DD145927A5 - PROCESS FOR PRODUCING A DN TRANSFER VECTOR - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung einer spezifischen Nucleotidsequenz, die den genetischen Code fuer ein spezifisches Protein enthaelt, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer dieser DNS in einen Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation der DNS erfolgt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Insulin-Gen und Wachstumshormon-Genen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschlieszende Charakterisierung. Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt. Zu diesen gehoeren ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem hoeherem Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische Nucleotidsequenz aus einem hoeherem Organismus enthaelt.The present invention relates to the isolation of a specific nucleotide sequence containing the genetic code for a specific protein, the synthesis of DNA having that specific nucleotide sequence and the transfer of this DNA into a host microorganism in which replication of the DNA occurs. In particular, the invention relates to the isolation of insulin gene and growth hormone genes, their purification, transfer and replication in a microbial host and their subsequent characterization. The invention provides new products. These include a plasmid into which a specific nucleotide sequence derived from a higher organism is inserted, and a new microorganism which, as part of its genetic makeup, contains a specific nucleotide sequence from a higher organism.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung einer spezifischen JNucieotidsequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein enthält, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen föucleotidsequenz und den Transfer dieser DKS in einen Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation der DKS erfolgt« Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Insulin-Gen und Wachstumshormon-Genen,-deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschließende Charakterisierung» Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt« Zu diesen gehören ein Plasmidj in welches eine spezifische ITucleotidsequenz, die einem höheren Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische ITucleotidsequenz aus einem höheren Organismus enthält» ·The present invention relates to the isolation of a specific JNucieotidsequenz containing the genetic code for a specific protein, the synthesis of DNA with this specific föucleotidsequenz and the transfer of these DKS in a microorganism as a host, in which the replication of DKS takes place Invention The Isolation of Insulin Gene and Growth Hormone Genes, Their Purification, Transfer and Replication in a Microbial Host, and Their Subsequent Characterization "The Invention Provides New Products." These include a plasmid into which a specific IT nucleotide sequence belongs to a higher Derived organism, and a new microorganism containing as part of its genetic makeup a specific ITucleotidsequenz from a higher organism »·

Charakteristik _ider bekann ten te chnls.chen LösungeηCharacteristic _i the most te th chnls.chen L ösungeη

Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet:The following symbols and abbreviations are used in this description:

DNS .= Desoxyribonukleinsäure . .DNA = deoxyribonucleic acid. ,

FINS » Ribonukleinsäure . 'FINS »ribonucleic acid. '

cDNS ;= komplementäre DNS · ' ·cDNS; = complementary DNA · '·

(enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz)(enzymatically synthesized from a mRNA sequence)

raRNS = messenger-RNS .raRNS = messenger RNA.

tRNS = transfer~RNS .tRNA = transfer ~ RNA.

dATP = Deoxyadenosintrlphosphat dGTP = Deoxyguanosintriphosphat dCTP = DeoxycytidintriphosphatdATP = deoxyadenosine tritol phosphate dGTP = deoxyguanosine triphosphate dCTP = deoxycytidine triphosphate

A = Adenin · ' A = adenine · '

T = Thymin ' . ·T = thymine '. ·

G s= Guanin . . ...G s = guanine. , ...

G = Cytosin : ' . · G = cytosine: '. ·

Tris S= 2~Amino-2-hydroxy-ethyl-l_J3-propandiol EDTA - Ethylendiamin-tetraessigsäure ATP ~ Adenosintriphosphat · TTP = ThymidintriphosphatTris S = 2 ~ amino-2-hydroxy-ethyl-l _J 3-propanediol EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid ATP adenosine triphosphate · ~ = TTP thymidine triphosphate

Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information, Es ist bekanntj dass die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird., der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt» Ausserdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken^- zur Steuerung von Kerstellungszeitpunkt und Menge 'jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannte Schliesslich dient die •Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.The biological meaning of the base sequence of the DNA is that of a store of genetic information. It is known that the base sequence of the DNA is used as a code which determines the amino acid sequence of all proteins produced by the cell. In addition, portions of the sequence serve regulatory purposes Control of the timing and amount of each protein. The mode of operation of these controlling elements is only partially recognized. Finally, the base sequence in each strand serves as a template in the replication of DNA, which accompanies cell division.

Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequem; der DNS auf die Aminosäuresequenz' von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist. . . . . ' The way in which the information of the bases is comfortable; DNA is transferred to the amino acid sequence of proteins is a fundamental process that is universal for all living organisms. , , , , '

Es konnte bewiesen werden, dass jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder raehrer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DNS mit einer Triplett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle.It has been demonstrated that any amino acid commonly present in proteins is determined by the sequence of one or more of its trinucleotides or triplets. Each protein thus corresponds to a segment of the DNA with a triplet sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein. The genetic code is illustrated in the following table.

Genetischer CodeGenetic code

Phenylalanin (Phe)Phenylalanine (Phe) TTKTTK Leucin (Leu)Leucine (Leu) XTYXTY Isoleucin (lie)Isoleucine (lie) ATM ·ATM · Methionin (Met)Methionine (Met) ATGATG Valin (VaI)Valin (VaI) GTLGTL Serin (Ser)Serine (Ser) ORSORS Prolin (Pro)Proline (Pro) CCLCCL Threonin (Thr)Threonine (Thr) ACLACL Alanin (AIa)Alanine (AIa) GCLGCL Tyrosin (Tyr)Tyrosine (Tyr) ΤΑΚΤΑΚ Terminationssignal termination ΤΑJΤΑJ Terminationssignaltermination TGATGA

Histidin (His) CAK. Glutamin (Gin) . CAJHistidine (His) CAK. Glutamine (gin). CAJ

Asparagin (Asn) AAKAsparagine (Asn) AAK

Lysin (Lys) AAJLysine (Lys) AAJ

Asparaginsäure (Asp) GAKAspartic acid (Asp) GAK

Glutaminsäure (GIu) CAJGlutamic acid (Glu) CAJ

Cystein (Cys) . TGKCysteine (Cys). TGK

Tryptophan (Try) TGGTryptophan (Try) TGG

Arginin (Arg) V/GZArginine (Arg) V / GZ

Glycin (GIy) . GGLGlycine (Gly). GGL

Schlüssel: Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Tri nucleotid d'er-DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pjrijnidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden i Key: Each triplet of three letters represents a tri nucleotide d'er DNA, with a 5 'end on the left and a 3' end on the right. The letters represent the purine or pjrijnidine bases that form the nucleotide sequence i

A - Adenin G = Guanin C = Cytosin T = ThyminA - adenine G = guanine C = cytosine T = thymine

- Ij- -- Ij - -

.X=T oder C, falls Y=A oder G.X = T or C if Y = A or G

X=C, falls Y=C oder T ' - Y=A, G, C oder T, falls X=CX = C, if Y = C or T '- Y = A, G, C or T, if X = C

Y=A oder G, falls X=T 'Y = A or G if X = T '

W= C oder A, falls Z= A oder G .W = C or A if Z = A or G.

W = C, falls Z = C oder T Z = A, G, C oder T, falls W=CW = C if Z = C or T Z = A, G, C or T if W = C

Z=A oder G₅ falls W=A V QR = TC, falls S = A, G, : C oder T .Z = A or G ₅ if W = AV QR = TC if S = A, G,: C or T.

QR = AG, falls S=T oder C ' S = A, G, C oder T* falls QR = TC .S=T oder G₉ falls QR = AG.QR = AG if S = T or C 'S = A, G, C or T * if QR = TC. S = T or G ₉ if QR = AG.

J «= A oder G .J «= A or G.

K-T oder C "K-T or C "

L= A, T, C oder G « M = A, ' C oder T- 'L = A, T, C or G «M = A, 'C or T-'

Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz In eine .Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription« In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen, Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotide in dem jedoch Ribose anstelle der Desoxyribose und Uracil anstelle von Thymin stehen» Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS« Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär. Diese RNS wird als messenger-RNS (niRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle,, ·. .In the biological process of the translation of the nucleotide sequence In a .Aminosäuresequenz takes place as a first step the so-called transcription «In this stage, a segment of the DNA with the responsible sequence for the protein to be translated to an RNA, the RNA is a DNA-like polynucleotides in the However, ribose instead of deoxyribose and uracil instead of thymine "The bases of the RNA are capable of the same kind of base pairing as the bases of the DNA." The RNA resulting from transcription of a DNA nucleotide sequence is therefore complementary to this copied sequence. This RNA is called messenger RNA (niRNA) because of its intermediate position between the genetic apparatus and the cell protein synthesis apparatus. ,

In der Zelle dient die mRNS als Matrize" in einem komplexen Vorgangj an dem zahlreiche Enzyme und Organellen innerhalb In the cell, the mRNA serves as a template "in a complex process involving many enzymes and organelles within

5 8-8 - 5 -5 8-8 - 5 -

der Zelle beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer AminosäureSequenzen führt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.involved in the cell and which leads to the synthesis of specific amino acid sequences. This process is called translation.

Häufig gibt es weitere Stufen, die dazu dienen, aus der bei der Translation entstandenen Aminosäuresequenz ein funktionales Protein zu erzeugen. Ein Beispiel ist die Herstellung des Insulins. .Often there are other stages that serve to generate a functional protein from the translation sequence of the amino acid sequence. An example is the production of insulin. ,

Der direkte Vorläufer des Insulins ist ein Polypeptide das Proinsulin, das die beiden Insulinketten A und B über ein weiteres Peptid C gebunden enthält, vergleiche Steiner, D. P. Cunningham, D., Spigelman, L» und At.en, B., Science 157, 697 (1967). Kürzlich wurde berichtet, dass das erste Translationsprodukt von Insulin-mRNS nicht Proinsulin selbst, sondern ein Pre~proinsulin ist, das mehr als 20 weitere Aminosäuren am Amino-Ende des Proinsulins enthält, vergleiche Calin, S.J. Keim, P. und Steiner, D.F.-, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73^ 1964 (197.6), und Lomedico, P.T« und Saunders, G.P- Nucl.Acids Res. JjS₂. >8l (1976). Die Struktur des Pre-pr oinsul inmoleJdils kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden: MHp-(Pre-peptid)-B~Kette~(C"Peptid)-A-Kette~COOH.The direct precursor of insulin is a polypeptide, the proinsulin containing the two insulin chains A and B bound via another peptide C, see Steiner, DP Cunningham, D., Spigelman, L and At., B., Science 157, 697 (1967). It has recently been reported that the first translation product of insulin mRNA is not proinsulin itself but a pre-proinsulin containing more than 20 additional amino acids at the amino end of proinsulin, see Calin, SJ Keim, P. and Steiner, DF , Proc. Natl. Acad. Be. USA 73 ^ 1964 (197.6), and Lomedico, PT "and Saunders, GP Nucl. Acids Res. JjS ₂ . > 8l (1976). The structure of the pre-pr oinsul inmoleJdils can be schematically represented as follows: MHp (Pre-peptide) -B ~ chain ~ (C "peptide) -A chain ~ COOH.

Zahlreiche Proteine von Bedeutung für Medizin oder Forschung werden in.den Zellen höherer Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt. Hierzu gehören zum Beispiel das Hormon Insulin, andere Peptidhormone wie das Wachstumshormon,· an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für 'technische, medizinische oder Forschungszwecke. Häufig'ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem Organismus su gewinnen, insbesondere, bei Proteinen menschlichenNumerous proteins of importance for medicine or research are found or produced in cells of higher organisms such as vertebrates. These include, for example, the hormone insulin, other peptide hormones such as growth hormone, proteins involved in the regulation of blood pressure and numerous enzymes of importance for technical, medical or research purposes. It is often difficult to obtain these proteins in useful amounts by extraction from the organism, especially human proteins

17.1.1975 53 547/1817.1.1975 53 547/18

Ursprungs* Es besteht daher ein Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen außerhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden» In manchen Fällen ist es möglich, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhaltene Das Wachstum von Zellen in Gewebekulturen ist jedoch langsam, das Medium ist teuer, · die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden und die Ausbeuten sind niedrig« Häufig ist es auch schwierig» einen gezüchteten Zellstarnro mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften' zu erhalten»Origin * There is therefore a need for techniques whereby such proteins are produced by cells outside the organism in reasonable amounts. In some cases, it is possible to obtain suitable cell strains through tissue culture techniques. However, the growth of cells in tissue cultures is slow , the medium is expensive, · the conditions must be closely controlled and the yields are low "It is often difficult to obtain a cultivated cell stamen with the desired differentiated properties"

Im Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch definierten Medien gezüchtet werden· Die Permentationstechnologie ist bereits hochentwickelt und gut steuerbar« Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch, und hohe Ausbeuten sind möglich. Außerdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der Tat zu den am besten charakterisierten und erkannten Organismen*In contrast, microorganisms such as bacteria can be grown relatively easily in chemically defined media. • The technology is already highly developed and well controlled. «The growth of organisms is rapid, and high yields are possible. In addition, certain microorganisms have already been genetically well characterized and indeed are among the best characterized and recognized organisms *

-7- ' 17.1-1979-7- '17.1-1979

53 547/1-853 547 / 1-8

Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RlS-SIatrize komplementären DITS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Oligp-deoxynucleotid-Primers und der vier Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCtP und TTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nicht-covalente Bindung des Oligodeoxynucleotid-Primers an das 3'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Doxynucleotide» entsprechend der Basenpaarungsregel, an das 3^f-Bnde der wachsenden Kette« Das ala Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadeiförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RUS und einen komplementären DNS-Einzelstrang# Die Reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelförmigen DI\FS~Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS~ Einzelstrangs durch die ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H» und Leder ₉ P», Proc« Uatl* Acade Sei» ^USA .iä» ¹⁴⁰⁸ (1972) und Efstratiadis_s A.₅Kafatos, F.C. Maxam, A.Fc und Kaniatis, Tc Gell* χ, 279 (1976).Reverse transcriptase catalyzes the synthesis of the Dls complementary to an RIS SIatrice in the presence of the RNA template, an oligo-deoxynucleotide primer, and the four deoxynucleoside triphosphates dATP, dGTP, dCtP, and TTP. The reaction is initiated by the non-covalent binding of the oligodeoxynucleotide primer to the 3 'end of the mRNA, it "is followed by the stepwise addition of the appropriate Doxynucleotide according to the base pairing rule to the 3 ^f -Bnde the growing chain" The ala product obtained Molecule may be described as hairpin shaped, it contains the parent RUS and a complementary DNA single strand # The reverse transcriptase may further catalyze a similar reaction using a single strand of DNA as a template, in which case the product is a hairpin shaped DI. FS ~ duplex is obtained with a loop of DNS ~ single-strand through which a pair of ends are joined; compare Aviv, H »and Leder ₉ P», Proc «Uatl * Acade Sei» ^USA .iä » ¹⁴⁰⁸ (1972) and Efstratiadis _s A. ₅ Kafatos, FC Maxam, A.Fc and Kaniatis, Tc Gell * χ, 279 ( 1976).

Restrictions-endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodies^erbindungen in doppeistrangiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des JÖks-Strangs gespalten wird. Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt.: Das Hauptmerkmal . eines Enzyms dieser- Art besteht darin, dass die hydrolytische Wirkung nur dort eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz v/ird als Erkennungsstelle (Spaltstelle) der Restrictions-endonuclease bezeichnet. Restrictions-endonucleasen wurden aus. verschiedenen Quellen isoliert und ihre Nueleotidsequenz und die Erkermungsstellen wurden ermittelt. Einige Restrictions-endonucleasen hydro-.lysieren die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so dass stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydro lysierte' DNS erneut zu binden» Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muss, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so dass es möglich wird, heterologe DNS-Sequenzen mit anderen, ähnlich-erhaltenen Sequenzen zu verknüpfen;' vergleiche Roberts, R.J_vCrit.Rev. Biochem. Hj_ 123 (I976). .Die Erkennüngssteilen sind relativ rar,'jedoch wurde die allgemeine Verwendbarkeit der Restrictions-endonucleasen stark erweitert durch die chemische Synthese doppelsträngiger Oligo-nucleotide mit den Sequenzen der Erkennungsstellen. Somit kann praktisch jedes DNS-Segment an ein anderes Segmentgekoppelt werden, indem man einfach das entsprechende Restrictions-oligo-nucleotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restrictions-endonuclease unterwirft, wobei man die erforderlichenRestrictive endonucleases are enzymes capable of hydrolyzing phosphodiester linkages in double-stranded DNA, cleaving the sequence of the Joks strand. If the DNA is in the form of a closed loop, it is converted into a linear form: the main feature. An enzyme of this kind is that the hydrolytic effect occurs only where a specific nucleotide sequence is present. This sequence is referred to as the recognition site (cleavage site) of the restriction endonuclease. Restriction endonucleases were eliminated. isolated from various sources and their nucleotide sequence and the Erkermungsstellen were determined. Some restriction endonucleases hydro-ly lyse the phosphodiester bonds in both strands in the same location, creating blunt ends. Others catalyze the hydrolysis of bonds a few nucleotides apart to form single-stranded regions at each end of the cleaved molecule. These single-stranded ends are self-complementary, therefore cohesive, and can be used to re-bind the hydrolyzed 'DNA'. Since any DNA susceptible to cleavage by such an enzyme must contain the same recognition site, the same cohesive ends are produced so that it becomes possible to link heterologous DNA sequences with other, similarly-derived sequences; See Roberts, RJ _v Crit.Rev. Biochem. Hj_ 123 (1976). The recognition parts are relatively rare, but the general utility of restriction endonucleases has been greatly enhanced by the chemical synthesis of double-stranded oligonucleotides with the recognition site sequences. Thus, virtually any DNA segment can be coupled to another segment by simply attaching the corresponding restriction oligonucleotide to the molecular ends and subjecting the product to the hydrolytic action of the corresponding restriction endonuclease, with the requisite

kohäsiven Enden erhält; vergleiche Heynecker, H.L,Shine,receives cohesive ends; compare Heynecker, H.L, Shine,

J. Goodman, H=M. Boyer, H.W. Rosenberg, J., Dickerson, R.E* Narang, S.A., Itakur a, K., Lin, S und Riggs, A.D.^ Nature 26?, 748 (I976J,und'Scheller. R.H. Dickerson, R.E. Boyer,J. Goodman, H = M. Boyer, H.W. Rosenberg, J., Dickerson, R.E. * Narang, S.A., Itakur a, K., Lin, S, and Riggs, A. D. Nature 26, 748 (1976) and Scheller, R.H. Dickerson, R. E. Boyer,

H.W. Riggs, A.D. und ^akura, K.,Science I96, 177 (1977).H. W. Riggs, A.D. and Akura, K., Science I96, 177 (1977).

Sl-Endonuclease ist ein Enzym, das zur Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen einsträngiger DNS oder einsträngiger Zwischenstücke in sonst doppelsträngiger DNS befähigt ist; vergleiche Vogt, V.M._;Eur.J.Biochem. 53^.192 (1975). .Sl-endonuclease is an enzyme capable of hydrolyzing the phosphodiester bonds of single-stranded DNA or single-stranded intermediates in otherwise double-stranded DNA; compare Vogt, VM _; Eur.J.Biochem. 53 ^ .192 (1975). ,

DNS-Ligase ist ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei DNS-Segmenten mit einem 5'-Phosphat bzw. einem J '-Hydroxyl be.'wirkt, ... die zum Beispiel von zwei DNS-Fragmenten gebildet -werden,¹ die durch kohäsive Enden zusammengehalten werden. Die normale Funktion des Enzyms besteht vermutlich darin, einsträngige Zwischenstücke in einem sonst doppeIsträh.gigen DNS-Molekül zu verbinden. Unter geeigneten Bedingungen kann jedoch DNS-Ligase die Verbindung stumpfer Enden katalysieren, wo zwei Moleküle mit stumpfen Enden covalent gebunden sind; vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H., und Khorana, H.G., Proc. Natl.Acad.Sci.,-USA 67i 3Λ68 (1970).DNA ligase is an enzyme that causes the formation of a phosphodiester bond between two DNA segments with a 5'-phosphate and a J'-hydroxyl, respectively ... which are formed, for example, by two DNA fragments. ¹ held together by cohesive ends. The normal function of the enzyme is presumably to join single-stranded intermediates in an otherwise double-stranded DNA molecule. Under appropriate conditions, however, DNA ligase can catalyze the blunt end junction where two blunt-ended molecules are covalently bound; compare Sgaramella, V., Van de Sande, JH, and Khorana, HG, Proc. Natl.Acad.Sci., - USA 67i 3Λ68 (1970).

Alkalische. Phosphatase ist ein Enzym, das Phosphatesterbindungen, einschliesslich der 5' -terminalen Phosphat.- in DNS hydrolysiert.Alkaline. Phosphatase is an enzyme that hydrolyzes phosphate ester bonds, including the 5 '-terminal phosphate.- in DNA.

'Eine weitere Stufe im zu beschreibenden Gesamtverfahren ist die Insertion eines spezifischen DNS-Fragments In einen DNS-Vektor, zum Beispiel ein Plasmid.-Als Plasniid bezeichnet man jede autonom DNS-replisierende Einheit, die in einer Mikrobenzelle neben dem Genom der Wirtszelle vorliegen kann. Ein Plasrnid ist mit den Chromosomen' der Wirtszelle nicht genetisctAnother step in the overall process to be described is the insertion of a specific DNA fragment into a DNA vector, for example a plasmid. Plasniid is any autonomously DNA replicating entity that can be present in a microbial cell adjacent to the genome of the host cell , A plasrnid is not genetisct with the chromosomes of the host cell

verbunden. Plasmid-Desoxyribonukleinsäuren sind doppelsträngige Ringmoleküle, im allgemeinen mit Molekulargewichten von der Grössenordnung einiger Millionen., obgleichconnected. Plasmid deoxyribonucleic acids are double-stranded ring molecules, generally with molecular weights of the order of a few millions, although

bei einigen des Molekulargewicht grosser als 10 ist. Sie stellen gewöhnlich nur einen kleinen prozentualen Anteil der gesamten DNS der Zelle dar. Die Plasmid-DNS lässt sich im allgemeinen von der DNS der Wirtszelle aufgrund des grössen Grössenunterschiedes abtrennen» Die Plasmide können unabhängig von der Geschwindigkeit der Teilung der Wirtszelle.replizieren, und in einigen Fällen kann ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der . Wachstumsbedingungen vom Experimentator beeinflusst werden. Obgleich das Plasmid als geschlossener Ring vorliegt, kann man auf künstlichem Weg ein DNS-Segment in.das Plasmid einführen, wobei ein rekombiniertesplasmid mit vergrösserter Molekülgrösse entsteht, ohne dass seine Fälligkeit zur Replikation oder Expression beliebiger Gene des Plasmids wesentlich beeinträchtigt würde. Das Plasmid dient daher als nützlicher Vektor zur Übertragung eines DNS-Segments in eine neue Wirtszelle«. Zur Neukombination von DNS geeignete Plasmide enthalten typischerweise Gene, die aus Selektionsgründen brauchbar sein können., zum Beispiel Gene der Arzneimittelresistenz.is greater than 10 at some of the molecular weights. They usually represent only a small percentage of the total DNA of the cell. The plasmid DNA can generally be separated from the DNA of the host cell due to the large size difference. The plasmids can replicate independently of the rate of division of the host cell, and in In some cases, their replication rate can be altered by changing the. Growth conditions are influenced by the experimenter. Although the plasmid is a closed ring, one can artificially introduce a DNA segment into the plasmid to produce a recombinant plasmid of increased molecular size without significantly affecting its maturity for replication or expression of any genes of the plasmid. The plasmid therefore serves as a useful vector for transferring a DNA segment into a new host cell. " Plasmids suitable for recombination of DNA typically contain genes that may be useful for selection purposes, for example, drug resistance genes.

Zur Illustr«ierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Ratteninsulin-Gen im einzelnen beschrieben« Das Insulin wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus der Sicht der klinischen Medizin und aus der Sicht der Grundlagenforschung, Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die Isolierung von Insulin-Gen aus anderen Organismen, einschliesslich Menschen, übertragen werden. · ' ' ' . To illustrate the practice of the invention, the isolation and transfer of rat insulin gene are described in detail. Insulin was chosen in this case because of its central importance from the point of view of clinical medicine and from the point of view of basic research The skilled artisan readily transfers to the isolation of insulin gene from other organisms, including humans. · '' '.

Insulin wurde 1922 zum ersten Mal isoliert. Bekanntlich wird dieses Hormon heute zur Behandlung von Diabetes verwendet. Zwar liefern die Schlachthäuser Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen als Insulinquelle, doch entwickelt sich eine Verknappung des Hormons, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Ausserdem ent- . wickeln einige Diabetiker eine allergische Reaktion gegen Rinder- und Schweineinsulin. Die Möglichkeit, menschliches Insulin in den weltweiten Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äusserst erwünscht« Die Herstellung von menschlichem Insulin in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht werden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, dass keine Technik zur- Einführung des Insulin-Gens in Bakterien vorlag. Die vorliegende Erfindung stellt eine derartige Technik bereit. ·Insulin was first isolated in 1922. As is known, this hormone is used today to treat diabetes. Although the slaughterhouses deliver pancreas from cattle and pigs as sources of insulin, there is a shortage of the hormone as the number of diabetics worldwide increases. In addition, Some diabetics have an allergic reaction to bovine and porcine insulin. The ability to produce human insulin in quantities that meet global needs would therefore be highly desirable. "The production of human insulin in bacteria is one technique that could achieve this goal. However, progress in this direction has been thwarted by the lack of technology for introducing the insulin gene into bacteria. The present invention provides such a technique. ·

Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen Code für ein'spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nueleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, dass auch das schliesslich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man zum Beispiel ein modifiziertes Insulin herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer insulinähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Insulins kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden. Ähnliche· Betrachtungen gelten für den Fall der Wachstumshormone.The ability to produce a DNA with a specific sequence that provides the genetic code for a specific protein allows modification of the nucleotide sequence by chemical or biological means such that the protein ultimately generated is also modified. For example, this could be used to make a modified insulin that caters to specific medical needs. The genetic ability to produce an insulin-like amino acid sequence with the essential functional properties of insulin can therefore be transferred to a microorganism. Similar considerations apply to the case of growth hormones.

Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus wie zum Beispiel ein Bakterium, eröffnet neue MöglichkeitenThe ability to transfer the genetic code for a particular protein needed in the normal metabolism of a higher organism into a microorganism such as a bacterium opens up new possibilities

& %J <J <J %$%ß -12- I7.I. &% J <J <J% $% ß -12- I7.I.

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zur Herstellung derartiger Proteine.. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder dem Ersatz solcher Proteine durch Proteine_? welche· von erfindungsgemäß ver~ änderten Mikroorganismen erzeugt wurden dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde, und es ergibt sich zum Beispiel die Möglichkeit zum.Aufbau von Symbiosen zwischen erfindungsgemäßen Mikroorganismen und Menschen mit chronic sehen oder akuten Mange Ikranlchei ten, wobei die auf erfindungsgemäße Weise genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden, um den pathologischen Stoffwechselfehler auszugleichen©for the production of such proteins. This also creates the possibility of propagation or replacement of such proteins by proteins _? which microorganisms modified according to the invention have been produced where the ability of the higher organism to produce these proteins has been damaged, and for example the possibility of building symbioses between microorganisms according to the invention and those with chronic or acute shortages Ikranlchei th, wherein the inventive manner genetically modified microorganisms are implanted or otherwise incorporated to compensate for the pathological metabolic error ©

Es wäre daher sehr erwünscht_s, den Transfer eine3 Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus y der normalerweise das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen· Auf diese Weise könnte das Protein unt-er gesteuerten Wachstumsbedingungen vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten wer'den. Es ist auch möglich, daß die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten Proteins durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten« Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer der Gensequenz„ die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genaix bekannter genetischer Struktur eröffnet außerdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit zu untersuchen wie die Synthese eines solchen Proteins gesteuert und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird. Ferner können isolierte Gene verändert 'werden, so daß sie Pröteinvarianten mit anderen therapeutischen oder funktioneilen Eigenschaften codieren*It would therefore be highly desirable _s, y the transfer eine3 gene codes for a protein of medical significance from an organism that normally produces the protein to achieve in a suitable microorganism · This would make the protein unt-he controlled growth conditions produced by the microorganism and in desired amounts wer'den. It is also possible that the total cost of producing the desired protein could be significantly reduced by such a method. "The ability to isolate and transfer the gene sequence" which determines the production of a particular protein into a microorganism of known genetic structure also opens up Research into the valuable way to study how the synthesis of such a protein is controlled and how the protein is processed after synthesis. Furthermore, isolated genes can be altered so that they code for proteine variants with other therapeutic or functional properties.

17.1.1979 53 547/1817.1.1979 53 547/18

Darlegung des V/es ens der Erfindung Presentation of the Invention of the Invention

Die vorliegende Erfindung betrifft Maßnahmen, um die genannten Ziele zu erreichen. Ein Verfahren wird offenbart, das mehrere Stufen, einschließlich Enzym-katalysierter Reaktionen umfaßte Vorstehend wurden die bisherigen Kenntnisse über die Katür dieser Enzymreaktionen skizziert*The present invention relates to measures to achieve the stated objects. A method is disclosed which comprises several stages, including enzyme-catalyzed reactions. Previously, previous knowledge of the topic of these enzyme reactions was outlined *

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer spezifischen, genetischen Information enthaltende Nucleotide sequenz, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Kucleotidsequenz und den Transfer der DNS in einen Wirts-Mikroorganismus *.The invention relates to a method for isolating a specific genetic information containing nucleotide sequence, the synthesis of DNA with this specific Kucleotidsequenz and the transfer of the DNA into a host microorganism *.

-Die Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen, die in ein Bakterium transferiert werden, nämlich des Strukturgens für Ratten Pre-proinsulin, des Gens für Ratten-Wachstumshormon und des Gens für menschliches Wachstumshormon« Danach kann davon ausgegangen werden, daß die Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus wie zum Beispiel eines Wirbeltiers auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist β Ein höherer Organismus wird hier definiert als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschließlich zum Beispiel der Insekten, Mollusken, Pflanzen, Wirbeltiere, einschließlich Säugetiere, wobei zu letzteren 'Rinder, Schweine, Primaten und Menschen gehören«. Unter einemThe invention is illustrated by the example of specific DNA sequences that are transferred to a bacterium, namely the structural gene for rats Pre-proinsulin, the gene for rat growth hormone and the gene for human growth hormone "Thereafter, it can be assumed that the method is well applicable to the transfer of any DNA sequence of a higher organism, such as a vertebrate, to any microorganism. β A higher organism is defined herein as any eucaryotic organism with differentiated tissues, including, for example, insects, molluscs, plants, vertebrates including mammals, the latter of which include 'bovine animals, swine, primates and humans'. Under a

Mikroorganismus versteht man jeden mikrokopischen lebenden Organismus, der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontisch oder eucaryontisch sein und zum Beispiel aus einem Bakterium, Protozon, Algen und Pilzen, einschliess~ lieh Hefen, bestehen kann. Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird. Die' intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von Reverser Transcriptase unterworfen, wobei diese Einwirkung in Gegnwart der zur Synthese eines komplementären (cDNS)-Strangs erforderlichen vier DeoxynucIeosid-triphosphate erfolgt. Das Produkt dieser ersten Reaktion mit Reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt. Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz/ die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit Reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate inkubiert. Das resultierende Produkt ist eineMicroorganism is any microcopic living organism known as protist, which may be procaryotic or eucaryotic, consisting of, for example, a bacterium, protozoan, algae and fungi, including yeasts. In the present method, a selected cell population is first isolated using a new method. From the cells, intact mRNA is extracted by a method that suppresses virtually all RNase activity. The intact messenger RNA from the extract is purified by column chromatography and then subjected to the action of reverse transcriptase, this action occurring in the absence of the four deoxynucleoside triphosphates required to synthesize a complementary (cDNA) strand. The product of this first reaction with reverse transcriptase is treated in a process that selectively removes the ribonucleotide sequence. The remaining deoxynucleotide sequence / which is complementary to the starting mRNA is incubated in a second reaction with reverse transcriptase or DNA polymerase in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates. The resulting product is one

. doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet. Die resultierende doppeltsträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man , an beiden Enden eine spezifische DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungsbzw. Spaltstelle eines Restriktionsenzyms aufweist. Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer Restriktions-endonuclease, double cDNA structure whose complementary strands are connected at one end by a single-stranded loop. This product is then treated with single-strand specific nuclease which cleaves off the single-stranded loop. The resulting double-stranded cDNA is then extended by adding, at both ends, a specific DNA having the sequence of recognition. Cleavage site of a restriction enzyme has. The addition is catalyzed by a DNA ligase. The extended cDNA is then treated with a restriction endonuclease

•behandelt, wobei an den 5'-Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige Enden entstehen.• treated with self-complementary single-stranded ends formed at the 5 'ends of each strand of the double helix.

S 5 8-8 - f? -S 5 8-8 - f? -

Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-endonuclease wird mit diesem Enzym behandelt, um. den Polynucleotidstrang zu spalten und selbst-komplemen-· täre einsträngige Nucleotidsequenzen.an den 5¹-Enden zu er« zeugen. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, dass das Plasmid eine zur Transformierung einer Wirts zelle fähige Ringstruktur' bildet. Die,wie vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase .zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Eildung eines lebensfähigen, geschlossenen Rings aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird. Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht. Zellen, die ein lebensfähiges Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien mit einem vom Plasmid beigesteuerten Merkmal wie zum Beispiel Arzneimittel-Resistenz. Reine Bakterienstämme, die das rekombinierte Plasraid mit der eingebauten cDNS-Sequenz enthalten, werden dann gezüchtet und das neukombinierte Plasmid wird anschliessend rdsoliert. Auf diese Weise können grosse Mengen an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, woraus man die spezifische cDNS-Sequenz durch £ndonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann« .·'.-. . 'A plasmid DNA having a recognition site for the same restriction endonuclease is treated with this enzyme to. to cleave the polynucleotide strand and to generate self-complementary single-stranded nucleotide sequences at the 5 ¹ ends. The 5'-terminal phosphate groups at the single-stranded ends are removed to prevent the plasmid from forming a ring structure capable of transforming a host cell. The cDNA prepared as described above and the plasmid DNA are then incubated together in the presence of DNA ligase. Under the reaction conditions described, the formation of a viable, closed loop of plasmid DNA can only occur if a segment of the cDNA is inserted. The plasmid containing the cDNA sequence is then placed in a suitable host cell. Cells that have taken up a viable plasmid are recognized by the appearance of colonies with a trait contributed by the plasmid, such as drug resistance. Pure bacterial strains containing the recombinant plasraid with the incorporated cDNA sequence are then grown and the recombined plasmid is subsequently disrupted. In this way, large amounts of recombinant plasmid DNA can be produced, from which one can re-isolate the specific cDNA sequence by Nandonucleolytic cleavage with the corresponding restriction enzyme. , '

Das erfindungsgemässe Grundverfahren ist auf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus, einschliesslich dem Menschen,und deren Transfer in : einen Mikroorganismus als Wirt anwendbar. Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Viert.und zur mikrobiologischen Synthese solcher' ; Proteine. Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde dieThe basic method according to the invention is applicable to the isolation of any nucleotide sequence from a higher organism, including humans, and their transfer into: a host microorganism. The method proves useful for the transfer of a genetic code for a specific protein of medical or technical nature and for the microbiological synthesis of such '; Proteins. To illustrate the invention, the

Insulin codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert, in Bakterien transferiert und dort repliziert» Auf gleiche Weise wurde die für Ratten-Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz isoliert, transferiert und in Bakterien repliziert. Die Methode ist auf den Transfer einer aus menschlichem ZeIlmaterial isolierten Nucleotidsequenz, zum Beispiel für menschliches ·Insulin und Wachstumshormon oder andere Polypeptidhormone anwendbar. .Insulin-encoding nucleotide sequence isolated from rats, transferred to and replicated in bacteria. Similarly, the rat growth hormone-encoding nucleotide sequence was isolated, transferred and replicated in bacteria. The method is applicable to the transfer of a nucleotide sequence isolated from human cell material, for example for human insulin and growth hormone or other polypeptide hormones. ,

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.The present invention includes a method of isolating a DNA molecule having a specific nucleotide sequence and transferring it to a microorganism, whereby the original nucleotide sequence of the DNA is found after multiplication in the microorganism.

Die das erfindungsgemässe Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden;The steps constituting the method according to the invention can be divided into four general categories;

1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus1. The isolation of a desired cell population from a higher organism

Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert: die DNS des zugrunde liegenden Organismus selbst, und eine RNS-ÜberSetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die USA vorgeschrieben, dass menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschliessend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfä3.tig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders ausgestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vergleiche US-Federal Register, Bd. hl, Nr. 131, 7.7.I967, S, 27902-27943. Jedes Verfahren mit tatsächlicher Brauchbarkeit zur Herstellung von menschlichem Protein, wie zum Beispiel das vorliegendeThere are two sources of a genetic sequence that encodes a particular protein: the DNA of the underlying organism itself, and an RNA translation of the DNA. Under the current National Institutes of Health safety regulations, the US requires that human genes of any kind can be introduced into recombined DNA and subsequently into bacteria only after being cleaned with great care, or when used in specially equipped (P4 ) Facilities, see US Federal Register, Vol. Hl, No. 131, 7.7.I967, S, 27902-27943. Any process of actual utility for the production of human protein, such as the present one

Verfahren, arbeitet daher vorzugsweise mit der Isolierung der spezifischen mHNS, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codiert. Auf diese V/eise geniesst man den weiteren Vorteil, dass die rnRNS leichter als aus- Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil ziehen aus der Tat-.sache dass in hochdirferenzierten Organismen wie den Wirbeltieren, die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Punktion hauptsächlich injier Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungssträfe des Organismus vorliegen. In derartigen Zellpopulationen besitzt ein grosser Anteil der aus den Zellen isolierten mPiNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der Isolierung angewandte Verfahren können im Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein.Method, therefore, preferably works by isolating the specific mHNS having a nucleotide sequence encoding the desired protein. In this vein, one enjoys the further advantage that the rnRNA can be purified more easily than extracted DNA. In particular, one can also take advantage of the fact that in high-directivity organisms such as vertebrates, it is possible to identify a specific cell population of specific localization in the organism whose puncture consists mainly in the production of the protein in question. Such a population may also be present during a transient developmental challenge of the organism. In such cell populations, a large proportion of the mPiNS isolated from the cells has the desired nucleotide sequence. The choice of the population of cells to be isolated and the methods used in the isolation may be of crucial importance in terms of the basic purity of the mRNA.

Ih den meisten Geweben, Drüsen und Organen werden die Zellen von einem im allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten, das hauptsächlich aus Kollagen besteht, das jedoch je nachdem auch andere Strukturproteine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann. Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert zwangsläufig Verfahren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix. Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfasst daher zwei Hauptstufen: die. Absonderung der Zellen vom Bindegewebe, und die Abtrennung der gewünschten Zellen von allen anderen im Gewebe vorliegenden Zellarten. Die erfindungsgemäss vorgesehenen ,Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen aus verschiedenen Geweben anwendbar. So wird zum. Beispiel die Isolierung von Langerhans'sehen InselnFor most tissues, glands and organs, the cells are held together by a generally fibrous network of connective tissue consisting primarily of collagen but which, depending on its location, may also contain other structural proteins, polysaccharides and mineral deposits. The isolation of cells of a particular tissue inevitably requires methods of releasing the cells from the connective tissue matrix. The isolation and purification of a particular differentiated cell type therefore comprises two main stages: the. Secretion of the cells from the connective tissue, and the separation of the desired cells from all other cell types present in the tissue. The procedures provided according to the invention are applicable to the isolation of numerous cell types from different tissues. So becomes the. Example the isolation of Langerhans' islands

aus Bauchspeicheldrüsen, die zur Isolierung von Insulin codierender mRNS geeignet sind, beschrieben.from pancreatic glands suitable for isolating insulin-encoding mRNA.

JQisulin produzierende Zellen können auch aus anderen Quellen stammen, zum Beispiel aus der Bauchspeicheldrüse von Kälberföten und aus gezüchteten Insel-Tumorzellen. Die Isolierung reiner Inselzellen ist in diesen Fällen wesentlichfeinfacher, insbesondere bei Verwendung reiner Zellkulturen. In diesen Fällen ist das vorstehend beschriebene Verfahren zur Isolierung der Inselzellen nicht erforderlich, doch bleibt das genannte Verfahren wegen seiner allgemeinen Anwendbarkeit von Vorteil. ^: .Jisulin producing cells may also be derived from other sources, for example, the pancreas of calf fetuses and cultured islet tumor cells. The isolation of pure islet cells is much more simple in these cases, especially when using pure cell cultures. In these cases, the above-described method for isolating the islets is not required, but the said method remains advantageous because of its general applicability. ^: .

Häufig kann der Anteil an gewünschter mRNS erhöht werden, wenn .man die Zellreaktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt. So kann zum Beispiel die Behandlung, mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen. Weitere Verfahren sind das Züchten bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährmediums oder einer -sonstigen chemischen Substanz. Bei der Isolierung von Wachs tumshorrnon-mRNS von Ratten wird durch Behandlung gezüchteter Hypophysenzellen mit Thyroidhormon und Glucocorticoiden der Anteil an Wachstumshormon-niRNS auf synergistische Weise beträchtlich erhöht.Often, the level of desired mRNA can be increased if .man properly adjusts cellular responses to environmental stimuli. For example, treatment with a hormone can lead to increased production of the desired mRNA. Further methods are culturing at a certain temperature or in the presence of a specific nutrient medium or other chemical substance. In the isolation of rat growth hormone mRNA, treatment of cultured pituitary cells with thyroid hormone and glucocorticoids significantly increases the level of growth hormone niRNA in a synergistic manner.

2. '· Extraktion der mRNS · " ' 2. '· Extraction of the m RNA · "'

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung der RNase-Aktivität im Zellextrakt. Die zu extrahierende mRNS' ist ein einsträngiges Polynucleötid, ungepaart mit einem komplementären Strang. Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phosphodiesterbindung in der Sequenz würde daher da.s gesamte Molekül fürAn essential feature of the present invention is the virtually complete removal of RNase activity in the cell extract. The mRNA to be extracted is a single-stranded polynucleotide unpaired with a complementary strand. The hydrolytic cleavage of a single phosphodiester bond in the sequence would therefore be the whole molecule for

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den Zweck der Transferierung einer intakten genetischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen. Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbeeitet, aktiv und aussergewöhnlich stabil. Es findet sich auf der Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien. Die Schwierigkeiten sind besonders akut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für."Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist. Das Problem der Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, und das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar.. Die überraschendejwirksamkeit der Methode wird am Beispiel der erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten Inselzellen der Bauchspeicheldrüse beschrieben.make the purpose of transferring an intact genetic sequence into a microorganism unusable. As already mentioned, the enzyme RNase is widely diffused, active and exceptionally stable. It is found on the skin, survives the usual rinsing procedures for glassware and occasionally contaminates organic chemical storage. The difficulties are particularly acute when working with extracts of pancreatic cells, since the thyroid gland is a source of digestive enzymes and therefore rich in RNase, but the problem of contamination by RNase is present in all tissues, and the presently disclosed method of removing the RNase activity is applicable to all tissues. The surprising effectiveness of the method is exemplified by the successful isolation of intact mRNA from isolated islet cells of the pancreas.

Beim Aufreissen der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen, die zur Isolierung der von Protein praktisch freien 'RNS angewandt werden, setzt man erfindungsgemäss eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chaotropen Kation und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein. Die gemeinsame Wirkung dieser Mittel wird am Beispiel ihx^er Verwendung bei der Isolierung von praktisch unverletzter mRNS aus. isolierten Langerhans¹sehen Inseln aus Ratten-Pankreas beschrieben.In the rupture of the cells and in all processes which are used to isolate the protein which is virtually free of protein, according to the invention a combination of a chaotropic anion, a chaotropic cation and a disulphide bond-cleaving agent is employed. The common effect of these agents is exemplified by their use in isolating virtually uninjured mRNA. isolated Langerhans ¹ see islands of rat pancreas described.

Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wässrigen. Medien und ihrer Verfügbarkeit. Geeignete chaotrope Kationen sind zum Beispiel das Guanidiniun Carbamoylguanidinium-, Guanylguanidinium-, Lithiumion und dergleichen. Geeignete chaotrope Anionen sind zum Beispiel das Jodid, Perchlorate Thiocyanate Diiodsalicylation undThe choice of suitable chaotropic ions is based on their solubility in aqueous. Media and their availability. Suitable chaotropic cations are, for example, guanidine carbamoylguanidinium, guanylguanidinium, lithium ion and the like. Suitable chaotropic anions are, for example, the iodide, perchlorate thiocyanate diiodo-salicylation and

dergleichen. Die Wirksamkeit von Salzen, die durch Kombination derartiger Kationen und Anionen gebildet sind, hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab. So ist zum Beispiel ,Lithium-diiodsalicylat ein stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumthiocyanat, jedoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0,1 M, ausserdem ist es relativ teuer» Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt, im · Guanidiniumthiocyanat vor, da dieses Salz leicht zugänglich und .in wässrigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa ^- Lösungen. . . ' ' .like. The effectiveness of salts formed by combining such cations and anions depends, in part, on their solubility. For example, lithium diiodo-salicylate is a stronger denaturant than guanidinium thiocyanate, but it has a solubility of only about 0.1M, and is relatively expensive. The preferred combination of cation and anion is in the guanidinium thiocyanate as this salt readily accessible and readily soluble in aqueous media, up to about 1/4 solutions. , , ''.

Thiolverbindungen wie das ß-Merkaptoethanol spalten bekanntlich intramolekulare Disulfidbindungen in Proteinen mittels einer Thiol-Disulfid-Austauschreaktion. Zahlreiche Thiolverbindungen sind in -dieser Richtung wirksam, zum Beispiel ß-Merkaptoethanol, Dithiothreit, Cystein, Propanoldimerkapt?"ⁿund dergleichen. Eine wesentliche.Eigenschaft ist die Löslichkeit in Wasser, da die Thiolverbindung in grossem Überschuss über die intramolekularen Disulfide vorliegen muss, um die Austauschreaktion zu Ende zu führen. ß-Merkaptoethanol wird wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen Preises bevorzugt»Thiol compounds such as β-mercaptoethanol are known to cleave intramolecular disulfide bonds in proteins by means of a thiol-disulfide exchange reaction. Many thiol compounds are in -this towards effective as beta-mercaptoethanol, dithiothreitol, cysteine, Propanoldimerkapt ^"s and the like?. A wesentliche.Eigenschaft the solubility in water, since the thiol compound must be present in large excess over the intramolecular disulfide to ß-Merkaptoethanol is preferred because of its availability and favorable price »

Bei ^C&iibierung der RNase während der RiJS-Extraktion aus Zellen oder Gewebeji ist die Wirkung eines chaotropen Salzes direkt von seiner Konzentration abhängig. Die bevorzugte Konzentration ist daher die höchstmögliche Konzentration. Der Erfolg des erfindungsgemässen Verfahrens hinsichtlich der Konservierung intakter mRNS während der Extraktion beruht vermutlich auf der raschen Denaturierung der RNase und dem Ausmass der De-Upon inhibition of RNase during RiJS extraction from cells or tissues, the effect of a chaotropic salt is directly dependent on its concentration. The preferred concentration is therefore the highest possible concentration. The success of the process according to the invention with regard to the preservation of intact mRNA during the extraction is presumably based on the rapid denaturation of the RNase and the extent of the degradation.

he.it naturierung. Dies erklärt möglicherweise die. überlegen- aes Guanidiniumthioncyanats gegenüber dem. Hydrochlorid, trätz der Tatsache, dass das Hydrochlorid als' Denaturierungsmittel nur wenig schwächer ist. Die Wirksamkeit eines Denaturierungsmittels wird definiert als die Schwellenkonzentration, die zurhe.it naturierung. This may explain that. superior guanidinium thione cyanate over the. Hydrochloride, trätz the fact that the hydrochloride as denaturing agent is only slightly weaker. The effectiveness of a denaturant is defined as the threshold concentration used for

3,43.4

- 2Θ-- 2Θ-

vollständigen Denaturierung eines Proteins benötigt wird. Andererseits hängt die Geschwindigkeit der Denaturierung zahlreicher Proteine ab von der Konzentration des Denaturierungsmittels in Bezug auf die Schwellenkonzentration, erhöht von der fünften zur zehnten Potenz; vergleiche "Tanford, CA. Adv.Prot.Chem. £3^ 121 (1968). Diese Be-complete denaturation of a protein is needed. On the other hand, the rate of denaturation of many proteins depends on the concentration of the denaturant in relation to the threshold concentration increased from the fifth to the tenth power; see "Tanford, CA Adv. Prot. Chem. £ 3 ^ 121 (1968).

; Ziehung ergibt qualitativ, dass ein nur schwach stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidlniumhydrochlorid ein Protein bei gleicher Konzentration um ein' Vielfaches • schneller denaturieren kann. Die kinetischen Beziehungen zwischen RNase-Denaturierüng und mRNS-Konservierung während deren Extraktion aus den Zellen war zum Zeitpunkt der Er-. findung offenbar noch nicht erkannt. Die obigen Erwägungen führen dahin, dass das bevorzugte Denaturierungsmittel ein solches Wäre, das eine niedrige Schwellenkonzentration in Kombination mit hoher Wasserlöslichkeit besitzt. Aus diesem Grund wird Guanidiniumthiocyanat gegenüber Lithiumdiiodsalylat bevorzugt, obgleich letztere Verbindung ein stärkeres; The draw qualitatively shows that a denaturant which is only slightly stronger than guanidinium hydrochloride can denature a protein at the same concentration by a multiple • faster. The kinetic relationships between RNase denaturing and mRNA preservation during their extraction from the cells was at the time of genesis. apparently not yet recognized. The above considerations suggest that the preferred denaturant would be one having a low threshold concentration in combination with high water solubility. For this reason, guanidinium thiocyanate is preferred over lithium diiodo salate, although the latter compound is a stronger

. Denaturierungsmittel ist, da die Löslichkeit des Guanidiniumthiocyanats wesentlich höher ist und man es daher in einer Konzentration anwenden kann, die eine raschere RNase-Inaktivierung erlaubt. Obige Erwägungen erklären auch die Bevorzugun von Guanidiniumthiocyanat vor dem vergleichsweise löslichen Hydrochlorid, da ersteres ein etwas stärkeres Denaturierungsmittel ist; ,, Denaturant is because the solubility of guanidinium thiocyanate is much higher and therefore it can be used in a concentration that allows for faster RNase inactivation. The above considerations also explain the preference of guanidinium thiocyanate over the comparatively soluble hydrochloride, as the former is a slightly stronger denaturant; .

. Die Verwendung eines Disulfidbindungen spaltenden Mittels in Kombination mit einem Denaturierungsmittel verstärkt und erhöht die Wirkung des letzteren, indem auf diese V/eise das RNase-Molekül vollständig entfaltet wird. Die Thiolverbindung beschleunigt den Fortgang des Denaturierungsprozesses, indem sie eine schnelle Renaturierung verhinderte die eintreten kann, falls die intramolekularen Disulfidblndungen intakt bleiben., Ferner wird jede, im mRNS-Präparat zurück-, The use of a disulfide bond-cleaving agent in combination with a denaturing agent enhances and enhances the effect of the latter by fully unfolding the RNase molecule. The thiol compound accelerates the progress of the denaturation process by preventing rapid renaturation which may occur if the intramolecular disulphide bonds remain intact. Further, any residue in the mRNA preparation is deleted.

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bleibende und dieses verunreinigende RNase praktisch inaktiv, auch in Abwesenheit von Denaturierungsmittel und Thiol. Disulfidbindungen spaltende Mittel mit Thiolgruppen sind bei jeder Konzentration in gewissem Ausmass wirksam, doch wird im allgemeinen ein grosser Überschuss an Tniolgruppen gegenüber den intramolekularen Disulfidbindungen teevorzugt, damit die Gleichgewichtsreaktion in Richtung der Disulfidspaltung abläuft. Andererseits sind zahlreiche Thiolverbindungen übelriechend und unangenehm bei ,hohen Konzentrationen zu verarbeiten, so dass für die Praxis eine . obere K'onzentrationsgrenze entsteht. Beim ß-Merkaptoethanol erwiesen sich Konzentration im Bereich von 0,05 M bis 1,0 M als wirksam, und Konzentrationen von 0,2 M werden bei der Isolierung von nicht abgebauter RNS aus Rattenpankreas als optimal betrachtet« ' .remaining and this contaminating RNase practically inactive, even in the absence of denaturant and thiol. Thiol group disulfide bond-cleaving agents are somewhat effective at any concentration, but generally, a large excess of Tniol groups over the intramolecular disulfide bonds is preferred for the equilibrium reaction to proceed in the direction of disulfide cleavage. On the other hand, many thiol compounds are foul-smelling and unpleasant to process at high concentrations, so that in practice a. upper K'onzentrationsgrenze arises. In the case of β-mercaptoethanol, concentrations ranging from 0.05 M to 1.0 M were found to be effective, and concentrations of 0.2 M were considered optimal in isolating undeveloped rat pancreatic RNA.

Der pH-Wert des Mediums während der mRNS-Exträktion aus den .Zellen kann im Bereich von pH 5,0 bis 8,0 liegen« 'The pH of the medium during mRNA extraction from the cells may range from pH 5.0 to 8.0.

Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die RNS aus der Masse aus Zellprotein und DNS abgesondert. Zu diesem Zweck sind mehrere Verfahren bekannt, die sämtlich geeignet sind. Eine übliche Praxis ist ein Ausfällverfahren mit Ethanol, bei dem die RI-JS selektiv ausfällt. Bevorzugt wird erfindungsgemäss die·Ausfällstufe umgangen und das HomogenaC direkt auf eine 5*7-molare Cäsiumchloridlösung, die sich in einem Zentrifugenröhrchen befindet, aufgeschichtet, worauf Zentrifugierung erfolgt; vergleiche die Beschreibung von Glisin, V., Crkvenjakov, R., und Byus, C, Biochemistry I^ 26^ (197²O. · Diese Methode wird bevorzugt, da sie stetig eine für Rl¹JaSe ungünstige Umgebung aufrecht erhält, so dass man die RNS in hoher Ausbeute und frei von DNS und Protein gewinnt. 'After rupture of the cells, the RNA is secreted from the cell protein and DNA mass. For this purpose, several methods are known, which are all suitable. A common practice is an ethanol precipitation process in which the RI-JS selectively precipitates. Preferably, according to the invention, the precipitation step is bypassed and the HomogenaC is piled directly onto a 5 * 7 molar cesium chloride solution, which is located in a centrifuge tube, followed by centrifugation; compare the description of Glisin, V., Crkvenjakov, R., and Byus, C, Biochemistry I ^ 26 ^ (197 ² O.). This method is preferred because it steadily maintains an environment unfavorable to Rl ¹ JaSe, so that the RNA is recovered in high yield and free from DNA and protein. '

Die obigen Verfahren führen zur Reinigung der gesamten RNS aus dem Zellhomogenisat. Nur ein Teil .dieser RNS ist jedoch die erwünschte mRNS. Um diese mRNS weiter zu reinigen, benutzt man die Tatsache, dass in den Zellen höherer Organismen mRNS nach der Transcription in der Zelle weiterverarbeitet wird unter Bindung mit Polyadenylsäure. Derartige mRNS mit daran gebundenen Poly-A-Sequenzen kann selektiv isoliert werden durch Chromatographieren an Säulen mit Cellulose, an die Oligo-thymidylat gebunden ist, siehe Aviv,. H. und Leder, P. loccit. Die vorstehenden Verfahren liefern im wesentlichen reine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind. Die Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS, unabhängig ihres Herkunftsorganismus, in praktisch gleicher V/eise ausgeführt werden. 'The above procedures result in purification of all RNA from the cell homogenate. However, only part of this RNA is the desired mRNA. To further purify these mRNAs, one uses the fact that in the cells of higher organisms, mRNA is further processed after transcription in the cell to bind with polyadenylic acid. Such mRNA with attached poly-A sequences can be selectively isolated by chromatography on columns of cellulose to which oligo-thymidylate is attached, see Aviv. H. and Leder, P. loccit. The above methods yield essentially pure, intact mRNAs from starting materials rich in RNase. Purification of the mRNA and subsequent in vitro steps can be performed with virtually any mRNA, regardless of its source organism. '

Unter bestimmten Bedingungen, zum Beispiel bei der Ver- . Wendung von Zellen aus Gewebekulturen als Quelle der mRNS, kann die Verunreinigung mit RNase so niedrig sein, dass obige Stufe der RNase-= Inhibierung nicht erforderlich ist« In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung-der RNase-Aktivität ausreichen.Under certain conditions, for example in the United States. Using cells from tissue culture as a source of mRNA, the contamination with RNase may be so low that the above stage of RNase inhibition is not required. In these cases, the prior art methods may be sufficient to reduce RNase activity.

2. ' Bildung der cDNS2. ' Formation of the cDNA

Figur 1 ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufer des Verfahrens. Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS komplementär ist. Als Enzym wählt man für diese Reaktion Reverse Transcriptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werdenjkönnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Strangs aufgrund der als Matrize verwendeten mRNS fähig ist«, Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen ausgeführt werden, wobei' man dieFigure 1 is a schematic representation of the remainder of the process. The first step is the formation of a DNA sequence that is complementary to the purified mRNA. As an enzyme, reverse transcriptase is chosen for this reaction, although in principle any enzyme could be used which is capable of forming a complementary DNA strand by virtue of the mRNA used as a template. The reaction can be carried out under the known conditions using

mRNS als Matrize und ein Gemisch der vier Deoxynucleosidtriphosphate als Vorläufer des DNS-Strangs einsetzt. Zweckraässig wird eines der Deoxynucleosid-triphosphate in ^- Stellung mit ;52_p markiert, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, zum geispiel durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu können; vergleiche Efstratiadis, A. -et..al.., loccit. Wie aus der Zeichnung 'ersichtlich., erhält man als Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptase eine doppe1strängige Haarnadelform mit nicht-coval'enter Bindung zwischen dem RNS-Strang und dem DHS-Strang....,·.mRNA as a template and a mixture of the four deoxynucleoside triphosphates as precursors of the DNA strand. For convenience, one of the deoxynucleoside triphosphates is labeled with ^ _p to monitor the course of the reaction and to control the work-up and separation, for example by chromatography and electrophoresis, and to give quantitative yield data; compare Efstratiadis, A. -et..al .., loccit. As can be seen from the drawing, the product of the reaction with the reverse transcriptase is a double-stranded hairpin with non-covalent binding between the RNA strand and the DHS strand.

Das Produkt der Reaktion mit der Reversen Transcriptase wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. Z'weckmässig verwendet man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephadex G-LOO" (Hersteller Pharmacia Inc. Uppsala, Schweden) und Ausfällung mit Ethanol. -The product of the reaction with the reverse transcriptase is recovered from the reaction mixture by standard methods. Z'weckmässig using a combination of phenol extraction, chromatography on "Sephadex G-LOO" (manufacturer Pharmacia Inc. Uppsala, Sweden) and precipitation with ethanol. -

Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die ENS-Matrize entfernt werden. Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt« Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch pH-Einstellung leicht gesteuert werden kann. 'Once the cDNA is enzymatically synthesized, the ENS template can be removed. Numerous methods for selectively degrading RNA in the presence of DNA are known. "The preferred method is alkaline hydrolysis, which is highly selective and easily controlled by pH adjustment. '

Nach der alkalischen Hydrolyse und anschliessenden Neutralisierung kann die mit ;32 markierte cDNS durch Ausfällung mit Ethanol konzentriert werden, falls dies erwünscht ist.After alkaline hydrolysis and subsequent neutralization, the cDNA labeled with 32 can be concentrated by precipitation with ethanol, if desired.

Die Synthese einer doppeIsträngigen haarnadelförniigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms, zum Beispiel mit DNS-Polymerase oder Reverser Transcriptase.The synthesis of a double-stranded hairpin-shaped cDNA is carried out using the corresponding enzyme, for example with DNA polymerase or reverse transcriptase.

Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschliesslich der Verwendung eines in^{ -Stellung mit 52p markierten Nucleosid-tripbosphats. Die Reverse Transcriptase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, zum Beispiel aus Vogel-Myeloblastosisvirus(das Virus ist erhältlich von der Life.Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es geraäss einem Vertrag mit den National Institutes of Health produziert).The reaction conditions are similar to those described above, including the use of a 52p-labeled nucleoside triphosphate. Reverse Transcriptase is available from a variety of sources including, for example, avian myeloblastosis virus (the virus is available from Life.Sciences Incorporated, St. Petersburg, Fla., Which is in the process of contracting with the National Institutes of Health).

Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert sein, die DNS aus dem Reaktionsgemisch rein zu gewinnen. Auch hier kann man zweckmässig Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephatex G-IOO" und Ausfällung mit Ethanol zur Reinigung des DNS-Produkts und Befreiung von Verunreinigendem Protein verwenden.After the formation of the cDNA hairpin, it may be advisable to recover the DNA from the reaction mixture purely. Again, it is convenient to use phenol extraction, chromatography on "Sephatex G-100", and precipitation with ethanol to purify the DNA product and remove contaminating protein.

Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppeIsträngige DNS überführt werden, indem man die einsträngige Schleife, die die' Enden komplementärer Stränge verbindet₉ entfernt. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfügung, die eine spezifische Hydrolytische Spaltung einsträngiger DNS-Bereiche bewirken. Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die S 1-Nuclease aus Aspergillus oryzae (das Enzym kann von der Miles Research Products, Elkhart, Indiana, bezogen werden). Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Sl-Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülen mit Basengepaarten Enden. Extraktion, Chromatographieren und Ausfällung mit Ethanol erfolgen wie vorstehend beschrieben. Die Verwendung von Re\rerser Transcriptase und .' Sl-Nuclease bei Synthesebdoppelsträngiger cDNS-Ubertragungen von mRNS wurde von Efstratiadis., et.al., loc.cit. beschrieben*The hairpin structure may be converted in a usual double-stranded DNA by the single-stranded loop that connect the 'ends of complementary strands t _{9 is} removed. For this purpose, various enzymes are available that cause specific hydrolytic cleavage of single-stranded DNA regions. An enzyme suitable for this purpose is the Aspergillus oryzae S 1 nuclease (the enzyme can be obtained from Miles Research Products, Elkhart, Indiana). Treatment of the hairpin DNA with Sl nuclease results in high yields of cDNA molecules with base-paired ends. Extraction, chromatography and precipitation with ethanol are carried out as described above. The use of Reerser Transcriptase and. ' Sl nuclease in the synthesis of double-stranded cDNA transmissions from mRNA was reported by Efstratiadis., Et al., Loc. Cit. described *

Gegebenenfalls kann man den Anteil an"cDNS-Molekülen mit stupfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coli-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate« Die Kombination von Exonuclease- und Iblymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender J)'-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervor-" stehender 5'-Enden. Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüpfungsreaktionen sichergestellt. . · ·.Optionally, the proportion of "blunt-ended cDNA molecules can be increased by treatment with E. coli DNA polymerase I in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates." The combination of exonuclease and iblymerase activity of the enzyme results in the removal of all prominent ones J) 'ends and to fill in all prominent' 5 'ends. In this way, the participation of the majority of cDNA molecules in the following linkage reactions is ensured. , · ·.

Die nächste Verfahrens stufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produkts derart, dass geeignete Sequenzen . an Jedem Ende stehen^ die eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-endonuciease aufweisen. Die V/ahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmässigkeitsgrünele in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz wird entsprechend der gewählten Restriktions-endonuciease ausgewählt, und diese V/ahl basiert wiederum auf der Wahl des DNS-Vektors, mit dem die öDNS zur rekombinieren'ist« Das gewählte Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-endonuciease anspricht. Das Plasmid pMB9 besitzt zum Beispiel eine Erkennungssteile für das Enzym Hind III. Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, K.O. und Wilcox, K.V/., J.MoleBiol.51^ 579 (1970) gereinigt. Das Enzym Hae III aus Hemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middle ton, J.H., Edgell, MoH. und Hutchinson III> CA. .J, Virol·. 10^ h2 (1972) gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird* katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet«The next step is to treat the ends of the cDNA product such that appropriate sequences. at each end are located a recognition site for a restriction endonuclease. The number of DNA fragments to be added to the ends is governed by convenience greens. The sequence to be added to the ends is selected according to the restriction endonuclease chosen, and this selection is again based on the choice of the DNA vector with which the ORD is to be recombined. The plasmid selected should have at least one site is responsive to cleavage by restriction endonuclease. The plasmid pMB9 has, for example, a recognition part for the enzyme Hind III. Hind III is isolated from Hemophilus influenza and purified according to the method of Smith, KO and Wilcox, KV /., J. Mol. Biol. 51, 579 (1970). The enzyme Hae III from Hemophilus aegyptious is obtained by the method of Middle ton, JH, Edgell, MoH. and Hutchinson III> CA. .J, Virol ·. 10 ^ h2 (1972). An enzyme from Hemophilus suis, designated Hsu I *, catalyzes hydrolysis at the same recognition sites as Hind III. These two enzymes are therefore considered to be functionally interchangeable. "

Zweckmässig verwendet man ein chemisch synthetisiertes -> doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppelsti'angs. Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in Figur 1 dargestellte Senquenz, vergleicheHeyneker, H.L., et al. und Scheller, R.H., et al«, loc,eit. Verschiedene solcher synthetischen Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfugung, so dass man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, dass sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endonucleasen ansprechen. ' ·· · .'· . .Conveniently, a chemically synthesized -> double-stranded decanucleotide is used with the recognition sequence for Hind III to bind to the ends of the cDNA double. The double-stranded decanucleotide has the sequence shown in Figure 1, see Heyneker, H.L., et al. and Scheller, R.H., et al., loc. Several such synthetic recognition site sequences are available today so that the ends of the double DNA can be prepared to respond to the action of one of the numerous restriction endonucleases. '·· ·.' ·. ,

Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDWS kann auf bekanntem Weg erfolgen. Das Verfahren der · Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet* A.,et al,, Biochemistry 12 , 5045 (1973) gereinigt worden V7ar. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc.cit. beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung einer . cDKS rait stumpfen Enden mit einem grossen molaren Überschuss eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuclease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind I] Erkennungssequenz an jedem Ende. Die Behandlung des Reaktionsprodukte mit Hind III-Endonuclease führt zur Spalung an der Erkemrongsstelle und Bildung einsträngiger selbst-komplementärer 5'-Enden, siehe Figur 1. .The binding of the recognition site sequence to the ends of the cDWS can be done in a known way. The method of choice is a reaction called "blunt-end linkage" which is catalyzed by a DNA ligase purified by the method of Panet * A., et al., Biochemistry 12 , 5045 (1973) , The blunt-end junction reaction was reported by Sgaramella, V., et al., Loc. Cit. described. The product of linking a. cDKS, blunt ends with a large molar excess of a double-stranded decanucleotide having a Hind III endonuclease recognition site is a cDNA with this Hind I recognition sequence at each end. Treatment of the Hind III endonuclease reaction product results in cleavage at the Erkemrong site and formation of single-stranded self-complementary 5 'ends, see Figure 1.

.4· Bildung eines rekombinierten DNS-Transfer-Vektors.4 · Formation of a recombined DNA transfer vector

Im Prinzip können eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS, ζην Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene.In principle, a variety of viral and plasmid DNA, ζην recombinant with the above-described.

/hergestellten Weise' cDNS verwendet werden. Die. Grundvoraussetzungen be-/ manufactured way 'cDNA can be used. The. Basic requirements

• stehen darin, dass der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muss, seine Replikation in der Wirtszelle erfolgt und dass er ausserdem eine genetische Bestimmungsgrösse besitzt, die es ermöglicht, diejenigen• means that the DNA transfer vector must be able to enter a host cell, replicate in the host cell, and have a genetic determinant that allows it

" Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der Öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health. Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Kommittee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäss 1st selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, ein-For public safety reasons, the scope of selection should be limited to those transfer vector species that are appropriate for the particular experiment, according to the National Institutes of Health guidelines mentioned above Transfer vectors are constantly being extended as new vectors have been developed and recognized by the corresponding National Institutes of Health Committee, and of course, according to the invention, the use of any viral and plasmid DNA having the described capabilities, including

<> schliesslich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht.<> Finally, those whose approval is still pending.

Geeignete Transfer-Vektoren, deren Verwendung heute genehmigt ist, sind verschiedene Derivate von BakteriophagenX(vgl. zum Beispiel Blattner, F.R./ Williams, B.G., Blechl, A.E.. Denniston-Thompson, K., Faber, H.E., Furlong, L.Α., Grunwald, D.J., Kiefer, D.O., Moore, D.D., Schumm, J₀V/., Sheldon, E.L. und Smithies, 0., Science 196, l6l (1977))und Derivate des Plasmids col El (Vgl. zum Beispiel Rodriguez, R.L., Bolivar, · S., Goodman, H.M., Boyer, H.V/. und Betlach. M.N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms In The Control of Gene Expression, D, P. Nierlich, V/. J., Rutter, CF., Fox. Eds. (Academic Press, NY, 1976) S. 471-477). Plasmide aus col El sind relativ klein, sie besitzen Molekulargewichte in der Grössenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, dass die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der Suitable transfer vectors, the use of which is approved today, are various derivatives of bacteriophage X (see, for example, Blattner, FR / Williams, BG, Blechl, AE, Denniston-Thompson, K., Faber, HE, Furlong, L.). Grunwald, DJ, pine, DO, Moore, DD, Schumm, J ₀ V /., Sheldon, EL and Smithies, 0., Science 196, L6L (1977)) and derivatives of the plasmid col El (See. eg Rodriguez , RL, Bolivar, S., Goodman, HM, Boyer, HV / and Betlach, MN, ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms In The Control of Gene Expression, D, P. Nierlich, V / J, Rutter , CF., Fox, Eds. (Academic Press, NY, 1976) pp. 471-477). Collo El plasmids are relatively small, have molecular weights on the order of millions of millions and have the property that the number of copies of plasmid DNA per host cell can be increased from 20 to 40 under normal conditions to 1000 or more when using the host cell treated with chloramphenicol. The ability to increase the amount of genes in the

Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators., die V/irtszelle zu veranlassen, dass sie' hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col El sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäss der Erfindung. Zu den geeigneten Derivaten von gol Elgehören die Plasmide pMB-9* die das Gen für Tetracyclin· resistenz tragen, und pBR-313, pBR-^15, pBR-Jlö, pBR-317 und pBR-j522, die ausser dem Tetracyclin-Resistenzgen ein Gen für Amp .icillinresistenz besitzen. Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genai stellt eine zweckmässige Möglichkeit zur.Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vorn Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart-der'Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col El Verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittelresistenz-Gen, eine Hlnd III-Erkennungsstelle besass.Under certain circumstances, under the control of the experimenter, the host cell allows the host cell to produce predominantly proteins encoded by the genes on the plasmid. Such derivatives of col El are therefore preferred transfer vectors according to the invention. Suitable derivatives of gol El include the plasmids pMB-9 * carrying the gene for tetracycline resistance, and pBR-313, pBR-15, pBR-J10, pBR-317 and pBR-j522, which are other than the tetracycline resistance gene possess a gene for ampicillin resistance. The presence of drug resistance gene is a convenient way to select the cells that have been successfully infested by the plasmid, as colonies of these cells grow in the presence of drugs, whereas cells without the plasmid do not grow or form colonies. In the examples of this specification, a plasmid of col E1 was always used having, in addition to the drug resistance gene, a Hnd III recognition site.

Wie beim Plasmid, kann auch die 'Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng •begrenzt wurde. Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X-1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind; vergleiche Curtiss, III, R., Ann.Rev.Microbiol., >0^ 507 (1976). E. coli RR-I kann verwendet werden, wenn PJ-Einrichtungen vorhanden sind. Wie im Fall der Plasmide, sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung des gewählten Vektors dienen können, ein-schliesslich Protisten und anderer Bakterien, zum Beispiel Hefen,As in the case of the plasmid, the choice of the suitable host can be made from a very broad spectrum, but the field has been narrowly restricted for reasons of public safety. An E. coli strain named X-1776 has been developed and approved by the National Institutes of Health for procedures of the type described, with P2 facilities prescribed; See Curtiss, III, R., Ann. Rev. Microbiol.,> 0 ^ 507 (1976). E. coli RR-I can be used if PJ devices are present. As in the case of the plasmids, the invention of course provides for the use of strains of any host cells which may serve to accommodate the chosen vector, including protists and other bacteria, for example yeasts,

Rekombinierte Plasmide werden erhalten, indem man mit Restriktions-Endonuclease behandelte Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, dass cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird · die Plasmid-DNS in molarem Überschuss über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher dazu geführt, dass die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkulieren. Die anschliessend transformierten Zellen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukorabinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäss Stand.der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endenuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, dass die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt. . .Recombinant plasmids are obtained by mixing restriction endonuclease treated plasmid DNA with cDNA, both containing analogously treated end groups. In order to minimize the possibility that cDNA segments undergo combinations with each other, the plasmid DNA is used in molar excess via the cDNA. This procedure has hitherto led to the bulk of the plasmids circulating without an inserted cDNA fragment. The subsequently transformed cells then contain mainly plasmid and no neukorabinierten with cDNA plasmids. The result is a very lengthy and time-consuming selection process. According to the prior art, this problem has been solved by attempting to prepare DNA vectors with a restriction enduclease recognition site in the middle of a suitable labeling gene such that the insertion of the cDNA shares the gene, thereby losing the gene encoded function entry. , ,

Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewandt. Hierbei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-Endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5^:-feerminalen Phosphatgruppen von den mit der Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis 10 herab. , .Preferably, a method of decreasing colony counts to be examined for recombined plasmids is used. Here, plasmid DNA cut with the restriction endonuclease is treated with alkaline phosphatase (commercial enzyme). By treating with alkaline phosphatase, the 5 ^: terminal phosphate groups are removed from the endonuclease-generated ends of the plasmid, and self-assembly of the plasmid DNA is prevented. The ring formation and transformation thus depend on the insertion of a DNA fragment having 5'-phosphorylated ends. This method reduces the relative frequency of transformations without recombination to less than 1 to 10. ,.

on - 3Ö on - 3Ö

Das eirfindungsgemässe Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die durch DNS-Ligase katalysierte·Reaktion.stattfindet· zwischen einer 5^f-Phosphat-DNS-Endgruppe und einer 5'-Hydroxyl-DNS-Endgruppe. Wird die terminale .5'-Phosphatgruppe entfernt, so tritt keine Bindungsreaktion ein. ' Ist aoppelsträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt:The method according to the invention is based on the fact that the DNA ligase-catalyzed reaction takes place between a 5 ^f -phosphate DNA end group and a 5'-hydroxyl-DNA end group. When the terminal .5 'phosphate group is removed, no binding reaction occurs. If double-stranded DNA is to be linked, two situations are possible, as shown in Table 1:

·..;.".· Tabelle 1 .·..;.".· Table 1 .

Fallcase

Reaktionsteilnehmerreactants

IIIIII

-OK" H 0 PO--OK "H 0 PO-

-OPO₃H₂ ^{+ ί 3}HO--OPO ₃ H ₂ ^{+ ί 3} HO-

-OH -OH-OH OH

OK OK

-OH-OH

5^f 5 ^f

H₂O ?-H ₂ O? -

-⁵OH- ⁵ OH

HOHO-HOHO-

Ligase-ProduktLigase product

3' 5*3 '5 *

0-P-O-0-P-O-

O-P-QO-P-Q

-0-P-O- -OH HO--0-P-O- OH HO-

4-24-2

+H+ H

keine Reaktionno reaction

In Tabelle 1 wird'die doppelsträngige DNS schernatisch durch zv/ei parallele Linien xviedergegeben, v/obei die 5'~ und 5' ~ Endgruppen je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen. Im Fall I liegen 5'-Phosphatgruppen an beiden beaktionsfähigen Endgruppen vor., mit dem Ergebnis, dass beide Stränge covalent gebunden werden^ Im Fall II' besitzt n'ur einer der zu verbindenden Stränge eine terniinale 5' -Phosphat-.· gruppe mit dem Ergebnis, dass eine, einsträngige covalenteIn Table 1, the double-stranded DNA is schematically reported by z / parallel lines x, respectively, with the 5 'and 5' end groups having hydroxyl or phosphate groups, as appropriate. In case I, 5'-phosphate groups are present on both of the bearable end groups, with the result that both strands are covalently bound. In case II ', only one of the strands to be joined has a terninal 5'-phosphate group the result being one, single-stranded covalent

Bindung erfolgt, während im anderen Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nicht-co\eLent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbunden. Im Fall III besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5^r~ Phosphatgruppe, so dass keine Bindungsreaktion eintreten kann. · ; . .Bonding occurs while in the other strand there is a discontinuity. The non-co-ligated strand remains bound to the molecule in a known manner due to hydrogen bonding between complementary base pairs on the opposite strands. In case III, none of the ends of the reactants has a 5 ^r ~ phosphate group, so that no binding reaction can occur. ·; , ,

Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung der 5'-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5^f-Phosphatgruppen anwenden, die die DNS- nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse. ... ·Unwanted binding reactions can therefore be prevented by treating respective ends of the reactants whose compound is to be prevented, with removal of the 5'-phosphate groups. Any method of removing 5 ^F phosphate groups that does not otherwise damage the DNA can be used. Preferred is the hydrolysis catalyzed by the enzyme alkaline phosphatase. ... ·

Das vorstehend beschriebene ,Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstitu-* ieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonstituiert werden. Das Enzym DNS- ' ' Ligase, das die End-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. und Khorana, H.G.., Proc. Natl.,Sci USA 6J^ 1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coIi erhaltene Ligase verwenden, vergleiche Modrich, P. und Lehman, I.R., J.Biol.Chem. 245, 3626 (1970).The method described above is useful even if a linear DNA molecule is to be cleaved into two subfragments, typically with a restriction endonuclease, and then reconstituted in the original sequence. The subfragments may be separately purified and the desired sequence reconstituted by reconnecting the subfragments. The enzyme DNA "'ligase, which catalyzes the end-to-end linkage of DNA fragments, can be used for this purpose, see Sgaramella, V., Van de Sande, JH and Khorana, HG., Proc. Natl., Sci USA 6J ^ 1468 (1970). If the sequences to be joined are not blunt, one can use the ligase obtained from E. coli, compare Modrich, P. and Lehman, IR, J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).

Die Rekonstituierung der Originalsequenz aus durch Restriktions-Endonuclease erhaltenen Unterfrägmente wird stark verbessert, wenn man eine Methode anwendet, die die Rekonstitution in falscher Sequenz verhütet. Dies geschieht durch Behandlung des cDNS-Fragments homogener Länge der gewünschten Sequenz mit einem Mittel, das die 5¹-terminalen Piiosphatgruppen der e'DNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die f>*-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS~Ligase, die zur Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5'-terminale Phosphatgruppe können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eijge 5'-Phosphatgruppe besitzen.Reconstitution of the original sequence from restriction endonuclease-derived subfragments is greatly improved using a method that prevents reconstitution in the wrong sequence. This is done by treating the cDNA fragment homogeneous length of the desired sequence with an agent that the 5 -terminal ¹ Piiosphatgruppen the e'DNS removed prior to cleavage of the homogeneous cDNA with a restriction endonuclease. It is again preferred to use alkaline phosphatase. The f> * - terminal phosphate groups are a structural precondition for the subsequent binding effect of DNA ligase, which is used to reconstitute the cleaved subfragments. Therefore, ends without a 5'-terminal phosphate group can not be covalently bound. The DNA subfragments can only be attached at those ends that have eijge 5'-phosphate group.

Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsreaktion, nämlich die Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, das heisst hinten~an-vorn, statt vorn-an-hinten. Andere mögliche Nebenreaktionen wie Dimerisierung und Cyclisierung v/erden nicht verhindert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäss Tabelle 1 erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalis abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.=This method avoids the most important undesired binding reaction, namely the joining of two fragments with reverse sequence, ie, back-to-front rather than front-to-back. Other possible side reactions, such as dimerization and cyclization, are not prevented because they occur in a Type II reaction according to Table 1. These side reactions are less detrimental as they lead to physically separable and identifiable products, which is not the case for the recombination in the wrong direction

Zur ,Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde Ratteninsulin codierende cDNS isoliert und mit einem Pl<asmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur Transformation von E. coli X-1776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zellen •gewonnene Meukombinierte Plasmid-DNS enthielt ein inseriertesTo illustrate the method described above, rat insulin-encoding cDNA was isolated and recombined with a plasmid. The DNA molecules were used to transform E. coli X-1776. The selection of the cells to be transformed was carried out by growth on a tetracycline-containing medium. Meukombinierte plasmid DNA obtained from transformed cells contained an inserted one

DNS~Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukombinationen, die auf gleiche Weise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurderr mit Hind III- oder HSU I-Endonuclease aus dem Plasmid freigesetzt und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode.von Maxam, A.M. und Gilbert, W., Proc. Natl.Acad.Sci USA, Jk^ 56O (1977) ermittelt. Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte .Codierungsreaktion für Ratten-Proinsulin I und 1> von 2J> Aminosäuren der Prepeptid-Sequenz. Eine Zusammenstellung der Nucleotidsequenz dieser Region wird nachstehend dargestellt.DNA ~ fragment of about 410 nucleotides in length. Other recombinations isolated in the same way were also analyzed. The inserted fragments were released from the plasmid with Hind III or HSU I endonuclease and the DNA sequence was determined by the method of Maxam, AM and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci USA, Jk ^ 56O (1977). The nucleotide sequences of the inserted DNA fragments were overlapped and contained the entire coding reaction for rat proinsulin I and 1> of 2J> amino acids of the pre-peptide sequence. A summary of the nucleotide sequence of this region is shown below.

.Auf ähnliche VJeise wurde Wachstumshormon von Ratten codierende cDNS isoliert, mit einem Plasmid rekombiniert und in E. coli transferiert. Nach ausgiebiger Replikation in E. coli wurde eine Nucleotidsequenz von etwa 800 Nucleotiden Länge isoliert, die die gesamte codierende Sequenz für Ratten-Wachstumshormon und Teile des Vorlauferpeptids und .einen Teil der 5-V-untranslatierten Region enthielten.In similar fashion, growth hormone encoding rat cDNA was isolated, recombined with a plasmid and transferred to E. coli. After extensive replication in E. coli, a nucleotide sequence of about 800 nucleotides in length was isolated which contained the entire coding sequence for rat growth hormone and portions of the precursor peptide and part of the 5-V untranslated region.

Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschliesslich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte, oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben,die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten. Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Ratten-Insulingen in E. coil. In den Beispielen werden ferner rekombinierte Plasmide . charakterisiert, die Teile von Ra-tten-Insulingen, Ratten-Wachtumshorrnongen, menschlichem Insulingen und' menschlichemThe described method is generally applicable to the isolation and purification of a gene from a higher organism, including human genes, its transfer into a microorganism and replication in the microorganism. New recombinant plasmids containing all or part of the isolated gene are also described. Furthermore, hitherto unknown new microorganisms are described which contain a gene of a higher organism as part of their genetic make-up. The following examples describe in more detail the method of use for the isolation, purification and transfer of rat insulin gene in E. coil. In the examples, further recombinant plasmids. characterizes the parts of rat insulins, rat guillotine shells, human insulin gene and human

^ or· ^ or ·

2 03 5 81S -34- ' ' -17.1.19792 03 5 81S -34- '' -17.1.1979

53 547/1253 547/12

Wachstumshormongen enthalten, sowie die die genannten Gene enthaltenden neuen Mikroorganismen» .Contain growth hormone gene, as well as the said genes containing new microorganisms ».

Aiisf'ührungshelgpieleAiisf'ührungshelgpiele

Zur Herstellung von gereinigten Ratten-Inseli-ellen wird die Bauchspeicheldrüse einer anästhetisierten Ratte mit Hank*scher Salzlösung infundiert durch rückläufige Infusion in den Pankreasgango Die Hank'sehe Salzlösung ist eine bekannte und handelsübliche Standardlösung« Dann wird die Bauchspeicheldrüse entfernt, in Hank'scher Lösung von O C zerkleinert und mit Kollagenase und Trypsin-Inhibitor verdaut« Sämtliche Verfahren erfolgen bei 0 bis 4 ⁰C, falls nichts anderes angegeben» Die Bedingungen bei der Verdauung sind äußerst kritisch» Zwei zerkleinerte Bauchspeicheldrüsen in 8 ml Gesamtvolumen Hank'scher Lösung werden in ein 30 ml-Glasrohr gefüllt. Alle Glasteile waren mit Silikon (Handelsbezeichnung Siliclad, Hersteller Clay-Adams Division, Beeton-Dickinson Inc., .Parsippany, New Jersey) behandelt wordene Das Inkubationsgemisch enthielt 12 mg Kollagenase, ein aus Clostridium histolyticum erhaltenes Enzym (hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Mandl, I«, Mackeman, JeD* und Howes, -E.L··, J.Clin-Invest· 32_S 1323 (1943) - Typ CLS IV, Hersteller Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey) und 1 mg Sojabohnen, trypsin-Inhibitor, Hersteller Sigma Chemical Company, St» Louis, Missouri* Die Inkubation erfolgte bei 37°C während 25 Min« unter Schütteln mit 90 Bewegungen pro Minute« Ständige* Beobachtung war erforderlich, um. sicherzustellen, daß die Kollagenase-Verdauung in optimalem-Ausmaß verliefe Bei zu kurzer Inkubation waren die Inselzellen unvollständig freigesetzt, bei zu langer Inkubation beginnt ihre Zersetzung» lach der Inkubation wurde das Glasrohr 1 Min* bei 200 χ G zentrifugiert« Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiertFor the preparation of purified rat islets, the pancreas of an anesthetized rat is infused with Hanker's saline solution by retrograde infusion into the pancreatic duct. Hank's saline is a well-known and commercially available standard solution. Then the pancreas is removed in Hank's solution crushed by OC and digested with collagenase and trypsin inhibitor "All procedures are carried out at 0 to 4 ⁰ C, unless otherwise stated" Conditions of digestion are extremely critical "Two crushed pancreas in 8 ml total volume Hank's solution are in 30 ml glass tube filled. All the glass parts had been treated with silicone (trade name: Siliclad, manufacturer Clay-Adams Division, Beeton-Dickinson Inc., Parsippany, New Jersey). The incubation mixture contained 12 mg collagenase, an enzyme obtained from Clostridium histolyticum (prepared essentially according to the method of Mandl, I "Mackeman Jed * and Howes, -EL · J. Clin-Invest · 32 _S 1323 (1943) - type IV CLS, manufacturer Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ) and 1 mg of soybean trypsin Inhibitor, manufacturer Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri * Incubation was carried out at 37 ° C for 25 min with shaking at 90 motions per minute. Constant observation was required to. ensure that the collagenase digestion proceeds to an optimal extent. If the incubation was too short, the islet cells were incompletely released; if incubated too long, their decomposition begins. After incubation, the glass tube was centrifuged for 1 min. at 200 ° C. The supernatant was decanted off

und der Kuchen wurde mit Hank¹scher Lösung gewaschen, . dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurde der Kuchen in 15 ml des Handelsprodukts Ficoll (Hersteller Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Schweden) mit der Dichte 1,O85 suspendiert. Eine Schicht von 8 ml Ficoll der Dichte l,080 wurde zugegeben und eine Schicht aus 5 ml" Ficoll der Dichte Ι,.ΟβΟ, dann wurde das Glasrohr in einem schwingenden Becherrotor 5 Min. bei 500 χ G und dann 5 Min. bei 2000 χ G zentrifugiert. Die Aeinar-Zellen blieben am Boden, die Inselzeilen stiegen imGiadienten auf und bildeten eine Schicht zwischen den beiden Oberschichten. Die Inselzellschicht enthielt verunreinigende Ganglionzellen, Lymphknoten und Bindegewebe. Grosse Verunreinigungsfragmente wurden vom Schichtmaterial entfernt. Der Rest des Präparates wurde unter dem Mikroskop von Hand von sichtbaren Verunreinigungen mittels einer Mikropipette befreit. Das Zellpräparat wurde dann in Hank'scher Lösung verdünnt und zentrifugiert. Die über-and the cake was washed with Hank ¹ shear solution,. this process was repeated five times. After the last centrifugation, the cake was suspended in 15 ml of the commercial product Ficoll (manufacturer Pharmacia Chemical Company, Uppsala, Sweden) at density 1, O85. A layer of 8 ml of Ficoll of density 1.080 was added and a layer of 5 ml of "Ficoll of density Ι, .ΟβΟ, then the glass tube was placed in an oscillating beaker rotor for 5 min at 500 χ G and then for 5 min at 2000 χ G The Aeinar cells remained at the bottom, the islet lines increased in the gradient and formed a layer between the two upper layers The islet cell layer contained contaminating ganglion cells, lymph nodes and connective tissue Large impurity fragments were removed from the layer material The microscope was then freed from visible impurities by micropipette and the cell preparation was diluted in Hank's solution and centrifuged.

ab-from-

stehende Flüssigkeit wurde dekantiert und der Zellkuchen standing liquid was decanted and the cell cake

• . vnirde in flüssigem Stickstoff gefroren gelagert.•. It is not stored frozen in liquid nitrogen.

Die von 200 Ratten zusammengefassten Inselzellen wurden in 4-molarer Guanidinlumthiocyanatlösung (Handelsbezeichnung Tridom, Hersteller: Fluka AG, Chemische Fabrik, Buchs) die 1-molar an ß-Merkaptoethanol und auf pH 5.» 0 gepuffert war,- bei 4 C homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5»7-molare Cäsiumchloridlösung, die 100 m MbI Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, überschichtet und l8 Std..The islet cells combined in 200 rats were homogenized at 4 ° C. in 4 molar guanidinium thiocyanate solution (trade name Tridom, manufacturer: Fluka AG, Chemische Fabrik, Buchs), which had been buffered 1 molar in β-mercaptoethanol and to pH 5.10. The homogenate was layered over 1.2 ml of 5 »7 molar cesium chloride solution containing 100 ml of MbI ethylenediaminetetraacetic acid and l8 hours.

bei j>7 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Beekman-Ultrazentrifuge beil5 c zentrifugiert. Dabei wandert die RNS zum Boden des Zentrlfugierröhrchens. ..centrifuged at j> 7 revolutions / minute in rotor SW 50.1 of a Beekman ultracentrifuge. The RNA migrates to the bottom of the centrifuge tube. ..

Polyadenylierte RNS wurde durch Chromatographieren des RNS-Gesamtpräparates an Oligo(dT)-Zellulose nach dem Verfahren von Aviv, H., und Leder, P. loc.cit. isoliert.Polyadenylated RNA was prepared by chromatographing the total RNA preparation of oligo (dT) cellulose by the method of Aviv, H., and Leder, P.loc.cit. isolated.

Zur Transcription der gesamten polyadenylierten RNS aus den Langerhans'sehen Inseln von Ratten in cDNS wurde Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus (erhalten von Life Science Inc., St. Petersburg, Florida) verwendet. Die Reaktionen wurden in 50 DiM Tris-KCl, pH 8,5jaitFor transcription of whole polyadenylated RNA from rat Langerhans' islets into cDNA, avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (obtained from Life Science Inc., St. Petersburg, Florida) was used. The reactions were carried out in 50 mM Tris-KCl, pH 8.5jait

9 mM-MgCl₂, 50 mM NaCl, 20 mM ß-Merkaptoethanol, 1 mM von jeweils 3 nicht-radioaktiven Deoxyribonucleosid-triphosphaten, 250 p.M des vierten, in ot-Stellung mit 3>2_p markiertem Deoxynucleosid-triphosphat, spezifische Aktivität 50-200 Curie/Mol, 20 pg/ml 01igo-dT,p__-, ο (Hersteller Collaborative Research, Waltham, Massachusetts), 100 ug/ml polyadenylierter RNS und 200 Einheiten/ml Reverser Transcriptase ausgeführt. Das Gemisch wurde I5 Min. bei 4-5 C inkubiert. Nach Zusatz von EDTA-NAp bis 25 mM wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, dann wurde die wässrige Phase an einer mit Sephadex G-1Ö0 gefüllten Säule von'0,5 cm Durchmesser und 10 cm Höhe in9mM MgCl ₂ , 50mM NaCl, 20mM β-mercaptoethanol, 1mM each of 3 non-radioactive deoxyribonucleoside triphosphates, 250pM of the fourth deoxynucleoside triphosphate ot-labeled with 3> 2 _p , specific activity 50 -200 Curie / mole, 20 μg / ml 01igo-dT, p __-, ○ (manufacturer Collaborative Research, Waltham, Massachusetts), 100 μg / ml polyadenylated RNA and 200 units / ml reverse transcriptase. The mixture was incubated at 4-5 C for 15 min. After addition of EDTA-NAp to 25 mM, the solution was extracted with an equal volume of water-saturated phenol, then the aqueous phase was poured onto a Sephadex G-10Ö0 filled column of 0.5 cm in diameter and 10 cm in height

10 mM Tris-HCl_s pH 9*0, 100 mM NaCi, 2 mM EDTA chromatographiert. Die eluierte Nukleinsäure vaarde nach Zusatz von Ammoniumacetat(pH 6,0 bis O₅25 M) mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Kuchen wurde in 50 ul frisch zubereiteter 0,1-molarer Nätriumhydroxidlösung gelöst und 20 Min. bei 70 °C inkubiert, um die RNS zu hydrolysieren. Das Gemisch wurde mit 1-molarer •Natriumace tat lösung, pH K, 5, neutralisiert und das 3>2p~cDNS-Produkt wurde mit Ethanol ausgefällt und erneut in Wasser gelöst. Proben einsträngiger cDNS wurden auf nativem Poly·- acrylamid-Gel nach der Methode von Dingman, CV/., und Peacock, A.C., Biochemistry T^ 659 (1968) analysiert«, Die Gele wurden getrocknet'.und die J2 -DNS wurde durch10 mM Tris-HCl _s pH 9 * 0, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA chromatographed. The eluted nucleic acid vaarde after addition of ammonium acetate (pH 6.0 to O ₅ 25 M) precipitated with ethanol. The precipitate was spun down, the cake was dissolved in 50 μl freshly prepared 0.1 molar sodium hydroxide solution and incubated at 70 ° C for 20 min. To hydrolyze the RNA. The mixture was neutralized with 1 M sodium acetate solution, pH K, 5, and the 3> 2p cDNA product was precipitated with ethanol and redissolved in water. Samples of single-stranded cDNA were analyzed on native polyacrylamide gel according to the method of Dingman, CV /., And Peacock, AC, Biochemistry T ^ 659 (1968). "The gels were dried." And the J2 -DNA was screened

Autoradiographie unter Verwendung eines Kodak No-Screen NS-2T-Films (Hersteller: Eastman Kodak Corp., Rochester, New York) ermittelt. Die eDNS war heterodispers, wie aus der Elektrophorese ersichtlich. Sie enthielt mindestens eine Haupt-cDNS von etwa 450 Nucleotiden (Vergleich mit bekannten Standards).Autoradiography using a Kodak No-Screen NS-2T film (manufacturer: Eastman Kodak Corp., Rochester, New York). The eDNS was heterodisperse as seen from electrophoresis. It contained at least one major cDNA of about 450 nucleotides (comparison with known standards).

Beispiel 2 ' · · ' . ·Example 2 '· ·'. ·

Die gemäss Beispiel 1 erhaltene einsträngige cDNS wurde mit Reverser Transcriptase behandelt, um den komplementären Strang herzustellen. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,2, 9 inM MgCL₂, 1OmM Dithiothreit, 50 mM von jeweils drei nicht-markierten Deoxyribonucleosid-triphosphateri, 1 IaM eines in c^-Stelluiig mit ;52_p markierten Nucleosidtriphosphats mit der spezifischen Wirkung 1-10 Curie/Millimol., 50 jag/ml cDNS und 220 Einheiten/ml Reverse Transcriptase«, Das Reaktionsgemisch wurde 120 Min. bei 45 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EI)TA-Na₂ bis 25 mM abgestoppt, dann wurde mit Phenol extrahiert, an Sephadex G-100 chromatographiert und mit Ethanol ausgefällt. Eine Probe des Reaktionsprodukts von 500 bis 1000 cprn wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Es wurde eineheterodisperse. Bande mit Zentrum vm %50 Nucleotide Länge beobachtet, beim Vergleich mit Standardproben« Proben der DNS-Reaktionsprodukte' der Beispiele 1 und 2 wurden gesondert mit überschüssiger Restriktions-Endonuclease Hae III behandelt und durch Gel-Elektrophorese analysiert. Beide Produkte wurden durch die Endonuclease gespalten, so dass zwei Banden der Radioaktivität bei der Gel-Elektrophorese beobachtet wurden. Die aus der* Spaltung der doppelsträngigen cDNS resultierenden Banden •repräsentierten Spaltungsprodukte von im wesentlichen.gleicherThe single-stranded cDNA obtained according to Example 1 was treated with reverse transcriptase to produce the complementary strand. The reaction mixture contained 50 mM Tris-HCl, pH 8.2, 9 in M _MgCl2, 1OmM dithiothreitol, 50 mM of three unlabeled deoxyribonucleoside triphosphateri, 1 IaM in a c ^ with -Stelluiig; 52 labeled nucleoside triphosphate with the _p specific effect 1-10 Curie / millimole, 50 μg / ml cDNA and 220 units / ml reverse transcriptase. The reaction mixture was incubated at 45 ° C for 120 min. The reaction was quenched by the addition of EI) TA-Na ₂ to 25mM, then phenol extracted, chromatographed on Sephadex G-100 and ethanol precipitated. A sample of the reaction product of 500 to 1000 cprn was analyzed by gel electrophoresis as described in Example 1. It became a heterodisperse. Band with center vm % 50 nucleotides in length observed when compared to standard samples 'samples of the DNA reaction products' of Examples 1 and 2 were treated separately with excess restriction endonuclease Hae III and analyzed by gel electrophoresis. Both products were cleaved by the endonuclease so that two bands of radioactivity were observed in gel electrophoresis. The bands resulting from the * cleavage of the double-stranded cDNAs • represented cleavage products of essentially the same

2Ä2E

Kettenlänge wie bei der Spaltung der einsträngigen cDNS.Chain length as in the cleavage of the single-stranded cDNA.

Beispiel j? .' 'Beis piel j? . ''

Das doppelsträngige Reaktionsprodukt von Beispiel 2 wurde in einer Konzentration von2-5 »g/ml mit ^O Einheiten SIr Nuclease mit einer Aktivität von 1200 Einheiten/ml (Hersteller: Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) in 0, OJ M Natriumacetat, pH 4,6, .0,3 M Natriumchlorid, 4,5 mM ZnCl,. 30 Min. bei 22 °C inkubiert und weitere 15 Min. bei 10 ⁰C. .Mit dem Zusatz von Tris-base bis 0,1 M Endkonzentration, EDTA bis 25 mM und E. coli-tRNS (hergestellt nach der Methode von Ehrenstein. G., Methods in Enzymology, Herausg. ' S.P. .Colowick und N.O. Kaplan, Bd. 12A, S." 588 (1967))bis 40 ug/ml vmrde die Verdauung gestoppt. Nach der Extraktion des Reaktionsgemisch mit Phenol und Chromatographieren· an · Sephadex G-100 vairde die eluierte 52_p-cDNS mit Ethanol ausgefällt. Diese Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute an cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden, die zur Verknüpfung der stumpfen Enden an chemisch 'synthetisierte Decanucleotide erforderlich waren. Hind III~Decamere wurden nach dem Verfahren von Scheller, R.H., Dickerson, R.E., Boyer, H.W., Riggs, A.D. und Itakura, K. ScienceThe double-stranded reaction product of Example 2 was prepared in a concentration of 2-5 »g / ml with ^ O units SIr nuclease with an activity of 1200 units / ml (manufacturer: Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) in 0.10M sodium acetate, pH 4 , 6, 0.3 M sodium chloride, 4.5 mM ZnCl,. Incubated for 30 min. At 22 ° C and a further 15 min. At 10 ⁰ C. With the addition of Tris-base to 0.1 M final concentration, EDTA to 25 mM and E. coli tRNA (prepared by the method of Ehrenstein "G., Methods in Enzymology, ed." SP. Colowick and NO Kaplan, Vol. 12A, p. "588 (1967)) to 40 μg / ml vmrde stopped digestion After extracting the reaction mixture with phenol and chromatographing. The eluted 52 _p- cDNA was precipitated with ethanol on Sephadex G-100 vairde, resulting in a high yield of base-paired cDNS molecules, which were required to link the blunt ends to chemically synthesized decanucleotides were prepared by the method of Scheller, RH, Dickerson, RE, Boyer, HW, Riggs, AD and Itakura, K. Science

(1977) hergestellt. Die Verknüpfung der Hind III-Decamere mit der cDNS erfolgte durch Inkubieren bei 14 °C in 66 mM Tr is-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl₀, 1 mM ATP, 1Ό mM Dithiothr'eit, 3 mM Hind III-Decamere mit 10^ cpm/pMol und Τ4 DNS-Ligase, etwa 500 Einheiten/Milliliter, während 1 Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde dann 5 Min. auf 65 C erwärmt, um die Ligase zu inaktivieren. Dann wurden KCl bis 50 mM Endkonzentration, ß-Merkaptoethanol bis 1 mM Endkonzentration und EDTA .bis 0,1 mM Endkonzentration vor der Verdauung mit 150 Einheiten/ml zugegeben, die während 2'Std.. bei 57 C (1977). The linkage of the Hind III decamers with the cDNA was carried out by incubation at 14 ° C in 66 mM Tris-HCl, pH 7.6, 6.6 mM MgCl ₀ , 1 mM ATP, 1 mM dithiothritol, 3 mM Hind III decamer with 10 cpm / pmole and 4 DNA ligase, about 500 units / ml, for 1 hour. The reaction mixture was then heated to 65 C for 5 min. To inactivate the ligase. Then, KCl to 50 mM final concentration, β-mercaptoethanol to 1 mM final concentration and EDTA. To 0.1 mM final concentration before digestion were added at 150 units / ml, which was incubated for 2 hr. At 57 ° C

HOHO

ausgeführt wurde. Hind III- und Hae III-Endonuclease sind handelsübliche Präparate, erhältlich bei New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts. Das Reaktionsprodmkt wurde durch Gel-Elektrophorese,wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Dabei wurde ein Peak beobachtet, der einer Sequenz von etwa' 450 Nucleotiden entsprach, ausserdem wurden Fragmente der abgespaltenen Hind III-Decamere beobachtet.was executed. Hind III and Hae III endonucleases are commercial preparations available from New England Bio-Labs, Beverly, Massachusetts. The reaction product was analyzed by gel electrophoresis as described in Example 1. A peak corresponding to a sequence of about 450 nucleotides was observed and fragments of the cleaved Hind III decamer were observed.

Beispiel 4 . ''"'..'.. Example 4 . '''' .. '..

Plasmid pMB-9-DNS (Herstellung :SRodrigues, R.L., Boiler, F., Goodman, H.M., Boyer, H.W. und Betlach, M., ICN-UCLA Symposium on Molecular und Cellular Biology, D.P. Wierlich, V/.J. Kutter* und CF. Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976) S. 471-477) wurde/an der Hind III-Erkennungsteile mit Hsu I-Endonuclease gespalten, dann mit alkalischer Phosphatase (Typ BAPF, Worthington Biochemical Corp., .Freehold, New Jersey) behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0,1 Einheit/Mikrogramm DNS vorhanden, das Reaktionsgemisch wurde in 2.5 mM Tris-HCl für pH 8 ^O Min. bei 25 ⁰C inkubiert, dann erfolgt Phenol-Extraktion zur Entfernung.der Phosphatase. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde die mit Phosphatase behandelte Plasraid-DNS zu cDNS zugegeben, die zu Hind III kohäsive Enden besass, und zwar in einem Molverhältnis von ;5 Mol Plasmid zu 1 Mol cDNS. Das Gemisch, wurde in 66 mM Tris, pH 7,6, 6,6 mMPlasmid pMB-9 DNA (Preparation: SRodrigues, RL, Boiler, F., Goodman, HM, Boyer, HW and Betlach, M., ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, DP Wierlich, V / J Cutters * and CF Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976) pp. 471-477) was cleaved at the Hind III recognition portions with Hsu I endonuclease, then with alkaline phosphatase (type BAPF, Worthington Biochemical Corp.). , .Freehold, New Jersey). The enzyme was present in the reaction mixture in an amount of 0.1 unit / microgram of DNA, the reaction mixture was incubated in 2.5 mM Tris-HCl for 8 min at 25 ^° C, then phenol extraction to remove the phosphatase , After precipitation with ethanol, the phosphatase treated plasraid DNA was added to cDNA which had Hind III cohesive ends in a molar ratio of 5 moles of plasmid to 1 mole of cDNA. The mixture was dissolved in 66 mM Tris, pH 7.6, 6.6 mM

10 mM Dithiothreit und 1 mM ATP 1 Std. bei 14 °C in Gegenwart von 50 Einheiten/ml Τ4 DNS-Ligase inkubiert»10 mM dithiothreitol and 1 mM ATP for 1 h at 14 ° C in the presence of 50 units / ml Τ4 DNA ligase incubated »

Dann wurde das Reaktionsgemisch direkt zu einer Suspension von E. coil X-1776-Zellen zugegeben, die wie folgt zur Transformation vorbereitet waren: die ,Zellen wurden bis zu einerThen, the reaction mixture was added directly to a suspension of E. coil X-1776 cells prepared for transformation as follows: cells were grown to one

Zelldichte von etwa 2 χ 10 Zellen/ml in 50 ml Medium gezüchtet, das 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/lCell density of about 2 × 10 6 cells / ml grown in 50 ml of medium containing 10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l

' Natriumchlorid, 2 mM NaÖH, 100 ug/ml DiaminopimelinsäureSodium chloride, 2 mM NaOH, 100 μg / ml diaminopimelic acid

und 40 ug/ml Thymin enthielt und 27 C zeigte. Die Zellen ; vmrden durch fünfminütiges Zentrifugieren unter 5 000 χ G bei 5 ⁰C gesammelt, in 20 ml kalter 10-millimolarer Natriumchloridlösung suspendiert, erneut zentrifugiert und wieder in 20 ml Transformationspuffer suppendiert, der 75 mM CaCIp,and 40 μg / ml of thymine and showed 27C. The cells; vmrden by centrifugation for five minutes at 5000 χ G at 5 ⁰ C collected, suspended in 20 ml of cold 10 millimolar sodium chloride solution, centrifuged again and suppendiert again in 20 ml transformation buffer containing 75 mM CaCIp,

l40 mM NaCl und 10 mM Tris pH 7,5 enthielt, und 5 Min. . in Eis stehengelassen. Dann wurden die Zellen zentrifugiert V :.. und erneut in 0,5 ml Transformationspuffer suspendiert. • ; Die Transformation erfolgte durch Vermischen von 100 ul40 mM NaCl and 10 mM Tris pH 7.5, and 5 min. left in ice. Then the cells were centrifuged V: .. and resuspended in 0.5 ml of transformation buffer. •; The transformation was carried out by mixing 100 μl

der Zellsuspension mit 50 ul rekombinierter DNS (1 ug/ml). ;· . Das Gemisch viurde 15 Min. bei 0 C inkubiert, dann 4 Min. .·. ' bei 25 ⁰C und ^O Min. bei 0 ⁰C behandelt. Sodann wurden die Zellen zum Wachstum unter ausgewählten Bedingungen auf Agar-Platten übertragen. of the cell suspension with 50 μl of recombinant DNA (1 μg / ml). ·. The mixture was incubated at 0 C for 15 min, then 4 min. at 25 ⁰ C and ^ O min. Treated at 0 ⁰ C. The cells were then transferred to agar plates for growth under selected conditions.

Das Aussuchen der rekombinierten Plasmide erfolgte mit .5 Mikrogramm/ml Tetracyclin bei Transformation.¹ dem Hind IH-. Produkt «. Es wurde eine als pAU-1 bezeichnete Neukornbination Isoliert. Rohe Plasmid-Präparate mit 2 ug - 5 J^S DNS (isoliert aus pAU-1) wurden mit überschüssiger Hsu I-Endonuclease behandelt. Dann wurden 10 mM EDTA-Na₂ und 10 % (Gewicht/Volumen) Rohrzucker zugesetzt Und das Gemisch wurde an 8 % Polyacrylamid-Gel zerlegt. Die DNS wurde in einer Stellung entsprechend etwa 410 Basenpaare Länge gefunden. In einem ähnlichen Versuch wurde als Transfer-Vektor das Plasmid pBR-;522 verwendet. Sämtliche Bedingungen blieben, wie beschrieben, lediglich die letzte Selektion der rekombinierten Klone erfolgte auf 20 ;ug/ml Ampicillin enthaltenden Platten. ·. . . .The recombinant plasmids were screened with .5 micrograms / ml tetracycline at transformation. ^{1 to} the Hind IH-. Product «. A reconnect called pAU-1 was Isolated. Crude plasmid preparations containing 2 μg - 5 J ^ S DNA (isolated from pAU-1) were treated with excess Hsu I endonuclease. Then, 10 mM EDTA-Na ₂ and 10 % (w / v) cane sugar were added and the mixture was disassembled to 8 % polyacrylamide gel. The DNA was found in a position corresponding to about 410 base pairs in length. In a similar experiment, the transfer vector used was the plasmid pBR-522. All conditions remained as described, only the last selection of the recombined clones was on 20 μg / ml ampicillin-containing plates. ·. , , ,

Be!spiel 5Play 5

Nach der Eluierung aus dem Gel wurde DNS markiert durch Inkubation miff- P-ATP und dem Enzym Polynucleotidkinase unter den von Maxam und Gilbert loc.cit. beschriebenen Bedingunge] Das Enzym katalysiert die Übertragung einer radioaktiven .Phosphatgruppe von I ~^J P-ATP auf die 5'-Enden der DNS. Das Enzym war aus E. coli nach der Methode von Panet, A., et al, Biochemistry 12, fjO²^ (1973) erhalten worden. Die so markierte DKS wurde mit Hae III-Endonuclease nach der Vorschrift von. Beispiel 2 gespalten, und zwei markierte Fragmente von etwa 265 bzw. Γ25 Basenpaaren wurden unter den in Beispiel 1 beschrieben Bedingungen a.n einem Polyacrylamid-Gel voneinander getrennt. Die isolierten Fragmente wurden spezifischen Spaltungsreaktionen unterworfen, dann erfolgte die Sequenzanalyse nach der Methode von Maxam und Gilbert, loc.cit«, Die Sequenz der folgenden Tabelle 2 bezieht sich auf eine Zusammenstellung der Ergebnisse dieser Versuchsreihen und ähnlicher Versuchsreihen mit cDNS und Plasmid-Vektoren aus col El wie pMB-9 und pBR-222. Am 5'-Ende ist eine Sequenz von schätzungsweise 50 bis 120 Nucleotiden Länge unbestimmt und das PoIy-dA-Segment am J^s-Ende ist von verschiedener Länge«, Diese Sequenz entspricht dem derzeitigen Y/issensstand, wobei selbstverständlich weitere Untersuchungen zusätzliche Details eröffnen oder die Notwendigkeit zu gerlngfügiger Revision einiger Bereiche mit sich bringen können. Die entsprechende Aminosäuresequenz von Ratten-After elution from the gel, DNA was labeled by incubation of miff-P-ATP and the enzyme polynucleotide kinase, as described by Maxam and Gilbert loc. Cit. The enzyme catalyzes the transfer of a radioactive .Phosphate group of I ~ ^J P-ATP to the 5 'ends of the DNA. The enzyme was obtained from E. coli according to the method of Panet, A., et al, Biochemistry 12, fjO ² (1973). The so labeled DKS was treated with Hae III endonuclease according to the protocol of. Example 2 cleaved, and two labeled fragments of about 265 and Γ25 base pairs were separated under the conditions described in Example 1 on a polyacrylamide gel. The isolated fragments were subjected to specific cleavage reactions, followed by sequence analysis according to the method of Maxam and Gilbert, loc. Cit. The sequence of the following Table 2 refers to a compilation of the results of these experimental series and similar series of experiments with cDNA and plasmid vectors col El such as pMB-9 and pBR-222. At the 5 'end, a sequence of approximately 50 to 120 nucleotides in length is indefinite, and the poly-dA segment at the J ^s end is of different length. "This sequence corresponds to the current literature, and further investigations will, of course, provide additional details or the need for a limited revision of some areas. The corresponding amino acid sequence of rat

miifc Proinsulin I beginnt der mit 1 bezeichneten Triplett-Stellung und endet milk der mit 86 bezeichneten Triplett-Stellung. Einige Ungewissheit verbleibt im Hinblick auf die in gestrichelter Linie unterstrichene Sequenzίmiifc proinsulin I begins the triplet position marked 1 and ends milk of the triplet position designated 86. Some uncertainty remains with respect to the dashed line underlined sequence

Tabelle 2Table 2

^/unbestimmt/ „„__{GCG CTG} g_{TC GTG CTC TGG GAG ccc MG CCT GGT CAG}. _{GCT Tn}. _{GTGMA CA0 CAC}· _{CTT TGT} ^ / indefinite / "" _ _{GCG CTG} g _{TC GTG CTC TGG GAG ccc MG CCT GGT CAG} . _{GCT Tn} . _{GTGMA CA0 CAC} · _{CTT TGT}

10 . · 20 · . · · 3010. · 20 ·. · · 30

CGT CCT CAC CTG GTG GAG GCT CTG TAG CTG GTG TGT CGG GAA CGT GGT TTG TTC TAC ACA" CCC AAC TCC CGT CGTCGT CCT CAC CTG GTG GAG GCT CTG TAG CTG GTG TGT CGG GAA CGT GGT TTG TTC TAC ACA "CCC AAC TCC CGT CGT

'" ' 40 · . · ' ' " 50 ' ' · tso '''40 ·. ·''"50''· tso

ΟΛΑ GTG GAG GAC CCG CAA GTG CCA CAA. CTG GAG CTG GCT GGA GGC CCG GAG GCC GCG GAT CTT CAG ACC TCG CCA ιΟΛΑ GTG GAG GAC CCG CAA GTG CCA CAA. CTG GAG CTG GCT GGA GGC CCG GAG GCC GCG GAT CTT CAG ACC TCG CCA ι

60 70 8060 70 80

CTG GAG GTT GCC CGG CAG AAG CGT CGC ATT GTG GAT CAG TGC TGC ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAA CTG GAGCTG GAG GTT GCC CGG CAG AAG CGT CGC ATT GTG GAT CAG TGC TGC ACC AGC ATC TGC TCC CTC TAC CAA CTG GAG

·/' · 86 ' · ' . ·. · / '· 86' · '. ·.

AAC TAC TGC AAC TGA GTTCAATCAATTCCCGATCCACCCCTCTGCAATGAATAAACCCTTTGAATGAGC-poly A ' ·AAC TAC TGC AAC TGA GTTCAATCAATTCCCGATCCACCCCTCTGCAATGAATAAACCCTTTGAATGAGC-poly A '·

mit gestrichelter Linie unterstrichen =· Bereiche vorhandener Unsicherheitunderlined with dashed line = · ranges of existing uncertainty

- TS--- TS--

Belspiel 6Belspiel 6

Eine menschliches Insulin codierende Nucleotidsequenz wird nach der Vorschrift der Beispiele 1 bis K isoliert, gereinigt und in ein Plasmid inseriert, wobei man von menschlichem Pankreasgewebe ausgeht, das. einer geeigneten Quelle entstammt, zuih Beispiel einem gespendeten Pankreas oder einem frischen Leichnam oder einem menschlichen · Ihsulinoma. Ein Mikroorganismus wird im wesentlichen nach Vorschrift von Beispiel k- erzeugt, mit einer die A-B-Kette von menschlichem Insulin codierenden Nucleotidsequenz. Die bekannte Aminosäuresequenz der Α-Kette lautet:A nucleotide sequence encoding human insulin is isolated, purified and inserted into a plasmid starting from human pancreatic tissue derived from a suitable source, for example a donated pancreas or a fresh corpse or a human, according to the instructions of Examples 1 to K. Ihsulinoma. A microorganism is produced in substantial accordance with the procedure of Example k- with a nucleotide sequence encoding the AB chain of human insulin. The known amino acid sequence of the Α chain is:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-i-.sn-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-i-.sn-

20  20

Tyr-Cys-Asn Die Aminosäuresequenz; der Kette B lautet:Tyr-Cys-Asn The amino acid sequence; the chain B is:

1 "i ίο .1 "i ίο.

j Phe-Val-Asn-Glu-Kis-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-L&u-Tyr-Leu-Val-I 20 30j Phe-Val-Asn-Glu-Kis-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-L & u-Tyr-Leu-Val-I 20 30

.Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr.Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr

Die Aminosäuresequenzen werden, ausgehend vom Ende, mit freier Aminogruppe beziffert, vergleiche Smith, L.F«, Diabetes 21, (Erg.2), 458 (1972). 'The amino acid sequences are numbered with free amino group starting from the end, see Smith, L. F., Diabetes 21, (Erg.2), 458 (1972). '

Beispiel 7« Example 7 «

Bei Genen nicht-menschlichen'Ursprungs erfordern die US-Sicherheitsbestimmungen nicht die Isolierung einer cDNSFor genes of non-human origin, US safety regulations do not require the isolation of a cDNA

oei · so hoher Reinheit wie menschlicher cDNS„ Es ist daher möglich, die das gesamte 'Ratten-Wachstumshorraon-Strukturgen enthaltende cDNS zu Isolieren, indem man elektrophoretisch abgetrennte DNS der erwarteten Länge von etwa 800 Basen-, paaren (entsprechend der bekannten Aminosäurelänge des Wachstumshormons) isoliert. Als. Quelle für Ra tten-V/achs turnshormon-mRNS wurden gezüchtete Hypophysenzellen von Ratten'Thus, it is possible to isolate the cDNA containing the entire rat growth hormone structural gene by pairing electrophoretically separated DNA of the expected length of about 800 bases (corresponding to the known amino acid length of the growth hormone ) isolated. When. Ratten-V / Achs turnhormone mRNAs were generated from cultured rat pituitary cells.

(sub-Klon des Zellstamms GH-I, zu beziehen bei der American Type Culture Collection) verwendet, vergleiche .Tashjian, A.H,, et. al., Endoehrinology 82,- jK2 ζΐ9β8). V/erden diese Zellen unter normalen Bedingungen gezüchtet, so macht die Wachstumshormon-mRNS nur 1 bis 3 % der gesamten Poly-A-enthaltenden RNS aus. Die Menge an Wachtumshormon-mRNS wurde jedoch über die Menge anderer mRNS in der Zelle erhöht durch die synergistische Einwirkung von Thyroidhormonen und Glucocorticoiderj. Die RNS wurde aus 5 χ 10 -Zellen gewonnen,, die in einer Suspensionskultur gezüchtet und zur Produktion von Wachstumshormon disponiert wurden durch Zusatz von 1 mM Dexamethason un 10 mM L-Triiodthyronin zum Medium 4 Tage vor dem Sammeln der Zellen. Die polyadenylierte RNS wurde aus der eytoplasmischen Membranfraktion der gezüchteten Zellen isoliert, siehe dazu Martial, J.Α., Baxter, J.D., Goodman, H.M. und Seeburg, P.H., Proc.Nat.Acad.Sci. USA 7^ l8l6(1977)* und Bancroft, P.C., Wu., G. und Zubay, G., Proc.Nat.Acad.ßcI. USA 7O₂. 56k6 (1975). Die mRNS wurden, dann im wesentlichen nach der Vorschrift der Beispiele 1, . 2 und J> weiter gereinigt und in doppeisträngige cDNS transcribiert. Nach der Fraktionierung der Gel-Elektrophorese wurde eine schwache aber deutliche Bande entsprechend einer DNS mit etwa 800 Basenpaaren Länge beobachtet.(sub-clone of cell strain GH-I available from the American Type Culture Collection), see Tashjian, AH, et. al., Endoehrinology 82, - jK2 ζΐ9β8). When these cells are grown under normal conditions, the growth hormone mRNA constitutes only 1 to 3 % of the total poly A-containing RNA. However, the amount of growth hormone mRNA was increased by the amount of other mRNA in the cell due to the synergistic action of thyroid hormones and glucocorticoids. The RNA was recovered from 5χ10 cells grown in a suspension culture and predisposed to growth hormone production by adding 1 mM dexamethasone and 10 mM L-triiodothyronine to the medium 4 days before collection of the cells. The polyadenylated RNA was isolated from the eytoplasmic membrane fraction of the cultured cells, see Martial, J.Α., Baxter, JD, Goodman, HM and Seeburg, PH, Proc.Nat.Acad.Sci. USA 7, 1816 (1977) * and Bancroft, PC, Wu., G. and Zubay, G., Proc. Nat. Acad. USA 7O ₂ . 56k6 (1975). The mRNAs were then, essentially according to the instructions of Examples 1,. 2 and J> further purified and transcribed into double-stranded cDNA. After fractionation of the gel electrophoresis, a weak but distinct band corresponding to a DNA of about 800 base pairs in length was observed.

Die Behandlung der gesamten, durch Transcription aus der mRNS der gezüchteten Hypophysenzellen erhaltene cDNS mit . 'Hhal-Endonuclease ergab zwei DNS-Hauptfragmente (nach elektrophoretischer Trennung) entsprechend etwa 3>20 Nucleotiden (Fragment A) und 2kO Nucleotiden (Fragment B). Die Nuieotidsequenzanalyse der Fragmente A und B gernäss der Vorschrift von Beispiel 5 ·. ergab, dass diese Fragmente tatsächlich Portionen der codierenden Region für Ratten-Wachstumshormon waren, und zwar auf der Basis der bekanntenTreatment of total cDNA obtained by transcription from the mRNA of the cultured pituitary cells. Hhal endonuclease yielded two main DNA fragments (after electrophoretic separation) corresponding to about 3> 20 nucleotides (fragment A) and 2kO nucleotides (fragment B). The nucleotide sequence analysis of fragments A and B according to the procedure of Example 5. revealed that these fragments were, in fact, portions of the coding region for rat growth hormone, based on the known ones

Aminosäuresequenz für Ratten-Wachstumshormon und durch Vergleich mit anderen bekannten Wachstumshormonsequenzen j vergleiche Wallis, M. und Davies, R.V.N., Growt Hormone And Related Peptides (Herausg. Copecile, A. und Muller, E.E. ), S. 1-14 (Elsevier, New Yoek, 1976), und Dayhoff, M.O., •Atlas of Protein Sequence and Structure, 5^ Erg. 2, S.120-121 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C, 1976)· Wird die doppeisträngige cDNS mit 8OO.Basenpaaren nach der vorstehend beschriebenen elektrophoretischen Isolierung analog mit; Hhal-Endonuclease behandelt, so erhält man unter den Hauptspaltprodukten zwei Fragmente, die in der Länge den Fragmenten A und B entsprechen.For rat growth hormone amino acid sequence and by comparison with other known growth hormone sequences, see Wallis, M. and Davies, RVN, Growt Hormones And Related Peptides (Ed. Copecile, A. and Muller, EE), pp. 1-14 (Elsevier, New Yoek, 1976), and Dayhoff , MO, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 ^ Erg. 2, p.120-121 (National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, 1976). When the double-stranded cDNA with 8OO base pairs is used in analogy with the electrophoretic isolation described above; Treated Hhal endonuclease, one obtains among the main cleavage products two fragments corresponding in length to the fragments A and B.

Da die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaaren nicht unter Rückgriff auf die Behandlung mit Restriktions-Endonuclease gereinigt wurde, musste die DNS zwecks Entfernung ungepaarter einsträngiger Enden behandelt werden. In der Praxis entfernt man diese ungepaarten Enden vor der elektrophoretischen Trennung in 25 Ul βθ mM Tris-HCl, pH 7,5* 8 mM MgClgj10 mM ß-Merkaptoethanol,. 1 mM ATP und 200 JiM von Jedem der Nucleotide dATP, dTTP, dGTP und dCTP. Das Gemisch wurde mit einer Einheit E.coil DN5-Polymerase I bei 10 ⁰C 10 Min. inkubiert, um alle hervortretenden J>^x -Enden zu entfernen und alle hervortretenden 5'-Enden aufzufüllen. DNS-Polymerase I ist ein handelsübliches Produkt (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana).Since the rat growth hormone cDNA of about 800 base pairs was not purified by treatment with restriction endonuclease, the DNA had to be treated to remove unpaired single-stranded ends. In practice, these unpaired ends are removed prior to electrophoretic separation into 25 μl of βθ mM Tris-HCl, pH 7.5 * 8 mM MgClg 10 mM β-mercaptoethanol. 1 mM ATP and 200 JiM of each of the nucleotides dATP, dTTP, dGTP and dCTP. The mixture was incubated with one unit E.coil DN5 polymerase I at 10 ⁰ C for 10 min., To remove any protruding J> ^x-ends and to fill all the protruding 5 'ends. DNA polymerase I is a commercial product (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana).

An die Ratten-Wachstumshormon-cDNS mit etwa 800 Basenpaareri . ' wurden chemisch synthetisierte Hind III-Bindeglieder nach der Vorschrift von Beispiel 5 addiert. Das Plasmid pBR-j522 mit einem Ampicillin-Resistenzgen und einer einzigen-Hind III-Stelle im Tetracyclin-Resistenzgen wurde mit Hind III-Endonuclease und alkalischer Phosphatase nach der Vorschrift ..,.·· von Beispiel K vorbehandelt. Das so behandelte Plasmid vmrdeTo the rat growth hormone cDNA of about 800 base pairs. Chemically synthesized Hind III linkers were added according to the procedure of Example 5. The plasmid pBR-j522 with an ampicillin resistance gene and a single Hind III site in the tetracycline resistance gene was pretreated with Hind III endonuclease and alkaline phosphatase according to the instructions ..,. ·· of Example K. The thus treated plasmid vmrde

mit der Raiten-Wachstumshormoh-cDNS mit den 800 Basenpaaren in einer DNS-Ligase-Reaktion gemäss Beispiel 3 kombiniert. Das Gemisch zur Ligase-Reaktion wurde zur TraräOrmierung einer Suspension von E. coli X-1776-Zellen, die gemäss Beispiel 3 behandelt worden waren, verwendet. Die rekombinierten Kolonien wurden aufgrund ihres Wachsturns auf Ampicillin enthaltende Nährplatten und ihrer Unfähigkeit zum Wachstum auf 20 pg/ml Tetracyclin ausgesondert. 10 derartiger Kolonien wurden erhalten, die das Plasmid mit einer Insertion von etwa 800 Basenpaaren enthielten. Die Freisetzung erfolgte durch Kind HI-Spaltung. ...with the Raiten growth hormone cDNA with the 800 base pairs in a DNA ligase reaction according to Example 3 combined. The mixture for ligase reaction was used to trimerize a suspension of E. coli X-1776 cells treated according to Example 3. The recombined colonies were segregated due to their growth on ampicillin-containing nutrient plates and their inability to grow to 20 pg / ml tetracycline. Ten such colonies were obtained containing the plasmid with an insertion of about 800 base pairs. Release was by Child HI cleavage. ...

'.-.. ' .· ' (EGH-DNS) Die Ratten-WachstUmshormon-DNf/mit 800 Basenpaaren wurde in präparativen Mengen aus dem rekombinierten Klon pRGH~l isoliert und die Nucleotidsequenz wurde., wie in Beispiel 5 beschrieben, ermittelt. Die Nucleotidsequenz umfasste Teile der 5'-untranslatierten Region des Ratten-Wachstumshormons und eine Sequenz von 26-Aminosäuren, die im Proteinvorläufer des Wachs tums^/$r°&ibr Sekretion gefunden wird. Die aus der Gen-Sequenz gefolgerte mRNS-Sequenz zeigt folgende Tabelle 3« Die vorausgesagte Aminosäuresequenz stimmt gut überein (mit Ausnahme der Stellungen 1 und 8) mit der Teilsequenz des Ratten-Wachstumshormons gemäss Wallis und Davies, loc.cit,, die die Reste 1-42, 65-69, IO8-II3, 132-145 und 150-190 aufweist. The rat growth hormone DNf / of 800 base pairs was isolated in preparative amounts from the recombinant clone pRGH-1 and the nucleotide sequence was determined as described in Example 5. The nucleotide sequence comprised portions of the 5'-untranslated region of the rat growth hormone and a sequence of 26 amino acids found in the protein precursor of growth / secretion. The mRNA sequence deduced from the gene sequence is shown in Table 3 below. "The predicted amino acid sequence agrees well (except for positions 1 and 8) with the rat growth hormone partial sequence of Valais and Davies, loc 1-42, 65-69, IO8-II3, 132-145 and 150-190.

Tabelle 3Table 3

DNS-Nucleotidsequenz eines Stranges, der die gesamte Ratten-Wachstumshormon codierende Sequenz enthält«. Die entsprechenden Aminosäuren werden,, zusammen mit ihrer Stellungsnummer in Bezug auf das Amino_rHnde aufgeführt. Negativ bezifferte Aminosäuren entsprechen der Sequenz von Pro-Wachstumshormon_o Die entsprechende mRNS-Sequens ist die gleiche, lediglich wird : in der mRNS T durch U ersetzt: ·DNA nucleotide sequence of a strand containing the entire rat growth hormone coding sequence. " The corresponding amino acids are listed together with their position number with respect to the amino _r hands. Negative quantified amino acids correspond to the sequence of pro-growth hormone _o The corresponding mRNA sequence is the same, but only: in the mRNA T is replaced by U: ·

Tabelletable

Mat Ala Ala Asp Ser Gin Thr Pro Trp Leu Leu Thr Plic Ser Leu Lou Cys Leu Leu Mat Ala Ala Asp Ser Gin Thr Pro Trp Leu Leu Thr Plic Ser Leu Lou Cys Leu Leu

5'—GTCGACAnATCACTGAGTGGCG . ·. ATG CCT GCA GAC TCT CAU ACT CCC TCfJ CTC GTG ACC TTC ACC CTG CTC TGC CTG CTG5'-GTCGACAnATCACTGAGTGGCG. ·. ATG CCT GCA GAC TCT CAU ACT CCC TCfJ CTC GTG ACC TTC ACC CTG CTC TGC CTG CTG

Trp Pro Gin CIu Ala GIy AIa Leu Pro Ala HeC Pro Leu Ser Ser Leu Phe AIa Asn Ala VaI Leu Arg Ala CIn !Ils Leu His Gin Leu TGG CCT CAA CAG GCT GGT GCT TTA CCT GCC ATG CCC TTG TCC ACT CUG TTT. CCC ΛΛΤ CCT GTG CTC CCA GCC CAG CAC CTG CAC CAG CTGTrp Pro Gin CIu Ala GIy AIa Leu Pro Ala HeC Pro Leu Ser Ser Leu Phe AIa Asn Ala VaI Leu Arg Ala CIn! Ils Leu His Gin Leu TGG CCT CAA CAG GCT GGT GCT TTA CCT GCC ATG CCC TTG TCC ACT CUG TTT. CCC ΛΛΤ CCT GTG CTC CCA GCC CAG CAC CTG CAC CAG CTG

-'λ · . · . 40 . · '.· .  -'λ ·. ·. 40. · '. ·.

Ala Ala Asp Thr Tyr Lys GIu Phe GIu Arg AIa Tyr He Pro GIu GIy GIn Arg Tyr Scr lie GIn Asn A3 a Gin Ala Ala Phe Cys Phe GCT GCT CAC ACC TAC AM GAG TTC GAG CGT CCC TAC ATT CCC CAG ¹GGA CAC CGC TAT TCC ATT CAG AAT CCC CAG CCT CCT TTC TGC TTCAla Ala Asp Thr Tyr Lys GIu Phe GIu Arg Ala Tyr He Pro GIu GIy GIn Arg Tyr Scr Gin Asn A3 a Gin Ala Ala Phe Cys Phe GCT GCT CAC ACC TAC AT GAG TTC GAG CGT CCC TAC ATT CCC CAG ¹ GGA CAC CGC TAT TCC ATT CAG AAT CCC CAG CCT CCT TTC TGC TTC

60 ' .· · " ·. 80 ,60 '. · · "·. 80,

Ser GIu Thr He Pro Ala Pro Thr GIy Lys GIu GIu Ala Gin CIn Arg Thr Asp Met. GIu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu lie Gin TCA GAG ACC ATC CCA GCC CCC ACC GCC MG GAG GAG GCC CAG CAG AGA ACT GAC ATG GAA TTG CTT CGC TTC TCG CTG CTG CTC ATC CAGSer GIu Thr He Pro Ala Pro Thr GIy Lys GIu GIu Ala Gin CIn Arg Thr Asp Met. Giu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu Leu Gin Gain Gain GG CC CC GCC CCC ACC GCC MG GAG GAG GCC CAG CAG AGA ACT GAC ATG GAA TTG CTT CGC TTC TCG CTG CTG CTC ATC CAG

. . · . . loo, , ·. , loo

Scr Trp Leu -GIy Pro VaI Gin Phü Leu Ser Arg He Phe Thr Asn Ser Leu Met Phe GIy Thr Ser Asp Arg VaI Tyr GIu Lys Leu Lys TCA TGG CTG GGG CCC GTG CAG TTT CTC AGC AGG.ATC TTT ACC AAC AGC CTG ATG TTT GGT ACC TCG GAC CGC GTC TAT GAG AM CTG AAG Trp Leu -Giy Pro VaI Gin Phu Leu Ser Arg He Phe Thr Asn Ser Leu Met Phe GIy Thr Ser Asp Arg VaI Tyr GIu Lys Leu Lys TCA TGG CTG GGG CCC GTG CAG TTT CTC AGC AGG.ATC TTT ACC AAC AGC CTG ATG TTT GGT ACC TCG GAC CGC GTC ACT GAG AT CTG AAG

'.' 120 · .· ' .· .' ...· l'»0 .' .'.' 120 ·. · '. ·.' ... · l '»0.' ,

Asp Leu GIu GIu GIy He Gin AIa Leu Net GIn Glu Leu GIu Asp GIy Ser Pro Arg He GIy Gin He Leu Lys GIn Thr Tyr Asp Lys GAC CTG CM CAG GGC ATC CAG GCT CTG ATG CAG GAG CTG CM. GAC GGC AGC CCC CGT ATT GGG CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAT GAC AAG Asp Leu GIu GIu GIy He Gin AIa Leu Net GIn Glu Leu GIu Asp GIy Ser Pro Arg He GIy Gin He Leu Lys GIn Thr Tyr Asp Lys GAC CTG CM CAG GGC ATC CAG GCT CTG ATG CAG GAG CTG CM. GAC GGC AGC CCC CGT ATT GGG CAG ATC CTC AAG CAA ACC TAT GAC AAG

. ' 160  , '160

Phe Asp Ala Asn Net Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr GIy Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys Ala GIu Thr TTT GAC CCC MC .ATG CCC AGC GAT GAC GCT CTG CTC MA AAC TAT GGG CTG CTC TCC TGC TTC MG AAG GAC CTG CAC AAG GCA CAG ACCPhe Asp Ala Asn Net Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr GIy Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu His Lys Ala GIu Thr TTT GAC CCC MC .ATG CCC AGC GAT GAC GCT CTG CTC MA AAC ACT GGG CTG CTC TCC TGC TTC MG AAG GAC CTG CAC AAG GCA CAG ACC

180 ' ' .180 ''.

Tyr Leu Arg VaI Net Lys Cys Arg Arg Phe Ala GIu Ser Ser Cys AIa Phe .Tyr Leu Arg VaI Net Lys Cys Arg Arg Phe Ala GIu Ser Ser Cys AIa Phe.

TAC CTG CGG CTC ATG MC TGT CGC CGC TTT CCG GM ACC ACC TGT GCT TTC TAG GCACACACTCGTGTCTCTGCGGCACTCCCCCGTTACCCCCCTGTACTTAC CTG CGG CTC ATG MC TGT CGC CGC TTT CCG GM ACC ACC TGT GCT TTC TAG GCACACACTCGTGTCTCTGCGGCACTCCCCCGTTACCCCCCTGTACT

CTGGCMCTGCCACCCCTACACTTTGTCCTMTMMTTMTGATGCATCATATC 'poly(A) .3' CTGGCMCTGCCACCCCTACACTTTGTCCTMTMMTTMTGATGCATCATATC 'poly (A) .3'

Beispiel 8 . . ··' · "Example 8. , ·· '· "

Die Isolierung von menschlicher Wachstumshormon-mRNS erfolgt im !wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 7, lediglich ist das biologische Ausgangsmaterial menschliches Hypophysentumorgewebe. Fünf benigne Hypophysentumoren vom Menschen, die nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren, und von denen jeder 0,4 bis 1,5 g wog, wurden in 4-molarer Gunidiniumthiocyanat-Lösung, die an Merkaptoethanol 1-molar und auf pH 5*0 gepuffert worden war, bei 4 ⁰C aufgetaut und homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5*7~m°lare Cäsiumchloridlösung, die 100 mmol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, aufgeschichtet und l8 Std. bei yj 000 Umdrehungen/Minute im Rotor SiV 50,1 einer Beckmann-Ultrazentrifuge bei 15 °C zentrifugiert» Dabei gelangte die RNS auf den Boden des Zentrifugenrohres. Die weitere Reinigung mit einer Säule mit Oligo-dT und Sucrose^- Gradientensedimentation erfolgte wie in den Beispielen 1, 2 und 5· Etwa 10 % der so isolierten RNS codierten Wachstumshormon,wie abzuschätzen war aus der Einverleibung eines radioaktiven Aminosäure-Vorläufers in Niederschlagsmaterial aus Ant!Wachstumshormon in einem zellfreien Translationssystem aus Weizenkeimen j vergleiche Roberts, B-E. und Patterson, B.M., Prac.Nat.Acad.'Sci. USA 70, 2330 (1973)·The isolation of human growth hormone mRNA is essentially according to the protocol of Example 7, except that the biological starting material is human pituitary tumor tissue. Five benign human pituitary tumors frozen in liquid nitrogen after surgical removal, each weighing 0.4 to 1.5 g, were placed in 4-molar gunidinium thiocyanate solution, 1 molar at mercaptoethanol and at pH 5 * 0 had been buffered, thawed at 4 ⁰ C and homogenized. The homogenate was layered over 1.2 ml of 5 × 7 molar cesium chloride solution containing 100 mmol of ethylenediaminetetraacetic acid and centrifuged for 18 hours at y / 000 revolutions / minute in the rotor SiV 50.1 of a Beckman ultracentrifuge at 15 ° C. The RNA came to the bottom of the centrifuge tube. Further purification with a column of oligo dT and sucrose gradient gradient sedimentation was as in Examples 1, 2 and 5. About 10 % of the thus isolated RNA encoded growth hormone was estimated to be from the incorporation of a radioactive amino acid precursor into precipitate Growth hormone in a cell-free translational system of wheat germs j see Roberts, BE. and Patterson, BM, Prac.Nat.Acad.'Sci. USA 70, 2330 (1973)

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Die Hersteilung/cDNS von menschlichem Wachstumshormon erfolgt im wesentlichen wie in Beispiel 7 beschrieben. Die cDNS wird durch. -Gel—Elektrophorese fraktioniert, und das zu einerThe production / cDNA of human growth hormone is carried out essentially as described in Example 7. The cDNA is going through. Gel electrophoresis fractionated, and that to one

/entsprechenden Stellung etwa oOO Nucleotiden Länge/wandernde Material wird"^ zur Klonierimg ausgewählt« Diese Fraktion wird mit DNS-Polymerase wie in Beispiel 6 beschrieben, behandelt, dann erfolgt End-'Addition der Kind III-Bindeglieder. Die cDNS wird dann mit dem mit alkalischer Phosphatase behandelten Plasmid pBR-^22 und DNS-Ligase rekombiniert. Mit der rekombiriierten DNS X-transformiert und ein die Wachstumshormon-DNS/ corresponding position about 100 nucleotides in length / migrating material is selected for cloning. "" This fraction is treated with DNA polymerase as described in Example 6, then end-addition of the Child III linkers is performed recombinant with alkaline phosphatase-treated plasmid pBR- ^ 22 and DNA ligase X-transformed with recombirated DNA and growth hormone DNA

enthaltender Stamm wird ausgewählt. Dieser Stamm wird in präparativen Mengen gezüchtet> die DNS wird daraus isoliert und ihre Nucleotidsequenz wird bestimmt. Die kloniertecontaining strain is selected. This strain is grown in preparative amounts> the DNA is isolated from it and its nucleotide sequence is determined. The cloned

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Wachstumshormon-DNS enthält die gesamte Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons codierende?! Nucleotide,, Die ersten 2j5 Aminosäuren des menschlichen WachstumshormonsGrowth hormone DNA contains the entire amino acid sequence of human growth hormone coding ?! Nucleotide ,, The first 2j5 amino acids of human growth hormone

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Die restliche Sequenz zeigt die Tabelle 4: .The remaining sequence is shown in Table 4:.

Tabelle 4 · . ·.' .'".·.Table 4 ·. ·. ' . ''. ·.

Nucleotidsequenz eines Stranges von menschlicher Wachstumshormon-DNS. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz des menschlichen'Wachsturashormons, beginnend am Amino-Ende. Die DNS-Sequenz entspricht der mRNS-Sequenz für menschliches Wachstumshormon, lediglich ersetzt in der mJRNS TJ das T. ' 'Nucleotide sequence of a strand of human growth hormone DNA. The numbers refer to the amino acid sequence of the human growth hormone hormone, beginning at the amino terminus. The DNA sequence corresponds to the mRNA sequence for human growth hormone, only replaced in the mJRNS TJ the T. "

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Durch das erfindungsgemässe Verfahren wird es erstmalig möglich, eine für ein spezifisches regulatorisches Protein eines höheren Organismus, wie zum Beispiel eines Wirbeltiers, codierende Nucleotidsequenz zu isolieren, ferner kann der Transfer der darin enthaltenen genetischen Information in einesn Mikroorganismus ausgeführt werden, in welchem die unbegrenzte Heplikation möglich ist. Das offenbarte Verfahren kann auf die Isolierung und Reinigung des menschlichen Insulingens und seinen Transfer in einen Mikroorganismus angewandt werden« Ebenso kann menschliches Wachsturashormongen und können andere Proteingene isoliert, transferiert und in einem Mikroorganismus repliziert werden. Offenbart werden einige neue rekombinierte Plasmide, die in ihrer Nucleotidsequenz eine Struktur aufweisen, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus erhalten wurde. Offenbart werden neue Mikroorganismen, die abgewandelt sind,, so dass' sie eine Nuce^ofcidsequenz enthalten, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus entstanden ist. Die Beispiele illustrieren die Erfindung am Transfer von Ratten-Gen für Proinsulin I in'einen Stamm von Escherichia coil und am Transfer von Ratten-Gen für Wachstumshormon an einem Stamm von E. coli. Die Sequenz des RauptStücks des transferierten Gens wurde in federn Fall ermittelt, wobei festgestellt wurde, dass sie die gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin I bzw» Ratten-Wachstumshormon codiert«By the method according to the invention, it becomes possible for the first time to isolate a nucleotide sequence coding for a specific regulatory protein of a higher organism, such as a vertebrate, furthermore, the transfer of the genetic information contained therein into a microorganism in which the unlimited replication is possible. The disclosed method can be applied to the isolation and purification of the human insulin gene and its transfer into a microorganism. Likewise, human growth hormone gene and other protein genes can be isolated, transferred and replicated in a microorganism. Disclosed are some novel recombinant plasmids having in their nucleotide sequence a structure obtained by transcription from a higher organism gene. Disclosed are new microorganisms that are modified to contain a nucleic acid sequence derived from transcription from a gene of a higher organism. The examples illustrate the invention of the transfer of rat gene for proinsulin I into a strain of Escherichia coli and the transfer of rat growth hormone gene to a strain of E. coli. The sequence of the main part of the transferred gene was determined feathered and found to code for the entire amino acid sequence of rat proinsulin I or "rat growth hormone".

Der hier beschriebene Mikroorganismus wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 31392 hinterlegt. Weiterhin wurde das Plasmid enthaltende Ratten-Insulingen, das unabhängig auf andere Mikroorganismen-Stämme übertragen werden kann, unter der Hinterlegungsnummer *10003 bei der ATCC hinterlegt.The microorganism described here has been deposited with the ATCC under the accession number 31392. Furthermore, the plasmid-containing rat insulin gene, which can be independently transferred to other strains of microorganisms, has been deposited under the accession number * 10003 with the ATCC.

Claims (6)

1«, Verfahren zur Herstellung eines DN5-~Transfer~Vektors mit einer Insulin codierenden Ifucleotidsequenz, gekennzeichnet dadurch, daß man1, a method for producing a DN5 ~ transfer vector with an insulin-encoding Ifucleotidsequenz, characterized in that a) aus der'Bauchspeicheldrüse eines Insulin produzierenden .Organismus Inselzellen isoliert, welche Insulin codierende mRNS enthalten,a) isolates islet cells containing insulin-encoding mRNA from the pancreas of an insulin-producing organism, b) aus den Inselzellen die niEITS in Gegenwart von R-Nase-Inliibitor extrahiert, so daß der RNase-Äbbau der reRNS verhindert wird,b) extracting the islets from the islets in the presence of R-nose inliibitor so as to prevent RNase breakdown of the reRNS; c) dio von Protein^ DITS und anderer RlTS im wesentlichen - freie rnliNS isoliert,c) isolating dioxygen from protein ^ DITS and other RlTS essentially - free RNAs, d) eine do.ppelnträngige oD?IS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRWD komplementäro Nucleotidsequens aufweist, wobei man eine oDITS mit Insulin codierender Hucleotidsequenz erhält _s d) a do.ppelnträngige oD? IS synthesized one strand has one of the mRWD komplementäro Nucleotidsequens to obtain a oDITS with insulin coding Hucleotidsequenz _s e) einen DITS-Transfer-Yektor mit reaktionsfähigen Enden die miteinander odor mit doppelsträngiger cDNS verbunden werden können, .bereitstellt, und e) providing a DITS transfer vector having reactive ends which can be linked together with double-stranded cDNA, and f) den DETS-Transfer-Vcktor und die doppelsträngige cDHS mit der Insulin codierenden Nucleotidsequenz miteinander verbindet,f) connecting the DETS transfer vaccine and the double-stranded cDHS with the insulin-encoding nucleotide sequence, 2_S Verfahre ίο. nach Punkt 1_? gekonnte lohnet dadurch, daß der HWase-Inhibitor ein chaotropes Kation, ein cha^ptropes Aiiiori und ein lÜBulfidbinöung spaltonaes Mittel enthalte 2 _S Move. after point 1 _? This is compensated by the fact that the HWase inhibitor contains a chaotropic cation, a chaotropic agent, and a sulphidide benzening agent SHSH AP C 07 D /205 588 53 547 18AP C 07 D / 205 588 53 547 18 3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man als chaotropes Kation Guanidiniumion und als chaotropes Anion Thioeyanation verwendet. .3. The method according to item 2, characterized in that is used as a chaotropic cation guanidinium ion and as a chaotropic anion thioeyanation. , 4. Verfahren nach Punkt 2_? gekennzeichnet dadurch, daß man4. Procedure according to point 2 _? characterized in that one als Mittel zum Spalten von Disulfidbindungen ß-Merkaptoethanol.verwendet·   used as a means for cleaving disulfide bonds β-mercaptoethanol. 5. Verfahren nach Punkt I₃ gekennzeichnet dadurch, daß man als RNase-Inhibitor 4—molares Guanidinxmthiocyanat .und 0,2-molares ß-Merkaptoethanol verwendet·5. The method according to item I _3, characterized in that is used as RNase inhibitor 4-molar Guanidinxmthiocyanat. And 0.2-molar ß-mercaptoethanol · 6. Verfahren nach Punkt I₃ gekennzeichnet dadurch, daß die reaktionsfähige Enden besitzenden DNS-Moleküle in Stufe (f) nach einem Verfahren verknüpft werden, bei dem ein bestimmter Teil der reaktionsfähigen Enden an der Verknüpfung miteinander gehindert wird, wobei das Verfahren darin besteht, daß man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit- einem Reagens vorbehandelt, das zur Entfernung der 5'—terminalen Phosphatgruppe befähigt ist, und DNS-MoIeküle mit vorbehandelten und unbehandelten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die' eine Verbindung zwischen den reaktionsfähigen Enden herstellende .Reaktion katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten reaktionsfähigen Enden, die in dar Ligsse-katalysierten Reaktion nichtmit-einander verbunden werden«6. The method of item I _3, characterized in that the reactive ends possessing DNA molecules in step (f) are linked by a method in which a certain part of the reactive ends are prevented from linking together, the method being that a certain portion of the reactive ends is pretreated with a reagent capable of removing the 5'-terminal phosphate group, and incubating DNA molecules with pretreated and untreated reactive ends together with a DNA ligase which is a compound between the reaction reactive catalyses, except for the pretreated reactive ends, which are not combined in the ligase-catalyzed reaction. " 7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Vorbehandlung der reaktionsfähigen Enden alkalische Ph ο ξ pha t a se ve rwe η3 e t „7. The method according to item 6, characterized in that for the pretreatment of the reactive ends of alkaline Ph ο ξ Pha ta se ve rwe η 3 et " AP C 07 D /205 588AP C 07 D / 205 588 GJi — 3 —GJi - 3 - 8. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch _} daß dae zu verbindenden MB-Moleküle aus einem Gemisch aus mit Restriktionn-Endenuclease "behandelter Plasmid™ I)NS und nicht plasmider linearer DiTS bestehen und der zur Vorbehandlung be .stimmte Teil die Plasmid-ONS enthält j so daß die End-an-Ende-Verknüpfung der. Plasmid-DNS ohne Heukombination mit der nicht-plasmiden verhindert wird. .8. The method of item 6, characterized in _that} dae to be connected MB molecules from a mixture of with Restriktionn-Endenuclease "treated plasmid ™ I) NS and not consist plasmider linear DITS and be for the pretreatment .stimmte part of the plasmid ONS contains j such that the end-to-end linkage of the plasmid DNA without hay combination with the non-plasmid is prevented. Hierzu 1 Seife For this 1 soap