DD217024A1 - Picosecond PHASENFLUOROMETER - Google Patents

Abstract

Ziel der Erfindung ist, phasenfluorometrische Messungen unter Verwendung von Avalanche-Photodioden mit hoher Zeitaufloesung und hoher Nachweisempfindlichkeit durchfuehren zu koennen. Die Aufgabe besteht darin, eine Phasenfluorometer-Anordnung anzugeben, in der die Avalanche-Photodiode mit grossem Arbeitswiderstand bei geringer Nachweisbandbreite arbeitet. Die Betriebsspannung der Avalanche-Photodiode wird mit der Modulationsfrequenz des Anregungslasers variiert, wodurch eine Gleichspannungskomponente im Photostrom entsteht. Stoerende andere Gleichspannungskomponenten werden durch eine mit Schwing-Prisma erzeugte Phasenmodulation des Vergleichslichtes und Verwendung eines Lockin-Voltmeters diskriminiert. Erfolgt die Variation der Betriebsspannung mit einer anderen Frequenz, so ist keine Schwingung des Prismas erforderlich. FigurThe aim of the invention is to be able to carry out phase fluorometric measurements using avalanche photodiodes with high time resolution and high detection sensitivity. The object is to provide a Phasenfluorometer arrangement in which the avalanche photodiode works with high resistance at low detection bandwidth. The operating voltage of the avalanche photodiode is varied with the modulation frequency of the excitation laser, creating a DC component in the photocurrent. Disturbing other DC components are discriminated by a generated with vibrating prism phase modulation of the comparison light and using a Lockin voltmeter. If the variation of the operating voltage with another frequency, so no vibration of the prism is required. figure

Description

Picosekunden-Phasenfluorometer Anwendungsgebiet der ErfindungPicosecond phase fluorometer Field of application of the invention

Öie Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der zeitaufgelösten Spektroskopie im Picosekunden- und Nanosekunden-Bereich mit Hilfe von Phasenfluorometern.The invention relates to the field of time resolved picosecond and nanosecond spectroscopy using phase fluorometers.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Characteristic of the known technical solutions

Zur Untersuchung von Fluoreszenz-Abklingzeiten im Nanosekunden- und Picosekunden-Bereich werden häufig Phasenfluorometer verwendet. In der Phasenfluorometrie wird die fluoreszierende Probe mit sinusförmig moduliertem^Licht angeregt, und aus der Phasenverschiebung zwischen dem ebenfalls sinusförmig modulierten Fluoreszenzlicht und dem Anregungslicht kann die Fluoreszenz-Abklingzeit ermittelt werden. Ein Phasenfluorometer besteht im wesentlichen aus einer sinusförmig modulierten Lichtquelle, der bestrahlten fluoreszierenden Probe sowie einem optischen System zur Bestrahlung eines Photodetektors mit dem Fluoreszenzlicht der Probe. Die Phasenverschiebung wird häufig mittels eines Referenzstrahles der Lichtquelle, der ebenfalls auf den Photodetektor gelenkt wird, gemessen.For the investigation of fluorescence decay times in the nanosecond and picosecond range, phase fluorometers are often used. In phase fluorometry, the fluorescent sample is excited with sinusoidally modulated light, and the fluorescence decay time can be determined from the phase shift between the likewise sinusoidally modulated fluorescent light and the excitation light. A phase fluorometer consists essentially of a sinusoidally modulated light source, the irradiated fluorescent sample and an optical system for irradiating a photodetector with the fluorescent light of the sample. The phase shift is often measured by means of a reference beam of the light source, which is also directed to the photodetector.

Sehr genaue Messungen von Depolarisationserscheinungen infolge Diffusions-Rotations-Prozessen an Molekülen sind mit Phasenfluorometern möglich, wenn die Bedingung 2ττί r > 1 erfüllt ist/Spencer, R.D. u.a., J.Chem.Phys.52,1645,(4-970)/. Die Größe f bedeutet hierbei die Modulationsfrequenz der Strahlung und 7 die Fluoreszenz-Abklingzeit der untersuchten Probe. Diese Bedingung zeigt, daß für Untersuchungen im Picosekunden-Bereich Modulationsfrequenzen größer 100 MHz zweckmäßig sind. Die höchste bisher in Phasenfluorometern verwendete Modulationsfrequenz betrug ca. 300MHz/Haar, H.-P. u.a., Chem.Phys. Lett, 49, (1977)/. Zur Modulation der Anregungsstrahlung diente eine Pockels-Zelle, und der Nachweis erfolgte über einen Photomultiplier. :Very accurate measurements of depolarization phenomena due to diffusion-rotational processes on molecules are possible with phase fluorometers, if the condition 2ττί r> 1 is fulfilled / Spencer, RD et al., J. Chem. Phy. 52, 1645, (4-970) /. The size f here means the modulation frequency of the radiation and 7 the fluorescence decay time of the examined sample. This condition shows that modulation frequencies greater than 100 MHz are expedient for investigations in the picosecond range. The highest modulation frequency hitherto used in phase fluorometers was about 300 MHz / hair, H.-P. ua, Chem.Phys. Lett, 49, (1977) /. A Pockels cell served to modulate the excitation radiation, and the detection was carried out via a photomultiplier. :

Auf sehr einfache Weise kann ohne Verwendung eines Modulators nach einem bekannten Vefahren /WP 147982, HO1S, 003/100/ an Argonlasern eine sinusförmige Modulation der Laserstrahlung erzielt werden, indem man den Magnetstrom soweit erniedrigt, daß nur noch zwei longitudinal Eigenschwingungen („Moden") angeregt sind. Man erhält in diesem Fälle eine sehr stabile Schwebung bei der Differenzfrequenz der beiden Moden, die zwischen ca. 400MHz und ca. 900MHz einstellbar ist.'·' . ' . ' '.''' '. ' ' ·'.'In a very simple manner, sinusoidal modulation of the laser radiation can be achieved without using a modulator according to a known method / WP 147982, HO1S, 003/100 / on argon lasers by lowering the magnetic current so far that only two longitudinal natural oscillations ("modes") are achieved. In this case one obtains a very stable beat at the difference frequency of the two modes, which can be set between approximately 400 MHz and approximately 900 MHz. '' '.'. ''.''' '. '' · '.'

Diese außerordentlich hohen Modulationsfrequenzen sind für die Untersuchung von Abkling- und Diffusionsprozessen von einigen Nanosekunden bis zu einigen Picosekunden sehr geeignet. Problematisch ist jedoch der Nachweis so hochfrequent modulierter schwacher Fluoreszenzstrahlung. Photomultiplier kommen nicht mehr in Betracht, da bei diesen die Laufzeitstreuungen der Photoelektronen und der Sekundärelektronen zu groß sind. Die einzige Alternative stellen gegenwärtig Avalanche-Photodioden dar, die bei Bandbreiten von etwa 1 GHz innere Verstärkungen bis zu 200 ermöglichen/Bezüglich ihrer inneren Verstärkung liegen Avalanche-Photodioden somit um vier bis sechs Größenordnungen schlechter als Photomultiplier. Die Nachweisgrenze in einem Phasenfluorometer mit Avalanche-Photodioden wird daher durch das nachgeschaltete frequenzselektive Voltmeter bestimmt, da dessen Eigenrauschen gegenüber dem Rauschen des Photostromes dominiert. Dies soll an einem Beispiel näher erläutert werden.These extraordinarily high modulation frequencies are very suitable for the investigation of decay and diffusion processes from a few nanoseconds to a few picoseconds. However, the problem is the detection of such high-frequency modulated weak fluorescence radiation. Photomultipliers are out of the question, since the propagation delays of the photoelectrons and the secondary electrons are too large for them. Currently, the only alternative is avalanche photodiodes that allow internal gains of up to 200 at bandwidths of around 1 GHz. In terms of internal amplification, avalanche photodiodes are four to six orders of magnitude worse than photomultipliers. The detection limit in a phase fluorometer with avalanche photodiodes is therefore determined by the downstream frequency-selective voltmeter, since its inherent noise is dominated by the noise of the photocurrent. This will be explained in more detail with an example.

Angenommen sei ein typisches selektives Mikrovoltmeter mit einem Eingangswiderstand von 50 Ohm sowie einem Eigenrauschen von 1 /*V. Soll die Avalanche-Photodiode ein Signal erzeugen, das mindestens gleich dem Eigenrauschen des ' Voltmeters ist, so muß bei einer inneren Verstärkung von 200 der primäre Photostrom mindestens 10"¹⁰A betragen. Bei einer typischen Bandbreite des selektiven Mikrovoltmeters von 3OkHz beträgt das Signal-Rausch-Verhältnis dieses primären Photostromes 100:1. Im Zuge des Avalanche-Prozesses wird dieser Wert zwar etwas verringert, doch wird die obige Aussage davon nicht berührt.Suppose a typical selective microvoltmeter with an input resistance of 50 ohms and an inherent noise of 1 / * V. If the avalanche photodiode is to produce a signal that is at least equal to the intrinsic noise of the voltmeter, then the internal photocurrent must be at least 10 " ¹⁰ A at an internal gain of 200. For a typical bandwidth of the selective microvoltsmeter of 3OkHz, the signal The noise ratio of this primary photocurrent is 100: 1. In the course of the avalanche process, this value is somewhat reduced, but the above statement is not affected.

Das Eigenrauschen eines selektiven Mikrovoltmeters entspricht näherungsweise dem Nyquist-Rauschen des Eingangswiderstandes U_R = (4kt_oRB)^1/2, wobei R den Eingangswiderstand und B die Bandbreite darstellen sowie der Ausdruck VT₀ den bekannten Wert 4 · 10 ²¹Ws hat. Ein vorgegebener Photodiodenstrom !führt am Eingangswiderstand R zu einer Signalspannung U = IR. Für das Signal-Rausch-Verhältnis bei rauschfreien Photostrom ergibt sich damit SNR = I (R/4kT_oB)^1/2. Dieser Ausdruck zeigt, daß zur Verbesserung der unteren Nachweisgrenze in einem Phasenfluorometer mit Avalanche-Photodioden der Eingangswiderstand des selektiven Mikrovoltmeters wesentlich erhöht werden müßte und bzw. oder die Nachweisbandbreite erheblich verringert werden müßte. Beide Maßnahmen führen jedoch in der Praxis auf andere gerätetechnische Schwierigkeiten und sind daher nicht praktikabel.The inherent noise of a selective microvoltmeter corresponds approximately to the Nyquist noise of the input resistance U _R = (4kt _o RB) ^1/2 , where R is the input resistance and B is the bandwidth and the term VT _{0 has} the known value 4 · 10 ²¹ Ws. A predetermined photodiode current leads to a signal voltage U = IR at the input resistor R. For the signal-to-noise ratio with noise-free photocurrent, this results in SNR = I (R / 4kT _o B) ^1/2 . This expression shows that to improve the lower detection limit in a phase fluorometer with avalanche photodiodes, the input resistance of the selective microvoltmeter would have to be significantly increased and / or the detection bandwidth would have to be significantly reduced. Both measures, however, lead in practice to other equipment technical difficulties and are therefore not practical.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist, phasenfluorometrische Messungen unter Verwendung von Avalanche-Photodioden mit hoher . Zeitauflösung und hoher Nachweisempfindlichkeit durchführen zu können. - .The aim of the invention is to provide phase fluorometric measurements using high avalanche photodiodes. Time resolution and high detection sensitivity to perform. -.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Phasenfluorometer-Anordnung anzugeben, in der die zum Nachweis der Fluoreszenzstrahlung dienende Avalanche-Photodiode mit einem großen Arbeitswiderstand bei geringer Nachweisbandbreite arbeitet. . , The invention has for its object to provide a Phasenfluorometer arrangement in which the avalanche photodiode serving to detect the fluorescence radiation works with a large working resistance at low detection bandwidth. , .

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß als Anregungslichtquelle ein sinusförmig modulierter Laser vorhanden ist. Im Strahlengang des Lasers ist die fluoreszierende Probe angeordnet deren Fluoreszenzlicht über ein optisches System, einen drehbaren Polarisator sowie ein Wellenlängen-Filter auf eine Avalanche-Photodiode gelangt. Erfindüngsgemäß befindet sich \m Strahlengang des Lasers vor der fluoreszierenden Probe ein Strahlteiler zur Ablenkung eines Anteils der Strahlung auf eine zweite Photodiode, deren Ausgang über einen Verstärker direkt an die Avalanche-Photodiode geführt ist. Im Strahlengang des Lasers ist ein zweiter Strahlteiler angeordnet zur Ablenkung eines weiteren Anteils der Strahlung über einen Umlenkspiegel, ein bewegliches Reflexions-Prisma, ein variables Graufilter und einen kleinen Umlenkspiegel auf die Avalanche-Photodiode. Am Reflexions-Prisma befindet sich ein Sensor, dessen Signalausgang mit dem Referenzeingang eines Niederfrequenz-Lock-in-Voltmeters verbunden ist. Der Meßeingang des Voltmeters ist mit dem Ausgang der Avalanche-Photodiode verbunden.The object is achieved in that a sinusoidally modulated laser is present as an excitation light source. In the beam path of the laser, the fluorescent sample is arranged whose fluorescent light passes through an optical system, a rotatable polarizer and a wavelength filter on an avalanche photodiode. Erfindüngsgemäß to \ m is the laser beam path prior to the fluorescent sample, a beam splitter for deflecting a portion of the radiation onto a second photodiode whose output is connected via an amplifier directly to the avalanche photodiode. In the beam path of the laser, a second beam splitter is arranged for deflecting a further portion of the radiation via a deflection mirror, a movable reflection prism, a variable neutral density filter and a small deflection mirror on the avalanche photodiode. At the reflection prism is a sensor whose signal output is connected to the reference input of a low-frequency lock-in voltmeter. The measuring input of the voltmeter is connected to the output of the avalanche photodiode.

|m Betrieb entsteht am Ausgang des zweiten Photodetektors ein sinusförmiges Signal bei der Modulationsfrequenz des Lasers, • jdas nach Passieren des Verstärkers zu einer sinusförmigen Änderung der an der Avalanche-Photodiode anliegenden Betriebsspannung führt. Arbeitet man in der Nähe der Durchbruchsspannung, so genügen schon einige Volt zur Erzielung| m operation produces at the output of the second photodetector a sinusoidal signal at the modulation frequency of the laser, • jdas after passing the amplifier leads to a sinusoidal change of the voltage applied to the avalanche photodiode operating voltage. If you work in the vicinity of the breakdown voltage, just a few volts are enough to achieve

oinnr merHirhnn Änrieriinn rler innoron Varetärlriinnoinnr merhirhnn changer rler innoron Varetärlriinn

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Trifft nun Fluoreszenzlicht auf die Avalariche-Photodiode, das ebenalls mit der Modulationsfrequenz des Lasers moduliert ist, so entsteht im Ausgangssignal der Avalanche-Photodiode eine Spektralkomponente der Frequenz OHz. Durch entsprechende Justierung des beweglichen Reflexiqns-Prismäs sowie des variablen Graufilters kann in der Avalanche-Photodiode ein zweites Signal erzeugt werden, das die gleiche Amplitude wie das Fluoreszenzsignal besitzt, gegenüber diesem aber eine Phasenverschiebung von 180° aufweist. In diesem Falle bilden das Fluoreszenzlicht und das phasen- und amplitudenjustierte Vergleichslicht zusammen eine unmodulierte Strahlung. Folglich entsteht auch am Ausgang der Avalanche-Photodiode keine Spektralkomponente der Frequenz OHz infolge der Verstärkungsmodulation.If fluorescent light now strikes the avalanche photodiode, which is also modulated with the modulation frequency of the laser, a spectral component of the frequency OHz is produced in the output signal of the avalanche photodiode. By appropriate adjustment of the movable Reflexiqns Prismäs and the variable gray filter can be generated in the avalanche photodiode, a second signal having the same amplitude as the fluorescent signal, but with respect to this has a phase shift of 180 °. In this case, the fluorescent light and the phase- and amplitude-adjusted comparison light together form an unmodulated radiation. Consequently, also at the output of the avalanche photodiode no spectral component of the frequency OHz due to the gain modulation.

Ein Signal mit der Frequenz OHz entsteht in diesem Fall, weil der Modulationsgrad der inneren Verstärkung relativ klein ist und infolge des Dunkelstromes; Um den Einfluß dieser beiden Komponenten auszuschließen, ist das Reflexions-Prisma nicht nur verschiebbar angeordnet, sondern befindet sich auf einem Schwingtisch, auf dem es mit niedriger Frequenz eine periodische Bewegung um einige Millimeter ausführt. Über den am Prisma angebrachten Sensor erreicht man, daß vom Lock-in-Voltmeter nur der Phasen- und Amplitudenabgleich zwischen Fluoreszenzlicht und Vergleichslicht bewertet wird. Die infolge der Prisma-Schwingung entstehende niederfrequenze Signalspannung kann mit Hilfe des Lock-in-Voltmeters sehr hochohmig und mit sehr geringer Bandbreite registriert werden.A signal with the frequency OHz arises in this case because the degree of modulation of the internal amplification is relatively small and due to the dark current; To eliminate the influence of these two components, the reflection prism is not only slidably mounted, but is located on a rocking table on which it performs a periodic movement of a few millimeters at low frequency. Via the sensor attached to the prism, it is achieved that the lock-in voltmeter only evaluates the phase and amplitude balance between the fluorescent light and the comparative light. The resulting low frequency signal voltage due to the prism oscillation can be registered with the help of the lock-in voltmeter very high impedance and with very low bandwidth.

Eine Variante der Erfindung besteht darin, daß im Falle der Verwendung eines Lasers mit externem Modulator ein Anteil der Modulatorspannung der Avalanche-Photodiode direkt zugeführt wird. ·;.·'A variant of the invention is that in the case of using a laser with external modulator, a portion of the modulator voltage of the avalanche photodiode is supplied directly. ·;. · '

Darüber hinaus ist die Ansteuerung der Avalanche-Photodiode durch eine Spannung mit von der Modulationsfrequenz des Lasers abweichender Frequenz möglich. Auf diese Weise kann die Auswertefrequenz, die gleich der Differenz der beiden Frequenzen ist, frei gewählt werden, und es ist keine Schwingung des Reflexions-Prismas erforderlich. In diesem Fall gestaltet man den zur Ansteuerung der Avalanche-Photodiode vorgesehenen Verstärker zweckmäßigerweise als Misch-Verstärker, in dem beispielsweise die Signale der Photodiode oder vom externen Modulator mit einer Niederfrequenzspannung gemischt werden. In allen angegebenen Varianten kann anstelle des Lock-in-Voltmeters auch ein selektives Niederfrequenz-Voltmeter benutzt werden. . 'In addition, the control of the avalanche photodiode by a voltage with deviating from the modulation frequency of the laser frequency is possible. In this way, the evaluation frequency which is equal to the difference of the two frequencies can be chosen freely, and no oscillation of the reflection prism is required. In this case, the amplifier provided for driving the avalanche photodiode is expediently designed as a mixed amplifier in which, for example, the signals of the photodiode or of the external modulator are mixed with a low-frequency voltage. In all variants, a selective low-frequency voltmeter can be used instead of the lock-in voltmeter. , '

Ausführungsbeispielembodiment

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden. In der zugehörigen Zeichnung ist das Schema des Picosekunden-Phasenfluörometers dargestellt.The invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment. In the accompanying drawing, the scheme of the picosecond Phasenfluörometers is shown.

Als Anregungslichtquelle dient ein Argonlaser L mit einer Resonatorlänge von 120cm. Ein solcher Laser hat einen Frequenzabstand benachbarter longitudinaler Moden von'125MHz. Stabile 2-Moden-Oszillation ist in diesem Falle beim vierbis siebenfachen Modenabstand erreichbar, d.h. es sind die Modulationsfrequenzen 500,625,750 und 875MHz, einstellbar. Im Strahlengang des modulierten Lasers ist die fluoreszierende Probe F angeordnet, deren Fluoreszenzlicht über die Linse Lt, den drehbaren Polarisator P, das Wellenlängen-Filter M sowie die Linse L2 auf die Avalanche-Photodiode PD1 gelangt. Im Strahlengang des Lasers ist vor der fluoreszierenden Probe F der Strahlteiler T2 angeordnet, über den ein Teil des Laserlichts auf die Photodiode PD2 gelangt. Es ist zweckmäßig, auch hier eine Avalanche-Photodiode zu verwenden. Der Ausgang der Photodiode PD2 ist mit dem Eingang des selektiven Verstärkers A verbunden, der auf die Modulationsfrequenzen des Lasers abgestimmt werden kann. Der Ausgang des Verstärkers A ist so mit der Avalanche-Photodiode PD1 verbunden, daß sein sinusförmiges Signal der an der Diode anliegenden Betriebsspannung überlagert wird. Wird die Diode nahe der Durchbruchsspannung betrieben, so führt bereits eine effektive Sinusspannung von wenigen Volt zu einer merklichen Modulation der inneren Verstärkung der Diode.The excitation light source is an argon laser L with a resonator length of 120 cm. Such a laser has a frequency spacing of adjacent 125 millisecond longitudinal modes. Stable 2-mode oscillation in this case is achievable at four to seven times the mode spacing, i. it is the modulation frequencies 500,625,750 and 875MHz, adjustable. In the beam path of the modulated laser, the fluorescent sample F is arranged, the fluorescent light on the lens Lt, the rotatable polarizer P, the wavelength filter M and the lens L2 reaches the avalanche photodiode PD1. In the beam path of the laser, the beam splitter T2 is arranged in front of the fluorescent sample F, via which part of the laser light reaches the photodiode PD2. It is expedient to use an avalanche photodiode here as well. The output of the photodiode PD2 is connected to the input of the selective amplifier A, which can be tuned to the modulation frequencies of the laser. The output of the amplifier A is connected to the avalanche photodiode PD1 so that its sinusoidal signal is superimposed on the voltage applied to the diode operating voltage. If the diode is operated close to the breakdown voltage, an effective sine voltage of a few volts already leads to a noticeable modulation of the internal amplification of the diode.

Infolge der Verstärkungsmodulation erzeugt das auf die Diode auftreffende, mit der gleichen Frequenz modulierte Fluoreszenzlicht einen Photostrom, der eine Spektralkomponente der Frequenz OHz besitzt. Zur Bestimmung der Phasenlage des Fluoreszenzlichtes befindet sich im Strahlengang des Lasers ein weiterer Strahlteiler T1, der einen Teil der modulierten Strahlung über den Umlenkspiegel S1, das verschiebbar und schwingfähig angeordnete Reflexions-Prisma V, das variable Graufilter G und den kleinen Umlenkspiegel S2 auf die Avalanche-Photodiode PD1 lenkt. Durch entsprechende Verschiebung des Reflexions-Prismas V sowie Einstellung des variablen Graufilters G kann in der Avalanche-Photodiode ein zweites Signal Verzeugt werden, das die gleiche Amplitude wie das Fluoreszenzsignal besitzt, gegenüber diesem aber eine Phasenverschiebung von 180° aufweist. In diesem Falle bilden das Fluoreszenzlicht und das Vergleichslicht zusammen eine unmodulierte Strahlung. Folglich entsteht auch am Ausgang der Avalanche-Photodiode PD1 keine Spektralkomponente der Frequenz OHz. Um zu vermeiden, daß andere Gleichstromkomponenten des Photostromes die Messung stören, wird das Reflexions-Prisma in niederfrequente Schwingungen versetzt. Bei einer Modulationsfrequenz des Laserlichtes von 500 MHz führt eine Schwingungsamplitude des Prismas von 7,5mrn zu einer Phasenmodulation des Vergleichslichtes von 10°. Die interessierende Spektralkomponente von OHz wird dadurch transformiert auf die Frequenz der Prismen-Schwingung. Zur Registrierung dient ein Lock-irvVoltmeter D, das an den Ausgang der Avalanche-Photodiode PD1 angeschlossen ist. Die Schwingung des Prismas V wird über einen an diesem angebrachten Sensor S in ein Steuersignal umgewandelt, das dem Referenz-Eingang des Lock-in-Voltmeters zugeführt wird. .As a result of the gain modulation, the fluorescence light incident on the diode at the same frequency produces a photocurrent having a spectral component of frequency OHz. To determine the phase position of the fluorescent light is in the beam path of the laser another beam splitter T1, the part of the modulated radiation on the deflection mirror S1, the displaceable and vibrationally arranged reflection prism V, the variable neutral density filter G and the small deflection mirror S2 on the avalanche Photodiode PD1 directs. By appropriate displacement of the reflection prism V as well as adjustment of the variable gray filter G, a second signal can be generated in the avalanche photodiode which has the same amplitude as the fluorescence signal, but has a phase shift of 180 ° relative to this. In this case, the fluorescent light and the comparative light together form an unmodulated radiation. Consequently, no spectral component of the frequency OHz is produced at the output of the avalanche photodiode PD1. In order to avoid that other DC components of the photocurrent interfere with the measurement, the reflection prism is set in low-frequency oscillations. With a modulation frequency of the laser light of 500 MHz, a vibration amplitude of the prism of 7.5 mm leads to a phase modulation of the comparison light of 10 °. The spectral component of interest from OHz is thereby transformed to the frequency of the prism oscillation. For registration, a Lock irvVoltmeter D, which is connected to the output of the avalanche photodiode PD1, is used. The vibration of the prism V is converted via a sensor S attached thereto into a control signal which is supplied to the reference input of the lock-in voltmeter. ,

Arbeitet man mit einem Eingangswiderstand des Lock-in-Voltmeters von 1 MOhm und mit einer Zeitkonstanten von 1 s, so ergibt sich theoretisch eine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses um den Faktor 2,5 · 10⁴ gegenüber dem Fall 50 Ohm/ 3OkHz. Hierbei wurde einerseits ein rauschfreier Photostrom angenommen. Andererseits wurde vorausgesetzt, daß bei der Verstärkungsmodulation in der Avalanche-Photodiode eine 0 Hz-Komponente entsteht, die von gleicher Größe ist wie eine 500 MHz-Komponente im Falle fehlender Verstärkungsmodulation. Die erste Annahme kann man als erfüllt ansehen, da an der Rauschgrenze eines typischen Mikrovoltmeters von ca. 1 /iV der Photostrom einer Avalanche-Photodiode bei 3OkHz Bandbreite noch ein Signal-Rausch-Verhältnis von ca. 100:1 besitzt. Die zweite Annahme ist um so besser erfüllt, je größer der Modulationsgrad der inneren Verstärkung ist. Zusammenfassend kann aber gesagt werden, daß selbst bei einem Modulationsgrad von 10% gegenüber dem Fall des Mikrovoltmeters eine erhebliche Verbesserung bezüglich der unteren Nachweisgrenze des Phasenfluormeters erzielt wird. Ein weiterer Vorteil der Anordnung besteht darin, daß eine Drift der Moduiationsfrequenz des Lasers infolge thermischer Einflüsse sich nicht auswirkt. Wjrd dagegen wie üblich ein selektives SVtikrovoltmeter verwendet, so muß dieses erfahrungsgemäß häufig nachgestellt werden. Der an die Photodiode PD2 angeschlossene Verstärker A kann relativ einfach aufgebaut werden, da er einerseits mit einem großen Eingangssignal von einigen hundert mV arbeitet und andererseits nicht extrem schmalbandig gestaltet sein muß. Eine gewisse Breitbandigkeit ist stattdessen sehr vorteilhaft zur Kompensation eventueller schneller Fluktuationen der Laser-Modulationsfrequenz.If one works with an input resistance of the lock-in voltmeter of 1 Mohm and with a time constant of 1 s, theoretically the signal-to-noise ratio improves by a factor of 2.5 × 10 ⁴ compared to the case of 50 ohms / 30 kHz , On the one hand, a noise-free photocurrent was assumed. On the other hand, it has been assumed that the gain modulation in the avalanche photodiode produces a 0 Hz component that is the same size as a 500 MHz component in the absence of gain modulation. The first assumption can be regarded as fulfilled, since at the noise limit of a typical microvoltmeter of about 1 / iV, the photocurrent of an avalanche photodiode at 3OkHz bandwidth still has a signal-to-noise ratio of about 100: 1. The second assumption is better fulfilled, the greater the degree of modulation of the internal amplification. In summary, however, it can be said that even with a modulation depth of 10% over the case of the microvoltmeter, a significant improvement in the lower detection limit of the phase fluorometer is achieved. Another advantage of the arrangement is that a drift of the modulation frequency of the laser due to thermal influences does not affect. If, on the other hand, as usual, a selective SVtrovoltmeter is used, it must, according to experience, be frequently readjusted. The connected to the photodiode PD2 amplifier A can be relatively simple, since he works on the one hand with a large input signal of a few hundred mV and on the other hand must not be designed extremely narrow band. Some bandwidth is instead very beneficial for compensating for any fast fluctuations in the laser modulation frequency.

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Phasenfluorometrische Messungen erfolgen mit dieser Anordnung wie üblich in der Weise, daß zunächst die fluoreszierende Probe F durch ein Streumedium ersetzt wird. Durch entsprechende Justierung des schwingenden Relfexions-Prismas V sowie des variablen Graufilters G bestimmt man die Nullstellung des Reflexions-Prismas. Anschließend erfolgt der gleiche Vorgang mit der fluoreszierenden Probe. Aus dererfolgreichen Verschiebung des Prismas bis zum Erreichen des jeweiligen Signalminimums am Lock-in-Voltmeter ergibt sich die gesuchte Phasenverschiebung infolge des Fluoreszenz-Prozesses.Phase fluorometric measurements are carried out with this arrangement as usual in such a way that first the fluorescent sample F is replaced by a scattering medium. By appropriate adjustment of the oscillating Relfexions prism V and the variable gray filter G determines the zero position of the reflection prism. Subsequently, the same procedure with the fluorescent sample. From the successful displacement of the prism until reaching the respective signal minimum at the lock-in voltmeter results in the desired phase shift due to the fluorescence process.

Claims (4)

-4-237 077 4-4-237 077 4 Erfindungsansprüche:Invention claims: 1. Picosekunden-Phasenfluorometer mit einem sinusförmig modulierten Laser als Anregungslichtquelle, mit einer im Strahlengang des Lasers befindlichen Probe und mit einem im Strahlengang des Fluoreszenzlichtes der Probe angeoi dneton1. picosecond phase fluorometer with a sinusoidally modulated laser as an excitation light source, with a dome in the beam path of the laser and a angeet in the beam path of the fluorescent light of the sample • optischen System aus zwei Linsen mit dazwischen befindlichem Polarisator und Wellenlängen-Filter zur Bestrahlung einer Avalanche-Photodiode mit Fluoreszenzlicht, mit einem im Strahlengang des Lasers angeordneten Strahlteiler zur Ablenkung eines Anteils der Laserstrahlung auf die Avalanche-Photodiode über einen Umlenkspiegel, ein verschiebbar angeo'rdnntes Refiexions-Prisma, ein variables Graufilter sowie einen weiteren Umlenkspiegel, gekennzeichnet dadurch, daß im Strahlengang des Läsers ein weiterer Strahlteiler angeordnet ist zur Ablenkung eines Teils der Laserstrahlung auf einen Photodetektor, dessen Ausgang über einen Verstärker so an die Avalanche-Photodiode geführt ist, daß sich das• Optical system consisting of two lenses with a polarizer and wavelength filter for irradiating an avalanche photodiode with fluorescent light, with a beam splitter arranged in the beam path of the laser for deflecting a portion of the laser radiation onto the avalanche photodiode via a deflection mirror, which is displaceable. rdnntes Refiexions prism, a variable neutral density filter and another deflection mirror, characterized in that in the beam path of the laser another beam splitter is arranged for deflecting a portion of the laser radiation to a photodetector whose output is passed through an amplifier so to the avalanche photodiode, that that is . Ausgangssigiial des Verstärkers der Photodioden-Betriebsspannung überlagert, daß der Ausgang der Avalanche-Photodiode mit einem Lock-in-Voltmeter verbunden ist/dessen Referenz-Eingang mit einem am schwingfähigen Reflexions-Prisma befindlichen Sensor verbunden ist. ·, ^% ., Superimposed on the output of the amplifier of the photodiode operating voltage that the output of the avalanche photodiode is connected to a lock-in voltmeter / whose reference input is connected to a sensor located on the oscillating reflection prism. ·, ^% . 2. Phasenfluorometer nach Punkt t, gekennzeichnet dadurch, daß im Falle der Verwendung eines Lasers mit externem Modulator der Verstärker dieses Modulators über einen separaten Ausgang verfügt, der an die Avalanche-Photodiode geführt ist. >2. phase fluorometer after point t, characterized in that in the case of using a laser with external modulator, the amplifier of this modulator has a separate output, which is guided to the avalanche photodiode. > 3. Phasenfluorometer nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der dem Photodetektor nachgeschaltete Verstärker eine Misch-Stufe enthält, der eine Niederfrequenz-Spannung zugeführt wird.3. phase fluorometer according to item 1, characterized in that the photodetector downstream amplifier includes a mixing stage, which is supplied to a low-frequency voltage. 4. Phasenfluorometer nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß anstölle des Lock-in-Voltmeters ein selektives Niederfrequenz-Voltmeter vorhanden ist.4. phase fluorometer according to item 1, characterized in that the tarry of the lock-in voltmeter, a selective low-frequency voltmeter is present. Hierzu 1 Seite Zeichnungen 'See 1 page drawings'