CZ99798A3 - Způsob přípravy chráněného dipeptidu L-alanyl-L-glutaminu - Google Patents

Abstract

Sloučenina se připravuje tak, že se chráněný L-alaninester spolu s L-glutaminem nebo Lglutaminamidem uvádí v reakčním prostředí na bázi organických rozpouštědel, mísitelných nebo nemísitelných s vodou, s přísadou solí alkalických kovů nebo alkalických zemin a dalších potřebných faktorů, do styku s mikrobiální proteasou, volnou imobilizovanou, při teplotě 20 až 60°C a hodnotě pH 8 až 10. Chráněný dipeptid je významnou výchozí látkou k přípravě L-alanyl-L-glutaminu, který se ve formě infuzních roztoků používá při léčení těžkých pooperaěních, traumatických, katabolických, septických a jiných stresových stavů.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy chráněného dipeptidu L -alanyl -L - glutaminu obecného vzorce I

X - L - alanyl - L - glutamin - Y /1 /, kde X je chránící skupina N - alfa - formylová, N - alfa - furylakryloylová, N - alfa benzoylová, N - alfa - benzyloxykarbonylová, N - alfa - fenylacetylová, N - alfa - terc.butyloxykarbonylová nebo N - alfa - fluorenylmetoxykarbonylová a Y je hydroxylová skupina čí aminoskupina. Chráněný dipeptid je výhodnou výchozí látkou k přípravě volného L -alanyl -L - glutaminu, který se ve formě infuzních roztoků používá při léčení těžkých pooperačních, traumatických, katabolických, septických a jiných stresových stavů.

Dosavadní stav techniky

Jak je známo, používají se syntetické dipeptidy /nebo tripeptidy/ jako složky infuzních roztoků pro parenterální výživu. Jde o peptidy těch L - aminokyselin, které jsou pro organismus potřebné, ale které jsou v roztoku buď nestálé /glutamin/ nebo jen omezeně rozpustné /cystein, tyrosin/. Ve srovnání s volnými aminokyselinami jsou dipeptidy stálejší a rozpustnější. Protože biologická dostupnost peptidů a tím i jejich využitelnost v organismu je velmi dobrá, je možné aplikací dipeptidů zvýšit přísun aminokyselin bez nežádoucí zátěže organismu /A.Veselková a spol., Čes. a Slov. Farm. 45, č.1, str. 14-16, 1996/.

Glutamin je v organismu důležitým donorem dusíku. Zejména v zátěžových stavech se jeho spotřeba zvyšuje, avšak v řadě případů jeho přirozená tvorba nestačí. Pro dodatečný přísun je však překážkou nestálost glutaminu ve vodném prostředí a při sterilizaci infuzních roztoků jeho rozklad. /P.Furst se spol., Proč. Nutr. Soc. 49, 343-359, 1990/. Glutamin však může být dodán organismu ve formě dipeptidů, z nichž se nejlépe osvědčil L - alanyl - L - glutamin, který je v plazmě zdravých probandú rychle odbouráván plazmatickou proteasou na alanin a glutamin za rychlé utilizace složek /Fiirst a spol., citováno výše; H. Lochs a spol., Metabolism 39, 833-836, 1990/. Konvenční výživová • ·

• · · · · · · • ··· · ··· • ····· · ···· · • * · · · · • · · · · · · terapie zmíněných stresových stavů však selhala a jedinou možnou cestou je dodání glutaminu do organismu ve formě infuzních roztoků doplněných alanylglutaminem.

Glutamin aplikovaný ve formě dipeptidu je velmi stálý, nerozkládá se na nežádoucí produkty a je mnohem rozpustnější než ve volném stavu, jak bylo experimentálně prokázáno/P. Stehle, Klinische Ernáhrung 35, 1991/.

Alanylglutamin lze připravit chemickou syntézou /P. Stehle a spol., J. Appl. Biochem, 4, 280-285, 1982/, která je však pro výrobu ve velkém měřítku z mnoha technických, ekonomických i ekologických důvodů nevýhodná. Dále se podařilo uskutečnit první modelovou enzymovou syntézu alanylglutaminu pro výzkumné účely pomocí cysteinových proteas papainu /z Carica papaya/ a ficinu /z Ficus carica/. Pomocí těchto rostliných proteas se však alanylglutamin nemůže ve velkém měřítku vyrábět, neboť jsou to drahé a těžko dostupné rostlinné proteasy, nepoužitelné pro ekonomickou výrobu.

Živočišná výroba proteas je rovněž nevýhodná, protože je drahá a těžkopádná a lze tak získávat jen některé proteasy pro speciální účely, například pepsin z hovězích žaludků nebo alfa-chymotrypsin z vepřových slinivek. Navíc nebyla v dostupné literatuře nalezena mezi proteasami živočišného původu žádná proteasa, která by byla schopna syntetizovat alanylglutamin.

Proto byla obrácena pozornost na výzkum mikrobiálních proteas, které by byly schopny syntetizovat žádaný dipeptid a které by byly dostupné, levné a umožňovaly ekonomickou výrobu v provozním měřítku. V odborné a patentové literatuře není až dosud známa žádná mikrobiální proteasa, která by byla schopna syntetizovat žádaný dipeptid, tj. alanylglutamin. Na základě systematického výzkumu, především dostupných komerčních mikrobiálních proteáz a mikroorganismů, se však podařilo najít vhodné proteasy, schopné syntetizovat chráněný alanylglutamin.

Podstata vynálezu

Vynález se tedy týká způsobu přípravy chráněného dipeptidu L - alanyl - L glutaminu obecného vzorce I

X - L - alanyl - L-glutamin - Y /1 /, kde X je chránící skupina N - alfa - formylová, N alfa - furylakryloylová, N - alfa benzoylová, N - alfa - benzyloxykarbonylová, N - alfa - fenylacetylová, N - alfa - terc.butyloxykarbonylová nebo N - alfa - fluorenylmetoxykarbonylová a Y je hydroxylová • · skupina čí amonoskupina. Podstata vynálezu spočívá v tom, že se chráněný ester L alaninu obecného vzorce Π

X - L - Ala - R / Π /, kde X je totéž, co ve vzorci I a R je alkyl s 1 až 3 atomy uhlíku nebo benzyl, spolu s L glutaminem nebo L - glutaminamidem uvádějí do styku s volnou nebo imobilizovanou mikrobiální proteasou nebo se směsemi těchto proteas, v prostředí organického rozpouštědla mísitelného nebo nemísitelného s vodou, které zahrnuje alkanoly s 1 až 5 atomy uhlíku, acetonitril, dimetylformamid, dioxan, dimetylsulfoxid, etylacetát, tetrachlormetan nebo jejich směsi, v koncentraci 0,5 až 99,5 % obj., s přísadou solí alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin s anorganickými kyselinami a dvojsodné soli kyseliny etylendiaminotetraoctové /EDTA/, při teplotě od teploty místnosti až do 60 °C a při hodnotě pH 8 až 10.

Účelně a výhodně se jako volné nebo imobilizované mikrobiální proteasy používají proteasy, vybrané ze souboru, který zahrnuje proteasu z Aspergillus oryzae, Streptomyces griseus, Vibrio proteolyticus ATCC 15338, karboxypeptidasu Y ze Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces coreanus, proteinasu K z Tritirachium album, peptidyl - Asp - metaloendopeptidasu z Pseudomonas fragi nebo metaloendopeptidasu z Pseudomonas fluorescens RK-9 /sbírka Výzkumného ústavu antibiotik a biotransformací/, a to jednotlivě nebo ve směsi.

Jako přísady do reakčního, resp. kultivačního prostředí jsou potřebné soli alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin s anorganickými kyselinami, zejména sírany, dusičnany, chloridy nebo fosforečnany a to jednotlivě nebo ve směsi; při použití některých proteas je účelná přísada chloridu zinečnatého, popřípadě přísada L-cysteinu.

Výhody způsobu podle vynálezu spočívají v tom, že výroba mikrobiálních proteas, která vychází z dostupných surovin, je levná, umožňuje jednoduchou izolaci enzymu na jednom místě pomocí sledu běžných operací a běžných zařízení. Pro výrobu dipeptidů stačí například příslušnou proteasu izolovat po kultivaci mikroorganismu jen do formy technického preparátu /není třeba izolace a purifikace až do krystalického stavu/, neboť ten se imobilizuje /například pomocí sífovacích činidel, zapolymerováním do polymerní sítě, popřípadě vazbou na organické polymery či porézní anorganické materiály/, čímž enzym přejde do formy malých pevných částic /rovněž je možné použít přímo rozpustný enzym zachycením do ultrafiltračních membrán/ a používá se opakovaně ve vsádkovém zařízení /například 100 až 1000 x podle stability enzymové aktivity a mechanické odolnosti imobilizovaného preparátu/ nebo v kontinuálně pracujícím reaktoru po dobu několik set h, kdy se enzymový materiál musí pro manipulační ztráty doplňovat. Po ukončené reakci se supernatant /reakční směs/ od imobilizované proteasy oddělí a shromažďuje k dalšímu zpracování.

• · • · « • · · • 4 ·

« · «

Chemická výroba L- alanyl - L - glutaminu pracuje výhradně vsádkově, je omezena únosným množstvím reakční směsi, používá toxické látky /např. fosgen/, vysoké teploty a tlaky, znečšťuje okolí. Skupiny, které spolu nemají reagovat, je třeba chránit, i přesto však mohou nastat nežádoucí reakce. Při chemické výrobě hrozí především epimerizace na chirálním uhlíku připravovaného peptidu /vznik racemické směsi/. Komplikovaná je i izolace chráněného peptidu až do čisté formy.

Naproti tomu je způsob výroby podle vynálezu realizovatelný v bioreaktorech, jednoduší, pracuje se za přijatelných teplot a tlaků, s běžnými látkami, při zachování ekologických podmínek. Nenastávají nežádoucí reakce na sekundárních skupinách a především nehrozí nebezpečí zmíněné epimerizace, neboť enzymy jsou přísně stereospecifické, takže rezultuje homogenní dipeptid. Systematickým výzkumem mikrobiálních proteas bylo nalezeno několik mikroorganismů, produkující proteasy schopné syntetizovat chráněný alanylglutamin. Jsou to proteasa z Aspergillus oryzae /plíseň/ a Streptomyces griseus /aktinomyceta/, karboxypeptidasa Y ze Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces coreanus /kvasinky/, proteinasa K z Tritirachium album /houba/, proteasa z Vibrio proteolyticus /bakterie/, peptidyl - Asp - metaloendopeptidasa z Pseudomonas fragi a metaloendopeptidasa z Pseudomonas fluorescens /pseudomonády/. Všechny jmenované proteasy jsou endopeptidasy nebo karboxypeptidasy, neboť jen ty jsou schopné produkovat žádaný dipeptid. Nejvýhodnější jsou serinové proteasy, neboť při jejich použiti se získá dipeptid za relativně krátkou dobu a ve vysokém výtěžku. I při enzymové přípravě je nutno používat chránící skupiny, ale jen pro alfa - aminoskupinu alaninu. Vhodné chránící skupiny jsou uvedeny výše. Pro syntézu se používá alanin ve formě esteru, což je již také zmíněno.

Pri provedení způsobu podle vynálezu se výchozí složky uvádějí ve vhodném reakčním prostředí do styku s některou z uvedených mikrobiálních proteas. Reakční prostředí obsahuje organické rozpouštědlo mísitelné nebo nemísitelné s vodou a podle povahy použité proteasy další potřebné přísady, například soli, EDTA, pufry, cystein a další. Za stálého míchání se teplota a hodnota pH udržují v potřebném rozmezí.

Při práci s imobilizovanou mikrobiální proteasou se reakční směs postupně shromažďuje a potom se v ni jednorázovým procesem ze vzniklého derivátu alanylglutaminu odstraní chránící skupina buď chemicky /například kontaktní hydrogenolýzou apod./ nebo s výhodou enzymově, kdy se využívá schopnosti některých amidas oddělovat chránící skupiny /penicilamidasa odstraňuje fenylacetylovou skupinu, peptidamidasa odštěpuje amidovou skupinu glutaminamidu apod./. Enzymová metoda odštěpování chránících skupin umožňuje při volbě vhodné chránící skupiny sestavit v provozu například sérii dvou průtokových reaktorů, kdy v prvním se syntetizuje chráněný • 0 • · · · »00 0··· • 0 · 0000 0000

0 0 0 0 0 0 0000 0 00 0 0 0

000 000 000

0· 000 00 0 00 00 alanylglutamin a ve druhém se odstraňuje chránící skupina, takže kontinuálně rezultuje přímo žádaný produkt, který se izoluje některým ze známých postupů, například iontoměnnou chromatografií, gelovou filtrací, popřípadě hydrofobní nebo afinitní chromatografií.

Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nikterak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

V termostatované nádobce o objemu 50 ml bylo připraveno 30 ml směsi obsahující 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 10 mM chloridu vápenatého, 10 mM L - cysteinu, 0,663 g N - fenylacetyl - L - alaninmetylesteru (0,1 M), 3,5 g L - glutaminu (0,8 M), 5% obj. etanolu a vodu na celkový objem 30 ml. pH bylo za míchání upraveno 2 M hydroxidem sodným na hodnotu 9,5 a po vytemperování směsi na 35°C bylo za míchání přidáno 10 mg karboxypeptidasy Y ze Saccharomyces cerevisiae, čímž byla zahájena reakce. Reakční směs byla intenzivně míchána a během reakce byla teplota udržována pomocí ultratermostatu na 35°C a pH bylo udržováno pomocí pH - státu na hodnotě 9,5 . Během reakce byly odebírány vzorky o objemu 0,5 ml, v nichž byla reakce zastavena přidáním 0,5 ml 2 M kyseliny chlorovodíkové. Vzorky byly hodnoceny kapilární elektroforézou spojenou s vyhodnocovacím počítačem. Po 180 min reakce, kdy byl její konec indikován téměř úplnou spotřebou N - fenylacetyl - L - alaninmetylesteru, byla nalezana koncentrace N - fenylacetyl - L - alanyl - L - glutaminu 26,7 g/l, což představuje konverzi 79,7 % vztaženo na výchozí acyldonorester.

Příklad 2

Analogicky jako v příkladě 1 bylo připraveno 30 ml směsi, která obsahovala 0,1 M chloridu draselného, 30 mM dusičnanu sodného, 1 mM EDTA, 0,621 g N - benzoyl L-alaninmetylesteru (0,1 M), 2,61 g L - glutaminamidu (0,6 M), 50 % obj. dimetylformamidu a vodu na celkový objem 30 ml. Za míchání bylo pH směsi upraveno 2 M hydroxidem sodným na hodnotu 9,0 a po vytemperování směsi na 40°C bylo přidáno 1,26 g proteasy z Aspergillus orazae, což vedlo k zahájení reakce. Za intenzivního míchání reakční směsi byla během reakce udržována teplota pomocí ultratermostatu na 40°C a pH bylo udržováno pomocí pH- státu na hodnotě 9,0 . Analogicky jako v příkladě 1 byly z reakční • · φ ΦΦΦΦ ΦΦ·· • · φ φ · · ΦΦΦΦ φ φφφ φ φ

Á *·<ΦΦφ ΦΦΦ ^V ····· φ·φ ΦΦΦΦ směsi odebírány vzorky a měřeny kapilární elektroforézou. Po 5 h reakce, kdy se již koncentrace N - benzoyl -L- alaninmetylesteru udržovala prakticky na stejné hodnotě, byla nalezena produkce N - benzoyl - L - alanyl - L - glutaminamidu 15,6 g/l, což vztaženo na výchozí acyldonorester představuje konverzi 48,8 %.

Příklad 3

Analogicky jako v příkladě 1 bylo připraveno 30 ml směsi, obsahující 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 50 mM síranu sodného, 4,38 g L - glutaminu (1 M), 0,747 g N benzyloxykarbonyl -L - alaninmetylesteru (0,1 M), 63 % obj. metanolu a vodu na celkový objem 30 ml. Za míchání bylo pH směsi upraveno 2 M hydroxidem sodným na hodnotu 8,0 a po vytemperování směsi na 30°C bylo za míchání přidáno 15 mg proteasy ze Streptomyces griseus, čímž byla zahájena reakce. Reakční směs byla intenzivně míchána, teplota byla udržována pomocí ultratermostatu na 30°C a pH bylo udržováno pomocí pH státu na hodnotě 8,0 . Vzorky byly odebírány a měřeny analogicky jako v příkladě 1. Po 120 min reakce bylo naměřeno 12,7 g/l N - benzyloxykarbonyl -L - alanyl - L - glutaminu, což představuje konverzi 39,3 %, vztaženo na výchozí acyldonorester.

Příklad 4

a) příprava částečně izolované technické proteasy z Vibrio proteolyticus ATCC 15338 Kultura uvedeného kmene byla udržována na šikmých agarech o složení:

Nutrient Agar Difco 3,1 %

Difco Agar 0,5 % chlorid sodný 2,2 % pH 7,0

Kultivace probíhala při 28°C na rotačním třepacím stroji o počtu otáček 240 min'¹ v 500 ml varných baňkách plněných 100 ml kultivačního média o složení;

sacharoza	4 %
corn-steep liquor (CSL)	4 %
hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát	0,5 %
síran amonný	0,5 %
síran draselný	0,1 %
chlorid vápenatý	0,1 %
síran hořečnatý heptahydrát	0,05 %

• · · · • · <

• · · · chlorid sodný 2,0 % pH 7,0

Baňky I. generace byly očkovány sterilně kličkou ze šikmého agaru a kultivace I. generace probíhala 24 h. Při očkování 1 % inokula z baněk I. genertace probíhala kultivace II. generace rovněž 24 h. O.D. na konci kultivace činila 5,4 a hodnota pH byla 7,9. Obsah baněk byl odstředěn pří 5000 g po dobu 30 min, čímž byl získán čirý nahnědlý supernatant o proteasové aktivitě 0,28 mg azokaseinu/min/ml. Supernatant byl zahuštěn na rotační vakuové odparce opatřené výkonnou rotační olejovou vývěvou při 25°C zhruba 5,5 x, přečemž bylo dosaženo proteasové aktivity zahuštěného supernatantu 0,65 mg azokaseinu/min/ml.

b) příprava dipeptidu

Analogicky jako v příkladě 1 bylo namícháno 10 ml směsi, obsahující po přepočtu na výsledný objem 30ml 0,1 M chloridu draselného, 10 mM chloridu vápenatého, 1 mM chloridu zinečnatého, 1 mM EDTA, 0,2385 g N - formyl -L - alaninpropylesteru (50 mM), 5,256 g L - glutaminu (1,2 M), 20 % obj. propanolu a vodu. Po vytemperování směsi na příslušnou teplotu a úpravě pH 2 M hydroxidem sodným na příslušnou hodnotu bylo za mícháni přidáno 20 ml zahuštěného supernatantu kultury Vibrio proteolyticus ATCC 15338, čímž byla zahájena reakce, při níž byla teplota intenzivně míchané směsi udržována pomocí ultratermostatu na 40°C a pH bylo udržováno pomocí pH - státu na hodnotě 9,5. Při analogickém odběru a analýze vzorků jako v příkladě 1 bylo po 3 h reakce nalezeno 7,2 g/l N - formyl -L - alanyl - L - glutaminu pn konverzi 58,7 %, vztaženo na výchozí acyldonorester.

Přiklad 5

a) příprava imobilizované proteasy

V 50 ml nádobce byly sférické částice organického kopolymeru metakrylaldehyd divinybenzen s obsahem 11,8 % hmot. metakrylaldehydových skupin o průměru 150 až 300 pm ve stechiometrickém poměru aktivovány hexametylendiaminem a v množství 2 g byly míchány pomocí magnetického míchadla ve 30 ml vody se 2 g proteinasy K z Tritirachium album v přítomnosti 1,6 ml 50 % obj. glutaraldehydu při teplotě místnosti po dobu 6 h. Po reakci byly imobilizované částice od supernatantu odděleny dekantací a důkladně promyty vodou. Bylo získáno 5,4 g vlhké hmoty imobilizované proteinasy K o specifické aktivitě 4,3 pmol L - leucinu/min/mg vlhké hmoty (dále jen j/min/mg - proteasová aktivita byla 0,11 mg azokaseinu/min/mg vlhké hmoty). Při původní aktivitě proteinasy K

13,7 j/min/mg preparátu (0,37 mg azokaseinu/min/mg) to představuje výtěžek imobolizace zhruba 85%.

b) příprava dipeptidu

Do reaktoru o objemu 50 ml opatřeného kotvovým míchadlem o počtu otáček 150 min'¹ , které udržovalo částice biokatalyzátoru v dokonalém vznosu, minimálně je mechanicky poškozujíc, a které zajišťovalo dokonalé promíchávání reakční směsi, bylo předloženo 4,5 g vlhkého katalyzátoru (přibližně 19000 j/min/30 ml, tj. na pracovní objem reaktoru) a bylo přidáno vždy 30 ml směsi, obsahující 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 10 mM chloridu vápenatého, 50 mM fosforečnanu tridraselného monohydrátu, 0,663 g N - fenylacetyl -L -alaninmetylesteru (0,1 M), 5,256 g L- glutaminu (1,2 M), 30 % obj. etanolu a vodu na celkový objem 30 ml. pH směsi bylo vždy upraveno 2 M hydroxidem sodným na hodnotu 9,7. V míchaném reaktoru probíhala vždy vsádkově reakce ve styku s imobilizovanou proteinasou K za udržování teploty pomocí ultratermostatu na 28°C a pH pomocí pH -státu na hodnotě 9,7 po dobu 60 až 80 min. Po reakci byla reakční směs vždy odtažena násoskou, opatřenou fritou proti úniku částic, a shromažďována k dalšímu zpracování.

Tímto způsobem bylo provedeno 120 opakovaných vsádkových konverzí; při analogickém odběru a měření vzorků jako v příkladě 1 činila průměrná produkce N -fenylacetyl -L -alanyl -L -glutaminu 29,8 g/l, což představuje průměrnou konverzi výchozího acyldonoresteru přibližně 90 %. Specifická aktivita imobilizované proteinasy klesla po 120 opakovaných vsádkových konverzích, tj. asi po 140 h provozu, na 3,9 j/min/mg vlhké hmoty, což reprezentuje operační poločas biokatalyzátoru asi 950 h.

Průmyslová využitelnost

Chráněné derivváty L - alanyl -L -glutaminu, připravené pomocí mikrobiálních proteas způsobem podle vynálezu, jsou vhodnými výchozími látkami k přípravě dipeptidu L -alanyl -L -glutaminu, který se ve formě infuznich roztoků používá k léčení těžkých pooperačních, traumatických, katabolických, septických a jiných stresových stavů.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy chráněného dipeptidu L - alanyl - L - glutaminu obecného vzorce I

   X - L - alanyl - L - glutamin - Y /1 /, kde X je chránící skupina N - alfa - formylová, N - alfa - furylakryloylová, N - alfa benzoylová, N - alfa - benzyloxykarbonylová, N - alfa - fenylacetylová, N - alfa - terc.butyloxykarbonylová nebo N - alfa - fluorenylmetoxykarbonylová a Y je hydroxylová skupina čí aminoskupina, vyznačující se tím, že se chráněný ester L - alaninu obecného vzorce II

   X-L-Ala-R /II /, kde X je totéž, co ve vzorci I a R je alkyl s 1 až 3 atomy uhlíku nebo benzyl, spolu s L glutaminem nebo L - glutaminamidem uvádějí do styku s volnou nebo imobilizovanou mikrobiální proteasou nebo se směsemi těchto proteas, v prostředí organického rozpouštědla mísitelného nebo nemísitelného s vodou, vybraného ze souboru, který zahrnuje alkanoly s 1 až 5 atomy uhlíku, acetonitril, dimetylformamid, dioxan, dimetylsulfoxid, etylacetát, tetrachlormetan nebo jejich směsi, v koncentraci 0,5 až 99,5 % obj., s přísadou solí alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin s anorganickými kyselinami a dvojsodné soli kyseliny etylendiaminotetraoctové, při teplotě od teploty místnosti až do 60 °C a při hodnotě pH 8 až 10.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako volné nebo imobilizované mikrobiální proteasy používají proteasy, vybrané ze souboru, který zahrnuje proteasu z Aspergillus oryzae, Streptomyces griseus, Vibrio proteolyticus ATCC 15338, karboxypeptidasu Y ze Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces coreanus, proteinasu K z Tritirachium album, peptidyl - Asp - metaloendopeptidasu z Pseudomonas fragi nebo metaloendopeptidasu z Pseudomonas fluorescens.
3. 3. Způsob podle nároku 1a 2, vyznačující se tím, že se jako soli alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin s anorganickými kyselinami používají sírany, dusičnany, chloridy nebo fosforečnany, a to jednotlivě nebo ve směsi.

   • · · • ·
4. 4. Způsob podle nároku 1 až 3, vyznačující se tím, že reakční prostředí obsahuje přísadu chloridu zinečnatého.
5. 5. Způsob podle nároku 1až3, vyznačující se tím, že reakční prostředí obsahuje přísadu cysteinu.