CZ73499A3

CZ73499A3 - Podjednotka ß3 lidského G proteinu

Info

Publication number: CZ73499A3
Application number: CZ99734A
Authority: CZ
Inventors: Winfried Siffert
Original assignee: Winfried Siffert
Priority date: 1996-09-13
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 1999-07-14
Also published as: BR9711475A; IS4987A; JP2001501811A; SK34099A3; EE9900092A; US6251853B1; TR199900500T2; ZA978220B; HUP9904110A3; DE19637518A1; NO991227D0; KR20000036058A; EA199900253A1; EP0931145A1; IL128746A0; AU4619297A; PL332417A1; WO1998011212A1; CA2265467A1; NO991227L

Description

(57) Anotace:

Podjednotka beta-3 lidského G-proteinu, kde tato podjednotka zahrnuje maximálně šest opakování motivu WD.

CZ 734-99 A3

0« 0000

9 ·

0 • 0

9 9 4

11/ · 99 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 • » 0 0000 · 00« 000 «·· 99

0 0* ··

Podjednotka β3 lidského G-proteinu

Oblast techniky

Vynález popisuje nově objevené lidské G-proteiny, zvláště pak podjednotky β3 G-proteinů, a způsoby přípravy a použití těchto proteinů v diagnóze a terapii.

Dosavadní stav techniky

Heterotrimerní proteiny vázající nukleotidy guaninu (Gproteiny) jsou velmi důležité při přenosu signálu uvnitř buňky. Zprostředkovávají přenos extracelulárních signálů po stimulaci hormonálních receptorů a dalších receptorů, které po aktivaci procházejí konformační změnou. Ta vede k aktivaci G-proteinů, které mohou následně aktivovat nebo inhibovat intracelulární efektory (například iontové kanály, enzymy). Heterotrimerní G-proteiny jsou složené ze tří podjednotek α, β a γ. K dnešnímu dni bylo biochemickými a molekulárně biologickými metodami charakterizováno několik různých podjednotek a, 5 podjednotek β a přibližně 12 podjednotek γ (Birnbaumer L. a Birnbaumer M., Signál transduction by G proteins: vydáno v roce 1994, J. Recept. Res. 15:213 až 252, 1995; Offermanns S. a Schultz G., Complex Information Processing by the transmembrane signaling systém involving G proteins. Naunyn Schmiedebergs-Arch. Pharmacol. 350:329 až 338, 1994; Nurnberg B., Gudermann T. a Schultz G., Receptors and G proteins as primary components of transmembrane signál transduction. 2. část G proteins: structure and function. J. Mol. Med. 73:123 až 132, 1995; Neer E. J., Heterotrimeric G

99

9 9 9

999 99 9

9

99

9 9 • 9 « · ···· proteins: Organizers of Transmembrane Signals. Cell 80:249 až 257, 1995; Rens-Domiano S. a Hamm Η. E., Structural and functional relationšhips of heterotrimeric G-proteins. FASEB J. 9:1059 až 1066, 1995).

Aktivace určitých podjednotek a prostřednictvím receptorů může být inhibována preinkubací s toxinem černého kašle (PTX-pertussis toxin). Mezi tyto podjednotky zahrnujeme především a izoformy ail, ai2 a ai3 a různé podjednotky ao. G-proteiny těchto typů jsou také označovány jako PTXsenzitivní G-proteiny.

Podstata vynálezu

Podjednotky γ a β jsou nositeli základních funkcí při aktivaci G-proteinů a při modulaci intracelulárních reakcí. Všechny podjednotky β G-proteinů, které byly dosud popsány, vykazují vysoký stupeň homologie na úrovni nukleotidové sekvence a rovněž na úrovni aminokyselinové sekvence. Tato homologie existuje nejenom mezi lidskými podjednotkami β (βΐ, β2 a β3), ale rovněž při srovnání podjednotek β jiných druhů, například octomilky nebo kvasinek.

Rentgenostrukturní analýzou byly v podjednotkách α, β a γ určeny ty aminokyseliny, které jsou ve vzájemném kontaktu a jsou tudíž nepostradatelné pro uspořádanou tvorbu heterotrimerů.

Všechny podjednotky β G-proteinů, které byly dosud popsány, náleží ke skupině proteinů obsahujících WD motivy. Nkonec podjednotky β přednostně interaguje s podjednotkami γ a C-koncová část se účastní interakcí s receptory.

Podjednotky β vytvářejí takzvané „vrtulovité struktury (propeller structure). Tyto vrtulovité struktury

99

9 9 9

999 999

9

99

9999 99 9

9 9 9 *9

9 9 ·99 • 9 «99 9999

9 9 9 9

9999 9 9·· v podjednotkách β G-proteinů jsou složeny ze sedmi β-listů, a každý β-list zahrnuje 4 oblasti aminokyselin v antiparalelním uspořádání. Sedmičetná symetrie vrtulovité struktury může být detekována na úrovni aminokyselinové sekvence, kde je zahrnuto sedm opakování motivu WD (tryptofan-kyselina asparágová). Motiv WD je tvořen přibližně 40 aminokyselinami a zahrnuje množství konzervativních aminokyselin včetně sekvence dipeptidu Trp-Asp. Zmíněný motiv WD je často ukončen opakováním WD (obrázek 1) .

Nedávno bylo překvapivě zjištěno, že podjednotka β3 Gproteinů obsahující pouze 6 (namísto původně popsaných 7) motivů WD se vykytuje například u pacientů trpících hypertenzí. Ve srovnáni s osobami s normálním tlakem je u pacientů trpících hypertenzí usnadněna buněčná aktivace PTXsenzitivních G-proteinů.

Molekulová analýza odhalila u podjednotky β3 pacientů trpících hypertenzí novou aminokyselinovou sekvenci, která je ve srovnáni se známou sekvencí o 41 aminokyselin kratší. Tato sekvence je znázorněna jako SEK. ID. Č: 2. Formálně je tato sekvence odvozena ze známé lidské podjednotky β3 delecí aminokyselin 167 až 207 .

Odpovídající sekvence DNA kódující protein popsaný SEK. ID. Č: 2 je popsána jako SEK. ID. Č: 1.

Příčinou výskytu zkrácené formy podjednotky ΰβ3 u pacientů trpících hypertenzí je pravděpodobně alternativní sestřih odpovídajícího genu. Na úrovni DNA se těsně před předpokládaným místem sestřihu nalézá intron. Tento intron začíná za nukleotidem 497 (číslování jako v SEK. ID. Č: 1) .

Z templátu genomové DNA bylo pomocí PCR rovněž možné detekovat intron začínající přibližně za nukleotidem 620. Zkrácená forma zřejmě vznikla delecí celého exonu. Vynález dále popisuje způsob přípravy zkrácených forem lidských •

0

0 0

000 •0 0000 « 0 0 • · ·

• 0 00 0 0 0 ♦ · 0 • ·0

W 0 0 0

0 0000 0 0 0 podjednotek Θβ3 (popsaných výše). Tento způsob zahrnuje expresi nukleotidové sekvence kódující takovou zkrácenou formu v hostitelském organizmu.

Pro expresi rekombinantního proteinu je nutné vytvořit konstrukt, který kromě kódující nukleotidové sekvence obsahuje rovněž signální a regulační sekvence jako například promotory, terminátory, místa odpovědná za vazbu na ribozom, polyadenylační signál a podobně. Obecné postupy pro expresi rekombinantních genů jsou odborníkům dobře známé.

Vynález se dále týká použití nukleotidových sekvencí podle vynálezu k přípravě účinných látek pro genovou terapii. Zavedením těchto nukleotidových sekvencí, buď samostatně nebo ve formě vhodného vektoru, do buněk pacientů může být dosaženo snadnější aktivovatelnosti G-proteinů v těchto buňkách.

Toto je žádoucí u velkého množství patologických stavů, které jsou spojeny s poruchami regulace funkce G-proteinů. .....

Jako onemocnění spojená s poruchou regulace funkce Gproteinu jsou označována onemocnění, při kterých se Gprotein účastní přenosu signálu, ale vykonává tuto svoji funkci nefyziologických způsobem.

Mezi tyto poruchy patří kardiovaskulární onemocnění, metabolické poruchy a poruchy imunitního systému.

Kardiovaskulárními onemocněními, které mohou být zmíněny, jsou:

Hypertenze, gravidní hypertenze (gestóza, hypertenze v těhotenství), nemoc srdečních věnčitých tepen, lokalizovaná a/nebo nelokalizovaná ateroskleróza, stenóza krevních cév, restenóza po revaskularizačních procedurách (např. PTCA-perkutánní transluminální koronární angioplastikas nebo bez implantovaného stentu), sklon k mrtvicím nebo trombózám a zvýšená agregace krevních destiček.

·· 9 44 44

4 4 9 9 4 4 ···· 4 9 4 9

4 444 4444 4 994 444

4 9 9 4 4 4

9444 4 44 4 44 44 ·« ····

Metabolickými poruchami, které mohou být zmíněny, jsou: Syndrom látkové výměny, inzulínová rezistence a hyperinzulinémie, diabetes II. typu, diabetické komplikace (např. nefropatie, neuropatie, retinopatie atd.), poruchy metabolizmu lipidů, poruchy centrální chemorecepce (C0₂ tolerance, acidózní tolerance, syndrom náhlého úmrtí kojenců (SIDS)).

Poruchami imunitního systému, které mohou být zmíněny, jsou:

Snížená síla imunitní odpovědi organizmu (tvorba imunoglobulinů, agresivita T-buněk a NK-buněk), obecně snížená schopnost proliferace včetně snížené schopnosti hojit zranění, sklon ke vzniku nádorů a proliferace zahrnující možnost metastázování zhoubně přeměněných buněk, doba trvání latentní fáze po nákaze HIV, než se nemoc stane klinicky pozorovatelnou, Kaposiho sarkom, sklon k cirhóze jater, transplantační tolerance a odmítnutí transplantátu.

Do rozsahu vynálezu dále spadá použití nukleotidových sekvencí podle vynálezu k diagnóze patologických stavů, zvláště pak ke stanovení rizika postižení onemocněním spojeným s poruchou regulace funkce G-proteinů.

Vynález může být rovněž využit, mimo stanovení rizika určitých poruch, k získání obecných fyziologických údajů týkajících se například chemorecepce, C0₂ tolerance, acidózní tolerance, rizika syndromu náhlého úmrtí kojenců (SIDS) nebo způsobilosti k různým druhům sportů.

Do rozsahu vynálezu dále spadá použití nukleotidových sekvencí komplementárních k nukleotidovým sekvencím kódujícím zkrácenou formu podjednotky Θβ3. Sekvence tohoto typu mohou být použity jako antisense konstrukty k léčbě nebo prevenci patologických stavů spojených s poruchami regulace funkce G-proteinů.

• 4 44

4 *

4 4

444 444 ke ·* ···· > 4 4 • 4 *

4 ·

4 4 4

4 4444 • · ·

4

Do rozsahu vynálezu dále spadají způsoby použitelné ke stanovení relativního rizika výskytu onemocnění spojeného s poruchou regulace funkce G-proteinů u daného subjektu, kde je toto stanovení provedeno srovnání sekvence genu kódujícího podjednotku β3 lidského G-proteinu daného subjektu s nukleotidovou sekvencí popsanou jako SEK. ID. Č: 1.

V případě, že jsou tyto dvě sekvence shodné, je danému subjektu připsáno zvýšené riziko onemocnění.

Použití vynálezu pro stanovení relativního rizika vývinu nemoci předpokládá odebrání vzorku, který obsahuje genetickou informaci, z organizmu pacienta. Toho je zpravidla dosaženo odebráním krve, ze které je izolována nukleová kyselina .

Z izolované nukleové kyseliny pacienta je určena struktura genu pro podjednotku β3 G-proteinu a jeho sekvence je porovnána se sekvencí zobrazenou jako SEK. ID. Č. ·. 1.

Struktura genu může být určena metodou sekvenování nukleové kyseliny. To může být provedeno bud' přímo z genomové DNA anebo po amplifikaci nukleové kyseliny například technikou polymerázové řetězové reakce (PCR).

Struktura genu může být určena bud' na úrovni genomové DNA anebo na úrovni mRNA nebo cDNA.

Ve výhodném provedení je sekvence stanovena po amplifikaci cDNA metodou PCR. Primery vhodné pro metodu PCR mohou být odborníky snadno vyvozeny ze sekvencí zobrazených jako SEK. ID. Č.:l. Ve výhodném provedení je v každém případě vybrán primer vázající se k řetězci a ke komplementárnímu řetězci před a za zvoleným místem delece.

Pro srovnávání genů mohou být použity i další metody, například metoda selektivní hybridizace nebo metoda mapování restrikčními enzymy.

Diagnostické metody popsané v předchozím textu mohou být rovněž prováděny na úrovni proteinu. Proteiny podle vynálezu ·· ···· • · · · • · · · ··· ···

9··4

mohou být například použity k produkci specifických protilátek rozpoznávajících zkrácenou formu podjednotky Ωβ3. Protilátky tohoto typu mohou být, tam kde je to vhodné, použity při stanoveních ELISA nebo k diagnostice (prováděné spolu s nebo jako náhrada diagnostiky na úrovni genů) na úrovni proteinů.

Vynález se dále týká přípravy transgenních zvířat nesoucích výše popsanou genetickou mutaci (zkrácenou podjednotku Θβ3). Transgenní zvířata tohoto typu jsou velmi důležitá, zvláště jako živočišný model pro výzkum a léčbu poruch popsaných výše. Odborníkům jsou dobře známy způsoby přípravy transgenních zvířat.

Popis obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje strukturu podjednotky β G-proteinu a její interakci s podjednotkou γ.

Obrázek 2 znázorňuje závislost aktivace G-proteinů indukované působením mastoparanu 7 (MAS 7) na koncentraci mastoparanu, a to u buněk získaných z organizmu osob s normálním tlakem (NT-buňky, prázdné kroužky) a u buněk získaných z organizmu pacientů trpících hypertenzí (HT-buňky, plná kolečka) . Hodnoty EC50 jsou 5 μΜ pro HT-buňky a 47 μΜ pro NTbuňky.

Obrázek 3 znázorňuje časovou závislost vazby [³⁵S] GTPyS (stimulované působením mastoparanu 7) na buněčné linie NT (NT, prázdné kroužky) a na HT-buňky (HT, plná kolečka).

Obrázek 4 znázorňuje závislost vazby [³⁵S] GTPyS (stimulované působením mastoparanu 7) na buněčné membrány izolované z NT-buněk (NT, prázdné kroužky) a z HT-buněk (HT, plná kolečka) na koncentraci GDP.

44

4 9 4

494 444

4

44 ·· ···· • · · • · ·

• ·

9949 9

9

4 9

9 9 9

4 4944

9 4

4

Obrázek 5 znázorňuje závislost vazby [³⁵S] GTPyS (stimulované působením mastoparanu 7) na buněčné membrány izolované z NT-buněk (NT, prázdné kroužky) a z HT-buněk (HT, plná kolečka) na koncentraci Mg⁺².

Obrázek 6 znázorňuje rekonstituci aktivace G-proteinů působením extraktů (získaných pomocí cholátu) z buněčných membrán z NT-buněk (NT, prázdné kroužky) a z HT-buněk (HT, plná kolečka).

Obrázek 7 znázorňuje strukturu nové varianty lidského proteinu G 3 a její interakci s podjednotkou γ.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je dále ilustrován na následujících příkladech.

Příklad 1

Funkční výsledky aktivace G-proteinů při esenciální hypertenzi

Aktivace G-proteinů byla detailně charakterizována na NT-buňkách a na HT-buňkách. Za tímto účelem byla sledována (a kvantifikována) stimulovaná inkorporace radioaktivně značeného [³⁵S] GTPyS postupem popsaným v publikaci Wieland a další (Wieland T., Liedel K., Kaldenberg-Stasch S., Meyer zu Heringdorf D., Schmidt M. a Jakobs K. Η. , Análysis of receptor-G-protein interactions in permeabilized cells. NaunynSchmiedeberg's Arch. Pharmacol. 351: 329 až 336, 1995). Gproteiny byly na počátku aktivovány stimulací buněk (permeabilizovaných pomocí digitoninu) působením peptidu mastoparan

7. Tento peptid simuluje konfiguraci „aktivovaný G-protein spojený s receptorem, a tudíž může být použit k indukci ·· ···· aktivace G-proteinů, která není závislá na přítomnosti receptorů (Ross E. M. a Hagashijima T., Regulation of G protein activation by mastoparan and other cationic peptides, Methods Enzymol. 237:27 až 39, 1994). Vazba GTPyS indukovaná pomocí MAS-7 je plně PTX-senzitivní a může být tudíž využita ke kvantifikaci aktivace heterotrimerních G-proteinů typu Gi. Obrázek 2 znázorňuje závislost aktivace G-proteinů indukované působením mastoparanu 7 (MAS 7) na koncentraci mastoparanu, a to u buněk získaných z organizmu osob s normálním tlakem (NT) a buněk získaných z organizmu pacientů trpících hypertenzí (HT). MAS-7 indukuje vytvoření pevné vazby [³⁵S] GTPyS na HT-buňky, a to s hodnotou EC50 přibližně 5 μΜ (Obr. 2). Maximální vazby je dosaženo při koncentraci MAS-7 přibližně 25 až 50 μΜ. Naproti tomu, koncentrace potřebná k indukci stejně intenzivní vazby [³⁵S] GTPyS na NT-buňky je desetinásobně vyšší (obrázek 2). Tato data ukazují, že k aktivaci PTX-senzitivních G-proteinů v HT-buňkách (ve srovnání s NT-buňkami) postačuje podstatně méně aktivovaných receptorů.

Vazba [³⁵S] GTPyS na HT-buňky je podstatně zrychlena (rychlostní konstanta 0,005 s¹ u NT-buněk ve srovnání s konstantou 0,01 s'¹ u HT-buněk) .

Obrázek 4 znázorňuje závislost vazby [³⁵S] GTPyS (stimulované působením mastoparanu 7) na buněčné membrány izolované z NT-buněk a HT-buněk na koncentraci GDP. Je zřejmé, že maximální stimulace vazby [³⁵S] GTPyS k membránám z HT-buněk je dosaženo při nižších koncentracích GDP (přibližně 0,2 μπιοί/ΐ) než je tomu u NT-buněk, kde je k dosažení stejného účinku nutné použít GDP v koncentraci 1 μιηοΐ/ΐ.

Podobně, maximální intenzity vazby (stimulované působením mastoparanu 7) [³⁵S] GTPyS k membránám izolovaným z HTbuněk je dosaženo při nižších koncentracích volných iontů ·

• ·

Mg⁺² (přibližně 0,01 mmol/l) než je tomu u NT-buněk, kde je k dosažení vazby [³⁵S] GTPyS o maximální intenzitě nutné použít volné ionty Mg⁺² v koncentracích 0,1 mmol/l (obrázek 5).

Další experimenty sledovaly zvýšenou aktivovatelnost Gproteinů odvozených z HT-buněk. Za tímto účelem byly z očí hovězího dobytka purifikovány fotoreceptor rhodopsin a transductin-podjednotka a G-proteinu (at) ; Phillips W. J., Wong S. C. a Cerione R. A. Rhodopsin/transductin interactions.

II. Influence of thé transductin-βγ subunit complex on the coupling of the transductin-a subunit to rhodopsin. J. Biol. Chem. 267:17040 až 17046, 1992. G-proteiny byly navíc pomocí cholátu extrahovány z membrán HT- a NT-buněk (Mitchell J., Northup J. K. a Schimmer Β. P. Defective guanyl nucleotide binding protein βγ subunits in a forskolin-resistant mutant of the Yl adrenocortical cell line. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89(19):8933 až 8937, 1992). Byla sledována specifická vazba (indukovaná rhodopsinem = receptorem) [³⁵S] GTPyS k atransductinu (at) a byl zkoumán vliv extraktů (získaných pomocí cholátu) z membrán HT- a NT-buněk na tuto vazbu. Koncentrace proteinů ve zmíněných extraktech byla ve všech experimentech stejná.

Obrázek 6 znázorňuje vliv extraktů (získaných pomocí cholátu) z HT- a NT-buněk na vazbu [³⁵S] GTPyS k atransductinu, kde je tato vazba stimulována rhodopsinem.

V tomto případě je zřejmé, že extrakty (získané pomocí cholátu) z HT-buněk stimulují vazbu (katalyzovanou rhodopsinem) [³⁵S] GTPyS k at podstatně účinněji než extrakty (získané pomocí cholátu) z NT-buněk.

Provedené experimenty umožňují vyvození následujících závěru • V HT-buňkách je zvýšena aktivovatelnost G-proteinů. Tato aktivovatelnost je, ve srovnání s aktivovatelnost! G10 ·· ···· ·· I • 9 · · · · « · » · · • · · · · ·*<* • · · * · ··*« · ·· · »·

I · » · • 9 9 proteinů z NT-buněk, daleko účinnější a vyžaduje podstatně méně aktivovaných receptorů a navíc je kinetika aktivace těchto G-proteinů zřetelně rychlejší (obrázky 2 a 3) .

Ve srovnání s NT-buňkami je u HT-buněk maximální aktivace G-proteinů dosaženo při nižších koncentracích GDP a volných iontů Mg⁺². Toto pozorování vede k závěru, že proteinové interakce podjednotek α, β a γ probíhají v HT-buňkách podstatně účinněji než je tomu v NT-buňkách (obrázky 4 a 5).

Vazba [³⁵S]GTPyS k at, kde je tato vazba indukována rhodopsinem, je působením extraktů (získaných pomocí cholátu) z HT-buněk stimulována podstatně účinněji než při použití extraktů (získaných pomocí cholátu) z NT-buněk. Tato skutečnost dokazuje, že zvýšená aktivovatelnost Gproteinů z HT-buněk může být rekonstituována v systému in vitro (obrázek 6). Z těchto zjištění je. navíc možné jednoznačně říci, že příčiny zásadních změn v HT-buňkách jsou situovány v podjednotkách βγ heterotrimerních Gproteinů. V experimentech sledujících možnost rekonstituce G-proteinů (o vyšší aktivovatelnosti) z HT-buněk není, v přítomnosti at, pozorována žádná aktivace podjednotek a přítomných v extraktech buněk (získaných pomocí cholátu). Fotoreceptor rhodopsin navíc specificky aktivuje pouze at a neaktivuje podjednotky a přítomné ve zmíněných extraktech.

Nově popsaný protein se skládá z 299 aminokyselin. Ve srovnání s lidskou podjednotkou ΰβ3 popsanou dříve, se v této nově popsané podjednotce nachází delece v oblasti čtvrtého opakování WD. Vzhledem k pravidelnosti výskytu určitých aminokyselin v sekvenci je nicméně možné předpoklá11 «· ···· ·· r ·· ·* ··· ···· • t · · · · · · · · • · · · · ···· · ··· *·· • · · » · · * «·»« · ·· · ·· ·· dat, še nový, zkrácený protein Θβ3 bude rovněž vytvářet vrtulovitou strukturu, v níž ale bude namísto sedmi listů vrtule (obrázek 1) pouze šest listů (obrázek 9).

Jelikož jsou jak N-konec, tak C-konec nové, zkrácené podjednotky Θβ3 stejné jako u dříve popsané podjednotky Θβ3, je možné u této zkrácené podjednotky předpokládat stejnou intenzitu interakcí s a a γ podjednotkami heterotrimerních G-proteinů a spřažení s receptory. Ve spojení s výsledky funkčních studií popsaných výše je zřejmé, že nová, zkrácená podjednotka Θβ3 je příčinou zvýšené aktivovatelnosti heterotrimernich G-proteinů, pozorované u pacientů trpících hypertenzí.

Předpokládá se, že důvodem výskytu zkrácené podjednotky σβ3 u pacientů trpících hypertenzí je alternativní sestřih genu kódujícího lidskou ΰβ3. Na úrovni DNA se přímo před předpokládaným místech sestřihu nalézá intron.

Tento intron začíná za baží 497 v otevřeném čtecím rámci (kde je A ve startovním kodonu ATG je definován jako +1).

Místa sestřihu tohoto intronu a místo větvení jsou znázorněny podtrženou kurzívou.

GGA CAC CAC GTG gtgaggctgaacattgctggtgctggggcttgggagtgggcccgg ccť.ttctctaacaqtctccctccattttqqcaq TGC CTT GTG GGA

Jelikož pomocí PCR je možné rovněž detekovat intron začínající v otevřeném čtecím rámci za baží 620, je zřejmé, že zkrácená forma lidského Θβ3 popsaná v této přihlášce je důsledkem alternativního sestřihu původní podjednotky Οβ3, kde tento alternativní sestřih vede k deleci celého exonu.

·· • · 0 0 • · · · · ·

000 0 *

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

1. PŘIHLAŠOVATEL:

(A) Jméno: BASF Aktiengesellschaft (B) Ulice: Carl-Bosh-Strasse 38 (C) Město: Ludwigshaften (D) Stát: Spolková republika Německo (E) PSČ: D-67056 (F) Telefon: 0621/6048526 (G) Telefax: 0621/6043123 (H) Telex: 1762175170 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Podjednotka β3 lidského G-proteinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 2 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kancelář (B) ULICE (C) MĚSTO (D) STÁT (E) PSČ:

Národní 32

Praha 1

Česká Republika 116 66 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č.

1.25 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:l:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1394	párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	POČET ŘETĚZCŮ: dva
	(D)	TOPOLOGIE:	lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: cDNA k mRNA
iii)	HYPOTETICKÝ: NE
(iv)	ANTISENSE: NE
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS	: Homo Sapiens
(ix)	CHARAKTERISTICKÉ	ZNAKY:
	(A)	NÁZEV/KLÍČ	: CDS
	(B)	UMÍSTĚNÍ:	1..900
(xi)	POPIS SEKVENCE:	SEK. ID. Č.;1:

ATG

GGG

GAG

ATG

GAG

CAA

CTG

CGT

CAG

GAA

GCG

GAG

CAG

CTC

AAG

48

Met

Gly

Glu

Met

Glu

Gin

Leu

Arg

Gin

Glu

Ala

Glu

Gin

Leu

Lys

1

5

10

15

CAG

ATT

GCA

GAT

GCC

AGG

AAA

GCC

TGT

GCT

GAC

GTT

ACT

CTG

GCA

GAG

96

Gin

Ile

Ala

Asp

Ala

Arg

Lys

Ala

Cys

Ala

Asp

Val

Thr

Leu

Ala

Glu

20

25

30

CTG

GTG

TCT

GGC

CTA

GAG

GTG

GGA

CGA

GTC

CAG

ATG

CGG

ACG

CGG

144

Leu

Val

Ser

Gly

Leu

Glu

Val

Gly

Arg

Val

Gin

Met

Arg

Thr

Arg

35

40

45

CGG

ACG

TTA

AGG

GGA

CAC

CTG

GCC

AAG

ATT

TAC

GCC

ATG

CAC

TGG

GCC

192

Arg

Thr

Leu

Arg

Gly

His

Leu

Ala

Lys

Ile

Tyr

Ala

Met

His

Trp

Ala

50

55

60

• · · · • · • · • · · · · · • · · ·· ·

ACT Thr

GAT Asp

TCT AAG CTG CTG GTA AGT

GCC TCG CAA GAT GGG AAG CTG

ATC Ile

240

Ser

Lys Leu Leu

Val

Ser

Ala

Ser

Gin

Asp

Gly

Lys

Leu

65

70

75

80

GTG

TGG

GAC

AGC

TAC

ACC

AAC

AAG

GTG

CAC

GCC

ATC

CCA

CTG

CGC

288

Val

Trp

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Lys

Val

His

Ala

Ile

Pro

Leu

Arg

85

90

95

TCC

TGG

GTC

ATG

ACC

TGT

GCC

TAT

GCC

CCA

TCA

GGG

AAC

TTT

GTG

336

Ser

Trp

Val

Met

Thr

Cys

Ala

Tyr

Ala

Pro

Ser

Gly

Asn

Phe

Val

100

105

110

GCA

TGT

GGG

CTG

GAC

AAC

ATG

TGT

TCC

ATC

TAC

AAC

CTC

AAA

TCC

384

Ala

Cys

Gly

Leu

Asp

Asn

Met

Cys

Ser

Ile

Tyr

Asn

Leu

Lys

Ser

115

120

125

CGT

GAG

GGC

AAT

GTC

AAG

GTC

AGC

CGG

GAG

CTT

TCT

GCT

CAC

ACA

GGT

432

Arg

Glu

Gly

Asn

Val

Lys

Val

Ser

Arg

Glu

Leu

Ser

Ala

His

Thr

Gly

130

135

140

TAT

CTC

TCC

TGC

CGC

TTC

CTG

GAT

GAC

AAC

AAT

ATT

GTG

ACC

AGC

480

Tyr

Leu

Ser

Cys

Arg

Phe

Leu

Asp

Asn

Ile

Val

Thr

Ser

145

150

155

160

TCG

GGG

GAC

ACC

ACG

TGT

GCC

AAG

CTC

TGG

GAT

GTG

CGA

GAG

GGG

ACC

528

Ser

Gly

Asp

Thr

Cys

Ala

Lys

Leu

Trp

Asp

Val

Arg

Glu

Gly

Thr

165

170

175

TGC

CGT

CAG

ACT

TTC

ACT

GGC

CAC

GAG

TCG

GAC

ATC

AAC

GCC

ATC

TGT

576

Cys

Arg

Gin

Thr

Phe

Thr

Gly

His

Glu

Sér

Asp

Ile

Asn

Ala

Ile

Cys

180

185

190

TTC

CCC

AAT

GGA

GAG

GCC

ATC

TGC

ACG

GGC

TCG

GAT

GAC

GCT

TCC

624

Phe

Pro

Asn

Gly

Glu

Ala

Ile

Cys

Thr

Gly

Ser

Asp

Ala

Ser

195

200

205

TGC

CGC

TTG

TTT

GAC

CTG

CGG

GCA

GAC

CAG

GAG

CTG

ATC

TGC

TTC

TCC

672

Cys

Arg

Leu

Phe

Asp

Leu

Arg

Ala

Asp

Gin

Glu

Leu

Ile

Cys

Phe

Ser

210

215

220

¹

CAC

GAG

AGC

ATC

TGC

GGC

ATC

ACG

TCT

GTG

GCC

TTC

TCC

CTC

AGT

720

His

Glu

Ser

Ile

Cys

Gly

Ile

Thr

Ser

Val

Ala

Phe

Ser

Leu

Ser·

225

230

235

240

GGC

CGC

CTA

TTC

GCT

GGC

TAC

GAC

TTC

AAC

TGC

AAT

GTC

TGG

768

Gly

Arg

Leu

Phe

Ala

Gly

Tyr

Asp

Phe

Asn

Cys

Asn

Val

Trp

245

250

255

GAC

TCC

ATG

AAG

TCT

GAG

CGT

GTG

GGC

ATC

CTC

TCT

GGC

CAC

GAT

AAC

816

Asp

Ser

Met

Lys

Ser

Glu

Arg

Val

Gly

Ile

Leu

Ser

Gly

His

Asp

Asn

260

265

270

AGG

GTG

AGC

TGC

CTG

GGA

GTC

ACA

GCT

GAC

GGG

ATG

GCT

GTG

GCC

ACA

864

Arg

Val

Ser

Cys

Leu

Gly

Val

Thr

Ala

Asp

Gly

Met

Ala

Val

Ala

Thr

275

280

285

GGT

TCC

TGG

GAC

AGC

TTC

CTC

AAA

ATC

TGG

AAC

TGAGGAGGCT <

GGAGAAAGGG

917

Gly

Ser

Trp

Asp

Ser

Phe

Leu

Lys

Ile

Trp

Asn

290 295

AAGTGGAAGG CAGTGAACAC ACTCAGCAGC TCTCTTCTAT ATTCCGGGTG CCATTCCCAC

CCCCTGCCCG

TAAGCTTTCT

300

ACCCCATCTC

CCTTTGAGGG

ATTCAGGTGT

CAGTGGGGAG

977

1037 • ·

1097

1157

1217

1277

1337

1394 ·· fefe·· ·· ·

CATGGGACTG TGCCTTTGGG AGGCAGCATC AGGGACACAG GGGCÁSÁGAA CTGCCCCATC *’ TCCTCCCATG GCCTTCCCTC CCCACAGTCC TCACAGCCTC TCCCTTAATG AGCAAGGACA ACCTGCCCCT CCCCAGCCCT TTGCAGGCCC AGCAGACTTG AGTCTGAGGC CCCAGGCCCT AGGATTCCTC CCCCAGAGCC ACTACCTTTG TCCAGGCCTG GGTGGTATAG GGCGTTTGGC CCTGTGACTA TGGCTCTGGC ACCACTAGGG TCCTGGCCCT CTTCTTATTC ATGCTTTCTC CTTTTTCTAC CTTTTTTTCT CTCCTAAGAC ACCTGCAATA AAGTGTAGCA CCCTGGT (2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 299 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(xi;	) POPIS	SEKVENCE: SEK.	ID.	v C. :	2 :
Met 1	Gly	Glu Met	Glu Gin Leu Arg 5	Gin	Glu 10	Ala Glu Gin Leu Lys Lys 15
Gin	Ile	Ala Asp 20	Ala Arg Lys Ala	Cys 25	Ala	Asp Val Thr Leu Ala Glu 30
Leu	Val	Ser Gly 35	Leu Glu Val Val 40	Gly	Arg	Val Gin Met Arg Thr Arg 45
Arg	Thr 50	Leu Arg	Gly His Leu Ala 55 ·	Lys	Ile	Tyr Ala Met His Trp Ala 60
Thr 65	Asp	Ser Lys	Leu Leu Val Ser 70	Ala	Ser	Gin Asp Gly Lys Leu Ile 75 80
Val	Trp	Asp Ser	Tyr Thr Thr Asn 85	Lys	Val 90	His Ala Ile Pro Leu Arg 95
Ser	Ser	Trp Val 100	Met Thr Cys Ala	Tyr 105	Ala	Pro Ser Gly Asn Phe Val 110
Ala	Cys	Gly Gly 115	Leu Asp Asn Met 120	Cys	Ser	Ile Tyr Asn Leu Lys Ser 125
Arg	GlU 130	Gly Asn	Val Lys Val Ser 135	Arg	Glu	Leu Ser Ala His Thr Gly 140
Tyr 145	Leu	Ser Cys	Cys Arg Phe Leu 150	Asp	Asp	Asn Asn Ile Val Thr Ser 155 160
Ser	Gly	Asp Thr	Thr Cys Ala Lys 165	Leu	Trp 170	Asp Val Arg Glu Gly Thr 175
Cys	Arg	Gin Thr 180	Phe Thr Gly His	Glu 185	Ser	Asp Ile Asn Ala Ile Cys 190

·· • · · ··· * · « · • · ···· · · · · • 9 · · · ···· · ··· ··· • · · · · · ·

999 9 99 9 99 99

Phe Phe

Pro 195

Asn

Gly Glu Ala Ile Cys Thr Gly Ser Asp Asp Ala

Ser

200

205

Cys

Arg

Leu

Phe

Asp

Leu

Arg

Ala

Asp

Gin

Glu

Leu

Ile

Cys

Phe

Ser

210

215

220

His

Glu

Ser

Ile

Cys

Gly

Ile

Thr

Ser

Val

Ala

Phe

Ser

Leu

Ser

225

230

235

240

Gly

Arg

Leu

Phe

Ala

Gly

Tyr

Asp

Phe

Asn

Cys

Asn

Val

Trp

245

250

255

Asp

Ser

Met

Lys

Ser

Glu

Arg

Val

Gly

Ile

Leu

Ser

Gly

His

Asp

Asn

260

265

270

Arg

Val

Ser

Cys

Leu

Gly

Val

Thr

Ala

Asp

Gly

Met

Ala

Val

Ala

Thr

275

280

285

Gly

Ser

Trp

Asp

Ser

Phe

Leu

Lys

Ile

Trp

Asn

290

295

PATENTOVÉ

NÁROKY

Claims

Podjednotka beta-3 lidského G-proteinu, notka zahrnuje maximálně šest opakování kde tato podjedmotivu WD.
2. Protein podle nároku 1, kde tento protein má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 2.
3. Nukleotidová sekvence kódující protein podle nároku 1 nebo 2.
4. Nukleotidová sekvence podle nároku 3, kde tato sekvence je popsána jako SEK. ID. Č: 1.
5. Způsob přípravy proteinu podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje použití nukleotidové sekvence podle jakéhokoliv z předchozích nároků spolu s vhodnými regulačními sekvencemi a expresi provedenou v hostitelském organizmu.
6. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že zmíněná exprese je provedena v buňkách imunitního systému pacientů trpících selháním imunity.
7. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím, že zmíněný pacient je HIV pozitivní.
8. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že zmíněná exprese je provedena v lidských somatických buňkách.
9. Použití nukleotidové sekvence podle jakéhokoliv z předchozích nároků k přípravě léčivých látek použitel18

A· ·· t A A 4

A A A

A A • A AAAA • AAA · ných k léčbě onemocnění spojených s poruchou funkce Gproteinů.
10. Použití genetické modifikace v genu pro podjednotku β3 lidského G-proteinu k diagnóze onemocnění.
11. Použití genetické modifikace v genu pro podjednotku β3 lidského G-proteinu ke stanovení rizika postižení onemocněním spojeným s poruchou regulace funkce G-proteinů.
12. Použití podle nároku 10 nebo 11, kde zmíněná genetická modifikace zahrnuje nukleotidovou sekvenci popsanou jako SEK. ID. Č: 1.
13. Použití podle nároků 10 až 12, kde zmíněným onemocněním je kardiovaskulární porucha, metabolická porucha nebo porucha imunitního systému.
14. Použití podle nároků 10 až 12, kde zmíněným onemocněním je hypertenze.
15. Použití nukleotidové sekvence podle jakéhokoliv z předchozích nároků k přípravě transgenních živočichů.
16. Použití nukleotidové sekvence komplementární k nukleotidové sekvenci podle nároku 3 nebo 4 k přípravě antisense léčiva k léčbě nebo prevenci onemocnění.
17. Použití podle nároku 16, kde zmíněným onemocněním je hypertenze, gravidní hypertenze, onemocnění srdečních věnčitých tepen, restenóza po revaskularizačních procedurách nebo mrtvice.

00 0000

00 0 ·* ··

00 0 000 0000 • · 0 0 0 0 0 · 0 · • 0 · 0 0 0000 · 000 ···

0 0 0 0 0 0 0

00000 ♦· · ·♦ ··
18. Použití podle nároku 16, kde zmíněným onemocněním je onemocnění, které je důsledkem diabetů, jako například nefropatie, polyneuropatie nebo retinopatie.
19. Použití podle nároku 16, kde zmíněným onemocněním je metastázující nádor.
20. Způsob použitelný ke stanovení relativního rizika postižení pacienta onemocněním spojeným s poruchou regulace funkce G-proteinů vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje srovnání sekvence genu pro podjednotku β3 lidského G-proteinu s nukleotidovou sekvencí popsanou jako SEK. ID. Č: 1 a v případě, že zmíněná sekvence genu pro podjednotku β3 lidského G-proteinu odpovídá SEK. ID. Č: 1, přiznání zvýšeného rizika onemocnění danému subjektu.
21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že srovnání genů je provedeno sekvenováním, restrikční analýzou nebo selektivní hybridizací.
22. Použití proteinu podle nároku 1 nebo 2 k přípravě protilátek specificky namířených proti tomuto proteinu.

·« ····

Obrázek 1 ·· 9

9 9 · 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 999 999

9 9 9 9 9

99999 99 9

99 99

9 9 9 9

9 9 9 9

999 999

9 9

Podjednotka γ