CZ9785A3 - Synthetic polymeric medicaments and process for preparing thereof - Google Patents
Synthetic polymeric medicaments and process for preparing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CZ9785A3 CZ9785A3 CS8597A CS9785A CZ9785A3 CZ 9785 A3 CZ9785 A3 CZ 9785A3 CS 8597 A CS8597 A CS 8597A CS 9785 A CS9785 A CS 9785A CZ 9785 A3 CZ9785 A3 CZ 9785A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gly
- phe
- leu
- mol
- polymer
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Vynález se týká polymerních léčiv obsahujících inertní syntetický polymerní nosič spojený pomocí biodegradabilního spaceru s nízkomolekulární bioaktivní molekulou a způsobu jejich přípravy.The invention relates to polymeric medicaments comprising an inert synthetic polymeric carrier coupled by means of a biodegradable spacer with a low molecular weight bioactive molecule and to a process for their preparation.
Četná nízkomolekulární léčiva používaná v chemoterapii pronikají rychle do nejrůznějších druhů buněk náhodnou difúzí buněčnou membránou. Tento nedostatek selektivity snižuje jejich použitelnost pro požadovanou cílovou tkáň a někdy způsobuje nežádoucí vedlejší jevy. Záchyt v buňce je rychlý, takže terapeutický účinek netrvá dlouho. Navíc léčivo může být rychle odstraněno z krevního řečiště ylcmeruldmi filtrací.Numerous low molecular weight drugs used in chemotherapy penetrate rapidly into a wide variety of cell types by random diffusion through the cell membrane. This lack of selectivity reduces their applicability to the desired target tissue and sometimes causes undesirable side effects. The capture in the cell is rapid, so the therapeutic effect does not last long. In addition, the drug can be rapidly removed from the bloodstream by ylcmeruldmi filtration.
Kovalentní navázání nízkomolekulárních bioaktivních molekul na rozpustné polymerní nosiče brání jak glomerulární filtraci, tak i průniku do buněk prostou' difúzí. Záchyt se omezuje na buňky schopné pohlcovat substráty selektivním mechanismem známým pod jménem pinocytóza, kdy část membrány ohraničující buňku se vchlípí dovnitř buňky, přičemž pohlcuje makromolekulu. Poté se část buněčné membrány oddělí směrem dovnitř, takže se vytvoří intracelulární organela, obsahující zachycený materiál.The covalent attachment of low molecular weight bioactive molecules to soluble polymeric carriers prevents both glomerular filtration and cell penetration by simple diffusion. The capture is limited to cells capable of absorbing substrates by a selective mechanism known as pinocytosis, wherein the cell-bounding portion of the cell is instilled into the cell, absorbing the macromolecule. Then, a portion of the cell membrane is detached inwardly to form an intracellular organelle containing the entrapped material.
Tento rozdíl v mechanismu záchytu poskytuje potenciální metodu, umožňující po průniku do intracelulárního prostoru. Malé molekuly, které vstupují do buněk v důsledku difúze, mají tendenci vniknout do všech částí buňky, zatímco makromolekuly po pinocytóze jsou transportovány v intracelulárních organelách (pinosomech) přímo do lysosomálního kompartmentu, kde se nachází řada hydrolytických enzymů.This difference in the capture mechanism provides a potential method to allow intracellular space penetration. Small molecules that enter cells due to diffusion tend to penetrate all parts of the cell, while macromolecules after pinocytosis are transported in intracellular organelles (pinosomes) directly to the lysosomal compartment where many hydrolytic enzymes are located.
Pinocytózní záchyt polymerního léčiva, které obsahuje takovou vazbu mezi léčivem a nosičem, která podléhá hydrolýze lysosomech, poskytuje tudíž mechanismus pro řízené intracelulární uvolňování bioaktivní molekuly, která vede k jejímu objevení se uvnitř cytoplasmy cílové buňky. Teoretické úvahy, vedoucí k na2 vržení takového systému léčiv, byly nedávno přehledně uvedeny v práci 3. Kopečka Syntéza na míru připravovaných rozpustných polymerních nosičů v Recent Advances in Drug Delivery Systems (Plenům Press, 1984).Thus, the pinocytic capture of a polymeric drug that contains a drug-carrier linkage that is subject to lysosome hydrolysis provides a mechanism for the controlled intracellular release of a bioactive molecule that results in its appearance within the cytoplasm of the target cell. Theoretical considerations leading to the delivery of such a drug system have recently been reviewed in Paper 3. Scoop Synthesis of tailored soluble polymeric carriers in Recent Advances in Drug Delivery Systems (Plenum Press, 1984).
Při navrhování takového systému je třeba splnit dvě kritéria. Za prvé, je třeba navrhnout vazbu mezi léčivem a nosičem, schopnou podléhat řízené lysosomální hydrolýze, ale zároveň stálé vůči účinku enzymů v krevním řečišti. Za druhé, polymerní léčivo musí být schopné specifického záchytu v těchto cílových buňkách, kde je požadován terapeutický účinek, při současném minimálním záchytu v jiných buňkách.Two criteria must be met when designing such a system. First, it is desirable to design a link between a drug and a carrier capable of being subjected to controlled lysosomal hydrolysis, but at the same time stable to the action of enzymes in the bloodstream. Second, the polymeric drug must be capable of specifically capturing in these target cells, where a therapeutic effect is desired, while minimizing capture in other cells.
Ačkoliv pinocytózní proces poskytuje určitý stupeň selektivity vůči makromolekulám, který může být optimalizován změnou molekulové je větší cílové selektivity možno dosáhnout tehdy, zabuduje-li se do molekuly specifický determinant. Buňky obsahují specifické receptory a antigeny na svém povrchu, které poznají určité molekuly nebo jejich části, známé jako specifické determinanty a reagují s nimi. Vysoké buněčné specificity je možno dosáhnout tím, že se do polymerního léčiva zabuduje determinant, který je rozeznáván typem buněk, pro než se požaduje léčivý účinek.Although the pinocytic process provides a degree of selectivity towards macromolecules that can be optimized by changing the molecular, greater target selectivity can be achieved by incorporating a specific determinant into the molecule. Cells contain specific receptors and antigens on their surface that recognize and interact with certain molecules or portions thereof, known as specific determinants. High cell specificities can be achieved by incorporating into the polymeric drug a determinant that is recognized by the type of cell for which a therapeutic effect is desired.
To znamená, že systém pro řízené dávkování léčiv, který umožní specifický cílový účinek, po němž bude následovat intracelulární uvolňování léčiva, musí mít tyto rysy:This means that a controlled drug delivery system that allows a specific target effect, followed by intracellular drug release, must have the following features:
(a) musí obsahovat polymerní nosič, který přednostně podléhá lysosomální hydrolýze, aby se usnadnilo vylučování polymeru z těla, (b) musí obsahovat degradabilní vazbu mezi léčivem a nosičem resistentní vůči extracelulární hydrolýze, ale podléhající řízené lysosomální hydrolýze, (c) musí obsahovat specifický determinant.(a) it must contain a polymeric carrier which preferably undergoes lysosomal hydrolysis to facilitate secretion of the polymer from the body; (b) it must contain a degradable bond between the drug and the carrier resistant to extracellular hydrolysis but subject to controlled lysosomal hydrolysis; determinant.
Takovou molekulu je možno znázornit schématicky tímto způsobemSuch a molecule can be represented schematically in this manner
© specifický determinant© specific determinant
Θ léčivo připojené biodegradabilní vazbou ”_“ volitelná biodegradabilní příčný vazba _ _ v polymerním nosičiΘ drug attached by biodegradable bond ”_“ optional biodegradable crosslink _ _ in polymer carrier
Ačkoliv se jako nosičů používalo přírodních makromolekul, hthoťhosf syntetické polymery poskytují ty výhody, že molekulová v-qHq se dá snadněji přizpůsobit, aby bylo dosaženo optimální buněčné selektivity a že na rozdíl od mnoha přírodních makromolekul, nejsou imunogenní. Rovněž se dají snadněji připravit v komerčním měřítkuAlthough natural macromolecules have been used as carriers, these phosphorous synthetic polymers provide the advantages that the molecular v-qHq is easier to adapt to achieve optimal cell selectivity and that, unlike many natural macromolecules, they are not immunogenic. They are also easier to prepare on a commercial scale
Syntetické polymery založené na N-(2-hydroxypropyl)methakryl amidu (HPMA) byly navrženy jako potenciální nosiče léčiv, viz US pat. č. 4,062.831 a 4,097.470; tyto polymery jsou rozpustné ve vodném prostředí a mají dobrou biokompatibilitu. Navíc, v důsledku zabudování p-nitrofenylesterů N-methakryloyloligopeptidů, mohou být kombinovány s mnoha léčivy, obsahujícími primární aminoskupinu. Polymerní řetězce mohou být sííovány pod bodem gelace, hmolhofb' aby se dosáhlo optimální molekulové váhy a aby, díky přítomnosti biodegradabilních příčných vazeb, byl zajištěn způsob degradace polymeru, usnadňující jeho vylučování z těla.Synthetic polymers based on N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide (HPMA) have been suggested as potential drug carriers, see US Pat. Nos. 4,062,831 and 4,097,470; these polymers are soluble in aqueous media and have good biocompatibility. In addition, due to the incorporation of p-nitrophenyl esters of N-methacryloyl oligopeptides, they can be combined with many drugs containing a primary amino group. The polymer chains may be crosslinked below the gelation point, to achieve optimal molecular weight, and to provide, by the presence of biodegradable cross-links, a method of degrading the polymer, facilitating its secretion from the body.
Jelikož lysosomální enzymy obsahují řadu proteináz, schopných hydrolyzovat peptidické vazby, zdálo by se, že přímá připojení bioaktivní molekuly na polymerní řetězec pomocí amidické vazby poskytne možnost lysosomální hydrolýzy. V praxi tomu však tak není. Bylo však zjištěno, že peptidické spacery, umístěné mezi léčivem a nosičem, podléhají degradaci účinkem lysosomálních enzymů v širokém rozsahu rychlostí. Vazba, která se štěpí, je obvykle vazba mezi léčivem a sousední aminokyselinou, ačkoliv vždycky tomu tak není. Ukazuje se, že hydrolýza, tj. rychlost uvolňování léčiva, značně závisí na počtu a povaze aminokyselinových zbytků v peptidickém spaceru. Obecně, spacery obsahující méně než tři aminokyseliny nepodléhaly lysosomální hydrolýze. Peptidické spacery, navržené tak, aby odpovídaly známé substrátové specifitě thiolových proteináz, které, jak je známo, jsou obsaženy v lysosomech, jsou štěpeny obvzlášt účinně.Since lysosomal enzymes contain a variety of proteinases capable of hydrolyzing peptide bonds, it would appear that direct attachment of the bioactive molecule to the polymer chain via an amide linkage would provide the possibility of lysosomal hydrolysis. However, this is not the case in practice. However, peptide spacers located between the drug and the carrier have been found to be subject to degradation by the action of lysosomal enzymes over a wide range of rates. The bond that cleaves is usually the bond between the drug and the adjacent amino acid, although this is not always the case. Hydrolysis, i.e., the rate of drug release, appears to depend greatly on the number and nature of the amino acid residues in the peptide spacer. In general, spacers containing less than three amino acids have not undergone lysosomal hydrolysis. Peptide spacers, designed to match the known substrate specificity of thiol proteinases, which are known to be contained in lysosomes, are cleaved particularly efficiently.
Dále bylo ukázáno, že modifikace glykoproteinů, vedoucí ke vzniku oligosacharidových vedlejších řetězců, zakončených galak4 tózou, vede k prudkému vzrůstu ukládání glykolproteinů v parenchymálních jaterních buňkách. Galaktózová jednotka působí jako specifický determinant, který reaguje s receptory, umístěnými na plazmatické membráně jaterních buněk. Tato okonost nabízí potenciální mechanismus pro cílené působení léčiv v případě hepatomu, tj. druhu rakoviny, který se zvlášť těžko léčí. Navíc, galaktózamin navázaný na kopolymery HPMA pomocí amidické vazby poskytuje podobný účinek a tím naznačuje, že receptory na membránách hepatocytů rozeznávají galaktozové jednotky nejenom jsou-li vázány glykosidickou vazbou, ale také, když tyto jednotky jsou přítomny jako N-acylgalaktózamin. 3e známa rada dalších rozeznávacích systémů, například N-acetylglukózamin/manózový rozeznávací systém Kupfferových buněk a makrofágů a fosfohexózový rozeznávací systém fibroblastů.Furthermore, it has been shown that the modification of glycoproteins leading to the formation of galactose-terminated oligosaccharide side chains results in a sharp increase in glycol protein deposition in parenchymal liver cells. The galactose unit acts as a specific determinant that reacts with receptors located on the plasma membrane of liver cells. This circumstance offers a potential mechanism for targeting drugs in the case of hepatoma, a type of cancer that is particularly difficult to treat. In addition, galactosamine bound to HPMA copolymers by amide coupling provides a similar effect and thus suggests that receptors on hepatocyte membranes recognize galactose units not only when bound by glycosidic linkage, but also when these units are present as N-acylgalactosamine. A number of other recognition systems are known, such as the N-acetylglucosamine / mannose recognition system of Kupffer cells and macrophages and the phosphohexose fibroblast recognition system.
Jiný možný mechanismus cílení spočívá v navázání polymerního léčiva na protilátku, která je^specificky rozeznávána buňkami, majícími odpovídající membránové antigeny. Molekuly léčiv byly též navazovány přímo na imunoglobulin, ale to může vést ke ztrátě aktivity léčiva, ztrátě aktivity protilátky anebo rozpustnosti konjugátu. Ukázalo se, že zavedení polymerního meziřetězce mezi léčivo a polymer značně zjednodušuje uvedené problémy.Another possible targeting mechanism is to bind the polymeric drug to an antibody that is specifically recognized by cells having the corresponding membrane antigens. Drug molecules have also been linked directly to immunoglobulin, but this can lead to loss of drug activity, loss of antibody activity, or solubility of the conjugate. It has been shown that the introduction of a polymer spacer between drug and polymer greatly simplifies these problems.
Další mechanismus cílení látek je založen na vazbě proteinu nebo hormonu na polymer, například transferinu nebo hormonu stimulujícího melanocyty, který se váže specificky na typ cílové buňky.Another mechanism for targeting substances is based on the binding of a protein or hormone to a polymer, for example, transferrin or a melanocyte stimulating hormone that binds specifically to the target cell type.
Zatímco potřeba syntézy cílených polymerních léčiv s hydrolyzovatelnými peptidickými spacery byla uváděna již dříve (viz práci Kopečka citovanou již dříve), peptidické spacery schopné řízeného intracelulárního uvolňování léčiv vhodnou rychlostí unikaly pozornosti výzkumných pracovníků.While the need for the synthesis of targeted polymeric drugs with hydrolyzable peptide spacers has been reported previously (see Kopeček, cited earlier), peptide spacers capable of controlled intracellular drug release at an appropriate rate have eluded the attention of researchers.
Jak bylo uvedeno dříve, rychlost lysosomální hydrolýzy peptidického spaceru závisí na počtu a povaze aminokyselinových zbytků. V tom se projevují jak0 prostorové, tak strukturní faktory . |flyeMo-G-t - koncová-b-y-drolýzy tipaniiu“tibsaliujícího 2 až-4 amino·/ |l<yaoliftQV8 zbytky obeen-ě—g-á-vigí-ria počťu μ £ Ϊ Ldhiíi ý uli zby ΙΚάη—corí přigepító pp-ootorové interakci mezi polymerním řetě-zcÍiiii a~uii2.yf jn r -iAs noted previously, the rate of lysosomal hydrolysis of a peptide spacer depends on the number and nature of the amino acid residues. This shows both spatial and structural factors. | flyeMo-Gt - terminal-by-drolysis of tipaniiu tibsalizing 2 to 4 amino · / | l <yaoliftQV8 obeen-g-a-vigir-ria residues μ £ Ϊ Ldhiii li uby ΙΚάη — cori prigepito pp- ootor interaction between the polymer chain and u2.2.f.
Rychlost koncové hydrolýzy spaceru obsahujícího 2 až 4 aminokyselinové zbytky obecně závisí na počtu přítomných zbytků, což se přičítá prostorové interakci mezi polymerním řetězcem a enzymem. Pro peptid dané délky rychlost hydrolýzy závisí na povaze (a sekvenci) aminokyselinových zbytků. Tato závislost je způsobena substrátovou specificitou lysosomálních enzymů, odpovědných za štěpení peptidického spaceru a část enzymu, kde probíhá interakce se substrátem, je známá jako aktivní místo enzymu. Aktivní místo hraje dvojí úlohu - váže substrát a zároveň katalýzuje reakci, například štěpení. Výzkum struktur komplexů proteolytických enzymů s peptidy ukazuje, že aktivní místo těchto enzymů je relativně velké a je vázáno na několik aminokyselinových zbytků v peptidú.The rate of terminal hydrolysis of a spacer comprising 2-4 amino acid residues generally depends on the number of residues present, which is attributed to the spatial interaction between the polymer chain and the enzyme. For a peptide of given length, the rate of hydrolysis depends on the nature (and sequence) of the amino acid residues. This dependence is due to the substrate specificity of the lysosomal enzymes responsible for cleavage of the peptide spacer, and the portion of the enzyme where the interaction with the substrate takes place is known as the active site of the enzyme. The active site plays a dual role - it binds the substrate and at the same time catalyses the reaction, for example fission. Investigation of structures of proteolytic enzyme complexes with peptides shows that the active site of these enzymes is relatively large and is bound to several amino acid residues in the peptides.
Degradabilita jednotlivé vazby v peptidickém řetězci tudíž závisí nejen na povaze struktury poblíž štěpené vazby, ale také na povaze aminokyselinových zbytků, relativně vzdálených od štěpené vazby, avšak hrajících důležitou úlohu tím, že udržují enzym v určité poloze během hydrolýzy. Detailní struktura aktivních míst lysosomálních enzymů nebyla zatím určena, což se projevilo jako překážka v přípravě peptidických spacerů, které podléhají lysosomální hydrolýze vhodnou rychlostí a jsou určeny pro použití v polymerních léčivech.Thus, the degradability of an individual bond in the peptide chain depends not only on the nature of the structure near the cleaved bond, but also on the nature of the amino acid residues relatively distant from the cleaved bond, but playing an important role in maintaining the enzyme at a certain position during hydrolysis. The detailed structure of the active sites of lysosomal enzymes has not yet been determined, which has proven to be an obstacle in the preparation of peptide spacers that undergo lysosomal hydrolysis at an appropriate rate and are intended for use in polymeric drugs.
Vynález se zakládá na objevu takových peptidických sekvencí, které mohou působit jako spacery schopné lysosomální hydrolýzy uspokojivou rychlostí tak, že umožní řízené intracelulární uvolňování léčiv, ale které jsou nadále resistentní vůči extracelulární hydrolýze, a mohou rovněž být použity pro vazbu specifických determinant. Dále byly vyvinuty systémy, umožňující snadné štěpeftí základního polymemího nosiče. Biodegradability je dosaženo tím, že do hlavního polymerního řetězce jsou zavedeny oligopeptidické sekvence obsahující biodegradovatelné vazby. Hydrolýza těchto vazeb je zvláště citlivá vůči sterické zábraně způsobené polymerními řetězci, více nežli hydrolýza koncových jednotek z peptidických vedlejších řetězců.The invention is based on the discovery of such peptide sequences that can act as spacers capable of lysosomal hydrolysis at a satisfactory rate so as to allow controlled intracellular drug release but which remain resistant to extracellular hydrolysis, and can also be used to bind specific determinants. In addition, systems have been developed to facilitate the cleavage of the basic polymeric carrier. Biodegradability is achieved by introducing oligopeptide sequences containing biodegradable linkages into the polymer backbone. Hydrolysis of these bonds is particularly sensitive to steric hindrance caused by polymer chains, rather than hydrolysis of terminal units from peptide side chains.
Podstatou tohoto vynálezu je polymerní léčivo tvořené inertním syntetickým polymerním nosičem na bázi opakujících se jednotek N-(2-hydroxypropyl)-methakrylamidu, který je pomocí aminokyselinových nebo peptidových spacerů spojený s biologicky aktivní molekulou a pomocí stejných nebo jiných spacerů popřípadě spojen se směrující jednotkou a který je popřípadě sesíťován, vyznačené tím, že sestává z (a) 5,0 až 99,7 mol.% jednotek odvozených z N-(2-hydroxypropyl) methakrylamidu vzorceThe present invention provides a polymeric drug consisting of an inert synthetic polymeric carrier based on N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide repeating units, which is linked to a biologically active molecule by means of amino acid or peptide spacer and optionally linked to a targeting unit via the same or other spacer; which is optionally cross-linked, characterized in that it consists of (a) 5.0 to 99.7 mol% of units derived from N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide of the formula
CH2 OHCH 2 OH
II I ch3 - c - co - nh - ch2 - CH - ch3 (b) 0.2 až 20.0 mol% jednotek odvozených z N-methakryloylovaného peptidu, vzorceII b 3 - c - co - n - 2 - CH - ch 3 (b) 0.2 to 20.0 mol% units derived from N-methacryloylated peptide of formula
CH2 CH 2
IIII
CH3 - C - CO - [NH - R - CO] - [B] kde -[NH-R-CO]-je zbytek odvozený od Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, GlyPhe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, GlyLeu-Ala, Gly-Phe-Tyr, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-PheLeu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-GlyVal-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe a Gly-Gly-Phe-LeuGly-Phe, a -[B] je bioaktivni molekula a (c) 0.1 až 94.3 mol% jednotek vzorceCH 3 - C - CO - [NH - R - CO] - [B] wherein - [NH-R-CO] -is a residue derived from Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, GlyPhe-Phe, Gly-Leu- Gly, Gly-Phe-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Phe-Tyr, Gly-Phe-Tyr Gly-Leu-Gly-Gly, Gly-Phe-Gly-Phe, Gly-Phe-Gly-Phe, Gly-Phe-Gly-Phe, Gly-Phe-Gly-Phe and Gly- Gly-Phe-LeuGly-Phe, α - [B] is a bioactive molecule and (c) 0.1 to 94.3 mol% units of the formula
CH3 - C - CO - NH - [D] neboCH 3 - C - CO - NH - [D] or
CH0 CH 0
IIII
CH3 - C - CO - [D] neboCH 3 - C - CO - [D] or
CH9 llCH 9 ll
CH3 - C - CO - [NH ~ R - CO] - D kde -[D] je determinant a -[NH-R-CO]-je zbytek odvozený od Leu,Phe, Gly-Gly, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-LeuPhe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-ValPhe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, Gly-Gly-Phe-Leu-GlyPhe.CH 3 - C - CO - [NH - R - CO] - D where - [D] is a determinant and - [NH-R-CO] -is a residue derived from Leu, Phe, Gly-Gly, Gly-Leu-Gly Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-LeuPhe, Gly-Leu-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly -Gly, Gly-Phe-Tyr-Gly, Gly-Phe-Gly-Phe, Gly-Phe-Gly-Phe, Gly-Phe-Gly-Phe -GlyPhe.
Polymerní léčivo podle vynálezu může dále obsahovat (d) do 5 mol.% jednotek vzorce ch2 <*2The polymeric drug according to the invention may further comprise (d) up to 5 mol.% Of units of formula CH 2 <2 *
CH3 - C - CO - [NH - R - CO] - [L] - [CO - R - NH] - co - c - ch3 kde -[NH-R-CO] je zbytek odvozený od Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, GLy-Phe-LeuGly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-PheGly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe a Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe a -[L]- je spojovací skupinou, a dále může obsahovat (e) jako jednotky schopné radioaktivního značení do 2 mol.% jednotek vzorceCH 3 - C - CO - [NH - R - CO] - [L] - [CO - R - NH] - co - c - ch 3 where - [NH-R-CO] is a residue derived from Gly-Leu- Gly, Gly-Phe-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Phe-Leu, Gly-Phe-Leu, Gly-Phe-Leu, Gly-Phe-Leu, Gly-Phe-Leu Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Gly-Phe-Gly-Phe, Gly-Phe-Gly-Phe and Gly-Gly-Phe- Leu-Gly-Phe and - [L] - is a linker, and may further comprise (e) as units capable of radiolabeling up to 2 mol% units of the formula
NH,NH,
IAND
CH, COCH, CO
II III I
CH3 - C - CO - NH - CH - CH2 - C6H4 - OHCH 3 - C - CO - NH - CH - CH 2 - C 6 H 4 - OH
Ne všechny kombinace oligopeptidových sekvencí uvedených pod (b) a biologicky aktivních molekul nebo molekul léčiv podléhají intracelulární lysosomální hydrolýze; například jak je uvedeno dále, kombinace Gly-Gly s daunomycinem nepodléhá této hydrolýze a proto by se neměl Gly-Gly používat jako peptidický spacer s daunomycinem. Gly-Gly je však přijatelný spacer pro ostatní léčiva, například pro deacetylkolchicin a kolcemid.Not all combinations of the oligopeptide sequences of (b) and biologically active or drug molecules undergo intracellular lysosomal hydrolysis; for example, as shown below, the combination of Gly-Gly with daunomycin is not subject to this hydrolysis and therefore Gly-Gly should not be used as a peptide spacer with daunomycin. However, Gly-Gly is an acceptable spacer for other drugs, for example, for deacetylcolchicine and colcemid.
Jak bylo ukázáno v souvislosti s bodem (c), determinant je možno připojit přímo k polymernímu řetězci buď amidovou nebo esterovou vazbou t.j. bez spaceru, nebo může být vázán přes aminokyselinový nebo peptidový spacer. Úvahy ovlivňující výběr vazby , která má být použita pro určitý determinant, jsou složité a závisí mimo jiné na charakteru a počtu jednotek nesoucích léčivo, nebo na tom, má-li polymer jednoduchý řetězec, nebo je větvený a ovšem na charakteru determinantu. Převládajícím požadavkem je, aby byl determinant dostupný pro specifické receptory na cílených buňkách, což je ve značné míře funkcí geometrie molekuly polymerního léčiva.As shown in connection with (c), the determinant may be attached directly to the polymer chain either by an amide or ester linkage i.e. without a spacer, or may be linked via an amino acid or peptide spacer. Considerations affecting the choice of binding to be used for a particular determinant are complex and depend among other things on the nature and number of drug-bearing units, or on whether the polymer has a single chain or is branched and, of course, on the nature of the determinant. The predominant requirement is that the determinant be available for specific receptors on targeted cells, which is largely a function of the geometry of the polymer drug molecule.
Biologicky aktivní molekula přítomná v polymerním léčivu je především protirakovinná látka, protimikrobiální látka, protiparazitická látka, protizánětlivá látka, kardiovaskulární léčivo nebo léčivo s účinkem na nervovou soustavu. Zvláštní přednost mají např. daunomycin, puromycin, adriamycin, isopropylester melfalanu (sarkolysin), bleomycin, desferioxamin, bestatin a tritylcystein.The biologically active molecule present in the polymeric drug is primarily an anticancer agent, an antimicrobial agent, an anti-parasitic agent, an anti-inflammatory agent, a cardiovascular drug or a drug having a nervous system effect. Particularly preferred are, for example, daunomycin, puromycin, adriamycin, melphalan isopropyl ester (sarcolysin), bleomycin, desferioxamine, bestatin and tritylcysteine.
7a7a
Determinantem je především monosacharid, disacharid, oligosacharid nebo O-methakryloylovaná sacharidová jednotka, jež jsou přednostně vázány amidovou vazbou, protilátky jako IgG (krysí imunoglobulin) a anti-0 protilátka, nebo protein, např. transferin nebo hormon stimulující melanocyty (MSH). Zvláště vhodné determinanaty jsou galaktoza, galaktozamin, glukozamin, manozamin a fukosylamin.In particular, the determinant is a monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide or O-methacryloylated carbohydrate unit, which are preferably bound by an amide bond, antibodies such as IgG (rat immunoglobulin) and an anti-O antibody, or protein, eg transferrin or melanocyte stimulating hormone (MSH). Particularly suitable determinanates are galactose, galactosamine, glucosamine, mannosamine and fucosylamine.
Skupina L tvořící spojku mezi polymerními řetězci, má s výhodou složení typu - A -. NH(CH2)X NH-A - , kde A je aminokyselina a x je celé číslo od 1 ao 12, a je připojena k sousedním peptidickým spacerům amidickými vazbami. Zvlášť výhodné vazebné skupiny jsou ty, v nichž x je 6 a aminokyselina A je Phe, Tyr, Ala, Gly nebo Leu, a ty, v nichž x je 2 a aminokyselina A je Ala.The L group forming the linker between the polymer chains preferably has an A-type composition. NH (CH 2 ) X NH-A -, wherein A is an amino acid and x is an integer from 1 and 12, and is attached to adjacent peptide spacer by amide bonds. Particularly preferred linking groups are those in which x is 6 and amino acid A is Phe, Tyr, Ala, Gly or Leu, and those in which x is 2 and amino acid A is Ala.
Zvlášť výhodné provedení vynálezu zahrnuje jednoduché nebo sesítěné řetězce specifikovaného polymeru s daunomycinem jako bioaktivní molekulou, galaktozou, galaktozaminem nebo fukosylaminem jako determinantem, Gly-Phe-Leu-Gly jako peptidickým spacerem mezi polymerním nosičem a jak daunomycinem, tak i galaktozaminem, a volitelně s Gly-Phe-Leu-Gly jako peptidickým spacerem obsaženým v příčné vazbě a -(Phe)NH(CH2)6NH(Phe)- jako spojující skupinou.A particularly preferred embodiment of the invention includes single or cross-linked chains of the specified polymer with daunomycin as bioactive molecule, galactose, galactosamine or fucosylamine as determinant, Gly-Phe-Leu-Gly as peptide spacer between polymer carrier and both daunomycin and galactosamine, and optionally with Gly -Phe-Leu-Gly as the peptide spacer contained in the crosslink and - (Phe) NH (CH 2 ) 6 NH (Phe) - as the linking group.
Vynález rovněž zahrnuje syntézu polymerních léčiv, jak uvedeno v popisu vynálezu.The invention also encompasses the synthesis of polymeric drugs as set forth in the disclosure.
Protože tentýž oligopeptidický spacer je možno použít jak pro vazbu bioaktivní molekuly, tak pro vazbu determinantu a příprava těchto sloučenin je jednodušší než těch, v nichž tyto spacery jsou různého druhu, nejprve popíšeme postup syntézy polymerního noseče se stejným spacerem. Syntéza probíhá v zásadě ve dvou stupních.Since the same oligopeptide spacer can be used for both the binding of the bioactive molecule and the determinant, and the preparation of these compounds is simpler than those in which these spacers are of different kinds, we will first describe the procedure for synthesizing a polymeric carrier with the same spacer. In principle, the synthesis takes place in two stages.
-Leu-Gly jako peptidickým spacerem obsaženým v příčné vazbj a - kPtuQNHCC^^NHCPhe)- jako spojující skupinou.-Leu-Gly as the peptide spacer contained in the crosslink and - to PtuQNHCC (NHCPhe) - as the linking group.
VynálezTe<Qěž zahrnuje syntézu polymerníctjxíéčiv, jak uvedeno v popisu vynálfThe invention also encompasses the synthesis of polymeric drugs as described herein
Protože tentýž oligope>4idický>-£rácer je možno použít jak pro vazbu bioaktivní molekuly^-^ťaí pro vazbu determinantu a příprava těchto sloučejjirfje jednoduš^únež těch, v nichž tyto spacery jsou různ-éfío druhu, nejprve popíšemfe^ftostup syntézy polymerní hg^rrósiče se stejným spacerem. Syntéza probít!á v zásadě ve^-ďVou stupních.Since the same oligomeric radical can be used for both the binding of the bioactive molecule and the binding of the determinant, and the preparation of these compounds is simply less than those in which these spacers are of various kinds, first of all, the process of polymer polymer synthesis. ^ Rigs with the same spacer. In principle, the synthesis proceeds in degrees.
Počáteční stupeň zahrnuje kopolymerizaci HPMA a p-nitrofenyl esteru N-methakryloylovaného oligopeptidu (začlenění N-methakryloyltyrosinamidu je rovněž možné, aby se získala jednotka umožňující radioaktivní značení), čímž se získá polymerní prekurzor, obsahující na peptidických postranních řetězcích koncové p-nitrofenoxyskupiny odštěpující se při následující adiční reakci. Druhý stupeň zahrnuje postupnou adici reaktivního léčiva, reaktivního determinantu a volitelně diaminového sííovadla. Jestliže polymerní nosič léčiva je požadován ve formě jednoduchého řetězce, léčivo a determinant se postupně adují na polymerní prekurzor v libovolném pořadí. Jestliže je požadován sesítěný produkt, pak vhodné sííující činidlo, léčivo a determinant se adují postupně na polymerní prekurzor, opět v libovolném pořadí.The initial step involves the copolymerization of HPMA and the N-methacryloylated oligopeptide p-nitrophenyl ester (incorporation of N-methacryloyltyrosinamide is also possible to obtain a radiolabeling unit) to yield a polymeric precursor containing terminal p-nitrophenoxy end groups cleaving at the peptide side chains following addition reaction. The second step involves the sequential addition of a reactive drug, a reactive determinant, and optionally a diamine crosslinker. If the polymeric drug carrier is desired in the form of a single chain, the drug and the determinant are gradually added to the polymeric precursor in any order. If a crosslinked product is desired, then a suitable cross-linking agent, drug, and determinant are added sequentially to the polymer precursor, again in any order.
Výše uvedený postup je možno znázornit následovně:The above procedure can be illustrated as follows:
HPMA + MAAV- ONpHPMA + MAAV-ONp
KopolymerizaceCopolymerization
ONp = p-nitrofenoxy MA = methakryloyl (Π) = léčivo © = determinant »-ΜΛ*0Νρ >-/W-0NpONp = p-nitrophenoxy MA = methacryloyl (Π) = drug © = determinant »-ΜΛ * 0Νρ> - / W-0Np
1) h2w-i1) h 2 wi
NH,NH,
Produkt 5 jednoduchým rMAr (fp řetězcem Y^Vw-θProduct 5 by simple rMAr (fp chain Y ^ Vw-θ
V případech, kdy léčivo a determinant nemají stejné vazebné jednotky, je možno použít dvou syntetických postupů.In cases where the drug and the determinant do not have the same binding units, two synthetic procedures may be used.
Pro ty případy, kdy vazebné skupiny léčiva a determinantu obsahují společné aminokyselinové zbytky, sousedící s nosičem, polymerní prekurzor obsahující tyto aminokyseliny se postupně nechá reagovat s aminokyselinou nebo peptidylovým derivátem determinantu a volitelně, v případě, že je požadován sesííovaný produkt, s diaminovým sííovadlem.For those cases where the drug and determinant binding groups contain common amino acid residues adjacent to the carrier, the polymer precursor containing these amino acids is sequentially reacted with the amino acid or peptidyl derivative of the determinant and optionally, if a crosslinked product is desired, with a diamine crosslinker.
HPMA + MA-VA-ONpHPMA + MA-VA-ONp
KopolymerizaceCopolymerization
PyV-oNp pW-ONpPyV-oNp pW-ONp
aa2-©aa 2 - ©
H2N~Í I—NH^ AA^H 2 N 1 - NH 4 AA 4
3) AA2O3) AA 2 O
Produkt s jednoduchým řetězcemSingle chain product
Sesítěný produkt j-^ýUAA1- 0 )-W-ΓThe cross-linked product is 1A- 1 -O-W-Γ
V’W-AA1-@V'W-AA 1
AA2- tAA 2 - t
Alternativně lze připravit polymerizovatelnou formu determinantu reakcí N-methakryloyl oligopeptidu obsahujícího požadovanou aminokyselinovou sekvenci s determinantem. Takto modifikovaný determinant se zabuduje do polymerního prekurzoru kopolymerizací. Polymerní prekurzor se potom nechá reagovat s reaktivním léčivem a volitelně, když je požadován zesítěný produkt, s diaminovým sítovadlem.Alternatively, a polymerizable form of a determinant can be prepared by reacting an N-methacryloyl oligopeptide containing the desired amino acid sequence with a determinant. The modified determinant is incorporated into the polymer precursor by copolymerization. The polymer precursor is then reacted with the reactive drug and optionally, when a crosslinked product is desired, with a diamine crosslinker.
Tento postup je možno znázornit následovně.This procedure can be illustrated as follows.
HPMA + MA-VK-ONp + MAO7l~THPMA + MA-VK-ONp + MAO7l-T
Sesítěný produktNetworked product
Je rovněž možné připravit polymerní prekurzory, podobné těm, které jsou popsány výše, ale obsahují peptidické postranní řetězce ukončené nikoliv p-nitrofenyl esterovými skupinami, ale skupinami karboxylovými. V přítomnosti vhodného činidla je možno připojit léčiva a determinanty k těmto polymerním prekurzorům pomocí koncových karboxylových skupin; v tomto případě se během adice uvolňuje hydroxylová a nikoli p-nitrofenoxylová skupina.It is also possible to prepare polymeric precursors similar to those described above, but containing peptide side chains terminated not by p-nitrophenyl ester groups but by carboxyl groups. In the presence of a suitable reagent, drugs and determinants can be attached to these polymeric precursors via terminal carboxyl groups; in this case, the hydroxyl rather than the p-nitrophenoxy group is released during the addition.
Léčiva a determinanty, obsahující reaktivní aminoskupiny, poskytují produkty, identické s těmi, které se získají z polymerních prekurzorů s koncovými p-nitrofenylesterovými skupinami, tj. reaktivní molekula je vázána na postranní řetězec pomocí amidic11 ké vazby. Avšak polymemí prekurzory, obsahující koncové karboxylové skupiny, na rozdíl od prekurzorů, obsahujících koncové p-nitrofenylesterové skupiny, rovněž reagují s léčivy a determinanty obsahujícími reaktivní hydroxyskupiny za vzniku produktů, v nichž reaktivní molekula je vázána na postranní řetězec pomocí esterové vazby.Drugs and determinants containing reactive amino groups provide products identical to those obtained from polymeric precursors with terminal p-nitrophenyl ester groups, i.e., the reactive molecule is bound to the side chain via an amidic bond. However, polymeric precursors containing terminal carboxyl groups, unlike precursors containing terminal p-nitrophenyl ester groups, also react with drugs and determinants containing reactive hydroxy groups to produce products in which the reactive molecule is bound to the side chain via an ester bond.
Polymemí prekurzory s postranními řetězci, ukončenými karboxylovými skupinami, mohou být připraveny (a) zásaditou hydrolý zou odpovídajícího polymerního prekurzoru s postranními řetězci, ukončenými p-nitrofenylesterovými skupinami, jejichž příprava byla popsána výše, (b) kopolymerizací HPMA libovolným syntetickým postupem popsaným výše pro přípravu polymerního prekurzoru s koncovými p-nitrofenylesterovými skupinami, ale s použitím neesterifikovaného N-methakryloylovaného peptidů jako komonomeru Výsledný kopolymer je pak možno reagovat s vhodným léčivem a determinantem .Polymeric side chain terminated polymers can be prepared by (a) basic hydrolysis of the corresponding p-nitrophenyl ester terminated polymeric side chain precursor as described above, (b) copolymerizing HPMA by any of the synthetic procedures described above for the preparation of polymeric precursor with terminal p-nitrophenyl ester groups but using non-esterified N-methacryloylated peptide as a comonomer The resulting copolymer can then be reacted with a suitable drug and determinant.
Metody, s jejichž pomocí je možno připravit polymemí preku zory s postranními řetězci, ukončenými karboxylovými skupinami, je možno znázornit následovně:The methods by which the carboxyl-terminated polymeric side chain precursors can be prepared can be illustrated as follows:
MA-7XT-TMA-7XT-T
-W-OH JW-OH-W-OH J W-OH
- 12 Vhodná činidla pro adici reaktivního léčiva anebo determinantu k polymerním prekurzorům, obsahujícím karboxylové skupiny, zahrnují karbodiimidy, jako například dicyklohexylkarbodiimid v organických rozpouštědlech a N-cyklohexyl-N '-(2-morfoli-Hoethyl)karbodiimid metho-p-toluensulfonát ve vodných roztocích a Woodwardovo činidlo, (N-ethyl-5-fenylisoxazolium-3’-sulfonát).Suitable reagents for addition of a reactive drug or determinant to polymeric precursors containing carboxyl groups include carbodiimides such as dicyclohexylcarbodiimide in organic solvents and N-cyclohexyl-N '- (2-morphol-Hoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate in aqueous solutions and Woodward's reagent, (N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonate).
Poradí, v němž se některé nebo všechny reaktivní determinan ty reaktivního léčiva ° sítující činidlo přidávají k polymerním prekurzorům při použití některého z postupů popsaných výše, není rozhodující. Množství použitých reakčních složek musí ovšem být takové, aby poskytlo požadovaný molární obsah každé komponenty v polymeru v rozmezí, vytčeném výše. Celková molekulová hmotnost je určena polymerizačními podmínkami, zvláště koncentrací iniciá toru, přítomností přenášečů a koncentrací komonomerních p-nitrofenoxyskupin.The order in which some or all of the reactive determinants of the reactive drug crosslinking agent are added to the polymer precursors using any of the methods described above is not critical. However, the amount of reactants used must be such as to provide the desired molar content of each component in the polymer within the range indicated above. The total molecular weight is determined by the polymerization conditions, in particular the initiator concentration, the presence of transporters and the concentration of comonomeric p-nitrophenoxy groups.
Produkty s jednoduchým řetězcem podle vynálezu mají s výhodou molekulovou hmotnost v rozmezí 5 000 až 60 000, výhodněji 20 000 až 40 000; sesítěné produkty výhodně v rozmezí 10 000 až 500'000, výhodněji 30 000 až 400 000.The single chain products of the invention preferably have a molecular weight in the range of 5,000 to 60,000, more preferably 20,000 to 40,000; crosslinked products preferably in the range of 10,000 to 500,000, more preferably 30,000 to 400,000.
Výchozí materiály, potřebné k provedení výše popsaných syntéz, jsou buóto běžně k dostání anebo mohou být připraveny obecnými metodami, známými těm, kdo má zkušenosti v daném oboru.The starting materials required to carry out the above syntheses are either commercially available or can be prepared by general methods known to those skilled in the art.
Peptidické deriváty, potřebné pro kopolymerizaci s N-(2-hydroxypropyDmethakrylamidem (HPMA), mohou tedy být připraveny a kopolymerizace může být uskutečněna následovně:Thus, the peptide derivatives required for copolymerization with N- (2-hydroxypropylmethacrylamide (HPMA)) can be prepared and copolymerization can be carried out as follows:
(i) Komerčně dostupný dipeptiď(obsahující první dva aminokyselinové zbytky požadovaného peptidického spaceru) je N-methakryloylován jak je popsáno například v Makromol. Chem. 177, 2833 (1976Λ (N-methakryloylovaný tyrosinamid pro účely radioaktivního řercWL může být získán stejným způsobem).(i) A commercially available dipeptide (containing the first two amino acid residues of the desired peptide spacer) is N-methacryloylated as described, for example, in Macromol. Chem. 177, 2833 (1976Λ (N-methacryloylated tyrosinamide for radiolabeling purposes can be obtained in the same manner).
(ii) N-methakryloylovaný dipeptid je pak esterifikován p-nitrofenolem jako je popsáno například v Makromol Chem. 178, 2169 (1977). (Methakryloylované p-nitrofenylové estery Leu a Phe, poskytující aminokyselinové spacery vhodné k použití pro determi nant, mohou být připraveny stejným způsobem).(ii) The N-methacryloylated dipeptide is then esterified with p-nitrophenol as described, for example, in Makromol Chem. 178, 2169 (1977). (Methacryloylated p-nitrophenyl esters of Leu and Phe, providing amino acid spacers suitable for use in detentants, can be prepared in the same manner).
(iii) Peptidický řetězec N-methakryloylovaného dipeptidy1-pnitrof enylesterů je pak prodloužen (pokud dipeptid není GlyGly, kdy di-peptid sám je jedním ze spacerů, kterých se dá použít pro vazbu determinant připojením oligopeptidu, obsahujícího potřebné aminokyselinové zbytky, za vzniku požadované peptidické sekvence, jak je popsáno například v Makromol. Chem.(iii) The peptide chain of N-methacryloylated dipeptides of 1-pnitrophenyl esters is then elongated (unless the dipeptide is not GlyGly, where the di-peptide itself is one of the spacer that can be used to bind determinants by attaching an oligopeptide containing the necessary amino acid residues) sequences as described, for example, in Makromol.
182, 1917 (1981).182, 1917 (1981).
(iv) N-methakrylovaný oligopeptid získaný z (iii) může být kopolymerizován a HPMA za vzniku polymerního prekurzoru s postranními řetězci obsahujícími koncové karboxylové skupiny, nebo může být reesterifikován p-nitrofenolem. V druhém případě N-methakryloylovaný peptidy1-p-nitrofenylester může být kopolymerizován s HPMA, jak je popsáno například v J. Polymer Sci., Polymer Symp. 66,15 (1979) nebo pokud léčivo a determinant mají mít různé spacery, může být podroben reakci s determinantem za vzniku M-methakryloylovaného oligopeptidického determinantu a pak kopolymerizován s N-methakryloylovaným esterem s HPMA, jak je popsáno například v Biochem. Biophys. Acta, 757, 518 (1983)(iv) The N-methacrylated oligopeptide obtained from (iii) may be copolymerized with HPMA to form a polymeric side chain precursor containing terminal carboxyl groups, or it may be re-esterified with p-nitrophenol. In the latter case, the N-methacryloylated peptides 1-p-nitrophenyl ester may be copolymerized with HPMA as described, for example, in J. Polymer Sci., Polymer Symp. 66, 15 (1979) or, if the drug and the determinant are to have different spacer, it can be reacted with the determinant to form an M-methacryloylated oligopeptide determinant and then copolymerized with the N-methacryloylated ester with HPMA as described, for example, in Biochem. Biophys. Acta., 757,518 (1983)
Příprava N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu je popsána v Angew. Makromol. Chem. 70, 109 (1978); k vazbě vhodná léčiva a determinanty jsou vesměs komerčně dostupné. Aminokyselinové a peptidylové deriváty léčiv a determinantů mohou být připraveny metodami popsanými v Makromol. Chem. 184, 1997 (1983) a sííovací činidla mohou být připravena, jak je popsáno například v Makromol. Chem. 182, 1899 (1981).The preparation of N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide is described in Angew. Makromol. Chem. 70, 109 (1978); Suitable drugs and determinants for binding are all commercially available. Amino acid and peptidyl derivatives of drugs and determinants can be prepared by the methods described in Makromol. Chem. 184, 1997 (1983) and crosslinking agents may be prepared as described, for example, in Makromol. Chem. 182, 1899 (1981).
Vynález také zahrnuje farmaceutické kompozice, které obsahují nejméně jedno polymerní léčivo podle vynálezu a inertní fyziologicky přípustný nosič. Polymerní léčivo lze podávat perorálně nebo jako injekce, např. intraperitoneálně, intravenózně nebo intramuskulárně.The invention also includes pharmaceutical compositions comprising at least one polymeric drug of the invention and an inert physiologically acceptable carrier. The polymeric drug may be administered orally or as an injection, e.g., intraperitoneally, intravenously, or intramuscularly.
Kterékoliv z běžných složek a aditiv lékových forem je možno v podstatě použít i pro polymerní léčivo podle vynálezu.Any of the conventional ingredients and additives of the dosage forms can in principle also be used for the polymeric drug of the invention.
V případě injekcí se doporučuje použít jako nosiče steri-lní vodná prostředí.In the case of injections, it is recommended to use sterile aqueous media as carriers.
V dalším jsou uvedeny příklady objasňující předmět vynálezu aniž by jej nějak omezovaly.The following are examples which illustrate the invention without limiting it.
Příklady 22 až 35 se týkají biologického zkoušení polymerních léčiv podle vynálezu a jejich analogů a zbývající příklady se týkají syntéz těchto polymerních léčiv.Examples 22 to 35 relate to biological testing of polymeric drugs of the invention and analogs thereof, and the remaining examples relate to the synthesis of these polymeric drugs.
Jak bylo uvedeno, příklady 22 az 35 se týkají biologických zkoušek analogů polymerních léčiv podle tohoto vynálezu, přičemž tyto analogy jsou sloučeniny obsahující znak (s) a v některých případech jeden nebo oba v^Zltelné znaky (d) a (e) sloučenin podle vynálezu, ale obsahují pouze jeden ze znaků (b) a (c) a nikoliv oba. V těchto příkladech byly použity analogy spíše než sloučeniny podle vynálezu, aby mohl být jasněji ukázán vliv změny znaků (b) a (c) jednotlivě.As noted, Examples 22 to 35 relate to biological assays of polymer drug analogs of the invention, wherein the analogs are compounds containing feature (s) and in some cases one or both of the green features (d) and (e) of the compounds of the invention. , but contain only one of characters (b) and (c), and not both. In these examples, analogs were used rather than the compounds of the invention to show more clearly the effect of changing features (b) and (c) individually.
Příklad 1Example 1
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím daunomycin vázaný na tetrapeptidový spacer, galaktozamin vázaný na di peptidový spacer a tyrosinamid vázaný přímo na hlavní řetězec.Preparation of a single chain polymer comprising daunomycin bound to a tetrapeptide spacer, galactosamine bound to a di peptide spacer, and tyrosinamide bound directly to the backbone.
HPMAHPMA
MA-Tyr-NH2 (1)MA-Tyr-NH 2
MA-Gly-Glygalaktózamin (2)MA-Gly-Glygalactosamine (2)
MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3) kopolymerizace ->MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3) copolymerization >
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Gly-galGly-Gly-gal
Gly-Phe-LeuGly-ONp (4) daunomycin ->Gly-Phe-LeuGly-ONp (4) Daunomycin ->
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Gly-GalGly-Gly-Gal
Gly-Phe-Leu-Gly-DNM (5)Gly-Phe-Leu-Gly-DNM
Příprava MA-Tyr-NH2 (1)Preparation of MA-Tyr-NH 2 (1)
MA-Tyr-NH2 byl připraven reakcí 3,4 g (0,017 mol) p-nitrofenylmethakrylátu a 3,0 g (0,017 mol) Tyr-NH2 v dimethylformamidu za míchání reakční směsi při 25 °C po dobu 16 hodin. Po odpařeníMA-Tyr-NH 2 was prepared by reacting 3.4 g (0.017 mol) of p-nitrophenylmethacrylate and 3.0 g (0.017 mol) of Tyr-NH 2 in dimethylformamide with stirring the reaction mixture at 25 ° C for 16 hours. After evaporation
14a rozpouštědla byl viskózní olej smísen se suchým éterem a malým množstvím hydrochinonu. Výtěžek byl 3 g pevné látky (£ Λ. 194 až 6 C; krystalizované z ethanolu). Molární extinkční koeficinet £*280 nm ~ 1,7 · (ethanol).14a of the solvent, the viscous oil was mixed with dry ether and a small amount of hydroquinone. The yield was 3 g of solid (194 194 ° C to 6 ° C; crystallized from ethanol). Molar extinction coefficient? * 280 nm ~ 1.7 · (ethanol).
Příprava MA-Gly-Gly-galaktózaminu (2)Preparation of MA-Gly-Gly-Galactosamine (2)
Do směsi 3,5 g (1,08 . 10~2 mol) MA-Gly-Gly-ONp (p-nitrofe nylesteru methakryloylglycylglycinu) a 2,8 g (1,3 . 10-2 mol) hydrochloridu galaktózaminu v 18 ml dimethylformamidu bylo porna lu přidáno _ 2To a mixture of 3.5 g (1.08, 10 -2 mol) of MA-Gly-Gly-ONp (methacryloylglycylglycine p-nitrophenyl ester) and 2.8 g (1.3.10 -2 mol) of galactosamine hydrochloride in 18 ml Dimethylformamide was added to the porcelain
1,8 ml (1,3 . 10 mol) triethylenaminu a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 16 hodin. Hydrochlorid triethylaminu byl pak odfiltrován a zbytek reakční směsi byl odpařen na viskozní olej. Po přidání ethanolu a ochlazení byl získán surový produkt.1.8 ml (1.3.10 mol) of triethyleneamine and the reaction mixture was stirred at 25 ° C for 16 hours. The triethylamine hydrochloride was then filtered off and the remainder of the reaction mixture was evaporated to a viscous oil. Addition of ethanol and cooling gave the crude product.
Po překrystalizování bylo získáno 1,5 g produktu; f.t. 112 °C (ethanol).After recrystallization 1.5 g of product were obtained; f.t. 112 ° C (ethanol).
Příprava MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3)Preparation of MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3)
Směs obsahující 4,1 g (1,0 . 10’2 mol) MA-Gly-Phe-ONp^připraven podle J. Polym. Sci. 66, 15 (1979)) v 50 ml dioxanu, 2,1 g (1,1 . 10 2 mol) H-leu-Gly-OH v 50 ml vody a 1,8 g (2,2 . 10~2 mol) NaHCO^byla míchána za p.&ko jo vát teploty/po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku, až byl objem směsi jedna čtvrtina původního objemu, a po přidání malého množství inhibitoru (hydrochinonu) byla reakční směs okyselena zředěnou kyselinou chlorovodíkovou na pH 2. Surový produkt byl extrahován do ethylacetátu a vysrážen diethyléterem. Výtěžek byl 74 % MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH; ť.t. 145 až 150 °C. TLC analýza prokázala, že produkt neobsahuje nečistoty, (poznámka: doporučuje se použít pro další reakční krok surový produkt, protože čistá látka během čištění snadno polymerizuje).A mixture containing 4.1 g (1.0.10 < 10 > mol) of MA-Gly-Phe-ON [beta] prepared according to J. Polym. Sci. 66, 15 (1979)) in 50 ml dioxane, 2.1 g (1.1.10 2 mol) H-leu-Gly-OH in 50 ml water and 1.8 g (2.2.10 -2 mol) NaHCO 3 was stirred at room temperature for 48 hours. The solvent was evaporated under reduced pressure until the volume of the mixture was one quarter of the original volume, and after addition of a small amount of inhibitor (hydroquinone) the reaction mixture was acidified with dilute hydrochloric acid to pH 2. The crude product was extracted into ethyl acetate and precipitated with diethyl ether. The yield was 74% MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH; ť.t. Mp 145-150 ° C. TLC analysis showed the product to be free of impurities (Note: it is recommended to use a crude product for the next reaction step, since the pure material readily polymerizes during purification).
MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH byl v množství 4,6 g (1,0 . 10~2 mol) esterifikován p-nitrofenolem (1,1 . 10 mol) v 55 ml THF pomocí dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) (1,1 - 10“2 mol). Po 3 hodinách při 15 °C a 12 hodinách při 25 °C byla odfiltrována dicyklohexylmočovina a zbývající roztok byl odpařen za sníženého tlaku. Zbytek po přidání suchého éteru ztuhnul a po překrystalizování ze směsi aceton-éter (3 : 1) poskytnul MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp ve výtěžku 76 % a v analytické čistotě; t.t. 124 až 8 °C. Analýza na aminokyseliny dala poměr Gly : Leu : Phe 2,0 : 1,0 : 0,99.MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH was 4.6 g (1.0. 10 @ -2 mole) is esterified with p-nitrophenol (1.1. 10 mmol) in 55 mL of THF using dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ( 1.1 - 10 ' 2 mol). After 3 hours at 15 ° C and 12 hours at 25 ° C, dicyclohexylurea was filtered off and the remaining solution was evaporated under reduced pressure. The residue upon addition of dry ether solidified and recrystallized from acetone-ether (3: 1) to give MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp in 76% yield and analytical purity; mp 124-8 ° C. Amino acid analysis gave a Gly: Leu: Phe ratio of 2.0: 1.0: 0.99.
Příprava reaktivního polymerního prekurzoru (4)Preparation of reactive polymer precursors (4)
Kopolymerizace HPMA + MA-Tyr-NH2 (1) + MA-Gly-Gly-galaktózamin (2) + MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OMp (3)HPMA copolymerization + MA-Tyr-NH 2 (1) + MA-Gly-Gly-galactosamine (2) + MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OMp (3)
K roztoku 2,5 g (1,75 . 102 mol) HPMA (92 mol. %), 0,047 g (1,90 . IO4 mol) MA-Tyr-NH2 (1 mol. %) a 0,555 g (9,54 . 104 mol) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5 mol. %) v 25 ml acetonu byl přidán roz- 16 < Ό r 73 > Ci (Λ zTo a solution of 2.5 g (1.75. 10 2 moles) HPMA (92 mol.%), 0.047 g (1.90. IO 4 mol) of MA-Tyr-NH 2 (1 mol.%) And 0.555 g ( 9.54. 10 -4 mol) of MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5 mol.%) in 25 ml acetone was added the decisive 16 <Ό y 73> C (Λ of
C3C3
G '·? > I σ iG '·? > I σ i
Ν»Ν »
N>· rc «X»N> · rc «X»
COWHAT
-J en tok 0,138 g (3,82 . 10”4 mol) MA-Gly-Gly-glaktózaminu (2 mol. %) v 1 ml DMSO. Poté byl přidán roztok 0,153 g azobisisobutyronitrilu ve 3 ml acetonu. Směs byla nalita do ampulí, ampule byly probublány dusíkem a zataveny a směs byla polymerizována při 50°C po dobu 24 hodin. Vysrážený polymer byl oddělen a přečištěn rozpuštěním v methanolu a přesrážením v acetonu. Výtěžek byl 1,9 g (60 %). Produkt obsahoval 4,7 mol. % postranních řetězcůA flow of 0.138 g (3.82, 10 -4 mol) of MA-Gly-Gly-glactosamine (2 mol%) in 1 ml of DMSO. A solution of 0.153 g of azobisisobutyronitrile in 3 ml of acetone was then added. The mixture was poured into ampoules, the vials were purged with nitrogen and sealed, and the mixture was polymerized at 50 ° C for 24 hours. The precipitated polymer was separated and purified by dissolution in methanol and precipitation in acetone. The yield was 1.9 g (60%). The product contained 4.7 mol. % of side chains
-Gly-Phe-Leu-ONp (stanoveno z £274 9,5 . 103 v DMSO) 1,8 mol.-Gly-Phe-Leu-ONp (determined from £ 274 9.5, 10 3 in DMSO) 1.8 mol.
% postranních řetězců -Gly-Gly-galaktózamin (stanoveno pomocí GPC po kyselé hydrolýze) a 1,0 mol._% postranních řetězců -Tyr-NH,. Váhový střed molární hmotnosti ÍL· aminolyzovaného polymeru byí 22 000; stupeň polydisperzity molárních hmotností Mw/Mn= 1,4. (M_ je číselný střed molární hmotnosti).% of the side chains -Gly-Gly-galactosamine (determined by GPC after acid hydrolysis) and 1.0 mol% of the side chains -Tyr-NH 2; The weight average molar mass of the aminolysed polymer was 22,000; molar mass polydispersity M w / M n = 1.4. (M_ is the number-average molar mass).
Příprava polymeru obsahujícího daunomycin (5)Preparation of polymer containing daunomycin (5)
Navázání daunomycinu na polymerní prekurzorBinding of daunomycin to a polymer precursor
Roztok 0,16 g (2,8 . 10“4 mol) hydrochloridu daunomycinu v 1 mol DMSO byl přidán k roztoku 1,0 g kopolymeru (4), jenž obsahoval 2,8 . 10’4 mol reaktivních p-nitrofenoxy skupin, ve 4 ml dimethylsulfoxidu (DMSO). Poté bylo přidáno 0,028 g (2,8 . 104 mol) triethylaminu. Směs byla míchána za teploty místnosti v temnu po dobu 16 hodin, načež bylo po odstranění případného zbytku ONp skupin přidáno 20 /Ul aminopropanolu. Polymer byl vysrážen nalitím reakční směsi po kapkách do 400 ml směsi aceton/diethyléter (9 : 1), sraženina byla odfiltrována, pečlivě promyta acetonem a éterem a vysušena. Polymer byl přečištěn dvojitou gelovou filtrací na Sephadexu LH-20 (2 x 100 cm) s použitím metanolu jako eluentu. Metanol byl odpařen za sníženého tlaku a čistý polymer byl izolován lyofilizací z vodného roztoku. Výtěžek 0,75 g. Polymer obsahoval 3,5 mol. % postranních řetězců ukončených daunomycinem (10,2 hmot. % daunomycinu), 1,8 mol. % postranních řetězců ukončených galaktózaminem (1,8 hmot. % galaktózaminu) a 1 mol. % postranních řetězců Tyr-NH2. Polymer obsahoval méně než 0,1 % nenavázaného daunomycinu vztaženo na množství navázaného daunomycinu.A solution of 0.16 g (2.8. 10 "4 mol) of daunomycin hydrochloride in 1 M DMSO was added to a solution of 1.0 g of copolymer (4), which contained 2.8. 10 < 4 > mol of reactive p-nitrophenoxy groups, in 4 ml of dimethylsulfoxide (DMSO). 0.028 g (2.8.10 4 mol) of triethylamine was then added. The mixture was stirred at room temperature in the dark for 16 hours after which 20 µL of aminopropanol was added after removal of any residual ONp groups. The polymer was precipitated by pouring the reaction mixture dropwise into 400 ml of acetone / diethyl ether (9: 1), the precipitate was filtered off, washed thoroughly with acetone and ether and dried. The polymer was purified by double gel filtration on Sephadex LH-20 (2 x 100 cm) using methanol as eluent. The methanol was evaporated under reduced pressure and the pure polymer was isolated by lyophilization from an aqueous solution. Yield 0.75 g. The polymer contained 3.5 mol. % daunomycin-terminated side chains (10.2 wt.% daunomycin), 1.8 mol. % galactosamine-terminated side chains (1.8 wt.% galactosamine) and 1 mol. % Of the side chains of Tyr-NH second The polymer contained less than 0.1% unbound daunomycin based on the amount of bound daunomycin.
Stanovení nenavázaného daunomycinu: Volný DNM byl stanoven extrakcí ethylacetátem; 1,5 mg polymeru bylo rozpuštěno v 1 ml vody a třepáno se směsí 1 ml pufru (0,2 M Na2CO3/NaHCO3, pH 9,8) a 2 ml ethylacetátu. Organická vrstva byla oddělena, vysušena malým množstvím suchého MgSO4 a koncentrace DNM byla stanovena spektrofotometricky při 485 nm (<£ » 1,0 . 104 v ethylacetátu).Determination of unbound daunomycin: Free DNM was determined by extraction with ethyl acetate; 1.5 mg of the polymer was dissolved in 1 ml of water and shaken with a mixture of 1 ml of buffer (0.2 M Na 2 CO 3 / NaHCO 3 , pH 9.8) and 2 ml of ethyl acetate. The organic layer was separated, dried with a small amount of dry MgSO 4, and the DNM concentration was determined spectrophotometrically at 485 nm (£ 1.0 · 10 4 in ethyl acetate).
Příklad 2Example 2
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím daunomycin a galaktózamin vázané na tetrapeptidový spacer a tyrosinamid vázaný přímo na hlavní polymerní řetězec.Preparation of a single chain polymer comprising daunomycin and galactosamine bound to a tetrapeptide spacer and tyrosinamide bound directly to the main polymer chain.
tyrosinamidtyrosinamide
Gly-Phe-Leu-Gly-ONpGly-Phe-Leu-Gly-ONp
1) Daunomycin1) Daunomycin
2) Galaktózamin φ— tyrosinamid2) Galactosamine H-tyrosinamide
Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin 'Gly-Phe-Leu-Gly-galaktózaminGly-Phe-Leu-Gly-Daunomycin Gly-Phe-Leu-Gly-Galactosamine
Kopolymer HPMA, MA-tyrosinamidu a MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (0,1 g, 2,85 . 105 mol -ONp skupin) byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (0,4 ml) a byl přidán roztok daunomycinhydrochloridu (8,5 mg,A copolymer of HPMA, MA-tyrosinamide and MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (0.1 g, 2.85, 10 5 mol -ONp groups) was dissolved in dimethylsulfoxide (0.4 mL) and a daunomycin hydrochloride solution was added. (8.5 mg,
1,5 . 10’5 mol v dimethylsulfoxidu (0,1 ml) s následným přidáním triethylmainu (1,5 mg, 1,5 . IO”5 mol). Směs byla míchána za teploty místnosti 90 minut a poté byl přidán roztok galaktózaminhydrochloridu (6,5 mg, 3,0 . 105 mol) v dimethylsulf oxidu (0,1 ml) s následným přidáním triethylaminu (3,0 mg, 3,0 . 10“5 mol). Směs byla míchána 16 hodin za teploty místnosti a pak nalita do směsi aceton/diethylester (9:1). Vysrážený polymer byl odfiltrován, důkladně promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymer byl čištěn dialýzou v dialyzační trubici proti zředěné kyselině a poté proti vodě. Čistý polymer byl izolován lyofilizací a obsahoval 2,17 mol. % postranních řetězců ukončených daunomycinem, tj. 7,5 hmot. % aktivního produktu, a 1,8 mol. % postranních řetězců ukončených galaktózaminem, tj. 2,0 hmot. % galaktózaminu.1.5. 10 < 5 > mol in dimethylsulfoxide (0.1 ml) followed by addition of triethylmain (1.5 mg, 1.5 * 10 < -5 > mol). The mixture was stirred at room temperature for 90 minutes and then a solution of galactosamine hydrochloride (6.5 mg, 3.0, 10 5 mol) in dimethylsulfoxide (0.1 mL) was added followed by the addition of triethylamine (3.0 mg, 3.0 10 ( 5 mol). The mixture was stirred at room temperature for 16 hours and then poured into acetone / diethyl ester (9: 1). The precipitated polymer was filtered off, washed thoroughly with acetone and diethyl ether and dried in vacuo. The polymer was purified by dialysis in a dialysis tube against dilute acid and then water. The pure polymer was isolated by lyophilization and contained 2.17 mol. % of daunomycin-terminated side chains, i.e. 7.5 wt. % of active product, and 1.8 mol. % galactosamine-terminated side chains, i.e. 2.0 wt. % galactosamine.
Příklad 3Example 3
Příprava polymeru- s jednoduchým řetězcem obsahujícím daunomycin vázaný na dipeptidový spacer a tyrosinamid vázaný přímo na hlavní polymerní řetězecPreparation of a single chain polymer containing daunomycin bound to a dipeptide spacer and tyrosinamide bound directly to the main polymer chain
HPMAHPMA
MA-Tyr-NH2 MA-Gly-Gly-ONp (6) > kopolymerizace ->MA-Tyr-NH 2 MA-Gly-ONp (6)> copolymerization ->
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Gly-ONp (7) daunomycinGly-Gly-ON? (7) daunomycin
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Gly-DNM (8) p-Nitrofenylester methakryloylglycylglycinu (6) byl připraven podle Makromol. Chem. 177, 2833 (1976). Příprava polymerního prekurzoru byla provedena stejně jako v příkladu l.M w/M = 1,4 (aminolysovaný prekurzor).Gly-Gly-DNM (8) methacryloylglycylglycine p-nitrophenyl ester (6) was prepared according to Makromol. Chem. 177, 2833 (1976). The preparation of the polymer precursor was carried out as in Example 1M w / M = 1.4 (aminolysed precursor).
Příprava polymeru obsahujícího daunomycin (8)Preparation of Daunomycin-containing Polymer (8)
K roztoku 0,50 g polymerního prekurzoru (7) obsahujícíhoTo a solution of 0.50 g of a polymer precursor (7) containing
5,5 mol. % Gly-Gly-ONp postranních řetězců (1,8 . 10^ mol skupin ONp) ve 2 ml DMSO bylo přidáno 0,038 g (1,35 . 10~4 mol) hydrochloridu daunomycinu v 0,3 ml DMSO a poté 0,014 g (1,35 . 10 mol) triethylaminu. Další postup byl stejný jako v příkladu 1. Výtěžek: 0,38 g polymeru, který obsahoval 3,1 mol.% postranních řetězců -Gly-Gly-daunomycin (10,2 htrt- % daunomycinu);5.5 mol. % Gly-Gly-ONp side chains (1.8. 10 ^ mol of ONp groups) in 2 mL of DMSO was added 0.038 g (1.35. 10 -4 mol) of daunomycin hydrochloride in 0.3 ml DMSO and then 0.014 g ( 1.35 (10 mol) of triethylamine. The further procedure was the same as in Example 1. Yield: 0.38 g of polymer which contained 3.1 mol% of side chains -Gly-Gly-daunomycin (10.2 htrt-% daunomycin);
£4θ5 nm = 9800 (H20).? 4? 5 nm = 9800 (H 2 O).
Příklad 4Example 4
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím daunomycin s anti-θ protilátky navázané na tetrapeptidový postranní řetězec a tyrosinamid vázaný přímo na hlavní polymerní řetězec.Preparation of a single chain polymer containing daunomycin with anti-θ antibodies linked to the tetrapeptide side chain and tyrosinamide bound directly to the main polymer chain.
//
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (9)Gly-Phe-Leu-Gly-ONp
Anti - 0 protilátky ->Anti - 0 antibodies ->
vodný pufr, pH 8,0aqueous buffer, pH 8.0
V- Tyr-NH2 daunomycin (- Gly-Phe-Leu-Gly-DNM (- Gly-Phe-Leu-Gly-ONp ) (10)V-Tyr-NH 2 Daunomycin (- Gly-Phe-Leu-Gly-DNM (- Gly-Phe-Leu-Gly-ONp) (10)
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
- Gly-Phe-Leu-Gly-DNM- Gly-Phe-Leu-Gly-DNM
- Gly-Phe-Leu-Gly-anti-0- Gly-Phe-Leu-Gly-anti-0
Ma-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3) byl připraven jak bylo popsáno v příkladu 1 a polymemí prekurzor (9) byl připraven kopolymerizací HPMA a (3) postupem popsaným v příkladu l, Polymemí prekurzor (9) obsahoval 8,0 mol. % Gly-Phe-Leu-Gly-ONp postranních řetězců a l_mol. % Tyr-NH2 . M.. aminolyzovaného prekurzoru (9) = 17 000; My/Mn - 1,3.Ma-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3) was prepared as described in Example 1 and polymeric precursor (9) was prepared by copolymerization of HPMA and (3) according to the procedure described in Example 1, Polymeric precursor (9) contained 8, 0 mol. % Gly-Phe-Leu-Gly-ONp side chains and 1_mol. % Of Tyr-NH second M .. aminolysed precursor (9) = 17,000; My / Mn - 1.3.
Příprava kopolymeru s daunomycinem a volnými reaktivními skupinamiPreparation of a copolymer with daunomycin and free reactive groups
K roztoku 0,31 g polymerního prekurzoru (9) (obsah ONp skupin 1,35 . 10“4 mol) v 1,2 DMSO bylo přidáno 0,028 g (5,1 . 10^ mol) hydrochloridu daunomycinu v 0,1 ml DMSO a 0,0052 g (5 . 10“5 mol) triethylaminu. Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 60 minut a potom nakapána do 400 ml směsi acetonéter (3 : 1), aby se polymer vysrážel. Polymer obsahoval 2,5 mol. % postranních řetězců ukončených daunomycinem a 4,3 mol. % postranních řetězců zakončených nezreagovanou skupinou ONp.To a solution of 0.31 g of polymer precursor (9) (the content of ONp groups of 1.35. 10 "4 mole) in 1.2 of DMSO was added 0.028 g (5.1. 10 ^ mol) of daunomycin hydrochloride in 0.1 ml of DMSO and 0.0052 g (5.10 "5 mol) of triethylamine. The reaction mixture was stirred at room temperature for 60 minutes and then dropped into 400 ml of acetone ether (3: 1) to precipitate the polymer. The polymer contained 2.5 mol. % of side chains terminated by daunomycin and 4.3 mol. % of side chains terminated with an unreacted ONp group.
Vázání anti-0 protilátek na polymer obsahující daunomycin mg kopolymeru popsaného v předchozím odstavci bylo rozpuštěno při 5C v 0,5 ml zředěné chlorovodíkové kyseliny (pH 3,0). Potom bylo přidáno 0,6 ml Sorensenova pufru (pH 8,0) obsahujícího 0,15 M NaCl, načež bylo přikapáno 0,67 ml roztoku protilátek anti-0 v témže pufru (roztok obsahoval 39,5 mg proteinu). Reakce probíhala po dobu 30 minut při 5C. Během následujících 30 minut byla teplota postupně zvýšena na 20C. (Na počátku reakce byl molární poměr reaktivních skupin ONp : NH2 = 1:1a koncentrace makromolekul byla 6,6 hm. %). Po hodině reagování byl přidán roztok 20 ,ul l-aminopropan-2-olu v 0,2 ml Sorensenova pufru (pH 8,0) obsahující 0,15 M NaCl. Po 10 minutách byla reakční směs převedena do Viskingovy dialyzační trubice a dialyzována proti fyziologickému roztoku upravenému fosfátovým pufrem na pH 7,2.Binding of anti-O antibodies to the polymer containing daunomycin mg of the copolymer described in the previous paragraph was dissolved at 5C in 0.5 ml of dilute hydrochloric acid (pH 3.0). 0.6 ml of Sorensen buffer (pH 8.0) containing 0.15 M NaCl was then added, followed by dropwise addition of 0.67 ml of anti-O antibody solution in the same buffer (the solution contained 39.5 mg of protein). The reaction was allowed to proceed for 30 minutes at 5C. Over the next 30 minutes, the temperature was gradually raised to 20 ° C. (At the start of the reaction, the molar ratio of reactive groups ONp: NH 2 = 1: 1 and the concentration of macromolecules was 6.6 wt%). After one hour of reaction, a solution of 20 µL of 1-aminopropan-2-ol in 0.2 ml Sorensen buffer (pH 8.0) containing 0.15 M NaCl was added. After 10 minutes, the reaction mixture was transferred to a Visking dialysis tube and dialyzed against phosphate buffered saline to pH 7.2.
Přiklad 5Example 5
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím puromycin a galaktózamin vázané na tetrapeptidový spacerPreparation of a single chain polymer containing puromycin and galactosamine bound to a tetrapeptide spacer
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Phe-Phe-Leu-ONp (13)Gly-Phe-Phe-Leu-ONp
1. Puromycin>1. Puromycin>
2. galaktózamin2. galactosamine
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Phe-Phe-LeupuromycinGly-Phe-Phe-Leupuromycin
Gly-Phe-Phe-Leugalaktózamin (14)Gly-Phe-Phe-Leugalactosamine (14)
Příprava MA-Gly-Phe-Phe-Leu-ONpPreparation of MA-Gly-Phe-Phe-Leu-ONp
Směs obsahující 4,1 g (1,0 . 102 mol) MA-Gly-Phe-ONp (viz příklad 1) v 50 ml dioxanu a 3,06 g (1,1 . 102 mol, Sigma) H-Phe-Leu-OH v 50 ml dioxanu a 1,85 g NaHCO3 (2,2 . 10“2 mol) v 50 ml vody byla míchána za teploty místnosti po dobu 45 h. Další postup byl podobný jako při přípravě (3) v příkladu 1. Surový produkt MA-Gly-Phe-Leu-OH (výtěžek 51 %) byl esterifikován p-nitrofenolem metodou popsanou v příkladu l. Čistý produkt byl získán v 50 % výtěžku po překrystalizování ze směsi aceton/éter (3 : 9). Analýza na aminokyseliny dala poměr Gly : Phe : Leu =A mixture containing 4.1 g (1.0.10 2 mol) of MA-Gly-Phe-ONp (see Example 1) in 50 ml dioxane and 3.06 g (1.1.10 2 mol, Sigma) H-Phe -Leu-OH in 50 mL dioxane and 1.85 g NaHCO 3 (2.2. 10 -2 mol) in 50 mL water was stirred at room temperature for 45 h. The procedure was similar to preparation (3) in Example 1. The crude product MA-Gly-Phe-Leu-OH (51% yield) was esterified with p-nitrophenol by the method described in Example 1. The pure product was obtained in 50% yield after recrystallization from acetone / ether (3: 9). . Amino acid analysis gave a ratio of Gly: Phe: Leu =
1,0 : 1,98 : 1,0.1.0: 1.98: 1.0.
Příprava polymerního prekurzoru (13)Preparation of polymer precursors (13)
Kopolymerizace HPMA (95 mol. %) s MA-Tyr-NH2 (1 mol. %) a ΜΑ-Gly-Phe-Phe-Leu- ONp (12) (5,0 mol. %) podle postupu popsaného v příkladu 1 poskytla polymerní prekurzor s obsahem 3,0 mol. % postranních řetězců -Gly-Phe-Phe-Leu-ONp s 1,0 mol. % postranních řetězců Tyr-NH2 . Mw - 23 000? f^/Mjj =1,3.Copolymerization of HPMA (95 mol%) with MA-Tyr-NH 2 (1 mol%) and ΜΑ-Gly-Phe-Phe-Leu-ONp (12) (5.0 mol%) according to the procedure described in Example 1 yielded a polymeric precursor containing 3.0 mol. % of side chains -Gly-Phe-Phe-Leu-ONp with 1.0 mol. % Of the side chains of Tyr-NH second M w - 23,000? m / z = 1.3.
Navázání puromycinu a galaktózaminuBinding of puromycin and galactosamine
K roztoku 0,36 g polymerního prekurzoru (13) obsahujícíhoTo a solution of 0.36 g of a polymer precursor (13) containing
6,5 . IO”5 mol ONp skupin v 1,4 ml DMSO byl přidán roztok 0,026 g (4,4 . 10”5 mol) «dihydrochloridu puromycinu v 0,1 ml DMSO a 0,0088 g (8,8 . 10”5 mol) triethylaminu. Po 30 minutách míchání při teplotě místnosti bylo do směsi přidán© 0,094 g (4,4 . 10”5 mol) galaktózaminu a 0,044 g (4,4 . 10“5 mol) triethylaminu. Reakční směs byla míchána 16 hodin a potom bylo přidáno 10 ,ul aminopropanolu.6.5. 10 < 5 > mol of ONp groups in 1.4 ml DMSO was added a solution of 0.026 g (4.4.10 < 5 > mol) of puromycin dihydrochloride in 0.1 ml DMSO and 0.0088 g (8.8, 10 < -5 > ) triethylamine. After 30 minutes stirring at room temperature was added to the mixture © 0.094 g (4.4. 10 "5 mol) of galactosamine and 0.044 g (4.4. 10" 5 mole) of triethylamine. The reaction mixture was stirred for 16 hours and then 10 µL of aminopropanol was added.
Polymer byl okamžitě vysrážen ve 400 ml acetonu, promýt a vysušen. Polymer byl přesrážen z roztoku v metanolu acetonem a přečištěn dialýzou vodného roztoku ve Viskingově dialyzační trubici. Po isolaci produktu lyofilizací bylo získáno 0,265 g polymeru obsahujícího 1,3 mol. % postranních řetězců zakončených puromycinem (j>, 7 hm. % puromycinu; stanoveno pomocí molárního extinkačního koeficientu 272nm = 2>° · 1q4> etan°l) a Ι.θ mol. % postranních řetězců zakončených galaktózaminem (1,0 hm. % galaktózaminu). Čistota produktu, t.j. přítomnost nízkomolekulárního puromycinu, bya kontrolována extrakcí polymeru do ethylenacetátu podle popisu v příkladě 1 a potvrzena GPC na Sephadexu G-15.The polymer was immediately precipitated in 400 ml of acetone, washed and dried. The polymer was precipitated from solution in methanol with acetone and purified by dialysis of the aqueous solution in a Visking dialysis tube. After isolation of the product by lyophilization, 0.265 g of a polymer containing 1.3 moles was obtained. % of puromycin-terminated side chains (>> 7 wt% puromycin; determined using a molar extinction coefficient of 272 nm = 2 > ° · 1q4 > ethane ° l) and Ι.θ mol. % galactosamine-terminated side chains (1.0 wt.% galactosamine). The purity of the product, ie the presence of low molecular weight puromycin, was controlled by extraction of the polymer into ethylene acetate as described in Example 1 and confirmed by GPC on Sephadex G-15.
Příklad 6Example 6
Příprava polymeru s kolchicin vázaný naPreparation of polymer with colchicine bound to
Z-Tyr-NH2 VAla-Val-Ala-ONp ) (16) jednoduchým řetězcem tripeptidový spacer deacetylcolchicin ->Z-Tyr-NH 2 VAla-Val-Ala-ONp) (16) single chain tripeptide spacer deacetylcolchicine ->
obsahujícím deacetyla malé množství Tyr-NH2 ;-Tyr-NH2 /-Ala-Val-Ala-deacetyl) colchicin / (17)containing deacetyla small amounts of Tyr-NH 2 ; -Tyr-NH 2 (-Ala-Val-Ala-deacetyl) colchicine / (17)
Příprava MA-Ala-Val-Ala-ONp (15) g (0,17 mol) alaninu bylo rozpuštěno v 40 ml metanolu a k roztoku bylopři -15 °C pomalu přidáno 20 g thionylchloridu.Preparation of MA-Ala-Val-Ala-ONp (15) g (0.17 mol) alanine was dissolved in 40 ml of methanol and 20 g of thionyl chloride was slowly added to the solution at -15 ° C.
Po 1 hodině za teploty místnosti a 2 h varu byl odstraněn metanol a 12 g Ala-OMe.HCl bylo isolováno pomocí diethyléteru.After 1 hour at room temperature and 2 hours of boiling, methanol was removed and 12 g of Ala-OMe.HCl was isolated with diethyl ether.
Do roztoku 10 g (0,086 mol) valinu a 3,4 g (0,086 mol)To a solution of 10 g (0.086 mol) valine and 3.4 g (0.086 mol)
NaOH ve směsi dioxan - voda (2 : 1) bylo pomalu přidáno při 0 °C za intenzivního míchání 20,5 g (0,094 mol) di-tert-butyldikarbonátu. Reakční směs byla míchána další hodinu při teplotě místnosti, dioxan byl odstraněn za sníženého tlaku a po okyselení směsi na pH 2 až 3 byl získán BOC-Val-OH. Surový produkt sestávající z 18 g viskózního oleje byl získán po odpaření rozpouštědla z ethylacetátového extraktu.NaOH in dioxane-water (2: 1) was slowly added at 0 ° C with vigorous stirring 20.5 g (0.094 mol) of di-tert-butyl dicarbonate. The reaction mixture was stirred for another hour at room temperature, dioxane was removed under reduced pressure, and acidified to pH 2-3 to obtain BOC-Val-OH. The crude product consisting of 18 g of a viscous oil was obtained after evaporation of the solvent from the ethyl acetate extract.
Kondensace BOC-Val-OH s Ala-OMe.HCl byla provedena metodou směsného anhydridu; 12 g (0,055 mol) BOC-Val-OH bylo rozpuštěno '> 40 ml suchého THF a k roztoku ochlazenému na -15 °C bylo přidáno 7,7 g (0,055 mol) Ala-OMe.HCl a 5,6 g (0,055 mol) triethylaminu. Reakční směs byla pak míchána při }-laboratorn-íf teplotě/dalších 16 hodin. THF byl odpařen a produkt byl extrahován ethylacetátem. Rekrystalizace z éteru poskytla 8.1 g analyticky čistého BOC-Val-Ala-OMe, f.t. 138 až 148 °C.The condensation of BOC-Val-OH with Ala-OMe.HCl was carried out by the mixed anhydride method; 12 g (0.055 mol) of BOC-Val-OH were dissolved> 40 ml dry THF and 7.7 g (0.055 mol) of Ala-OMe.HCl and 5.6 g (0.055 mol) were added to the solution cooled to -15 ° C. ) triethylamine. The reaction mixture was then stirred at room temperature for a further 16 hours. The THF was evaporated and the product was extracted with ethyl acetate. Recrystallization from ether gave 8.1 g of analytically pure BOC-Val-Ala-OMe, m.p. 138-148 ° C.
Odstranění BOC skupiny bylo provedeno rozpuštěním 8,1 g BOC-Val-Ala-OMe v 60 ml methanolu a přidáním 20 ml 30 % methanolického HC1. Po 2 hodinách míchání bylo rozpouštědlo odpařeno a byl isolován surový HC1.Val-Ala-OMe.Removal of the BOC group was accomplished by dissolving 8.1 g of BOC-Val-Ala-OMe in 60 mL of methanol and adding 20 mL of 30% methanolic HCl. After stirring for 2 hours, the solvent was evaporated and crude HCl-Val-Ala-OMe was isolated.
N-methakryloylalanin byl připraven Schotten-Baumanovou acylací. Kondensace MA-Ala-OH (5,35 g; 0,034 mol) s HCl.Val-Ala-OMe (8,1 g) byla provedena v dimethylformamidu pomocí dicyklohexylkarbodiimidu (7,0 g) v přítomnosti triethylaminu (3,4 g). Rekrystalizací z CH2C12 (s přídavkem penthanu) bylo získánoN-methacryloylalanine was prepared by Schotten-Bauman acylation. Condensation of MA-Ala-OH (5.35 g; 0.034 mol) with HCl. Val-Ala-OMe (8.1 g) was carried out in dimethylformamide with dicyclohexylcarbodiimide (7.0 g) in the presence of triethylamine (3.4 g) . Recrystallization from CH 2 C1 2 (with addition of isopentane) afforded
9,5 g MA-Ala-Val-Ala-OMe.9.5 g of MA-Ala-Val-Ala-OMe.
g MA-Ala-Val-Ala-OMe bylo hydrolyzováno v methanolu s malým přebytkem 2N BaOH a po odstranění metanolu okyseleno kyselinou citrónovou na pH 3; 4 g surového produktu bylo použito v následující reakci.g of MA-Ala-Val-Ala-OMe was hydrolyzed in methanol with a small excess of 2N BaOH and acidified with citric acid to pH 3 after removal of methanol; 4 g of crude product was used in the next reaction.
Z 3,6 g MA-Ala-Val-Ala-OH (0,012 mol), 1,5 g (0,012 mol) p-nitrofenolu a 2,5 g (0,0125 mol) dicyklohexylkarbodiimidu v 50 ml tetrahydrofuranu bylo připraveno 2,0 g (výtěžek 40 %) MA-Ala-Val-Ala-ONp; ťr.t. 174 až 6 °C, který byl překrystalizován z ethylacetátu/hexanu. Molární extinkční koeficient χ» ^274 nmFrom 3.6 g of MA-Ala-Val-Ala-OH (0.012 mol), 1.5 g (0.012 mol) of p-nitrophenol and 2.5 g (0.0125 mol) of dicyclohexylcarbodiimide in 50 ml of tetrahydrofuran were prepared 2, 0 g (40% yield) MA-Ala-Val-Ala-ONp; ťr.t. 174-6 ° C, which was recrystallized from ethyl acetate / hexane. Molar extinction coefficient χ ^ 274 nm
9300 (DMSO).9300 (DMSO).
Příprava ^e/y*»*z-z»Mc?prekurzoruPreparation of a Mc precursor
Kopolymerizace HPMA (95 mol. %), MA-Tyr-NH2 (1 mol. %) a MA-Ala-Val-Ala-ONp (4 mol. %) poskytla polymerní prekurzor, který obsahoval 2,9 mol. % postranních řetězců s ONp skupinami.Copolymerization of HPMA (95 mol%), MA-Tyr-NH 2 (1 mol%) and MA-Ala-Val-Ala-ONp (4 mol%) yielded a polymer precursor containing 2.9 mol. % of side chains with ONp groups.
Mw = 27 000; Mw/Mn = 1,4 (stanoveno pro aminolyzovaný prekurzor).M w = 27,000; M w / M n = 1.4 (determined for aminolysed precursor).
Směs deacetylkolchicinu a isodeacetylkolchicinu byla připravena reakcí trimethylkolchicinové kyseliny s diazomethanem známým postupem (Biochemistry 25, 2463 (1966)).A mixture of deacetylcolchicine and isodeacetylcolchicine was prepared by reacting trimethylcolchicine acid with diazomethane according to a known method (Biochemistry 25, 2463 (1966)).
Vázání deacetylkolchicinuDeacetylcolchicine binding
K roztoku 0,41 g polymerního prekurzoru (16), obsahujícího 4,0.10 mol ONp skupin, v 1,6 ml DMSO bylo přidáno 0,021 g (6,0.10 mol) deacetylkolchicinu v DMSO. Směs byla míchána po dobu 20 hodin za teploty místnosti v temnotě a potom byl polymer vysrážen v acetonu. Přečištění bylo provedeno ultrafiltrací (membrána UM-02) ve vodě s 20 % methanolu. Polymerní produkt byl isolován lyofilizací a obsahoval 2,7 mol. % postranních řetězců ukončených deacetylkolchicinem. (Vypočítáno z molárního extinkčního koeficientu £To a solution of 0.41 g polymer precursor (16) containing 4.0.10 mol ONp groups in 1.6 ml DMSO was added 0.021 g (6.0.10 mol) deacetylcolchicine in DMSO. The mixture was stirred for 20 hours at room temperature in the dark and then the polymer was precipitated in acetone. Purification was performed by ultrafiltration (membrane UM-02) in water with 20% methanol. The polymer product was isolated by lyophilization and contained 2.7 mol. % of deacetylcolchicine-terminated side chains. (Calculated from the molar extinction coefficient.
1,6.104 (ethanol)).1.6.10 4 (ethanol)).
350 nm350 nm
Příklad 7Example 7
Příprava větveného polymeru obsahujícího daunomycin a galaktózamin připravený následnou aminolýzouPreparation of branched polymer containing daunomycin and galactosamine prepared by subsequent aminolysis
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (18)Gly-Phe-Leu-Gly-ONp
Tyr-NH2 Tyr-NH 2
Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycinGly-Phe-Leu-Gly-Daunomycin
Gly-Phe-Leu-Gly-galGly-Phe-Leu-Gly-gal
H(Phe)-NH(CH2)6NH-(Phe)H daunomycin galaktozamin (-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-NH(CH2)ÓNH-Phe-Gly-Leu-Phe-Gly ?H (Phe) -NH (CH 2) 6 -NH- (Phe) H daunomycin galactosamine (-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-NH (CH 2) NH-Phe-Gly-Leu-Phe-Gly?
( · (19)(19)
Polymerní prekurzor (18) byl připraven kopolymerizací HPMA (90 mol. %), MA-Tyr-NH2 (1 mol. %), a MA-Gly-Phe-Leu-GlyONp (9,0 mol. %). Polymerní prekurzor (18) obsahoval 8,0 mol. % postranních řetězců ukončených skupinami ONp. Mw = 17 000;Polymer precursor (18) was prepared by copolymerization of HPMA (90 mol%), MA-Tyr-NH 2 (1 mol%), and MA-Gly-Phe-Leu-GlyONp (9.0 mol%). The polymer precursor (18) contained 8.0 mol. % of side chains terminated by ONp groups. M w = 17,000;
Mw/Mn = 1,3 (stanoveno pro aminolyzovaný prekurzor). M w / M n = 1.3 (determined for aminolysed precursor).
0,2 g polymerního prekurzoru (18) (8,0 mol. % postranních řetězců obsahujících skupiny ONp) v 0,8 ml DMSO (9,8.10-^ mol ONp) bylo přidáno k roztoku 0,0045 g (1,1.10^ mol) N,N’-bis(H-Phe)hexamethylendiaminu v 0,2 ml DMSO. Směs byla míchána trusihoST/' za jpe-ke jovcý teplotyppo 5 minut a potom bylo postupně přidáno 0,036 g (6,3.10“^ mol) hydrochloridu daunomycinu rozpuštěného v 0,3 ml DMSO a 0,0064 g (6,3.10-5 mol) triethylaminu. Směs byla míchána po dobu 60 minut a poté byl přidán roztok hydrochloridu galaktózaminu (0,018 g; 8,5 . 10-5 mol) a triethylamin (0,0086 g;0.2 g of polymer precursor (18) (8.0 mol% of side chains containing ONp groups) in 0.8 ml of DMSO (9.8.10 - ? Mol ONp) was added to a solution of 0.0045 g (1.1.10? mol) N, N'-bis (H-Phe) hexamethylenediamine in 0.2 mL DMSO. The mixture was stirred at room temperature for 5 minutes and then 0.036 g (6.3 x 10 -4 mol) of daunomycin hydrochloride dissolved in 0.3 ml of DMSO and 0.0064 g (6.3 x 10 -5 mol) were gradually added. ) triethylamine. The mixture was stirred for 60 minutes and then a solution of galactosamine hydrochloride (0.018 g; 8.5, 10 -5 mol) and triethylamine (0.0086 g;
8,5 . IQ-5 mol). Směs byla míchána po dalších 16 hodin a polymer v8.5. 10 -5 mol). The mixture was stirred for an additional 16 hours and the polymer in
byl vysrážen ée acetonu. Polymer byl přečištěn nejprve gelovou filtrací s použitím Sephadexu LH-20 a metanolu a poté dialysou ve Viskinsově dialyzační trubici proti vodě. Čistý polymer byl isolován lyofilizací. Polymerní produkt obsahoval 2,8 mol. % postranních řetězců zakončených daunomycinem (7,8 hm. % daunomycinu stanoveno z £435 nm = 9,8 · 105 v DMSO) a 3,9 mol. % postranních řetězců zakončených galaktózaminem. Výtěžek polymeru 0,15 g;was precipitated with acetone. The polymer was purified by first gel filtration using Sephadex LH-20 and methanol and then by dialysis in a Viskins dialysis tube against water. Pure polymer was isolated by lyophilization. The polymer product contained 2.8 mol. % daunomycin-terminated side chains (7.8 wt.% daunomycin determined from? 435 nm = 9.8 · 10 5 in DMSO) and 3.9 mol. % galactosamine-terminated side chains. Polymer yield 0.15 g;
M,, = 110 000: M,,/M„ = 4,0 (M,, aminolyzovaného prekurzoru byla W W Π w J r 1 M ,, = 110,000: M ,, / M '= 4.0 (M ,, aminolysed precursor was WW Π w J r 1
000; Mw/Mn = 1,3).000; M w / M n = 1.3).
Příklad 8Example 8
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím bleomycin s Tyr-Nf^ tyrosinamidPreparation of a single chain polymer containing bleomycin with Tyr-Nf-tyrosinamide
ÍTyr-NH? S-Tyr-Nl·^ bleomycin (Et-NH? S-Tyr-Nl · Bleomycin (
Gly-Leu-Gly-ONp -AGly-Leu-Gly-bleomycin (20) / (21)Gly-Leu-Gly-ONp -AGly-Leu-Gly-Bleomycin (20) / (21)
Methakryloylglycylleucylglycin p-nitrofenylester byl připraven postupem popsaným v příkladě 6 pro sloučeninu (15).The methacryloylglycylleucylglycine p-nitrophenyl ester was prepared as described in Example 6 for compound (15).
Polymerní prekurzor byl získán kopolymerizaci HPMA (94 mol. %),The polymer precursor was obtained by copolymerization of HPMA (94 mol%),
MA-Tyr-NHz (1 mol. %) a MA-Gly-Leu-Gly-ONp (5 mol. %). Polymerní prekurzor (20) obsahoval 4,3 mol. % postranních řetězců zakončených skupinami ONp.MA-Tyr-NH 2 (1 mol%) and MA-Gly-Leu-Gly-ONp (5 mol%). The polymer precursor (20) contained 4.3 mol. % of side chains terminated by ONp groups.
K roztoku 0,137 g prekurzoru (20) (3,8 . 10 mol skupinTo a solution of 0.137 g of precursor (20) (3.8. 10 mol groups)
ONp) v 0,55 ml dimethylsulfoxidu byl přidán roztok 0,047 g (3,8 . 10-5 mol) sulfátu bleomycinu a 0,0038 g (3,8 . 10-5 mol) triethylaminu v 0,3 ml DMSO. Reakčni směs byla míchána po dobu hodin a polymer byl poté isolován přídavkem 20 /ul aminopropav ' nolu a vysrážením 4θ- acetonu. Po dvou dnech dialýzy za použití Viskingovy trubice byl polymer lyofilizován. Výtěžek 0,102 g.ONp) in 0.55 ml of dimethyl sulfoxide was added a solution of 0.047 g (3.8, 10 -5 mol) of bleomycin sulfate and 0.0038 g (3.8, 10 -5 mol) of triethylamine in 0.3 ml of DMSO. The reaction mixture was stirred for hours and the polymer was then isolated by adding 20 µL of aminopropanol and precipitating 4θ-acetone. After two days of dialysis using a Visking tube, the polymer was lyophilized. Yield 0.102 g.
Polymerní produkt obsahoval 3,1 mol. % postranních řetězců ukončených bleomycinem (stanoveno kinetickým měřením koncentrace ONp skupin) .The polymer product contained 3.1 mol. % of bleomycin-terminated side chains (determined by kinetic measurement of ONp group concentration).
Příklad 9Example 9
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím hormon stimulující melanocyty (MSH) navázaný na dipeptidový spacerPreparation of a single chain polymer containing melanocyte stimulating hormone (MSH) linked to a dipeptide spacer
VGly-Gly-ONp MSH ý-Gly-Gly-MSH ? (22) ) (23)VGly-Gly-ONp MSH? -Gly-Gly-MSH? (22)
K roztoku 0,20 g polymerního prekurzoru (22) (5,0 mol. % Gly-Gly-ONp), který obsahoval 6,6 . 10-^ mol ONp skupin, v 0,8 ml DMSO byl přidán roztok 0,005 g (3,0 . 10-^ mol) hormonu stimulujícího melanocyty v 0,3 ml DMSO. Po 16 hodinách míchání bylo přidáno 10 /Ul aminopropanolu a polymerní produkt byl vysrážen v acetonu. Po přečištění pomocí dialýzy a lyofilizace byl produkt analyzován na obsah vázaného MSH. Polymerní produkt (23) obsahoval 1,3 hm. % MSH (stanoveno spektroskopicky·, pro 0,347 mg/ml MSH ve vodě je A^^nm ~ l’^)Příklad 10To a solution of 0.20 g of polymer precursor (22) (5.0 mol% Gly-Gly-ONp) containing 6.6. 10 - moles of ONp groups, in 0.8 ml of DMSO a solution of 0.005 g (3.0, 10 - moles) of melanocyte stimulating hormone in 0.3 ml of DMSO was added. After stirring for 16 hours, 10 µL of aminopropanol was added and the polymer product was precipitated in acetone. After purification by dialysis and lyophilization, the product was analyzed for bound MSH content. The polymer product (23) contained 1.3 wt. % MSH (determined spectroscopically, for 0.347 mg / ml MSH in water is λmax) -1 Example 10
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím desferioxamin vázaný na tetrapeptidový spacer (-Tyr-NH2 ýTyr-NH2 ( desferioxamin (Preparation of a single chain polymer containing desferioxamine bound to a tetrapeptide spacer (-Tyr-NH 2 γTyr-NH 2 (desferioxamine (
VGly-Phe-Leu-Gly-ONp _S-Gly-Phe-Leu-Gly/ ' ) desferioxamin (24) > (25)VGly-Phe-Leu-Gly-ONp (S-Gly-Phe-Leu-Gly) desferioxamine (24)> (25)
Polymerní prekurzor (24) obsahující 4,3 mol. % postranních s ONp skupinami (0,20 g; 5,3 . 10^ mol ONp skupin) byl rozpuštěn v 0,8 ml DMSO a bylo k němu přidáno 0,070 g (1,06 . 10-4 mol) desferioxaminu a 0,011 g (1,06 . 10^ mol)triethvlaminu v 0,2 ml hťfíhotf·'Polymer precursor (24) containing 4.3 mol. % Of side groups having ONp (0.20 g, 5.3. 10 ^ mol of ONp groups) was dissolved in 0.8 mL DMSO was added thereto 0.070 g (1.06. 10 -4 mol) and 0.011 g desferrioxamine (1.06. 10 .mu.mol) triethylamine in 0.2 ml.
DMSO. Po 16 hodinách míchání za |pkffjovó| teploty /byl polymerníDMSO. After stirring for 16 hours under stirring temperature was polymeric
-Tyr-NH2 • Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (26)-Tyr-NH2 • Gly-Phe-Leu-Gly-ONp
1. bestatin1. bestatin
2. galaktózamin >2. galactosamine>
produkt vysrážen v 200 ml acetonu. Přečištění bylo provedeno dialýzou ve vodě obsahující 20 % metanolu pomocí Viskingovy dialyzační trubice.product precipitated in 200 ml acetone. Purification was performed by dialysis in water containing 20% methanol using a Visking dialysis tube.
Obsah desferioxaminu byl počítán z kinetických měření, kterým se stanoví obsah ONp skupin v reakční směsi. Polymerní produkt obsahoval 3,9 mol. % postranních řetězců s vázaným desferioxaminem (12,4 hm. % desferioxaminu).The desferioxamine content was calculated from kinetic measurements to determine the content of ONp groups in the reaction mixture. The polymer product contained 3.9 mol. % desferioxamine-bound side chains (12.4 wt.% desferioxamine).
Příklad 11Example 11
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím bestatin a galaktózamin vázané na tetrapeptidový spacerPreparation of a single chain polymer containing bestatin and galactosamine bound to a tetrapeptide spacer
Tyr-Nl·^Tyr-Nl
Gly-Phe-LeuGyl-bestatin Gly-Phe-LeuGly-gal (27)Gly-Phe-LeuGyl-Bestatin Gly-Phe-LeuGly-Gal (27)
0,150 g polymerního prekurzoru (18), jež obsahoval 6.8 . 10~5 mol ONp skupin, bylo rozpuštěno v 0,6 ml DMSO a byl přidán roztok 0,030 g (1,3 . 10'4 mol) galaktózaminu a 0,014 g (1,3 . 10~4 mol) triethylaminu v 0,2 ml OMSO. Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 16 hodin, produkt byl vysrážen v 200 ml acetonu a čištěn dialýzou po dobu 3 dnů. Lyofilizovaný produkt (0,111 g) byl analyzován na obsah galaktózaminu (viz příklad 1). Množství navázaného bestatinu bylo vypočítáno z kinetických měření sledováním množství ONp skupin v reakční směsi. Polymerní produkt (27) obsahoval 1,4 mol. % postranních řetězců ukončených bestatinem (2,4 hm. % bestatinu) a 5,4 mol. % postranních řetězců ukončených galaktózaminem (5,5 hm. % galaktózaminu).0.150 g of polymer precursor (18) containing 6.8. 10 ~ 5 mol of ONp groups was dissolved in 0.6 ml DMSO and a solution of 0.030 g (1.3. 10 -4 mol) of galactosamine and 0.014 g (1.3. 10 -4 mol) of triethylamine in 0.2 ml OMSO. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours, the product was precipitated in 200 ml of acetone and purified by dialysis for 3 days. The lyophilized product (0.111 g) was analyzed for galactosamine content (see Example 1). The amount of bound bestatin was calculated from kinetic measurements by monitoring the amount of ONp groups in the reaction mixture. The polymer product (27) contained 1.4 mol. % of bestatin side chains (2.4 wt.% bestatin) and 5.4 mol. % galactosamine-terminated side chains (5.5 wt.% galactosamine).
Příklad 12Example 12
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím adriamycin a manosamin vázané na tetrapeptidový spacerPreparation of a single chain polymer containing adriamycin and mannosamine bound to a tetrapeptide spacer
ÍTyr-NH2 1.adriamycin l-Tyr-N^1-Tyr-NH 2 1.adriamycin 1-Tyr-N 2
Gly-Leu-Leu-Gly-ONp 2.mannosamin Í-Gly-Leu-Leu-Gly-> / adriamycin (28) hGly-Leu-Leu-Gly/mannosamine (29)Gly-Leu-Leu-Gly-ONp 2.mannosamine-Gly-Leu-Leu-Gly-> / adriamycin (28) hGly-Leu-Leu-Gly / mannosamine (29)
Methakryloylglycylleucylglycin p-nitrofenylester byl připraven podobným postupem jako sloučenina (3) v příkladě 1.The methacryloylglycylleucylglycine p-nitrophenyl ester was prepared in a similar manner to compound (3) in Example 1.
Polymerní prekurzor (28) byl připraven kopolymerizací HPMA (89,5 mol. %), Ma-Tyr-NH2 (1 mol. %) a MA-Gly-Leu-Leu-Gly-ONp (9,5 mol. %). Polymer obsahoval 8,1 mol. % tetrapeptidových postranních řetězců ukončených skupinami ONp. Mw = 17 000;Polymer precursor (28) was prepared by copolymerization of HPMA (89.5 mol%), Ma-Tyr-NH 2 (1 mol%) and MA-Gly-Leu-Leu-Gly-ONp (9.5 mol%). The polymer contained 8.1 moles. % of tetrapeptide side chains terminated with ONp groups. M w = 17,000;
Mw/Mn = 1,3 (stanoveno pro aminolyzovaný prekurzor).M w / M n = 1.3 (determined for aminolysed precursor).
Polymerní produkt (29) byl připraven z 0,4 g polymerního prekurzoru (28) obsahujícího 1,8 . 10-4 mol skupin ONp a rozpuštěného v 1,6 ml OMSO. K roztoku bylo přidáno 0,06 g (1,1 . IO-4, mol) triethylaminu. Následující postup byl tentýž jako v příkladě 1. Polymerní produkt obsahoval 3,2 mol. % postranních řetězců obsahujících adriamycin (9,6 hm. % adriamycinu) a 4,1 mol. % postranních řetězců obsahujících manosamin. Výtěžek byl 0,31 g. Obsah sacharidových zbytků byl stanoven po kyselé hydrolýze pomocí GPC s použitím známé metody (Anal. Biochem. 73, 532 (1976))The polymer product (29) was prepared from 0.4 g of polymer precursor (28) containing 1.8. 10 -4 mol of ONp groups and dissolved in 1.6 ml of OMSO. To the solution was added 0.06 g (1.1, 10 -4, mol) of triethylamine. The following procedure was the same as in Example 1. The polymer product contained 3.2 mol. % of adriamycin-containing side chains (9.6 wt.% adriamycin) and 4.1 mol. % of mannosamine-containing side chains. The yield was 0.31 g. The content of carbohydrate residues was determined after acid hydrolysis by GPC using a known method (Anal. Biochem. 73, 532 (1976))
Příklad 13Example 13
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím bleomycin navázaný na tripeptidový spacerPreparation of a single chain polymer containing bleomycin bound to a tripeptide spacer
Gly-Phe-Tyr-ONp (30) bleomycinGly-Phe-Tyr-ONp (30) bleomycin
Gly-Phe-Tyr-bleomycin (31)Gly-Phe-Tyr-Bleomycin (31)
Reaktivní monomer MA-Gly-Phe-Tyr-rONp a polymerní prekurzor (30) byly připraveny podle Makromol. Chem. 182, 799 (1981). Polymerní prekurzor obsahoval 8,5 mol. % postranních řetězců s ONp skupinami. M/Mn = 1,3 (stanoveno pro aminolyzovaný prekurzoř) .The reactive monomer MA-Gly-Phe-Tyr-rONp and the polymer precursor (30) were prepared according to Makromol. Chem. 182, 799 (1981). The polymer precursor contained 8.5 mol. % of side chains with ONp groups. M / M n = 1.3 (determined for aminolysed precursor).
Vázání bleomycinu na polymerní prekurzor bylo provedenc podle procedury popsané v příkladě 8. Polymerní produkt (31) obsahoval 5,7 mol. % postranních řetězců s bleomycinem.Binding of bleomycin to the polymer precursor was performed according to the procedure described in Example 8. The polymer product (31) contained 5.7 moles. % of side chains with bleomycin.
Příklad 14Example 14
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím puromycin s fukosylamin vázané na tripeptidový spacer >Gly-Phe-Phe-0Np 1. puromycin ÍGly-Phe-Phe-puromycin ' 2. f ucosylamine f-Gly-Phe-Phe-f ucosyla< mine (32) / (33)Preparation of a single-chain polymer containing puromycin with fucosylamine bound to a tripeptide spacer> Gly-Phe-Phe-0Np 1. Puromycin I-Gly-Phe-Phe-puromycin ' ) / (33)
Reaktivní monomer MA-Gly-Phe-ONp a polymerní prekurzor (32) byly připraveny podle Makromol. Chem. 182, 799 (1981). Polymerní prekurzor obsahoval 12,9 mol. % postranních řetězců s ONp skupinami. M = aminolyzovaného prekurzoru bylo 14 000; M /M„ = 1,28. K roztoku 0,25 g polymerního prekurzoru (32) (1,64.10 mol skupin ONp) v 1 ml DMSO byl přidán roztok 0,029 g (4,9 . 10~5 mol) dihydrochloridu puromycinu. a 0,010'g (9,8 .. 10~5 mol) triethylaminu v 0,25 ml DMSO. Reakce probíhala po dobu 1 hodiny a potom bylo do směsi přidáno 0,015 g (9,0 . 10~5 mol) fukosylaminu v 0,1 ml DMSO). Následující postup byl podobný postupu popsaném v příkladě 5. Polymerní produkt (33) obsahoval 4,1 mol. % postranních řetězců ukončených puromycinem a 6,7 mol. % postranních řetězců ukončených fukosylaminem.MA-Gly-Phe-ONp reactive monomer and polymer precursor (32) were prepared according to Makromol. Chem. 182, 799 (1981). The polymer precursor contained 12.9 moles. % of side chains with ONp groups. M = aminolysed precursor was 14,000; M / M + = 1.28. To a solution of 0.25 g of polymer precursor (32) (1.64.10 moles of ONp groups) in 1 ml of DMSO was added a solution of 0.029 g (4.9, 10 -5 moles) of puromycin dihydrochloride. and 0,010'g (9.8 .. 10 ~ 5 mol) of triethylamine in 0.25 ml DMSO. The reaction was allowed to proceed for 1 hour and then 0.015 g (9.0, 10 -5 mol) of fucosylamine in 0.1 ml DMSO was added to the mixture. The following procedure was similar to that described in Example 5. The polymer product (33) contained 4.1 mol. % puromycin-terminated side chains and 6.7 mol. % fucosylamine-terminated side chains.
Příklad 15Example 15
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím transferin vázaný na dipeptidový spacer j-Gly-Gly-ONp transferin V-Gyl-Gly-transferin ) (34) > ) (35)Preparation of a single chain polymer containing transferrin coupled to a dipeptide spacer j-Gly-Gly-ONp transferrin V-Gyl-Gly-transferrin) (34)>) (35)
27, 4 mg polymerního prekurzoru (34), jenž obsahoval 11,4 mol. % postranních řetězců Gly-Gly-ONp^ bylo rozpuštěno v 0,25 ml zředěné chlorovodíkové kyseliny (pH 3,0). Bylo přidáno 1,25 mo Sórensenova pufru (pH 8) obsahujícího 0,1 M NaCl a poté roztok 14,2 mg transferinu v 0,5 ml téhož pufru. Po 45 minutách bylo ke směsi přidáno 10 ^ul l-amino-2-propanolu rozpuštěného v 0,2 ml Sérensenova pufru. Po 30 minutách byla rakce zastavena a směs byla převedena do Viskingovy dialyzační turbice a dialyzována proti fyziologickému roztoku s fosfátovým pufrem (pH 7,2)27.4 mg of polymer precursor (34) containing 11.4 mol. % of the Gly-Gly-ONβ side chains were dissolved in 0.25 ml of dilute hydrochloric acid (pH 3.0). 1.25 molar Sorensen buffer (pH 8) containing 0.1 M NaCl was added followed by a solution of 14.2 mg transferrin in 0.5 ml of the same buffer. After 45 minutes, 10 µl of 1-amino-2-propanol dissolved in 0.2 ml of Serensen buffer was added to the mixture. After 30 minutes, the reaction was stopped and the mixture was transferred to a Visking dialysis turbine and dialyzed against phosphate buffered saline (pH 7.2).
Příklad 16Example 16
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím IgG vázaný na dipeptidový spacer ^-Gly-Gly-OH _IgG_j_Gyl-Gyl-IgGPreparation of a Single Chain Polymer Containing IgG Bound to a Dipeptide spacer? -Gly-Gly-OH-IgG-i-Gyl-Gyl-IgG
Kopolymer HPMA a MA-Gly-Gly-OH (15,0 mg; 5,0 . 106 mol COOH skupin) byl rozpuštěn v Sefrensenově pufru s pH 5 (75 ^ul) a při teplotě 1 °C byl přidán roztok 0,002 mg N-cyklohexylN'-(2-morfolinoethyl)-karbodiimidu v témž pufru (40 /ul). Směs byla míchána po 15 minut a potom k ní bylo pomalu přidáno 60,0 mg IgG ve 235 ^ul téhož pufru. Směs byla dále míchána po 5 hodin a ponechána stát přes noc při 4 °C. Surová reakční směs byla dialyzována proti fyziologickému roztoku s fosfátovým pufrem (pH 7,2).A copolymer of HPMA and MA-Gly-Gly-OH (15.0 mg, 5.0. 10 -6 mol COOH) was dissolved in Sefrensenově buffer pH 5 (75 .mu.l), and at 1 ° C was added a solution of 0.002 mg N-cyclohexyl N '- (2-morpholinoethyl) -carbodiimide in the same buffer (40 µl). The mixture was stirred for 15 minutes and then 60.0 mg of IgG in 235 µl of the same buffer was slowly added. The mixture was further stirred for 5 hours and allowed to stand overnight at 4 ° C. The crude reaction mixture was dialyzed against phosphate buffered saline (pH 7.2).
Příklad 17Example 17
Příprava větveného polymeru obsahujícího puromycin a galaktózamin vázané na tripeptidový spacerPreparation of a branched polymer comprising puromycin and galactosamine bound to a tripeptide spacer
Gly-Phe-Tyr-ONp (36)Gly-Phe-Tyr-ONp
1. H-Ala-Gly-HN(CH2)6NH-Gly-Ala-HH-Ala-Gly-HN (CH 2 ) 6 NH-Gly-Ala-H
2. puromycin2. puromycin
3. galaktózamin3. galactosamine
->->
Gly-Phe-Tyr-puromycinGly-Phe-Tyr-puromycin
Gly-Phe-Tyr-galGly-Phe-Tyr-gal
Gly-Phe-Tyr-Ala-Gly-KN(CH2)éNH-Gly-Ala-Tyr-Phe-Gly (37)Gly-Phe-Tyr-Ala-Gly-CN (CH 2) s -NH-Gly-Ala-Tyr-Phe-Gly (37)
Polymerní prekurzor (36) obsahující 4,8 mol. % postranních řetězců se skupinami ONp byl připraven podle Makromol. Chem. 182, 1899 (1981).Polymer precursor (36) containing 4.8 mol. % of side chains with ONp groups were prepared according to Makromol. Chem. 182, 1899 (1981).
2,0 g polymerního prekurzoru (36), jenž obsahoval 5,9 mol skupin ONp býlo rozpuštěno v 8 ml DMSO a postupně byl přidán roztok 0,038 g (9,8 . 10-5mol)dihydrochloridu 1,2-bis(alanylglycylamino)ethanu v 0,2 ml DMSO a 0,020 g (2,0 . 10-4 mol) triethyl aminu. Po 20 minutovém míchání byl k reakční směsí přidán roztok 0,120 g (2 . 10 4 mol) dihydrochloridu puromycinu v 1 ml DMSO a mol) triethylaminu. Po hodinovém míchání ,-4 a 0,040 g (4 reakční směsi byl přidán roztok' 0,129 g (6,0 . 10_Η mol) hydrochloridu galaktózaminu a 0,060 g (6,0 . 10 4 mol) triethylaminu v 1 ml DMSO. Směs byla míchána dalších 16 hodin při ;poko-jov4f teplotělr Produkt byl isolován a přečištěn jak bylo popsáno v příkladu 5. Produkt obsahoval 1,5 mol. % postranních řětězců zakončených galaktózaminem.2.0 g of polymer precursor (36) containing 5.9 moles of ONp groups was dissolved in 8 ml of DMSO and a solution of 0.038 g (9.8.10 -5 mol) of 1,2-bis (alanylglycylamino) dihydrochloride was gradually added. of ethanol in 0.2 ml of DMSO and 0.020 g (2.0, 10 -4 mol) of triethylamine. After stirring for 20 minutes, a solution of 0.120 g (2.10 4 mol) puromycin dihydrochloride in 1 ml DMSO and 1 mol triethylamine was added to the reaction mixtures. After stirring for an hour, -4 and 0.040 g (4 reaction mixtures) was added a solution of 0.129 g ( 6.0.10 10 mol) of galactosamine hydrochloride and 0.060 g ( 6.0.10 4 mol) of triethylamine in 1 ml of DMSO. The product was isolated and purified as described in Example 5. The product contained 1.5 mol% of galactosamine-terminated side chains.
Příklad 18Example 18
Příprava větveného polymeru obsahujícího puromycin a fukosylamin vázané na tripeptidový spacerPreparation of a branched polymer containing puromycin and fucosylamine bound to a tripeptide spacer
-Gly-Phe-Phe-ONp (38)-Gly-Phe-Phe-ONp
1. H-Gly-HN(CH2)6NH-Gly-HH-Gly-HN (CH 2 ) 6 NH-Gly-H
2. puromycin2. puromycin
3. fucosylamin •Gly-Phe-Phe-puromycin3. fucosylamine • Gly-Phe-Phe-puromycin
-Gly-Phe-Phe-fucosylamin •Gly-Phe-Phe-Gly-HN(CH2)6NH-Gly-Phe-Phe-Gly(36)-Gly-Phe-Phe-fucosylamin • Gly-Phe-Phe-Gly-HN (CH 2) 6 NH-Gly-Phe-Gly (36)
Polymerní prekurzor (38) obsahující 4,8 mol. % postranních řetězců se skupinami ONp byl připraven podle Makromol. Chem.Polymer precursor (38) containing 4.8 mol. % of side chains with ONp groups were prepared according to Makromol. Chem.
182, 1899(1981).182, 1899 (1981).
2,0 g polymerního prekurzoru (38) obsahujícího 5,9 . 10'4 mol skupin bylo rozpuštěno v 8 ml DMSO a k roztoku byl postupně přidán roztok 0,029 g (9,8 . 10’^ mol) 1,2-bis(glycylamino)ethan diacetátu v 0,2 ml DMSO, připravený podle Makromol. Chem. 182,2.0 g of polymer precursor (38) containing 5.9. 10 ' 4 mol groups were dissolved in 8 ml DMSO and a solution of 0.029 g (9.8.10 10 mol) 1,2-bis (glycylamino) ethane diacetate in 0.2 ml DMSO, prepared according to Makromol, was gradually added. Chem. 182,
1899 (1981), a 0,020 g (2,0 . 10 mol) triethylaminu. Sííování bylo prováděno po dobu 5 minut. Do směsi bylo potom přidáno1899 (1981), and 0.020 g (2.0.10 mol) of triethylamine. Crosslinking was performed for 5 minutes. The mixture was then added
0,120 g (2,0 . 10~4 mol) dihydrochloridu puromycinu v 1 ml DMSO -4 a 0,040 g (4 . 10 mol) triethylaminu. Reakční směs byla míchána 16 hodin při pokojová teplotě/ Produkt byl isolován a přečištěn podle postupu popsaného v příkladě 5. Produkt obsahoval 1,4 mol. % postranních řetězců zakončených puromycinem (4,2 hm. % puromycinu) a 3,0 mol. % postranních řetězců zakončených fukosylaminem.0.120 g (2.0.10-4 mol) puromycin dihydrochloride in 1 ml DMSO -4 and 0.040 g (4.10 mol) triethylamine. The reaction mixture was stirred at room temperature for 16 hours. The product was isolated and purified according to the procedure described in Example 5. The product contained 1.4 mol. % puromycin-terminated side chains (4.2 wt.% puromycin) and 3.0 mol. % fucosylamine-terminated side chains.
Příklad 19Example 19
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím daunomycin vázaný na tetrapeptidový spacer a galaktózu vázanou přímo na polymerní řetězecPreparation of a single chain polymer containing daunomycin bound to a tetrapeptide spacer and galactose bound directly to the polymer chain
GalGal
Gly-Phe-Leu-Gly-ONp daunomycin (40)Gly-Phe-Leu-Gly-ONp Daunomycin (40)
GalGal
Gly-Phe-Leu-Glydaunomycin (41)Gly-Phe-Leu-Glydaunomycin
Příprava polymerního prekurzoru (40)Preparation of polymer precursors (40)
Ve 13,0 ml dimethylsulfoxidu bylo rozpuštěno 0,71 g (5. 10-^ mol) l,2,3,4-di-0-isopropyliden-6-0-methakryloyl-tif-D-galaktopyranózy (připravené podle 0. Chem. Soc. (London) C, 1913 (1986)).In 13.0 ml of dimethyl sulfoxide was dissolved 0.71 g (5 to 10 - ^ mole) of l, 2,3,4-di-0-isopropylidene-6-0-methacryloyl-tif-D-galactopyranose (prepared according to the 0th Chem. Soc. (London) C, 1913 (1986)).
K tomuto roztoku bylo přidáno 3 mg azobisisobutyronitrilu (1,8 . 10-4 mol) v 1,8 ml dimethylsulfoxidu a nato 291 mg MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5 . 10-4 mol) v 1 ml DMSO, jenž byl připraven podle metody popsané v příkladě 1. Směs byla probublána dusíkem a potom polymerizována v zatavené ampuli při 60 °C po 30 hodin.To this solution was added 3 mg of azobisisobutyronitrile (1.8.10 -4 mol) in 1.8 ml of dimethylsulfoxide, followed by 291 mg of MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5.10 -4 mol) in 1 ml. DMSO, prepared according to the method described in Example 1. The mixture was purged with nitrogen and then polymerized in a sealed vial at 60 ° C for 30 hours.
Výsledný polymer byl přesrážen éterem a deacetonován rozpuštěnímThe resulting polymer was precipitated with ether and deacetonated by dissolution
HtfelheS Tř · v 80% vodné kyselině mravenčí po 20 hodin při fcoltejová teplotě/ Výtěžek polymerního prekurzoru po odpaření mravenčí kyseliny byl 1,2 g; obsah skupin ONp byl 9,5 mol. % a obsah galaktózy byl 52 mol. %.HtfelheS Three times in 80% aqueous formic acid for 20 hours at folate temperature / yield of polymer precursor after evaporation of formic acid was 1.2 g; the content of ONp groups was 9.5 mol. % and the galactose content was 52 mol. %.
Vázání daunomycinu na polymerní prekurzor (40)Binding of daunomycin to a polymer precursor (40)
V 1,6 ml DMSO bylo rozpuštěno 374 mg (1,6 . 10-4 mol) polymerního prekurzoru (40) a k roztoku bylo přidána 50 mg (8 . 10”5 mol) hydrochloridu daunomycinu v 0,3 ml DMSO a 0,0111 ml (8 . 10-5 inoj|.^triethylaminu. Reakční směs byla míchána při ftoleg jovat teplotěÓO minut. Potom bylo přidáno 20 ^ul aminopropanolu a produkt byl ihned vysrážen v 200 ml acetonu.· Sraženina byla rozpuštěna v metanolu a polymerní frakce byla oddělena na 100 x 2,5 cm koloně se Sephadexem LH-20 promyté metanolem.In 1.6 ml of DMSO, 374 mg (1.6. 10 -4 mol) of polymer precursor (40) was dissolved, and 50 mg (8. 10 -5 mol) of daunomycin hydrochloride in 0.3 ml of DMSO was added to the solution. 0111 ml (8.10 -5 Inoj |. ^ triethylamine. the reaction mixture was stirred at ftoleg jovat teplotěÓO minutes. After addition of 20 .mu.l aminopropanol and the product immediately precipitated in 200 ml of acetone. · the precipitate was dissolved in methanol and the polymer fraction was separated on a 100 x 2.5 cm Sephadex LH-20 column washed with methanol.
Výtěžek byl 0,28 g; obsah tetrapeptidových postranních řetězců zakončených daunomycinem byl 3,5 mol. %.The yield was 0.28 g; the content of daunomycin-terminated tetrapeptide side chains was 3.5 mol. %.
Příklad 20Example 20
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím isopropylester melfalanu vázaný na tripeptidový spacer a galaktózu vázanou přímo na hlavní řetězec (-AcGalaktóza )-Gly-Phe-0Np (42)Preparation of a Single Chain Polymer Containing a Melphalan Isopropyl ester Bound to a Tripeptide spacer and a Backbone Galactose (-AcGalactose) -Gly-Phe-0Np (42)
Glycylmelíalan isopropylester (Gly-Me-ipe)Glycylmelialan isopropyl ester (Gly-Me-ipe)
AcGalaktózaAcGalactose
Gly-Phe-Gly-Me-ipe (43) kyselina mravenčíGly-Phe-Gly-Me-ipe (43) Formic acid
->->
GalaktózaGalactose
Gly-Phe-Gly-Me-ipe (44)Gly-Phe-Gly-Me-ipe
Příprava isopropylesteru melfalanu (Me-ipe)Preparation of isopropyl ester of melphalan (Me-ipe)
Roztok 5 g melfalanu v 20 % HC1 v isopropylalkoholu byl vařen 5 hodin pod zpětným chladičem. Po ochlazení v chladničce byly izolovány bílé krystaly analyticky čistého produktu a vysušeny ve vakuu; t.t. 200 až 201 °C. Roztok Me-ipe v 50 ml diethyléteru byl probubláván NH^ 3 hodiny; rozpouštědlo bylo potom odpařeno a olejovitý produkt byl použit v dalším stupni syntézy.A solution of 5 g melphalan in 20% HCl in isopropyl alcohol was refluxed for 5 hours. After cooling in a refrigerator, white crystals of analytically pure product were isolated and dried in vacuo; m.p. 200 DEG-201 DEG. A solution of Meipe in 50 mL of diethyl ether was bubbled through NH 4 for 3 hours; the solvent was then evaporated and the oily product used in the next step of the synthesis.
Příprava isopropylesteru glycylmelfalanu (Gly-Me-ipe)Preparation of glycyl melphalan isopropyl ester (Gly-Me-ipe)
Gly-Me-ipe byl připraven reakcí 3,03 g BOC-Gly-OH s 6,0 g Me-ipe v 50 ml tetrahydrofuranu s použitím DCC metody. Chránící skupina BOC byla odstraněna v 15% metanolickém HC1 a volná fáze byla připravena probubláváním suspenze Gly-Me-ipe hydrochloridu v diethylétheru amoniakem. Chlo-rid amonný byl odfiltrován a olejovitý produkt byl isolován po odpaření rozpouštědla.Gly-Meipe was prepared by reacting 3.03 g of BOC-Gly-OH with 6.0 g Meipe in 50 ml of tetrahydrofuran using the DCC method. The BOC protecting group was removed in 15% methanolic HCl, and the free phase was prepared by bubbling a suspension of Gly-Meipipe hydrochloride in diethyl ether with ammonia. The ammonium chloride was filtered off and the oily product was isolated after evaporation of the solvent.
Příprava polymerního prekurzoru (42)Preparation of polymer precursors (42)
Polymerní prekurzor (42) byl připraven radikálovou srážecí kopolymerizací DCM (1,2,3,4-di-0-isopropyliden-6-0-methakryloyl-ť£-D-galaktopyranózy) a p-nitrofenylesteru methakryloylglycylphenylalaninu (MA-Gly-Phe-ONp) (připraven dle Makromol. Chem.Polymer precursor (42) was prepared by radical precipitation copolymerization of DCM (1,2,3,4-di-O-isopropylidene-6-O-methacryloyl-β-D-galactopyranose) and methacryloylglycylphenylalanine p-nitrophenyl ester (MA-Gly-Phe) -ONp) (prepared according to Makromol. Chem.
178, 2169 (1977) podle postupu popsaného v příkladě 1.178, 2169 (1977) according to the procedure described in Example 1.
Polymerační směs: HPMA 3,43 (85 mol. %)Polymerization mixture: HPMA 3.43 (85 mol%)
MA-Gly-Phe-ONp 0,926 g (8 mol. %)MA-Gly-Phe-ONp 0.926 g (8 mol%)
DGM 0,65 g (7 mol. %) azobisisobutyronitril 0,24 gDGM 0.65 g (7 mol%) azobisisobutyronitrile 0.24 g
Polymerizace byla prováděna 24 hodin při 50 °C v 44 ml acetonu.The polymerization was carried out for 24 hours at 50 ° C in 44 ml of acetone.
Vázání Gly-Me-ipe na polymemí prekurzor (42)Gly-Me-ipe Binding to Polymer Precursor (42)
Ve 20 ml dimethylsulfoxidu byly rozpuštěny 3 g polymerního prekurzoru (42) a k roztoku bylo přidáno 0,816 g Gly-Me-ipe.3 g of polymer precursor (42) were dissolved in 20 ml of dimethyl sulfoxide and 0.816 g of Gly-Meipe was added.
Směs byla míchána zateploty místnosti 3 dny a polymer byl potom vysrážen v acetonu a dvakrát přesrážen z metanolu do směsi acetonu a diethyléteru (1 : 1). Chráněná galaktóza vázaná na polymerním nosiči byla deacetonylována v 80 % kyselině mravenčí (viz příklad 19) a polymemí léčivo bylo isolováno lyofilizací a přesrážením z metanolu do směsi aceton - diethyléter (1 : 1). Výtěžek polymeru 2,9 g. Obsah léčiva vázaného na polymerním nosiči (Isopropylesteru melfalanu): 106 mg/g polymeru (vypočítáno z elementární analýzy po odečtení obsahu chloru). Molekulová hmotnost polymerního nosiče: Mw = 35 000. Nepřítomnost nízkomolekulárních látek (volného léčiva) byla prokázána GPC· s použitím Sephadexu G-25 jako náplně kolon.The mixture was stirred at room temperature for 3 days and the polymer was then precipitated in acetone and precipitated twice from methanol into a 1: 1 mixture of acetone and diethyl ether. Protected polymer-bound galactose was deacetonylated in 80% formic acid (see Example 19), and the polymeric drug was isolated by lyophilization and reprecipitation from methanol to acetone-diethyl ether (1: 1). Polymer yield 2.9 g. Content of drug bound to polymeric carrier (Isopropyl ester of melphalan): 106 mg / g polymer (calculated from elemental analysis minus the chlorine content). Molecular weight of polymer carrier: M w = 35,000. The absence of low molecular weight substances (free drug) was demonstrated by GPC · using Sephadex G-25 as a column pack.
Příklad 21Example 21
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem obsahujícím isopropylester melfalanu vázaný na tetrapeptidový spacer a galaktózu vázanou na hlavní řetězecPreparation of a Single Chain Polymer Containing a Melphalan Isopropyl ester Bound to a Tetrapeptide spacer and a Backbone Galactose
AcGalaktózaAcGalactose
Gly-Phe-ONpGly-Phe-ONp
Leucylglycylmelfalan isopropylester (Leu-Gly-Me-ipe)Leucylglycyl melphalan isopropyl ester (Leu-Gly-Me-ipe)
AcGalaktózaAcGalactose
Gly-Phe-Leu-Gly-Me-ipe (43) kyselina mravenčíGly-Phe-Leu-Gly-Me-ipe (43) Formic acid
-} /-Galaktóza í-Gly-Phe-Leu-Gly-Galactose-Gly-Phe-Leu-Gly
Me-ipe (46)Me-ipe (45)
Příprava isopropylesteru leucylglycylmelfalanuPreparation of leucylglycyl melphalan isopropyl ester
V 35 ml THF bylo reagováno 3,1 g BOC-Leu-Gly-OH s 3,7 g Me-ipe s použitím DCC metody. Produkt BOC-Leu-Gly-Me-ipe byl krystalizován z acetonu. Chránící skupina BOC byla odstraněna probubláváním amoniaku pres suspenzi hydrochloridu v diethylétheru. Čistý olejovitý produkt byl izolován po oddělení chloridu amonného a odpaření rozpouštědla. Polymerní prekurzor (42) byl připraven metodou popsanou v příkladě 20.In 35 mL of THF, 3.1 g of BOC-Leu-Gly-OH was reacted with 3.7 g of Meipe using the DCC method. BOC-Leu-Gly-Me-ipe was crystallized from acetone. The BOC protecting group was removed by bubbling ammonia through a suspension of hydrochloride in diethyl ether. The pure oily product was isolated after separation of ammonium chloride and evaporation of the solvent. The polymer precursor (42) was prepared by the method described in Example 20.
Vázání isopropylesteru leucylglycylmelfalanu na polymerní prekurzorBinding of leucylglycyl melphalan isopropyl ester to a polymer precursor
Reakce byla provedena postupem podobným jako v příkladě 18. K roztoku 1,5 g polymerního prekurzoru (42) v 10 ml DMSO bylo přidáno 0,5 g Leu-Gly-Me-ipe a směs byla míchána 3 dny. Polymer (45) byl vysrážen v směsi aceton - diethyléther (1 : 1) a dvakrát přesrážen z metanolu do téže směsi. Deacetonylace galaktózy a izolace a charakterizace polymeru (46) byly provedeny způsobem popsaným v příkladě 18. M polymerního nosiče 35 000; obsah léčiva (isopropylesteru melfalanu vázaného na polymer): 118 mg/g polymeru. Nepřítomnost volného léčiva byla kontrolována GPC (Sephadex G-25).The reaction was carried out in a manner similar to Example 18. To a solution of 1.5 g of polymer precursor (42) in 10 ml of DMSO was added 0.5 g of Leu-Gly-Meipe and the mixture was stirred for 3 days. Polymer (45) was precipitated in acetone-diethyl ether (1: 1) and precipitated twice from methanol into the same mixture. Galactose deacetonylation and polymer isolation and characterization (46) were performed as described in Example 18. M polymeric carrier 35,000; drug content (polymer bound isopropyl ester of melphalan): 118 mg / g polymer. The absence of free drug was controlled by GPC (Sephadex G-25).
Příklad 22 až 25Examples 22 to 25
Vliv různých peptidových spacerů na účinnost téhož léčivaEffect of different peptide spacers on the efficacy of the same drug
Příklad 22Example 22
Vliv na aktivitu 11210 myší leukemie in vitroEffect on 11210 mouse leukemia activity in vitro
Tyto pokusy byly provedeny se třemi analogy HPMS, které neobsahovaly specifické determinanty. Všechny tři analogy obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní část a peptidový spacer k léčivu podle bodu (b). V detailu vypadaly analogy takto :These experiments were performed with three HPMS analogs that did not contain specific determinants. All three analogs contained daunomycin as the biologically active moiety and peptide spacer to the drug of (b). In detail, the analogues looked like this:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Gly-daunomycin (b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (c) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Phe-Leu-daunomycin.(a) HPMA with -Gly-Gly-Daunomycin (b) HPMA with -Gly-Phe-Leu-Gly-Daunomycin (c) HPMA with -Gly-Phe-Phe-Leu-Daunomycin.
Myší leukemie L1210 byla uchovávána jako suspenzní kultura v mediu RPMI 40 obsahujícím 10 % koňského séra inaktivovaného teplem. Za těchto podmínek trvá zdvojení počtu buněk 15 až 20 hodin při hustotě buněk až přibližně 1 . 10^ buněk/ml. Hustoty buněk byly stanoveny pomocí Coulter počítače.L1210 mouse leukemia was stored as a suspension culture in RPMI 40 medium containing 10% heat inactivated horse serum. Under these conditions, doubling the number of cells takes 15 to 20 hours at a cell density of up to about 1. 10 µl cells / ml. Cell densities were determined using a Coulter counter.
Při hodnocení cytotoxicity polymerního léčiva buňky byly nasazeny do 10 ml zkumavek a byla měřena počáteční hustota buněk. Různá polymerní léčiva byla přidána v různých koncentracích a buňky byly uchovávány v kultivační komoře po dalších 72 hodin před dalším měření hustoty buněk.When evaluating the cytotoxicity of the polymer drug, the cells were seeded in 10 ml tubes and the initial cell density was measured. Various polymeric drugs were added at different concentrations and cells were stored in the culture chamber for a further 72 hours before further cell density measurements.
Počet buněk nalezených ve zkumavkách obsahujících polymerní léčivo byl vyjádřen jako procento buněk nalezených ve zkumavkách inkubovaných po stejnou dobu (72 h) bez přídavku léčiva.Výsledky jsou znázorněny graficky v obrázku 1 přiložených výkresů, v němž jsou vyneseny křivky procentického růstu buněk proti končen traci daunomycinu v /ug/ml. Výsledky ukazují, že všechny tři ana logy byly cytotoxické vůči myší leukémii L1210 in vitro do jisté míry, ale analogy (b) a (c) vykazovaly lepší inhibiční efekt než analog (a).The number of cells found in tubes containing polymeric drug was expressed as the percentage of cells found in tubes incubated for the same time (72 h) without drug addition. The results are shown graphically in Figure 1 of the accompanying drawings, which shows the percent cell growth curves versus daunomycin termination. in / µg / ml. The results show that all three analogs were cytotoxic to murine L1210 leukemia in vitro to some extent, but analogs (b) and (c) showed a better inhibitory effect than analogue (a).
Příklad 23Example 23
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vitroEffect on L1210 mouse leukemia activity in vitro
Experimenty byly provedeny s třemi HPMA analogy neobsahujícími specifické determinanty. Všechny tři analogy obsahovaly sar kolysin (melfalan-ipe) jako biologicky aktivní část a peptidové spacery k léčivu podle bodu (b).Tyto analogy byl zkoušeny v detailním složení:The experiments were performed with three HPMA analogs not containing specific determinants. All three analogs contained sar colysin (melphalan-ipe) as the biologically active moiety and peptide spacers to the drug of (b). These analogs were tested in a detailed composition:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Leu-Gly-sarkolysin;(a) HPMA with the substituents -Gly-Leu-Gly-sarcolysin;
(b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-sarkolysin;(b) HPMA with the substituents -Gly-Phe-Leu-Gly-sarcolysin;
(c) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Gly-sarkolysin.(c) HPMA with -Gly-Phe-Gly-sarcolysin substituents.
Postup experimentu byl stejný jako v příkladě 22.The experiment procedure was the same as in Example 22.
Výsledky jsou znázorněny graficky v obrázku 2 připojených výkresů, v němž křivky představují závislosti procentického růstu buněk na koncentraci sarkolysinu v yug/ml. Výsledky ukazují, že všechny tři analogy byly do jisté míry cytotoxické vůči myší leukémii L1210 in vitro, avšak analog (c) měl podstatně lepší inhibiční účinek než analogy (a) a (b), které při nízkých končen· tracích stimulovaly růst.The results are shown graphically in Figure 2 of the accompanying drawings in which the curves represent the dependence of the percent cell growth on the sarcolysin concentration in yug / ml. The results show that all three analogs were somewhat cytotoxic to murine L1210 leukemia in vitro, but analog (c) had a significantly better inhibitory effect than analogs (a) and (b), which stimulated growth at low concentrations.
- 37 Příklad 24- 37 Example 24
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vivoEffect on L1210 mouse leukemia activity in vivo
Následující experimenty byly provedeny se dvěma HPMA analogy, které neobsahovaly specifické determinanty; obě látky měly jednoduchý řetězec a obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást a peptidové spacery podle bodu (b). Detailní struktura analogů byla následující:The following experiments were performed with two HPMA analogs that did not contain specific determinants; both compounds had a single chain and contained daunomycin as a biologically active component and the peptide spacers according to (b). The detailed structure of the analogs was as follows:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (b) HPMA se substituenty -Gly-Gly-daunomycin.(a) HPMA with -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin substituents (b) HPMA with -Gly-Gly-daunomycin substituents.
Myší leukemie L1210 byla naočkována (105 živých buněk) xntraperitonálně myším DBA2 ve dni nula. Kopolymery HPMA byly podávány ve dnech 1. 2. a 3. Bylo zaznamenáno přežití všech zvířat. Kontrolní (neléčená) zvířata uhynula vždy mezi 15. a 20. dnem. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce.L1210 mouse leukemia was inoculated (10 5 viable cells) x-terraperitonally to DBA 2 mice at day zero. HPMA copolymers were administered on days 1, 2 and 3. Survival of all animals was noted. Control (untreated) animals always died between day 15 and day 20. The results are summarized in the table.
Tabulka 1Table 1
Z tabulky 1 je zřejmé, že přežití zvířat se neprodloužilo při podávání analogu (b). Oproti tomu, zvířata léčená analogem (a) přežívala znatelně déle a značná část jich přežila dlouhodobě.It can be seen from Table 1 that animal survival was not prolonged when analog (b) was administered. In contrast, animals treated with analogue (a) survived significantly longer and a significant proportion of them survived in the long term.
Příklad 25Example 25
Vliv na rychlost uvolňování léčiva in vitroEffect on drug release rate in vitro
Byly připraveny dva HPMA analogy s jednoduchým řetězcem, které neobsahovaly specifické determinanty. Oba analogy obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást vázaný na konci peptidického spaceru. Detailní složení analogů bylo:Two single-chain HPMA analogs were prepared that did not contain specific determinants. Both analogs contained daunomycin as a biologically active moiety bound at the end of the peptide spacer. The detailed composition of the analogs was:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Phe-Leu-daunomycin.(a) HPMA with -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (b) HPMA with -Gly-Phe-Phe-Leu-daunomycin.
Každý analog (25 mg v 1,5 ml) byl inkubován s 1 ml roztoku enzymu při 37 °C. Enzymový roztok obsahoval přečištěný lysosomální enzym kathepsin L (3,8 . 10“? mol/1) v fosfátovém pufru (pH 6,0) obsahujícím 5 mM glutationu a 1 mM EDTA.Each analog (25 mg in 1.5 ml) was incubated with 1 ml enzyme solution at 37 ° C. The enzyme solution contained purified lysosomal enzyme cathepsin L (3.8, 10 µM) in phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM glutathione and 1 mM EDTA.
Uvolňování léčiva bylo měřeno v různých časových intervalech extrakcí při odpovídající vlnové délce. Vzorky inkubační směsi (0,15 ml) byly odebírány a přidány k 1,5 ml pufru (pH 9,8) a 1,5 ml ethylacetátu. Po pěti minutách intensivního třepání byl odebrán vzorek (1 ml) ethylacetátové vrstvy a extinkce byla měřena při 485 nm.Drug release was measured at various time intervals by extraction at the corresponding wavelength. Samples of the incubation mixture (0.15 mL) were collected and added to 1.5 mL of buffer (pH 9.8) and 1.5 mL of ethyl acetate. After five minutes of vigorous shaking, a sample (1 mL) of the ethyl acetate layer was taken and the extinction was measured at 485 nm.
Výsledky jsou graficky znázorněny v obrázku 3 připojených výkresů, v němž jsou vyneseny křivky množství uvolněného analogu v procentech původně přítomného léčiva proti času v hodinách. Výsledky ukazují, že rychlost uvolňování daunomycinu je podstatně vyšší byl-li použit jako spacer léčiva -Gly-Phe-Leu-Gly-, než byl-li použit -Gly-Phe-Phe-Leu-.The results are shown graphically in Figure 3 of the accompanying drawings, in which the curves of the amount of analog released in percent of the initially present drug versus time in hours are plotted. The results show that the release rate of daunomycin is significantly higher when -Gly-Phe-Leu-Gly- was used as a spacer than -Gly-Phe-Phe-Leu-.
Příklad 26 až 28Examples 26 to 28
Vliv různých léčiv, které mají stejné peptidové spaceryEffect of different drugs having the same peptide spacers
Příklad 26Example 26
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vitro'Effect on In vitro L1210 Mouse Leukemia Activity
Experimenty byly prováděny se čtyřmi HPMA analogy, které neobsahovaly determinanty; všechny látky měly jednoduchý řetězec a obsahovaly různá léčiva. Spacery všech čtyř léčiv byly v souhlase s vynálezem: dvě měly spacery -Gly-Phe-Leu-Gly- a dvě spacery -Gly-Leu-Phe-. Detailní složení analogů bylo:The experiments were performed with four HPMA analogs that did not contain determinants; all substances had a single chain and contained different drugs. The spacers of all four drugs were in accordance with the invention: two had -Gly-Phe-Leu-Gly- and two -Gly-Leu-Phe- spacers. The detailed composition of the analogs was:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin a tyrosinamid (b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-puromycin a tyrosinamid (c) HPMA se substituenty -Gly-Leu-Phe-sarkolysin a (d) HPMA se substituenty -Gly-Leu-Phe-tritylcystein.(a) HPMA with -Gly-Phe-Leu-Gly-Daunomycin and Tyrosinamide (b) HPMA with -Gly-Phe-Leu-Gly-Puromycin and Tyrosinamide (c) HPMA with -Gly-Leu-Phe-Sarkolysin and (d) HPMA with -Gly-Leu-Phe-tritylcysteine substituents.
Experimentální postup byl tentýž jako v příkladě 22. Výsledky jsou graficky znázorněny v obrázku 4 připojených výkresů, v němž jsou křivky získané vynesením procent buněk, které přežívaly po 72 hodinách proti koncentraci polymerního léčiva v mg/ml. Výsledky, ukazují, že do jisté míry jsou všechny čtyři polymerní léčiva cytotoxická vůči leukémii L1210 in vitro, ale že daunomycin s peptidovou vazbou byl podstatně účinnější než puromycin a tritylcystein byl mírně účinnější než sarkolys in.The experimental procedure was the same as in Example 22. The results are shown graphically in Figure 4 of the accompanying drawings, in which the curves are obtained by plotting the percentage of cells that survived after 72 hours against the polymer drug concentration in mg / ml. The results show that to some extent all four polymeric drugs are cytotoxic to L1210 leukemia in vitro, but that peptide-coupled daunomycin was significantly more potent than puromycin and tritylcysteine was slightly more potent than sarcolysin in.
Příklad 27Example 27
Vliv na aktivitu myší leukemie L1210 in vitroEffect on L1210 mouse leukemia activity in vitro
Byly připraveny dva analogy HPMA, které neobsahovaly determinanty. Analogy obsahovaly rozdílná léčiva, ale spacer léčiv byl tentýž ve všch případech v souladu s vynálezem. Detailní struktura analogů byla:Two HPMA analogs were prepared that did not contain determinants. The analogs contained different drugs, but the spacer of drugs was the same in all cases in accordance with the invention. The detailed structure of the analogs was:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Gly-deacetylkolchicin a (b) HPMA se substiuenty -Gly-Gly-kolcemid.(a) HPMA with the substituents -Gly-Gly-deacetylcolchicine and (b) HPMA with the substituents -Gly-Gly-colcemid.
Experimentální postup je pospán v příkladě 22.The experimental procedure is described in Example 22.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 5 připojených výkresů, v němž byly křivky získány vynesením procentického růstu buněk proti koncentraci polymerního léčiva v mg/ml. Výsledky ukazují, že oba analogy byly cytotoxické vůči myší leukémii L121O in vitro, ale že analog (b) měl větší inhibiční účinek než analog (a).The results are graphically shown in Figure 5 of the accompanying drawings, in which the curves were obtained by plotting the percentage growth of cells versus polymer drug concentration in mg / ml. The results show that both analogs were cytotoxic to murine L1210 leukemia in vitro, but that analog (b) had a greater inhibitory effect than analog (a).
Příklad 28Example 28
Vliv na rychlost uvolňování léčiva in vitro v přítomnosti enzymůEffect on drug release rate in vitro in the presence of enzymes
Byly připraveny dva HPMA analogy s jednoduchým řetězcem, které neobsahovaly determinanty. Analogy obsahovaly různá léčiva, ale spacer léčiva byl v obou případech stejný a byl v souladu s vynálezem. Detailní struktura analogů byla:Two single-chain HPMA analogs were prepared that did not contain determinants. The analogs contained different drugs, but the spacer drug was the same in both cases and was in accordance with the invention. The detailed structure of the analogs was:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Gly-deacetylkolchicin a (b) HPMA se substituenty -Gly-Gly-kolcemid.(a) HPMA with the substituents -Gly-Gly-deacetylcolchicine and (b) HPMA with the substituents -Gly-Gly-colcemid.
Experimentální postup byl tentýž jako v příkladě 22.The experimental procedure was the same as in Example 22.
Výsledky jsou graficky znázorněny v obrázku 5 připojených výkresů, v němž byly získány křivky vynesením procentického růstu buněk proti koncentraci polymerního léčiva v mg/ml. Výsledky ukazují, že oba analogy byly cytotoxické vůči myší leukémii L1210 in vitro, ale že analog (b) měl vyšší inhibiční účinek než analog (a).The results are graphically depicted in Figure 5 of the accompanying drawings, in which curves were plotted by plotting percent cell growth versus polymer drug concentration in mg / ml. The results show that both analogs were cytotoxic to murine L1210 leukemia in vitro, but that analog (b) had a higher inhibitory effect than analog (a).
Příklad 28Example 28
Vliv na rychlost uvolňování léčiva in vitro v přítomnosti enzymůEffect on drug release rate in vitro in the presence of enzymes
Byly připraveny dva analogy HPMA s jednoduchým řetězcem, které neobsahovaly determinanty. Analogy obsahovaly rozdílná léčiva, ale spacer léčiva byl v obou případech stejný a byl v souladu s vynálezem. Detailní struktura analogů byla:Two single-chain HPMA analogs were prepared that did not contain determinants. The analogs contained different drugs, but the spacer of the drug was the same in both cases and was in accordance with the invention. The detailed structure of the analogs was:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Phe-leu*Gly-daunomycin a tyrosinamid (b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-puromycin a tyrosinamid.(a) HPMA with -Gly-Phe-leu-Gly-daunomycin and tyrosinamide (b) HPMA with -Gly-Phe-Leu-Gly-puromycin and tyrosinamide.
Obě látky byly zkoumány s použitím dvou různých roztoků enzymů, a to (1) směsi lysosomálních' enzymů izolovaných z krysích jater podle metody Troueta a spol. (1974) v pufru (pH 5,5) obsahujících 1 mM EDTA, 5 mM redukovaného glutathionu a 0,2 % Triton X-100 a (2) přečištěný lysosomální enzym kathepsin L (3,8 . 10-7 mol/1) ve fosfátovém pufru (pH 6,0) obsahujícím 5mM glutathion a 1 mM EDTA.Both compounds were investigated using two different enzyme solutions, namely (1) a mixture of lysosomal enzymes isolated from rat liver according to the method of Trouet et al. (1974) in a buffer (pH 5.5) containing 1 mM EDTA, 5 mM reduced glutathione and 0.2% Triton X-100, and (2) purified lysosomal cathepsin L enzyme (3.8, 10 -7 mol / l) in phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM glutathione and 1 mM EDTA.
Každý analog (25 mg v 1,5 ml) byl inkubován s 1 ml roztoku enzymu. Uvolrěné léčivo bylo měřeno v různých časových intervalech extrakcí volného léčiva a změřením absorbance spektrofotometricky při odpovídající vlnové délce. Vzorky inkubační směsi (0,15 ml) byly odebírány a přidány k 1,5 ml pufru (pH 9,8) a 1,5 ml ethylacetátu. Po pěti minutách intenzivního třepání byl odebrán vzorek .(?. ml ) ethylacetátové vrstvy a extinkce byla změřena při 485 nm pro daunomycin a nebo při 272 nm pro puromycin.Each analog (25 mg in 1.5 ml) was incubated with 1 ml enzyme solution. The drug released was measured at various time intervals by extracting the free drug and measuring the absorbance spectrophotometrically at the corresponding wavelength. Samples of the incubation mixture (0.15 mL) were collected and added to 1.5 mL of buffer (pH 9.8) and 1.5 mL of ethyl acetate. After five minutes of vigorous shaking, a sample (ml ml) of the ethyl acetate layer was taken and the extinction was measured at 485 nm for daunomycin or at 272 nm for puromycin.
Výsledky jsou graficky znázorněny v obrázku 6 připojených výkresů, v němž byly křivky získány vynesením množství uvolněné41 ho léčiva v procentech původně přítomného léčiva v analogu proti času v hodinách. Výsledky získané se směsí lysosomálních enzymů (1) jsou vyneseny jsko prázdné kroužky a výsledky s přečištěným enzymem kathepsinem L (2) jako vyplněné kroužky.The results are shown graphically in Figure 6 of the accompanying drawings, in which the curves were obtained by plotting the amount of drug released in percent of the initially present drug in analogue over time in hours. The results obtained with the mixture of lysosomal enzymes (1) are plotted as open circles and the results with purified cathepsin L (2) as filled circles.
Tyto výsledky ukazují:These results show:
(a) rozdíly v rychlosti uvolňování puromycinu a daunomycinu mající stejný peptidový spacer a (b) rozdíly ve schopnosti přečištěného lysosomálního enzymu a směsi lysosomálních enzymů získaných z různých zdrojů degradovat tentýž peptidový spacer nesoucí totéž koncové léčivo.(a) differences in the release rate of puromycin and daunomycin having the same peptide spacer; and (b) differences in the ability of purified lysosomal enzyme and a mixture of lysosomal enzymes obtained from different sources to degrade the same peptide spacer bearing the same terminal drug.
(Trouet, A, (1974) Methods in Enzymology, (Fleisher, S.(Trouet, A, (1974) Methods in Enzymology, (Fleisher, S.).
and Packer, L. Eds.), Vol. XXXI, str. 323 až 329, Academie Press, New York. EDTA = ethylendiaminotetraoctová kyselina, Triton X-100 = kvartérní amoniové povrchově aktivní činidlo).and Packer, L. Eds., Vol. XXXI, pp. 323-329, Academic Press, New York. EDTA = ethylenediaminotetraacetic acid, Triton X-100 = quaternary ammonium surfactant).
Příklady 29 až 34Examples 29 to 34
Vliv přítomnosti specifických determinantůInfluence of specific determinants
Příklad 29Example 29
Vliv na rychlost záchytu polymerů melanomovými buňkami in vitroInfluence on polymer capture rate by melanoma cells in vitro
Byl připraven HPMA analog obsahující hormon stimulující melanocyty (MSH) jako determinant z hormonu stimulujícího o(-malanocyty; peptidový spacer k determinantu byl -Gly-Gly- v souladu s vynálezem. Analog byl větveného typu (přes MSH) a neobsahoval biologicky aktivní součást. Přípravek analogu byl označen radio125 nuklidem I a jeho schopnost vázat buňky myšího melanomu Cloně M3 591 byla srovnávána se schopností kontrolního HPMA polymeru obsahujícího tyrosinamidové substituenty a žádné substituenty determinatu. Tři vzorky kultury byl naočkovány 2 . 10^ buněk a inkubovány po tři dny před experimentem. Ke kulturám bylo přidáno 100 /ul každého polymeru a tyto byly inkubovány až do 60 minut. V daných intervalech byly kultury terminovány a z média byl odebrán vzorek; byl stanoven celkový počet buněk a počet buněk spojených s radioaktivitou.An HPMA analogue containing melanocyte stimulating hormone (MSH) as a determinant of o-stimulating hormone (-malanocytes) was prepared; the peptide spacer to the determinant was -Gly-Gly- in accordance with the invention. analog composition was designated radio125 nuclide I and its ability to bind to murine melanoma cells Clone M3 591 was compared with the ability to control the HPMA polymer containing tyrosinamidové substituent and no substituent determinatu. Triplicate cultures were inoculated with 2.10 ^ cells and incubated for three days before the experiment. 100 µl of each polymer was added to the cultures and incubated for up to 60 minutes at which time the cultures were terminated and a sample was taken from the medium to determine the total number of cells and the number of cells associated with radioactivity.
Výsledky jsou graficky znázorněny v obrázku 7 připojených výkresů, v němž byly získány křivky vynesením záchytu v /ul media na mg buněčného proteinu proti času v minutách. Výsledky ukazují, že analog obsahující MSH vykazoval vyšší vázání buněk melanomů ve srvonání s kontrolním polymerem.The results are graphically depicted in Figure 7 of the accompanying drawings, in which curves were plotted by plotting capture / µl medium per mg cell protein versus time in minutes. The results show that the MSH-containing analog showed a higher binding of melanoma cells in combination with the control polymer.
Příklad 30Example 30
Vliv na rychlost spotřeby polymeru lidským fibrovatelem in vitroInfluence on the rate of polymer consumption by human fibroser in vitro
HPMA analog obsahující apotransferin (75 /ul, 580 /ug/ml) byl značkován radiochemicky jodogenní metodou; -Gly-Gly- byl použit jako spacer k determinantu ve shodě s vynálezem. Látka neobsahovala biologicky aktivní součást. Chromatografie prokázala, že analog měl molární hmotnost asi 260 000, odpovídající vzorci polymer(apotransferin).j.The HPMA analog containing apotransferin (75 µl, 580 µg / ml) was radiochemically labeled with the iodogenic method; -Gly-Gly- was used as a spacer to the determinant in accordance with the invention. The substance did not contain a biologically active component. Chromatography showed that the analog had a molecular weight of about 260,000, corresponding to the formula polymer (apotransferin).
Po čtyřech dnech pěstování subkultury (buněčný konfluent) byly buňky fibroblastu (lidská pokožka) promyty a inkubovány předem určenou dobu v Hankově vyváženém roztoku solí (3 ml) obsahujícím anoalog značený radionuklidem (200 ^ul, /ug/ml). Počty buněk byly stanoveny ve vzorcích prostředí (1 ml) ve dvou oddělených skupinách, aby se rozlišilo mezi vázáním a internalizací. Skupina byla štěpena trypsinem, aby byla odstraněna vazba ligandu k transferinovému receptoru; skupina 2 nebyla takto upravována. Vzorky obou skupin byly rozpuštěny ve vodném NaOH a byla v nich stanovena radioaktivita a množství proteinu. Rychlost záchytu byla srovnávána s kontrolním HPMA polymerem obsahujícím -Gly-Phe-Phe-Leu-aminopropanolové substituenty a žádné substituenty determinantu.After four days of cultivation of the subculture (cell confluent), fibroblast cells (human skin) were washed and incubated for a predetermined time in Hank's balanced salt solution (3 ml) containing radionuclide-labeled Anoalog (200 µl, µg / ml). Cell numbers were determined in environmental samples (1 ml) in two separate groups to distinguish between binding and internalization. The group was digested with trypsin to remove ligand binding to the transferrin receptor; Group 2 was not modified in this way. Samples of both groups were dissolved in aqueous NaOH to determine radioactivity and protein levels. The capture rate was compared to a control HPMA polymer containing -Gly-Phe-Phe-Leu-aminopropanol substituents and no determinant substituents.
Výsledky jsou graficky znázorněny v obrázku 8 přiložených výkresů, v němž byly křivky získány vynesením záchytu v ^ul media na mg buněčného proteinu proti času v hodinách. Výsledky ukazují, že polymer obsahující apotransferin vykazoval zvýšenou internalizaci a vazebnou internalizaci vůči lidským fibroblastům ve srovnání s kontrolním polymerem.The results are shown graphically in Figure 8 of the accompanying drawings, in which the curves were obtained by plotting capture in µl medium per mg cell protein versus time in hours. The results show that the apotransferin-containing polymer showed increased internalization and binding internalization to human fibroblasts compared to the control polymer.
Příklad 31Example 31
Vliv na záchyt polymeru lidským hepatomem in vitroEffect on polymer capture by human hepatoma in vitro
Byla připravena řada HPMA analogů obsahujících galaktózu jeko specifický detereminant, v nichž byla galaktóza vázána přímo na polymerní řetězec esterovou vazbou. Analogy obsahovaly vzrůstající množství galaktózy v rozmezí 0 až 99 mol. %; biologicky aktivní součásti nebyly přítomny. Analogy byly značeny pomocí chloraminu T a byla zkoušena jejich schopnost pronikat do buněk lidského hepatomu (Hep G2) in vitro. Buňky byly pěstovány v jednovrstvých kulturách v EMEM obsahujícím 10 % plodového hovězícho séra. Vždy tři kultury byly naočkovány s 2 . 10^ buněk a inkubovány 3 dny před použitím k pokusu. Buňky byly inkubovány s každým analogem (100 /Ul) po dobu 15 sekund Potom byl odebrán vzorek media a jednovrstvé buňky byly důkladně promyty. K rozpuštění buněk bylo přidáno 2,5 ml 1 M NaOH a byly odebrány vzorky pro stanovení obsahu radioaktivní značky a celkového proteinu.A series of HPMA analogs containing galactose as a specific detereminant were prepared in which galactose was bound directly to the polymer chain by an ester bond. The analogues contained increasing amounts of galactose in the range of 0 to 99 moles. %; biologically active components were not present. Analogs were labeled with chloramine T and tested for their ability to penetrate human hepatoma (Hep G2) cells in vitro. Cells were grown in monolayer cultures in EMEM containing 10% fetal bovine serum. Three cultures were inoculated with 2. 10 µl cells and incubated for 3 days prior to use in the experiment. Cells were incubated with each analog (100 µl) for 15 seconds. A media sample was then collected and the monolayer cells were washed extensively. 2.5 ml of 1 M NaOH was added to dissolve the cells and samples were taken to determine the radiolabel and total protein content.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 9, v němž byly získány křivky vynesením záchytu v % countů χ 103 mg buněčného proteinu proti mol. % galaktózy v každém analogu. Výsledky ukazují, že záchyt HPMA kopolymerů s galaktózou lidkým hepatomem je úměrná mol. % přítomné galaktózy.The results are graphically depicted in Figure 9, in which the curves were plotted by plotting in% counts χ 10 3 mg cell protein versus mol. % galactose in each analog. The results show that capture of HPMA galactose copolymers with human hepatoma is proportional to moles. % galactose present.
Příklad 32Example 32
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vitroEffect on L1210 mouse leukemia activity in vitro
Pokusy byly provedeny se dvěma HPMA kopolymery, z nichž jeden je předmětem tohoto vynálezu. Obě sloučeniny obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást s -Gly-Phe-Leu-Glyjako spacer léčiva. Sloučenina podle tohoto vynálezu obsahovala dále fukosylamin jako determinant a· -Gly-Phe-Leu-Gly- jako spacer determinantu.The experiments were performed with two HPMA copolymers, one of which is the subject of the present invention. Both compounds contained daunomycin as a biologically active component with -Gly-Phe-Leu-Gly as spacer drugs. The compound of the invention further contained fucosylamine as a determinant and · -Gly-Phe-Leu-Gly- as a spacer determinant.
Experimentální postup byl stejný jako v příkladě 22.The experimental procedure was the same as in Example 22.
Výsledky jsou graficky znázorněny v obrázku 10, v němž byly křivky získány vynesením procentického růstu buněk proti koncentraci daunomycinu v /Ug/ml. Výsledky ukazují, že cytotox44 xicita polymerního léčiva vůči myší leukémii L1210 in vitro významě vzroste je-li v molekule přítomen fukosylamin jako determinant.The results are graphically shown in Figure 10, in which the curves were obtained by plotting the percentage cell growth versus daunomycin concentration in µg / ml. The results show that the cytotox44 xicity of the polymer drug to murine L1210 leukemia in vitro increases significantly when fucosylamine is present as a determinant in the molecule.
Příklad 33Example 33
Vliv na cílení polymeru in vivoEffect on polymer targeting in vivo
Byly připraveny dva HPMA kopolmery, které měly následující strukturu a složení:Two HPMA copolymers were prepared having the following structure and composition:
[Tyr-NH2 (1,7 mol %) ^-Tyr-NH2 (1,8 mol %)[Tyr-NH 2 (1.7 mol%)] -Tyr-NH 2 (1.8 mol%)
Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (3,5 mol %) ) (2,2 mol %) bGly-Phe-Leu-Gly-galaktózamin ) (1,9 mol %)Gly-Phe-Leu-Gly-Daunomycin (-Gly-Phe-Leu-Gly-Daunomycin (3.5 mol%)) (2.2 mol%) bGly-Phe-Leu-Gly-Galactosamine) (1.9 mol) %)
Polymer 1 Polymer 2Polymer 1 Polymer 2
Polymer 2 je předmětem tohoto vynálezu, polymer 1 nikoliv.Polymer 2 is an object of the present invention, polymer 1 is not.
125 nba HPMA polymery byly značeny radionuklidem I pomocí chloraminu T. Tato radioaktivní značka je stálá v biologickém prostředí => proto umožňuje sledovat osud polymeru in vivo.125 n and HPMA polymers were labeled with radionuclide I with chloramine T. This radiolabel is stable in the biological environment, thus allowing the fate of the polymer to be traced in vivo.
Polymer (přibližně 100 ^ug v 0,1 ml pufru) byl injekčně podán do femorální žíly samce krysího plemene Wistar (250 až 350 g) udržovaného v anestézii a po 30 minutách bylo zvíře usmrceno a měřeno rozdělení radioaktivity v jeho těle.The polymer (approximately 100 µg in 0.1 ml buffer) was injected into the femoral vein of a male Wistar rat (250-350 g) anesthetized and after 30 minutes the animal was sacrificed and the radioactivity distribution in its body measured.
Dosažené výsledky jsou znázorněny v tabulce 2The results obtained are shown in Table 2
Tabulka 2Table 2
Z výsledků vyplývá, že připojení i malého množství galaktózaminu (1,9 mol. %) účinně směruje významnou část HPMA kopolymeru do krysích jater během 30 minut od nitrožilního podání.The results indicate that attachment of even a small amount of galactosamine (1.9 mol%) effectively directs a significant portion of the HPMA copolymer to rat liver within 30 minutes of intravenous administration.
Příklad 34Example 34
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vivoEffect on L1210 mouse leukemia activity in vivo
Pokusy byly provedeny se dvěma HPMA analogy, z nichž jeden je předmětem tohoto vynálezu. Oba analogy obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást, -Gly-Phe-Leu-Gly- jako spacer léčiva a zbytky tyrosinamidu. Polymer podle vynálezu obsahoval ještě fukózu jako determinant; spacer determinantu byl -Gly-Phe-Leu-Gly-. Detailní struktura polymerů byla:The experiments were carried out with two HPMA analogues, one of which is the subject of the present invention. Both analogs contained daunomycin as a biologically active component, -Gly-Phe-Leu-Gly- as spacer drugs and tyrosinamide residues. The polymer of the invention still contained fucose as a determinant; The determinant spacer was -Gly-Phe-Leu-Gly-. The detailed structure of the polymers was:
(-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin 4Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin v-Tyr-NH2 y-Gly-Phe-Leu-Gly-f ukóza ýTyr-NH2 (-Gly-Phe-Leu-Gly-Daunomycin 4Gly-Phe-Leu-Gly-Daunomycin v-Tyr-NH 2 y-Gly-Phe-Leu-Gly-phosose yrTyr-NH 2
Polymer 1 Polymer 2Polymer 1 Polymer 2
Myší leukémie L1210 byla naočkována (10^ živých buněk) intraperitoneálně myším 0BA2 v den nula. Zvířata byla potom rozdělena do dvou skupin, které byly léčeny odděleně. Zvířata první skupiny byla léčena polymerem 1, zvířata druhé skupiny polymerem 2; v obou skupinách byla podávána dávka ekvivalentní 7,5 g daunomycinu/kg. Bylo zaznamenáváno přežití zvířat v obou skupinách.L1210 mouse leukemia was inoculated (10 µl viable cells) intraperitoneally to OBA 2 mice at day zero. The animals were then divided into two groups, which were treated separately. Animals of the first group were treated with polymer 1, the animals of the second group were treated with polymer 2; in both groups a dose equivalent to 7.5 g of daunomycin / kg was administered. The survival of the animals in both groups was recorded.
Výsledky prokázaly, že zvířata ve skupině 2 léčená polymerem podle vynálezu, přežívala nejméně dvakrát tak dlouho jako zvířata ve skupině 1 léčená polymerem bez determinantu; tak v jedné řadě pokusů přežilo dlouhodobě ve skupině 2 57 % zvířat, ve srovnání se skupinou 1, kde dlouhodobě přežilo pouze 25 % zvířat.The results showed that animals in Group 2 treated with the polymer of the invention survived at least twice as long as animals in Group 1 treated with the polymer without a determinant; Thus, in one series of experiments, 57% of animals survived long term in Group 2, compared to Group 1, where only 25% of animals survived long term.
Příklad 35Example 35
Vliv různých peptidových spacerů u téhož léčiva a specifického determinantuEffect of different peptide spacers on the same drug and specific determinant
Pokusy byly provedeny se dvěma HPMA kopolymery, které byly oba ve shodě s předmětem vynálezu. Oba kopolymery obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást a anti-θ protilátku jako determinant. U každého z polymerů byl použit tentýž peptidový spacer u léčiva i determinantu, ale spacery se lišily v obou polymerech. Detailní struktura kopolymerů byla:The experiments were carried out with two HPMA copolymers, both in accordance with the present invention. Both copolymers contained daunomycin as a biologically active component and anti-θ antibody as determinant. For each of the polymers, the same peptide spacer was used for both drug and determinant, but spacers differed in both polymers. The detailed structure of the copolymers was:
VGly-Phe-Leu-Gly-daunomycin Í-Gly-Phe-Leu-Gly- anti-θ protilátkaVGly-Phe-Leu-Gly-daunomycin-Gly-Phe-Leu-Gly-anti-θ antibody
Polymer 1Polymer 1
Gly-daunomycinGly-daunomycin
Gly-Gly-anti-θ protilátka Polymer 2Gly-Gly-anti-θ antibody Polymer 2
Aktivita kopolymerů byla zkoušena proti T-lymfocytům in vivo měřením poklesu reakce na anti-ovčí červené krvinky u myší. Dosažené výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.The activity of the copolymers was tested against T cells in vivo by measuring the decrease in anti-sheep red blood cell response in mice. The results obtained are shown in Table 3.
Tabulka 3Table 3
Jak lze vidět z výsledků, polymer 1 obsahující -Gly-Phe-Leu -Gly-spacery k léčivu a determinantu je značně účinnější při zabíjení T-lymfocytů než odpovídající polymer 2, který obsahuje -Gly-Gly-spacer.As can be seen from the results, polymer 1 containing -Gly-Phe-Leu -Gly-spacers to the drug and determinant is considerably more effective in killing T cells than the corresponding polymer 2 containing -Gly-Gly-spacer.
O za oO za o
mm
C r~ -< ΓΠC r ~ - <ΓΠ
H <H <
I iI i
Claims (16)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SK9785A SK9785A3 (en) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Polymeric remedy and preparation method thereof |
CS8597A CZ278551B6 (en) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CS8597A CZ278551B6 (en) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ9785A3 true CZ9785A3 (en) | 1994-01-19 |
CZ278551B6 CZ278551B6 (en) | 1994-03-16 |
Family
ID=5332511
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CS8597A CZ278551B6 (en) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ278551B6 (en) |
SK (1) | SK9785A3 (en) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9174871B2 (en) | 2012-11-02 | 2015-11-03 | Empire Technology Development Llc | Cement slurries having pyranose polymers |
US9212245B2 (en) | 2012-12-04 | 2015-12-15 | Empire Technology Development Llc | High performance acrylamide adhesives |
US9238774B2 (en) | 2012-11-02 | 2016-01-19 | Empire Technology Development Llc | Soil fixation, dust suppression and water retention |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19930177B4 (en) * | 1999-06-30 | 2007-02-08 | Nikolai Vladimirovich Bovin | Intermolecular associating compounds and their use |
WO2012057748A1 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Empire Technology Development Llc | Biocompatible polymerizable acrylate products and methods |
-
1985
- 1985-01-04 SK SK9785A patent/SK9785A3/en unknown
- 1985-01-04 CZ CS8597A patent/CZ278551B6/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9174871B2 (en) | 2012-11-02 | 2015-11-03 | Empire Technology Development Llc | Cement slurries having pyranose polymers |
US9238774B2 (en) | 2012-11-02 | 2016-01-19 | Empire Technology Development Llc | Soil fixation, dust suppression and water retention |
US9212245B2 (en) | 2012-12-04 | 2015-12-15 | Empire Technology Development Llc | High performance acrylamide adhesives |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SK278506B6 (en) | 1997-08-06 |
CZ278551B6 (en) | 1994-03-16 |
SK9785A3 (en) | 1997-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0187547B1 (en) | Synthetic polymeric drugs | |
Duncan et al. | Anticancer agents coupled to N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers. I. Evaluation of daunomycin and puromycin conjugates in vitro | |
Kopeček et al. | Targetable polymeric prodrugs | |
Ulbrich et al. | Polymeric drugs based on conjugates of synthetic and natural macromolecules: I. Synthesis and physico-chemical characterisation | |
US7041818B2 (en) | DDS compound and method for measurement thereof | |
US6620916B1 (en) | Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same | |
EP0955064B1 (en) | Process for producing drug complexes | |
US6933352B2 (en) | Amphiphilic compounds having a dendritic branch structure | |
US9289510B2 (en) | Polymeric drug delivery conjugates and methods of making and using thereof | |
AU4094300A (en) | Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers | |
Ulbrich et al. | Poly (ethylene glycol) s containing enzymatically degradable bonds | |
Hoes et al. | Biological properties of adriamycin bound to biodegradable polymeric carriers | |
EP1463529B1 (en) | Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy | |
CZ9785A3 (en) | Synthetic polymeric medicaments and process for preparing thereof | |
Ulbrich et al. | Polymer‐bound derivatives of sarcolysin and their antitumour activity against mouse and human leukaemia in vitro | |
CZ294996B6 (en) | Reactive polymers and copolymers based on N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide, process of their preparation and their use for synthesis of polymeric medicaments, further for modification of biologically active proteins and preparation of systems for gene transportation | |
EP1200461A2 (en) | Polypeptide dendrimers as unimolecular carriers of diagnostic imaging contrast agents, bioactive substances and drugs | |
Sintov et al. | Polymeric drug delivery of enzymatically degradable pendant agents: Peptidyl-linked procainamide model system studies | |
Lapicque et al. | Polysaccharidic prodrugs for enzymatically controlled release | |
EP0489220A1 (en) | Cytotoxic N,N'-bis (succinyl-peptide-) derivatives of 1,4-bis (aminoalkyl)-5,8-dihydroxyanthraquinones and antibody conjugates thereof | |
Vepřek | Desing and synthesis of Tn-bearing glycodendrimers and their interaction with components of innate and adaptive immunity | |
CZ2003605A3 (en) | pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy | |
AU2004201277A1 (en) | Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers | |
Zanini | Quantitative multivalent carbohydrate-protein interactions from novel glycodendrimers. | |
Ambrosi | Polymeric neoglycoconjugates: Synthesis, characterization and properties |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20050104 |