the tandem repeat sequences repeating at least 3 units and polynucleotides of complementary sequence to the above.
DRITTE DEFINITIONTHIRD DEFINITION
Polynucleotide mit der allgemeinen FormelPolynucleotides having the general formula
H-(J-Kern-K)n-L (1)H- (J-core-K) n -L (1)
„Kern" eine der Sequenzen mit mindestens 6 aufeinanderfolgenden Nucleotiden von innerhalb einer gemeinsamen Kern region von Minisatelliten von Human- oder Tier-Genom-DNA, die mindestens 75%, vorzugsweise 80%, Konsensus ergibt, darstellt; „Kern" nicht unbedingt die gleiche Sequenz in jeder sich wiederholenden Einheit haben muß, und alle anderen Symbole die oben erläuterte Bedeutung haben,"Core" is one of the sequences having at least 6 contiguous nucleotides from within a common core region of minisatellites of human or animal genomic DNA which yields at least 75%, preferably 80%, consensus; "nucleus" is not necessarily the same Must have sequence in each repeating unit, and all other symbols have the meaning explained above,
und Polynucleotide mit komplementärer Sequenz zu der obigen.and polynucleotides having complementary sequence to the above.
VIERTE DEFINITIONFOURTH DEFINITION
Polynucleotide mit mindestens drei Wiederholungen einer Sequenz von 6 bis 36NT, einschließlich einer abgeleiteten (5' —» 3') Kernsequenz, ausgewählt unter:Polynucleotides having at least three repeats of a sequence of 6 to 36NT, including a derived (5 'to 3') core sequence selected from:
(5') GPGGGCWGGWXG (3') (6)(5 ') GPGGGCWGGWXG (3') (6)
worin P nicht = G, W = A oder T und X = A oder Gwhere P is not = G, W = A or T and X = A or G
oder eine Variante davon, vorausgesetzt, daß die gesamten tatsächlichen Kernsequenzen in allen Wiederholungen mindestens 70% Homologie mit den gesamten „echten" Kernsequenzen, definiert in bezug auf Formel (6), in der gleichen Anzahl von Wiederholungen aufweisen,or a variant thereof, provided that the total actual core sequences in all iterations have at least 70% homology with the total "true" core sequences defined with respect to formula (6) in the same number of repetitions,
und Polynucleotide mit komplementärer Sequenz zu der obigen.and polynucleotides having complementary sequence to the above.
In den obigen Formeln und im Text wird die Sequenz in der üblichen Bezeichnung 5' -» 3' gezeigt.In the above formulas and in the text, the sequence is shown in the usual designation 5 '- »3'.
Die Erfindung umfaßt Polynucleotide von DNA, RNA und von jeder anderen, zu DNA hybridisierbaren Art. Die Polynucleotide nach obiger Definition sind unmarkiert und können Doppelstrang (DS)- oder Einzelstrang (SS)-Form haben.The invention encompasses polynucleotides of DNA, RNA and any other species hybridizable to DNA. The polynucleotides as defined above are unlabeled and may have double stranded (DS) or single stranded (SS) forms.
Die Erfindung umfaßt markierte Polynucleotide in SS-Form zur Verwendung als Sonden sowie ihre markierten DS-Vorläufer, von denen die SS-Sonden hergestellt werden können.The invention encompasses labeled polynucleotides in SS form for use as probes as well as their labeled DS precursors from which the SS probes can be made.
Vorzugsweise sind sie in einer beliebigen herkömmlichen Form 32P-radiomarkiert, können aber alternativ mit Hilfe anderer auf dem Gebiet der Hybridisierung allgemein bekannter Maßnahmen radiomarkiert werden, mit Biotin oder einem ähnlichen Stoff nach dem Verfahren von D. C. Ward, u.a., wie in Proceedings of the 1981ICN-UCLA Symposium on Developmental Biology using Purified Genes (Berichte des ICN-UCl-A Symposiums von 1981 über Entwicklurjgsbiologie unter Verwendung gereinigter Gene) in Colorado vom 15. bis 20. März 1981, Band XXII11981, Seiten 647 bis 658, Academic Press, Herausgeber Donald D. Brown, u. a., beschrieben wird, oder sogar enzym-markiert nach dem Verfahren von A. D. B. Malmcolm, u. a. Abstracts of the 604 th Biochemical Society Meeting (Berichte der 604.Tagung der Biochemischen Gesellschaft), Cambridge, England (Tagung vom 1.JuIi 1983) sein.Preferably, they are P-radiolabeled in any conventional form 32 , but may alternatively be radiolabeled by other means well known in the art of hybridization, with biotin or similar by the method of DC Ward, et al., As in Proceedings of the 1981 ICN-UCLA Symposium on Developmental Biology using Purified Genes (Reports from the 1981 ICN-UCL-A Symposium on Developmental Biology Using Purified Genes) in Colorado, March 15-20, 1981, Volume XXII11981, pages 647-658, Academic Press, Editors Donald D. Brown, et al., Or even enzyme-labeled according to the method of ADB Malmcolm, et al., Abstracts of the 604th Biochemical Society Meeting, Cambridge, England (meeting of 1 .JuIi 1983).
Somit betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine Polynudeotid-Sonde, die für genetische Abstammungsbestimmungen von Human- oder Tier-DNA enthaltenden Proben von Nutzen ist und außer einer markierten oder Markiererkomponente (marker) ein Polynucleotid mit mindestens drei Tandemwiederholungen (einschließlich Varianten) von Sequenzen aufweist, die mit einer Minisatellitenregion des Human- oderTier-Genoms bis zu einem Grade homolog sind, daß die Hybridisierung der Sonde zu einem entsprechenden DNA-Fragment möglich ist, das durch Fragmentieren der Proben-DNA mit einer Restriktions-Endonuclease gewonnen wurde,Thus, in a further aspect, the invention relates to a polynucleotide probe useful for genetic descent determinations of human or animal DNA-containing samples and, in addition to a labeled or marker component, a polynucleotide having at least three tandem repeats (including variants) of sequences having homology with a minisatellite region of the human or animal genome to a degree that allows hybridization of the probe to a corresponding DNA fragment obtained by fragmenting the sample DNA with a restriction endonuclease,
gekennzeichnet dadurch, daßcharacterized in that
a) die Wiederholungen jeweils einen Kern enthalten, der zu mindestens 70% mit einer Konsensuskernregion von ähnlicher Länge homolog ist, die in einer Vielzahl von Minisatelliten von verschiedenen Genom-Stellen vorhanden ist;a) the repeats each contain a core that is at least 70% homologous to a consensus core region of similar length present in a plurality of minisatellites from different genome sites;
b) der Kern 6 bis 16 Nucleotide lang ist;b) the core is 6 to 16 nucleotides in length;
c) die Gesamtanzahl von Nucleotiden innerhalb der sich wiederholenden Einheit, die nicht zum Kern beiträgt, höchstens 15 beträgt.c) the total number of nucleotides within the repeating unit that does not contribute to the core is at most 15.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Probe von Human- oder Tier-Genom-DNÄ mit einer erfindungsgemäßen Sonde und zum Nachweis von hybridisierten Fragmenten der DNA.The invention also relates to a method for identifying a sample of human or animal genome DNA with a probe according to the invention and for detecting hybridized fragments of the DNA.
Dieser Aspekt der Erfindung kann umfassen:This aspect of the invention may include:
Fragmentierung von Gesamt-DNA von einer Zellmaterialprobe unter Verwendung einer Restriktions-Endonuclease, Hybridisierung stark variabler DNA-Fragmente mit einer Sonde nach obiger Definition, die neben einer markierten oder Markiererkomponente eine wiederholte Kernkomponente enthält, undFragmentation of total DNA from a cell material sample using a restriction endonuclease, hybridization of highly variable DNA fragments with a probe as defined above, which contains a repeated core component in addition to a labeled or marker component, and
Bestimmung de» Kennzeichen- oder Markiererkonzentration, die an DNA-Fragmente verschiedener Länge gebunden ist, oder allgemeiner an Bänder von verschiedener Molekülgröße.Determination of the label or marker concentration bound to DNA fragments of different lengths, or more generally to bands of different molecular size.
Normalerweise wird die fragmentierte DNA vor der Hybridisierung nach der Kettenlänge eingestuft oder aufgespalten, z. B.Normally, the fragmented DNA is classified or split by chain length prior to hybridization, e.g. B.
durch Elektrophorese, und die Markiererkonzentration ermittelt, um ein charakteristisches Musterzu erhalten, von dem einzelne Elemente spezifischen genetischen Ursprungs sind.by electrophoresis, and the marker concentration to obtain a characteristic pattern of which individual elements are of specific genetic origin.
Die folgenden in der Erfindung und den oben genannten früheren Spezifikationen angewandten Definitionen können eine Hilfe sein.The following definitions applied in the invention and the above prior specifications may be helpful.
Eine Region von Human- oder Tier-DNA an einem erkannten Platz oder einer erkannten Stelle wird als hypervariabel bezeichnet, wenn sie in vielen verschiedenen Formen auftritt, z. B. hinsichtlich der Länge oder Sequenz.A region of human or animal DNA at a recognized site or site is said to be hypervariable if it occurs in many different forms, e.g. B. in terms of length or sequence.
Genetische Veränderung im Muster von Human- oder Tier-DNA-Fragmenten, die nach Elektrophorese getrennt und mit Hilfe einer Sonde ermittelt werden.Genetic alteration in the pattern of human or animal DNA fragments separated after electrophoresis and detected by probe.
Polymorphpolymorph
Man bezeichnet ein Gen oder ein anderes Segment einer DNA als Polymorph, wenn es von einem Individuum zum anderen Veränderung zeigt.A gene or other segment of a DNA is called a polymorph when it changes from one individual to another.
Eine Polynucleotidsequenz, die serienweise vollkommen oder unvollkommen wiederholt wird.A polynucleotide sequence that is repeated in series completely or imperfectly.
Ein Bereich menschlicher oder tierischer DNA, der von Tandemwiederholungen einer kurzen DNA-Sequenz umgeben ist. Alle Wiederholungseinheiten müssen nicht notwendigerweise vollkommene Identität zeigen.An area of human or animal DNA surrounded by tandem repeats of a short DNA sequence. All repeating units do not necessarily have to show perfect identity.
Eine Sequenz, die als am nächsten kommend unter einer Anzahl von Wiederholungssequenzen bezeichnet werden kann; üblicherweise unter den Wiederholungseinheiten von zwei oder mehr Restriktionsenzymfragmenten unterschiedlichen Ursprungs oder Ortes.A sequence that may be referred to as closest to a number of repeat sequences; usually among the repeat units of two or more restriction enzyme fragments of different origin or location.
Eine Sequenz, die keine exakte Wiederholung entweder hinsichtlich Anzahl oder hinsichtlich Art der Nucleotide darstellt, jedoch erkennbar eine Wiederholung einer Übereinstimmungssequenz ist; üblicherweise eine Kemsequenz oder eine Wiederholung, die eine Kernsequenz enthält.A sequence that is not an exact repeat either in number or in type of nucleotides but is clearly a repeat of a match sequence; usually a nuclear sequence or a repeat containing a core sequence.
Variantevariant
Eine tatsächliche Sequenz, die von einer definierten Wiederholungssequenz in einem geringen Grad abweicht (mehr als 50% Homologie).An actual sequence that deviates slightly from a defined repeat sequence (more than 50% homology).
Ursprünglich ein einzelner kleiner eindeutiger Bereich der Sequenzähnlichkeit innerhalb einer Übereinstimmungs- ; Originally, a single small unique region of sequence similarity within a match ;
Wiederholungssequenz und durch Restriktionsenzymfragmente abgetrennt, dazu verwendet, die Übereinstimmungs-Wiederholungssequenz zu definieren sowie durch Minisstellithybridisierung mit jedem Fragment. Ausgedehnt darauf, auf daraus abgeleitete Wiederholungssafluenzen, z. B. definierte Kernsequenzen (unten) Bezug zu nehmen.Repeat sequence and separated by restriction enzyme fragments, used to define the match repeat sequence and by minisstellithybridisierung with each fragment. Extended to refer to derived repetitions, e.g. B. defined core sequences (below) to take reference.
Eine Kernsequenz mit vollständiger Übereinstimmung mit einer der Formeln (2) bis (8) innerhalb ihrer eigenen Länge.A core sequence with complete agreement with one of the formulas (2) to (8) within its own length.
Im Vergleich zweier Sequenzen dergleichen Länge die Anzahl der Basenpaare (bp) minus Anzahl der bp-Substitutionen in einer, die notwendig ist, die andere zu ergeben, als Prozentsatz der Anzahl der Basenpaare (bps).In comparison of two sequences of the same length, the number of base pairs (bp) minus the number of bp substitutions in one which is necessary to give the other, as a percentage of the number of base pairs (bps).
Nucleotid (nt) und Basenpaar (bp) werden synonym verwendet. Beide können DNA oder RNA bezeichnen. Die Abkürzungen C, A, G, T beziehen sich üblicherweise auf (Desoxy)Cytidin, (Desoxy)Adenosin, (Desoxy)Guanosin und entweder Desoxythymidin oder-Uridin.Nucleotide (nt) and base pair (bp) are used synonymously. Both may designate DNA or RNA. The abbreviations C, A, G, T usually refer to (deoxy) cytidine, (deoxy) adenosine, (deoxy) guanosine and either deoxythymidine or uridine.
Die Tandemwiederholungssequenz (künstlich oder natürlich isoliert) kann somit eine vollkommene Wiederholung sein, ist aber vorzugsweise eine unvollständige Wiederholung. Vorzugsweise sind mindestens zwei Wiederholungen unvollständige Wiederholungen der Konsensuskernsequenz. Es sind vorzugsweise mindestens drei Wiederholungen und noch besser mindestens 7 in der Sondensequenz vorhanden.The tandem repeat sequence (artificial or naturally isolated) may thus be a perfect replicate, but is preferably an incomplete repeat. Preferably, at least two repeats are incomplete repeats of the consensus core sequence. There are preferably at least three repeats, and more preferably at least 7, in the probe sequence.
Die Herstellung einer Sonde kann die Isolierung eines natürlichen Minisatelliten durch ΚΙοηέη und die Identifizierung durch DNA-Sequenzierung erforderlich machen. Sie kann auch die Excision des verlangten Kernes und seine anschließende Umwandlung in eine Tandemwiederholung oder die Stimulierung von ungleichartigen Austauschvorgängen mit Kernfragmenten unterschiedlichen Ursprungs erfordern. Sie kann auch das Klonen des Polynucleotide umfassen.The preparation of a probe may require the isolation of a natural minisatellite by ΚΙοηέη and identification by DNA sequencing. It may also require the excision of the required nucleus and its subsequent conversion to tandem repeat or the stimulation of unequal exchanges with nuclear fragments of different origins. It may also include cloning the polynucleotide.
Andererseits kann der Aufbauschritt auch das Synthetisieren der identifizierten Konsensuskernsequenz oder eines Fragmentes davon einschließen. Die Konsensuskernsequenz enthält vorzugsweise nicht weniger als 6BP und vorzugsweise nicht mehr als · 16BP. Eine Tandemwiederholung des synthetischen Kerns wird dann konstruiert.Alternatively, the building step may include synthesizing the identified consensus core sequence or a fragment thereof. The consensus core sequence preferably contains not less than 6BP and preferably not more than 16BP. A tandem repeat of the synthetic core is then constructed.
In natürlicher Form kann das Polynucleotid aus einer Aufeinanderfolge von Vorgängen zu verschiedenen Zeiten, worauf Klonen erfolgreicher oderteilweise erfolgreicher Zwischenprodukte folgt, resultieren und kann Fragmente natürlicher oder synthetischer Herkunft enthalten, so daß das endgültige Polynucleotid wenig Ähnlichkeit mit dem Ausgangs-Minisatelliten haben kann.In its natural form, the polynucleotide may result from a sequence of events at different times, followed by cloning of successful or partially successful intermediates, and may contain fragments of natural or synthetic origin, such that the final polynucleotide may have little resemblance to the parent minisatellite.
Die erfindungsgemäßen Sonden sind für folgende Gebiete brauchbar:The probes according to the invention are useful for the following fields:
1. Vaterschafts- und Mutterschaftsnachweis bei Menschen.1. Proof of paternity and maternity in humans.
2. Familiengruppenverifizierung, z. B. bei Einwanderungskonflikten und Erbschaftsstreitigkeiten.2. Family group verification, eg. In immigration conflicts and inheritance disputes.
3. Zygotie-Prüfungen bei Zwillingen.3. Zygotia tests on twins.
4. Prüfungen auf Inzucht bei Menschen.4. Tests for inbreeding in humans.
5. Allgemeine Abstammungsanalysen bei Menschen.5. General ancestry analyzes in humans.
6. Identifikation von Stellen von Erbkrankheiten bei Menschen, wo durch die Konstruktion spezifischer Sonden der Nachweis eines genetischen Defektes ermöglicht wird.6. Identification of sites of hereditary diseases in humans, where the construction of specific probes enables the detection of a genetic defect.
7. Gerichtsmedizin7. Forensic Medicine
(a) Eindeutige Bestimmung von Spermaproben von Vergewaltigungsopfern(a) Clear identification of sperm samples from rape victims
(b) Eindeutige Bestimmung von Blut-, Haar- und Spermaproben, z. B. von verschmutzter Kleidung(b) Clear identification of blood, hair and sperm samples, e.g. B. from dirty clothes
(c) Identifizierung von menschlichen Überresten.(c) identification of human remains.
8. Zell-Chimarismus-Untersuchungen, z. B. Verfolgen von Spender- gegenüber Empfängerzellen nach Knochenmarktransplantation.8. Cell-chimerism studies, e.g. B. Tracking donor versus recipient cells after bone marrow transplantation.
9. Viehzüchtungs- und Stammbaumanalysen/Bescheinigung der Echtheit. (Dazu könnten beispielsweise die laufende Kontrolle9. Cattle breeding and pedigree analyzes / certificate of authenticity. (This could include, for example, the ongoing control
und Überwachung von reinen Tierrassen und die Überprüfung von Stammbäumen im Falle von Rechtsstreitigkeiten, so z. B. bei der Rennpferd- und Hündezüchtung, gehören). Auch zur Bereitstellung genetischer Markierungssubstanzen, die einen Zusammenhang mit vererbten Merkmalen von wirtschaftlicher Bedeutung zeigen könnten.and surveillance of pure animal breeds and the examination of pedigrees in the event of litigation, such as B. in racehorse and Hündezüchtung belong). Also, to provide genetic markers that could show an association with inherited traits of economic importance.
10. Routinemäßige Qualitätskontrolle von Zellreihen gezüchteter Tiere, Überprüfung auf Kontamination reiner Zellreihen und für routinemäßige Identifikationsarbeiten.10. Routine quality control of cell lines of bred animals, checking for pure cell line contamination and for routine identification work.
11. Analyse von Tumorzellen und Tumoren in bezug auf molekulare Abnormitäten.11. Analysis of tumor cells and tumors for molecular abnormalities.
12. Man ist der Meinung, daß die Polynucleotide oder davon abgeleiteten Sonden eine potentielle Verwendung in der Pflanzenzüchtung finden werden.12. It is believed that the polynucleotides or probes derived therefrom will find potential use in plant breeding.
Darin stellen dar:In it represent:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Verfahrensweise zur Herstellung einer 33-BP-Wiederholsequenz des Myoglobin-Gens, ihr Einsatz in ein Plasmid und ihr Klonen;Fig. 1 is a schematic representation of the procedure for preparing a 33-BP repeat sequence of the myoglobin gene, its use in a plasmid and its cloning;
Fig. 2 eine Photokopie einer Aufnahme von Autoradiogramm von Fragmenten der Genom-DNA-Hybridisierung zu verschiedenen DNA-Sonden, die auch einen Stammbaum verwandter Individuen zeigt, deren DNA in zwei der Autoradiogramme identifiziert wurde;Figure 2 is a photocopy of an autoradiograph of fragments of genomic DNA hybridization to various DNA probes, also showing a pedigree of related individuals whose DNA was identified in two of the autoradiograms;
Fig. 3 Autoradiogramme von DNA-Proben von 3 nicht verwandten Menschen, die mit drei verschiedenen erfindungsgemäßen Sonden sondiert wurden;Fig. 3 autoradiograms of DNA samples from 3 unrelated humans probed with three different probes according to the invention;
Fig. 4 ein Autoradiogramm von DNA-Proben von 9 Menschen, von denen einige verwandt waren und von denen zwei eineiige Zwillinge waren, sondiert mit einer erfindungsgemäßen Sonde;Fig. 4 is an autoradiograph of DNA samples from 9 humans, some of which were related, two of which were monozygotic twins, probed with a probe of the invention;
Fig. 5 Autoradiogramme von DNA-Proben von 2 Menschen und 17 Tieren, sondiert mit einer erfindungsgemäßen Sonde; Fig. 6 eine Reihe von Autoradiogrammen von DNA-Proben von Mitgliedern einer ghanesischen, in einen Einwanderungskonflikt verwickelten Familie, erfindungsgemäß sondiert;Fig. 5 autoradiograms of DNA samples from 2 humans and 17 animals probed with a probe according to the invention; Fig. 6 is a series of autoradiographs of DNA samples of members of a Ghanaian family involved in an immigration conflict probed according to the invention;
Fig. 7 Autoradiogramme von DNA-Proben einer von Neurofibromatose befallenen blutsverwandten Gruppe; Fig. 8 Autoradiogramme von DNA von einem Gudscharati-Stamm, erzeugt zur Untersuchung von möglicher Mitvererbung von Minisatellitenfragmenten und erheblicher Persistenz von fetalem Hämoglobin (HPFH); und Fig.9a und 9b genetische Diagramme, die die Vererblichkeit von HPFH und verschiedenen Minisatelliten in einem großen Stamm zeigen;FIG. 7 shows autoradiograms of DNA samples of a blood-related group affected by neurofibromatosis; FIG. 8 shows autoradiograms of DNA from a Gudzharati strain, generated for the study of possible co-inheritance of minisatellite fragments and substantial persistence of fetal hemoglobin (HPFH); and Figures 9a and 9b are genetic diagrams showing the heritability of HPFH and various minisatellites in a large strain;
Fig. 10 ein Diagramm, das die Herstellung eines geklonten künstlichen Minisatelliten zeigt; Fig. 11 eine Reihe von Autoradiogrammen von DNA-Proben von zwei nicht verwandten Nachgeburten, sondiert mit neuartigen synthetischen Sonden;Fig. 10 is a diagram showing the preparation of a cloned miniature artificial satellite; Figure 11 is a series of autoradiographs of DNA samples from two unrelated abortions probed with novel synthetic probes;
Fig. 12 eine Reihe vqn Autoradiogrammen von sondierten DNA-Proben von einer großen blutsverwandten Gruppe; Fig. 13 ein Autoradiogramm, das verschiedene DNA-Bandmuster zeigt, die bei Zwillingen unter Verwendung verschiedener Sonden erhalten wurden;Fig. 12 shows a series of autoradiograms of probed DNA samples from a large blood-related group; Fig. 13 is an autoradiogram showing various DNA band patterns obtained in twins using various probes;
Fig. 14 ein Autoradiogramm, bei dem miteinsträngigerund mitdoppelsträngigen Sonden erzeugte Bandmuster verglichen werden;Fig. 14 is an autoradiogram comparing band patterns generated with single-stranded and double-stranded probes;
Fig. 15 und 15A Autoradiogramme von DNA-Erkennungszeichen (fingerprints), erhalten von gerichtsmedizinischen Proben;" Fig. 16 ein Autoradiogramm, das von einer Hundefamilie erhaltene DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) zeigt; Fig. 17 ein Autoradiogramm, das DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) einer kurzhaarigen Hauskatzenfamilie zeigt; Fig. 18 ein Autoradiogramm, das von verschiedenen Schafen unter Verwendung von zwei verschiedenen Sonden gewonnene DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) zeigt; ^Fig. 15 and 15A are autoradiograms of fingerprints obtained from forensic samples; Fig. 16 is an autoradiogram showing fingerprints obtained from a dog family; Fig. 17 is an autoradiogram showing the DNA signature (Fig. Fig. 18 is an autoradiogram showing fingerprints of different sheep using two different probes; Fig. 18 is an autoradiogram showing fingerprints of a short-haired domestic cat family
Fig. 19 ein Autoradiogramm, das DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von drei verschiedenen Schweinen zeigt; Fig.20 ein Autoradiogramm, das DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) einer Kuh-Familie und weiterer Rinderzeigt; und Fig. 21 ein Fig. 20 ähnliches Autoradiogramm unter Verwendung anderer Sonden.Fig. 19 is an autoradiogram showing DNA fingerprints of three different pigs; Fig. 20 is an autoradiogram showing DNA fingerprinting of a cow family and other cattle; and Fig. 21 is an autoradiogram similar to Fig. 20 using other probes.
Eine Human-Genom-Sammlung von 10 bis 20KB Sau3A, teilweise von Human-DNA in Phage"\L47,1 geklont, wurde durch Hybridisierung mitder33-BP-Myoglobin-Wiederholsonde „pAV33,7" gescreent. Mindestens 40 start-bis-schwach hybridisierende Plaques wurden in einer Sammlung von 3 x 105Rekombinanten identifiziert. Eine willkürliche Auswahl von acht dieser positiven Plaques wurde gereinigt (λ33,1-15), und die Southern-Tüpfel-Analyse von Phagen-DNA wurde angewandt, um zu zeigen, daß die hybridisierende DNA in jedem Rekombinanten innerhalb einer einzigartigen kurzen (0,2-2KB) Region des . Rekombinanten lokalisiert war. Die Sequenz-Analyse zeigte, daß diese Region in jedem der acht Rekombinanten einen aus 3-29 Tandemkopien einer Wiederholsequenz, deren Länge von 16BP in λ33,15 bis 64 in λ33,4 reichte, bestehenden Minisatelliten enthielt. Die meisten Minisatelliten enthielten eine einheitliche Anzahl von Wiederholungen. In λ33,6 bestand die37-BP-Wiederholung ihrerseits aus einem divergierenden Trimer einer grundlegenden 12-BP-Einheit. Jeder A33-Rekombinant stellte eine andere Region des Human-Genoms dar, wie durch die jeden Minisatelliten flankierende klon-spezifische DNA-Sequenz bestätigt wurde.A human genome library of 10 to 20Kb Sau3A, partially cloned from human DNA into phage "\ L47,1, was screened by hybridization with the33-BP myoglobin repeat probe" pAV33,7 ". At least 40 start-to-weak hybridizing plaques were identified in a collection of 3 x 10 5 recombinants. An arbitrary selection of eight of these positive plaques was purified (λ33, 1-15), and Southern dot assay of phage DNA was used to show that the hybridizing DNA in each recombinant was isolated within a unique short (0, 2-2KB) Region of the. Recombinant was localized. Sequence analysis showed that this region contained in each of the eight recombinants a minisatellite consisting of 3-29 tandem copies of a repeat sequence ranging in length from 16BP in λ33.15 to 64 in λ33.4. Most minisatellites contained a uniform number of repetitions. In λ33.6, the 37-BP repeat in turn consisted of a diverging trimer of a basic 12-BP unit. Each A33 recombinant represented a different region of the human genome as confirmed by the clone-specific DNA sequence flanking each minisatellite.
Die acht geklonten Minisatellitenregionen befanden sich innerhalb von 0,5—2,2 KB Hinfl DNA-Fragmenten, die kleiner als die polymorphen2-6KB DNA-Fragmente sind, die durch pAV33,7 in Hinfl Digests von Human-DNA nachgewiesen werden können. Um bestimmen zu können, ob irgendeine der geklonten Minisatellitenregionen ebenfalls polymorph war, wurden 32P-markierte einsträngige DNA-Sonden von geeigneten M 13-Subklonen jedes Minisatelliten hergestellt und mit hoher Genauigkeit zu einer Gruppe von 14 nicht-verwandten Britisch-kaukasischen, mit Hinfl digerierten DNAn hybridisiert. Typische Hybridisierungsmuster zeigen, daß jede Sonde unter diesen Hybridisierungsbedingungen eine einzigartige Region des Human-Genoms entdeckt, und daß drei dieser Regionen stark polymorph sindThe eight cloned minisatellite regions were within 0.5-2.2 KB of Hinfl DNA fragments smaller than the polymorphic 2-6KB DNA fragments that can be detected by pAV33,7 in human DNA digests. In order to determine if any of the cloned minisatellite regions were also polymorphic, 32 P-labeled single-stranded DNA probes were prepared from appropriate M 13 subclones of each minisatellite and with high accuracy to a group of 14 unrelated British Caucasian, with Hinfl digested DNAn hybridized. Typical hybridization patterns show that each probe discovers a unique region of the human genome under these hybridization conditions and that three of these regions are highly polymorphic
Nähere Einzelheiten der obigen Verfahrensweise sind in den Beispielen enthalten. Hinsichtlich der oben festgelegten Definitionen der Polynucleotide entsprechen die Definitionen der allgemeinen Formel Further details of the above procedure are included in the examples. With regard to the definitions of the polynucleotides set forth above, the definitions correspond to the general formula
H- (J-C-K)n-L (8)H- (JCK) n -L (8)
worin C eine Kernsequenz darstellt und die anderen Symbole die oben erläuterten Bedeutungen haben. In allen Definitionen kann die Kernsequenz in einer Einheit der nächsten gleichen oder sich von dieser unterscheiden. Sie kann beispielsweise ein zusätzliches Nucleotid oder zwei enthalten, ihr kann ein Nucleotid oder zwei fehlen, oder sie kann sich in (z. B.) 1 bis 4 Nucleotiden unterscheiden, wenn ein Vergleich mit einer für die sich wiederholenden Einheiten als Ganzes anwendbaren Konsensuskernsequenz angestellt wird.wherein C represents a core sequence and the other symbols have the meanings explained above. In all definitions, the core sequence in one unit may be the same or different from the next. For example, it may contain one additional nucleotide or two, may lack one or two nucleotides, or may differ in (eg) 1 to 4 nucleotides, when compared to a consensus core sequence applicable to the repeating units as a whole becomes.
Der Kern kann in verschiedener Weise definiert werden. Eine allgemeine Definition kann durch Bezugnahme auf die Verfahrensweise, durch die 'die Kernsequenz identifiziert werden kann, gewonnen werden. Eine Minisatellitenregion von Genom-DNA wird mit einer Sequenz wieThe core can be defined in various ways. A general definition may be obtained by reference to the manner in which the core sequence can be identified. A minisatellite region of genomic DNA is tagged with a sequence such as
GGAGGTGGGCAGGAXG (2)GGAGGTGGGCAGGAXG (2)
verglichen. Eine x-Nucleotide lange von dem Minisatelliten entnommene Sequenz, die die größte Homologie mit einem x-Nucleotiden zeigt, der von allen möglichen x-Nucleotid langen Sequenzen mit der Formel (2) ausgewählt wurde, wird als diecompared. A x-nucleotide long sequence taken from the minisatellite showing the largest homology with an x-nucleotide selected from all possible x-nucleotide long sequences of the formula (2) is named as
Kernsequenz angesehen. Das ist natürlich eine sehr begrenzte Möglichkeit für die Definierung des Kerns und sie sollte in einem oder wenigen Kernen von 6 Nucleotiden Länge, 1 oder wenigen von 7 Nucleotiden Länge und so weiter bis zu 16 Nucleotiden Länge resultieren („wenige", weil es in einigen Fällen mehr als eine Sequenz mit größter, z. B. 100%, Homologie geben wird). Um die entdeckte Möglichkeit von Veränderungen in der auf diese Weise definierten Kernsequenz aufzeigen zu können, wird vorausgesetzt, daß eine Veränderung bis zu einem solchen Ausmaß vorhanden sein kann, daß alle η sich wiederholenden Einheiten im Durchschnitt mindestens 70% Homologie ihrer Kerne mit Kernen nach obiger Definition aufweisen. Alle flankierenden Sequenzen, J und K, innerhalb der Wiederholeinheit werden nicht in die Betrachtung für Homologiezwecke einbezogen, wobei der Vergleich einzig zwischen Kernen angestellt wird. Die definierten Kerne können unterschiedliche Längen haben und können „gemischt" sein, d. h. sie können in einigen sich wiederholenden Einheiten homolog mit (z. B.) GGGCAGGAXG von Formel (2) und in anderen homolog mit (z.B.) GGGCAGGTGG von Formel (3) sein. Varianten sollten daher eher hinsichtlich der Homologien mit (Kern)n und nicht unbedingt mit „Kern" selbst betrachtet werden.Core sequence viewed. This, of course, is a very limited possibility for the definition of the nucleus and should result in one or a few nuclei of 6 nucleotides in length, 1 or a few 7 nucleotides in length and so on up to 16 nucleotides in length ("few" because in some If there is more than one sequence of greatest, eg, 100%, homology.) In order to demonstrate the discovered possibility of changes in the core sequence thus defined, it is anticipated that there will be a change to such an extent For example, all η repeating units may have on average at least 70% homology of their nuclei with nuclei as defined above All flanking sequences, J and K, within the repeating unit are not included in the consideration for homology purposes, the comparison being made only between nuclei The defined cores can have different lengths and can be "mixed", i h they can be homologous with (eg. GGGCAGGAXG of formula (2) and in others homologous with (eg) GGGCAGGTGG of formula (3). Variants should therefore be considered more in terms of homologies with (core) n and not necessarily with "core" itself.
Die „erste", früher festgelegte Definition wurde von den obigen Erwägungen abgeleitet, aber dahingehend vereinfacht, daß der Kern als eine Sequenz von beliebiger Länge von 6 bis zum Maximum von 12-16, je nachdem, wie der Fall liegt, in den gezeigten Formeln (2) bis (5) definiert wird. Für Varianten gilt eine ähnliche Annahme.The "first" definition previously defined was derived from the above considerations, but simplified in that the kernel is represented as a sequence of any length from 6 to the maximum of 12-16, as the case may be, in the formulas shown (2) to (5) For variants, a similar assumption applies.
Die „zweite" Definition definiert den Kern in bezug auf aufeinanderfolgende Hybridisierungsschritte, von denen jeder zusätzliche Minisatellitenfragmente erzeugen kann. Man wird leicht erkennen, daß es durch die Ausführung einer ausreichenden Anzahl von Hybridisierungen bei einer umfangreichen Sammlung von Human-Genom-DNA, Untersuchung einer ausreichenden Anzahl von hybridisierten Fragmenten, Herstellung von Sonden davon, erneuten Sondierung der Genom-DNA und so weiter, theoretisch unendlich viele Male möglich sein müßte, zu einem Bereich von Konsensuskernsequenzen zu gelangen, der weitgehend in Minisatelliten-DNAn repräsentiert ist. In der Praxis ist nicht anzunehmen, daß diese Vorgänge ungeheuer viele Male und in einem ungeheuer großen Umfang ausgeführt werden müssen, um zu einer ausreichend breiten Konsensuskernregion zu gelangen, und daher werden (willkürlich) nur 3 Sondierungsvorgänge in die Definition aufgenommen.The "second" definition defines the nucleus with respect to sequential hybridization steps, each of which can generate additional minisatellite fragments, It will be readily appreciated that by carrying out a sufficient number of hybridizations on a large collection of human genomic DNA, examining a sufficient number of hybridized fragments, preparation of probes thereof, rescanning of the genomic DNA, and so on, theoretically would be infinitely many times possible to arrive at a range of consensus core sequences that is largely represented in minisatellite DNAs not to assume that these processes have to be executed immensely many times and to a tremendous extent in order to reach a sufficiently broad consensus core region, and therefore only (3) probing operations are (arbitrarily) included in the definition.
In der „dritten" Definition stellt W den Kern dar, und wird die Möglichkeit einer breit gefächerten Konsensuskernregion mit daran befindlichen Abwandlungen angenommen, die um nicht mehr als 25% (z. B. 4 Nucleotide von 16) abweichen. Ist eine Kernregion aus bis zu annähernd 16 Nucleotiden mit einer möglichen Abweichung bis zu 25% definiert worden, wird der Kern Walseine Sequenz von mindestens 6 aufeinanderfolgenden Nucleotiden von innerhalb dieser Region definiert.In the "third" definition, W represents the core, and assumes the possibility of a broader consensus core region with modifications to it that do not deviate by more than 25% (eg 4 nucleotides from 16) At approximately 16 nucleotides, with a possible variation of up to 25%, the nucleus W is defined as having a sequence of at least 6 contiguous nucleotides from within this region.
Die „vierte" Definition betrifft eine neudefinierte Konsensuskernformel (6), die aus synthetische Polynucleotide betreffenden Untersuchungen ermittelt wurde.The "fourth" definition concerns a newly-defined consensus core formula (6) determined from studies involving synthetic polynucleotides.
Diese Untersuchungen haben zu weiteren Definitionen kürzerer Kernsequenzen geführt." So bleibt vorzugsweise die nachfolgende (5' —» 3') Sequenz:These investigations have led to further definitions of shorter core sequences. "Thus, the following (5 '-> 3') sequence preferably remains:
PGGGCWG (7)PGGGCWG (7)
in allen sich wiederholenden Einheiten erhalten, wobei P und W die in der vierten Definition oben erläuterten Bedeutungen haben. P ist vorzugsweise T; W ist vorzugsweise Ain all repeating units, where P and W are as defined in the fourth definition above. P is preferably T; W is preferably A
Vorzugsweise bleibtauch die nachfolgende (5'-»3') Sequenz: Preferably, the following (5 '-> 3') sequence also remains:
TGGGCA (8)TGGGCA (8)
in allen sich wiederholenden Einheiten erhalten.obtained in all repeating units.
Nach einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt werden Polynucleotide, die mindestens drei Wiederholungen haben, einschließlich der nachfolgenden 5' —» 3' Kernsequenz:In another aspect of the invention, polynucleotides having at least three repeats, including the following 5 '- »3' core sequence:
GGPGGGCWGGWXG (7)GGPGGGCWGGWXG (7)
worin P = nicht G, W = AoderTundX = A oder G oder eine Variante davon, vorausgesetzt, daß die gesamten tatsächlichen Kernsequenzen in allen Wiederholungen mindestens 70% Homologie mit den gesamten „echten", in bezug auf Formel (7) definierten Kernsequenzen in der gleichen Anzahl von Wiederholungen aufweisen, und Polynucleotide mit komplementärer Sequenz zu der obigen zur Verfügung gestellt.where P = not G, W = A or T and X = A or G or a variant thereof, provided that the total actual core sequences in all repeats have at least 70% homology with the total "true" core sequences defined with respect to formula (7) in the have the same number of repeats, and polynucleotides with complementary sequence to the above provided.
In allen obigen Definitionen ist der Kern mindestens 6 Nucleotide lang, vorzugsweise mindestens 7 oder 8, und am besten 12 oder mehr, z. B. 14 bis 16. Die Sequenz GGGCAGGAXG von Formel (2) (die 10 End-Nucleotide am 3'-Ende) ist eine Sequenz mit hohem Konsensus und erscheint besonders vielversprechend. Vorzugsweise enthält der Kern mindestens 6 und noch besser alle 10 Nucleotide dieser Sequenz.In all the above definitions, the core is at least 6 nucleotides in length, preferably at least 7 or 8, and most preferably 12 or more, e.g. 14 to 16. The sequence GGGCAGGAXG of formula (2) (the 10 end nucleotides at the 3 'end) is a high consensus sequence and appears to be particularly promising. Preferably, the core contains at least 6, and more preferably, every 10 nucleotides of this sequence.
Die Variantkerne haben vorzugsweise mindestens 75% und noch besser mindestens 80 oder 85% Homologie.The variant nuclei preferably have at least 75% and more preferably at least 80 or 85% homology.
Die flankierenden Sequenzen J und K innerhalb jeder sich wiederholenden Einheit sind vorzugsweise weggelassen oder kurz gehalten, z.B. auf 0,1 oder 2 Nucleotide an jeder Seite, und vorzugsweise sollten J und Kzusammen nicht über 20, und noch besser über 15 liegen. Die Gesamtanzahl von Nucleotiden in der Summe von J + Kern + K innerhalb einer sich wiederholenden Einheit sollte vorzugsweise nicht über 36 und noch besser 31 und am besten 25 betragen.The flanking sequences J and K within each repeating unit are preferably omitted or kept short, e.g. to 0.1 or 2 nucleotides on each side, and preferably J and K should not be above 20, and more preferably above 15. The total number of nucleotides in the sum of J + core + K within a repeating unit should preferably not be above 36 and more preferably 31 and most preferably 25.
Die Anzahl von Wiederholeinheiten η beträgt vorzugsweise mindestens 10, zweckmäßigerweise 10 bis 40, aber im Prinzip kann η jede beliebige Zahl sogar bis zu 10000 sein.The number of repeating units η is preferably at least 10, suitably 10 to 40, but in principle, η may be any number even up to 10000.
Die flankierenden Sequenzen H und L sind irrelevant. Sie können weggelassen werden, oder sie können in jeder Anzahl von Nucleotiden vorhanden sein, z. B. bis zu 20000, obwohl das Arbeiten mit einer so langen Sonde normalerweise nicht empfindlich wäre. Sie können DS-DNA enthalten, selbst wenn die Wiederholsequenzen von SS-DNA sind.The flanking sequences H and L are irrelevant. They may be omitted, or they may be present in any number of nucleotides, e.g. Up to 20,000, although working with such a long probe would normally not be sensitive. They can contain DS-DNA, even if the repeat sequences are from SS-DNA.
Für das Identifizierungsverfahren können bekannte Techniken der Sondierung angewandt werden, von denen die brauchbarste ist, die Proben-DNA mit Restriktionsenzym(en) (einem oder mehreren, wie angemessen) zu spalten, die die Tandemwiederholsequenzen nicht spalten, oder nur in einem irrelevanten Umfang, der ihre Fähigkeit, sondiert zu werden, nicht beeinträchtigt, spalten.For the identification method known probing techniques may be used, the most useful of which is to cleave the sample DNA with restriction enzyme (s) (one or more, as appropriate) that do not cleave the tandem repeat sequences, or only to an irrelevant extent, which does not affect their ability to be probed.
Ausführungsbeispieleembodiments
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung erläutert, Temperaturen sind in 0C angegeben.The following examples illustrate the invention, temperatures are given in 0 C.
(1) Konstruktion einer lange Tandemwiederholsequenzen enthaltenden Sonde von dem Human-Myoglobin-Gen(1) Construction of probe containing long tandem repeat sequences from the human myoglobin gene
Die Konstruktion dieser Sonde wird schematisch in Fig. 1 der Zeichnungen gezeigt, die fünf Stufen, (a) bis (e) markiert, darstellt. Das Ausgangs-Myoglobin-Gen (a) wird von P.Weiler, u.a., EMBO J., 3,439-446 (1984) beschrieben. Wie darin gezeigt wird, besitzt das Gen eine im ersten Intron gelegene Region, die aus vier Wiederholungen einer von fast identischen 9-BP-Sequenzen flankierten 33-BP-Sequenz besteht (r in Fig. 1). Diese Region wurde in einem 169-BP-Hinfl-Fragment isoliert (b), das end-repariert und durch Klonen in die Smal-Stelle des Plasmids pUC 13 verstärkt wurde, siehe J.Vieira, u. a., Gene 19,259-268 (1982). Ein Monomer wurde durch Spaltung der dritten und vierten Wiederholungen mit der Restriktions-Endonuclease Avail (A) isoliert (c). (Durch eine einfache Basensubstitution in den Wiederholungen 1 und 2 wird diese Stelle eliminiert und statt dessen eine Ddel [D] Stelle geschaffen.) Durch Ligation des33-BP-Monomeren über die nicht-identischen klebrigen Avall-Enden wurde ein Kopf-Schwanz-Polymer (d) erzeugt, das eine unbekannte Anzahl (n) von sich wiederholenden Einheiten besitzt. Mindestens 10 Wiederholungen enthaltende Polymere wurden durch präparative Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert, end-repariert, in die Smal-Stelle von pUC 13 eingesetzt und in E.coli JM83 geklont, siehe J.Vieira, u. a., supra. Die Struktur des polymeren DNA-Inserts in dem resultierenden Plasmid, als pAV33,7 (e) bezeichnet, wurde durch Excision des Inserts an der Polyverbindungsstelle mit BamHI plus EcoRI Einfüllmarkierung mit a-32-P-dCTP an der BamHI-Stelle, und Partialdigestion mit Avail bestätigt. Markierte Partialdigest-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel aufgelöst. Es wurde ermittelt, daß pAV33,7 23 Wiederholungen des 33-BP-Monomeren enthält, enthalten in einem 767 BP BamHI-EcoRI-Fragment, wie gezeigt (e).The construction of this probe is shown schematically in Fig. 1 of the drawings, which illustrates five stages marked (a) to (e). The parent myoglobin gene (a) is described by P. Weiler, et al., EMBO J., 3,439-446 (1984). As shown therein, the gene has a first intron region consisting of four repeats of a 33-BP sequence flanked by nearly identical 9-BP sequences (r in Figure 1). This region was isolated (b) in a 169 bp Hinfl fragment which was end-repaired and amplified by cloning into the SmaI site of plasmid pUC13, see J. Vieira, et al., Gene 19, 259-268 (1982). , A monomer was isolated by cleavage of the third and fourth repeats with the restriction endonuclease Avail (A) (c). (By a simple base substitution in repeats 1 and 2 this site is eliminated and instead a Ddel [D] site is created.) Ligation of the 33-BP monomer over the non-identical tacky Avall ends became a head-to-tail polymer (d) having an unknown number (n) of repeating units. Polymers containing at least 10 repeats were isolated by preparative agarose gel electrophoresis, end-repaired, inserted into the SmaI site of pUC 13 and cloned into E. coli JM83, see J.Vieira, et al., Supra. The structure of the polymeric DNA insert in the resulting plasmid, as pAV33,7 (s) referred to was carried excision of the insert at the BamHI plus EcoRI Polyverbindungsstelle with fill mark with a- 32 P-dCTP at the BamHI site, and Parti Aldi Gestion confirmed with avail. Labeled partial digests were resolved by electrophoresis on a 2% agarose gel. PAV33.7 was found to contain 23 repeats of the 33-BP monomer contained in a 767 bp BamHI-EcoRI fragment as shown (e).
(2) Sequenzierung einer Auswahl von Minisatellitenregionen des Human-Genoms durch die Myogiobin 33-BP-Wiederholsonde(2) Sequencing of a selection of minisatellite regions of the human genome by the Myogiobin 33-BP repeating probe
Eine Sammlung von 10 bis 20 KB Human-DNA-Fragmenten, geklont in Bakteriophage λΙ.47,1, siehe P. Weiler, u. a., supra und W.A.M.Loenen, u.a., Gene 20,249-259 (1980), wurde durch Hybridisierung mit dem 767BP pAV33,7 Insert, beschrieben in Schritt (1) oben, gescreent, 32P-markiert in vitro nach dem Verfahren von P. Weller, u.a., supra. Eine Auswahl von acht positiven Plaques wurde gereinigt, um als λ33,1-15 bezeichnete Rekombinanten zu gewinnen. Jede derartige Phagen-DNA wurde einmal mit Hinfl oder Haelll digeriert, durch ein 1,5%iges Agarosegel elektrophoresiert, und 33-Wiederholungen-verwandte Sequenzen darin wurden durch Southem-Tüpfel-Hybridisierung mit pAV33,7 DNA lokalisiert. Jeder Rekombinant ergab ein einziges „\33-positives" Hinfl- und Haeill-Fragment, mit Ausnahme von λ33,4 und 11, die keine nachweisbaren positiven Haelll-Fragmente ergaben (infolge einer Haelll-Spaltungsstelle, die in den Wiederholregionen in diesen Rekombinanten vorhanden sind). Die \33-positiven Hinfl- und Haelll-Fragmente wurden mit Hilfe von präparativer Gelelektrophorese isoliert, wenn erfsrderlich end-repariert, und in die Smal-Stelle der doppelsträngigen DNA M13 MP8 stumpf-endig eingesetzt, J. Messing, u. a., Gene 19,269-276(1982). Positive SS-M 13-Rekombinanten wurden nach Transformation in E.coli JM101 isoliert und mit Hilfe der Didesoxynucleotid-Ketten-Terminationsmethode sequenziert. Alle \33-positiven Fragmente enthielten eine sich . wiederholende Tandemregion, die in einigen Fällen direkt sequenziert werden konnte. In anderen Fällen, in denen die Wiederholregion zu weit von der Sequenzierungs-Primer-Stelle entfernt war, wurden die M 13-lnserts durch Spaltung mit Restriktions-Endonucleasen verkürzt und neu-sequenziert.A collection of 10 to 20 kb human DNA fragments cloned in bacteriophage λΙ.47,1, see P. Weiler, et al., Supra and WAMLoenen, et al., Gene 20,249-259 (1980), was prepared by hybridization with the 767BP pAV33 , 7 insert described in step (1) above, screened, 32 P-labeled in vitro according to the method of P. Weller, et al., Supra. A panel of eight positive plaques was purified to recover recombinants designated λ33, 1-15. Each such phage DNA was digested once with Hinfl or Haelll, electrophoresed through a 1.5% agarose gel, and 33 repeat-related sequences therein were located by Southern spotted hybridization with pAV33.7 DNA. Each recombinant gave a single "\" 33 "positive" up and down fragment, except for λ33,4 and 11, which gave no detectable positive Haelll fragments (due to a Haell I cleavage site present in the repeat regions in these recombinants The \ 33-positive Hinfl and Haelll fragments were isolated by preparative gel electrophoresis, when finally required, and inserted into the SmaI site of the double-stranded DNA M13 MP8 blunt-ended, J. Messing, et al. Gene 19, 269-276 (1982) Positive SS-M 13 recombinants were isolated after transformation into E. coli JM101 and sequenced using the dideoxynucleotide chain termination method All \ 33 positive fragments contained a tandem repeating region found in E. coli JM101 In other cases, where the repeat region was too far from the sequencing primer site, the M 13 inserts were cleaved by restriction tion endonucleases shortened and re-sequenced.
Die Struktur der \33-positiven Fragmente wird unten in Form von 8 als λ33,1,33,3, 33,4,33,5, 33,6,33,10,33,11, und 33,15 bezeichneten Karten gezeigt. Das tatsächlich verwendete Restriktionsenzym und die Längen von Fragmenten in Nucleotiden waren λ33,1: Haelll, 2000; 33,3: Hinfl, 465; 33,4: Hinfl, 2000; 33,5: Hinfl, 1 600; 33,6: Haelll, 720; 33,10: Haelll, 720; 33,11: Hinfl, 1020; λ33,15: Hinfl, 1 220. Jede Karte zeigt wiederholte Sequenzen von Basen in der oberen Fallbeschreibung über einem rechtwinkligen Kasten. Die „Wiederholungen" sind hinsichtlich der Anzahl von Basen nicht unbedingt vollständig, und einige unterscheiden sich durch Substitution von Basen. Daher handelt es sich bei der über dem Kasten gezeigten wiederholten Sequenz um eine Konsensussequenz (con), wobei sie diejenige ist, mit der der größte Teil der vorgenommenen Sequenzierung übereinstimmt. Der Kasten zeigt, wie die Wiederholungen von dem Konsensus abweichen. Leerstellen in dem Kasten bezeichnen gefundene Übereinstimmung. Die Basensymbole A, C, G, T in dem Kasten bezeichnen Substitution durch diejenige Base für die eine, die darüber in der Konsensussequenz gezeigt wird. X = A oder G, Y = C oder T. - = ein im Vergleich mit dem Konsensus fehlendes Nucleotid. >>><<< (Fischgräten) Symbole deuten darauf hin, daß die Sequenzierung bisher noch nicht vorgenommen wurde, obwohl aus Autoradiogrammen der Sequenzierungs-Gele deutlich hervorgeht, daß es sich bei der Sequenz um eine „Wiederholung" des Konsensus handelt (wobei die Bezeichnung „Wiederholung" natürlich in der gleichen annähernden Weise wie oben angewandt wird). Die Fragmente λ33,3,33,5,33,10,33,11 und 33,15 wurden vollständig sequenziert, die anderen nur teilweise sequenziert. Die unter „con" an der linken Seite der Kästen befindlichen Zahlen sind die Wiederholanzahl der Sequenzen. Die untere Zahl in dieser Reihe bezeichnet.die Anzahl von Wiederholungen. So enthält λ33,1 26 Wiederholungen einer 62-Nucleotid (NT)-Sequenz, die in der oberen Fallbeschreibung über dem Kasten angegeben ist. Die in der unteren Fallbeschreibung oberhalb und unterhalb von jeder Karte gezeigte Sequenz ist die flankierende Sequenz, die an den 5'- bzw. 3'-Seiten des Wiederholsequenzblockes liegt, und diese flankierenden Sequenzen werden nicht wiederholt. Mit anderen Worten, die Struktur ist der des durch die flankierenden Sequenzen repräsentierten statistischen Copolymeren analog, in dem durch die Tandemwiederholungen repräsentierte Einheiten von Blockcopolymeren erscheinen.The structure of the \ 33-positive fragments is shown below in the form of 8 as λ33,1,33,3, 33,4,33,5, 33,6,33,10,33,11, and 33,15 , The restriction enzyme actually used and the lengths of fragments in nucleotides were λ33.1: Haelll, 2000; 33.3: Hinfl, 465; 33.4: Hinfl, 2000; 33.5: Hinfl, 1 600; 33.6: Haelll, 720; 33:10: Haelll, 720; 33:11: Hinfl, 1020; λ33,15: Hinfl, 1 220. Each map shows repeated sequences of bases in the upper case description over a rectangular box. The "repeats" are not necessarily complete with respect to the number of bases, and some differ by substitution of bases, so the repeated sequence shown above the box is a consensus sequence (con), being the one with which the The box shows how the repeats deviate from the consensus, blanks in the box denote match found The base symbols A, C, G, T in the box denote substitution by that base for the one above it X = A or G, Y = C or T. - = a missing nucleotide compared to the consensus. >>> <<< (herringbone) symbols indicate that sequencing has not yet been done although autoradiograms of the sequencing gels clearly indicate that the sequence is a "repeat" of the consensus (Fig i the term "repetition" is of course applied in the same approximate manner as above). The fragments λ33,3,33,5,33,10,33,11 and 33,15 were completely sequenced, the others only partially sequenced. The numbers under "con" on the left side of the boxes are the number of repetitions of the sequences, and the lower number in this row indicates the number of repetitions, so λ33.1 contains 26 repeats of a 62 nucleotide (NT) sequence The sequence shown above in the upper case description above and below each card is the flanking sequence located at the 5 'and 3' sides of the repeating sequence block, respectively, and these flanking sequences do not In other words, the structure is analogous to the random copolymer represented by the flanking sequences in which units of block copolymers represented by the tandem repeats appear.
(3) Entdeckung und Identifizierung einer gemeinsamen, kurzen „Kern"-Sequenz, die innerhalb der Wiederholsequenz jedes(3) discovery and identification of a common, short "core" sequence within the repeat sequence of each
\33-positiven Fragmentes liegt und einen Teil davon bildet\ 33-positive fragment lies and forms part of it
Die Wiederholsequenz jeder Region wurde mit der Myoglobin-33-BP-Wiederholsequenz in pAV33,7 und mit ihrer Umkehr-Ergänzung unter Verwendung der Punkt-Matrix-Analyse verglichen. Sehr bemerkenswert war es,' daß eine einzige kleine, unzweideutige Region von Sequenzähnlichkeit zwischen Myoglobin-33-BP-Wiederholsequenz und den Konsensuswiderholsequenzen der A33-positiven Fragmente gefunden wurde. In die gleiche Region teilten sich die Wiederholungen aller acht A33-Fragmente, und sie wird als der „gemeinsame Kern" bezeichnet. Die folgende Karte zeigt den Vergleich.The repeat sequence of each region was compared to the myoglobin 33-BP repeat sequence in pAV33,7 and its reverse complement using dot-matrix analysis. It was noteworthy that 'a single, small, unambiguous region of sequence similarity between myoglobin 33-BP repeat sequence and the consensus repeat sequences of the A33-positive fragments was found. The same region shared the repeats of all eight A33 fragments, and is referred to as the "common nucleus." The following map shows the comparison.
concon
Lambda 33,1Lambda 33.1
ccgtgtcacccacaagcttctggggggtggggggtacgatgttcaggaaa AAG G GTG G G CAG G AAGTG GAGTGTGTG CCTGCTTCCCTTCCCTGTCTTGTCCTG GAAACTCAccgtgtcacccacaagcttctgggggtggggggtacgatgttcaggaaa AAG G GTG G G CAG G AAGTG GAGTGTGTG CCTGCTTCCCTTCCCTGTCTTGTCCTG GAAACTCA
concon
gcagttgtggcatcccatccgtggagaaagcaagcccctgccccggcagggcagttgtggcatcccatccgtggagaaagcaagcccctgccccggcagg
Lambda 33,3Lambda 33.3
cctttcccttcctgccgtcagccctggaaaaaggttgtggggggagaaag con CCGGGAGGTGGGCAGGAAXGGGTGGAGXXGGGcctttcccttcctgccgtcagccctggaaaaaggttgtggggggagaaag with CCGGGAGGTGGGCAGGAAXGGGTGGAGXXGGG
gtagagaggtgaggggtggttcctccatagagaggagacctagcccactggtagagaggtgaggggtggttcctccatagagaggagacctagcccactg
Lambda 33,4Lambda 33.4
ggcagggatgggggaccgggccagaccccagctgctgagcacgcgccacc TGCAGGGTGGGGAGGGCAG-AAAGAACCCCCGCGTGXAGGGGCACC-CACATCTGGGGCCACAGGAggcagggatgggggaccgggccagaccccagctgctgagcacgcgccacc TGCAGGGTGGGGAGGGCAG-AAAGAACCCCCGCGTGXAGGGGCACC-CACATCTGGGGCCACAGGA
TGTTGT
A A-A-
- A- A
- A- A
- G- G
- G- G
- G- G
T G T GT G T G
cctaagcaggttctggtggcctcctggctgggtgtaggcagaggctggctcctaagcaggttctggtggcctcctggctgggtgtaggcagaggctggct
Lambda 33,5Lambda 33.5
gagctaatgtttcgggggctgcactgggtcatgtgagtaatcatgagggc con YGGGCAGG-AGGGGGAGGgagctaatgtttcgggggctgcactgggtcatgtgagtaatcatgagggc with YGGGCAGG-AGGGGGAGG
ccagtatcctgggaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaccagtatcctgggaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaa
Lambda 33,6 tacaatgtgagtagaggagacctcacatttgaccttggäaagtLambda 33.6 tacaatgtgagtagaggagacctcacatttgaccttggaaagt
TGGAGGAAGGGCTGGAGGAGGGCTCCGGAGGAAGGGCTGGAGGAAGGGCTGGAGGAGGGCTCCGGAGGAAGGGC
ggttgctcctcactctgtggtctttgtctgtccagaccttcccttcttggggttgctcctcactctgtggtctttgtctgtccagaccttcccttcttgg
Lambda 33,10Lambda 33,10
aagcatcaaacagggctgggtgtttagtccttttccacatctggctccca GAAGTAGGAGGTGGCTGGAGTGGGCAGGCAGGACTG-TCCCCaagcatcaaacagggctgggtgtttagtccttttccacatctggctccca GAAGTAGGAGGTGGCTGGAGTGGGCAGGCAGGACTG-TCCCC
aggagacactgccctggtggctctgaccccctgcagcctcctatgctctaaggagacactgccctggtggctctgaccccctgcagcctcctatgctcta
Lambda 33,11Lambda 33.11
caggaggaggcagaaagtggcagaggagccctccaggccggagggacacg con CAGGAAGCAGTGAGGCCCTGGGCTGGTGGTGGGcaggaggaggcagaaagtggcagaggagccctccaggccggagggacacg with CAGGAAGCAGTGAGGCCCTGGGCTGGTGGTGGG
cacgatgccttggggcagcactcacacacagtaagtgcccaagtcaaatgacacgatgccttggggcagcactcacacacagtaagtgcccaagtcaaatga
Lambda 33,15Lambda 33.15
ggtggttttcaagaaagcgtttcatgcaatttgctttaaatgttaggaaa con GAGGTGGGCAGGTGGAggtggttttcaagaaagcgtttcatgcaatttgctttaaatgttaggaaa con GAGGTGGGCAGGTGGA
aatacctacagatgaggtgtgtgcttattctctgtgcaagatttcagagtaatacctacagatgaggtgtgtgcttattctctgtgcaagatttcagagt
In der Karte wird die Gesamtheit jeder in Schritt (2) oben bestimmten Konsensussequenz gezeigt. Es handelt sich dabei um die Abschnitte, die sich tandemartig in der Myoglobin-33-BP-Sonde und in den aus Human-Genom-DNA isolierten A33-positiven Fragmenten wiederholen. Die Karte zeigt die gemeinsame Kernregion als 16 Nucleotide lang in der oberen Fallbeschreibung.The map shows the entirety of each consensus sequence determined in step (2) above. These are the sections that repeat in tandem in the myoglobin 33-BP probe and in the human genome DNA-isolated A33-positive fragments. The map shows the common core region as 16 nucleotides in the upper case description.
Gemeinsame KernregionCommon core region
33 bp myoglobin33 bp myoglobin
ctaaa&ctctaaa & ct
λ33»1 ccctgtcttgtcctggaaactca' X33,3 xxgggccgλ33 »1 ccctgtcttgtcctggaaactca 'X33.3 xxgggccg
>33,4 eatctggggccacaggatgcaggg> 33.4 eatctggggccacaggatgcaggg
aggaagggct gta-ggaggtggctaggaagggct gta-ggaggtggct
.λ33,10 X33,11.λ33,10 X33,11
#3,15# 3.15
Gemeinsamecommon
ggaggtggggaggtgg
cctssrsctcctssrsct
eraregioneraregion
GGAGGIGQGGAGGiUG aagGGTGGGCAGGAAG GGAGGTGGGCAGGAAZ tGgGGaGGGCAGaAAGGGAGGIGIGGGAGGiUG aagGGTGGCAGGAAG GGAGGTGGGCAGGAAZ tGgGGaGGGCAGaAAG
ggagcTygggcaggagg GGAGGaGGGCtGGAGG GGA-GTGGGCAGGcAG GGtGGTGGCrCAGGAAG aGAGGTGVC-GCAGGt GGggagcTygggcaggagg GGAGGaGGGCtGGAGG GGA-GTGGGCAGGcAG GGtGGTGGCrCAGGAAG aGAGGTG V C-GCAGGt GG
U U-A IiU; -LU- -r'g-OüUlj.il-tVij * Diese Sequenz ist ein Trimer, daher tragen die flankierenden Regionen zum Kern bei.U UA IiU; -L U- r'g-OuUlj. i l-tVij * This sequence is a trimer, so the flanking regions contribute to the core.
gaccgaggtgaccgaggt
tggagtgtgtgectgottccctttggagtgtgtgectgottccctt
gggtggaggggtggag
aacccccgcgtgzag.gg.gcaccc5aacccccgcgtgzag.gg.gcaccc5
,gggctccgg gactgtcccdgaa sagtgaggo, gggctccgg gactgtcccdgaa says gaggo
- 3*- 3 *
Wieder gilt X = A oder G, Y = C oder T,-= ein fehlendes Nucleotid. Man wird feststellen, daß es einen erheblichen Übereinstimmungsbeweis für diese 16 Nucleotide gibt, von denen 8 100% Übereinstimmung aufweisen und ein neuntes „X" bis zu dem Grade übereinstimmt, daß es weder A noch G ist. Diese 9 Nucleotide sind in der untersten Zeile unterstrichen und zeigen die Nucleotide der gemeinsamen Kern region. Die gemeinsame Kern region wird von den Resten der Tandemwiederholeinheiten flankiert, die in der unteren Fallbeschreibung gezeigt werden. Der AnfangsVEndpunkt jedes Wiederholkonsensus ist durch das Symbol T identifiziert; im Falle von λ33,4 und λ33,15 gibt es eine nicht-einheitliche Anzahl von Wiederholungen, und die einzelnen Wiederholungsanfanas- und -endDunkte werden HaKmr Hi in-h h;o onrWon Q>,mh„ior7Again, X = A or G, Y = C or T, - = a missing nucleotide. It will be noted that there is considerable consensus evidence for these 16 nucleotides, 8 of which are 100% matched and a ninth "X" matches to the extent that it is neither A nor G. These 9 nucleotides are in the bottom line The common nuclear region is flanked by the residues of the tandem repeat units shown in the lower case description The initial CONNECTION point of each repeat consensus is identified by the symbol T, in the case of λ33.4 and λ33, 15, there will be a nonuniform number of iterations, and the individual replicate attach and end points will become HaKmr Hi in -h h; o onrWon Q>, m h "ior7
bezeichnet. Man wird einsehen, daß die gemeinsame Kern region nur durch ausgeklügelte Analysen zu identifizieren war, da sie häufig nicht vollständig innerhalb einer einzigen Konsensussequenz der\33-positiven Fragmente liegt und sich über zwei aufeinanderfolgende Sequenzen der Myoglobin-Gen-33-BP-Wiederholung erstreckt.designated. It will be appreciated that the common core region could only be identified through sophisticated analysis, as it is often not completely within a single consensus sequence of the \ 33 positive fragments and spans two consecutive sequences of myoglobin gene 33 BP repeat ,
Zur Darstellung des Umfanges an Übereinstimmung mit den als im Rahmen der Erfindung liegend definierten Polynucleotiden werden die verschiedenen Determinanten in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt:To illustrate the extent of agreement with the polynucleotides defined herein as being within the scope of the invention, the various determinants are listed in Table 1 below:
Die unterstrichenen Zahlen bezeichnen unzulässige Längen.The underlined numbers indicate impermissible lengths.
(4) Entdeckung daß polymorphe Human-Genom-DNA-Fragmente durch Hybridisierung mit Sonden einzelner λ33-positiver Fragmente nachgewiesen werden können(4) discovery that polymorphic human genomic DNA fragments can be detected by hybridization with probes of individual λ33-positive fragments
Nach Fig. 2 wurde DNA von weißen Blutkörperchen gewonnen, die einer Stichprobe britischer Kaukasier (1-6) und von ausgewählten Mitgliedern eines großen britischen Asiatenstammes (7-18) entnommen wurde. Der Stammbaum wird in herkömmlicher Form gezeigt, wobei ein Quadrat einen Mann, der Kreis eine Frau bezeichnet und Heirat durch eine Linie zwischen beiden angezeigt wird. Zwei Heiraten zwischen Blutsverwandten, zwischen Vetter und Cousine ersten Grades, werden durch eine Doppellinie zwischen den Partnern gekennzeichnet. ΙΟ-μ,-Proben von DNA wurden mit Hinfl digeriert, durch ein 20 cm langes 1%iges Agarosegel elektrophoresiert, in situ denaturiert und durch Tüpfeln auf ein Sartorius-Nitrozellulosefilter übertragen. Einsträngige 32P-markierte Hybridisierungssonden wurden aus M 13-Rekombinanten, die Minisatelliten-(tandemartig sich wiederholende)-Regionen enthielten, hergestellt. Die wirklich verwendeten Sonden werden später beschrieben. Die Verfahrensweise war wie folgt. Annähernd 0,4^g M13-einstränige DNA wurden mit 4ng 17mer Sequenzierungs-Primer (M. L. Duckworth, u.a., Nucleic Acids Res., 9 1961-1706 [1981]) in 10μΙ 1OmM MgCI2,10mMTris-HCI (pH-Wert 8,0) 30 Minuten lang bei 6O0C getempert. Die Primer-Extension erfolgte durch die Zugabe von 16μΙ 80μΜ dATP, 80μΜ dGTP, 80μΜ dTTP, 1OmM Tris-HCI (pH-Wert 8,0), 0,1 mM EDTA plus 3μΙ (30 uCi)a-32P-dCTP (3000 Ci (ηΜοΓ1) und 1 μ\ von 5 Einheiten μΓ-1 Klenow-Fragment (Boehringer) und 15 Minuten Inkubieren bei 37°C. Die Extension wurde durch die Zugabe von 2,5jU.10,5mM dCTP und „Jagen" bei 370C über weitere 15 Minuten beendet. (Unter „Jagen" ist die Zugabe eines dNTP-Gemischs zur Vervollständigung des Kreises von DS DNA auf der Template von M13 SS DNA zu verstehen). Die DNA wurde an einer geeigneten Restriktions-Endonuclease-Stelle entweder im Insert oder in dem vom Insert entfernten M 13-Polylinker gespalten, durch die Zugabe von VioVol. 1,5M NaOH, 0,1 M EDTA denaturiert, und das 32P-markierte einsträngige vom Primer ausgehende DNA-Fragment wurde mit Hilfe der Elektrophorese durch ein 1,5%iges niedrig-schmelzendes Agarosegel (Sea Plaque) zurückgewonnen. Das herausgeschnittene Band (spezifische Aktivität >109cpm/^g DNA) wurde bei 1000C in Gegenwart von 1 mg alkali-abgetrennterTräger-Human-Placenta-DNA (abgetrennt in 0,3M NaOH, 2OmM EDTA bei 1000C, 5 Minuten lang, anschließend neutralisiert mit HCI) geschmolzen und direkt in die Hybridisierungskammer gegeben. Die Träger-DNA diente auch dazu, jene etwaige nachfolgende Hybridisierung zu sich wiederholenden DNA-Sequenzen zu unterdrücken. Als eigentliche Hybridisierungssonden wurden verwendet: (A) 33,1, ein annäherndes 2000 NT subgeklontes Haelll-Fragment, das den Minisatelliten (26 Wiederholungen einer 62-NT-Sequenz = 1 612 NT) plus annähernd 350 NT flankierende Human-DNA enthielt; (B) 33,4, ein 695 NT Nicht-Minisatelliten EcoRI-Fragment an der vom Primer entfernten Seite des Minisatelliten, enthalten in einem 2 015 NT Hinfl-Fragment; und (C, D, E) 33,15, ein 592 NT subgeklontes Fragment, das die λ 33,15 Minisatelliten-Sequenz (29 Wiederholungen einer 16-NT-Sequenz, die sich im Durchschnitt um zwei Nucleotide von der gemeinsamen, oben gezeigten Kernregion unterscheidet) plus 128 NT flankierende Human-DNA enthielt.As shown in Fig. 2, DNA was recovered from white blood cells taken from a sample of British Caucasians (1-6) and selected members of a large British Asian strain (7-18). The pedigree is shown in a conventional manner, with a square indicating a man, the circle a woman, and marriage indicated by a line between the two. Two marriages between blood relatives, between cousin and first cousin, are marked by a double line between the partners. ΙΟ-μ, samples of DNA were digested, electrophoresed through a 20 cm 1% agarose gel, denatured in situ and transferred to a Sartorius nitrocellulose filter by spotting. Single-stranded 32 P-labeled hybridization probes were prepared from M13 recombinants containing minisatellite (tandemly repeating) regions contained prepared. The probes actually used will be described later. The procedure was as follows. Approximately 0.4 μg of M13 single-stranded DNA was digested with 4μg of 17mer sequencing primer (ML Duckworth, et al., Nucleic Acids Res., 9, 1961-1706 [1981]) in 10μΙ 10mM MgCl 2 , 10mM Tris HCl (pH 8 , 0) for 30 minutes at 6O 0 C tempered. The primer extension was performed by the addition of 16μΙ 80μΜ dATP, 80μΜ dGTP, 80μΜ dTTP, 10μM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1mM EDTA plus 3μΙ (30μCi) a- 32 P-dCTP (3000 Ci (ηΜοΓ 1 ) and 1 μ \ of 5 units μΓ- 1 Klenow fragment (Boehringer) and incubated for 15 min at 37 ° C. Extension was monitored by the addition of 2.5jU.10.5 mM dCTP and "Hagen for 15 more minutes at 37 ° C. (By "hunting" is meant the addition of a dNTP mixture to complete the circle of DS DNA on the template of M13 SS DNA.) The DNA was ligated to an appropriate restriction endonuclease In either the insert or in the M 13 polylinker away from the insert, denatured by the addition of VioVol 1.5M NaOH, 0.1 M EDTA, and the 32 P-labeled single-stranded primer-derived DNA fragment was digested The electrophoresis was recovered by 1.5% low melting agarose gel (Sea Plaque) The excised tape (specific act ivity> 10 9 cpm / ^ g DNA) was stirred at 100 0 C (in the presence of 1 mg alkali-abgetrennterTräger-human placental DNA was separated in 0.3 M NaOH, 2OmM EDTA at 100 0 C for 5 minutes, then neutralized with HCI) and added directly to the hybridization chamber. The carrier DNA also served to suppress any subsequent hybridization to repeating DNA sequences. As actual hybridization probes were used: (A) 33.1, an approximate 2000 NT subcloned Haelll fragment containing the minisatellites (26 repeats of a 62-NT sequence = 1612 NT) plus approximately 350 NT flanking human DNA; (B) 33.4, a 695 NT non-mini-satellite EcoRI fragment on the side of the minisatellite remote from the primer contained in a 2015 NT Hinfl fragment; and (C, D, E) 33.15, a 592 NT subcloned fragment containing the λ 33.15 minisatellite sequence (29 repeats of a 16-NT sequence, averaged two nucleotides from the common one shown above Core region) plus 128 NT flanking human DNA.
Die Hybridisierungen wurden wie von A.J.Jeffreys, u.a.. Cell 21,555-564 (1980) beschrieben ausgeführt, nur wurde Dextransulfat durch 6% (M/V) Polyethylenglycol 6000 ersetzt, um die Hintergrundmarkierung zu reduzieren. Die Filter A und B wurden über Nacht in 0,5x SSC bei 650C hybridisiert und in 0,2 χ SSC bei 650C gewaschen. Die Filter C-E wurden hybridisiert und bei 650C in 1 χ SSC gewaschen. Die Filter wurden 1 bis 3 Tage lang bei -800C autoradiographiert, wobei eine schnelle Wolfram-Verstärkerfolie verwendet wurde.The hybridizations were carried out as described by AJJeffreys, et al. Cell 21,555-564 (1980), except that dextran sulfate was replaced with 6% (w / v) polyethylene glycol 6000 to reduce background labeling. The filters A and B were hybridized overnight in 0.5x SSC at 65 0 C and washed in 0.2 χ SSC at 65 0 C. The filters CE were hybridized and washed at 65 ° C. in 1 × SSC. The filters were autoradiographed for 1 to 3 days at -80 0 C to obtain a fast amplifier tungsten film was used.
Wie in Fig. 2 gezeigt wird, entdeckte die wiederholte Kernsonde 33,15 ein extrem kompliziertes Profil von Hybridisierungsfragmenten in mit Hinfl digerierter Human-DNA. Nur die größten (4-20 KNT) Hinfl-Fragmente konnten vollständig aufgelöst werden, und diese zeigten extremen Polymorphismus bis zu dem Umfang, daß das Hybridisierungsprofil einen individuenspezifischen DNA-„Fingerabdruck" („fingerprint") lieferte.As shown in Fig. 2, the repeated nuclear probe 33,15 detected an extremely complicated profile of hybridization fragments in human DNA digested with added. Only the largest (4-20 KNT) Hinfl fragments could be completely resolved and these showed extreme polymorphism to the extent that the hybridization profile provided an individual-specific DNA "fingerprint".
Die Stammbaum-Analyse bestätigte die extreme polymorphe Veränderung, die so groß ist, daß alle Individuen, selbst innerhalb einer einzigen blutsverwandten Gruppe von Vettern-Heiraten ersten Graden (16 bis 18, Fig. 2), unterschieden werden können. Die Familien in Fig. 2 (D, E) zeigen, daß die meisten der großen Hinfl-Fragmente von jedem Elternteii auf nur einige der Nachkommen übertragen wurden, wodurch nachgewiesen wurde, daß die meisten dieser Fragmente im heterozygoten Zustand vorhanden sind und daß die Heterozygotie bei diesen großen hypervariablen Fragmenten annähernd 100% erreichen muß. Umgekehrt können alle Fragmente in den Nachkommen zurückverfolgt werden bis zu dem einen oder anderen Elternteil (mit nur einer Ausnahme), und somit bilden sie einen Satz von gleichbleibend vererbten genetischen Markierern. Kein Band wird speziell vomThe pedigree analysis confirmed the extreme polymorphic change that is so great that all individuals can be distinguished even within a single blood-related group of first-degree cousin marriages (16-18, Figure 2). The families in Figure 2 (D, E) show that most of the large Hinfl fragments from each parent were transferred to only some of the offspring, demonstrating that most of these fragments are present in the heterozygous state and that heterozygosity must reach approximately 100% in these large hypervariable fragments. Conversely, all fragments in the offspring can be traced back to one or the other parent (with only one exception), and thus form a set of consistently inherited genetic markers. No band is specially made by
Vater auf den Sohn oder vom Vater auf die Tochter übertragen, siehe Filter D, Fig. 2. Das schließt Y- bzw. X-Kopplung aus, und legt nahe, daß diese Minisatelliten-Fragmente im Ursprung vorwiegend autosomal sind. Wenn es auch bisher noch unbekannt ist, ob diese DNA-Fragmente ihren Ursprung in dem Satz von Autosomen haben, so stammen sie nicht von einer einzigen lokalisierten Region eines Autosoms. Stattdessen können Paare von Elternfragmenten identifiziert werden, die sich unabhängig im Nachkommen aufspalten, siehe Filter D, Fig.2. Um genau zu sein, ein Paar von Bändern AB in einem Elternteil (und bei dem anderen fehlend) kann nicht allelomorph sein, wenn mindestens ein AB oder— Nachkomme vorhanden ist; das Vorhandensein von A- oder -B-Rekombinant-Nachkommenschaft beweist weiterhin das Fehlen einer festen Kopplung zwischen A und B. Eine sorgfältige Prüfung des ursprünglichen Autoradiogramms dieser Familie, das in Fig. 2 D gezeigt wird, ergibt durch diese Kriterien mindestens 10 auflösbare Bänder inder Mutter, von denen 8 gegenseitig nicht-allelomorph und nicht eng gekoppelt sind. Zwei andere Bänder können je ein AIIeI von einem der 8 ungekoppelten Fragmente sein, da nur A- oder -B-Nachkommenschaft in der begrenzten Anzahl von analysierten Nachkommen beobachtet wurde, obwohl eine so kleine Probe nicht ausreichend für einen Beweis ist, daß solche Paare von Fragmenten AIIeIe einer einzigen Stelle sind. Das führt zu der Schlußfolgerung, daß die Kernsonde in der Lage ist, nützliche Informationen gleichzeitig an mindestens mehreren unterschiedlichen ungekoppelten hypervariablen Stellen zu liefern. Diese Schlußfolgerung wird eingehender in Beispiel 8 untersucht.Transferring father to son or from father to daughter, see filter D, Fig. 2. This excludes Y and X coupling, respectively, and suggests that these minisatellite fragments are predominantly autosomal in origin. Although it is still unknown whether these DNA fragments originate from the set of autosomes, they do not come from a single localized region of an autosome. Instead, pairs of parental fragments can be identified that split independently in the offspring, see filter D, FIG. To be precise, a pair of bands AB in one parent (and missing in the other) can not be allelomorphic if there is at least one AB or offspring; the presence of A or B recombinant progeny further demonstrates the lack of tight coupling between A and B. Careful examination of the original autoradiogram of this family, shown in Figure 2D, yields at least 10 resolvable bands by these criteria in the mother, 8 of which are mutually non-allelomorphic and not closely coupled. Two other bands may each be an allele of one of the 8 uncoupled fragments, since only A or B progeny were observed in the limited number of progeny analyzed, although such a small sample is not sufficient to prove that such pairs of Fragments are all a single site. This leads to the conclusion that the nuclear probe is capable of providing useful information simultaneously on at least several different uncoupled hypervariable sites. This conclusion will be examined in more detail in Example 8.
Im Gegensatz dazu ergaben die beiden anderen, nicht erfindungsgemäßen Sonden (Filter A und B, Fig. 2) nur ein Band oder zwei Bänder, und sie waren eindeutig nicht in der Lage, viele unterschiedliche polymorphe Regionen gleichzeitig zu entdecken, und somit sind sie für den allgemeinen diagnostischen Gebrauch nicht geeignet.In contrast, the other two probes not according to the invention (filters A and B, Fig. 2) gave only one band or two bands, and clearly were unable to detect many different polymorphic regions at the same time, and thus they are for not suitable for general diagnostic use.
Es wurden zwei weitere Sonden, abgeleitet von geklonten A33-positiven Fragmenten, λ33,5 und λ33,6, analog zu Beispiel 1, Schritt (4) hergestellt. Die 33,5 Sonde bestand aus einem 308NT DNA-Fragment, geklont in M13MP8 und enthielt 14 Wiederholungen der oben genannten Konsensussequenz, bei der es sich im Prinzip um eine 17 NT lange Variante der gemeinsamen Kernsequenz zusammen mit 70 NT flankierender Human-DNA handelt. Die 33,6 Sonde enthielt 18 Wiederholungen einer 37 NT Sequenz, die ihrerseits aus 3 Wiederholungen einer annähernd auf 12 NT verkürzten Sequenz, abgeleitet von der gemeinsamen Kernregion, plus einem zusätzlichen TC an ihren 5'-Ende bestand. Die 18 χ 37 Wiederholblöcke wurden von 95 NT Human-DNA flankiert. Die Struktur der 37 NT Sequenz kann dargestellt werden als:Two additional probes derived from cloned A33-positive fragments, λ33.5 and λ33.6, were prepared analogously to Example 1, step (4). The 33.5 probe consisted of a 308NT DNA fragment cloned into M13MP8 and contained 14 repeats of the above consensus sequence, which is, in principle, a 17 NT long variant of the common core sequence along with 70 NT flanking human DNA. The 33.6 probe contained 18 repeats of a 37 NT sequence, which in turn consisted of 3 repeats of an approximately 12 NT truncated sequence derived from the common core region plus an additional TC at its 5 'end. The 18χ37 repeat blocks were flanked by 95 NT human DNA. The structure of the 37 NT sequence can be represented as:
TGG AGG AGG GGCTGG AGG AGG GGC
TGG AGG A-G GGC(oderTGG AGG AGG G-C) TCCGG AGG AGG GGCTGG AGG A-G GGC (or TGG AGG AGG G-C) TCCGG AGG AGG GGC
Diese Sonde wurde gleichfalls in M13MP8geklont.This probe was also cloned in M13MP8.
In der späteren Beschreibung wird eine 1 T-NT-Konsensussequenz AGGGCTGGAGG für diese Sonde angegeben. Beide Sonden wurden mit 32P markiert und analog zu Beispiel !,Schritt (4) zu Human-DNA von einer Gruppe von 14 ' nichtverwandten Kaukasiern hybridisiert. Beide Sonden haben eine komplizierte Gruppe von hybridisierenden Fragmenten nachgewiesen, von denen viele extreme polymorphe Veränderungen zeigten. Verschiedene, durch 33,5 entdeckte Fragmente waren neu und bisher noch nicht mit Hilfe der 33,15-Kernsonde entdeckt worden. Die 33,6-Sonde entdeckte eine fast gänzlich neue Gruppe von Minisatelliten, und deren genaue Vererbung wurde durch die Stammbaumanalyse bestätigt (siehe Beispiel 8).In the later description, a 1 T NT consensus sequence AGGGCTGGAGG is given for this probe. Both probes were labeled with 32 P and hybridized to human DNA from a panel of 14 'unrelated Caucasians analogously to Example 1, step (4). Both probes have detected a complex group of hybridizing fragments, many of which showed extreme polymorphic changes. Various fragments discovered by 33.5 were new and had not yet been discovered using the 33.15 nuclear probe. The 33.6 probe discovered an almost entirely new group of minisatellites, and their exact inheritance was confirmed by pedigree analysis (see Example 8).
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert und erklärt.The invention is further explained and explained by the following examples.
Die Digestion der Proben-DNA wird vorzugsweise unter Verwendung einer Restriktions-Endonuclease ausgeführt, die 4 Basenpaare von Nucleotiden erkennt. Es wurde gefunden, daß das DNA-Erkennungs(fingerprint)-Muster für die längsten hypervariablen Fragmente weitgehend von der verwendeten 4-BP-Erkennungs-Restriktions-Endonuclease unabhängig ist. Das läßtauf jeden Fall vermuten, daß diese großen Fragmente nicht von längeren Minisatelliten stammen, sondern daß jedes einen vollständigen langen homogenen Minisatelliten enthält, der keine Restriktions-Endonuclease-Spaltungsstellen besitzt und von Human-DNA flankiert ist, äie die normale hohe Dichte von 4-BP-Spaltungsstellen aufweist. Das stimmt mit den in den vorhergehenden Beispielen und in Beispiel 8 zusammengestellten Ergebnissen überein, die zeigen, daß die meisten dieser großen Minisatellitenfragmente ungekoppelt sind und sich im Stammbaum unabhängig abspalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Probe von DNA durch Verwendung von zwei verschiedenen Sonden bei getrennten Hybridisierungen, die zwei unterschiedliche Erkennungszeichen (fingerprints) ergeben, „doppelt-charakterisiert" („doubly fingerprinted"), zum Beispiel Sonden von Fragmenten Lambda 33,15 und 33,6. Durch diese Mittel wird die an sich schon geringe Wahrscheinlichkeit, daß zwei nicht-verwandte Individuen die gleichen Erkennungszeichen (fingerprints) haben, weiter verringert. Zum Beispiel wird in Beispiel 4 eine Wahrscheinlichkeit von nur 10~19 angegeben, selbst dann, wie es bevorzugt wird, wenn unvollständig-aufgelöste Hybridisierungs-DNA-Fragmente mit Längen von weniger als 4KB ignoriert werden. Die Erfindung umfaßt ein Verfahren für den Vaterschaftsnachweis. Annähernd die Hälfte der polymorphen Minisatellitenfragmente in einem Nachkommen stammen vom Vater, und diese väterlichen Fragmente können durch einen Vergleich der mütterlichen und Nachkommen DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) identifiziert werden. Alle diese väterlichen Fragmente werden normalerweise in der DNA des Vaters vorhanden sein. Es wird angenommen, daß durch Verwendung einer Sonde 33,15 und von DNA-Fragmenten mit einer Länge von mindestens 4KB, die Wahrscheinlichkeit, daß der mutmaßliche Vater zufällig alle 6 vater-spezifischen DNA-Fragmente, die praktisch beim Nachkommen identifiziert werden, besitzt, in der Größenordnung von 10~5 liegt, und daß sie durch die Verwendung der beiden Sonden 33,6 und 33,15zur Größenordnung von 10~8 reduziert wird. Selbstverständlich werden die exakten Wahrscheinlichkeiten von der einwandfreien Auflösung und der Kompliziertheit der gewonnenen DNA-Muster abhängen und werden verbessert werden, wenn zusätzliche Vater-Fragmente mit einer Länge von weniger als 4KB analysiert werden oder wenn eine dritte Sonde verwendet wird. Ausreichend DNA (0,5 bis 5 Mikrogramm) kann schnell aus einem einzigen Tropfen Humanblut für die DNA-Erkennungsbestimmung (fingerprinting) isoliert werden. So wurden DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von einer wahllosen Gruppe von Individuen sowie zwei Leuten, deren DNA zuvor charakterisiert (fingerprinted) wurde, plus zwei SchwesternThe digestion of the sample DNA is preferably carried out using a restriction endonuclease which recognizes 4 base pairs of nucleotides. It has been found that the DNA recognition (fingerprint) pattern for the longest hypervariable fragments is largely independent of the 4-BP recognition restriction endonuclease used. This suggests in any case that these large fragments are not derived from longer minisatellites, but that each contains a complete long homogeneous minisatellite which has no restriction endonuclease cleavage sites and is flanked by human DNA, the normal high density of 4-5 minisatellites. Having BP cleavage sites. This is consistent with the results compiled in the previous examples and in Example 8, showing that most of these large minisatellite fragments are uncoupled and split off independently in the pedigree. In a preferred embodiment, a sample of DNA is doubly fingerprinted using two different probes in separate hybridizations giving two different fingerprints, for example, probes of fragments lambda 33,15 and 33.6. By these means the already low probability that two unrelated individuals have the same identifiers (fingerprints) is further reduced. For example, in Example 4, a probability of only 10 ~ 19 is indicated, even then, as is preferred, incompletely-resolved if hybridization DNA fragments with lengths of less than 4KB be ignored. The invention includes a method for proof of paternity. Approximately half of the polymorphic minisatellite fragments in a progeny are from the father, and these paternal fragments can be identified by comparing the maternal and progeny fingerprints. All of these paternal fragments will normally be present in the father's DNA. It is believed that by using a probe 33,15 and DNA fragments of at least 4KB in length, the likelihood that the putative father happens to possess all 6 father-specific DNA fragments virtually identified in the progeny, is on the order of 10 ~ 5 , and that it is reduced by the use of the two probes 33, 6 and 33, 15 on the order of 10 ~ 8 . Of course, the exact probabilities will depend on the proper resolution and complexity of the DNA patterns obtained, and will be improved if additional parent fragments of less than 4KB in length are analyzed or if a third probe is used. Sufficient DNA (0.5 to 5 micrograms) can be rapidly isolated from a single drop of human blood for DNA fingerprinting. Thus, DNA fingerprints were made by an indiscriminate group of individuals as well as two people whose DNA had previously been fingerprinted, plus two sisters
erzeugt. Die beiden zuvor charakterisierten Individuen konnten einfach und eindeutig auf der Basis von Vergleichen der DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) identifiziert werden, ebenso die beiden Schwestern, die eine beträchtliche Anzahl von Minisatellitenfragmenten gemeinsam besaßen.generated. The two previously characterized individuals could be identified easily and clearly based on comparisons of DNA fingerprints, as well as the two sisters who shared a significant number of minisatellite fragments.
Die DNA kann aus den verschiedensten Zellen einer bestimmten Person, die alle das gleiche Erkennungszeichen (fingerprint) ergeben, entnommen werden. So sind die DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) für Sperma- und Blut-DNA nicht zu unterscheiden, was auch für die Muster eineiiger Zwillinge gilt. Außerdem werden die Muster anscheinend dauerhaft in gezüchteten Zellen aufrechterhalten, wie bei einem Vergleich von DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von Blut-DNA mit DNA, die aus vom Epstein-Barr-Virus transformierten Lymphoblastoid-Zellreihen dergleichen Person isoliert wurde, gezeigt wurde.The DNA can be taken from the most diverse cells of a given person, all of which give the same fingerprint. Thus, the fingerprints for sperm and blood DNA are indistinguishable, as are the patterns of identical twins. In addition, the patterns appear to be persistently maintained in cultured cells, as shown in a comparison of DNA fingerprints of blood DNA with DNA isolated from epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cell lines of the same subject.
Tiere, auf die die Erfindung anwendbar ist, umfassen die meisten Säugetiere, Vögel, Amphibien und Fische. Beispiele sind Hühner, Hamster, Kaninchen, Mäuse, Sperlinge, Turmfalken, Frösche, Wassermolche und Fische. Im Falle von Hühnern wurde ein sehr komplizierter verschmierter Abschnitt von hybridisierenden DNA-Fragmenten erzeugt. Durch Digestion mit Haell wurde die Verschmierung beseitigt, und ein „sauberes" Erkennungszeichen (fingerprint) erhalten. Es ist daher wahrscheinlich, daß Hühner-DNA auch einen langen kernhaltigen Satelliten enthält, dessen Wiederholeinheiten eine oder mehrere Haelll-Spaltungsstellen enthalten; durch Spaltung mit Haelll wird daher dieser Satellit zu sehr kleinen DNA-Fragmenten reduziert, die vom Boden des Gels während der DNA-Elektrophorese wegwandern. Es ist gelegentlich möglich, daß andere Tiere verschmierte Bänder erzeugen und daß diese auflösbar sein werden, wenn die DNA mit entsprechenden Enzymen, die die längeren Fragmente spalten, digeriert wirdAnimals to which the invention is applicable include most mammals, birds, amphibians and fish. Examples are chickens, hamsters, rabbits, mice, sparrows, kestrels, frogs, water monkeys and fish. In the case of chickens, a very complicated blurred section of hybridizing DNA fragments was generated. By digestion with Haell, the smear was removed and a "clean" fingerprint was obtained It is therefore probable that chicken DNA also contains a long nucleated satellite whose repeat units contain one or more Haell I cleavage sites by cleavage with Haelll Therefore, this satellite is reduced to very small DNA fragments that migrate away from the bottom of the gel during DNA electrophoresis It is sometimes possible that other animals will produce smeared bands and that they will be soluble when the DNA is labeled with appropriate enzymes split the longer fragments, digest them
In den folgenden zusätzlichen Beispielen werden die Temperaturen in 0C angegeben.In the following additional Examples, temperatures are in 0 C.
DNA wurde aus frischen Human-Plazentasnach der Beschreibung von A.J.Jeffreys, Cell 18,1-10(1979) isoliert. Es wurden drei individuelle Plazentas, 1-3 markiert, verwendet. 8-Mikrogramm-Proben von DNA wurden mit Hinfl und/oder Sau3A in Gegenwart von 4mM Spermidintrichlorid zur Unterstützung der vollständigen Digestion digeriert, nach Phenolextraktion durch Ethanölpräzipitation zurückgewonnen und durch ein 20cm langes 0,6%iges Agarosegel mit 30V etwa 24 Stunden lang der Elektrophorese unterzogen, bis alle DNA-Fragmente von weniger als 1,5 KB Länge von dem Gel abelektrophorisiert waren. DNA wurde anschließend durch Tüpfeln auf ein Sartorius-Nitrozellulosefilter übertragen. Einsträngige M13-DNA-Sonden mit hoher spezifischer Aktivität (über 109cpm 32P/Mikrogramm DNA) wurden nach der Beschreibung in Beispiel 1 Schritt (4) hergestellt. Die genauen angewandten Sonden waren: (a) 33,5-Sonde, bestehend aus einem 220 NT Haelll DNA-Fragment, das den größten Teil des Lambda-33,5-Minisatelliten (17 NT χ 14 Wiederholungen) plus etwa 60 NT flankierende Human-DNA, subgeklont in die Smal-Stelle von MI3MP8 enthält; (b) 33,6-Sonde, bestehend aus einem 720 NT Haelll-Fragment, bestehend aus dem MinisatelNten plus etwa 50 NT flankierender Human-DNA, subgeklont in die Smal-Stelle von M13MP8; und (c) die gleiche 33,15-Sonde wie in Beispiel 1, Schritt (4), wobei es sich um ein 592-NT-Pstl-Ahalll-Fragment handelt, das den Minisatelliten plus 128 NT flankierende Human-DNA, subgeklont in M13MP19 DNA, digeriert mit Pstl plus Smal, enthält. Southern-Tüpfel-Hybridisierung und Waschen wurden in 1 x SSC bei 65°C nach der obigen Beschreibung für die Filter C-E in Beispiel 1, Schritt (4), vorgenommen. Die Filter wurden bei Raumtemperatur vier Tage lang ohne Verstärkungsfolie autoradiographiert. Jede Sonde erzeugte ein anderes Fragmentmuster, dessen Kompliziertheit weitgehend von der verwendeten Tetranucleotid-Restriktions-Endonuclease unabhängig ist. Figur 3 zeigt das erzielte Muster. Die Auflösung von polymorphen, weniger als 4KB langen Fragmenten wird in Doppeldigests mit Hinfl plus Sau3A verbessert, weil Hintergrundhybridisierung ausgeschaltet wird, die vermutlich durch relativ divergierte und invariante Hinfl Minisatellitenfragmente verursacht wurde, dieSau3A Spaltungsstellen innerhalb einer oder mehrerer Wiederholeinheiten angesammelt haben. Bei Doppeldigests kann die Anzahl der durch Sonde 33,15 entdeckten auflösbaren polymorphen Fragmente von etwa 15 auf etwa 23 pro Individuum erhöht werden, wobei allerdings ein Verlust von etwa 20% langer einfacher Digest-Minisatellitenfragmente, die wahrscheinlich eine Sau3A-Spaltungsstelle in den meisten oder allen Wiederholeinheiten enthalten, auftreten kann.DNA was isolated from fresh human placentas as described by AJ Jeffreys, Cell 18: 1-10 (1979). Three individual placentas, 1-3 marked, were used. 8 microgram samples of DNA were digested with Hinfl and / or Sau3A in the presence of 4 mM spermidine trichloride to aid in complete digestion, recovered after phenol extraction by ethanol precipitation, and electrophoresed through a 20 cm 0.6% agarose gel at 30V for approximately 24 hours until all DNA fragments of less than 1.5KB in length were electrophoresed from the gel. DNA was then transferred by spotting onto a Sartorius nitrocellulose filter. High specific activity single stranded M13 DNA probes (above 10 9 cpm 32 P / microgram DNA) were prepared as described in Example 1 step (4). The precise probes used were: (a) 33.5 probe consisting of a 220 NT Haelll DNA fragment containing most of the lambda 33.5 minisatellite (17 NT χ 14 repeats) plus about 60 NT flanking human DNA, subcloned into the SmaI site of MI3MP8; (b) 33.6 probe consisting of a 720 NT Haelll fragment consisting of the Minisatel Nten plus about 50 NT flanking human DNA, subcloned into the SmaI site of M13MP8; and (c) the same 33.15 probe as in Example 1, step (4), which is a 592 NT PstI-AhallI fragment subcloned into the minisatellite plus 128 NT flanking human DNA M13MP19 DNA digested with PstI plus SmaI contains. Southern spotted hybridization and washing was done in 1 x SSC at 65 ° C as described above for the filters CE in Example 1, step (4). The filters were autoradiographed at room temperature for four days without reinforcement film. Each probe produced a different fragment pattern, the complexity of which is largely independent of the tetranucleotide restriction endonuclease used. FIG. 3 shows the obtained pattern. The resolution of polymorphic fragments less than 4KB long is improved in double-digests with Hinfl plus Sau3A because background hybridization is eliminated, presumably caused by relatively divergent and invariant hins minisatellite fragments that have accumulated Sau3A cleavage sites within one or more repeat units. In double digests, the number of resolvable polymorphic fragments detected by probe 33,15 can be increased from about 15 to about 23 per individual, however, with loss of about 20% simple digest minisatellite fragments likely to have a Sau3A cleavage site in most or all repeat units may occur.
Beispiet 4Example 4
8-Mikrogramm-Proben von Human-Blut-DNA, die aus einer Stichprobe von 20 nicht verwandten britischen Kaukasieren entnommen worden war, wurden mit Hinfl digeriert und durch Southern-Tüpfeln mit der Minisatellitensonde 33,6 oder 33,15 nach der Beschreibung in Beispiel 3 hybridisiert. Jedes DNA-Erkennungszeichen (fingerprint) (Individuum A) wurde mit dem Muster in der benachbarten Gelspur (Individuum B) verglichen, und die Anzahl von Bändern in A, die bei B deutlich fehlten, plus diejenigen, die ein mitwanderndes Gegenstück von annähernd gleicher autoradiographischer Intensität in B hatten, wurden bewertet. Die in der folgenden Tabelle angeführten Ergebnisse sind Mittelwerte aller paarweisen Vergleiche. Einem kleinen Anteil (etwa 6%) von zusätzlichen schwach hybridisierenden Fragmenten in A entsprachen stark hybridisierende Fragmente in B, und weil es in solchen Fällen nicht möglich war, zu entscheiden, ob das Band in A ebenfalls in B vorhanden war, wurden solche Fragmente ignoriert. Wenn die mitwandernden Bänder in A und B immer identische AIIeIe der gleichen Minisatellitenstellesind, dann wird die mittlere Wahrscheinlichkeit x, daß ein AIIeI in A auch in B vorhanden ist, mit der mittleren Allel-Häufigkeit (Homozygotie) in Beziehung gesetzt q durch χ = 2q - q2,somitq = 1 - (1 - x)1/2. In der Praxiswird ein (unbekannter) Anteil von mitwandernden Bändern in A und B zufällig von einer anderen Minisatellitenstelle herrühren, und somit sind die Berechnungen der mittleren Allel-Häufigkeit und Homozygotie maximal und hängen von der elektrophoretischen Auflösung von Minisatellitenfragmenten ab.8 micrograms samples of human blood DNA taken from a sample of 20 unrelated British Caucasians were digested with Hinfl and Southern spotted with the 33.6 or 33.15 minisatellite probe as described in Example 3 hybridized. Each DNA fingerprint (individual A) was compared to the pattern in the adjacent gel trace (individual B), and the number of bands in A distinctly lacked at B, plus those that were a co-migrating counterpart of approximately the same autoradiographic Intensity in B were evaluated. The results given in the following table are mean values of all pairwise comparisons. A small proportion (about 6%) of additional weakly hybridizing fragments in A corresponded to strongly hybridizing fragments in B, and because it was not possible in such cases to decide whether the band in A was also present in B, such fragments were ignored , If the migrating bands in A and B are always identical AIIeIe of the same minisatellite sites, then the mean probability x that AIIeI in A is also present in B, is related to the mean allele frequency (homozygosity) q by χ = 2q - q 2 , thus q = 1 - (1 - x) 1/2 . In practice, an (unknown) portion of migrating bands in A and B will be random from another minisatellite site, and thus the mean allele frequency and homozygosity calculations are maximal and depend on the electrophoretic resolution of minisatellite fragments.
Die in Tabelle 1 gezeigten Wahrscheinlichkeiten beziehen sich auf die gezeigten individuellen Größenfragmente von DNA. Um eine sich auf den am besten leserlichen Teil des Erkennungszeichens (fingerprint) beziehende Gesamtwahrscheinlichkeit, d. h. gesamte DNA mit einer Größe über4KB, zu erhalten, müssen die drei Figuren zusammengenommen werden. So beträgt beispielsweise die mittlere Wahrscheinlichkeit, daß alle von der Sonde 33,15 in Individuum A entdeckten Fragmente auch in B vorhanden sind, 0,082·9 χ 0,205·1 x 0,2767 = 3 x 10"11. Die Wahrscheinlichkeit, daß alle durch beide Sonden 33,15 und 33,6 in A entdeckten Fragmente auch in B vorhanden sind, beträgt 5 χ 10~19.The probabilities shown in Table 1 relate to the individual size fragments of DNA shown. In order to obtain a total probability related to the most legible part of the fingerprint, ie, total DNA larger than 4KB, the three figures must be taken together. For example, the average probability that all fragments detected by probe 33, 15 in individual A are also present in B is 0.08 2 × 9 × 0.20 5 × 1 × 0.27 × 67 = 3 × 10 -11 The probability that all fragments discovered in A by both probes 33,15 and 33,6 are also present in B is 5 χ 10 ~ 19 .
Ähnlichkeiten von Erkennungszeichen (fingerprints) zwischen beliebigen Paaren von IndividuenSimilarities of fingerprints between arbitrary pairs of individuals
In diesem Beispiel wird die somatische Stabilität von DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) und deren Anwendung beim Vaterschaftsnachweis erläutert.This example explains the somatic stability of DNA fingerprints and their use in paternity testing.
Durch EB-Virus transformierte und in flüssigem Stickstoff aufbewahrte Lymphoblastoidzellreihen wurden nach 2 Jahren in flüssiger Kultur wiederhergestellt. Diese gezüchteten Lymphozyten wurden zweimal in normaler Salzlösung gewaschen; DNA von dem Lymphozyt-Pellet und von weißen Blutkörperchen wurde nach der Beschreibung von A.J.Jeffreys, Cell 18, (1979) vorbereitet. Sperma-DNA wurde in ähnlicher Weise gewonnen, nur wurde das von Samen gewonnene Sperma mit 1M2-Mercaptoethanol 5 Minuten lang bei Raumtemperatur vor der Lysis mit SDS behandelt. DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) wurden nach der Beschreibung in Beispiel 3 hergestellt, wobei 5-Mikrogramm-Proben von mit Hinfl digerierter und mit Sonde 33,6 (a) oder 33,15 (b) hybridisierter DNA verwendet wurden.EBV-transformed lymphocyte cell lines stored in liquid nitrogen were reconstituted after 2 years in liquid culture. These cultured lymphocytes were washed twice in normal saline; DNA from the lymphocyte pellet and white blood cells was prepared as described by A. J. Jeffreys, Cell 18, (1979). Sperm DNA was recovered in a similar manner except that semen collected from semen was treated with 1M2-mercaptoethanol for 5 minutes at room temperature before lysis with SDS. DNA labels (fingerprints) were prepared as described in Example 3 using 5 microgram samples of DNA hybridized with and digested with probe 33.6 (a) or 33.15 (b).
In diesem Beispiel wird die Verwendung einer erfindungsgemäßen Sonde für den Nachweis stark polymorpher Regionen in der DNA verschiedener Vertebraten erläutert.This example illustrates the use of a probe according to the invention for the detection of highly polymorphic regions in the DNA of various vertebrates.
DNA-Proben wurden aus von Hühnern, Sperlingen und Turmfalken entnommenem Blut, von der Leber von Kaninchen und Mäusen, von Human-Plazehtas und von den ausgeweideten Kadavern von Fröschen und Fischen hergestellt. 8-Aig-Proben von DNA wurden mit Hinfl digeriert, jedoch nicht die Hühner-DNA, die mitHaelll digeriert wurde. Die Restriktions-Digests wurden durch ein 0,6%iges Agarosegel elektrophoresiert, denaturiert, auf ein Sartorius-Nitrozellulosefilter übertragen und wie oben beschrieben mit der Human-Minisatellitensonde 33,15 hybridisiert. Der Hybridisierungsvorgang erfolgt bei 65°C in 1 χ SSC. Die Ergebnisse von den folgenden Proben gehen aus Fig. 5 hervor:DNA samples were prepared from blood drawn from chickens, sparrows, and kestrels, from the rabbit and mouse liver, from human placehtas, and from the gutted cadavers of frogs and fish. 8-Aig samples of DNA were digested with Hinfl, but not the chicken DNA digested with Haelll. Restriction digests were electrophoresed through a 0.6% agarose gel, denatured, transferred to a Sartorius nitrocellulose filter and hybridized to the human minisatellite probe 33,15 as described above. The hybridization process is carried out at 65 ° C in 1 χ SSC. The results of the following samples are shown in Fig. 5:
1,2: nicht-verwandte Human-Plazenta-DNA1,2: unrelated human placental DNA
3: Kaninchen-DNA, von einer FrHybride von Alaska- und Weißen Wiener-Rassen3: rabbit DNA, from a F r hybrids of Alaska and White breeds Wiener
4: Kaninchen-DNA der Alaska-Rasse4: Alaskan rabbit DNA
5,6: Mäuse (Mus musculus) DNA: von zwei im Freien gefangenen griechischen Mäusen5.6: Mice (Mus musculus) DNA: from two Greek mice caught outdoors
7: Mäuse (Mus musculus) DNA: vom durch Inzucht erzeugten Stamm DBA-27: Mice (Mus musculus) DNA: from inbred strain DBA-2
8: Mäuse (Mus musculus) DNA: vom durch Inzucht erzeugten Stamm C57/BL108: Mice (Mus musculus) DNA: from inbred strain C57 / BL10
9,10: ' Hühner-DNA: NB die DNA wurde mitHaelll digeriert9,10: 'Chicken DNA: NB the DNA was digested with Haelll
11,12: Sperling-DNA11:12: Sperling DNA
13,14,15: Turmfalken-DNA13,14,15: Kestrel DNA
16,17: Frosch (Xenopus tropicalis) DNA16,17: Frog (Xenopus tropicalis) DNA
18,19: Elritzen-DNA.18:19: minnows DNA.
Wie man feststellen kann, wurden erfolgreiche variable DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von fast allen getesteten Vertebraten gewonnen, und sie sind offensichtlich ebenso informativ wie die Human-DNA-Erkennungszeichen (fingerprints).As you can see, successful variable fingerprint fingerprints have been obtained from almost all vertebrates tested, and they are obviously as informative as the human DNA fingerprints.
Die mit Hinfl gespaltene Hühner-DNA erzeugte gleichfalls eine sehr komplizierte, allerdings weniger intensive Verschmierung von hybridisierender DNA (nicht gezeigt). Durch Digestion mit Hae11 wurde diese Verschmierung jedoch beseitigt und ein sauberes polymorphes Erkennungszeichen (fingerprint)-Muster erzielt.The Hinfl-digested chicken DNA also produced a very complicated but less intense smearing of hybridizing DNA (not shown). By digesting with Hae11, however, this smear was eliminated and a clean polymorphic fingerprint pattern was achieved.
Die beiden durch Inzucht gewonnenen Mäusestämme haben einfachere Erkennungszeichen (fingerprints) als die im Freien gefangenen Mäuse. Das war zu erwarten, weil die meisten hypervariablen Minisatellitenstellen bei der Wildform heterozygot, aber homozygot bei Züchtung sein werden, wodurch die Anzahl der hybridisierenden DNA-Fragmente bei gezüchteten Stämmen halbiert wird.The two inbred mouse strains have simpler fingerprints than the mice caught outdoors. This was to be expected because most hypervariable minisatellite sites in the wild-type will be heterozygous but homozygous in culture, halving the number of hybridizing DNA fragments in cultured strains.
In den folgenden Beispielen wird die Anwendung bestimmter oben beschriebener Sonden weiter erklärt.The following examples further explain the use of certain probes described above.
Darin wird die Anwendung der DNA-Erkennungszeichen (fingerprint)-Analyse in einem Einwanderungsfall beschrieben, dessen Lösung mit herkömmlichen genetischen Methoden sehr schwierig, wenn nicht unmöglich gewesen wäre.It describes the application of DNA fingerprint analysis in an immigration case, which would have been very difficult, if not impossible, to solve using conventional genetic methods.
Der Fall betraf einen ghanesischen Jungen, der im Vereinigten Königreich geboren war und nach Ghana zur Wiedervereinigung mit seinem Vater emigrierte und anschließend allein in das Vereinigte Königreich zurückkehrte, um wieder mit seiner Mutter, seinem Bruder und zwei Schwestern zusammenzuleben.The case involved a Ghanaian boy born in the United Kingdom who emigrated to Ghana for reunion with his father and then returned to the United Kingdom alone to reunite with his mother, brother and two sisters.
Es lagen aber Anzeichen für die Vermutung vor, daß ein Austausch stattgefunden hatte, entweder gegen einen nicht verwandten Jungen oder einen Sohn einer der Schwestern der Mutter, von denen alle in Ghana lebten. Infolgedessen erhielt der zurückgekehrte Junge keine Aufenthaltsgenehmigung für das Vereinigte Königreich. Auf Veranlassung des Rechtsanwaltes der Familie wurde eine Analyse zur Bestimmung der Vaterschaft des Jungen durchgeführt. Der Fall wurde doch dadurch kompliziert,However, there were indications that an exchange had taken place, either against an unrelated boy or a son of one of the mother's sisters, all of whom lived in Ghana. As a result, the returned boy did not receive a residence permit for the United Kingdom. At the instigation of the family lawyer, an analysis was made to determine the paternity of the boy. The case was complicated by
daß weder der Vater noch irgendeine der Schwestern der Mutter für die Analyse zur Verfügung standen. Dazu kam, daß die Mutter, obwohl sie überzeugt war, daß es sich bei dem Jungen um ihren Sohn handelte, nicht sicher über die Vaterschaft war. DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von Blut-DNA-Proben, die von den zur Verfügung stehenden Mitgliedern der Familie (der Mutter M, dem Bruder B und den Schwestern S1 und S 2 sowie dem betreffenden Jungen X) entnommen wurden, wurden daher durch Southern-Tüpfel-Hybridisierung auf zwei oben beschriebene Minisatellitensonden 33,6 und 33,15, von denen jede eine andere Gruppe von hypervariablen Minisatelliten in Human-DNA nachweist, hergestellt.that neither the father nor any of the mother's sisters were available for analysis. In addition, although the mother was convinced that the boy was her son, the mother was not sure about the paternity. Fingerprints of blood DNA samples taken from the available members of the family (Mother M, Brother B and Sisters S1 and S 2 and the subject Boy X) were therefore obtained by Southern Spot hybridization to two minisatellite probes 33,6 and 33,15 described above, each of which detects a different set of hypervariable minisatellites in human DNA.
8-;u.g-Proben von Blut-DNA von der Mutter (M), dem fraglichen Jungen (X), seinem Bruder (B), den Schwestern (S 1 und S 2) und einer nicht-verwandten Person (U) wurden mit Hinfl digeriert, durch ein 0,7%iges Agarosegel elektrophoresiert und durch Southem-Tüpfeln auf die Sonden hybridisiert. Die Autoradiogramme sind in Fig. 6 zu sehen. In den DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) der Mutter (M) vorhandene Fragmente sind durch eine kurze horizontale Linie gekennzeichnet; bei M fehlende, aber in mindestens einem der zweifelsfreien Verwandten (B, S1, S 2) vorhandene väterliche Fragmente sind mit einem langen Strich markiert. "Mütterliche" und väterliche auf X übertragene Fragmente sind durch einen Punkt gekennzeichnet. Die DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von X enthalten keine zusätzlichen aufgelösten Fragmente. Alle Fragmente wurden von den Originalautoradiogrammen, die mit verschiedenen Belichtungen angefertigt worden waren, bewertet; teilweise aufgelöste schwächere Bänder, vor allem zur Unterseite des Gels hin, die nicht zuverlässig bewertet werden konnten, wurden ignoriert. Der erste Sch ritt bestand in der Feststellung der Vaterschaft von X aus den Mustern hypervariabler Fragmente. Obwohl der Vater nicht zur Verfügung stand, konnten die meisten seiner DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von vaterspezifischen DNA-Fragmenten, die in mindestens einem der drei nicht angezweifelten Familienmitglieder (B, S1, S2) vorhanden waren, aber bei M fehlten, rekonstruiert werden. Von den auf diese Weise identifizierten 39 Vaterfragmenten war etwa die Hälfte in den DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von X vorhanden. Da DNA-Fragmente selten auf die DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von nicht-verwandten Personen verteilt sind (siehe Person U in Fig. 6), führt das unbedingt zu dem Schluß, daß X den gleichen Vater wie B, S1 und S 2 hat. Nach Abzug dieser vaterspezifischen DNA-Fragmente blieben 40 Fragmente bei X, von denen alle bei M vorhanden waren. Das ist wieder ein klarer Beweis, daß M die Mutter von X ist, und daß somit X, B, S1 und S2 echte Geschwister sind.8 μg samples of blood DNA from the mother (M), the boy in question (X), his brother (B), the sisters (S 1 and S 2) and an unrelated person (U) were included Finished, electrophoresed through a 0.7% agarose gel and hybridized to the probes by Southern spotting. The autoradiograms are shown in FIG. Fragments present in DNA (fingerprint) tags of the mother (M) are indicated by a short horizontal line; missing paternal fragments present in at least one of the unquestionable relatives (B, S1, S 2) are marked with a long dash. "Maternal" and paternal fragments transmitted on X are indicated by a dot. The fingerprints of X do not contain additional fragments. All fragments were scored from the original autoradiograms made with different exposures; partially resolved weaker bands, especially towards the bottom of the gel, which could not be reliably evaluated, were ignored. The first step was to establish the paternity of X from the patterns of hypervariable fragments. Although the father was unavailable, most of his fingerprints could be reconstructed from paternal-specific DNA fragments present in at least one of the three undoubted family members (B, S1, S2) but missing from M , Of the 39 father fragments identified in this way, about half were present in X's DNA fingerprint markers. Since DNA fragments are rarely distributed to the DNA labels (fingerprints) of unrelated persons (see person U in Fig. 6), this necessarily leads to the conclusion that X has the same parent as B, S1 and S2 , After deducting these paternal-specific DNA fragments, 40 fragments remained at X, all of which were present at M. This again is clear proof that M is the mother of X, and thus X, B, S1, and S2 are real siblings.
Es wurde oben gezeigt, daß die mittlere Wahrscheinlichkeit, daß ein Fragment in einem DNA-Erkennungszeichen (fingerprint) einer Person in einem zweiten willkürlich ausgewählten Individuum vorhanden ist, annähernd 0,2 bei Nordeuropäern beträgt. Die entsprechende Schätzung für den Vater und M ist 0,26, ein Zeichen, daß die DNA-Erkennungszeichen-Variabilität bei diesen Ghanesen sich nicht wesentlich von der von Nordeuropäern unterscheidet. Bei den folgenden Wahrscheinlichkeitsberechnungen wird die überaus konservative Annahme gemacht, daß alle Bänder mit einer einheitlichen Wahrscheinlichkeit von 0,26 (Quantelung folgt) aufgeteilt sind.It has been shown above that the mean probability that a fragment is present in a person's DNA recognition mark (fingerprint) in a second arbitrarily selected individual is approximately 0.2 in Northern Europeans. The corresponding estimate for the father and M is 0.26, an indication that the DNA tag variability in these genes is not significantly different from that of Northern Europeans. In the following probability calculations, the most conservative assumption is made that all bands are divided with a uniform probability of 0.26 (following quantization).
Die erste Frage ist, ob X mit dieser Familie verwandt ist. Die DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von X enthalten 61 bewertbare Fragmente, von denen alle bei M und/oder dem Vater vorhanden sind. Wenn X nicht verwandt ist, dann beträgt die Wahrscheinlichkeit, daß jedes seiner Bänder bei diesen Eltern vorhanden ist, 1-(1 - 0,26)2 = 0,45; die Wahrscheinlichkeit, daß M und/oder der Vater zufällig alle 61 der Bänder von X besitzen, ist daher'0,4561 = 7 χ 10"22. X ist eindeutig mit dieser Familie verwandt.The first question is whether X is related to this family. X's fingerprint tags contain 61 assessable fragments, all of which are present at M and / or the parent. If X is not related then the probability of each of its bands being present in these parents is 1- (1 - 0.26) 2 = 0.45; the probability that M and / or the father happens to have all 61 of the bands of X is therefore 0.45 61 = 7 χ 10 22. 22 X is clearly related to this family.
Das nächste Problem ist, ob eine nicht-verwandte Frau, und nicht M, die Mutter von X sein könnte. Die DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von X enthalten 40 „mütterliche" Fragmente, von denen wir annehmen, daß —25 speziell von der Mutter vererbt worden sind; die restlichen Fragmente verteilen sich auf die Mutter und den Vater und können daher nicht verwendet werden, um den Beweis für die Mutterschaft von M zu erbringen. Alle 25 mutterspezifischen Fragmente in X sind in M vorhanden. Die Chance, daß M nicht verwandt ist mit X, aber zufällig alle 25 Fragmente besitzt, beträgt daher 0,2625 = 2 χ 10~15. Daher müssen X und M verwandt sein.The next problem is whether an unrelated woman, and not M, could be the mother of X. The X fingerprints of X contain 40 "maternal" fragments, of which we assume that -25 were specifically inherited from the mother, the remaining fragments being distributed to the mother and father, and therefore can not be used to prove the maternity of M. All 25 parent-specific fragments in X are present in M. The chance that M is not related to X, but has all 25 fragments at random, is therefore 0.26 25 = 2 χ 10 ~ 15 Therefore, X and M must be related.
Das letzte und schwierigste Problem ist, ob die Schwester von M, die für die Analyse nicht zur Verfügung stand, die Mutter von X sein könnte (der Vater müßte natürlich der Ehemann von M sein). Wenn Bänder auf wahllose Personen mjt einer mittleren Wahrscheinlichkeit von 0>26 verteilt sind^dann ist die entsprechende Chance, daß ein Fragment in einem Individuum auch bei einem Verwandten vorhanden ist, 0,62. Die Möglichkeiten, daß M die Schwester von X's echter Mutter ist und zufällig alle 25 mutterspezifischen Bänder von X enthält, betragen daherO,6225 = 3 x 10~6. Wirziehen daherüber jeden echtenZweifel erhaben die Schlußfolgerung, daß M die echte Mutter von X sein muß. Dieser Beweis wurde den Einwanderungsbehörden vorgelegt, die den Fall gegen X einstellten und ihm den Aufenthalt im Vereinigten Königreich und das Zusammensein mit seiner Familie erlaubten.The last and most difficult problem is whether M's sister, who was not available for analysis, could be the mother of X (of course the father would have to be M's husband). If bands on indiscriminate individuals are distributed with an average probability of 0> 26, then the corresponding chance that a fragment exists in an individual even in a relative is 0.62. The possibilities that M is the sister of X's true mother and by chance contains all 25 native specific bands of X amount dahero, 62 25 = 3 x 10 ~ 6th Therefore, beyond any real doubt, we draw the conclusion that M must be the real mother of X. This evidence was presented to the immigration authorities, who closed the case against X, allowing him to stay in the UK and get together with his family.
Dieser schwierige Fall zeigt, wie DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) einen eindeutigen positiven Beweis für Verwandschaftsverhältnisse liefern können, selbst in einigen Fällen, in denen kritische Familienmitglieder fehlen. Der vorliegende Fall wurde durch die Tatsache vereinfacht, daß X den gleichen Vater wie seine Geschwister hatte, und daß sein Vater keine Bänder ausschließlich auf X übertragen hat (im DurchschnittwürdeVie der väterlichen Bänder so übertragen sein). Solche X-einzigartigen Fragmente würden, obwohl sie offensichtlich den Beweis für die Verwandtschaft zwischen X und M abschwächen, in der Praxis die Analyse nicht unbedingt in Frage stellen. Es wäre unwahrscheinlich, daß X mehr als 5 derartige väterliche Fragmente außer den 25 mutterspezifischen haben wird. Die Möglichkeiten, daß mindestens 25 von 30 spezifizierten Bändern zufällig bei X und M, wenn sie nicht verwandt sind, oder wenn M die Tante von X wäre, gleich sind, betragen 8 χ 10"11 bzw. 9 χ 1Q~3. Diese Analyse ist daher stichhaltig und würdein den meisten Fällen einen klaren Beweis für oder gegen eine behauptete Verwandtschaft liefern. Ungewöhnlich ist es natürlich, daß alle relevanten Mitglieder einer Familie zur Verfugung stehen werden, zum Beispiel bei Vaterschaftsstreitigkeiten oder bei Familien, die Schwierigkeiten hinsichtlich der Wiedervereinigung bei Einwanderung haben; DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) werden fast immer in der Lage sein, solche Probleme zu lösen.This difficult case shows how DNA fingerprints can provide clear positive evidence for relationships, even in some cases where critical family members are missing. The present case was simplified by the fact that X had the same father as his siblings, and that his father did not transmit any tapes exclusively to X (on average, the paternal tapes would be so transferred). Such X-unique fragments, although apparently weakening the evidence for the relationship between X and M, would not necessarily challenge the analysis in practice. It would be unlikely that X would have more than 5 such paternal fragments other than the 25 parent-specific ones. The possibilities that at least 25 out of 30 specified bands are coincidental at X and M when they are not related, or when M is the apex of X, are 8 χ 10 " 11 and 9 χ 1Q ~ 3, respectively is therefore valid and in most cases would provide clear evidence for or against alleged kinship It is unusual, of course, for all the relevant members of a family to be available, for example in paternity or family disputes, the difficulties of reunification on immigration DNA-markers (fingerprints) will almost always be able to solve such problems.
Quantelung von DNA-Erkennungszeichen (fingerprints)Quantization of DNA labels (fingerprints)
61 DNA-FragmentewurdenbeiM bewertet und mit 39 Fragmenten, die speziell vom Vater vererbt worden waren, verglichen, Vs der heterozygoten DNA-Fragmente des Vaters werden nicht auf B, S1 oder S 2 übertragen, und somit ergibt die korrigierte Berechnung für die Anzahl von vaterspezifischen Fragmenten 39 χ ah = 45. Da die Gesamtanzahl von Fragmenten in den DNA-Erkennungszeichen von M und von dem Vater annähernd gleich sein müßte, beträgt dann die Anzahl von Fragmenten in M, die der Vater auch besitzt ~ (61 - 45) = 16. Die mittlere Wahrscheinlichkeit der Bandverteilung (x) auf M und den Vater beträgt daher 1β/βι = 0,26, was mit früheren Berechnungen übereinstimmt, die vom Screenen einer Stichprobe von Nordeuropäern erhalten wurden (x = 0,2, Lit. 2).61 DNA fragments were scored at M and compared with 39 fragments specifically inherited from the father, Vs of the father's heterozygous DNA fragments are not transferred to B, S1 or S 2, and thus the corrected calculation for the number of father-specific Fragments 39 χ a h = 45. Since the total number of fragments in the DNA labels of M and the father should be approximately equal, then the number of fragments in M which the father also possesses is ~ (61 - 45) = 16. The mean probability of band distribution (x) on M and the father is therefore 1β / βι = 0.26, which is consistent with previous calculations obtained from screening a sample of Northern Europeans (x = 0.2, ref. 2) ).
Annähernd die Hälfte der 45 Vaterbänder wurden auf B, S1 und S 2 (18,24 bzw. 18) übertragen, wie für heterozygote Bänder zu erwarten war. Von den 61 Bändern in M war mehr als die Hälfte auf B, S1 und S 2 (32, 38 bzw. 39, Mittel = 36,3) vererbt worden, wie zu erwarten war, weil einige der Bänder von M auch der Vater haben wird und daher auf die meisten oder alle Kinder übertragen werden. Wenn die DNA-Erkennungszeichen von M η verteilte, auf alle Kinder übertragene Bänder enthalten, plus (61-n)heterozygote,aufdie Hälfte der Kinder übertagene Bänder, dann gilt η + 0,5(61 - η) = 36,3,weshalbn = 12,wasmitder Berechnung von 16 bei Mund dem Vater gemeinsamen vorhandenen Bändern übereinstimmt (siehe oben). Die DNA-Erkennungszeichen von X bestehen aus 21 vaterspezifischen Fragmenten plus 40 auch bei M vorhandenen Bändern. Der Anteil der letzteren Bänder, die mutterspezifisch sind und beim Vater nicht vorhanden sind, kann auf zwei Wegen berechnet werden. Erstens sollte die Anzahl der mutterspezifischen Bänder etwa gleich der für den Vater spezifischen Anzahl sein, das bedeutet 45/2 = 22,5. Zweitens η (—12) der 40 mütterlichen Bänder in X werden verteilte Mutter/Vater-Bänder sein (siehe oben), so daß 28 mutterspezifische Bänder in X übrigbleiben. Die Anzahl von Fragmenten, die X speziell von seiner Mutter erworben hat, beträgt daher ~25.Approximately half of the 45 father bands were transferred to B, S1, and S 2 (18,24 and 18, respectively) as expected for heterozygous bands. Of the 61 bands in M, more than half had been inherited to B, S1, and S 2 (32, 38, and 39, average = 36.3), as was to be expected, because some of the bands of M also have the father will be transferred to most or all children. If the DNA labels of M η contain distributed bands transmitted to all children, plus (61-n) heterozygous bands transmitted to half of the children, then η + 0.5 (61-η) = 36.3, therefore = 12, which coincides with the calculation of 16 bands common to the patient's mouth (see above). The DNA tags of X consist of 21 paternal-specific fragments plus 40 bands also present at M. The proportion of the latter bands, which are specific to the mother and are not present in the father, can be calculated in two ways. First, the number of parent-specific bands should be approximately equal to the number specific to the father, that is, 45/2 = 22.5. Second, η (-12) of the 40 maternal bands in X will be distributed parent / father bands (see above), leaving 28 parent-specific bands in X. The number of fragments that X acquired specifically from his mother is therefore ~ 25.
Wahrscheinlichkeit von Bandaufteilung: Die mittlere Wahrscheinlichkeit, daß einem Fragment in einem Individuum ein Band mit ähnlicher elektrophoretischer Mobilität und autoradiographischer Intensität in einer zweiten Stichprobenperson gleicht, wird als χ (x = 0,2 — 0,26, siehe oben) definiert. Größere Minisatellitenfragmente sind weniger häufig aufgeteilt, vermutlich infolge geringerer Allel-Häufigkeiten und besserer elektrophoretischer Auflösung, und somit ist die Fragment-Aufteilungs-Wahrscheinlichkeit χ heterogen. Weil fast alle Fragmente unabhängig vererbt werden, beträgt daher die maximale Wahrscheinlichkeit, daß alle η Fragmente in einem Individuum in einem zweiten Stichprobenindividuum vorhanden sind, xn; jegliche Heterogenität in χ wird diese Wahrscheinlichkeit herabsetzen.Probability of Band Division: The average probability that a fragment in one individual will resemble a band with similar electrophoretic mobility and autoradiographic intensity in a second sample subject is defined as χ (x = 0.2-0.26, supra). Larger minisatellite fragments are less frequently partitioned, presumably due to lower allele frequencies and better electrophoretic resolution, and thus fragment fragmentation probability χ is heterogeneous. Because almost all fragments are inherited independently, therefore, the maximum probability that all η fragments in an individual are present in a second sample individual is x n ; any heterogeneity in χ will reduce this probability.
Bandaufteilung zwischen Geschwistern: Wenn aufgeteilte Bänder immer identische AIIeIe der gleichen hypervariablen Stelle darstellen, dann steht χ mit der mittleren Allelhäufigkeitq durch χ = 2q — p2in Beziehung, somit kann gezeigt werden, daß die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Band in einem Individuum ebenfalls in seinen oder ihren Geschwistern vorhanden ist, (4 + 5q - 6q2 + q3)/4(2-q) beträgt.Band sharing between siblings: If split bands always represent identical alleles of the same hypervariable position, then χ is related to the mean allele frequency q by χ = 2q - p 2 , thus it can be shown that the probability that a given band in an individual will also be is present in his or her siblings (4 + 5q - 6q 2 + q 3 ) / 4 (2-q).
Für χ = 0,26 beträgt q0,14, und der erwartete Anteil von in einem ersten Verwandten vorhandenen Bändern, die durch eine Aufzeichnung verteilt sind, ist 0,62. Diese Wahrscheinlichkeit wird etwas verringert, wenn stattdessen angenommen wird, daß auf Stichprobenpersonen verteilte Bänder niemals identische AIIeIe sind, das heißt, daß viele Minisatelliten AIIeIe der gleichen Größe besitzen.For χ = 0.26, q is 0.14, and the expected proportion of bands present in a first relative distributed through a record is 0.62. This probability is somewhat reduced if, instead, it is assumed that bands distributed to samplers are never identical allies, that is, many minisatellites are all of the same size.
Um die Möglichkeit der Verwendung von DNA-Erkennungszeichen für die Kopplungsanalyse bei Menschen, insbesondere für die Suche nach hypervariablen DNA-Fragmenten, die mit der Krankheitsstelle bei großen Ahnenreihen cosegregieren, bestimmen zu können, wurden die DNA-Erkennungszeichen von zwei großen Familien untersucht, von denen eines für Neurofibromatose und das andere für erbliche Persistenz von Fetushämoglobin segregiert, die anscheinend durch ein Autosomominantgen, das nicht an das /3-Globingenbüschel gekoppelt ist, bestimmt werden.In order to determine the possibility of using DNA recognition labels for human linkage analysis, particularly for the search for hypervariable DNA fragments that cosegregate with the disease site in large progenitor lines, the DNA recognition characters of two large families were investigated, from one segregates for neurofibromatosis and the other for hereditary persistence of fetal hemoglobin, which appears to be determined by an auto-dominant antigen not coupled to the / 3 globule cluster.
Segretation von hypervariablen Minisatellitenfragmenten in den DNA-Erkennungszeichen einer an Neurofibromatose leidenden FamilienSegregation of hypervariable minisatellite fragments in the DNA recognition mark of a family suffering from neurofibromatosis
Mit Hinfl digerierte Blut-DNA-Proben wurden auf einem 35cm langen 0,7%igen Agarosegel elektrqphoresiert und durch Southern-Tüpfeln auf Minisatellitensonden 33,6 und 33,15 hybridisiert. DNA-Erkennungszeichen werden in Fig.7 für den nicht befallenen Vater (F), 5 Söhne (S) und 6Töchter (D) gezeigt; die befallene Mutter stand für die Untersuchung nicht zur Verfugung. An multiplen Neurofibromen leidende Nachkommen sind durch (+) gekennzeichnet; die übrigen Nachkommen zeigen keine Anzeichen von Neurofibromatose. Aufgelöste väterliche (O) und mütterliche (O) heterozygote DNA-Fragmente sind gekennzeichnet, und ihre Segregation in Nachkommen wurde direkt von mit kurzen, mittleren und langen Belichtungszeiten aufgenommenen Autoradiogrammen bewertet. Es wurden nur diejenigen DNA-Fragmente bewertet, deren Positionen und relative Intensitäten in jedem Nachkommen mit denen der Eltern übereinstimmten. Gekoppelte Paare AB von DNA-Fragmenten, die AB oder — in Nachkommen segregieren, sind durch eine durchgehende Linie verbunden; AIIeIe, die A- und -B segregieren, sind durch gestrichelte Linien verbunden. Ein mütterliches Fragment, das Anzeichenfür Kopplung in Verbindung mit Neurofibromatose zeigt, ist mit einem Sternchen markiert; alle sechs befallenen Nachkommen haben dieses Fragment geerbt, und vier von fünf nichtbefallenen Kindern haben dieses Band nicht, so daß sich eine Übereinstimmung von 10/n zwischen Vererbung dieses Bandes und Neurofibromatose ergibt.Supplemented blood DNA samples were electrophoresed on a 35cm 0.7% agarose gel and hybridized by Southern spotting on minisatellite probes 33.6 and 33.15. DNA labels are shown in Figure 7 for unaffected father (F), 5 sons (S) and 6 daughters (D); the afflicted mother was not available for the examination. Offspring suffering from multiple neurofibromas are indicated by (+); the remaining offspring show no signs of neurofibromatosis. Resolved paternal (O) and maternal (O) heterozygous DNA fragments are characterized and their segregation in offspring was assessed directly from autoradiograms taken with short, medium and long exposure times. Only those DNA fragments were evaluated whose positions and relative intensities in each offspring matched those of the parents. Coupled pairs AB of DNA fragments that segregate AB or - in offspring are connected by a solid line; All that segregate A and B are connected by dashed lines. A maternal fragment showing signs of coupling in association with neurofibromatosis is marked with an asterisk; all six affected offspring have inherited this fragment, and four out of five unaffected children do not have this band, so there is a 10 / n match between inheritance of this band and neurofibromatosis.
Stoffe und Methoden DNA-Isolierung 'Substances and Methods DNA Isolation '
Frisches Blut wurde mit einem gleichen Volumen von 1 χ SSC(SSC, Kochsalz-Natriumcitrat, 0,15 M NaCI, 15mM Trinatriumcitrat, pH-Wert 7,0) verdünnt, auf Histopaque-1077 (Sigma) aufgetragen, und kemhaltige Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt. Alternativ wurde gefrostetes Blut in 2VoI. 1 χ SSC aufgetaut und kemhaltige Zellen plus Kern 15 Minuten durch Zentrifugieren mit 10000 g pelletisiert. Hochmolekulare DNA wurde wie von Jeffreys, A. J. (1979), Cell 18,1-10, beschrieben hergestellt.Fresh blood was diluted with an equal volume of 1 χ SSC (SSC, saline sodium citrate, 0.15 M NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0), applied to Histopaque-1077 (Sigma), and nucleated cells were passed through Collected centrifuging. Alternatively, frozen blood was in 2VoI. 1 χ SSC thawed and nucleated cells plus core pelleted by centrifugation at 10,000 g for 15 minutes. High molecular weight DNA was prepared as described by Jeffreys, A.J. (1979), Cell 18,1-10.
5-jU.g-Proben von Human-DNA wurden mit 20 Einheiten Hinfl in Gegenwart von 4mM Spermidintrichlorid 2 Stunden lang bei 37°C digeriert und durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation zurückgewonnen. Restriktionsdigests wurden in 16μΙ H2O plus 4μΙ Gelfüllmischung (12,5% Ficoll 400, 0,2% Bromphenolblau, 0,2 M Trisacetat, 0,1 M Na-Acetat, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,3) und 2/nl 5mg/ml Ethidiumbromid gelöst und auf ein horizontales Agarosegel gegeben (0,7% Sigma Typ I Agarose in 4OmM Trisacetat, 2OmM Na-Acetat, 0,2 mM EDTA, 0,5^g/ml Ethidiumbromid (pH-Wert 8,3); Gele 0,7 cm dick und 20 oder 35cm lang). Nach einer Äquilibrierungszeit von 10 Minuten wurden die Gele 24 bis 48 h lang mit 2 V/cm elektrophoresiert, bis alle weniger als 1,5 KB langen DNA-Fragmente von dem Gel abelektrophoresiert waren. DNA wurde durch Auftröpfeln auf ein Nitrozellulosefilter (Sartorius, 0,45μΐη Porengröße) übertragen. 32P-markierte einsträngige Sonden-DNA wurde von den Humanminisatelliten M13-Rekombinanten 33,6 und 33,15 hergestellt zu Southern Tupfen in 1 χ SSC bei 650C hybridisiert und wie in der Hauptanmeldung beschrieben, autoradiographiert.5μU.g samples of human DNA were digested with 20 units of Hinfl in the presence of 4mM spermidine trichloride for 2 hours at 37 ° C and recovered by phenol extraction and ethanol precipitation. Restriction digests were performed in 16μΙ H 2 O plus 4μΙ gel-filled mixture (12.5% Ficoll 400, 0.2% bromophenol blue, 0.2M tris-acetate, 0.1M Na-acetate, 1mM EDTA, pH 8.3) and 2 / nl 5mg / ml ethidium bromide dissolved and placed on a horizontal agarose gel (0.7% Sigma type I agarose in 4OmM tris acetate, 2OmM Na-acetate, 0.2 mM EDTA, 0.5 ^ g / ml ethidium bromide (pH 8,3), gels 0,7 cm thick and 20 or 35cm long). After a 10 minute equilibration period, the gels were electrophoresed at 2V / cm for 24 to 48 hours until all less than 1.5KB DNA fragments were electrophoresed from the gel. DNA was transferred by licking onto a nitrocellulose filter (Sartorius, 0.45μΐη pore size). 32 P-labeled single-stranded probe DNA was 33.6 and 33.15 produced by the human minisatellite M13 recombinants to Southern spots hybridized at 65 0 C in 1 χ SSC and as described in the parent application, autoradiographed.
Die Speicherung von Segregationsdaten und die Analyse der Kopplung wurden auf einem BBC-Mikrocomputer, Modell B, vorgenommen.The storage of segregation data and the analysis of the coupling were done on a BBC microcomputer, Model B.
Tabelle 3 enthält eine Zusammenstellung von Minisatellitenmarkierern in der Neurofibromatose-Familie.Table 3 contains a compilation of minisatellite markers in the neurofibromatosis family.
Vaterfather
Muttermother
Sonde:Probe:
33,633.6
33,1533,15
33,633.6
33,1533,15
Die Anzahl von unterschiedlichen bewerteten Stellen (c) wird durch n-a-b angegeben. Das gesamte DNA-Erkennungszeichen (fingerprint), das unaufgelöste und daher nicht bewertete Fragmente umfaßt, wird von N heterozygoten Stellen (2 N Fragmenten) gewonnen. Angenommen, daß die bewerteten (n-b) eindeutigen Fragmente eine Stichprobe der 2 N Bänder in einem DNA-Erkennungszeichen (fingerprint) sind, dann steht die berechnete Gesamtanzahl durch eine bestimmte Sonde entdeckter hypervariabler Stellen N mit der Anzahl allelomorpher Paare a in Beziehung durchThe number of different scored digits (c) is given by n-a-b. The entire DNA fingerprint, which comprises unresolved and therefore unevaluated fragments, is derived from N heterozygotic sites (2N fragments). Assuming that the weighted (n-b) fragments are a sample of the 2N bands in a DNA fingerprint, then the calculated total number of hypervariable sites N discovered by a particular probe will be related to the number of allelomorphic pairs a
(n-b) (n-b-1)(n-b) (n-b-1)
2a2a
+ 1+ 1
Tabelle 4: Segregation hypervariabler Fragmente in der Neurofibromatose-FamilieTable 4: Segregation of hypervariable fragments in the neurofibromatosis family
Zur Untersuchung der Übertragungshäufigkeit von hypervariablen Fragmenten (Fig.7) wurde die Anzahl von Fragmenten, die durch die Sonden 33,6 und 33,15 aus η bewerteten entdeckt wurden, die auf genau r Kinder in der Gruppe von 11 übertragen wurden, mit der erwarteten, durch die binomische VerteilungTo examine the frequency of transmission of hypervariable fragments (Fig. 7), the number of fragments detected by the probes 33,6 and 33,15 from η evaluated, which were transferred to exactly r children in the group of 11, was compared with the expected, by the binomial distribution
11Cr η ·· ^— bei einer angenommenen Übertragung von 50%, gegebenen Anzahl verglichen (Tabelle 4). In allen Kindern 11 Cr η ·· ^ - with an assumed transfer of 50%, given number compared (Table 4). In all children
vorhandene Fragmente können von homozygoten Stellen stammen und wurden ignoriert. Auf irgendeines der Kinder nicht übertragene mütterliche Fragmente konnten nicht bewertet werden, weil Mutter-DNA nicht zur Verfügung stand. Die durchschnittlichen Übertragungshäufigkeiten (+ S.E.M.) sind gleichfalls angeführt.Existing fragments may be homozygous sites and were ignored. Maternal fragments not transferred to any of the children could not be evaluated because maternal DNA was not available. The average transmission frequencies (+ S.E.M.) are also given.
Die Kopplung zwischen Fragmenten AB wurde durch Bewertung der Anzahl von Nachkommen, die für AB tendierten (entweder AB oder—) untersucht, wobei alle möglichen paarweisen Vergleiche von väterlichen oder mütterlichen Fragmenten angewandt wurden, die zuerst AIIeIe und gekoppelte Bänder ausgeschlossen hat (d. h. c Stellen wurden in jedem Elternteil analysiert, siehe Tabelle 3, wodurch sichThe coupling between fragments AB was assessed by evaluating the number of progeny that tended to be AB (either AB or -), using all possible pairwise comparisons of paternal or maternal fragments that had first excluded alleles and coupled bands (ie, c sites were analyzed in each parent, see Table 3, resulting in
c(c — 1) paarweise Vergleiche ergaben). Paare von Fragmenten, die in die Null- oder 11 -Kinder-Klassen fallen, stellen AIIeIec (c - 1) resulted in pairwise comparisons). Pairs of fragments that fall into the null or 11-child classes are all aII
bzw. eng gekoppelte Paare dar; nach Definition fallen keine Paare in beide Klassen. Die beobachtete Verteilung wird mit deror closely coupled pairs; by definition, no pairs fall into both classes. The observed distribution is with the
erwarteten verglichen, wenn alle c Stellen ungekoppelt sind (U), wobei die Anzahl von paarweisen Vergleichen, die genau r (AB oder—) Nachkommen ergeben, in diesem Fall durch die binomische Verteilung 11Cr eic — 1) —_ ! gegeben wird. Die Verteilung wird auch mit der erwarteten verglichen, wenn die c Stellen gebündelt und imexpected if all c digits are uncoupled (U), where the number of pairwise comparisons that yield exactly r (AB or) descendants, in this case by the binomial distribution 11 Cr eic - 1) -_! is given. The distribution is also compared with the expected when the c sites are bundled and in the
gleichen Abstand vorhanden sind, wobei die benachbarten Stellen durch eine Rekombinatfrequenz9 (10, 20 oder 3OcM auseinander) getrennt sind. Das Bündel wird daher über (c - 1) ψ Karteneinheiten verteilt sein, worin ψ= —1/21 η (1-2Θ). Füre Stellen (willkürlich an einem oder einem anderen AIIeI entnommen) wird die Anzahl von paarweisen Vergleichen, die genau r (AB und—) Nachkommen in der Gruppe von 11 ergeben, gegeben durch:are the same distance apart, with the adjacent sites separated by a recombination frequency 9 (10, 20 or 3OcM apart). The bundle is therefore (c - 1) be distributed ψ map units, where ψ = - 1/21 η (1-2Θ). For digits (taken arbitrarily at one or another allele), the number of pairwise comparisons that give exactly r (AB and -) offspring in the group of 11 is given by:
(c-i). "σ.(C-i). "Σ.
worin Xi die Rekombinationsfraktion zwischen zwei i Karteneinheiten auseinanderliegenden Stellen ist; x* wird durch die Eintragungsfunktionwherein Xi is the recombination fraction between two i map units apart; x * is determined by the entry function
χ, = V2(I -e"2"") gegeben.χ, = V 2 (I -e " 2 "").
Zwei bei den vorliegenden Untersuchungen verwendete Minisatelliten-Hybridisierungssonden werden ausführlich in der Hauptanmeldung beschrieben. Sonde 33,15 besteht aus einem geklonten Human-Minisatelliten, der sich aus 29 Wiederholungen einer 16-BP-Variante der Kernsequenz zusammensetzt. Die Wiederholeinheit des Minisatelliten in Sonde 33,6 ist ein divergiertes Trimer des am besten erhaltenen 11 -BP-3' Endes der Kernsequenz und wird 18mal wiederholt. Die Sequenzen des Kerns und der Sondenwiederholeinheit sind:Two minisatellite hybridization probes used in the present studies are described in detail in the parent application. Probe 33,15 consists of a cloned human minisatellite composed of 29 repeats of a 16-BP variant of the core sequence. The minisatellite repeat unit in probe 33.6 is a divergent trimer of the best-preserved 11 -BP-3 'end of the core sequence and is repeated 18 times. The sequences of the core and the probe repeating unit are:
A Kern GG AGGTGG GCAGGAGGA Core GG AGGTGG GCAGGAGG
33.15 AGAGGTGGGCAGGTGG33.15 AGAGGTGGGCAGGTGG
33.16 AGGGCTGGAGG33.16 AGGGCTGGAGG
Der Unterschied sowohl in der Sequenz als auch der Wiederhollänge der Sonden 33,6 und 33,15 resultiert in ihrer Entdeckung verschiedener Muster von langen hypervariablen Minisatellitenfragmenten in Hinfl-Digest von Human-DNA. Diese 4-BP-Restriktions-Endonuclease maximiert die Auflösung von variablen Minisatelliten durch die Freisetzung langer sich tandemartig wiederholender Minisatelliten in DNA-Fragmenten mit wenig flankierender DNA.The difference in both the sequence and the repeat length of probes 33,6 and 33,15 results in their discovery of various patterns of long hypervariable minisatellite fragments in Hinfl digest of human DNA. This 4-BP restriction endonuclease maximizes the resolution of variable minisatellites by releasing long, tandemly repeating minisatellites into DNA fragments with little flanking DNA.
Zur Untersuchung der Segregation individueller Minisatelliten-DNA-Fragmente, wurde eine große Gruppe"von 11 englischen Personen auf Neurofibromatose (von Recklinghausen-Krankheit), eine Autosomdominant-Störung in Verbindung mit Tumoren desperiphären und zentralen Nervensystems, segregiert. Bisher wurden noch keine genetischen Markierer mit dieser Krankheit gekoppelt.To study the segregation of individual minisatellite DNA fragments, a large group of 11 English individuals were segregated for neurofibromatosis (from Recklinghausen disease), an autosomal dominant disorder associated with tumors of the peripheral and central nervous system. So far, no genetic markers have been identified coupled with this disease.
Blut-DNA-Erkennzeichen (fingerprints), nachgewiesen durch die Sonden 33,6 und 33,15, der 11 Kinder (6 befallen, 5 nicht befallen) wurden mit ihrem nicht befallenen Vater in Fig. 7 verglichen. Die Auflösung von Minisatelliten-DNA-Fragmenten wurde durch Elektrophorese in 35cm langen Agarosegelen maximiert.Blood DNA tags (fingerprints), detected by probes 33,6 and 33,15, of 11 infants (6 infested, 5 unaffected) were compared with their unaffected father in FIG. The resolution of minisatellite DNA fragments was maximized by electrophoresis in 35cm long agarose gels.
Da viele dieser hypervariablen Minisatelliten, vor allem die größten DNA-Fragmente, niedrige Allel-Häufigkeiten besitzen und nur selten, wie vorausgesagt, bei nicht-verwandten Personen auftreten, sind viele dieser Fragmente in der Neurofibromatose-Familie im heterozygoten Zustand vorhanden und werden nur auf einige der Nachkommen übertragen. Obwohl die DNA der befallenen Mutter nicht zur Verfugung stand, konnten von der Mutter stammende Minisatellitenfragmente ohne Schwierigkeiten als in einigen Nachkommen vorhandene, aber beim Vater fehlende Fragmente identifiziert werden. Väterliche Fragmente konnten ähnlich identifiziert werden. Durch Anwendung der beiden Sonden 33,6 und 33,15 war es möglich, die Segregation von 41 väterlichen und 32 mütterlichen DNA-Fragmenten in dieser Familie zu bewerten (Fig. 7, Tabelle 3). Es sind zahlreiche zusätzliche polymorphe Fragmente vorhanden, aber sie wurden entweder von dem Gel abelektrophoresiert oder unvollständig aufgelöst und konnten daher nicht zuverlässig bewertet werden.Since many of these hypervariable minisatellites, especially the largest DNA fragments, have low allele frequencies and rarely, as predicted, occur in unrelated individuals, many of these fragments are present in the neurofibromatosis family in the heterozygous state and are only on transfer some of the offspring. Although the DNA was unavailable to the affected mother, minisatellite fragments derived from the mother could be readily identified as fragments present in some offspring but missing from the father. Paternal fragments could be similarly identified. By using the two probes 33.6 and 33.15, it was possible to evaluate the segregation of 41 paternal and 32 maternal DNA fragments in this family (Figure 7, Table 3). There are numerous additional polymorphic fragments present, but they were either electrophoresed or incompletely resolved from the gel and therefore could not be reliably evaluated.
Heterozygote väterliche DNA-Fragmente wurden im Durchschnitt auf 53% der Nachkommen übertragen. Ähnlich zeigten die mütterlichen Fragmente eine Übertragung von 48%, was auch mit der 1:1 Segregation übereinstimmt (Tabelle 4). Außerdem folgte die Anzahl der Kinder, die jedes Fragment erhielten, der erwarteten binomischen Verteilung, in der der Anteil von elterlichen Fragmenten, die auf genau r Kinder in der Gruppe von 11 übertragen werden, 11Cr —— beträgt (Tabelle 4). Es wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß diese DNA-Fragmente Mendelsche Vererbung zeigen, undHeterozygous paternal DNA fragments were transmitted on average to 53% of the offspring. Similarly, the maternal fragments showed 48% transmission, which is also consistent with 1: 1 segregation (Table 4). In addition, the number of children receiving each fragment followed the expected binomial distribution, in which the proportion of parental fragments transferred to exactly 11 children in the group of 11 was 11 Cr - (Table 4). It was concluded that these DNA fragments show Mendelian inheritance, and
daß die Bewertung von elterlichen Bändern, vor allem der kleineren und weniger gut aufgelösten Fragmente, nicht wesentlich durch mögliche Fälle von Segregation von zwei oder mehr überlagerten Bändern, die eine scheinbare Übertragungshäufigkeit von >75% ergeben wurden, beeinflußt wird. Die einwandfreie Mutterschaft und Vaterschaft aller Kinder wird gleichfalls durch diese DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) bestätigt.that the evaluation of parental bands, especially of the smaller and less well resolved fragments, is not significantly affected by possible segregation cases of two or more superposed bands, which would give an apparent transmission frequency of> 75%. The perfect motherhood and paternity of all children is also confirmed by these DNA identification marks (fingerprints).
Durch paarweise Vergleiche der Segregationsmuster alier väterlichen oder mütterlichen DNA-Fragmente in dieser großen Familie ist es möglich, allelomorphe Paare von Fragmenten plus Paare zu identifizieren, die eine enge Kopplung bei der Verbindung zeigen (die Chancen für eine zufällige Kosegregation eines bestimmten Paares von Bändern in dieser Gruppe beträgt 1:1024). Mehrere Fälle allelomorpher Paare von väterlichen und mütterlichen Fragmenten konnten mit beiden Sonden identifiziert werden (Fig. 7). Sonde 33,6 entdeckte auch ein gekoppeltes Paar von Fragmenten bei der Mutter und bei dem Vater. Eine ähnliche Kopplung wurde in einer zweiten Familie gefunden (siehe unten), so daß man annehmen könnte, daß mindestens eine der zu Sonde 33,6 hybridisierenden hypervariablen Regionen ein langer Minisatellit/Satellit ist, der (eine) innere Spaltungsstelle(n) für Hinfl enthält und daher gespalten wird, um zwei oder mehr Fragmente zu erzeugen, die in Familien als ein Minisatelliten „Haplotyp" kosegregieren. Keines der mit Hilfe von Sonde 33,15 bewerteten polymorphen DNA-Fragmente war in der Reihe der durch 33,6 entdeckten Fragmente vorhanden; irgendein derartiges, zu beiden Sonden hybridisiertes Fragment würde als Bänder gleicher Größe entdeckt worden sein, die von dem gleichen Elternteil auf die gleichen Kinder übertragen (d.h. „gekoppelt") wurden. Diese beiden Sonden hybridisieren dahe*r zu im wesentlichen vollkommen anderen Untergruppen von Human-Minisatelliten.By pairwise comparisons of the segregation patterns of all paternal or maternal DNA fragments in this large family, it is possible to identify allelomorphic pairs of fragments plus pairs, which show close coupling in the compound (the chances of random cosegregation of a particular pair of bands in this group is 1: 1024). Several cases of allelomorphic pairs of paternal and maternal fragments could be identified with both probes (Figure 7). Probe 33.6 also discovered a coupled pair of fragments in the mother and father. A similar coupling was found in a second family (see below) so that one might assume that at least one of the hypervariable regions hybridizing to probe 33.6 is a long minisatellite / satellite having an internal cleavage site (s) for Hinfl and thus cleaved to generate two or more fragments that segregate into families as a minisatellite "haplotype." None of the polymorphic DNA fragments evaluated by probe 33,15 was in the series of fragments discovered by 33,6 Any such fragment hybridized to both probes would have been discovered to be bands of equal size that were transmitted (ie "coupled") from the same parent to the same children. These two probes therefore hybridize to essentially completely different subgroups of human minisatellites.
Durch Ausschaltung von Allelen und gekoppelten Fragmenten wurde gefolgert, daß 34 und 25 einzelne Stellen im Vater bzw. der Mutter bewertet wurden (Tabelle 3). Bei 80% der Stellen ist nur eines der beiden AIIeIe aufgelöst, und das zweite AIIeI befindet sich vermutlich in dem schlecht aufgelösten Komplex von kürzeren Minisatellitenfragmenten. Das besagt, daß große Unterschiede in den Minisatelliten-Allel-Längen Vorhandensein müssen, die vermutlich auf einen ungleichen Austausch in diesen sich wiederholenden Tandemregionen zurückzuführen sind; verschiedene in Fig.7 identifizierte allelomorphe Paare zeigen tatsächlich erhebliche Längendifferenzen. Von dem Anteil von Bändern, die paarweise zu Allelen zusammengefügt werden können, kann man berechnen, daß die Gesamtanzahl von heterozygoten Stellen, die in den gesamten, durch die Sonden 33,6 und 33,15 entdeckten DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) vorhanden sind, annähernd 43 bis 66 beträgt, von denen annähernd die Hälfte im Vater und der Mutter bewertet werden können (Tabelle 3). Es ist nicht möglich, Allelismus zwischen väterlichen und mütterlichen Fragmenten in dieser Familie zu bestimmen.By eliminating alleles and coupled fragments, it was concluded that 34 and 25 individual sites in the father and mother were scored (Table 3). At 80% of the sites, only one of the two is resolved, and the second allele is thought to be in the poorly resolved complex of shorter minisatellite fragments. This implies that large differences in minisatellite allele lengths must be present, presumably due to an unequal exchange in these repeating tandem regions; different allelomorphic pairs identified in Figure 7 actually show significant differences in length. From the proportion of bands that can be paired to form alleles, it can be calculated that the total number of heterozygous sites present in the total fingerprints detected by probes 33,6 and 33,15, approximately 43 to 66, of which approximately half can be assessed in the father and the mother (Table 3). It is not possible to determine allelism between paternal and maternal fragments in this family.
Alle der bewerteten väterlichen Stellen sind autosomal und zeigen keine spezifische Übertragung weder an Töchter (X Kopplung) noch an Söhne (Y Kopplung). Außerdem segregieren alle Paare AB von väterlichen DNA-Fragmenten anscheinend unabhängig in Nachkommen, so daß durchschnittlich eine gleiche Anzahl von (AB,—)undA-,-B) Nachkommen entstehen; genaue Zahlen folgten der erwarteten binomischen Verteilung für ungekoppelte Stellen (Tabelle 4). Mütterliche DNA-Fragmente zeigten ein ähnliches Verhalten. Eine ausführlichere Analyse legt nahe, daß der minimale Abstand von Stelle zu Stelle bei diesen Stellen >1,30cM (46 Karteneinheiten) betragen müßte; durch jeden engeren Abstand würde eine erhebliche Anzahl von Paaren von Fragmenten erzeugt, die zum Kosegregieren tendieren (gekoppelt bei Verbindung) oder als Pseudo-Allele segregieren (gekoppelt bei Abstoßung) (Tabelle 4). Die auflösbaren Minisatellitenstellen müssen daher über mindestens die Hälfte des 300OcM langen Human-Genoms verteilt sein, und müssen daher über viele oder alle der Human-Autosomen verstreut sein. Ein mütterliches Minisatellitenfragment (Fig.7) zeigt schwache Anzeichen für Kopplung in Verbindung mit Neurofibromatose, wobei 10/11 Kinder für dieses Fragment und die Krankheit (Θ = 1OcM, ρ = 0,006) anfällig sind. Da jedoch 25 verschiedene mütterliche Stellen bewertet worden sind, ist die Wahrscheinlichkeit, daß ein AlIeI von mindestens einer dieser Stellen zufällig den beobachteten Grad von Kopplung bei Verbindung oder Abstoßung zeigt, hoch (p = 0,24).All of the rated paternal sites are autosomal and show no specific transmission to either daughters (X coupling) or sons (Y coupling). In addition, all pairs AB of paternal DNA fragments apparently segregate independently in progeny, giving an average of an equal number of (AB, -) and A -, - B) offspring; exact numbers followed the expected binomial distribution for uncoupled sites (Table 4). Maternal DNA fragments showed a similar behavior. A more detailed analysis suggests that the minimum site-to-site spacing at these sites would be> 1.30 cM (46 map units); any closer distance would produce a significant number of pairs of fragments that tend to cosegregate (coupled on joining) or segregate as pseudo-alleles (coupled in repulsion) (Table 4). The resolvable minisatellite sites must therefore be distributed over at least half of the 300 OcM human genome, and therefore must be scattered across many or all of the human autosomes. A maternal minisatellite fragment (Figure 7) shows faint signs of coupling associated with neurofibromatosis, with 10/11 infants susceptible to this fragment and disease (Θ = 1OcM, ρ = 0.006). However, since 25 different maternal sites have been scored, the probability of an AlIeI from at least one of these sites randomly showing the observed level of attachment or rejection coupling is high (p = 0.24).
Die Analyse von DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) wurde auf eine größere, vier Generationen umfassende Familie von Gudscharati-Asiaten ausgedehnt, die sowohl für/3-Thalassämie als auch für angeborene Persistenz von Fetalhämoglobin (HPFH) segregiert.The analysis of DNA fingerprints has been extended to a larger, four-generation family of Gudzharati Asians, which segregate for both / 3-thalassemia and congenital persistence of fetal hemoglobin (HPFH).
Autoradiogramme von in Fig.8A und 8B gezeigten Ma^kierersegregationsmustern wurden wie folgt angefertigt. TOjug-Proben von Blut-DNA wurden mit Hinfl digeriert, und DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) wurden wie in Fig. 7 beschrieben unter Verwendung von Sonde 33,6 (A) oder 33,15 (B) erzeugt. Die Elektrophorese wurde in einem verhältnismäßig kurzen Agarosegel (20cm) vorgenommen. Die Verwandtschaft zwischen den Personen ist in Fig. 9 angegeben. A, hypervariable Fragmente a, bund csind eng gekoppelt und sind entweder alle in jedem Mitglied der Familie vorhanden oder fehlen alle. B, Kosegregation von Band g und HPFH (H). Die Personen IV7 und IV8 sind eineiige Zwillinge und haben nicht unterscheidbare DNA-Erkennungszeichen (fingerprints).Autoradiograms of the sampler segregation patterns shown in Figs. 8A and 8B were prepared as follows. Blood-DNA TOjug samples were digested and fingerprints were generated as described in Fig. 7 using probe 33.6 (A) or 33.15 (B). The electrophoresis was done in a relatively short agarose gel (20 cm). The relationship between the persons is shown in FIG. A, hypervariable fragments a, c are tightly coupled and are either all present or absent in each member of the family. B, cosegregation of band g and HPFH (H). Persons IV7 and IV8 are identical twins and have indistinguishable DNA fingerprints.
Stoffe und Methoden entsprechen denen von Beispiel 8.Substances and methods are the same as in Example 8.
Die Kosegregationsanalyse ist in den Fig. 9A und 9 B wiedergegeben.The cosegregation analysis is shown in FIGS. 9A and 9B.
In Fig.9A wurde die Segregation von 30 hypervariablen Fragmenten von Il 4 und 27 Fragmenten von Il 5 in Nachkommen III 1-11 nach möglicher Kopplung von Paaren AB von elterlichen Fragmenten gescreent; mögliche Beispiele für Kopplung, dieIn Figure 9A, the segregation of 30 hypervariable fragments of Il 4 and 27 fragments of Il 5 in progeny III 1-11 was screened for possible coupling of AB pairs from parental fragments; possible examples of coupling, the
wenigstens 6/7 (AB, ) Nachkommen zeigen, wurden weiter bei zusätzlichen Verwandten untersucht. Die beiden deutlichstenat least 6/7 (AB,) offspring were examined further with additional relatives. The two clearest
Beispiele für Kopplung werden gezeigt (a-f, Vorhandensein von Fragmenten a-f in einer Person; · Fragment fehlt). Die Fragmente a-c und e,f zeigen jeweils einwandfreie Kosegregation; Fragment d tendiert zur Kosegregation mit a-c; aber die Gruppe IV1-4 ist nicht informativ, und die eineiigen Zwillinge IV 7,8 sind rekombinant, die a-c, aber nicht d geerbt haben. B, Vererbung von /3-Thalassämie-Merkmal (c, D)1 HPFH (H) und Minisatellitenfragment g. Personen wurden als von HPFH befallen bewertet, wenn sie > 1 % HbF (normal) oder >3% HbF (-Thalassämie-Merkmal) zeigten. HPFH und /3-Thalassämiemerkmal segregieren unabhängig in Hl 1-11 und IV 5-8 und werden durch ungekoppelte Stellen bestimmt. Fragment g kosegregiert einwandfrei mit HPFH in den untersuchten Personen.Examples of coupling are shown (af, presence of fragments af in a person, fragment missing). The fragments ac and e, f each show perfect cosegregation; Fragment d tends to cosegregate with ac; but group IV1-4 is not informative, and identical twins IV 7,8 are recombinant which have inherited ac, but not d. B, inheritance of / 3-thalassemia trait (c, D) 1 HPFH (H) and minisatellite fragment g. Subjects were rated as having HPFH> 1% HbF (normal) or> 3% HbF (-Thalassemia trait). HPFH and / 3 thalassemia features segregate independently in HL 1-11 and IV 5-8 and are determined by uncoupled sites. Fragment g cosegregates perfectly with HPFH in the subjects studied.
Wie in Fig.9 A, B gezeigt, wird die Elevation von HbF unabhängig vom /3-Thalassämiemerkmai übertragen und wird anscheinend durch eine nicht mit dem /3-Globin-Genbüschel gekoppelte Autosom-Dominant-Stelle bestimmt. Über eine ähnliche sardinische Familie wurde von Gianni, u. a. EMBO J. 2,921-925 (1983) berichtet.As shown in Figures 9A, B, the elevation of HbF is transmitted independently of the / 3 thalassemia marker and is apparently determined by an autosomal dominant site not coupled to the / 3 globin gene tuft. About a similar Sardinian family was by Gianni, u. a. EMBO J. 2,921-925 (1983).
In Fig.8A und 8 B wurden 30 variable Fragmente in dem Großvater (Il 4) und 27 Fragmente in der Großmutter (Il 5) bewertet. Die Untersuchung ihrer sieben Nachkommen (III 1-11) zeigte, daß diese Fragmente von mindestens 22 einzelnen ungekoppelten väterlichen und 18 mütterlichen autosomalen Stellen stammten, wobei die für die Neurofibromatose-Familie beschriebenenIn FIGS. 8A and 8B, 30 variable fragments in the grandfather (Il 4) and 27 fragments in the grandmother (Il 5) were evaluated. Examination of their seven offspring (III 1-11) showed that these fragments were from at least 22 individual uncoupled paternal and 18 maternal autosomal sites, those described for the neurofibromatosis family
Kriterien angewandt wurden. Die übrigen DNA-Fragmente zeigten Anzeichen von Allelismus oder Kopplung an andere Fragmente, obwohl der Beweis mit dieser kleinen Gruppe nicht möglich ist (ein bestimmtes Paar von elterlichen DNA-Fragmenten hatte eine Chance von 1 /64, daß es zufällig entweder gekoppelt oder als AIIeIe in einer Gruppe von 7 übertragen wird). Ein weiterer Beweis für Kopplung wurde bei zusätzlichen Mitgliedern der Familie gesucht, und die beiden stärksten Fälle von Kupplung sind in den Fig.8 und 9 wiedergegeben. Von Sonde 33,6 entdeckte Fragmente a, b und c werden in vollständiger Kopplung von Il 4 auf seine Kinder (III 1-11) und dann die Enkel (IV 1-8) übertragen; es waren keine Rekombinanten in 14 informativen Nachkommen zu finden (p = 4 χ 10~9 bei drei kosegregierenden Bändern). Wie oben erläutert, könnte man vermuten, daß die Fragmente a-c einen von einer einzigen hypervariablen Stelle stammenden Minisatelliten „Haplotyp" darstellen. Das durch Sonde 33,15 entdeckte Band d zeigtauch Anzeichen für Kopplung an die Bänder a-c; allerdings ist ein Kind (IV1-4) uninformativ, weil beide Elternteile das Fragment d tragen und ein anderes (IV 5-8) ein Rekombinant enthält (eineiige Zwillinge IV 7,8). Der Beweisfür Kopplung zwischen Bandfd und dem a-c-Büschel ist somit schwach (0 = 1OcM, ρ = 0,01). Mütterliche Bänder e (nachgewiesen durch 33,6) und f (nachgewiesen durch 33,15) zeigen ebenfalls eine feste Kopplung sowohl in den Abkömmlingen von Il 4 und Il 5 als auch in weiteren verwandten Nachkommen III 15-20 und IV17-22 (20 informative Nachkommen, keine Rekombinanten, 0 = OcM, ρ = 10""6). Da die Sonden 33,6 und 33,15 unterschiedliche Gruppen von Minisatelliten entdeckten und nicht zu den Fragmenten e und f kreuz-hybridisieren, können diese Fragmente ein Beispiel für authentische Kopplung zwischen zwei unterschiedlichen autosomalen Minisatellitenstellen darstellen. Schließlich sind die beiden Kopplungsgruppen (Fragmente a-c und e-f) keine AIIeIe der gleichen Stelle. Person III 1 ist eine Verbindungs-Heterozygote, die sowohl das väterliche a-c-Büschel als auch das mütterliche e-f-Paar trägt; beide Büschel werden auf zwei seiner vier Kinder übertragen, woraus hervorgeht, daß sie nicht als AIIeIe segregieren, sondern statt dessen von zwei ungekoppelten hypervariablen Regionen herrühren müssen.Criteria were applied. The remaining DNA fragments showed signs of allelism or coupling to other fragments, although the proof with this small group is not possible (a particular pair of parental DNA fragments had a 1/64 chance of being either randomly coupled or alluded to in a group of 7 is transmitted). Further proof of coupling was sought from additional members of the family, and the two strongest cases of coupling are shown in Figs. 8 and 9. Fragments a, b, and c discovered by probe 33.6 are transferred in complete coupling of Il 4 to his children (III 1-11) and then to the grandchildren (IV 1-8); no recombinants were found in 14 informative progeny (p = 4 χ 10 ~ 9 in three cosegregating bands). As explained above, one might suspect that the fragments ac represent a haplotype minisatellite derived from a single hypervariable site, and the band d detected by probe 33,15 also shows signs of coupling to the bands ac, but a child (IV1- 4) uninformative because both parents carry the fragment d and another (IV 5-8) contains a recombinant (identical twins IV 7, 8). The evidence for coupling between bandfd and the ac tuft is thus weak (0 = 1 ocM, ρ = 0.01). Maternal bands e (detected by 33.6) and f (detected by 33.15) also show a strong coupling in both the progeny of IL 4 and IL 5 and in other related offspring III 15- 20 and IV17-22 (20 informative offspring, no recombinants, 0 = OcM, ρ = 10 "" 6 ). Since probes 33,6 and 33,15 detected different groups of minisatellites and did not cross to fragments e and f. hybridize, these fragments can be a Be ispiel for authentic coupling between two different autosomal minisatellite sites. Finally, the two coupling groups (fragments ac and ef) are not all AIIeIe the same place. Person III 1 is a compound heterozygote that carries both the paternal ac tuft and the maternal ef pair; both tufts are transferred to two of his four children, indicating that they do not segregate as AIIeIe, but instead must originate from two uncoupled hypervariable regions.
Keines der mütterlichen (Il 5) Minisatellitenfragmente zeigte signifikante Kopplung mit ß-Thalassämie-Merkmalen und sind daher nicht eng an das/3-Globin-Genbüschel an Chromosom 11 gekoppelt. Im Gegensatz dazu kosegregierte ein 8,6KB langes mütterliches Fragment (g) mit HPFH bei den sieben Nachkommen und bei drei informativen Gruppen von Enkeln (Fig.9). Bei 12 Nachkommmen waren keine Rekombinanten zu sehen, was auf enge Kopplung (0 = OcM, ρ = 2 χ 1O-4) schließen läßt. Selbst wenn man die Tatsache berücksichtigt, daß 17 Stellen in Il 5 untersucht worden sind, ist diese Kopplung noch signifikant (die Wahrscheinlichkeit, daß ein AIIeI von mindestens einer der 17 bewerteten Stellen zufällig Kosegregation mit HPFH zeigen wird, beträgt 0,004). Es wurde weiterhin überprüft, ob Fragment g in Il 5 ein einzelnes Minisatelliten-Allel ist und nicht zwei übereinandergelagerte segregierende DNA-Fragmente, indem die DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) aller in Fig.9 gezeigten Personen, digeriert mit Sau3 A anstelle von Hinf I, untersucht wurden; jedes positive Erkennungszeichen (fingerprint) enthielt ein entsprechendes Sau3A Fragment mit einer ähnlichen Größe wie das Fragment g (8,2 KB gegenüber 8,6 KB), wie von einem einzelnen Minisatellitenfragment zu erwarten war.None of the maternal (Il 5) minisatellite fragments showed significant coupling with β-thalassemia characteristics and are therefore not tightly coupled to chromosome 11/3-globin tufts. In contrast, an 8.6 Kb maternal fragment (g) cosegregated with HPFH in the seven offspring and in three informative groups of grandchildren (Figure 9). In 12 descendants, no recombinants were seen, which suggests close coupling (0 = OcM, ρ = 2 χ 10 -4 ). Even taking into account the fact that 17 sites in Il 5 have been studied, this coupling is still significant (the probability that an ai of at least one of the 17 sites evaluated will coincidentally show co-segregation with HPFH is 0.004). It was further tested whether fragment g in Il 5 is a single minisatellite allele and not two superimposed segregating DNA fragments by the fingerprints of all persons shown in Figure 9 digested with Sau3 A instead of Hinf I , were examined; each positive fingerprint included a corresponding Sau3A fragment of similar size to fragment g (8.2 KB vs. 8.6 KB) as expected from a single minisatellite fragment.
Die Nachkommenschafts-Analyse bei Menschen zeigt, daß die durch Minisatellitensonden entdeckten DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) zuverlässig für die Untersuchung der Segregation von multiplen heterozygoten DNA-Fragmenten selbst bei Familien verwendet werden können, bei denen der eine oder andere Elternteil für die Untersuchung nicht zur Verfügung steht. Durch die Anwendung von zwei derartigen Sonden können bis zu 34 hypervariable Stellen gleichzeitig bei einer einzigen Person analysiert werden, eine Rate von Gen-Markierer-Erzeugung, die viel höher liegt als die mit herkömmlichen Methoden einschließlich RFLPs in der Humangenetik erzielte. Durch die ständige Vererbung von variablen Minisatellitenfragmenten in Verbindung mit der geringen Populationshäufigkeit von individuellen Fragmenten sind sie ausgezeichnet für die Kopplungsanalyse geeignet, wie durch die Beispiele der bei den beiden untersuchten Familien entdeckten Kopplung gezeigt wurde. Es soll betont werden, daß obwohl diese hypervariablen Minisatelliten Rekombinations-Heißstellen sein können, die geschätzte Rate von an einem langen Minisatelliten erfolgendem Austausch (~ 0,001 je Garnet) nicht ausreicht, um die Kopplung zwischen einer Minisatellitenstelle und einem benachbarten Gen, z. B. einer Krankheitsstelle, erheblich zu stören. Es wird geschätzt, daß die Gesamtanzahl von zusammen durch die Minisatellitensonden 33,6 und 33,15 entdeckten hypervariablen Stellen annähernd 60 beträgt. Mindestens eines der beiden AIIeIe von etwa der Hälfte dieser Stellen kann in einem bestimmten DNA-Erkennungszeichen (fingerprint) aufgelöst werden, und daher folgt daraus, daß das Spektrum von untersuchten Stellen in unterschiedlichen DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) nicht identisch sein wird. Die meisten oder alle derartigen Stellen sind genetisch ungekoppelt und müssen somit über einen erheblichen Teil des Human-Genoms verstreut sein. Ihre genaue Lage ist nicht bekannt, und man muß das Klonen und die regionale Lokalisierung von individuellen hypervariablen Minisatellitenstellen abwarten. Komischerweise wurden bisher keine Minisatelliten am X- oder Y-Chromosom in keiner der untersuchten Familien gefunden. Es wird geschätzt, daß annähernd 43 verschiedene Stellen auf mögliche Geschlechtskoppiung im Vater der Neurofibromatose-Familie zusammen mit Person Il 4 in derHPFH-Familie bewertet worden sind. Da X-und Y-Chromosomen zusammen ~ 5% des Genoms eines Mannes bilden, beträgt dann die Wahrscheinlichkeit, daß keine wahllos verteilten 43 Stellen an diesen Chromosomen sitzt, (0,9O)43 = 0,1; das offensichtliche Fehlen von geschlechtsgekoppelten Minisatelliten ist daher nicht von Bedeutung.Human progeny analysis shows that fingerprinting detections detected by minisatellite probes can be used reliably to study the segregation of multiple heterozygous DNA fragments even in families where one parent or another is not used in the study Available. By using two such probes, up to 34 hypervariable sites can be analyzed simultaneously in a single person, a rate of gene marker generation much higher than that achieved with conventional methods including RFLPs in human genetics. Due to the constant inheritance of variable minisatellite fragments in combination with the low population abundance of individual fragments, they are well suited for linkage analysis as demonstrated by the examples of coupling discovered in the two families studied. It should be emphasized that although these hypervariable minisatellites may be recombination hot spots, the estimated rate of long minisatellite replacement (~0.001 per garnet) is insufficient to facilitate coupling between a minisatellite site and an adjacent gene, e.g. B. a disease site to disturb significantly. It is estimated that the total number of hypervariable sites detected together by the minisatellite probes 33, 6 and 33, 15 is approximately 60. At least one of the two parts of about half of these sites can be resolved in a given fingerprint fingerprint, and therefore it follows that the spectrum of sites examined in different DNA fingerprints will not be identical. Most or all of these sites are genetically uncoupled and thus must be scattered across a substantial portion of the human genome. Their exact location is unknown and one must wait for the cloning and regional localization of individual hypervariable minisatellite sites. Strangely enough, no minisatellites on the X or Y chromosome have been found in any of the families studied so far. It is estimated that approximately 43 different sites have been evaluated for possible sex coupling in the father of the neurofibromatosis family along with person IL 4 in the HPFH family. Since X and Y chromosomes together make up ~ 5% of a man's genome, then the probability that there are no randomly distributed 43 sites on these chromosomes is (0.90) 43 = 0.1; the obvious lack of sex-linked minisatellites is therefore not significant.
Diese verteilten hypervariablen Minisatellitenstellen sind für die Suche nach mit Krankheitsstellen gekoppelten Markierern gut geeignet, wie durch die vorläufigen Beispiele von Kopplung mit Neurofibromatose und HPFH gezeigt wird. Im Gegensatz zur herkömmlichen genetischen Einzel-Stellen-Analyse können Kopplungsdaten nichtzwischen nicht-verwandten kleinen Gruppen verteilt sein, weil ein anderes Minisatelliten-Allel wahrscheinlich mit der Krankheitsstelle in jedem Nachkommen assoziiert ist. Statt dessen sind DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) nur für die Untersuchung der Kopplung, vor allem von Dominantstörungen, in einer großen Gruppe und am besten in einer einzigen großen Familie geeignet. Bisher gestatten die Sonden 33,6 und 33,15 die Bewertung von bis zu 34 autosomalen hypervariablen Stellen in einem Lebewesen. Die Chance, daß mindestens eine dieser Stellen eng mit einer bestimmten Krankheitsstelle (innerhalb 1OcM) gekoppelt ist, beträgt 20%, bei einer angenommenen wahllosen Verteilung von Minisatelliten in der 300OcM langen Human-Kopplungs-Karte. Bei erweiterten Gruppen wie der HPFH-Familie fällt diese Wahrscheinlichkeit auf ~ 10%, weil nur ein AIIeI der meisten Stellen bewertbar ist, und um Kopplung nachweisen zu können, müßte dieses AIIeI bei Kopplung mit der Krankheitsstelle verbunden sein. Um diese Wahrscheinlichkeit auf über 50% zu erhöhen, wäre die Bewertung von >104 hypervariablen Stellen in einer einzigen großen Familie und von > 208 Stellen in einer erweiterten Gruppe erforderlich. DieseThese distributed hypervariable minisatellite sites are well suited for the search for disease site-coupled markers, as demonstrated by the preliminary examples of coupling with neurofibromatosis and HPFH. In contrast to traditional single-site genetic analysis, coupling data may not be distributed among unrelated small groups because another minisatellite allele is likely to be associated with the disease site in each offspring. Instead, fingerprints are only suitable for studying the coupling, especially of dominant disorders, in a large group and best of all in a single large family. So far, probes 33,6 and 33,15 allow the evaluation of up to 34 autosomal hypervariable sites in a subject. The chance that at least one of these sites is closely linked to a particular disease site (within 1OcM) is 20%, assuming an indiscriminate distribution of minisatellites in the 300OcM human coupling map. In extended groups such as the HPFH family, this probability drops to ~ 10% because only one part of most sites is assessable, and in order to detect coupling, this allele would need to be linked to the disease site. To increase this probability to over 50%, the assessment of> 104 hypervariable sites in a single large family and> 208 sites in an extended group would be required. These
Werte liegen über der Gesamtanzahl von mit den beiden Minisatellitensonden bisher nachgewiesenen Stellen. Die Sonden 33,6 und 33,15 entdecken jedoch im wesentlichen vollkommen verschiedene Gruppen von hypervariablen Stellen, so daß man annehmen kann, daß die Gesamtanzahl von Human-Minisatelliten, die verschiedene Versionen der Kernsequenz enthalten, sehr groß sein kann.Values are greater than the total number of digits detected so far with the two minisatellite probes. However, probes 33,6 and 33,15 discover essentially completely different groups of hypervariable sites, so it can be assumed that the total number of human minisatellites containing different versions of the core sequence can be very large.
Bei der herkömmlichen Human-Nachkommenschafts-Analyse unter Verwendung definierter Einzel-Stellen-Markierer, ergibt der Nachweis von Kopplung zwischen einem Markierer und der Krankheitsstelle gewöhnlich direkt die annähernde genomische Lage der Krankheitsgens, und das kann weiterhin durch die Analyse von weiteren Nachkommen ermittelt werden. Die Umkehrung gilt für DNA-Erkennungszeichen (fingerprints). Eine weitere Analyse für mögliche Kopplung zwischen einem hypervariablen DNA-Fragment und einer Krankheit ist über die Isolierung des Fragments durch präparative Gelelektrophorese und Klonen möglich. Stellenspezifische Hybridisierungssonden können dann aus dem isolierten Minisatelliten entweder unter Anwendung von einmaligen Sequenz-DNA-Segmenten, die den Minisatelliten unmittelbar flankieren, oder durch Anwendung des gesamten Minisatelliten bei sehr scharfer Hybridisierung entwickelt werden. Solche stellenspezifischen Sonden können zur Erweiterung der Kopplungsdaten in zusätzlichen Familien und zur Lokalisierung des Minisatelliten innerhalb des Human-Genoms verwendet werden. Diese Möglichkeit wurde kürzlich durch Klonen des8,2KBSau3A Minisatellitenfragmentes, das scheinbar an die HPFH-Stelle in der Gujdscharati-Familie gekoppelt ist, bestätigt.In conventional human progeny analysis using defined single-site markers, detection of coupling between a marker and the site of disease usually directly results in the approximate genomic location of the disease gene, and this can be further determined by analysis of further offspring. The inverse applies to DNA labels (fingerprints). Further analysis for possible coupling between a hypervariable DNA fragment and a disease is possible via isolation of the fragment by preparative gel electrophoresis and cloning. Site-specific hybridization probes can then be developed from the isolated minisatellite either by using unique sequence DNA segments flanking the minisatellites directly, or by using the entire minisatellite with very sharp hybridization. Such site-specific probes can be used to extend the coupling data in additional families and to locate the minisatellite within the human genome. This possibility has recently been confirmed by cloning the 8.2 KBSau3A minisatellite fragment apparently linked to the HPFH site in the Gujajarati family.
Wie oben beschrieben wurde, erzeugen die Sonden 33,5,33,6 sowie 33,15, von denen jede aus einem Human-Minisatelliten besteht, der sich in jedem Fall aus einer anderen Variante der Kernsequenz zusammensetzt, unterschiedliche DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) und entdecken daher unterschiedliche Gruppen von hypervariablen Minisatellitenregionen in Human-DNA und der anderer Vertebrates Vor allem die Sonden 33,6 und 33,15 entdecken weitgehend oder vollkommen verschiedene Gruppen von Minisatelliten (siehe die dritte Anmeldung und „DNA ,Erkennungszeichen' (,fingerprints') und Kopplungsanalyse in Human-Nachkommenschaften", von A.J.Jeffreys, V.Wilson, S.L.Thein, D.J.Weatherall & B.A. J. Ponder) infolge der Differenzen, die sowohl hinsichtlich der Länge als auch der genauen Sequenz des in jeder Sonde vorhandenen wiederholten Kernes vorhanden sind.As described above, probes 33, 53, 36, and 33, 15, each consisting of a human minisatellite, which in any case is composed of a different variant of the core sequence, produce different DNA labels (fingerprints). and therefore, discover different groups of hypervariable minisatellite regions in human and other vertebrate DNA. Specifically, probes 33,6 and 33,15 detect broadly or completely different groups of minisatellites (see the third application and 'DNAprints'). and coupling analysis in human progeny ", by AJJeffreys, V.Wilson, SLThein, DJWeatherall & BAJ Ponder) due to differences in both the length and the exact sequence of the repeated nucleus present in each probe.
Um untersuchen zu können, ob die Möglichkeit besteht, weitere hypervariable Regionen unter Verwendung von Tandemwiederholungen von anderen Versionen der Kernsequenz entdecken zu können, wurde eine Reihe synthetischere Minisatelliten hergestellt.In order to investigate the possibility of discovering additional hypervariable regions using tandem repeats from other versions of the core sequence, a number of more synthetic minisatellites were prepared.
Der Versuch, Mehrkernsonden herzustellen, wird in Fig. 10 dargestellt, in der der Weg für die Herstellung einer geklonten Tandemwiederholung der Kreuzungs-Heißstellen-Initiator-Sequenz (Chi, GCTGGTGG) von E.coli gezeigt wird. Für die Schritte zur Erzeugung einer Poly-Chi-Sonde wurden Standard-DNA-Techniken angewandt und betrafen:The attempt to prepare multicore probes is shown in Figure 10, which shows the route for preparing a cloned tandem repeat of the cross-over-hot-site initiator sequence (Chi, GCTGGTGG) from E. coli. For the steps of generating a poly-Chi probe, standard DNA techniques were used and concerned:
1. Ein synthetisches Oligonucleotid, das eine Tandemwiederholung der 8 Nucleotide langen Chi-Sequenz enthielt, wurde nach dem Verfahren von H. W. D. Matthes, u.a., (1984) (EMBO J. 3,801-805) und D. G. Brenner & W. V. Shaw (1985) EMBO J. 4,561-568 hergestellt Ein zweites aus einem Dimer der komplementären Sequenz von Chi bestehendes Oligonucleotid wurde gleichfalls synthetisiert.1. A synthetic oligonucleotide containing a tandem repeat of the 8 nucleotide Chi sequence was prepared by the method of HWD Matthes, et al., (1984) (EMBO J. 3,801-805) and DG Brenner & WV Shaw (1985) EMBO J 4.561-568 prepared. A second oligonucleotide consisting of a dimer of the complementary sequence of Chi was also synthesized.
2. Diese beiden Oligonucleotide wurden bei 37°C in 1OmM MgC^, 10 mM Tris-HCI (pH-Wert 8,0) miteinander verschmolzen, um ein kurzes doppelsträngiges Segment von DNA zu bilden. Die Sequenz des zweiten Oligonucleotids wurde gewählt, um ein verschmolzenes Molekül mit 3-Nucleotid-langen 5' vorstehenden, für die Kopf-Schwanz-Ligation geeigneten Termini zu schaffen.2. These two oligonucleotides were fused together at 37 ° C in 10 mM MgCl 2, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to form a short double-stranded segment of DNA. The sequence of the second oligonucleotide was chosen to provide a fused molecule with 3-nucleotide-long 5 'protruding termini suitable for head-to-tail ligation.
3. Die 5'-Termini wurden unter Verwendung von T4Polynucleotidkinase plus ATP phosphoryliert.3. The 5 'termini were phosphorylated using T4 polynucleotide kinase plus ATP.
4. Getemperte DNA-Fragmente wurden in einer Kopf-Schwanz-Art unter Verwendung von T4DNA-Ligase plus ATP miteinander ligiert, um ein wiederholtes Chi-Polymer zu erzeugen.4. Annealed DNA fragments were ligated together in a head-to-tail manner using T4DNA ligase plus ATP to produce a repeated chi polymer.
5. Ligierte Polymere wurden durch Elektrophorese durch ein 1,5%igesAgarosegel nach der Größe getrennt, und Polymere mit einer Länge über 150 Basenpaare wurden durch Elektrophorese auf DE 81 Papier isoliert (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corri, P., &Chambon, P., 1981, Anal. Biochem. 112, 295-298).5. Ligated polymers were size separated by electrophoresis through a 1.5% agarose gel and polymers longer than 150 base pairs were isolated by electrophoresis on DE 81 paper (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corri, P., & Chambon, P., 1981, Anal Biochem 112, 295-298).
6. Die zurückgewonnenen langen Polymere wurden durch Einfüll-Reparatur unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von E.coli DNA Polymerase I stumpf-beendet und in die Smal-Stelle von M13MP19 RF DNA ligiert. (J. Messing & J. Vieira, 1982, Gene 19.269-276). Ligierte DNA wurde in E.coli JM101 transformiert und einsträngige Phagen-DNAvon individuellen weißen Plaques isoliert.6. The recovered long polymers were blunt-ended by fill repair using the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I and ligated into the SmaI site of M13MP19 RF DNA. (J. Messing & J. Vieira, 1982, Gene 19: 269-276). Ligated DNA was transformed into E. coli JM101 and single stranded phage DNA isolated from individual white plaques.
7. Der DNA-Insert jedes geklonten Isolats wurde mit Hilfe der Didesoxynucleotidmethode sequenziert (M. D. Biggin, T. J. Gibson & H. F. Hong, 1983, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 80, 3963-3965), um die Länge, Orientierung und Sequenz des polymeren Inserts zu bestimmen. Eine Rekombinant M13-Phage wurde gefunden und als M13-Kern A bezeichnet, die 50 Tandemwiederholungen der in der ausgereiften einsträngigen Phagen-DNA 5'-» 3' ausgerichteten Chi-Sequenz enthielt (d. h. der Insert ist Poly(Chi) und nicht Poly (komplementär von Chi).7. The DNA insert of each cloned isolate was sequenced by the dideoxynucleotide method (MD Biggin, TJ Gibson & HF Hong, 1983, Proc. Nat. Acad., USA 80, 3963-3965) for length, orientation and sequence of the polymeric insert. A recombinant M13 phage was found and designated M13 core A, which contained 50 tandem repeats of the Chi sequence aligned in the mature single-stranded phage DNA 5'- »3 (ie, the insert is poly (chi) rather than poly (chi) complementary to Chi).
8. Eine 32P-markierte einsträngige Hybridisierungssonde wurde durch Primer-Extension unter Anwendung der gleichen Methoden wie zur Herstellung der Sonden von Phage 33,6 und 33,15 hergestellt.8. A 32 P-labeled single-stranded hybridization probe was prepared by primer extension using the same methods as for preparing the phage 33,6 and 33,15 probes.
Unter Anwendung der obigen Technik wurden fünf weitere Versionen der Kernsequenz synthetisiert und als Polykern-Rekombinanten in M13 geklont, um Rekombinanten in M13 geklont, um Rekombinanten M13-Kern A-F zu gewinnen. Die Kernvarianten wurden so gewählt, daß sie sowohl hinsichtlich der Länge als auch der genauen Sequenz des Kernes variieren. Tabelle 5 enthält eine Zusammenstellung der Wiederholsequenz in Klonen M13-Kern A-F im Vergleich mit der Kernsequenz und mitfrüher verwendeten, in den früheren Anmeldungen beschriebenen Sonden 33,5,33,6 und 33,15. Die am stärksten invarianten Basen in der Kernsequenz sind unterstrichen. Die Orientierung jedes Insert in dem Vektor M13MP19 ist gleichfalls angegeben (-», Insert ist Poly(kern); <—, Insert ist die komplementäre Sequenz von Poly(kem). In der unteren Beschreibung angegebene Basen bezeichnen Abweichungen von der Kernsequenz. Kurze Charakterisierungen jeder Sequenz sind in den „Bemerkungen" zusammengefaßt.Using the above technique, five further versions of the core sequence were synthesized and cloned as poly-core recombinants in M13 to clone recombinants in M13 to recover recombinants M13 core A-F. The core variants were chosen to vary in both the length and the exact sequence of the core. Table 5 contains a summary of the repeat sequence in clones M13 core A-F as compared to the core sequence and with previously used probes 33,5,33,6 and 33,15 described in earlier applications. The most invariant bases in the core sequence are underlined. The orientation of each insert in the vector M13MP19 is also given (- », insert is poly (nucleus); <-, insert is the complementary sequence of poly (kem).) Bases given in the description below indicate deviations from the core sequence Each sequence is summarized in the "Remarks".
Tabelle 5: Charakterisierung von sechs künstlichen Minisatellitensonden (M13.Kern A-F)Table 5: Characterization of six artificial minisatellite probes (M13.Kern A-F)
Homologie (%) BP Anz.Orien- BemerkungenHomology (%) BP Num. Comments
Wieder-tierung holungenRe-cycling
Kern GGAGGTGGGCAGGAAG 16Core GGAGGTGGGCAGGAAG 16
G G
33,6 (a)a GGGCt GGAGG33.6 (a) a GGGCt GGAGG
33,15 a GAGGTGGGCAGGt GG33,15 a GAGGTGGGCAGGt GG
33,5 g GGAGGTGGGCAGGAGG33.5 g GGAGGTGGGCAGGAGG
M13.KernA TGGGCt GGM13.KernA TGGGCt GG
M13.KernB GTGGGCAGGAAGM13.KernB GTGGGCAGGAAG
M13.KemC TGGGCAGM13.KemC TGGGCAG
M13.KemD GGTGGGCAGGt GGM13.KemD GGTGGGCAGGt GG
M13.KernE a GGGCAM13.KernE a GGGCA
M13.KernF AGGcaGGtAGGtGG 14M13.KernF AGGCAGGTAGGTGG 14
100100
Bei einem anfänglichen Screening wurden DNA-Digests von zwei nicht-verwandten Individuen mit 33,15 und mit jeder der Sonden M13.Kern A-F sondiert. 8^g-Proben von DNA von zwei nichtverwandten Plazentas (1,2) wurden mit Hinfl digeriert, durch ein 0,7%iges Agarosegel elektrophoresiert, Southern-getüpfelt und zu jeder mit 32P markierten Sonde nach dem in der Hauptanmeldung beschriebenen Verfahren hybridisiert. Die gewonnenen Autoradiogramme sind in Fig. 11 enthalten. Alle Sonden entdeckten multiple DNA-Fragmente in jedem Individuum.In an initial screen, DNA digests from two unrelated individuals were probed at 33.15 and with each of the M13 core N probes. 8 g samples of DNA from two unrelated placentas (1,2) were digested, electrophoresed through a 0.7% agarose gel, spotted Southern and hybridized to each 32 P-labeled probe according to the method described in the parent application , The obtained autoradiograms are contained in FIG. 11. All probes detected multiple DNA fragments in each individual.
Die Sonden B, C und D entdeckten jeweils ein Erkennungszeichen (fingerprint) von DNA-Fragmenten, das bei den beiden Individuen erheblich differierte; das Erkennungszeichen (fingerprint) variierte auch von Sonde zu Sonde, obwohl einige Fragmente von mehr als einer Sonde entdeckt wurden und bis zu einem gewissen Grade mit der Gruppe der von Sonde 33,15 entdeckten hypervariablen Fragmenten eine Überlappung zeigten. Man schlußfolgert, daß die Sonden B-D alle für die DNA-Erkennung (fingerprinting) geeignet sind und zusammen die Anzahl von hypervariablen Minisatelliten, die bei Menschen und anderen Vertebraten untersucht werden können, erweitern werden. Von Interesse ist hier das mit Kern C gewonnene erfolgreiche Erkennungszeichen (fingerprint), das nur das mittlere am besten erhaltene 7-Basenpaar-Segment der Kernsequenz enthält.Probes B, C, and D each detected a fingerprint of DNA fragments, which differed significantly in the two individuals; the fingerprint also varied from probe to probe, although some fragments from more than one probe were discovered and to some extent overlap with the group of hypervariable fragments detected by probe 33,15. It is concluded that probes B-D are all suitable for DNA fingerprinting and, together, expand the number of hypervariable minisatellites that can be probed in humans and other vertebrates. Of interest here is the successful identification (fingerprint) obtained with core C, which contains only the middle best preserved 7 base pair segment of the core sequence.
Durch weitere Kürzung des Kernes zur Gewinnung der6-Basenpaar-Wiederholung in Kern.E wurde das DNA-Erkennungszeichenmuster vollständig verändert, um eine Gruppe von Fragmenten zu enthüllen, die meistens auf die beiden getesteten Individuen verteilt sind (d. h. diese Fragmente zeigen keine extreme polymorphe Veränderung). Daher ist Kern E vermutlich nicht so brauchbar wie eine Sonde für die DNA-Erkennungszeichen-Analyse wie die zuvor verwendeten Sonden 33,5, 33,6 und 33,15. Das läßt auch auf eine praktische Mindestforderung von 7-Basenpaaren von Kernsequenzen für eine allgemein erfolgreiche DNA-Erkennung (fingerprinting) schließen. Durch eine Zerreißung der mittleren am besten erhaltenen Region des Kernes (M 13.Kern F) scheint auch die Kompliziertheit und Variabilität des DNA-Erkennungszeichenmusters reduziert zu werden. M13.Kern A (Poly Chi) erzeugt ein neuartiges und intensives Muster von hybridisierenden DNA-Fragmenten. Viele dieser Fragmente sind sehr groß (>15KB) und schlecht aufgelöst und können ohne weiteres von einer herkömmlichen langen Satellitensequenz stammen, die die zufällige Hinfl-Spaltungsstelle enthält. Einige DNA-Fragmente zeigen individuelle Variabilität.By further truncation of the core to obtain the 6 base pair repeat in the core. E, the DNA recognition pattern was completely altered to reveal a group of fragments that are mostly distributed among the two individuals tested (ie, these fragments do not show extreme polymorphic change ). Therefore, nucleus E is probably not as useful as a probe for DNA label analysis like the previously used probes 33.5, 33.6 and 33.15. This suggests a practical minimum requirement of 7 base pairs of core sequences for generally successful DNA fingerprinting. Breaking the middle best conserved region of the nucleus (M 13.Kern F) also appears to reduce the complexity and variability of the DNA signature pattern. M13.Kern A (poly chi) generates a novel and intense pattern of hybridizing DNA fragments. Many of these fragments are very large (> 15KB) and poorly resolved and can be readily derived from a conventional long satellite sequence containing the random Hinfl cleavage site. Some DNA fragments show individual variability.
Weitere Untersuchung von Kern AFurther investigation of Kern A
Die von M13.Kern A erzeugten Muster wurden weiterhin bei der von Neurofibromatose befallenen Familie analysiert, die auch unter Verwendung der Sonden 33,6 und 33,15 umfassend charakterisiert wurde (siehe Beispiel 8 und Fig. 7). In Fig. 12 werden DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von Hinfl Digests von DNA von dem Vater (F), sechs Töchtern (D) und fünf Söhnen (S) gezeigt. Von Neurofibromatose befallene Personen, einem vererbten Autosomdominat-Krebs, sind mit + gekennzeichnet; DNA von der befallenen Mutter stand nicht zur Verfügung. Segregation von väterlichen (·) und mütterlichen (o) Bändern ist gekennzeichnet. Durch eine durchgehende Linie verbundene Bänder sind gekoppelt, und die durch gestrichelte Linien verbundenen segregrieren als AIIeIe. Mit(x) gekennzeichnete Bänder wurden kürzlich unter Verwendung von Sonde 33,15 entdeckt.The patterns generated by M13.Kern A were further analyzed in the neurofibromatosis-infested family, which was also characterized using probes 33.6 and 33.15 (see Example 8 and Figure 7). In Fig. 12, fingerprints of Hinfl digests of DNA from the father (F), six daughters (D), and five sons (S) are shown. Neurofibromatosis-affected individuals, an inherited autosomal cancer, are marked with +; DNA from the afflicted mother was not available. Segregation of paternal (·) and maternal (o) ligaments is indicated. Bands connected by a solid line are coupled, and those connected by dashed lines are segregated as aII. Bands labeled (x) were recently discovered using probe 33,15.
ErgebnisseResults
Im Gegensatz zu den mit den Sonden 33,6 und 33,15 gewonnenen DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) ist der Grad der Variabilität verhältnismäßig gering, wobei viele Fragmente an alle Nachkommen übertragen werden (d. h. diese Fragmente sind gemeinsam, nicht selten, in der Population vorhanden und oftmals im homozygoten Zustand vorhanden). Die Segregation von 6 heterozygoten väterlichen und 9 heterozygoten mütterlichen Bändern konnte in der Gruppe der 11 Kinder bewertet werden.In contrast to the fingerprints obtained with probes 33,6 and 33,15, the degree of variability is relatively low, with many fragments being transferred to all offspring (ie, these fragments are common, not uncommon, in the population present and often present in the homozygous state). The segregation of 6 heterozygous paternal and 9 heterozygous maternal bands was evaluated in the group of 11 children.
Eines der väterlichen und ein allelomorphes Paar der mütterlichen Bänder wurde früher mit Sonde 33,15 entdeckt. Nach Eliminierung allelomorpher und gekoppelter Paare von Bändern stehen 2 neue väterliche Stellen und 6 neue mütterliche Stellen zur Verfügung, die bisher weder mit Sonde 33,6 noch mit 33,15 bewertet wurden, im Vergleich zu 34 väterlichen und 25 mütterlichen früher bewerteten Stellen. Die Poly-Chi-Sonde ist daher bei der Gen-Analyse bei Menschen nur von begrenztem Nutzen.One of the paternal and one allelomorphic pair of maternal ligaments was previously discovered using probe 33,15. After elimination of allelomorphic and coupled pairs of ligaments, there are 2 new paternal sites and 6 new maternal sites that have not previously been scored with either 33.6 or 33.15, compared to 34 paternal and 25 maternal previously assessed sites. The poly-Chi probe is therefore of limited use in gene analysis in humans.
Die Ergebnisse der Beispiele 16 und 17 bestätigen die Bedeutung der neun in der obersten Reihe von Tabelle 5 unterstrichenen und früher auf Seite 18 der Hauptanmeldung erörterten Dominant-Nucleotide. Es ist ein langer Weg zurückzulegen, um die in der Hauptanmeldung gemachte Voraussage, daß eine Mindestsequenz von sechs Nucleotiden in einem erfolgreichen Sondenkern erforderlich ist, bestätigen zu können. Somit ist Kern E ein Vertreter mit minimaler Nützlichkeit, und es ist möglich, daß andere Sequenzen von sechs Nucleotiden eine schwach verbesserte Brauchbarkeit zeigen könnten, z. B. die Sequenz TGGGCA, die später erklärt wird. Die Erhöhung auf sieben Nucleotide ist im Rahmen der Erfindung ziemlich dramatisch. In einem Versuch, die wichtigsten Punkte einer brauchbaren Kemsequenz zu definieren, können die Varianten X und Y, die oben zur Kennzeichnung alternativer Nucleotide verwendet wurden, mit Erfolg zu einer vollständigen logischen Gruppe erweitert werden, wie anschließend gezeigt wird:The results of Examples 16 and 17 confirm the importance of the nine underlined in the top row of Table 5 and discussed earlier on page 18 of the parent application dominant nucleotides. It is a long way to go to confirm the prediction made in the parent application that a minimum sequence of six nucleotides in a successful probe core is required. Thus, core E is a minimal utility and it is possible that other sequences of six nucleotides might show poorly improved utility, e.g. For example, the sequence TGGGCA, which will be explained later. The elevation to seven nucleotides is quite dramatic in the invention. In an attempt to define the key points of a useful nucleotide sequence, variants X and Y used above to designate alternative nucleotides can be successfully extended to a complete logical group, as shown below:
X = AoderG P = nichtGX = A or G P = notG
Y = CoderT (Q = nicht A) W = AoderT (R = nichtC)Y = CoderT (Q = not A) W = A or T (R = notC)
V = C oder G (S = nicht T)V = C or G (S = not T)
(O = alles)(O = everything)
( ) = in der folgenden Diskussion nicht verwendet. *() = not used in the following discussion. *
Durch Anwendung dieser Terminologie kann von einem erfindungsgemäßen Aspekt gesagt werden, daß er ein Polynucleotid betrifft, das die folgende wiederholte Kemsequenz:By applying this terminology, an aspect of the invention can be said to relate to a polynucleotide having the following repeated nucleotide sequence:
GPGGGCWGGWXG (6)GPGGGCWGGWXG (6)
enthält. Die obige kennzeichnet natürlich die repräsentativste Zwölf-Nucleotid-Sequenz. Es wurde jedoch gezeigt, daß der Sieben-Nucleotid-Kem C gleichfalls sehr brauchbar ist, und um diesen mit „erlaubten" Varianten von der obigen Zwölf-Kernsequenz mit einzubeziehen, kann ein Aspekt so ausgelegt werden, daß er auch ein Polynucleotid, das Wiederholungen der unten aufgeführten Sieben-Kernsequenz aufweistcontains. The above, of course, identifies the most representative twelve-nucleotide sequence. However, it has been shown that the seven nucleotide core C is also very useful, and to include this with "allowed" variants from the above twelve nucleotide sequence, one aspect may be construed as including a polynucleotide, the repeats has the seven core sequence listed below
PGGGCWG (7)PGGGCWG (7)
umfaßt.includes.
Vorzugsweise wird P natürlich gleich T wie in Kern C sein. Die andere günstigste Möglichkeit wäre A.Preferably, P will of course be equal to T as in core C. The other cheapest option would be A.
Wegen der Deutlichkeit wurde die prozentuale Homologie auch in Tabelle 3 angegeben. Hinsichtlich der künstlichen Sonden dieser Anmeldung sollte beachtet werden, daß es sich bei den Wiederholungen um genaue Wiederholungen handelt, so daß die Homologie des Minisatelliten als Ganzes durch die Homologie der Kemsequenz angegeben werden kann. Das war nicht unbedingt bei den früheren Sonden 33,6,33,15 und 33,5 der Fall, bei denen die Homologie in Klammern angegeben wurde. Das ist auf zwischen den Wiederholungen auftretende Varianten zurückzuführen. Kern F deutet vielleicht auf eine minimale prozentuale Homologie für die Brauchbarkeit hin. Dieses Fehlen von Konsensus wurde vermutlich durch das Zerreißen der mittleren/in dem Kern vorhandenen GruppierungBecause of the clarity, the percent homology was also given in Table 3. With respect to the artificial probes of this application, it should be noted that the repeats are exact repeats, so that the homology of the minisatellite as a whole can be indicated by the homology of the nucleotide sequence. This was not necessarily the case for the former probes 33, 36, 33, 15 and 33, where homology was given in parentheses. This is due to variations occurring between repetitions. Kern F may indicate a minimum percentage homology for usability. This lack of consensus was probably due to the disruption of the middle / existing clustering in the nucleus
TGGGCA (8)TGGGCA (8)
übertrieben. Es ist bemerkenswert, daß die obige Gruppierung in den erfolgreichsten Sonden B, C und D vorhanden ist und in allen weniger erfolgreichen A, E und Fzerrissen ist. Es ist daher zu erwarten, daß erfolgreichere Sonden mit einem Minimum von 70% Gesamthomologie mit Formel (6) zu erzeugen sein müßteexaggerated. It is noteworthy that the above grouping exists in the most successful probes B, C, and D, and is less successful in all A, E, and tears. It is therefore expected that more successful probes would have to be produced with a minimum of 70% total homology with formula (6)
Es ist bemerkenswert, daß die mittlere Sechs-Polynucleotidgruppierung von Formel (8) It is noteworthy that the middle six-polynucleotide moiety of formula (8)
TGGGCATGGGCA
in Kern E gleichfalls zerrissen wurde. Es könnte möglich sein, daß eine Sechs-Nucleotid-Kernsequenz wie oben erfolgreicher sein würde, obwohl die Erhöhung der Länge von.sechs auf sieben Nucleotide sich als ein stärker vorherrschendes Merkmal erweisen könnte.was likewise torn in core E. It might be possible that a six nucleotide core sequence would be more successful as above, although increasing the length from six to seven nucleotides could prove to be a more prevalent feature.
Daher kann von einem erfindungsgemäßen Aspekt gesagt werden, daß er ein Polynucleotid, das Wiederholungen der Kemsequenz TGGGCA aufweist, betrifft.Therefore, an aspect of the present invention can be said to relate to a polynucleotide having repeats of the sequence of TGGGCA.
Allgemeiner kann gesagt werden, daß die Erfindung in einem Aspekt ein Polynucleotid nach der „ersten" Definition oben betrifft, in dem die Sequenz TGGGCA in allen sich wiederholenden Sequenzen vorhanden ist.More generally, in one aspect, the invention relates to a "first" definition above polynucleotide in which the sequence TGGGCA is present in all the repeating sequences.
Unter einem anderen Aspekt betrachtet, kann von der Erfindung gesagt werden, daß sie eine Modifikation des Polynucleotide von der „ersten" Definition oben betrifft, in dem „Kern" eine Sequenz von mindestens sechs aufeinanderfolgenden Nucleotiden, gelesen in der gleichen 5' —» 3' Richtung, ausgewählt aus der in Formel (2) gezeigten Sequenz, darstellt; „Kern" muß nicht unbedingt die gleiche Sequenz in jeder sich wiederholenden Einheit haben, vorausgesetzt, daß alle Einheiten die Sequenz TGGGCA enthalten.Viewed from another aspect, the invention may be said to relate to a modification of the "first" definition polynucleotide above, in which "nucleus" is a sequence of at least six consecutive nucleotides read in the same 5 '' 3 '' sequence Represents direction selected from the sequence shown in formula (2); "Core" need not necessarily have the same sequence in each repeating unit, provided that all units contain the sequence TGGGCA.
Vorzugsweise werden die übrigen Gruppen jeder Einheit mindestens 70% Homologie mit der Sequenz von Formel (6) (oder noch besser von Formel [2]) innerhalb der Grenzen der Gesamteinheitslänge aufweisen.Preferably, the remaining groups of each unit will have at least 70% homology with the sequence of formula (6) (or even better of formula [2]) within the limits of the total unit length.
Die Bestimmung von Zygotie bei Zwillingen ist nicht nur für epidemiologische, genetische und geburtshilfliche Untersuchungen von Bedeutung, sondern auch wegen der Differenz in der Prognose zwischen monozygOten und dizygoten Zwillingen. Monozygote oder eineiige Zwillinge haben ein geringeres Geburtsgewicht, bereiten größere medizinische Schwierigkeiten und weisen höhere Sterblichkeitsraten als dizygote Zwillinge auf. Bei Kaukasiern sind etwa 30% der neugeborenen Zwillinge von unterschiedlichem Geschlecht und somit dizygot. Eine Untersuchung der Plazentamembran zeigt, daß weitere 20% der Fälle monochorionisch sind, und diese sind immer monozygot. Die übrigen 50%, ein Anteil der verhältnismäßig konstant auf Populationen verteilt ist, haben gleiches Geschlecht, haben diamniotische dichorionische Plazentas und können entweder mono-oder dizygot sein. Es wurde eine Vielzahl von Methoden zur Bestimmung von Zygotie in diesen Fällen angewandt, wobei das allgemeine Aussehen, Erkennungszeichenermittlung (fingerprinting), Hauttransplantation, Geschmackprüfung und Bestimmung genetischer Markierer vorgenommen wurden. Das letztere ist am zuverlässigsten mit einer Genauigkeit von 95 bis 98%. Normalerweise müssen jedoch sehr viele derartige Markierer untersucht werden, weil die meisten Protein- und Antigenvarianten verhältnismäßig geringe mittlere Heterozygotien haben.The determination of zygote in twins is important not only for epidemiological, genetic and obstetric examinations, but also for the difference in prognosis between monozygotic and dizygotic twins. Monozygotic or identical twins have lower birth weight, greater medical difficulty, and higher mortality rates than dizygotic twins. In Caucasians, about 30% of newborn twins are of different sex and thus dizygot. An examination of the placental membrane shows that a further 20% of the cases are monochorionic, and these are always monozygotic. The remaining 50%, a proportion of which is relatively constant on populations, have the same sex, have diamniotic dichorionic placentas, and may be either mono or dizygotic. A variety of methods have been used to determine zygote in these cases, including general appearance, fingerprinting, skin grafting, taste testing, and genetic marker determination. The latter is the most reliable with an accuracy of 95 to 98%. Normally, however, many such markers must be screened because most protein and antigen variants have relatively low average heterozygotes.
In den folgenden Beispielen wurden DNA von zwölf Paaren neugeborener Zwillinge unter Verwendung der oben beschriebenen Minisatelliten-DNA-Sonden untersucht. Erzielte DNA-„Fingerabdrücke" demonstrieren eine solche Variabilität zwischen Personen, daß nur monozygote Zwillinge identische Muster zeigen. In den sieben Fällen, in denen Zygotie durch Geschlechtsbeobachtungen oder Plazentauntersuchungen bestimmt werden konnte, stimmten die DNA-Ergebnisse mit diesen Ermittlungen überein. Bei den anderen fünf Zwillingspaaren und bei den zwei Gruppen von Drillingen ermöglichte die DNA-Analyse eine rasche Bestimmung von Zygotie. Erfindungsgemäße DNA-Sonden bieten somit einen einfachen genetischen Test, der eine positive Bestimmung von Zygotie in allen Fällen von mehrkeimiger Schwangerschaft ermöglichen sollte.In the following examples, DNA from twelve pairs of newborn twins were examined using the minisatellite DNA probes described above. DNA fingerprinting demonstrated such variability between individuals that only monozygotic twins show identical patterns: in the seven cases in which zygote could be determined by gender observation or placental examination, the DNA results agreed with these findings Five pairs of twins and the two sets of triplets allowed DNA analysis to rapidly determine zygote DNA probes of the invention thus provide a simple genetic test that should allow a positive determination of zygote in all cases of multiple pregnancy.
Einsträngige-DNA-Sonden 33,6 und 33,15 wurden zur Bestimmung von Zygotie bei zwölf Paaren neugeborener Zwillinge verwendet, worüber Einzelheiten in Tabelle 6 zu finden sind.Single-stranded DNA probes 33.6 and 33.15 were used to determine zygotia in twelve pairs of neonatal twins, details of which can be found in Table 6.
Plazentation*Placentation *
DNA-MusterDNA pattern
Monochorionisch Dochorionisch Dichorionisch Monochorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch DichorionischMonochorionic Dochorionisch Dichorionisch Monochorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch Dichorionisch
IdentischIdentical
NichtidentischNot identical
IdentischIdentical
IdentischIdentical
NichtidentischNot identical
NichtidentischNot identical
IdentischIdentical
NichtidentischNot identical
NichtidentischNot identical
NichtidentischNot identical
IdentischIdentical
NichtidentischNot identical
* Alle Plazentas waren diamnionisch* All Plazentas were diamnionic
Bei Entbindung entnommene Nabelschnur-Blutproben oder peripherale Blutproben (0,5 bis 1,0 ml), die von jedem Baby am Tage nach der Geburt gewonnen wurden, wurden zur DNA-Extraktion verwendet. Plazentas wurden untersucht, um zu bestimmen, ob sie mono- oder diamniotisch oder chorionisch waren. DNA wurde mit Hilfe von Standard-Verfahren extrahiert (Old, J. M., Higgs, D. R., Gene analysis in D.J.Weatherall, Herausg.TheThalassaemias. Methods in Haematology [Die Thalassämie. Verfahren in der Hämatologie], Churchill Livingstone, 1983) und 10 bis 15^g wurden mit Hinfl digeriert. Die Proben wurden durch ein 22cm langes 0,6%igesAgarosegel bei 45V etwa 36 Stunden lang elektrophoresiert, bis alle < 1,5 KB langen DNA-Fragmente vom Gel abelektrochoresiert worden waren. DNA wurde durch Tüpfeln auf ein Nitrozellulosefilter übertragen und zwei Stunden lang unter Vakuum getrocknet. Dieeinsträngigen DNA-Sonden, 33,15 und 33,6 wurden nach obiger Beschreibung mit 32P markiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 dargestellt.At-delivery umbilical cord blood or peripheral blood samples (0.5-1.0 ml) taken from each baby on the day after birth were used for DNA extraction. Placentas were examined to determine if they were mono- or diamiotic or chorionic. DNA was extracted by standard methods (Old, JM, Higgs, DR, Gene analysis in DJ Weatherall, Ed. The Thalassaemias, Methods in Hematology [Thalassemia, Method in Hematology], Churchill Livingstone, 1983) and 10 to 15 ^ g were killed with Hinfl. The samples were electrophoresed through a 22cm long 0.6% agarose gel at 45V for about 36 hours until all <1.5KB long DNA fragments were electroblasted from the gel. DNA was transferred to a nitrocellulose filter by spotting and dried under vacuum for two hours. Single-stranded DNA probes 33, 15 and 33.6 were labeled with 32 P as described above. The results are shown in FIG.
In Fig. 13 zeigen die Lanes 1,2 die DNA-Bandmuster, die bei jedem Zwilling im Falle 1 unter Anwendung dereinsträngigen 33,6-Minisatellitensonde gewonnen wurden. Lanes 3 bis 19 zeigen die mit der einsträngigen 33,15-Sonde erzielten „Fingerprints": — Fall 1, Lanes 3,4; Fall 2 Lanes 5, 6; Fall 3, Lanes 7, 8; Fall 4, Lanes 9,10; Fall 5, Lanes 11,12; Fall 6, Lanes 13, 14; Fall 7, Lanes 15,16. Lanes 17 bis 19 sind drei Drillinge von weiblichem, männlichem und weiblichem Geschlecht. Ein Vergleich der Lanes 1 und 2 mit den Lanes 3 und 4 zeigt, daß die beiden Sonden 33,6 und 33,15 verschiedene Gruppen von Minisatellitenbändern entdecken. Größenmarkierer sind in Kilobasen angegeben.In Figure 13, lanes 1, 2 show the DNA band patterns obtained for each twin in case 1 using the single-stranded 33.6 minisatellite probe. Lanes 3 to 19 show the "fingerprints" obtained with the single-stranded 33,15 probe: Case 1, Lanes 3,4, Case 2 Lanes 5, 6, Case 3, Lanes 7, 8, Case 4, Lanes 9, 10 Case 5, Lanes 11, 12; Case 6, Lanes 13, 14; Case 7, Lanes 15, 16. Lanes 17 to 19 are three triplets of female, male, and female gender. A comparison of Lanes 1 and 2 with the lanes 3 and 4 show that the two probes 33, 6 and 33, 15 detect different groups of minisatellite bands Size indicators are in kilobases.
In sieben Fällen (siehe Tabelle 6) konnte Zygotie einfach durch Untersuchung des Geschlechts der Zwillinge und ihrer Plazentamembranen bestimmt werden. Alle Zwillinge mit monochorionischen (oder monoamniotischen) Plazentas (z. B. Fall 1) sind monozygot, obwohl nur etwa 50% der monozygoten Zwillinge monochorionische Plazentas haben (2). Folglich mußten die Zwillinge im Fall 1 monozygot sein, und sie zeigten identische DNA-Muster bei beiden Sonden 33,15 und 33,6 (Fig. 1). In fünf Fällen hatten die Zwillinge unterschiedliches Geschlecht und zeigten bei beiden Sonden 33,15 und 33,6 unterschiedliche Bandmuster. In den Fällen 3,5,7,9 und 11 wiesen die Zwillinge das gleiche Geschlecht auf und hatten dichorionische Plazentas, daher konnten sie weder mono- noch dizygot sein. DNA-Analysen zeigten, daß zwei Paare von Zwillingen (Fälle 5 und 9) unterschiedliche Bandmuster hatten und daher dizygot waren, während identische Bänder in den drei anderen Fällen (Fällen 3,7 und 11) auf Monozygotie deuteten.In seven cases (see Table 6), zygotes were easily determined by examining the sex of the twins and their placental membranes. All twins with monochorionic (or monoamniotic) placentas (eg, Case 1) are monozygotic, although only about 50% of the monozygotic twins have monochorionic placentas (2). Thus, in Case 1, the twins had to be monozygotic, and they showed identical DNA patterns in both probes 33, 15 and 33, 6 (Figure 1). In five cases, the twins had different sexes and showed different band patterns for both probes 33,15 and 33,6. In cases 3, 5, 7, 9 and 11, the twins were of the same sex and had Dichorionic placentas, so they could not be mono- or dizygotic. DNA analyzes showed that two pairs of twins (cases 5 and 9) had different band patterns and were therefore dizygous, whereas identical bands in the other three cases (cases 3, 7 and 11) indicated monozygosity.
Zwei Gruppen von neugeborenen Drillingen wurden in gleicher Weise untersucht. In beiden Fällen hatte die Mutter Fruchtbarkeitsmedikamente zur Herbeiführung einer Schwangerschaft eingenommen, und jeder Drilling zeigte ein einmaliges Bandmuster (z.B. Lane 17 bis 19, Fig. 13).Two groups of newborn triplets were examined in the same way. In both cases, the mother had taken fertility drugs to induce pregnancy, and each treble showed a unique banding pattern (e.g., Lane 17-19, Figure 13).
Die Ergebnisse gehen aus Fig. 14 hervor, in der Lanes 1 und 2 die Ergebnisse bei Verwendung von einsträngiger33,15 und die Lanes 3 und 4 die Ergebnisse bei Verwendung von doppelsträngiger 33,15 zeigen.The results are shown in Figure 14, in which Lanes 1 and 2 show the results using single stranded 33,15 and Lanes 3 and 4 the results using double stranded 33,15.
Obwohl sowohl ein- als auch doppelsträngige Sonden für die Erarbeitung jeder Diagnose ausreichten, konnten mehr Bänder mit radioaktiveren einsträngigen Sonden unterschieden werden (Fig. 14).Although both single- and double-stranded probes were sufficient for the preparation of each diagnosis, more bands could be distinguished with more radioactive single-stranded probes (Figure 14).
Als Alternative zu diesen einsträngigen Sonden wurde die Möglichkeit untersucht, die entsprechenden doppelsträngigen Sonden einzusetzen, die in den meisten Laboratorien bekannter sind. Bei den verwendeten doppelsträngigen DNA-Sonden handelte es sich um I) ein doppelsträngiges 600BP Pstl — Ahalll-Fragment, das den „Kem"-Minisatelliten von λ33,15, enthielt, und I!) ein doppelsträngiges 720 BPHaelll-Fragment, das den „Kern"-Minisatelliten von λ33,6 enthielt. Diese wurden durch Einschnitt-Translation zu einer spezifischen Aktivität von 0,5 bis 1,0 χ 109cpm 32VIpQ DNA markiert. Die Bedingungen für die Prähybridisierung und die Hybridisierung entsprachen den in dem oben identifizierten Standardverfahren beschriebenen, nur wurden 1 χ SSC und 10 % Dextransulfat in dem Hybridisierungspuffer für die doppelsträngigen Sonden verwendet. Die Filter wurden 1 Stunde lang in 1 χ SSC bei 65°C gewaschen und mit Verstärkerfolien 1 bis 3 Tage lang bei -70°C autoradiographiert.As an alternative to these single-stranded probes, the possibility of using the corresponding double-stranded probes known in most laboratories has been explored. The double-stranded DNA probes used were I) a 600BP double-stranded PstI-Ahalll fragment containing the "Kem" minisatellite of λ33.15, and I!) A double-stranded 720 BPHaIII fragment containing the " Core "minisatellite of λ33.6. These were labeled by incision translation to a specific activity of 0.5 to 1.0 χ 10 9 cpm 32 VIpQ DNA. The conditions for prehybridization and hybridization were as described in the standard procedure identified above, except that 1 χ SSC and 10% dextran sulfate were used in the hybridization buffer for the double-stranded probes. The filters were washed for 1 hour in 1 χ SSC at 65 ° C and autoradiographed with intensifying screens at -70 ° C for 1 to 3 days.
In den sieben Fällen, in denen Zygotie unabhängig bestimmt werden konnte, stimmten die DNA-Ergebnisse mit den aufgrund von Beobachtungen des Geschlechts und von Plazentauntersuchungen gezogenen Schlußfolgerungen überein. Bei den anderen fünf Paaren war eine eindeutig klare Bestimmung von Zygotie mit Hilfe der Minisatellitensonden möglich. In ähnlicher Weise konnten von den beiden untersuchten Drillings-Gruppen nachgewiesen werden, daß sie trizygot sind. In den 50% der Fälle, in denen Zwillingszygotie weder anhand des ungleichen Geschlechts (dizygot) noch einer monochorionischen Plazenta (monozygot) bestimmt werden kann, muß eine genetische Analyse angewandt werden. Der Informationswert solcher Tests ist dem Umfang von Polymorphismusan den untersuchten Genstellen und der Anzahl der getesteten Stellen proportional. Bei mehrfachen Antigen- und Enzymbestimmungen roter Blutkörperchen können Genauigkeiten in bezug auf von Zygotie in der Größenordnung von 95 bis 98% erreicht werden, allerdings nur, wenn die relevanten Allelhäufigkeiten in der Population bekannt sind (Nylander, P. P. S., The phenomenon of twinning (das Phänomen von symmetrischer Zellteilung). In: Barron, S. L., Thomson, A. M., Herausgeber, Obstetrical Epidemiology (Epidemologie in der Geburtshilfe). London, Academic Press, 1983:143-165). Auch die Analyse hinsichtlich mehrfachem Restriktionsenzym-Stellenpolymorphismus ergibt mit mehreren verschiedenen DNA-Sonden einen erheblichen Prozentsatz von „falscher positiver" Diagnose von Monozygotie (Derom, C, Bakker, E., Vlietinek, R., Derom, R., Van der Berghe, HI,Thiery, M., Pearson, P., Zygosity determination in newborn twins using DNA variants [Bestimmung von Zygotie bei neugeborenen Zwillingen unter Verwendung von DNA-Varianten]), J. Med. Genet., 1985,22: 279-282). Durch erfindungsgemäße Minisatellitensonden wird dieses Problem wegen der großen Anzahl und der beträchtlichen Variabilität der hypervariablen DNA-Segmente, die sie entdecken, gelöst. Wie bereits oben beschrieben, sind hybridisierende Minisatellitenfragmente nur selten zwischen willkürlich ausgewählten Personen verteilt (vergleiche auch nicht verwandte Personen in Fig. 13). Es wurde oben- schon gezeigt, daß die Chancen gegen zwei nicht verwandte Personen, die identische DNA Erkennungszeichen (fingerprints) mit beiden Sonden 33,6 und 33,15 zeigen, die verschiedene Gruppen hypervariabler Stellen entdecken, daher astronomisch sind (p < 1018, siehe Beispiel 4). Bei blutsverwandten Gruppen, die etwa die Hälfte ihrer Fragmente gemeinsam besitzen, beträgt die Wahrscheinlichkeit einer solchen „falschen positiven" Diagnose von genetischer Identität <10~8. Daher wird durch die kombinierte Verwendung der einsträngigen Hybridisierungssonden 33,6 unS 33,15 eine Genauigkeit erzielt, die.einige Größenordnungen höher als bei bisherigen genetischen Tests liegt. Selbst bei der Anwendung der konventionelleren doppelsträngigen Minisatellitensonden, die nicht zu den durch die einsträngigen Sonden entdeckten schwächeren Bändern hybridisieren können (Fig. 14), können noch genügend Informationen aus DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) gewonnen werden, um die Rate an „falscher Monozygotie" auf < 10~4 zu senken.In the seven cases where zygote could be independently determined, the DNA results were consistent with the conclusions drawn from observations of sex and placental findings. For the other five pairs, a clear determination of zygote was possible with the help of minisatellite probes. Similarly, the two triplets studied proved to be trizygous. In the 50% of cases where twin cytotoxicity can not be determined by either the unequal sex (dizygot) or a monochorionic placenta (monozygotic), a genetic analysis must be used. The informational value of such assays is proportional to the amount of polymorphism at the sites of interest and the number of sites tested. With multiple antigen and enzyme determinations of red blood cells, accuracies with respect to zygotes of the order of 95 to 98% can be achieved, but only if the relevant allele frequencies in the population are known (Nylander, PPS, The phenomenon of twinning of symmetric cell division) In: Barron, SL, Thomson, AM, Editor, Obstetrical Epidemiology, London, Academic Press, 1983: 143-165). Multiple restriction enzyme site polymorphism analysis also yields a significant percentage of "false positive" diagnosis of monozygosity with several different DNA probes (Derom, C, Bakker, E., Vlietinek, R., Derom, R., Van der Berghe, HI, Thiery, M., Pearson, P., Zygosity determination in newborn twins using DNA variants [Determination of zygotia in neonatal twins using DNA variants]), J. Med. Genet., 1985, 22: 279-282 Minisatellite probes according to the present invention solve this problem because of the large number and considerable variability of the hypervariable DNA segments they detect.As already described above, hybridizing minisatellite fragments are rarely distributed between randomly selected individuals (see also unrelated persons in US Pat It has been shown above that the odds against two unrelated individuals displaying identical DNA recognition characters (fingerpr ints) with both probes 33, 6 and 33, 15, which detect different groups of hypervariable sites, are therefore astronomical (p < 10 18 , see Example 4). For blood-related groups that share about half of their fragments, the likelihood of such a "false positive" diagnosis of genetic identity is <10 -8 Therefore, accuracy is achieved through the combined use of single-stranded hybridization probes 33.6 and 33.15 Even with the use of the more conventional double-stranded minisatellite probes, which can not hybridize to the weaker bands discovered by the single-stranded probes (Figure 14), enough information can still be obtained from DNA labels ( fingerprints) are obtained in order to reduce the rate of "false Monozygotie" to <10 ~ 4th
Ein weiterer Vorteil dieser Methode der Zygotie-Bestimmung liegt darin, daß nur sehr wenig Probe für die Analyse erforderlich ist. Die Hälfte eines Milliliters von peripherem oder Nabelschnurblut ergab immer ausreichend DNA. Durch Schaffung dieser unkomplizierten Mittel zur Bestimmung von Zygotie bei neugeborenen sowie älteren Zwillingen und Drillingen müßten genauere epidemiologische Studien über die Determinanten und die Einflüsse für verschiedene Arten von Mehrfachschwangerschaft möglich sein.Another advantage of this method of zygotic determination is that very little sample is required for the analysis. Half a milliliter of peripheral or umbilical cord blood always yielded sufficient DNA. By providing these uncomplicated means of determining zygotia in neonate and older twins and triplets, more detailed epidemiological studies of the determinants and effects of different types of multiple pregnancy should be possible.
In den folgenden Beispielen werden Molekülmasse-Markierer in den Autoradiogrammen nicht angegeben, aber der wirksame allgemeine Bereich betrug 1,5 bis 2OkB wie bei anderen Ergebnissen.In the following examples, molecular weight markers are not reported in the autoradiographs, but the effective general range was 1.5 to 2OkB as in other results.
Anwendung von DNA-Erkennungszeichenermittlung (fingerprinting) in der Gerichtswissenschaft Durch .die individuelle Spezifität der durch die Minisatellitensonden 33,6 und 33,15 entdeckten DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) sind diese ideal für die Personenidentifizierung in der Gerichtswissenschaft geeignet. Die einzige Unsicherheit besteht darin, ob DNA in einer ausreichend gut erhaltenen Form, beispielsweise in getrocknetem Blut oder Samenspuren, überlebt, um die DNA-Erkennungszeichen-Analyse durchführen zu können. Um die Möglichkeit, gerichtliche Proben analysieren zu können, zu bestimmen, wurde eine Versuchsstudie mit von Dr. Peter Gill vom Home Office Central Research Establishment, Aldermaston, gelieferten DNA-Proben durchgeführt.Application of DNA Fingerprinting in Jurisprudence Through the individual specificity of the fingerprint identifiers discovered by the minisatellite probes 33, 6 and 33, 15, these are ideally suited for person identification in the field of jurisprudence. The only uncertainty is whether DNA in a well-preserved form, such as dried blood or semen, will survive to perform the DNA label analysis. In order to determine the possibility of being able to analyze forensic samples, an experimental study with Peter Gill of the Home Office Central Research Establishment, Aldermaston, supplied DNA samples.
Getrocknetes Blut und Samenspuren von Kleidung wurden vor der von Dr. Gill ausgeführten DNA-Extraktion (Lysis mit SDS in Gegenwart von 1 M DTT, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation) verschieden lange bei Raumtemperatur gehalten. DNA wurde ebenfalls aus frischen Haarwurzeln und von vor und nach Geschlechtsverkehr gemachten Vagina-Abstrichen extrahiert. Die DNA-Proben wurden mit Hinfl digeriert, durch ein 0,8%iges Agarosegel elektrophoresiert und auf ein Nitrozellulosefilter getüpfelt. Das Filter wurde mit 32P-markierter einsträngiger Sonde 33,15 unter Anwendung der oben beschriebenen Standard-Technik hybridisiert.Dried blood and traces of clothing were removed before Dr. Gill performed DNA extraction (lysis with SDS in the presence of 1 M DTT, followed by phenol extraction and ethanol precipitation) for several days at room temperature. DNA was also extracted from fresh hair roots and vaginal smears taken before and after sexual intercourse. The DNA samples were digested, electrophoresed through a 0.8% agarose gel, and spotted onto a nitrocellulose filter. The filter was hybridized with 32 P-labeled single-stranded probe 33,15 using the standard technique described above.
Bei den elektrophoresierten Proben handelte es sich um:The electrophoresed samples were:
1. 40μ\ Samenspuren an Kleidung, 4 Wochen alt1. 40 μ \ semen traces of clothing, 4 weeks old
2. 40μΙ frischer Samen2. 40μΙ fresh seeds
3. 60μ.Ι frisches Blut3. 60μ.Ι fresh blood
'4. 60μΙ Blutspuren an Kleidung, 4 Wochen alt'. 4 60μΙ traces of blood on clothing, 4 weeks old
5. 60μΙ Blutspuren an Kleidung, 2 Jahre alt5. 60μΙ traces of blood on clothing, 2 years old
6. 15 Haarwurzeln6. 15 hair roots
N. B. 1 bis 6 waren von dem gleichen Mann entnommen worden.N.B. 1 to 6 were taken from the same man.
7. 60μΙ Blutspuren an Kleidung, männlicher, frisch.7. 60μΙ blood traces of clothing, male, fresh.
8. Vaginaabstrich von 11, eine Stunde nach Geschlechtsverkehr mit 7 angefertigt8. vaginal smear of 11, one hour after having sex with 7 made
9. Wie bei 8, aber 7 h nach Geschlechtsverkehr9. As at 8, but 7 hours after sexual intercourse
10. Vaginaabstrich von 1110. vagina smear of 11
11. 60μ,Ι Blutspuren an Kleidung, weiblicher, frisch.11. 60μ, Ι traces of blood on clothing, female, fresh.
Die gewonnenen DNA-Erkennungszeichen sind in Fig. 15 dargestellt. Für jede zur Analyse vorgesehene Probe wurde ausreichend DNA (~0,5 bis 3/u.g) extrahiert. DNA in bis zu 2 Jahre alten getrockneten Blutspuren und in bis zu 1 Monat altem getrocknetem Samen war nicht erheblich verschlechtert und ergab identische DNA-Erkennungszeichen (fingerprints)(wie sie ausfrischem Blut und Samen der gleichen Person erzielt wurden. Ein DNA-Erkennungszeichen (fingerprint) könnte ebenfalls von nur 15 Haarwurzeln gewonnen werden.The recovered DNA labels are shown in FIG. For each sample intended for analysis, sufficient DNA (~ 0.5 to 3 / μg) was extracted. DNA in dried blood traces up to 2 years old and in dried seeds up to 1 month old did not significantly deteriorate, giving identical DNA fingerprints ( as obtained from fresh blood and semen from the same individual.) A DNA signature (fingerprint ) could also be obtained from just 15 hair roots.
Die nach dem Geschlechtsverkehr angefertigten Vaginaabstriche ergaben auch ein nicht verschlechtertes DNA-Erkennungszeichen (fingerprint). Die Abstrichmuster entsprachen aber hauptsächlich dem des Blutes der Frau und nicht des Mannes, was besagt, daß der größte Teil der von den Abstrichen gesammelten DNA von während des Abstriches abgestreiften Vaginaepithelzellen und nicht von Sperma stammte. Trotzdem konnten drei nicht-weibliche Bänder in den nach-koitalen Proben entdeckt werden; diese entsprachen den Hauptbändern im Blut des Mannes und mußten vom Sperma stammen; solche Bänder konnten in einer 7 Stunden nach dem Geschlechtsverkehr entnommenen Probe entdeckt werden.The vaginal swab made after intercourse also gave a non-deteriorated DNA fingerprint. However, the swab specimens corresponded mainly to the woman's and not the man's blood, indicating that most of the DNA collected from the smears came from vaginal epithelial cells stripped off during the smear and not from sperm. Nevertheless, three non-female bands could be detected in the post-coital samples; these corresponded to the main ligaments in the blood of the man and had to come from the sperm; such ligaments could be detected in a sample collected 7 hours after sexual intercourse.
Diese vorläufigen Ergebnisse zeigen, daß DNA in den verschiedensten gerichtsmedizinischen Proben gut erhalten bleibt und daß die DNA-Erkennungszeichenermittlung (DNA-fingerprinting) für Identifizierungszwecke bei wenigstens einigen gerichtsmedizinischen Proben anwendbar ist. Zum Beispiel ist jetzt eine positive Identifizierung eines Frauenschänders anhand von Samenspuren von der Kleidung eines Opfers möglich. Die Situation ist bei Vaginaabstrichen von Vergewaltigungsopfern wegen der Verunreinigung von Vagina-DNA weniger sicher; jedoch müßte durch die Entfernung dieser weiblichen DNA durch SDS-Lysis vor der für die Isolierung von Sperma-DNA erforderlichen 2-DTT- oder Mercaptoethanol-vermittelten Reduktion von Sperma ein deutlicheres Sperma-DNA-Erkennungszeichen erzeugt werden. Die Identifizierung von Frauenschändern müßte dann durch die DNA-Erkennungszeichen-Analyse von Samenspuren und/oder Vagina-Abstrichen möglich sein. In einer neueren Studie in Zusammenarbeit mit Dr. Gill ist kürzlich bestätigt worden, daß klare „fingerprints" von Sperma-DNA von Vagina-Abstrichen nach Geschlechtsverkehr unter Anwendung einer vorbereitenden Trennungstechnik, wie sie allgemein oben beschrieben wird, gewonnen werden können.These preliminary results indicate that DNA is well-preserved in a variety of forensic samples and that DNA fingerprinting is useful for identification purposes in at least some forensic samples. For example, now a positive identification of a woman abuser based on traces of semen from the clothing of a victim is possible. The situation is less certain with vagina smears from rape victims due to contamination of vaginal DNA; however, removal of this female DNA by SDS-lysis would require the production of a more prominent sperm DNA signature prior to the 2-DTT or mercaptoethanol-mediated reduction of sperm required for the isolation of sperm DNA. The identification of women abusers would then be possible through DNA tracing analysis of semen traces and / or vaginal smears. In a recent study in collaboration with dr. Gill has recently been confirmed that clear "fingerprints" of sperm DNA from vaginal swabs following sexual intercourse can be obtained using a preliminary separation technique as generally described above.
Fig. 15 A zeigt DNA-Erkennungszeichen (Lane 3) von zwei 61/2h nach Geschlechtsverkehr gemachten Vagina-Abstrichen. In Lane 1 wird ein Erkennungszeichen (fingerprint) von einer Blutprobe vom männlichen Partner gezeigt, und in Lane 2 wird ein DNA-Erkennungszeichen vom Blut des weiblichen Partners gezeigt. Weibliche Zellkerne aus den Abstrichen wurden vorzugsweise durch vorbereitende Inkubation in einem SDS/Proteinase-K-Gemisch lysiert. Spermakerne sprechen auf diese Behandlung nicht an und können daher von der weiblichen Komponente durch Zentrifugieren getrennt werden. Spermakerne wurden anschließend durch Behandlung mit einem SDS/Proteinase-K/DTT-Gemisch lysiert.Fig. 15 A shows DNA recognition mark (Lane 3) from two 6 1 / 2H made by sexual intercourse vaginal smears. Lane 1 shows a fingerprint of a blood sample from the male partner, and Lane 2 shows a DNA signature from the blood of the female partner. Female nuclei from the smears were preferably lysed by preliminary incubation in an SDS / proteinase K mixture. Sperm cores do not respond to this treatment and therefore can be separated from the female component by centrifugation. Sperm nuclei were subsequently lysed by treatment with an SDS / proteinase K / DTT mixture.
Es ist offensichtlich, daß dieserTrennungsvorgang ein voller Erfolg war. Der Sperma-DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von durch Samen verunreinigten Vagina-Abstrichen entsprachen genau den von dem Blut des männlichen Partners gewonnenen Erkennungszeichen (fingerprints).It is obvious that this separation process was a complete success. The sperm DNA markings (fingerprints) of seed-contaminated vagina swabs corresponded exactly to the fingerprints obtained from the male partner's blood.
DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von wirtschaftlich wichtigen Tieren, die unter Anwendung von Human-Minisatellitensonden gewonnen wurdenFingerprinting of economically important animals obtained using human mini-satellite probes
DNA-Proben wurden aus von Hunden, Katzen, Schafen, Schweinen, Pferden und Rindern entnommenem Blut angefertigt. 8/xg-Proben wurden mit einer geeigneten Restriktions-Endonuclease(Hinfl, wenn nichts anderes angegeben wird) digeriert, und die Restriktionsdigests wurden nach der Phenolextraktion durch Ethanolpräzipitation zurückgewonnen. Die Restriktionsdigests wurden erneut in Wasser gelöst, durch ein 0,7%iges Agarosegel elektrophoresiert, denaturiert, auf ein Schleicher-Schuell-Nitrozellulosefilter übertragen und wie oben mit 32P-markierten Human-Minisatelliten-Sonden 33,6 oder 33,15 hybridisiert.DNA samples were made from blood drawn from dogs, cats, sheep, pigs, horses and cattle. 8 / xg samples were digested with a suitable restriction endonuclease (Hinfl, unless otherwise stated), and the restriction digests recovered after phenol extraction by ethanol precipitation. The restriction digests were redissolved in water, electrophoresed through a 0.7% agarose gel, denatured, transferred to a Schleicher-Schuell nitrocellulose filter and hybridized as above with 32 P-labeled human minisatellite probes 33,6 or 33,15.
Die von einer Hundefamilie mit Hilfe von Sonde 33,6 gewonnenen DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) sind in Fig. 16 dargestellt.The DNA tags (fingerprints) obtained from a dog family by probe 33.6 are shown in FIG.
Bei den elektrophoresierten Proben handelte es sich um: Lane LBeagle-Vater Lane 2. Windhund-MutterThe electrophoresed samples were: Lane LBeagle-Father Lane 2. Greyhound Mother
Lane 3,4, 5 „Greagle", junge Hunde dieser Eltern (jeweils weiblich, männlich, männlich) Ein ausführliches DNA-Erkennungszeichen (fingerprint), in der Komplexität denen von Human-DNA abgeleiteten ähnlich, wurde von jedem Hund gewonnen. Die DNA-Erkennungszeichen zeigten eine erhebliche Variabilität, wie man aus einem Vergleich der vom Vater und der Mutter gewonnenen Muster (Lanes 1,2) ersehen· kann. Alle drei Nachkommen haben andere DNA-Erkennungszeichen (fingerprints), die in jedem Fall aus Bändern bestehen, von denen alle bis auf den Vater und/oder die Mutter zurückverfolgt werden können. Diese DNA-Erkennungszeichen sind daher für den Vaterschaftsnachweis und die Stammbaumanalyse bei Hunden wie bei Menschen von Nutzen.Lane 3,4, 5 "Greagle", young dogs of these parents (each female, male, male) A detailed DNA fingerprint, similar in complexity to those derived from human DNA, was obtained from each dog - Signs showed considerable variability, as can be seen from a comparison of the patterns obtained by the father and the mother (Lanes 1, 2) .All three offspring have different DNA fingerprints, which in any case consist of ribbons, all of which can be traced back to the father and / or mother, and these DNA tags are therefore useful for paternity and pedigree analysis in both dogs and humans.
Die DNAn in den Proben 1 bis 3 waren leicht abgebaut, wodurch vorzugsweise die Intensitäten der größten (am langsamsten wandernden) Bänder verringert wurden. Trotz dieses Abbaues konnte die Übertragung von Bändern von den Eltern auf die Nachkommen ohne weiteres bestimmt werden.The DNAs in Samples 1 to 3 were slightly degraded, thereby preferably reducing the intensities of the largest (slowest migrating) bands. Despite this degradation, the transmission of tapes from parents to offspring was readily determined.
Fig. 17 zeigt DNA-Erkennungszeichen (fingerprints) von einer kurzhaarigen Hauskatzenfamilie unter Verwendung von Sonde 33,6 (links) und Sonde 33,15 (rechts)Fig. 17 shows fingerprint fingerprints of a short-haired domestic cat family using probe 33.6 (left) and probe 33.15 (right)
Lane I. MutterLane I. Mother
Lane 2. VaterLane 2. Father
Lane 3. KätzchenLane 3. Kitten
Beide Sonden 33,6 und 33,15 erzeugen informative DNA-Erkennungszeichen. Die meisten Bänder bei den Kätzchen können als vom Vater oder der Mutter stammend bewertet werden, und daher eignen sich diese DNA-Erkennungszeichen für die Stammbaumprüfung sowie für die individuelle Identifizierung bei Katzen.Both probes 33,6 and 33,15 generate informative DNA recognition characters. Most kitten tapes can be rated as being from the father or the mother, and therefore, these DNA tags are suitable for pedigree examination as well as for individual identification in cats.
Von verschiedenen Schafen unter Anwendung der Sonden 33,6 (links) und 33,15 (rechts) gewonnene DNA-Erkennungszeichen werden in Fig.18 gezeigt. Als Proben dienten: Lane 1. Weiblicher Mischling Lane 2. Weiblicher Mischling Lane 3. Weibliches Dorset Lane 4. Weibliches Hampshire χ Dorset Lane 5. Männliches DorsetDNA tags obtained from various sheep using probes 33.6 (left) and 33.15 (right) are shown in Figure 18. The samples used were: Lane 1. Female hybrid Lane 2. Female hybrid Lane 3. Female Dorset Lane 4. Female Hampshire χ Dorset Lane 5. Male Dorset
Individuum-spezifische DNA-Erkennungszeichen wurden mit beiden Sonden von jedem Schaf gewonnen. Die DNA-Erkennungszeichen sind schwächer und weniger komplex als Human-DNA-Erkennungszeichen, aber trotzdem für die Identifizierung und für genetische Zwecke von Nutzen. Sonde 33,6 entdeckt ein oder zwei intensive polymorphe Bänder in jedem Schaf, zusätzlich zu dem Bereich schwächerer Bänder. Diese Bänder stammen vermutlich von einer einzigen Minisatellitenstelle, die zufällig einen sehr hohen Grad von Homologie mit Sonde 33,6 zeigt.Individual-specific DNA labels were obtained with both probes from each sheep. The DNA tags are weaker and less complex than human DNA tags, but still useful for identification and genetic purposes. Probe 33.6 detects one or two intense polymorphic bands in each sheep, in addition to the area of weaker bands. These bands presumably come from a single minisatellite site, which happens to show a very high degree of homology with probe 33.6.
Fig. 19 zeigt DNA-Erkennungszeichen von drei verschiedenen Schweinen (Lanes 1 bis 3) und drei verschiedenen Pferden (Lanes 4 bis 6) (Geschlecht und Züchtung nicht spezifiziert). Beide Sonden 33,6 und 33,15 erzeugen individuumspezifische DNA-Erkennungszeichen bei jeder Spezies. Die DNA-Erkennungszeichen sind, besonders bei Sonde 33,15, schwach und enthalten im Vergleich zu den entsprechenden Human-DNA-Erkennungszeichen sehr wenige Bänder, abertrotzdem wird die kombinierte Verwendung beider Sonden für die Individuum-Identifizierung von Nutzen sein.Fig. 19 shows DNA recognition characters of three different pigs (Lanes 1 to 3) and three different horses (Lanes 4 to 6) (sex and breeding not specified). Both probes 33,6 and 33,15 produce individual-specific DNA recognition characters in each species. The DNA tags are weak, especially with probe 33,15, and contain very few bands compared to the corresponding human DNA tags, but the combined use of both probes will be useful for individual identification.
Fig. 20 zeigt DNA-Erkennungszeichen von Hinfl-DNA-Digests, die mit Hilfe von Sonde 33,6 von einer Kuh-Familie und von weiteren Rindern gewonnen wurden. Als Proben dienten: (Lane 1. Mensch) Lane 2. Muttertier Lane 3. Vatertier Lane 4. Kalb von 1 und 2 Lane 5. Angus-Bulle Lane 6. Friesischer BulleFig. 20 shows DNA recognition characters of Hinfl DNA digests recovered from a cow family and from other cattle using probe 33.6. Lane 2. Dam Lane 3. Father Animal Lane 4. Calf 1 and 2 Lane 5. Angus Bull Lane 6. Friesian Bull
Wie bei Schafen, Schweinen und Pferden wurde auch hier ein ziemlich einfaches, aber trotzdem tierspezifisches DNA-Erkennungszeichen für jedes Tier gefunden. Bei dem Kalb konnten alle Bänder bis zurück zu dem Muttertier und/oder dem Vatertier verfolgt werden, eine Bestätigung für den Stammbaum des TieresAs with sheep, pigs and horses, a rather simple but nevertheless animal-specific DNA identification was found for each animal. In the calf, all the ligaments could be traced back to the dam and / or the father, confirming the pedigree of the animal
Fig. 21 zeigt Ergebnisse mit Sonde 33,15 bei dergleichen Kuh-DNA. Individuelle Lanes sind gekennzeichnet: Figure 21 shows results with probe 33.15 in the same cow DNA. Individual lanes are marked:
1. Muttertier1. mother animal
2. Vatertier2nd Father Animal
3. Kalb von 1 und 2 4.'Angus-Bulle3rd calf of 1 and 2 4.'angus bull
5. Friesischer Bulle (6. Mensch)5. Frisian bull (6th person)
Mit Sonde 33,15 wurde ein intensives und nichtauflösbar-komplexes Muster hybridisierender DNA-Bänder in mit Hinfl digerierter Kuh-DNA erzeugt. In einem BgIII Digest ist dieses intensive Signal hauptsächlich auf sehr große DNA-Fragmente beschränkt, woraus vermutet werden kann, daß dieses Signal von einer gebüschelten Sequenz oder Region stammt, am wahrscheinlichsten einer herkömmlichen Satelliten-DNA. Eine kurze autoradiographische Aufnahme des Hinfl Digests zeigt eine „Leiter" von Bändern zur Unterseite des Gels hin, mit einer Periodizität zwischen „Sprossen" von 45 bis 50 Basenpaaren (Daten nicht angegeben). Somit stammt das intensive Signal höchst wahrscheinlich von einem Satelliten mit einer 45 bis 50 Basenpaare langen Wiederholeinheit. Das intensive Signal ist weitgehend in mit Pvull, Ddel oder AIuI digerierter Kuh-DNA vernichtet, so daß die Satelliten-DNA-Wiederholeinheit vermutlich eine oder mehrere Stellen für jede dieser Restriktions-Endonucleasen, aber nichtProbe 33.15 was used to generate an intense and non-resolvable complex pattern of hybridizing DNA bands in annealed cow DNA. In a BglII digest, this intense signal is primarily confined to very large DNA fragments, suggesting that this signal comes from a tufted sequence or region, most likely a conventional satellite DNA. A short autoradiographic image of the Hinfl digest shows a "ladder" of bands towards the bottom of the gel, with a periodicity between "sprouts" of 45 to 50 base pairs (data not shown). Thus, the intense signal is most likely from a satellite with a 45 to 50 base pair repeat unit. The intense signal is largely annihilated in Pvull, Ddel or AluI-digested cow DNA, so the satellite DNA repeating unit is believed to have one or more sites for each of these restriction endonucleases, but not
für Hinfl oder BgIII enthält. Dieses sind genau die Eigenschaften des 1,720 Kuhsatelliten (E. Posch! und R.E.Streek, „Prototype sequence of bovine 1,720 satellite DNA" [Prototyp-Sequenz von Schweine—1,720 Satelliten-DNA], J.Mol. Biol., 143,147-153; 1980), der aus 100000 Tandemwiederholungen einer 46-Basenpaar-Wiederholeinheit besteht. Vergleiche der Sequenz von der 1,720 Wiederholeinheit mit der Kernsonde-33,6-Wiederholeinheit und der 33,15-Wiederholeinheit werden im folgenden gegeben:for Hinfl or BgIII. These are exactly the properties of the 1,720 cow satellite (E.Poch !, REStreek, "Prototype sequence of bovine 1,720 satellite DNA" [prototype sequence of porcine 1.720 satellite DNA], J. Mol. Biol., 143, 147-153; Consisting of 100,000 tandem repeats of a 46 base pair repeat unit Comparisons of the sequence of the 1,720 repeat unit with the core probe 33.6 repeat unit and the 33.15 repeat unit are given below:
Kerncore
core GGAGGTGGGCAGGAiIG Hhal Ddelcore GGAGGTGGGCAGGAiIG Hhal Ddel
3£3 £
Λ Γ7ΟΑ ΠΊ1Π1 "I ΓΙ 1 ΓΤΠ Λ ΓΠΛ< Λ PPP Λ P ' Φ Λ ', Λ,ΊΛΛΛΠ ι Π P tnp rnp ρ η η pn ρ p-FfiP ί Λ Γ7ΟΑ ΠΊ1Π1 "I ΓΙ 1 ΓΤΠ Λ ΓΠΛ <Λ PPP Λ P ' Φ Λ', Λ, ΊΛΛΛΠ ι Π P tnp rnp ρ η η pn ρ p-FfiP ί
I j ( <c!U Q 'J. CrLrO Lf ACjl-tiXO-n. LrUu ίΐίί ji.1 Jj-iiLrl/ ir'-rU O .du Lr X j X U UrV jOjwi L/x I j (<c! UQ 'J. CrLrO Lf ACjl-tiXO-n. LrUu ίΐίί ji.1 Jj-iiLrl / ir'-rU O .du Lr Xj XU UrV jOjwi L / x
33,15 AGAGGTGGGCAGGTGG33.15 AGAGGTGGGCAGGTGG
33,6, AGGGOTGGAGG33.6, AGGGOTGGAGG
Wie man sehen kann, enthält die 1,720-Satelliten-Wiederholeinheit eine nahezu vollständige Kopie der 3'-Region der Kernsequenz (Übereinstimmungen sind oben durch * gekennzeichnet). Diese Region in der 1,720-Wiederholung gibt eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit der Wiederholeinheit von 33,15, aber eine weniger gute Übereinstimmung mit 33,6. Daraus erklärt sich, warum 1,720-Satelliten-DNA durch Sonde 33,15 aber nicht durch Sonde 33,6 entdeckt wird (Fig. 20). (Die 1,720-Satelliten-Wiederholeinheit [wie die des Myoglobin Λ33 Minisatelliten] enthält zu viele Nucleotide an jeder Seite des Kernes [H + J in Formel [1] >15] als daß sie als Multistellen-Sonde gemäß der Erfindung wirken könnte.) Zur Entdeckung von Kuh-Minisatelliten, die zu Sonde 33,15 hybridisieren, wurde Kuh-DNA mit AIuI oder Ddel digeriert, um den 1,720-Satelliten auf 46-Basenpaar-Monomere zu reduzieren, die sich von der Unterseite dieses Gels abelektrophoresieren. Fig. 21 zeigt, daß klare DNA-Erkennungszeichen tatsächlich für jedes dieser Restriktionsenzyme von Kalb-DNA gewonnen wurden (Nr.3). Jedoch stammten nahezu alle diese Bänder von Variantblöcken von 1,720-Satelliten-DNA, eingebettet in normaler 1,720-DNA, die die AIuI und Ddel Stellen in jeder Wiederholung verloren haben (vielleicht durch Mutation einer oder einer anderen der oben gezeigten unterstrichenen Basen, die die überlappenden ASuI und Ddel Stellen vernichten würden). Das könnte der Grund für die folgende Fakten sein:As can be seen, the 1,720 satellite repeater contains an almost complete copy of the 3 'region of the core sequence (matches are indicated above by *). This region in the 1.720 repetition gives an excellent match with the repeat unit of 33.15, but a less good match with 33.6. This explains why 1,720 satellite DNA is detected by probe 33,15 but not by probe 33,6 (Figure 20). (The 1,720 satellite repeat unit [such as the myoglobin Λ33 minisatellite] contains too many nucleotides on each side of the core [H + J in formula [1]> 15] to act as a multi-site probe according to the invention.) To detect cow minisatellite hybridizing to probe 33,15, cow DNA was digested with AluI or Ddel to reduce the 1,720 satellite to 46 base pair monomers which were electrophoresed from the bottom of this gel. Fig. 21 shows that clear DNA labels were actually obtained for each of these restriction enzymes of calf DNA (No.3). However, nearly all of these bands were from variant blocks of 1,720 satellite DNA embedded in normal 1,720 DNA that lost the AluI and Ddel sites in each repeat (perhaps by mutation of one or another of the underlined bases shown above which overlap ASuI and Ddel bodies would destroy). That could be the reason for the following facts:
a. Tatsächlich identische Kalb-DNA-Erkennungszeichen wurden bei Verwendung von AIuI und Ddel gewonnen.a. Actually identical calf DNA recognition characters were obtained using AluI and Ddel.
b. Die größten Fragmente hybridisieren beständig intensiver als die kleineren (weil sie entsprechend mehr 1,720-Satelliten-Wiederholeinheiten enthalten; das größte Kalb-DNA-Fragment enthält ~440 dieser Einheiten). Bei Menschen nimmt die Bandintensität nicht fortlaufend mit der Größe zu (Fig. 21).b. The largest fragments hybridize consistently more intensely than the smaller ones (because they contain correspondingly more 1,720 satellite repeat units, with the largest calf DNA fragment containing ~ 440 of these units). In humans, the band intensity does not increase continuously with size (Figure 21).
c. Fast alle diese Kalb-DNA-Erkennungszeichenfragmente werden durch Hhal eliminiert, die einmal innerhalb der 1,720-Wiederholeinheit spaltet (siehe oben, Daten nicht angegeben).c. Almost all of these calf DNA signature fragments are eliminated by Hhal, which cleaves once within the 1.720 repeat unit (see above, data not shown).
d. Das Vatertier (Nr. 2) hat fast keine hybridisierenden Fragmentein einem Alul-Digest. Das könnte bedeuten, daß die diese Variantwiederholblöcke enthaltende Region von 1,720-Satelliten-DNA bei diesem Tier ausgetilgt wurde.d. The parent animal (# 2) has almost no hybridizing fragments in an Alul digest. This could mean that the region of 1.720 satellite DNA containing these variant repeats was eradicated in this animal.
e. Die Muttertier-(Nr. 1) und Kalb-(Nr.3) DNA-Erkennungszeichen sind nahezu identisch. Das Muttertier ist wahrscheinlich wegen einer Tilgung heterozygot, die der beim Vatertier gemachten Feststellung äquivalent ist, und hat zufällig das nichtgetilgte Chromosom (und daher alle Bänder) auf das Kalb übertragen. Daher sind alle diese Bänder gekoppelt und werden nicht unabhängig auf Nachkommen übertragen, wie es bei Menschen der Fall ist.e. The dam (No. 1) and calf (# 3) DNA labels are almost identical. The dam is probably heterozygous for eradication equivalent to that found in the sibling and has accidentally transferred the non-eroded chromosome (and therefore all ligaments) to the calf. Therefore, all these bands are coupled and are not independently transmitted to offspring, as is the case with humans.
Trotzdem zeigen alle fünf getesteten Rinder unterschiedliche „Satelliten"-DNA-Erkennungszeichenmuster, und daher können diese ungewöhnlichen Typen von Erkennungszeichen bei der Individuen-Identifizierung von Nutzen sein, allerdings nicht für die Bereitstellung von Multi-Stellen-Markierer-Informationen.Nevertheless, all five cattle tested show different "satellite" DNA recognition pattern, and therefore, these unusual types of labels may be useful in individuals identification, but not for providing multi-site marker information.
Bestimmte Sonden können zufriedenstellend arbeiten, wenn η nicht unbedingt gleich 3 in Formel (1) ist. In jeder solchen Sonde kann wenigstens ein Paar von Wiederholungen von (J. Kern. K) durch eine keinen Kern enthaltenden DNA-Sequenz von mindestens zwei weiteren Wiederholungen getrennt sein. Daher kann eine ausreichend lange Sonde konstruiert werden, in der (J. Kern. K)-Sequenzen paarweise, durch „Nicht-Kern"-DNA-Sequenzen getrennt, angeordnet sind.Certain probes can work satisfactorily if η is not necessarily equal to 3 in formula (1). In each such probe, at least one pair of repeats of (J.Key, K) may be separated from a non-nucleated DNA sequence by at least two more repeats. Therefore, a probe of sufficient length can be constructed in which (J.Key.K) sequences are arranged in pairs, separated by "non-core" DNA sequences.
Claims (32)
H-(J-Kern-K)n-L ' (1)*
H- (J-core-K) n -L '(1)
* (a) X gleich A oder G ist, Y ist C oder T, T = Toder U, m ist 0,1 oder 2, ρ ist 0 oder 1, q ist 0 oder 1, η ist wenigstens 3;wherein
* (a) X is A or G, Y is C or T, T is Toder U, m is 0,1 or 2, ρ is 0 or 1, q is 0 or 1, η is at least 3;
Family
ID=
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