DD151964A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ERGOSINE - Google Patents
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Abstract
Um Ergosin breiter pharmazeutischer Verwendung zuzufuehren, werden Claviceps-Staemme benoetigt, die in der Lage sind, saprophytisch Ergosin zu bilden, das nahezu frei von Nebenalkaloiden ist, und sich durch Stabilitaet, hohe Alkaloidprodukten und gute Fermentationseigenschaften auszeichnet. Die Aufgabe wird geloest, indem man zur Herstellung von Ergosin den Stamm Claviceps purpurea (Fr.) Tul. IBP 179, seine Mutanten oder Varianten verwendet. Der neue Stamm bildet ein Gesamtalkaloidgemisch (ca. 900-1300 *g/ml Naehrmedium), von dem mindestens 50 % der Alkaloide mit organischen Loesungsmitteln ausschuettelbar sind (ca. 80-90 % Ergosin/Ergosinin und 10-20 % leicht abtrennbare Substanzen). Der Stamm wird in aerober Fermentation in einem fluessigen Naehrmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaelt, in emerser und/oder submerser Kultur bei einer Temperatur von 20-30 Grad C und einem pH-Wert von 4,0-6,2 waehrend eines Zeitraumes von 7-35 Tagen kultiviert. 95 % der gebildeten Alkaloide werden in das Naehrmedium abgegeben, aus dem man Ergosin/Ergosinin isoliert.To deliver ergosine to a broader pharmaceutical use, claviceps strains capable of producing saprophytic ergosine, which is almost free of side alkaloids, and characterized by stability, high alkaloid products and good fermentation properties, are required. The task is solved by using the strain Claviceps purpurea (Fr.) Tul. To produce Ergosin. IBP 179, its mutants or variants used. The new strain forms a total alkaloid mixture (about 900-1300 * g / ml nutrient medium), of which at least 50% of the alkaloids can be extracted with organic solvents (about 80-90% ergosin / ergosinin and 10-20% easily separable substances) , The strain is grown in aerobic fermentation in a liquid nutrient medium containing an assimilable carbon source, an assimilable nitrogen source and mineral salts in an emersed and / or submerged culture at a temperature of 20-30 degrees C and a pH of 4.0-6 , 2 cultivated during a period of 7-35 days. 95% of the alkaloids formed are released into the nutrient medium from which ergosine / ergosinin is isolated.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ErgosineThe invention relates to a process for the production of ergosins
Von den über 50 bisher bekannten natürlichen Mutterkornalkaloiden besitzen die Vertreter der Peptidgruppe eine große Bedeutung in der Medizin, so z. B. Ergotamin, Ergocornin, Ergokryptin und Ergocristin. Das Ergosin steht dem Ergotamin sehr nahe und unterscheidet sich vom letzteren durch Austausch der Aminosäure Phenylalanin gegen die Aminosäure Leucin in der Cyclolseitenkette. Ergosin wirkt wie andere Mutterkornalkaloide vom Peptidtyp uterotonisch sowie vasokonstriktorisch und ist deshalb für die Medizin von Bedeutung. Das Ergosin bzw. seine 9>1O-Dihydroderivate können als Mittel gegen Migräne bzw. zur Behandlung von arterieller Hypertonie, peripheren Gefäßerkrankungen, Störungen der Gehirnzirkulation oder Herzarrhytmien verwendet werden (siehe z. B. DDR-Patentschrift 128612, DDR-Patentschrift 128613). · Auch ist das Ergosin eine Schlüsselverbindung für Partialsynthesen. ·Of the more than 50 previously known natural ergot alkaloids, the representatives of the peptide group have great importance in medicine, such. Ergotamine, Ergocornin, Ergokryptin and Ergocristin. The Ergosin is very close to the ergotamine and differs from the latter by replacing the amino acid phenylalanine with the amino acid leucine in the cyclol side chain. Like other ergot alkaloids of the peptide type, ergosine has an uterotonic and vasoconstrictive effect and is therefore of importance to medicine. The ergosin or its 9> 10-dihydro derivatives can be used as agents for migraine or for the treatment of arterial hypertension, peripheral vascular diseases, disorders of brain circulation or cardiac arrhythmias (see, for example, DDR patent 128612, DDR patent 128613). · Ergosin is also a key compound for partial syntheses. ·
Bisher sind kaum Verfahren bekannt geworden, nach denen saprophytisch Ergosin gewonnen werden kann.So far, hardly any methods have become known according to which saprophytic ergosine can be obtained.
In einem britischen Patent ist beschrieben, daß durch Claviceps purpurea OKI 88/72 neben Ergokryptin, ErgocorninIn a British patent is described by Claviceps purpurea OKI 88/72 in addition to ergocryptine, Ergocornin
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und Ergometrin als Hauptalkaloide (JO %, 28 % bzw. 22 %) auch Ergosin in Mengen von 5 % gebildet wird (Brit. Patent 1 401 406).and Ergometrin as the main alkaloids (JO%, 28 % and 22 %, respectively) and ergosine in amounts of 5% is formed (Brit. Patent 1 401 406).
In anderen Patenten wird die gleichzeitige Gewinnung von Ergocornin und Ergosin nebeneinander geschützt. Der geschützte Stamm bildet beide Alkaloide bzw. ihre Isomeren Ergocorninin und Ergosinin in etwa gleichen Mengen bei einem Gesamtalkaloidgehalt von etwa 900 - 1100 ng/ml Nährlösung (Brit. Patent 1 184 039)οIn other patents, co-production of ergocornine and ergosine is protected side by side. The protected strain forms both alkaloids or their isomers ergocorninin and ergosinin in approximately equal amounts with a total alkaloid content of about 900 - 1100 ng / ml nutrient solution (Brit. Patent 1 184 039) ο
In einem weiteren Patent ist die mikrobiologische Gewinnung eines von anderen Peptidalkaloiden freien Ergosins beschrieben. Als Begleitalkaloide treten Clavinalkaloide auf (ca. 10 % der Gesamtalkaloide gegenüber 90 % Ergοsin/Ergosinin), die leicht abtrennbar sind. (DDR-Patentschrift 129 801),Another patent describes the microbiological production of ergosine free of other peptide alkaloids. Clavinal alkaloids occur as adjuvant alkaloids (about 10% of the total alkaloids compared to 90% Ergofin / Ergosinin), which are easily separable. (DDR patent 129 801),
Die Nachteile der genannten Verfahren bestehen darin, daß entweder eng verwandte-Peptidalkaloide nebeneinander vorliegen, die erst auf kompliziertem Wege voneinander getrennt werden müssen, oder daß erst nach langen Fermentationszeiten geringe Ergosinmengen produziert werden.The disadvantages of the said methods are that either closely related peptide alkaloids are present side by side, which must first be separated from each other in a complicated way, or that only small amounts of ergosin are produced after long fermentation times.
Es ist das Ziel der Erfindung, nach einem günstigen Verfahren das Alkaloid Ergosin herzustellen und damit eine pharmazeutische Verwendung zu ermöglichen.It is the object of the invention to prepare the alkaloid Ergosin according to a favorable process and thus to enable a pharmaceutical use.
Darlegung des Wesens der Erfindung . · Explanation of the essence of the invention . ·
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde/ ein Verfahren zur Herstellung von Ergosin zu entwickeln, bei dem die aufwendige Abtrennung verwandter Peptidalkaloide nicht erforderlich und das ökonomisch vorteilhaft ist. Hierzu sind Stämme zu isolieren, dieThe invention has for its object to develop / a process for the preparation of ergosine, in which the complex separation of related peptide alkaloids is not required and which is economically advantageous. For this purpose, isolate strains that
1. in der Lage sind, saprophytisch Ergosin zu bilden, das nahezu frei ist von Nebenalkaloiden und1. are able to form saprophytic ergosin, which is almost free of side alkaloids and
2. sich durch Stabilität, hohe Alkaloidproduktion und gute Fermentationseigenschaften auszeichnen.2. are characterized by stability, high alkaloid production and good fermentation properties.
3 - Z I 4 33 - Z I 4 3
Erfindungsgemäß werden zur Herstellung von Ergosin der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 179> seine Mutanten oder Varianten verwendet.According to the invention for the production of ergosine the strain Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 179> uses its mutants or variants.
Der neue Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IEP 179 ist beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR in Jena unter der Bezeichnung IMET PA 136 hinterlegt. Er bildet ein Gesamtalkaloidgemisch (ca . 900 - 1300jig/inl Nährmedium), ' ' von dem mindestens 5.0 % der Alkaloide mit organischen Lösungsmitteln ausschüttelbar sind und davon wiederum mehr als 80 - 90 % durch das Isomerenpaar* Ergosin/Ergosinin repräsentiert werden. Die restlichen 10 - 20 % stellen leicht von den Hauptalkaloiden abtrennbare Substanzen (Clavinalkaloide bzw. Ergometrin) dar. Ergokryptin trat teilweise in geringen Spuren auf. In den Nährmedien verbleibt nach dem Ausschütteln u. a. Lysergsäure. Die Alkaloide lassen sich auf bekannten Wegen aus dem Nährmedium isolieren. Eine Umwandlung der isomeren Alkaloide ineinander ist möglich.The new tribe Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IEP 179 is deposited with the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the Academy of Sciences of the GDR in Jena under the name IMET PA 136. It forms a total alkaloid mixture (about 900-1300 μg / inl of nutrient medium), of which at least 5.0 % of the alkaloids can be shaken out with organic solvents and of which more than 80-90% are represented by the isomer pair ergosine / ergosinine. The remaining 10 - 20% are easily separable from the main alkaloids substances (Clavinalkaloide or ergometrine). Ergokryptin occurred partially in small traces. Lysergic acid remains in the nutrient media after shaking out. The alkaloids can be isolated from the nutrient medium by known methods. A conversion of the isomeric alkaloids into each other is possible.
Der Stamm zeichnet sich dadurch aus, daß er mehr als 95 % der gebildeten Alkaloide in die umgebenden Nährmedien abgibt und daß er neben Ergosin und dessen Isomeren Ergosinin nur Begleitalkaloide bildet, die leicht abtrennbar sind.The strain is characterized by the fact that it releases more than 95% of the alkaloids formed into the surrounding nutrient media and that it forms only Begleitalkaloide next to ergosine and its isomers ergosinin, which are easily separable.
Die !Cultivation zur Charakterisierung von Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 179, IMET PA 136, erfolgte auf bzw. in den in. Tabelle 1 zusammengestellten Medien. Der neue Stamm besitzt die folgenden makroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften:The! Cultivation for the characterization of Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 179, IMET PA 136, was carried out on or in the media compiled in Table 1. The new strain has the following macroscopic and microscopic properties:
Makroskopisches Aussehen Macroscopic appearance
Alter der Agarkulturen: 3 WochenAge of the agar cultures: 3 weeks
Agar HL 126: Flacher, hellbrauner Rasen, feinwollig, kaum gefaltetAgar HL 126: Flat, light brown lawn, fine wool, barely folded
Einzelkolonien: 0 0y8. - 1,3 cm, scharf aufgesetztSingle colonies: 0 0 y 8. - 1.3 cm, set sharply
hellbraun, feinwollig, im UV-licht schwache Fluoreszenzlight brown, fine wool, weak fluorescence in UV light
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Agar KL 829: Erhabener, stark gefalteter Rasen, dessen Oberseite graubraun ist, oft scharf aufgesetzte Ränder.Agar KL 829: Elevated, strongly folded turf, the top of which is gray-brown, often sharply set edges.
Einzelkolonienι 0 0,8 -1,3 cm, bis 1 cm hoch, Napfkuchenförmig aufgesetzt, mit graubrauner Oberseite. Junge Kolonien besitzen eine graubraune, alte Kolonien eine mittelbraune Unterseite. Im UV-Licht Fluoreszenz.Einzelkolonienι 0 0.8 -1.3 cm, up to 1 cm high, cupcake-shaped, with gray-brown top. Young colonies have a greyish-brown, old colonies have a mid-brown underside. In UV light fluorescence.
Vorkultur 'HL 849;Preculture 'HL 849;
Tage alt - Das Myeel besteht aus knotenstockartigenDays old - The myeel consists of nodose-like
Hyphen. Vereinzelt treten längliche, ellipsoide Sporen auf. Hyphen-0: 6 - 8 yxm. Hyphae. Occasionally elongated, ellipsoidal spores occur. Hyphae 0: 6 - 8 yxm.
Hauptkultur EL 833iMain culture EL 833i
Tage alt - Mycel mit langen, verzweigten Hyphen, deren Wand normal und septiert ist. Die Hyphen' wirken "körnig" mit zentralem oder wandständigem Plasma. Blasige Anschwellungen, meist am Hyphenende. Selten Sporen. Hyphen-0: 5-7 μυι· 0 der blasigen Anschwellungen: 8-10 jum.Days old - mycelium with long, branched hyphae whose wall is normal and septate. The hyphae are "grainy" with central or walled plasma. Bloomy swelling, usually at the end of the hyphae. Rarely spores. Hyphen-0: 5-7 μυι · 0 of the bloody swelling: 8-10 μm.
14Tege alt - Das Mycel besteht aus langen, verzweigten, stark septiert en Hyphen. Das Plasma ist zentral oder wandständig angeordnet. Hyphen-0: 5-7 /im.14Tege old - The mycelium consists of long, branched, strongly septate hyphae. The plasma is arranged centrally or walled. Hyphae 0: 5-7 / im.
Knotenstockartige Verdickungen: 8-12 ;um, vereinzelt Arthrosporen.Nodal-like thickenings: 8-12 um, occasionally arthrospores.
Das Mycel enthält Lipidtröpfchen, deren Anteil in alkaloid-. bildenden Kulturen besonders hoch ist.The mycelium contains lipid droplets whose portion is in alkaloid. particularly high in crops.
Die Kultivation erfolgte bei 24 +1 0C. Die Schüttelkulturen wurden auf Rundschütteltisehen bei 240 UpM inkubiert.The culture was carried out at 24 +1 0 C. The shake cultures were incubated on Rundschütteltisehen at 240 rpm.
Die aerobe Fermentation des Pilzes zur Produktion erfolgt zweckmäßigerweise in flüssigen Nahrmedien in emerser und/ oder submerser Kultur. Die Nährmedien enthalten eine assimi-The aerobic fermentation of the fungus for production is expediently carried out in liquid nutrient media in an emersed and / or submerged culture. The nutrient media contain an assimilated
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lierbare C-Quelle, wie beispielsweise Saccharose, Glucose, Mannit;, Sorbit, Glycerin, Zitronen- oder Bernsteinsäure, eine assimilierbare N-Quelle, wie beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Pepton, Caseinhydrolysat oder ein Ammoniumsalz, sowie Mineralsalze. Die Fermentation kann beispielsweise in .Fernbach-, Erlenmeyer- oder Schüttelkolben oder im Fermenter erfolgen.A soluble C source such as sucrose, glucose, mannitol, sorbitol, glycerol, citric or succinic acid, an assimilable N source such as ammonia, asparagine, peptone, casein hydrolyzate or an ammonium salt, as well as mineral salts. The fermentation can take place, for example, in .Fernbach, Erlenmeyer or shake flasks or in the fermenter.
Die Kultivation erfolgt zweckmäßigerweise ein- bis dreistufig. Es ist vorteilhaft, wenn die Vorkultur 4-14 Tage alt und das Impfverhältnis Vor- : Hauptkultur = 1:5 bis 1 : 20 ist. Die Hauptkultur beträgt 7-35 Tage. Der pH-Wert kann zwischen 4,0 und 6,2, die Temperatur zwischen 20 und JO 0C liegen. Optimal ist eine Fermentation bei 22 - 25 0C und pH'5,2 - 5,9.The cultivation is expediently one to three stages. It is advantageous if the preculture is 4-14 days old and the inoculum ratio is pre-main culture = 1: 5 to 1:20. The main culture is 7-35 days. The pH may be between 4.0 and 6.2, the temperature between 20 and JO 0 C. A fermentation at 22 - 25 0 C and pH'5,2 - 5,9 is optimal.
Die Stammerhaltung kann über Röhrchen, Protoplastenselektion oder durch Tiefkühllagerung unter Verwendung von Schutzkolloiden, wie Zo B. 60 %ige Saccharoselösung: Magermilch 2:1, auf übliche Weise erfolgen.Stammering can be achieved by tube, protoplast selection or by refrigerated storage using protective colloids, such as Zo B. 60% sucrose: skim milk 2: 1, in the usual way.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die verwendeten Nährinedien sind Tabelle 1 zu entnehmen.The following examples are intended to illustrate the invention. The nutrient media used are shown in Table 1.
Ausgehend von Konserven des Stammes Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 179 wurden Vorkulturen von 100 ml Medium NL 849 in 500 ml-Schüttelkolben beimpft. Die Kolben wurden 7 Tage bei 24+1 0C bei 240 UpM bebrütet. 10 % der erhaltenen Kulturen dienten-dazu, 500 ml-Kolben mit je 100 ml Medium KL 720 zu beimpfen. Nach 14-tägiger Bebrütung unter den beschriebenen Bedingungen enthielten die Kulturen 510 P-S Alkaloide, die nach bekannten Verfahren aufgearbeitet und isoliert wurden.Starting from canned food of the tribe Claviceps purpurea (Fr.) TuI. IBP 179 seed cultures of 100 ml medium NL 849 were inoculated in 500 ml shake flasks. The flasks were incubated at 240 rpm for 7 days at 24 + 1 0C. 10% of the cultures obtained were used to inoculate 500 ml flasks with 100 ml medium KL 720 each. After incubation for 14 days under the conditions described, the cultures contained 510 hp alkaloids, which were worked up and isolated by known methods.
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10 % der in Beispiel 1 genannten Vorkultur wurden zum Beimpfen von 100 ml Nährmedium NL 833 in 500 ml-Kolben benutzt. Nach 14-tägiger Inkubation unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen enthielten die Kolben 946 ^ig/ml Gesamtalkaloid der folgenden Zusammensetzung:10% of the preculture mentioned in Example 1 was used to inoculate 100 ml of nutrient medium NL 833 in 500 ml flasks. After incubation for 14 days under the conditions given in Example 1, the flasks contained 946 μg / ml total alkaloid of the following composition:
Mit organischen Lösungsmitteln ausschüttelbar: 480 jig/ml, davon 80 %' Ergosin/lrgosinin, 15 % Clavinalkaloide und 5 % Ergometrin. .Can be shaken with organic solvents: 480 μg / ml, of which 80 % is ergosine / lrgosinine, 15% clavine alkaloids and 5 % ergometrine. ,
Beispiel 3 : ' " " ' Example 3 : ''''
Zur Identifizierung der Alkaloide werden 10 ml der Nährmedien alkalisiert und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird auf 5 ml eingeengt. Davon werden 2 ml durch präparative Schichtchromatographie an Kieselgel mit Fluoreszenzindikator (Lösungsmittelsystem Chloroform : Äthanol =8 : 2) getrennt. Die Alkaloidflecke werden abgeschabt, mit einer Mischung von Wasser : Methanol : Eisessig =45 : 45 : 10 aufgenommen und anschließend mit van Urk's Reagenz zentrifugiert. Der Überstand wird mit einer Quarzlampe 5 min bestrahlt und die Extinktion im Photometer bestimmt. Die Alkaloidmengen können unter gleichen Bedingungen aufgestellten Eichkurven entnommen werden»To identify the alkaloids, 10 ml of the nutrient media are alkalized and extracted with chloroform. The extract is concentrated to 5 ml. Of these, 2 ml are separated by preparative layer chromatography on silica gel with fluorescence indicator (solvent system chloroform: ethanol = 8: 2). The alkaloid stains are scraped off, taken up with a mixture of water: methanol: glacial acetic acid = 45: 45: 10 and then centrifuged with van Urk's reagent. The supernatant is irradiated with a quartz lamp for 5 min and determines the extinction in the photometer. The quantities of alkaloids can be taken from calibration curves prepared under the same conditions »
Die präparative Gewinnung der Peptidalkaloide wurde auf folgende Weise durchgeführt: 2,5 1 Nährlösung wurden alkalisch gestellt (pH£ 9)» erschöpfend mit Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte im Vakuum eingedampft. Daraus resultieren 1300 mg Rohalkaloidgemisch. Dieses Material wurde in wenig Chloroform gelöst und an einer Kieselgel-Säule chromatographiert. Als Elutionsmittel diente Chloroform, dem steigende Mengen Äthanol (bis 15 %) zugesetzt wurden. Es bildeten sich zwei getrennte, im UV-Licht blau fluoreszierende Zonen. Die rascher wandernde Zone ergab Ergosinin. Nach Umkristallisieren aus Methanol wurden 290 mg Ergosinin (C30H57O5N5) erhalten, Fp 225 0O. Γ*2ψ = + 394 ° (c = 1 % Chloroform). Hochaufgelöstes Massenspektrum m/e:The preparative recovery of the peptide alkaloids was carried out in the following manner: 2.5 liters of nutrient solution were made alkaline (pH 9), extracted exhaustively with chloroform, and the combined extracts were evaporated in vacuo. This results in 1300 mg of crude halide mixture. This material was dissolved in a little chloroform and chromatographed on a silica gel column. The eluent was chloroform, to which increasing amounts of ethanol (up to 15%) were added. It formed two separate, in the UV light blue fluorescent zones. The faster moving zone yielded ergosinine. After recrystallization from methanol, 290 mg ergosinin (C 30 H 57 O 5 N 5 ) were obtained, mp 225 0 O. Γ * 2ψ = + 394 ° (c = 1 % chloroform). High-resolution mass spectrum m / e:
547 (M+); Gef. 547, 2807, Ber. 547, 2794 für C30H37O5N5. Weitere prominente Fragmente m/e: 280; 267; 224; 221; 210; 167;. 154.547 (M + ); Gef. 547, 2807, Ber. 547, 2794 for C 30 H 37 O 5 N 5 . Other prominent fragments m / e: 280; 267; 224; 221; 210; 167 ;. 154th
Das Eluat der langsamer wandernden Zone enthielt 680 mg Ergosin (0,QH37OcNc). Massenspektrum m/e: 547 (M+). V/eitere prominente Fragmente m/e: 280; 267; 224; 221; 210; 167; 154.The slower moving zone eluate contained 680 mg ergosine (0, QH 37 OcNc). Mass spectrum m / e: 547 (M + ). Other prominent fragments m / e: 280; 267; 224; 221; 210; 167; 154th
In beiden Fällen war die Keller1sehe und van Urk'sche Reaktion positiv, und das Absorptionsspektrum im UV zeigte beiX= 312 nm ein Maximum. .In both cases the Keller 1 and Van Urk reaction were positive, and the absorption spectrum in the UV showed a maximum at X = 312 nm. ,
Bei der sauren Hydrolyse entstanden jeweils Leucin und Prolin. Die alkalische Hydrolyse lieferte Lysergsäure (Ergosin) bzw. Isolysergsäure (Ergosinin).Acid hydrolysis produced leucine and proline, respectively. Alkaline hydrolysis provided lysergic acid (ergosine) or isolysergic acid (ergosinine).
Auch das chromatographische Verhalten der beiden isolierten Peptidalkaloide stimmte mit authentischem Ergosin bzw. Ergosinin überein. Eine Umwandlung der Alkaloide ineinander nach bekannten Methoden war möglich.The chromatographic behavior of the two isolated peptide alkaloids was also consistent with authentic ergosine or ergosinin. A conversion of the alkaloids into each other by known methods was possible.
Zusammensetzung der verwendeten Nährlösungen (Angaben in g/l)Composition of the nutrient solutions used (data in g / l)
Claims (3)
geführt wird3. The method according to points 1 and 2, characterized in that the Ferm
to be led
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| YU181880A (en) | 1983-02-28 |
| EP0022973A1 (en) | 1981-01-28 |
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