DD240389A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF BIOMULGATORS - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Produktion von Bioemulgatoren. Das Ziel besteht in der Verbesserung der Synthese- und Exkretionsleistung bei Verwendung von wasserloeslichen Kohlenstoffquellen. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, durch phaenotypische Massnahmen eine hoehere Produktionskonzentration zu gewaehrleisten. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe so geloest, dass Acinetobacter calcoaceticus EB 114 auf Acetat chemostatisch kultiviert und gleichzeitig Glucose, die nicht assimiliert werden kann, zugespeist wird. Die Produktivitaet wird auf diese Weise mindestens um das 3fache gesteigert.The invention relates to a microbial process for the production of bioemulsifiers. The goal is to improve the synthesis and excretion performance using water-soluble carbon sources. It is based on the task of ensuring a higher production concentration through phenotypic measures. According to the invention, the object is achieved in such a way that Acinetobacter calcoaceticus EB 114 is chemostatically cultivated on acetate and at the same time glucose, which can not be assimilated, is fed in. The productivity is increased in this way at least 3 times.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Bioemulgatoren mit Hilfe von Bakterien. Es kann angewendet werden in der chemischen und pharmazeutischen Industrie.The invention relates to a process for the continuous production of bioemulsifiers by means of bacteria. It can be applied in the chemical and pharmaceutical industry.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Die Synthese und Gewinnung von Bioemulgatoren mit Hilfe von Bakterien (Rosenberg, E. et al. 1979,Appl.Environm. Microbiol., 37,402) und Hefen (Tülloch A. P. etal. 1968, J. Chem. 46,1523; Cooper, D. G. etal. 1984, Appl. Enrironm. Microbiol. 47,173) ist bekannt. Als Kohlenstoffquellen für die mikrobielle Synthese von Bioemulgatoren unterschiedlicher chemischer Natur werden sog. heterotrophe Substrate verwendet. Bei schwerwasserlöslichen, d. h. hydrophoben Substraten wie z. B. n-Alkanen ist die Produktkonzentration deutlich höher als bei hydrophilen Substraten, weshalb dieses Phänomen in Zusammenhang mit der Aufnahme (Substrat-Transport in die Zelle) gebracht wird (ltoh, S., Suzuki, T. 1972: Agric. Biol. Chem. 36,2233). Bei Verwendung hydrophober, meist sogar noch heterogener Substrate, z. B. von n-Alkanen unterschiedlicher Kettenlänge, ergeben sich bei der Abtrennung des Produktes vom Produzenten und von im Medium verbleibenden Substratenresten erhebliche Probleme, und aufwendige Reinigungsoperationen sind unumgänglich. Diese Nachteile sind nicht gegeben, wenn wasserlösliche Substrate als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle benutzt werden. Jedoch haben diese den Nachteil, wie bereits erwähnt, geringerer Ausbeute. Ihm wird begegnet durch Züspeisung von Ammonium-Eisen(ll)-sulfat. Dies kann jedoch nur gelingen in dem Maße, wie Grenzen durch die Konvertierbarkeit der Kohlenstoffquelle gesetzt werden. Trotz Verwendung solcher Effektoren bleiben die Verfahren im wesentlichen diskontinuierlich.The synthesis and recovery of bioemulsifiers with the aid of bacteria (Rosenberg, E. et al., 1979, Appl.Environm.Microbiol., 37, 402) and yeasts (Tülloch AP et al., 1968, J. Chem., 46, 1523, Cooper, DG et al 1984, Appl. Enrironm Microbiol 47,173) is known. So-called heterotrophic substrates are used as carbon sources for the microbial synthesis of bioemulsifiers of different chemical nature. For heavy water soluble, d. H. hydrophobic substrates such. B. n-alkanes, the product concentration is significantly higher than hydrophilic substrates, which is why this phenomenon in connection with the uptake (substrate transport into the cell) is brought (ltoh, S., Suzuki, T. 1972: Agric. Biol. Chem 36,2233). When using hydrophobic, usually even more heterogeneous substrates, eg. B. of n-alkanes of different chain length, resulting in the separation of the product from the producer and remaining in the medium substrate residues significant problems, and complex purification operations are essential. These disadvantages are not present when water-soluble substrates are used as the sole source of carbon and energy. However, these have the disadvantage, as already mentioned, lower yield. It is countered by the feeding of ammonium iron (II) sulfate. However, this can only succeed to the extent that limits are set by the convertibility of the carbon source. Despite the use of such effectors, the processes remain essentially discontinuous.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Bioemulgatorproduktion auf wasserlöslichen Substraten zu steigern und ein kontinuierliches Verfahren zu entwickeln.The object of the invention is to increase the bioemulsifier production on water-soluble substrates and to develop a continuous process.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Erfindung hat zur Aufgabe, durch phänotypische Maßnahmen die Synthese und Extraktion von Bioemulgatoren bei Verwendung wasserlöslicher Substrate zu erhöhen.The object of the invention is to increase the synthesis and extraction of bioemulsifiers using water-soluble substrates by means of phenotypic measures.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß Acinetobacter calcoaceticus EB114, hinterlegt im ZIMET Jena unter der Nummer 11089, auf Acetat chemostatisch vermehrt wird, wobei Glucose, die nicht für das Zellwachstum verwendet werden kann, im Verhältnis 1:1 ...2Ol (in g) zugespeist wird.According to the invention, the object is achieved in that Acinetobacter calcoaceticus EB114, deposited in ZIMET Jena under the number 11089, is chemostatically propagated on acetate, wherein glucose, which can not be used for cell growth, in the ratio 1: 1 to 2Ol (in g) is fed.

(Stammbeschreibung)(Strain description)

Bei dem verwendeten Stamm handelt es sich um streng aerobe, unbewegliche, gram-negative, vorwiegend in Diploform auftretende, mehr oder weniger kurze plumpe Stäbchen bis kokkoide Zellen. Auf Pepton-Glucose-Agar bildet dieser Stamm bei 30⁰C nach 24h weißlich-gelbe, leicht konvexe, glattrandige Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm mit glatter, feucht glänzender Oberfläche und schmieriger, butterartiger Konsistenz. Dieses Bakterium erweist sich als positiv hinsichtlich Katalase, Lipase, Urease, Lecithinase und als negativ in bezug auf Oxidase, Amylase, Gelatinase, H₂S- und Indolbindung, Voges-Proskauer-Reaktion und Hämolyse. Es assimiliert NH₃ und Nitrat sowie diverse Aminosäuren als N-Quelle und Kohlenwasserstoffe, Alkohole sowie organischen Säuren als einzige Kohlenstoff- und Energiequellen. Zucker können nicht assimiliert werden. Der Stamm ist resistenzt gegenüber Penicellin, Chloramphenicol, Oxacillin, Cephalotin, Ampicillin, und empfindlich gegenüber den Antibiotica Streptomycin, Nalidinxinsäure, Polymyxin-B, Kanamycin und Carbenicillin.The strain used is strictly aerobic, immobile, gram-negative, predominantly Diploform, more or less short plump rods to coccoid cells. On peptone-glucose agar, this strain produces whitish-yellow, slightly convex, smooth-stranded 1 mm diameter colonies at 30 ^° C. after 24 h with a smooth, moisturizing surface and greasy, buttery consistency. This bacterium is positive for catalase, lipase, urease, lecithinase and negative for oxidase, amylase, gelatinase, H ₂ S and indole binding, Voges-Proskauer reaction and hemolysis. It assimilates NH ₃ and nitrate as well as various amino acids as N-source and hydrocarbons, alcohols and organic acids as sole carbon and energy sources. Sugar can not be assimilated. The strain is resistant to penicellin, chloramphenicol, oxacillin, cephalotine, ampicillin, and susceptible to the antibiotics streptomycin, nalidinic acid, polymyxin-B, kanamycin and carbenicillin.

Bei kohlenstoffsubstrat-limitiertem Wachstum bei Durchflußraten von 0,1 bis 0,5 h"¹ im pH-Bereich von 6-8 und Temperaturenzwischen 25 und 35⁰C werden auf Acetat allein Konzentrationen von 200 bis300mgr¹ erreicht. Die Produktivitäten liegen dabei zwischen 20 und 150 mg · Γ¹ · h"¹. Durch Zusatz von Glucose in einem Mischungsverhältnis von 1:1 bis 20 (Acetat: Glucose, in g) wird die Bioemulgatorkonzentration auf 500 bis 1200 mg · Γ¹ gesteigert, die korrespondierenden Produktivitäten ergeben sich zu 50 bis 600mg · Γ¹ rT¹.When carbon substrate-limited-growth at flow rates of 0.1 to 0.5 h ^"1 in the pH range of 6-8 and temperatures of between 25 and 35 ⁰ C alone concentrations of 200 ¹ bis300mgr be achieved acetate. The productivities are between 20 and 150 mg × ¹ × h ^-1 . By addition of glucose in a mixing ratio of 1: 1 to 20 (acetate: glucose, in g), the Bioemulgatorkonzentration is increased to 500 to 1200 mg · Γ ¹ , the corresponding productivities result in 50 to 600mg · Γ ¹ rT ¹ .

Die Abtrennung des ausgeschiedenen Bioemulgators geschieht auf üblichem und bekanntem Wege, z. B. durch Extraktion oder/und Ausfällen.The separation of the excreted Bioemulgators done by conventional and known ways, eg. B. by extraction and / or precipitation.

Im folgenden wird die Erfindung durch Ausführungsbeispiele verifiziert.In the following the invention is verified by embodiments.

Beispiel 1example 1

Das Bakterium Aeinetpbactercalcoäceticus EB114 wird in einem für aerobe Kultivierung geeignetem Rückfermentor bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,8 gezüchtet. Die Geiöstsauerstoffkonzentration bewegt sich zwischen 20 und 60% Sättigung. Die kontinuierliche Kultivierung bei einer Verdürinungsrate von 0,14h"¹ erfolgte auf 3,6g · Γ¹ Acetat als Kohlenstoffquelle und einem Mineralmedium folgender Zusammensetzung (in mg · Γ¹).The bacterium Aeinetpbactercalcoäceticus EB114 is grown in a suitable for aerobic culture Rückfermentor at 30 ⁰ C and a pH of 6.8. The dissolved oxygen concentration is between 20 and 60% saturation. The continuous cultivation at a rate of 0.14 h ^{-1 was} carried out on 3.6 g × ¹ acetate as carbon source and a mineral medium of the following composition (in mg × ¹ ).

NH₄CI, 3400; KIVI₂PO₄, 310; MgSO₄ · 7H₂0,15; CaCI₂ 2H₂O, 20; FeSO₄ · 7H₂O, 5; ZnSO₄ · 7H₂O, 0,44; MnSO₄ · 4M₂O, 0,82; CuSO₄ · 5 H₂O, 0,78; Na₂MoO₄ · 2 H₂O, 0,25.NH ₄ Cl, 3400; KIVI ₂ PO ₄ , 310; MgSO ₄ .7H ₂ 0.15; CaCl ₂ 2H ₂ O, 20; FeSO ₄ .7H ₂ O, 5; ZnSO ₄ .7H ₂ O, 0.44; MnSO ₄ .4M ₂ O, 0.82; CuSO ₄ .5H ₂ O, 0.78; Na ₂ MoO ₄ .2H ₂ O, 0.25.

Unter stationären Fermentationsbedingungen wurde eine Biomassekonzentration von Ig!""¹ erhalten, die Emulgatorkonzentration betrug unter diesen Bedingungen 286mg Γ¹.Under stationary fermentation conditions, a biomass concentration of Ig! "" ^{1 was} obtained, the emulsifier concentration under these conditions was 286 mg Γ ¹ .

Durch Zugabe von Glucose in einer Konzentration von 15g · Γ¹ konnte die Emulgatorkonzentration auf 920 mg · Γ¹ gesteigert werden. Darausfolgt, daß durch die Anwesenheit von Glucose die Produktivität von 40 auf 130 mg Γ¹ · h"¹ erhöht wurde.By adding glucose at a concentration of 15 g · Γ ¹ the emulsifier concentration was increased to 920 mg · Γ. ¹ It follows that the productivity was increased from 40 to 130 mg Γ ¹ · h ^-1 by the presence of glucose.

Beispiel 2Example 2

Acinetobactercalcoaceticus EB114 wird unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen, aber bei einer Verdünnungsrate von 0,425h"¹ kultiviert. Die ausgeschiedene Emulgatorkonzentration betrug dabei 205mg · Γ¹. Durch Zugabe von Glucose im obengenannten Mischungsverhältnis erfolgte Steigerung auf 690mg · 1"¹. Daraus erfolgte, daß die Produktivität von 90mg · Γ¹ · h"¹ auf 290 mg l"¹h"¹ in Anwesenheit von Glucose erhöht wurde;Acinetobactercalcoaceticus EB114 is cultured under the conditions given in Example 1, but at a dilution rate of 0.425 h- ¹ . The precipitated emulsifier concentration was 205 mg.l- ¹ . Addition of glucose in the abovementioned mixing ratio led to an increase to 690 mg.l- ¹ . It was that the productivity of 90mg · Γ ¹ × h ^"1 to 290 mg l" ¹ h ^"1 was increased in the presence of glucose;

Claims (3)

Erfindungsansprüche:Invention claims: 1. Verfahren zur Produktion von Bioemulgatoren mit Hilfe von Bakterien bei Verwendung wasserlöslicher Substanzen als Kohlen- und Energiequelle gekennzeichnet dadurch, daß die Synthese und Exkretion eines Bioemulgators mit Stämmen von Acinetobacter calcoaceticus, EB114, hinterlegt im ZIMET Jena unter der Nummer 11089, durchgeführt wird, die auf Acetat als Kohlenstoffsubstrat unter Zugabe von Glucose, die für das Wachstum nicht verwendet werden kann, kontinuierlich bei pH-Werten zwischen 6 bis 8 und Temperaturen zwischen 25°C und 35°C vermehrt werden.1. A process for the production of bioemulsifiers with the aid of bacteria when using water-soluble substances as a coal and energy source, characterized in that the synthesis and excretion of a bioemulsifier with strains of Acinetobacter calcoaceticus, EB114, deposited in ZIMET Jena under the number 11089 performed on acetate as a carbon substrate with the addition of glucose, which can not be used for growth, be continuously increased at pH values between 6 to 8 and temperatures between 25 ° C and 35 ° C. 2. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß Acetat und Glucose in Mischungsverhältnis von 1:1 bis 1:20, bevorzugt von 1:1 bis 1:4 (in g) verwendet werden.2. The method according to claim!, Characterized in that acetate and glucose in a mixing ratio of 1: 1 to 1:20, preferably from 1: 1 to 1: 4 (in g) are used. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß bei Durchflußraten von 0,1 bis 0,5 h"¹ gearbeitet wird.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that at flow rates of 0.1 to 0.5 h " ^{1 is} worked.