DD147005A5 - METHOD FOR DETECTING BACTERIAL INFECTIONS - Google Patents

Abstract

Es handelt sich um ein Verfahren zum Nachweis bakterieller Infektionen vor oder neben Virusinfektionen des Auges und anderer Organe, bei dem man eine Probe, die von einem koerpereigenen Stoff, wie Traenen oder dergleichen, an der Infektionsstelle entnommen worden ist, einer fuer bakterielle Enzyme reaktivierenden Behandlung unterwirft und die bakteriellen Enzyme in dem so erhaltenen Material nachweist. Der Nachweis wird insbesondere durch Anfaerben einer Probe des nach der reaktivierenden Behandlung erhaltenen Materials in einem von den bakteriellen Enzymen zersetzbaren Substrat und Feststellen der Bildung von Halonen ( augehellten Hoefen ) u. gegebenenfalls deren Groesze durchgefuehrt. Das Verfahren ist von Bedeutung, weil bakterielle Enzyme, die ohne Anwendung von Antibiotika bei Virusinfektionen im Organismus entstehen koennen, die Bildung von antiviralem Interferon in der Zelle beeintraechtigen oder hindern.It is a method for the detection of bacterial infections before or next to viral infections of the eye and other organs, in which a sample taken from a body's own substance, such as tears or the like, at the site of infection, a bacterial enzyme reactivating treatment subjects and detects the bacterial enzymes in the material thus obtained. In particular, detection is provided by staining a sample of the material obtained after the reactivating treatment in a substrate which can be decomposed by the bacterial enzymes and detecting the formation of halons (ovoided hives) and the like. if necessary their size is carried out. The method is important because bacterial enzymes, which can be produced without viral antibiotics in viral infections in the organism, impair or prevent the formation of antiviral interferon in the cell.

Description

69 6 6 "Λ- ^Berlin' ^den 9-4.1980 69 6 6 "Λ- ^Berlin ' ^the 9-4.1980

ό * ν w _{G 01} jj/216 966 ό * ν w _{G 01} jj / 216 966

(56 589/11)(56 589/11)

Verfahren zum Nachweis bakterieller InfektionenMethod for detecting bacterial infections

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis bakterieller Infektionen vor oder neben Virusinfektionen des Auges und anderer Organe«,The invention relates to a method for detecting bacterial infections before or alongside virus infections of the eye and other organs.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Zur Behandlung von Viruserkrankungen des Auges wurden bisher schon antivirale Substanzen wie Interferon verwendet (Emödi u· a· 1974i Jordan, 1974)· Es wurde damit im allgemeinen eine Besserung der Virusinfektion erreicht, doch konnte vielfach ein erneutes Auftreten einer akuten Virusinfektion nicht verhindert werden·Antiviral substances such as interferon have hitherto been used for the treatment of viral diseases of the eye (Emödi u · a · 1974i Jordan, 1974). · An improvement in the viral infection has generally been achieved, but in many cases a recurrence of an acute viral infection could not be prevented.

Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß ein enger Zusammenhang zwischen einer bakteriellen Infektion und einer Viruserkrankung besteht, d· h., daß einer Viruserkrankung immer eine bakterielle Infektion vorangeht oder eine Viruserkrankung von einer solchen bakteriellen Infektion begleitet wird» Vor und während einer Viruserkrankung sind bakterielle Enzyme beim Krankheitsherd vorhanden· Diese bakteriellen Enzyme, wie die Hyaluronidase, beeinträchtigen bzw, hindern eine Bildung von antiviralem Interferon in der Zelle, wodurch ein Eindringen und ein Ausbreiten des Virus ermöglicht wird. ·In the context of the invention, it has been found that there is a close connection between a bacterial infection and a viral disease, that is, that a viral disease always precedes a bacterial infection or a viral disease is accompanied by such a bacterial infection "before and during a viral disease Bacterial enzymes present at the site of the disease · These bacterial enzymes, such as hyaluronidase, impair or inhibit the production of antiviral interferon in the cell, thus allowing the virus to enter and spread. ·

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis bakterieller Infektionen vor oder neben Virus-The object of the invention is to provide a method for detecting bacterial infections before or next to viral infections.

G 01 Η/216 966 (56 589/11)  G 01 Η / 216 966 (56 589/11)

Infektionen des Auges und anderer Organe, wodurch dann eine wirksame Behandlung der Virusinfektionen durch Verabreichung geeigneter Antibiotika außer antiviralen Substanzen und dadurch eine Unterdrückung einer Bildung von bakteriellen Enzymen erreicht werden kann»Infections of the eye and other organs, which can then be used to effectively treat viral infections by administering appropriate antibiotics other than anti-viral substances and thereby suppressing the formation of bacterial enzymes. "

£a£^gw]£^£ a £ ^ gw] £ ^

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bakterielle Enzyme sichtbar zu machen»The invention is based, to make bacterial enzymes visible »

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß man eine Probe, die von einem körpereigenen Stoff, wie Tränen oder dergleichen, an der Infektionsstelle entnommen worden ist, einer für bakterielle Enzyme reaktivierenden Behandlung unterwirft und in dem so erhaltenen Material bakterielle Enzyme nachweist«This object is according to the invention solved by subjecting a sample that has been taken from an endogenous substance, such as tears or the like, at the site of infection, reactivating a treatment for bacterial enzymes treatment and detects bacterial enzymes in the material thus obtained

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung setzt man der Probe vor oder nach der reaktivierenden Behandlung für bakterielle Enzyme ein Antibiotikum oder'mehrere Antibiotika zu_e Die Antibiotika wirken bekeriostatisch oder bakterizid zerstören jedoch nicht die bakteriellen Enzyme der Probe«According to one embodiment of the invention utilizes the sample before or after reactivating treatment for bacterial enzymes an antibiotic oder'mehrere antibiotics _e Antibiotics act bekeriostatisch or bactericidal but not destroy the bacterial enzymes of the sample "

Bei positivem Nachweis von bakteriellen Enzymen in der Probe können diese im einzelnen durch "Neutralisieren" mit geeigneten Substanzen, wie z» B«. Hyaluronidase mit Heparin, Äthylendiamantetraessigsäure (EDTA), Zinksulfate Sterole usw«, bestimmt werden»If positive evidence of bacterial enzymes in the sample can be obtained, they can be "neutralized" with suitable substances, such as "B". Hyaluronidase with heparin, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), zinc sulfates, sterols, etc., to be determined »

-3- 9.4.1980-3- 9/4/1980

G 01 N/216 ' (56 589/11)G 01 N / 216 '(56 589/11)

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht den Nachweis "bakterieller Infektionen neben Virusinfektionen aufgrund der Peststellung von bakteriellen Enzymen auch dann, wenn die Bakterien selbst nicht nachweisbar sein sollten·The method of the invention makes it possible to detect "bacterial infections in addition to viral infections due to the plague of bacterial enzymes, even if the bacteria themselves should not be detectable."

iTach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung färbt man zum nachweis der bakteriellen Enzyme in dem nach der reaktivierenden Behandlung erhaltenen Material eine Probe des letzteren in einem von den bakteriellen Enzymen ζ er set zrbaren Substrat an und stellt die Bildung von Halonen (aufgehellten Höfen) und gegebenenfalls deren Größe fest.According to a further embodiment of the invention, to detect the bacterial enzymes in the material obtained after the reactivating treatment, a sample of the latter is stained in a substrate which can be set by the bacterial enzymes and the formation of halons (whitened halos) and optionally theirs Size fixed.

Mit Vorteil kann bei Durchführung der Erfindung als Substrat ein Glucosaminoglycansubstrat und zum Anfärben desselben Toluidinblau verwendet werden.Advantageously, a glucosaminoglycan substrate and staining of the same toluidine blue can be used as a substrate in carrying out the invention.

Bei positivem Nachweis bakterieller Infektionen vor oder neben Virusinfektionen nach dem Verfahren der Erfindung kann beispielsweise folgende Behandlung beim Patienten vorgenommen werden:For positive detection of bacterial infections before or in addition to viral infections according to the method of the invention, for example, the following treatment can be performed on the patient:

1· Zur lokalen Behandlung (Tropfen oder Salbe)1 · For local treatment (drops or ointment)

Antibiotika: Gentamycinsulfat oderAntibiotics: gentamycin sulfate or

Chloramphenicol . oderChloramphenicol. or

Cephalotinnatrium (Cephalin) oderCephalotin sodium (cephalin) or

{Derramycin oder{Derramycin or

andere weitere Antibiotika, die dem Antibiogramm nach verwendbar sind.other more antibiotics that are suitable for the antibiogram.

O>ÖO -4« 9*4.1980O> ÖO -4 «9 * 4.1980

G 01 Ιί/21 β 966 (56 589/11)G 01 Ιί / 21 β 966 (56 589/11)

Diese Antibiotika werden wegen ihrer direkten antiviralen Wirkung zur ophtalmischen Behandlung eingesetzte Die angewendeten Mengen entsprechen den üblichen, müssen aber noch wirksam sein können (bakterizide Mindestwirkung)· Im allgemeinen schwanken die angewendeten Mengen zwischen 3 mcg/ml und 100 mcg/ml«These antibiotics are used because of their direct antiviral effect for ophthalmic treatment The applied amounts are the usual, but must still be effective (minimum bactericidal effect) · In general, the applied amounts vary between 3 mcg / ml and 100 mcg / ml «

Es wird außerdem die zusätzliche Verwendung von Polymixin B-»Sulfat mit/oder Ueomycinsulfat in einer Konzentration von 0,25 % bis 0,50 % empfohlen, und zwar nicht nur wegen der antibakteriellen Wirkung dieser beiden.Antibiotika, sondern hauptsächlich wegen derer Fähigkeit, die bakteriellen Enzyme zu neutralisieren· Besonders Neomycinsulfat unterstützt das Interferon und erleichtert das Eindringen desselben»It is also recommended to additionally use polymixin B »sulphate with / or omeomycin sulphate in a concentration of 0.25 % to 0.50 % , not only because of the antibacterial effect of these two antibiotics, but mainly because of their ability to Neutralize Bacterial Enzymes · Neomycin sulfate in particular supports interferon and facilitates its penetration »

2e Neutralisatoren für bakterielle Enzyme2e neutralizers for bacterial enzymes

a<* Polymixin B-Sulfat, Neomycinsulfat,a <* Polymixin B sulfate, neomycin sulfate,

Metalles, wie Silber, Kupfer, Quecksilber, ferner Jode Als Beispiel wird Zinksulfat, 0_s5 %_} in Kochsalzlösung angegebeneMetal such as silver, copper, mercury, further Jode As an example, zinc sulfate, 0 _s specified _5%} in saline

b« Heparinsulfat5 0,05 %% lokal oder subconjunctival, wie auch allgemein,,b " Heparin sulfate5 0.05 %% locally or subconjunctival, as well as generally ,,

DEAE (Diäthylaminzellulosedextran) in Dosen von 400 meg/ ml/Tag lokal oder allgemein zur Unterstützung der Interferone indringung»DEAE (Diethylamincellulose Exxtran) in doses of 400 meg / ml / day locally or generally in support of interferon inding »

c* Eßbare Säure, 0,1.bis 1 %_s in Kochsalzlösung (pH7)© (Sie ist nicht gleichzeitig mit Metallen zu verwenden), L-Cystein (freie Base), 1,2 % bis 3 %_f c * Edible acid, 0.1 to 1 % _s in saline (pH7) © (it should not be used simultaneously with metals), L-cysteine (free base), 1.2 % to 3 % _f

-5- . 9.4.1980-5-. 09/04/1980

G 01 Ή/ 216 966 (56 589/11)G 01 Ή / 216 966 (56 589/11)

aliphatische Alkohole, die Sulfate enthalten, N-Acetylcystein (eine weitere Form der Cysteingruppe, wird auch als Interferon-Stabilisator empfohlen)·aliphatic alcohols containing sulfates, N-acetylcysteine (another form of cysteine group, is also recommended as an interferon stabilizer) ·

3· Interferon und/oder Initiatoren dafür3 · interferon and / or initiators for it

a· Menschliches fibroblastisches Interferon für lokale Anwendung in einer Dosierung von 1 χ 10 ref· Einheiten/ml 2 bis 6x/Tag v/ährend wenigstens 7 Tagen· Es ist eine Kochsalzlösung von Phosphatpuffer (pH7), die auch eine Lösung von menschlichem Albumin (0,3 %) enthält.a · Human fibroblastic interferon for topical administration at a dose of 1 · 10 ref · units / ml 2 to 6x / day for at least 7 days · It is a saline solution of phosphate buffer (pH7) which also contains a solution of human albumin ( 0.3%).

b· Menschliches leukocytisch.es Interferon für lokale Anwendung in einer Dosierung von 1 χ 10 ref_# Einheiten/ ml 2 bis 6x/Tag während wenigstens 7 Tagen·b. Human leukocytic interferon for topical administration at a dosage of 1 χ 10 ref _# units / ml 2 to 6x / day for at least 7 days.

Beide Substanzen sollen in plastischen Kapillarröhrchen von 0,5 bis 1 ml (=1 bis 2 Tropfen) für eine einmalige Anwendung in einer Kühlanlage aufbewahrt werden·Both substances should be stored in plastic capillary tubes of 0.5 to 1 ml (= 1 to 2 drops) for a single application in a refrigeration system.

c. Poly 1:0 (Polylysin-CA-Zellulose), gelöst in Phosphatpuffer (pH 7) in einer Dosierung von 1000 mcg/ml, wird ^/ in einer Kühlanlage aufbewahrte Pur lokale Anwendung werden 100 bis 200 Einheiten/0,1 cm .6 bis 8x/Tag wenigstens während 7 Tagen verabreicht, (Therapeutische Gesamtdosis von 5000 bis 30 000 meg)» Pur die intravenöse Anwendung wird eine therapeutische Gesamtdosis von 30 mcg/70 kg Körpergewicht verabreicht (das sind 4000 bis 6000 Einheiten in 24 Stunden)· Die oben angegebenen Ueutralisatoren sind wenige Minuten vor derc. Poly 1: 0 (polylysine-CA-cellulose), dissolved in phosphate buffer (pH 7) at a dose of 1000 mcg / ml, is ^/ in a refrigerator kept Pur local application 100 to 200 units / 0.1 cm to .6 Administered at least for 7 days, (total therapeutic dose of 5,000 to 30,000 meg) "Intravenous use is administered a total therapeutic dose of 30 mcg / 70 kg body weight (that is 4,000 to 6,000 units in 24 hours) The above specified neutralizers are minutes before the

2 I Ö-V ÖÖ -6- . 9,4*19302 I Ö-V ÖÖ -6-. 9.4 * 1930

G 01 N/216 966 (56 589/11)G 01 N / 216 966 (56 589/11)

Verabreichung von Poly I:G anzuwenden, um dadurch eine Depolarisierung des Gewebes zu erreichen_e Diese Depolarisierung bereitet das Eindringen von Interferon vor«, ·Administration of Poly I: G to thereby achieve tissue depolarization _e This depolarization prepares the entry of interferon «, ·

4β Interferon-Stabilisatoren4β Interferon stabilizers

a» H-Acetylcysteindextran, 0_?05 ml/Tropfena »H-acetyl cyst indextran, 0 _? 05 ml / drop

b* Dextran in allen seinen Formenb * Dextran in all its forms

c«, Polyvinylpyrrolidon (Polyvinylpirididon)c, polyvinyl pyrrolidone (polyvinyl pyrididone)

5» Zusätzlich zu den vorstehenden Interferon-Stabilisatoren können die folgenden Substanzen bei schweren Infektionen eingewendet v/erden:5 »In addition to the above interferon stabilizers, the following substances may be used in severe infections:

a« Steroide für die lokale Anwendung, 0_?05 % bis Oj5 % bis 1 %_s 4x/'£ag_i für die allgemeine Anwendung 5 bis 50 mg/Tag♦ .a «Steroids for local use, 0 _? 05% to Oj5% to 1% _s 4x / '£ _i ag for general use from 5 to 50 mg / day ♦.

bo Indomed als Antiprostaglandinmaterial, 1 % bei lokaler Anwendung, 10 mg bei parenteraler Anv/endung·bo Indomed as antiprostaglandin material, 1 % at local application, 10 mg at parenteral application

c* IeD₈Ue oder Trifluorothymidin in kleinen Mengen, das entgegenwirkt, und eine mögliche Reaktivierung des Virus verhindert _β c * IeD ₈ Ue or trifluorothymidine in small amounts, which counteracts, and a possible reactivation of the virus prevents _β

-7- 9.4.1930-7- 9.4.1930

G 01 Η/216 9ββ (56 589/11)G 01 Η / 216 9ββ (56 589/11)

Ausfuhr ungsbeispielExport example

Das Verfahren der Erfindung wird in dem nachfolgenden Beispiel erläutert.The process of the invention will be explained in the following example.

Beispielexample

Kleine Platten von Mikrogev/ebekulturen v/erden mit folgenden Substanzen angefüllt:Small plates of microvegetables are filled with the following substances:

2 bis 3 cm von einem Puffer (pH 7 bis 8,1), der konzentriertes Material nach Hank mit kleinsten Mengen Penicillin-Streptomycin-Mycostatin enthält_t*2 to 3 cm from one buffer (pH 7 to 8.1), contains the concentrated material by Hank with very small amounts of penicillin-streptomycin Mycostatin * _t

Agarose 1 % in Kochsalzlösung,Agarose 1% in saline,

ein Glucosaminoglycansubstrat, v/ie z, B. Chondroitinsulfat, in Konzentrationen von 0,01 %, 0,05 % und 0,1 %, oder Hyaluronidsäure in Konzentrationen von 0,001 % bis 0,1 %» a glucosaminoglycan substrate, v / ie z, B. chondroitin sulfate, in concentrations of 0.01 %, 0.05 % and 0.1%, or hyaluronic acid in concentrations of 0.001 % to 0.1 % »

Außer den obigen Mikroplatten werden folgende Kontrollplatten vorbereitet:In addition to the above microplates, the following control plates are prepared:

Mikroplatten, die nur Material nach Hank mit 1 % Agarose ohne Substrat enthalten, oder Mikroplatten, die eine Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung (PBS) mit 1 % Agarose ohne Substrat enthalten,Microplates containing only Hank's material with 1 % agarose without substrate or microplates containing phosphate buffer saline (PBS) with 1 % agarose without substrate,

Mikroplatten, die Material nach Hank mit Agarose und das Substrat und zusätzlich die Standardenzyme Hyaluronidase (aufgearbeitete Rindertestes) (1 mg/ml oder Lösungen nach Microplates, the Hank material with agarose and the substrate and in addition the standard enzymes hyaluronidase (reclaimed bovine testes) (1 mg / ml or solutions according to

£ I Qy Ο© -8- 9·4*19ΒΟ £ I Qy Ο © -8- 9 · 4 * 19ΒΟ

G 01 Ν/216 966 (56 589/11) .G 01 Ν / 216 966 (56 589/11).

einer Standardskala) enthalten, und zwar an einer Stelle der Platte» An eine andere Stelle wird. für. Yergleichszwecke bakterielles Enzym von Tränen in einer Lösung nach einer Standardskala gebracht,a standard scale), at one point on the plate. For. Yergleichszwecke bacterial enzyme of tears in a solution according to a standard scale,

Mikroplatten, die außer Agarose und Substrat auch Enzym-* Meutralisator, wie Heparin, 0,05 % oder Dextransulfat in verschiedenen Verdünnungen und Lösungen^, enthalten·Microplates containing not only agarose and substrate but also enzyme neutralizers, such as heparin, 0.05 % or dextran sulfate in various dilutions and solutions.

Alle Mikroplatten sollen hermetisch, verschlossen in einer Kühlanlage aufbewahrt werden«All microplates should be kept hermetically sealed in a refrigeration system. «

Technische Methoden für die Gewinnung des Enzyms aus verschiedenen biologischen Flüssigkeiten und Geweben, Tränen, Blut, Samen, Cornea, Leukocyten und Bakterienkulturen von Infektionssteilen«Technical methods for obtaining the enzyme from various biological fluids and tissues, tears, blood, seeds, cornea, leukocytes and bacterial cultures of infectious agents «

Das Gewinnen des Materials wird mit einem FiIterpapierstreifen oder einer solchen Scheibe, wie z_e B» dem Streifen für den Schirmer-Test oder der gebräuchlichen Scheibe für ein Antibiogramm, oder mittels Mikrokapillarröhren durchgeführte Jedes gewonnene Material wird in einige oder alle Mikroplatten gebracht und bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert« Hachher werden die Filterpapierstreifen oder -scheiben von den Mikroplatten genommen und der Anfärbung unterworfen«Recovering the material is carried out with a FiIterpapierstreifen or of such a disk, such as _e B "the strips for the Schirmer test or the conventional glass for an antibiogram, or by means of Mikrokapillarröhren Each recovered material is brought to some or all microplates and at room temperature incubated for 60 minutes. "Hachher, the filter paper strips or discs are removed from the microplates and subjected to staining."

2 cm ToluidinblaUj 0,1 %, werden gleichmäßig auf jede Mikroplatte gestreut_s 5 Minuten dort gehalten und danach mit 7%iger Essigsäure gewaschen«2 cm ToluidinblaUj 0.1%, evenly sprinkled onto each _s microplate five minutes and held there and then washed with 7% acetic acid washed "

2 16 9 66 -9- 9.4.19802 16 9 66 -9- 9 April 1980

G 01 N/216 966 (56 589/11)G 01 N / 216 966 (56 589/11)

Das Verfahren besteht hierbei also aus dem Anfärben eines Glucosaminoglycansubstrats mit Toluidinblau (einer orthochromatischen Farbe) und dem darauffolgenden Entfärben, um dadurch einen Halo (aufgehellten Hof) an der Reaktionsstelle zwischen dem Substrat und dem dies zersetzenden Enzym zu erhalten.Thus, the method consists of staining a glucosaminoglycan substrate with toluidine blue (an orthochromatic color) and then decolorizing to thereby obtain a halo (brightened yard) at the reaction site between the substrate and the enzyme which degrades it.

Claims (1)

•10- 9*4»1980• 10-9 * 4 »1980 G 01 N/216 966 (56 589/11)G 01 N / 216 966 (56 589/11) 1» Verfahren zum Nachweis'bakterieller Infektionen vor oder -neben Virusinfektionen des Auges und anderer Organe,' gekennzeichnet dadurch^ daß man eine Probe_s die von einem körpereigenen Stoff, wie Tränen oder dergleichen, an der Infektionsstelle entnommen worden ist, einer für bakterielle Enzyme reaktivierenden Behandlung unterwirft und in dem so erhaltenen Material bakterielle Enzyme nachweist,1 "Method for the detection of bacterial infections before or after viral infections of the eye and other organs, characterized in that a sample _{s taken} from an endogenous substance, such as tears or the like, at the site of infection, one for bacterial enzymes subjecting to reactivating treatment and detecting bacterial enzymes in the material thus obtained, 2« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man de r Probe vor oder nach der reaktivierenden Behandlung für bakterielle Enzyme ein Antibiotikum oder mehrere Antibiotika zusetzt«2 «Method according to item 1, characterized in that an antibiotic or several antibiotics are added to the sample before or after the reactivating treatment for bacterial enzymes.« 3e Verfahren nach Punkt 1 und 2,-gekennzeichnet dadurch, daß man zum Nachweis der bakteriellen Enzyme in dem nach der reaktivierenden Behandlung erhaltenen Material eine Probe des letzteren in einem von den bakteriellen Enzymen zersetzbaren Substrat anfärbt und die Bildung von Halonen (aufgehellten Höfen) und gegebenenfalls deren Größe feststellt» 3e method according to item 1 and 2, characterized in that, to detect the bacterial enzymes in the material obtained after the reactivating treatment, a sample of the latter in a decomposable by the bacterial enzymes substrate stains and the formation of halons (lightened courts) and if necessary determine their size » 4«, Verfahren nach Punkt 3g gekennzeichnet dadurch, daß man als Substrat ein Glucosaminoglycansubstrat und zum Anfärben desselben Toluidinblau verwendet«,4, method according to item 3g, characterized in that the substrate used is a glucosaminoglycan substrate and for staining the same toluidine blue,