CZ505985A3 - Vector comprising gene encoding gm-csf protein of primaries, host cell being transformed thereby and process for preparing the primary gm-csf protein by making use thereof - Google Patents

Abstract

Recombinant colony stimulating factor (CSF) protein is claimed. It is prepd by isolating CSF protein as expressed from eukaryotic or prokaryotic host cells into which has been transformed a vector coding for the CSF protein. Also claimed is a method for prepg and isolating a transformation vector contg. CSF/CDNa by (a) prepg. RNA from a cell that produces CSF, (b) prepg. polyadenylated mRNA from this, (c) prepg single stranded CDNA from mRNA, (d) converting the single stranded CDNA to double stranded cDNA, (e) inserting the double stranded cDNA into transformation vectors and transforming bacteria with the vector to form colonies (f) picking pools of 200-500 colonies and isolating plasmid DNA from each pool, (g) transfecting the plasmid DNA into suitable host cells for expressing CSF protein, (h) culturing the transfected cells and assaying the supernatant for CSF activity and selecting CSF positive pools and screening the colonies used to make the pool to identify a colony having CSF activity.

Description

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká vektoru, který zahrnuje gen kódující bílkovinu GM-CSF primátů, hostitelské buňky, která je jím transformovaná, - a způsobu výroby bílkoviny GM-CSF..primázů za. jejího použití a rovněž cDNA, která odpovídá výše uvedenému genu.The invention relates to a vector comprising a gene encoding a primate GM-CSF protein, a host cell transformed therewith, and a method for producing a GM-CSF protein from a primate. its use as well as the cDNA corresponding to the above gene.

..Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Různé typy buněk, které se nacházejí v krvi/ je možno všechny odvodit od základních buněk, které se mohou dále diferencovat. Tyto základní buňky mají dvě funkce: /1/ reprodukují samy sebe, takže udržují populaci základních buněk v těle a /2/ vytvářejí další buňky, které se diferencují do různých zralých typů krevních buněk. Buňka, která se diferencuje určitým způsobem, se nazývá progenitor. Progenitor pro lymfocyty T, lymfocyty B, granulocyty, červené krvinky, destičky a eosinofilní buňky, jakož i nezralé progenitory, které mohou-dávat vznik různým typům zralých buněk byly pokusně studovány jak in vivo, tak in vitro, jak je popsáno například v publikaci Dexter, T.M. 1983 J. Pathology 141 415 - 433. In vitro bylo možno prokázat, Že prolyferace a/nebo diferenciace každého typu progenitoru závisí na specifických faktorech”, které je možno odvodit z různých zdrojů. Například progenitory pro červené krvinky vyžadují přítomnost faktorů, který byl nazván erythropoietin. Faktory, kterých je zapotřebí pro přežití^, prolýferaci a diferenciaci myeloidních progenitorů pro tvorbu zralých neutrofilních granulocytů, monocytů a zralých makrofágů se nazývají faktory, které podporují tvorbu kolonií (CSF).The different types of cells found in the blood can all be derived from the basic cells, which can further differentiate. These basic cells have two functions: (1) they reproduce themselves, so that they maintain a population of basic cells in the body and (2) they create additional cells that differentiate into different mature types of blood cells. A cell that differentiates in a certain way is called a progenitor. The progenitor for T-lymphocytes, B-lymphocytes, granulocytes, red blood cells, platelets and eosinophil cells, as well as immature progenitors that can give rise to different types of mature cells have been studied in vivo and in vitro as described, for example, in Dexter. , TM 1983 J. Pathology 141 415-433. In vitro, it has been shown that the proliferation and / or differentiation of each type of progenitor depends on specific factors that can be derived from various sources. For example, red blood cell progenitors require the presence of factors called erythropoietin. The factors required for survival, proliferation and differentiation of myeloid progenitors to produce mature neutrophil granulocytes, monocytes, and mature macrophages are called colony forming factors (CSFs).

účinnost těchto faktorů byla velmi důkladně studována u myší. Většina orgánů dospělých myší produkuje látku s účinností CSF. Sloučeniny, ktez ré mají určitou účinnost tohoto typu byly získány z různých tkání a různými způsoby, tyto látky se však-, od sebe poněkud liší svými biochemickými vlastnostmi.the efficacy of these factors has been studied extensively in mice. Most adult mouse organs produce a substance with CSF activity. Compounds having some activity of this type have been obtained from different tissues and in different ways, but these substances differ somewhat in their biochemical properties.

Z tohoto důvodu zůstává strukturní příbuznost různých faktorů zatím neznáma. Mimoto se zdá, že CSF působí pravděpodobně ve více než jednom stupni vývoje gra- 4 í<For this reason, the structural relationship of the various factors remains unknown. In addition, CSF appears to be active in more than one stage of the development of grains

nulocytů a makrofágů, přičemž opět není známo, zda znulocytes and macrophages, again it is not known whether z

je jediný faktor zodpovědný za všechny typy účinnosti nebo zda je zapotřebí, aby v každém stupni působil jiný faktor, jak je podrobněji popsáno v publikaci Burgess, A. a Metcalf, D. 1980 Blood 56 ........._ *is the only factor responsible for all types of efficacy or whether there is a need for a different factor at each stage, as described in more detail in Burgess, A. and Metcalf, D. 1980 Blood 56 ......... *

947-957.947-957.

Látka s účinností lidského CSP byla získána z placenty, některých ^ní plodu, z makrofágů a ze stimulovaných T—buněk. Linie T-buněk (Mo), která vytváří jednu nebo větší počet látek s účinností CSP byla získána z nemocného s leukémií,^ při níž byly zmnoženy určité varianty buněk T (Leukemická retikuloendothelliosa), jak bylo popsáno v publikaci Golde a další 1978 Blood 52 1068 - 1072.The human CSP was derived from the placenta, some fetuses, macrophages, and stimulated T cells. A T cell line (Mo) that produces one or more CSP-active substances was obtained from a patient with leukemia in which certain variants of T cells (Leukemia reticuloendothelliosis) were multiplied as described in Golde et al. 1978 Blood 52 1068-1072.

Schopnost CSP stimulovat granulocyty a makrofágy znamená, že farmaceutické prostředky s touto účinností by byX možno klinicky použít v těch situacích, kdyby bylo zapotřebí zvýšit produkci buněk myeloidního typu. Někteří nemocní s velmi vysokými hladinami normálních granulocytů měli ve skutečnosti nádory, které produkovaly příliš veliké mnpžství CSP. V jednom případě došlo po chirurgickém odstranění nádoru k rychlému poklesu počtu granulocytů na normální hladíSuT^což^by^edlO^k^názoruj—------- 5 že tímto způsobem by bylo možno regulovat počet obí— '·-- bájících granulocytů. ..Tento, názor byl vysloven také v publikaci Hocking, W., Goodman, J., a Golde D.,The ability of CSP to stimulate granulocytes and macrophages means that pharmaceutical compositions with this potency would be clinically useful in those situations if the production of myeloid-like cells had to be increased. Some patients with very high levels of normal granulocytes actually had tumors that produced too much CSP. In one case, after tumor removal, the granulocyte count rapidly decreased to normal levels, suggesting that the number of both defending patients could be controlled in this way. granulocytes. This opinion was also expressed in Hocking, W., Goodman, J., and Golde D.,

Blood 61 600 (1983). Farmaceutické prostředky s obsa- 3 hem CSP je možno užít klinicky při léčbě potlačení ;Blood 61,600 (1983). The CSP-containing pharmaceutical compositions can be used clinically in the treatment of suppression;

dřeně, která je způsobena po ozáření nádorů nebo při chemické léčbě těchto nádorů, Mimoto farmaceutické prostředky s obsahem CSF by mohly být užitečné při léčbě těžkých infekcí, protože CSP může zvýšit počet granulocytů a/nebo monocytň a/nebo může tyto elementy aktivovat.In addition, CSF-containing pharmaceutical compositions could be useful in the treatment of severe infections, since CSP may increase the number of granulocytes and / or monocytes and / or activate these elements.

ZOF

Existují různé typy známé účinnostiThere are various types of known efficacy

Z rZ r

CSP, včetně granulocytární účinnosti (G-CSF), učiňz nosti na makrofágy (M-CSF), účinnosti na granulocyty zCSP, including granulocytic activity (G-CSF), macrophage activity (M-CSF), granulocyte activity from

i makrofágy (GM-CSF) a účinnosti na větší počet těchto buněk. Vynález se zvláště zabývá otázkou výroby GM-CSF. Bílkoviny tohoto typu již byly izolovány z různých živočišných zdrojů, vynález se však zvláště týká výroby CSP ^savců, zvláště člověka a opic.macrophages (GM-CSF) and efficacy on a greater number of these cells. The invention is particularly concerned with the production of GM-CSF. Proteins of this type have already been isolated from various animal sources, but the invention relates in particular to the production of CSPs in mammals, especially humans and monkeys.

„ .. ------ BiQiogxeké ^a^_ biochemické-studie látek s účinností CSF byly až dosud brzděny skutečností, že jednak bylo těchto látek k dispozici velmi milé množství, zvláště pokud jde o CSF lidí a/nebo dalších primátů, jednak byly tyto látky nečisté. Je zřejmé, že by bylo žádoucí přesně identifikovat bílkovinu t* z nebo bílkoviny, které jsou nositel,^ účinnosti CSF."------ BiQiogxeké .. ^ ^_ and biochemical studies-CSF antiviral agents have hitherto been hampered by the fact that, first, these substances have been available for a very nice amount, especially as regards the CSF of humans and / or other primates, as well these substances were impure. It would be appreciated that it would be desirable to accurately identify the protein or proteins that carry CSF activity.

Dále by bylo žádoucí získat stálý zdroj CSF, s výhodou primátů a zvláště člověka, tak, aby bylo možno snadno získat tyto bílkoviny-ve větším množství a s čistotou, která je dostatečná pro zjištění biologických a biochemických vlastností těchto látek, aby Jí je pak bylo možno použít k léčbě.Furthermore, it would be desirable to obtain a stable source of CSF, preferably primates, and especially humans, so that these proteins can be readily obtained in larger quantities and with a purity sufficient to detect the biological and biochemical properties of these substances, used to treat.

V poslední době byla vyvinuta technika molekulárního klonování, která dovoluje klonovat sled nukleotidů, který je kádem pro bílkoviny a tak získat bílkovinu ve větším množství při vhodné volbě hostitele a vektoru, jak bylo popsáno v fcxiJa publikaci Maniatis, T. Molecular Cloning - Δ Laboratory Manuál Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Σ. 1982. Bílkovinu je možno izolovat a čistit běžnými způsoby. Způsoby klonování, které by-r ly až dosud použity je možno obecně rozdělit na tři skupiny: (1) způsoby, které jsou založeny na znalosti struktury bílkoviny, například na znalosti sledu aminokyselin, (2) způsoby, založené na identifikaci bilk koŤiny, jejíž expresi došlo při použití klonovaného genu použitím protilátky, specifické pro tuto bílkojr-inu-a—í-3-)—půsjohy-,, založené na identifikaci RNA,______ kterou je pak možno podrobit translaci za získání bílkoviny, pro niž je kódem uvedený gen. ·- Všechny tyto způsoby jsou velmi nesnadné v případě, že bílkovina, například CSP je k disposici ve velmi malém množství. Znamená to, že v případě, že je nesnadné získat dostatečné množství čištěné bílkoviny, je také nesnadné stanovit sled aminokyselin této bílkoviny nebo alespoň část toýČhoto sledu. Identifikace bílkoviny pi expresi vazbou na protilátku se s výhodou provádí při použití monospecifického polyklonálního antiséra s vysokým titrem. Toto antisérum však rovněž nelze získat bez většího množství čisté bílkoviny, kte% se užije jako angigen. Monoklonální protilátka poskytuje alternativní přístup, avšak požadovaná protilátka se také velmi nesnadno získává bez vhodného antigenů a mimo to monoklonální protilátka nemusí reagovat s bílkovinou ve formě, v níž u této bílkoviny došlo k expresi při dostupném systému hostitele a vektoru. Mimo to k translaci RNA - za získání- identifikovatelné bílkoví- - ny je zapotřebí, aby požadovaná RNA byla přítomna ve zdroji RNA v dostatečném množství, aby ji bylo zRecently, a molecular cloning technique has been developed that allows the cloning of a nucleotide sequence that is a tub of proteins and thus obtain a larger quantity of protein with appropriate choice of host and vector, as described in Maniatis, T. Molecular Cloning - Δ Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Spring.Σ. 1982. The protein may be isolated and purified by conventional means. The cloning methods which have been used hitherto can generally be divided into three groups: (1) methods based on protein structure knowledge, for example amino acid sequence knowledge, (2) methods based on the identification of bilkins, the expression occurred using a cloned gene using an antibody specific for this protein-α-β-3-β-ω-based, based on the identification of RNA, which can then be translated to obtain a protein encoded by the gene . All these methods are very difficult when a protein such as CSP is available in very small quantities. This means that if it is difficult to obtain a sufficient amount of purified protein, it is also difficult to determine the amino acid sequence of the protein or at least part of the sequence. The identification of the protein when expressed by antibody binding is preferably performed using a high titer monospecific polyclonal antiserum. However, this antiserum also cannot be obtained without a large amount of pure protein to be used as an angigen. The monoclonal antibody provides an alternative approach, but the desired antibody is also very difficult to obtain without suitable antigens, and moreover, the monoclonal antibody may not react with the protein in the form in which the protein was expressed using an available host and vector system. In addition, in order to translate RNA to obtain an identifiable protein, it is necessary that the RNA of interest be present in the source of the RNA in sufficient quantity to

možno oddělit. Relativní dostatek RNA, která je kódem pro určitou bílkovinu, jde obvykle ruku v ruce * e · • ·can be separated. The relative abundance of RNA that encodes for a particular protein usually goes hand in hand * e · • ·

ft s dostatkem proteinu, takže je možno říci, že protein vyskytující se v malém množství je obvykle kódován. mRNA, která se vyskytuje rovněž v malém množství.ft with sufficient protein, so it can be said that a protein occurring in small amounts is usually encoded. mRNA, which also occurs in small amounts.

Buněčná linie Mo byla užita jako výchozí materiál pro čištění lidského CSF a také pro identifikaci odpovídajících typů mRNA. Avšak i při použití tohoto poměrně dobrého zdroje CSF je nesmírně nesnadné izolovat dostatečné množství uvedené bílkoviny pro strukturální studie.The Mo cell line was used as a starting material for purification of human CSF as well as for identifying the corresponding mRNA types. However, even using this relatively good source of CSF, it is extremely difficult to isolate enough protein for structural studies.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

VIN

A.AND.

Č í;Č í;

« Vynález překonává problémy dosavadního stavu techniky tím, že poskytuje dobrý zdroj bílkoviny s aktivitou CSF, za použití genového inženýrství. Pro klonování cDNA. kódující protein s aktivitou CSF lze použít nový způsob klonování, pro který je nutný,pouze test aktivity CSF. Vhodné metody pro měření CSF jsou popsány dále v příkladu 2.The invention overcomes the problems of the prior art by providing a good source of protein with CSF activity, using genetic engineering. For cloning cDNA. encoding a protein with CSF activity, a new cloning method for which only the CSF activity assay is required. Suitable methods for measuring CSF are described below in Example 2.

Vynález tedy popisuje vektor zahrnující gen kódující bílkovinu GM-CSF primátů, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. I za šipkou pro CSF-Thr, CSF-Ile nebo CSF-G, nebo její aleiické nebo jiné funkční ekvivalenty, zachovávající si aktivitu GM-CSF v restu na lidské kostní dřeni, ve kterých je alespoň jedna aminokyselina přidána, nahrazena nebo odstraněna. Vynález rovněž popisuje cDNA. kódující bílkovinu s aktivitou CSF (tedy CSF/cDNA), mikroorganismus nebo buněčnou.....linii .. (hostitelskou buňku) , transformovanou rekombinantním vektorem obsahujícím takovou CSF/cDNA a způsob výroby bílkoviny' GM-SCF primátů pomocí exprese CSF/cDNA., při kterém se kultivuje výše uvedený mikroorganismus nebo buněčná linie. Jelikož je tato bílkovina produkována buňkou podle vynálezu, je jisté, že se jedná o bílkovinu· vykazující aktivitu CSF. Vektor pro transformaci obsahující CSF/cDNA lze připravit a izolovat ná^rďdůjTcím způsobem, při kterém se:Accordingly, the invention provides a vector comprising a gene encoding a primate GM-CSF protein having the amino acid sequence shown in Figure I after the arrow for CSF-Thr, CSF-Ile, or CSF-G, or its ali or other functional equivalents retaining GM- CSF in rest on human bone marrow in which at least one amino acid is added, replaced or removed. The invention also provides cDNA. encoding a protein with CSF activity (i.e., CSF / cDNA), a microorganism or cell line (host cell) transformed with a recombinant vector containing such CSF / cDNA and a method for producing a GM-SCF primate protein by CSF / cDNA expression wherein the above microorganism or cell line is cultured. Since this protein is produced by a cell of the invention, it is certain that it is a protein exhibiting CSF activity. A transformation vector containing CSF / cDNA can be prepared and isolated in the following manner:

r r ι* fr r ι * f

připraví RNA z buňka, která produkuje CSF;prepare RNA from a cell that produces CSF;

z uvedené RNA se připraví polyadenylovaná mRNA;polyadenylated mRNA is prepared from said RNA;

z uvedené mRNA se připraví cDNA s jednoduchým řetězcem; tato cDNA s jednoduchým řetězcem se převede na cDNA s dvojitým řetězcem;producing single stranded cDNA from said mRNA; converting this single-stranded cDNA to a double-stranded cDNA;

tato cDNA s dvojitým řetězcem se včlení do vektoru pro transformaci a tímto vektorem se transformují bakterie za vzniku kolonií;the double-stranded cDNA is inserted into a transformation vector, and this vector transforms the bacteria to form colonies;

spojí se vždy 200 až 500 kolonií a z každé skupiny kolonií se izoluje plasmidová DNA;200-500 colonies were pooled and plasmid DNA was isolated from each colony group;

plasmidovou DNA se transfektují vhodné hostitelské buňky pro expresi bílkoviny CSF;plasmid DNA is transfected with appropriate host cells to express the CSF protein;

tpansfektované buňky se kultivují a u .supernatantu se testuje aktivita CSF; a vyberou se vzorky pozitivní na CSF a kolonie použité pro vytvoření pozitivních vzorků se zkoumají pro zjištění, která kolonie vykazuje aktivitu CSF.tpansfected cells are cultured and the supernatant is assayed for CSF activity; and CSF positive samples are selected and colonies used to generate positive samples are examined to determine which colony exhibits CSF activity.

Tyto bílkoviny CSF jsou růstové a diferenciační hormony pro buňky myeloidního systému. Jsou určeny například pro klinické použití pro léčení myelosuprese, zejména v případě (symptomatické) granuiocytopenie po chemické léčbě nádorů nebo léčbě nádorů ozařováním.These CSF proteins are growth and differentiation hormones for myeloid system cells. They are intended, for example, for clinical use in the treatment of myelosuppression, particularly in the case of (symptomatic) granuiocytopenia after chemical treatment of tumors or treatment of tumors by radiation.

Popis obrázků na výkresechDescription of the drawings

Obr. 1 znázorňuje sled (sekvenci) DNA, který je kódem pro bílkovinu CSF. Úplná sekvence DNA kóduje lidský CSF; Změny“uvedené u lidského' sledu^-' jsou' rozdíly/ kzeré odlišují tento sled od sledu opiceGiant. 1 shows the DNA sequence coding for the CSF protein. The complete DNA sequence encodes human CSF; Changes "given the human 'sequence ^-' are 'differences / kzeré distinguish this sequence from the sequence of the monkey

- 11 Gibbon. Znázorněn je rovněž sled aminokyselin, který vzniká při použití uvedeného sledu SNA.- 11 Gibbon. Also depicted is the amino acid sequence produced by the use of said SNA sequence.

Na obr. 2 je schematicky znázorněn způsob výroby plasmidu pTPL z plasmidu pAdS26SVpA(3).Figure 2 schematically illustrates a method for producing plasmid pTPL from plasmid pAdS26SVpA (3).

* __ Obr. 3 je schematický pokračováním v* __ Giant. 3 is a schematic of the following

ňbr. 2 a znázorňuje způsob výroby plasmidů p91023 z plasmidu pTPL.ňbr. 2 and shows a process for producing plasmids p91023 from plasmid pTPL.

I- . Obr. 4 je schematickým pokračováním vI-. Giant. 4 is a schematic continuation of

obr. 3 a znázorňuje plasmid p91O23(B).Figure 3 shows plasmid p91O23 (B).

Sále bude uvedeno vysvětlení některých pojmů k usnadnění porozumění způsobu podle vynálezu. Pokud by se á* rozjísah definice odlišoval od běžného rozsahu v oboru, bude to dále uvedeno.Some terms will be explained below to facilitate understanding of the method of the invention. If the scope of the definition differs from the normal range in the art, it will be discussed below.

Amplifikace nebo pomnožení znamená * pochod, při němž buňka produkuje opakovaná; genu s vlastní chromosomální SNA.Amplification or multiplication means * a process in which a cell produces repeated; gene with its own chromosomal SNA.

CSF je látka s b^iogickým účinkem, í’ která je dále definována metodami stanovení.CSF is a biological substance which is further defined by methods of determination.

Bílkovina CSP je bílkovina z primátů, která má účinnost CSP. Pro potřeby vynálezu je pojem CSP jako bílkovina užíván i pro modifikované bílkoviny CSP, alelave variace bílkoviny CSP a pro tuto bílkovinu i v případě, že je před její řetězec zařazen zbytek METThe CSP protein is a primate protein that has CSP activity. For the purposes of the invention, the term CSP as a protein is also used for modified CSP proteins, but also for variations of the CSP protein and for this protein even when the rest of the MET is preceded by its chain

Směrem dolů znamená směrem ke 3 -zakončení nukleotidového sledu.Downward means toward the 3-terminus of the nucleotide sequence.

Sled, podporující reakci je nukleotidový sled, který může způsobit potenciaci transkripce genu nezávisle na své poloze vzhledem k tomuto genu nebo na orientaci sledu.A reaction-promoting sequence is a nucleotide sequence that can cause potentiation of gene transcription independently of its position relative to that gene or sequence orientation.

Gen je sled deoxyribonukleotidů,A gene is a sequence of deoxyribonucleotides,

Z Z který je kódem pro danou bílkovinu. Pro účely vynálezu gen nemá obsahovat oblasti, které jsou pro translaci zbytečné, například signální sledy, póly adenylové řetězce, promotory nebo podpůrné sledy.Z is the code for the protein. For the purposes of the invention, the gene should not contain regions that are unnecessary for translation, for example, signal sequences, adenyl chain poles, promoters or support sequences.

Vazba je způsob, při němž dochází zBinding is the way in which it occurs from

ke tvorbě iosfodiesterové vazby mezi 5 -zakončenímto form an phosphodiester bond between the 5-terminus

Z .OF .

a 3 -zakončením dvou řetězců DNA. Vazbu je možno provést několika známými způsoby při použití enzymů včetně T4 ligázy.and 3-terminating two strands of DNA. Binding can be accomplished by several known methods using enzymes including T4 ligase.

- ... Orientace je pořadínukleotidůve— sledu DNA. Převrácená orientace sledu DNA je takoZ z vá orientace, při níž je pořadí 5 - a 3 -zakončení jednoho sledu obráceno vzhledem k tomuto pořadí ve druhém sledu. Toto uložení je důležité proOrientation is the sequence of nucleotides in the DNA sequence. The inverted orientation of a DNA sequence is also the orientation in which the order of 5- and 3-terminations of one sequence is reversed relative to that order in the other sequence. This fit is important for

- 13 transkripci dalšího sledu DNA ve zdroji DNA nebo pro replikaci vektorů, které obsahují uvedený sled.Transcription of another DNA sequence in a DNA source or for replication of vectors containing said sequence.

Transkripce je syntéza SNA z původníTranscription is the synthesis of SNA from the original

DNA.DNA.

Transformace znamená změnu genotypu v v/ buňky tím* že buňka přijme cizorodou DNA. V některých případech je možno transformaci prokázat změnou v v fenotypu buňky. Transformované buňky se nazývají trans v >Transformation means altering the genotype in v / cells by receiving the foreign DNA. In some cases, transformation can be demonstrated by a change in the cell phenotype. The transformed cells are called trans v>

formanty, buňky před transformací jsou původní buňky.formants, cells before transformation are parent cells.

Translace je syntéza polypeptidů z mRNA.Translation is the synthesis of polypeptides from mRNA.

zof

Účinnost CSF je možno získat z velkého počtu buněčných zdrojů včetně prostředí, v němž vThe efficacy of CSF can be obtained from a large number of cellular sources, including the environment in which

se nacházejí mononukleární buňky periferní krve, z plicní a placentární tkáně, z kostní dřeně, z moči nemocných, který trpí chudokrevností, z krevního sera a z normálních a neoplastichých linií T-lymfocytů a monojáiukleárních fagocytů. Jednou buněčnou linií, která produkuje CSF je linie Mo. 6SF, produkované touto buněčnou linií je znám jako CSP pro granulocyty a makrofágy (GM-CSF), jde o lidský CSF.are peripheral blood mononuclear cells, from lung and placental tissue, bone marrow, from the urine of patients suffering from anemia, blood serum, and from normal and neoplastic lineages of T lymphocytes and mononuclear phagocytes. One cell line that produces CSF is the Mo line. The 6SF produced by this cell line is known as CSP for granulocytes and macrophages (GM-CSF), it is human CSF.

Jeden zdroj CSF opice Gibbon je linie T-buněk, která je označena jako UCD MLA-144. Tato buněčná linie byla uložena ve sbírce ATCC, odkud je možno ji získat pod číslem uložení; =One source of Gibbon monkey CSF is the T-cell line, which is designated UCD MLA-144. This cell line was deposited with the ATCC collection and can be obtained under deposit number; =

Aby bylo možno izolovat klon CSP. podle vynálezu, bylo nutno použít nového způsobu, který vyžaduje zejména stanovení účinnosti CSP.To isolate the CSP clone. according to the invention, it was necessary to use a new method which requires, in particular, the determination of CSP efficiency.

vin

Nejprve je nutno identifikovat buňku, která produV · kuje CSP, například T-lymfocyty nebo jiné buňky, jak bylo uvedeno svrchu. Pak se izoluje mRNA této vFirst, it is necessary to identify a cell that produces CSP, for example T-lymphocytes or other cells as mentioned above. The mRNA of this v

buňky. S výhodou se užívá T-lymfocytů. V tomto případě s mRNA, která je vázána na membránu a obsahuje ,bC>s ra-ENA pro lymfokiny/oddělí od volné mRNA v hunkách.cells. Preferably, T lymphocytes are used. In this case, with the membrane-bound and mRNA-containing mRNA, it is isolated from the free mRNA in hunks.

íand

Tímto oddělením se obohatí izolovaná mRNA 5 až lOkrát o sled, který je nutný pro výrobu lymfokinů a tím se snižuje námaha, vynalezená na identifikaci příslušného klonu. Pak se připraví chromatografií na oligo dT celulosá polyadenylová mRNA.This compartment enriches the isolated mRNA 5 to 10 times with the sequence required for lymphokine production, thereby reducing the effort invented to identify the respective clone. Cellulosic polyadenyl mRNA was then prepared by oligo dT chromatography.

Z mRNA še připraví skupina cDNA při použití vektoru, vhodného pro přenesení do hostitele zA cDNA group is prepared from the mRNA using a vector suitable for transfer to a host from a cDNA

k expresi požadované bílkoviny s účinností CSP.to express the desired protein with CSP activity.

Pák se připraví cDNA použitím standardních způsobů ze svrchu získané mRNA. Hybridní RNA/cDNA se pak převede na cDNA s dvojitým řetězcem a tento materiál je pak možno včlenit do vhodného vektoru .Then cDNA was prepared using standard methods from the above mRNA. The hybrid RNA / cDNA is then converted to double stranded cDNA and the material can then be incorporated into a suitable vector.

- 15 Vhodný systém hostitele a vektoru pro isolaci klonu CSF je založen na expresi cDNA ve vhodném vektoru pro transformaci. Vhpdným vektorem pro transformaci může být vektor, získaný přechodným včleněním DNA do buněk Ssavců způsobem podle publikace Mellon, Ρ., V. Parker, Y. Gluzman,A suitable host and vector system for isolating a CSF clone is based on expression of the cDNA in a suitable vector for transformation. An appropriate vector for transformation can be a vector obtained by transiently incorporating DNA into mammalian cells according to the method of Mellon, et al., V. Parker, Y. Gluzman,

T. Maniatis 1981 Cell 27 279 - 288. Aby bylo možno ( isolovat požadované transfořmanty CSP, není nutné, vT. Maniatis 1981 Cell 27 279 - 288. It is not necessary to isolate the required CSP

aby všechny buňky populace stabilně obsahovaly exogenní geny , které by bylo možno využít k expresi požadovaného CSF jako produktu. Je možné přechodně včlenit exogenní geny do subpopulace buněk tak, aby tato subpopulace produkovala požadovanou bílkovinu alespoň několik dnů. Protože není zapotřebí užít další látky k označení podle vynálezu, může dojít k tomu, že exogenní DNA se ztratí při buněčném růstu v průběhu jednoho až dvou týdnů. Avšak dva až tři dny pro přenesení do vhodných buněk ^savců je možno produkty nalézt a prokázat.that all population cells stably contain exogenous genes that could be used to express the desired CSF as a product. It is possible to temporarily incorporate exogenous genes into a subpopulation of cells so that the subpopulation produces the desired protein for at least several days. Since there is no need to use additional substances for labeling according to the invention, it may happen that exogenous DNA is lost in cell growth within one to two weeks. However, two to three days for transfer to suitable mammalian cells, the products can be found and detected.

Systém hostitel a vektor, který je vhodný pro toto použití je buněčná linie opic CV-1, transformovaná působením defektwní molekuly DNA SV40 jak bylo popsáno v publikaci Gluzman, Y., Cell 23 lV5~-~l8^y—198l·.—Transf ormované-opiči_bunky.^CV-l_,_______A host and vector system suitable for use herein is the monkey cell line CV-1 transformed with a defective SV40 DNA molecule as described in Gluzman, Y., Cell 23 &apos; ormed-monkey-cells. ^ CV-1 _, _______

- 16 které obsahují defektwní SV-40 DNA jsou označovány COS (CV-1, defektwřní, SV40), tyto buňky neobsahují uplnou kopii genomu SV—40, avšak produkují vysokou urovefil velkého antigenu T a dochází u nich k replikaci SV40 DNA. Tyto buňky také podporují replikaci- 16 which contain defective SV-40 DNAs are termed COS (CV-1, defective, SV40), these cells do not contain a full copy of the SV-40 genome but produce high urovefil of large T antigen and replicate SV40 DNA. These cells also support replication

SV40, které chybí na začátku některé části a bakteriálního plasmidu, který obsahuje SV40 podle publikace Myers, R.M. a Tjian, R. 1980 ENAS ££6491 - 6495.SV40 that is absent at the beginning of a portion and a bacterial plasmid that contains SV40 according to Myers, R.M. and Tjian, R. 1980 ENAS 6491-6495.

Tento systém tedy představuje prostředek pro amplifikace přenesené exogenní DNA přes SV40 za zvýšení hladiny mRNA a bílkoviny,^ýejíž expresi dochází za přítomnosti exogenní DNA. Je však možno užít i podobné systémy.Thus, this system provides a means for amplifying transferred exogenous DNA via SV40 to increase mRNA and protein levels expressed in the presence of exogenous DNA. However, similar systems may be used.

Vekt/ojy, užité k expresi CSíý typi<The vect (s) used to express CSα type

ky obsahují další pomocné části jako podpůrné slftdyu, promotory, introny, pólyadenylováná místa, 3 -nekod<£f oblasti a aktivátory translace, jak bude dále podrobněji vysvětleno.These include additional helper moieties such as promoters, promoters, introns, polyadenylated sites, 3-point regions and translation activators, as will be explained in more detail below.

, Vektory mphou obsahovat >e-dy. Podpůrné sledy se odlišují od promotoru, avšak mají s ním podobný účinek. Jejich funkce na buněčné úrovni není ještě dobře známa, avšak jejich jedinečnou vlastností je schopnost aktivace nebo potenciace transkripce bez závislosti na jejich poloze nebo, Mph mph vectors contain> e-dy. The support sequences differ from the promoter but have a similar effect with it. Their function at the cellular level is not yet well known, but their unique property is the ability to activate or potentiate transcription regardless of their location or

- 17 i- 17 i

Μ tΜ t

eE

1* p1 * p

Γ· *Γ · *

orientaci. Promotory musí hýt uloženy směrem vzhůru, kdežto podpůrné sledy mohou být uloženy směrem vzhůru od 5 -zakončení promotoru, uvnitř genu jako intrnn nebo směrem dolů mezi genem a polyadenylováným místem nebo 3 —zakončením polyadenylovaného místa. Promotory s převráceným sledem nejsou funkční, avšak převráce_r /-ceně podpůrné sledy jsou účinné. -Podpůrné., sledy mají vliv na promotory pouze v tom případě, že jsou přítomny na tomtéž řetězci DNA. Jejich úloha je podrobněji vysvětlena v publikaci Khoury a další, Cell 33. 313 - 314 (1983).orientation. Promoters must be positioned upside down, whereas support sequences may be positioned upstream of the 5-terminus of the promoter, within the gene as intrinsic or downward between the gene and the polyadenylated site or the 3-terminus of the polyadenylated site. Promoter with inverted sequence are functional but reverses _r / -Prices supporting sequences are effective. Supporting sequences affect promoters only if they are present on the same DNA strand. Their role is explained in more detail in Khoury et al., Cell 33, 313-314 (1983).

Výhodné podpůrné., sledy/pro použití v buňkách/ Ssavců je možno získat z živočišných vitu, například z opičího viru 40, z viru polyomu, z viru papillomu skotu, z retroviru nebo adenovitu. Ideální ot je, aby podpůrný sled byl odvozen od viru, pro který vPreferred support sequences (for use in mammalian cells) can be obtained from animal wool, for example simian virus 40, polyoma virus, bovine papilloma virus, retrovirus or adenovite. The ideal ot is that the support sequence should be derived from the virus for which v

je buňka hostitele propustná, t j. z viru, který normálně infikuje buňky tohoto hostitele. Pedpůxaé-_sle-dy z virů / je možno snadno získat z virů běžně dostupných ze sbírek. Oblasti podpůrných „sledů z některých virů, například z viru Rousova sarkomu a opičího vitu 40 jsou dobře známy, jak bylo popsáno v publikaci See Lučiv a další, Cell 33. 705 - 716 (1983) —Je rutinním-postupem -/-molekulárni^bielogie vyjmoutthe host cell is permeable, i.e., from a virus that normally infects the host cell. Preferred viruses from the virus are readily obtainable from viruses commonly available from collections. Regions of support sequences from some viruses, such as Rous sarcoma virus and simian vita 40, are well known, as described in See Luciv et al., Cell 33, 705-716 (1983). whitish cut

- 18 tyto oblasti podle známých map pro působení restrikčních enzymů pro jednotlivé viry a v případě potřeby _ modifikovat tyto oblasti, aby bylo možno včlenit podpůrnýsled do vektoru požadovaným způsobem. Tyto postupy jsou popsány například v publikacích Kaufman a další, J. Mol. Hbl., 159. 601 - 621 (1982) a Mol. Cell Biol. 2 (11), 1304 - 1319 (1982). Je také možno postupovát tak, že se podpůrný sled syntetizuje z údajů, které jsou o sledu známy. Jředpůmé sdedy z vitů obsahují obvykle méně než 150 párů baží a jsou dostatečně malé, aby je bylo možné syntetizovat.These regions according to known restriction enzyme treatment maps for individual viruses and, if necessary, modify these regions to incorporate a support sequence into the vector in the desired manner. Such procedures are described, for example, in Kaufman et al., J. Mol. Hbl., 159, 601-621 (1982) and Mol. Cell Biol. 2 (11), 1304-1319 (1982). Alternatively, the support sequence can be synthesized from data known about the sequence. The simple vera of vitas usually contain less than 150 pairs of bases and are small enough to be synthesized.

Další součástí vektoru by měl být pólyadenylováný sled. Jde o sled DNA, který je uložen směrem dolů od přenášené oblasti genu, obvykle těsně pod místem, v němž se zastavuje transkripce. Přidává^ se obvykle adenin^ribonukleotid^čímž vzniká polyadenir nukleotidové zakončení na 3 -zakončení mENA. Polyadenylace je důležitá pro stabilizaci mBNA proti dev gradaci v buňce, která může snížit množství mBNA a “ tím také množství výsledné^- bílkoviny. ·—··—Eukaryátická polyadanilová zakončení jsou dobře známa. Hexanukleotid 5 -AAUAAA-3 se nachází lí až 30 nukleotidů od místa, v němž polyadenylace už začíná. Sledy DNA, které obsahují polyadenylo- 19 trvaný sled, je možno získat z virů podle fax publikovaných zpráv. Polyadenylovaný sled je možno získat například z -niéát-ho beta-globinu a z opičího viru 40, avšak polyadenylováná místa, izolovaná z virů jsou výhodnější. Protože tyto sledy jsou známé, je možno je syntetizovat in vitro a navázat na vektory běžným způsobem.Another part of the vector should be a polyadenylated sequence. This is a DNA sequence that is located downstream of the transferred region of the gene, usually just below the transcription stop site. Typically, adenine ribonucleotide is added to form a polyadenir nucleotide terminus at the 3-terminus of mENA. Polyadenylation is important in stabilizing against MBNA dev gradation in the cell that can reduce the amount and MBNA "thus the amount of resultant ^- protein. Eucaryic polyadanil tails are well known. The hexanucleotide 5 -AAUAAA-3 is located up to 30 nucleotides from where the polyadenylation begins. DNA sequences that contain a polyadenylo-long sequence can be obtained from viruses according to fax published reports. A polyadenylated sequence can be obtained, for example, from an eateate beta-globin and simian virus 40, but polyadenylated sites isolated from viruses are more preferred. Since these sequences are known, they can be synthesized in vitro and coupled to vectors in a conventional manner.

Sled, který odděluje polyadenylovaný sled od kodonu, v němž/ se zastavuje translace, je s výhodou no-přenášenjr-sied-DNÁ, například eukar^atický gén bez promotoru. Protože promotor není přítomen, k expresi sledu nedojde. Tento sled by měl být do4 statečně dlouhý, řádu až přibližně 1000 baží od kodonu pro ukončení translace k polyadenylovánému sledu. Tento 3 - afrpřeaášený sled má obvykle za následek zvýšení výtěžku výsledného produktu. Vektor může končit přibližně 30 párů baží směrem dolů od polyadenyl o váného sledu, je však výhodnější zachovat 3 -sledy, které se nachází směrem dolů od polyadenylovaného sledu v jejich původní formě. Jde o sle0 dy, které mají obvykle 200 až 600 pár^. baží smetem dolů od polyadenylováného sledu.The sequence which separates the polyadenylated sequence from the codon in which translation is / is stopped is preferably a non-promoted gene, e.g., a promoter-free eukaryotic gene. Since the promoter is not present, the sequence is not expressed. This sequence should be bravely long, of the order of up to about 1000 bases from the translation termination codon to the polyadenylated sequence. This 3-afrained sequence usually results in an increase in the yield of the final product. The vector may end up to about 30 pairs down the polyadenyl sequence, but it is preferable to retain the 3-sequence downstream of the polyadenylated sequence in their original form. These are usually from 200 to 600 pairs. it sweeps down from the polyadenylated sequence.

Přítomnosti intronů v nepřenášené-.Presence of introns in non-transmitted.

části vektoru může rovněž zvýšit výtěžky výsledného produktu. Tyto introny je možno získat i z jiných - zdrojů než-z buňky hostitele nebo z genjá/ýUe například možno užít hybridní intron, který se izoluje z adenoviru nebo z genu pro imunoglobulin, včleněného směrem dolů od místa pro počátek transkripce v adeno— viru, čímž je možno zvýšit výtěžek výsledného produktu.parts of the vector can also increase the yields of the final product. These introns can be obtained from sources other than the host cell or genome, for example, by using a hybrid intron that is isolated from an adenovirus or immunoglobulin gene inserted downstream of an adeno virus transcription start site, thereby the yield of the final product can be increased.

Při výhodném provedení způsobu pro klonování CSP a pro konstrukci vektoru pro expresi je možno užít aktivačního genu pro translaci. Akt iz vátory translace jsou geny, které jsou kódem pro bílkovinu nebo pro SNA, které ovlivňují translaci požadované mRNA. Nejlepším příkladem je gen, který je spojený s xxxsn adenovirem (VAVAI), u tohoto genu dochází k transkripci a interakci se sledem v 5 -aepřená&ané oblasti mRNA adenovitu, jak bylo popsáno v publikaci Thimmappaya a další, 1982 Cell 3 543. Potřebné sledy pro aktivaci ttanslave působením VA RNA leží v oblasti vedoucího sledu mRNA adenoviru. Tento sled pochází . z genomu adenoviru a nachází se po transkripci v — zIn a preferred embodiment of the method for cloning CSP and for constructing an expression vector, an activation gene for translation can be used. Both actin and translational translation genes are genes that encode a protein or an SNA that affect the translation of the desired mRNA. The best example is the gene that is associated with xxxsn adenovirus (VAVAI), which transcribes and interacts with a sequence in the 5-annealed region of adenovirus mRNA, as described in Thimmappaya et al., 1982 Cell 3,543. activation of ttanslave by VA RNA lies in the adenovirus mRNA leader region. This sequence comes from. from the adenovirus genome and is found after transcription of v - z

blízkosti 5 -zakončení. VA RNA může aktivovat translaci mRNA. Vektory pro klonování a expresi cDNA tedy s výhodou obsahují tuto formu genů z genu adenovirunear 5-ending. VA RNA can activate translation of mRNA. Thus, cDNA cloning and expression vectors preferably contain this form of genes from the adenovirus gene

VA.VA.

Tyto vektory mohou být syntetizovány známým způsobem. Složky vektorů, například ' podpůrné- sledy, promotory a podobně je možno získat z přírodních zdrojů nebo syntetizovat, jak bylo uvedeno svrchu. Zásadně v případě, že tyto složky je možno naípézt v DNA, kterou je možno získat ve velkém množství, například jako složku virů nebo je-li možné tyto složky snadno syntetizovat, pak je možno tyto složky snadno získat při použití restrikčních enzymů a tím získat i velká množství vektorů tak, že se pěstuje organismus, který je zdrojem DNA, DNA /se rozštěpí příslušnou endonukleásou, fragmenty se oddělí, fragment s obsahem hledaného sledu se identifikuje a izoluje. Obvykle se vektor pro transformaci získá v malém množství a pak se naváže na vhod¹ ný vektor pro syntézu, u něhož dochází k autonomní replikaci například, na pxokarycfcicky plasniid nebo na fág. Ve většině případů je možno užít plasmý pB322 jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Kaufmana a dalších.These vectors can be synthesized in a known manner. Vector components, for example, promoters, promoters and the like, can be obtained from natural sources or synthesized as described above. In principle, if these components can be found in DNA, which can be obtained in large quantities, for example as a component of viruses, or if these components can be readily synthesized, then these components can be readily obtained using restriction enzymes and thereby obtain large amounts of vectors are grown by growing the organism which is the source of the DNA, cleaving the DNA with the appropriate endonuclease, separating the fragments, and identifying and isolating the fragment containing the sequence of interest. Typically, transformation vectors obtained in small quantity and then ligated to ¹ Nu suitable vector for synthesis in which there is autonomous replication, for example, on pxokarycfcicky plasniid or phage. Plasma pB322 can be used in most cases as described in Kaufman et al., Supra.

Vektory pro syntézu jsou užity ke klonování vektorů pro transformaci běžným způsobem, například přenesením do prokaryotického organismu, replikací vektoru pro syntézu za získání vysokého počtu kopií s následnou izolací tohoto vektoru rozštěpením buněka izolací tohoto vektoru z buněčné drti.Synthesis vectors are used to clone transformation vectors in a conventional manner, for example by transfer to a prokaryotic organism, by replicating the synthesis vector to obtain a high copy number, followed by isolating the vector by cleaving the cell by isolating the vector from cell debris.

4·4 ·

Vekt/ory s obsahem cDNA, připravené z buněk, které produkují látky s účinností CSF se pak přenesou do E. coli a pěstují na plot=· nách v Fetriho miskách v množství přibližně 2000 kolonií v misce. Pak se kolonie přenesou na nitroflThe cDNA-containing vect (s) prepared from cells producing CSF activity are then transferred to E. coli and grown on Fetri dishes at approximately 2000 colonies per dish. The colonies are then transferred to nitrofl

Z Z V celulozovy filtr a filtr se přenese na novou plotnu, která se uchovává jako vzorek. Po vypěstování koýlonií se tyto kolonie pomnoží a srovnávají se zZ Z The V cellulose filter and filter are transferred to a new plate, which is stored as a sample. After the cultivation of the colony, these colonies are multiplied and compared to the colonies

s původními koloniemi tak, aby úseky filtrů bylo í možno identifikovat s odpovídající částí plotny, užité jako vzorek.with the original colonies so that the filter sections can be identified with the corresponding portion of the plate used as the sample.

zof

Každý filtr se rozřeže na úseky, které obsahují předem stanovené počty kolonií, s výhodou přibližně 200 až 500 kolonií na usek.Each filter is cut into sections containing predetermined numbers of colonies, preferably about 200 to 500 colonies per section.

zof

Kolonie z každého useku se přenesou do živného ,, *#· prostředí, například do L-bujonu, Jí bakterie se ¹ oddělí odstředěním a izoluje se plasmidová DNA. Plasmidová DNA z každého useku filtračního papíru se přenese do vhodného hostitele k dosažení exprese bílkoviny. Výhodným vektorem pro syntézu jeThe colonies from each section are transferred to the nutrient ,, * # · medium, for example L-broth, eating bacteria is ^one separated by centrifugation and plasmid DNA was isolated. Plasmid DNA from each filter paper compartment is transferred to a suitable host to achieve protein expression. A preferred vector for synthesis is

- 23 Á mutanta pXsmidu pBR322 z E. soli, v němž byly vyv nechány sledy, které poškozují eukaryotickó buňky, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené citaci Kaufmana a dalších. Při použití této mutanty odpadá potřeba i zničit zbytek plasmidu před přenesením. Po vypěsto-r vání buněk po transfekci se prostředí zkoumá na pří-kladnost látek s účinností 6SF. Positivní výsledek zA β mutant pXsmid pBR322 from the E salt, in which sequences that damage eukaryotic cells were generated as described in Kaufman et al., Supra. Using this mutant, there is no need to destroy the remainder of the plasmid prior to transfer. After the cells were grown after transfection, the environment was examined for the 6SF activity. Positive result from

’ ukazuje na to, že ve zkoumaném useku filtru se nachází kolonie, která obsahuje CSP/cDNA.’Indicates a colony containing CSP / cDNA is present in the filter in question.

Aby byli možno stanovit, který z klonů useku filtru obsahuje CSP/cDNA, je zapotřebí zTo determine which of the filter clones contain CSP / cDNA, z is required

vypěstovat každý klon z useku filtru. Kultury se pak uloží do matrice a připraví se směs každé horizontál ní řady a každého vertikálního sloupce matrice. Z těchto směsí se připraví vzorky DNA a provede se transfekce do hostitelských buněk k dosažení exprese. Supernatanty, získané tímto způsobem se znovu zgrow each clone from the usku filter. The cultures are then placed in a matrix and a mixture of each horizontal row and each vertical column of the matrix is prepared. DNA samples are prepared from these mixtures and transfected into host cells for expression. The supernatants obtained in this manner are recovered from the

zkoumají na účinnost CSP. V obvyklém případě má tuto účinnost jedna směs vertikálního sloupce a jedna směs horizontální řady. Společný klon pak obsahuje CSP/cDNA. V případě, že matrice obsahuje více než jeden pozitivní klon, je pozitivní více než jeden sloupec a více než jedna řada. V tomto případě je ftinvestigate the effectiveness of CSP. Typically, one vertical column mixture and one horizontal row mixture have this efficiency. The common clone then contains CSP / cDNA. If the matrix contains more than one positive clone, more than one column and more than one row are positive. In this case, ft

zapotřebí dále roztřídit malé množství klonů, u nichž by přítomnost CSF/cDNA padala v úvahu.a small number of clones in which the presence of CSF / cDNA would be considered should be further sorted.

CSF/cDNA se z klonu izoluje pomocí restrikčních enzymů a známým způsobem je možno zjistit sled. Je zřejmé, že popsaný postup je možno použít k získání CSF/cDNA. z jakéhokoliv zdroje. Úplný sled je znázorněn na obr. 1 současně s předpokládaným, sledem aminokyselin bílkoviny, která je produktem po translaci..The CSF / cDNA is isolated from the clone by restriction enzymes and the sequence can be detected in a known manner. It is understood that the described procedure can be used to obtain CSF / cDNA. from any source. The complete sequence is shown in Figure 1 along with the predicted amino acid sequence of the protein which is the translation product.

Sled DNA, který je kódem pro bílkovinu s účinností CSF, tak, jak je znázorněn na obr. 1, může být modifikován běžným způsobem, čímž je možno získat pozměněný výsledný protein CSF, který stále má požadovanou účinnost při testech. Je například možno jednu, dvě, tři, čtyři nebo pět aminokyselin nahradit jinými aminokyselinami. V belgickém patentovém spisu č. 898 016 se popisuje typický způsob náhrady cysteinu například serinem. tThe DNA sequence coding for a protein with CSF activity, as shown in FIG. 1, can be modified in a conventional manner to yield an altered resulting CSF protein that still has the desired assay performance. For example, one, two, three, four or five amino acids may be replaced by other amino acids. Belgian Patent Specification No. 898,016 describes a typical method of replacing cysteine with, for example, serine. t

CSF/cDNA podle vynálezu obsahuje úplný gen, kterému předchází kodon A.TG a CSF/cDNA, který je kódem pro aleiické variace bílkoviny CSF. Jedna aleia je znázorněna.na obr. 1. Další alela, která byla nalezena při práci na vynálezu má thymidinový zbytek v poloze 365 místo cytosinového zbytku, který je znázorněn na obr. 1. Bílkovina CSF, získaná podle vynálezu, zahrnuje také 1-methioninový derivát (Met-CSF) a aleiické variace bílkoviny CSF. Úplná bílkovina CSF, tak, jak je znázorněna sledem na obr. 1, začíná sledem Ala-Pro-Ala-Arg..., jehož začátek je označen šipkou po nukleotidu v poloze 66 na obr. 1. V případě Met-CSF začíná tato· látka sledem Met-Ala-Pro-Ala-Arg... . Aleiické variace, znázorněná na obr. 1, obsahuje Thr v poloze 100 (zbytek začíná u Ala za šipkou) a je možno ji označit jako CSF (Thr). Jiná variace má zbytek Ile v poloze 100 a je možné ji označit jako CSF (Ile) . Pro· úplnost zde uvádíme, že zde používaná zkratka CSF-G označuje GM-CSF gibona.The CSF / cDNA of the invention comprises a full length gene preceded by the codon A.TG and a CSF / cDNA that encodes aleic variations of the CSF protein. One allele is shown in Figure 1. Another allele found in the present invention has a thymidine residue at position 365 instead of the cytosine residue shown in Figure 1. The CSF protein obtained according to the invention also includes 1-methionine a derivative (Met-CSF) and aleic variations of the CSF protein. The complete CSF protein, as depicted in the sequence in Figure 1, starts with the sequence Ala-Pro-Ala-Arg ..., which is indicated by an arrow at nucleotide 66 at Figure 1. In the case of Met-CSF, this begins · Substance of the sequence Met-Ala-Pro-Ala-Arg .... Aleic variation, shown in Fig. 1, comprises a Thr at position 100 (the residue starts at Al behind the arrow) and may be referred to as CSF (Thr). Another variation has an Ile residue at position 100 and may be termed CSF (Ile). For completeness, the abbreviation CSF-G used herein refers to the GM-CSF Gibbon.

* i ♦* i ♦

- 25 Γ -* · řř re r * * ♦ r * * * t · » ř« » * » » e e · *- Γ 25 · ř re 25 25 25 25 25 25 25 e e e

Čištěná bílkovina CSF má specifickou účinnost (aktivitu) alespoň 10⁷ jednotek na mg bílkoviny a s výhodou alespoň 4xl0⁷ jednotek na mg bílkoviny, při provádění testu účinnosti na buňkách lidské kostní dřeně.The purified CSF protein has a specific activity (activity) of at least 10 ⁷ units per mg protein, and preferably at least 4x10 ⁷ units per mg protein, when performing an activity assay on human bone marrow cells.

Systémy hostitel-vektor pro expresi CSF mohou být prokaryotické nebo eukaryotické, avšak vzhledem ke komplexnosti CSF je výhodnějším systémem pro expresi systém ze savce. Exprese se snadno dosáhne transformací prokaryotických nebo eukaryotických buněk vhodnýmvektorem pro CSF. .....Host-vector CSF expression systems may be prokaryotic or eukaryotic, but due to the complexity of CSF, the mammalian expression system is more preferred. Expression is readily achieved by transforming prokaryotic or eukaryotic cells with a suitable CSF vector. .....

Sled DNA, získaný výše uvedeným způsobem, může být exprimován přímo v buňkách savce za řízení vhodným promotorem. Je možno užít heterologní promotory, které jsou v oboru dobře známy.The DNA sequence obtained as described above can be expressed directly in mammalian cells under the control of a suitable promoter. Heterologous promoters well known in the art can be used.

Aby bylo možno dosáhnout exprese CSF v prokaryotických buňkách nebo buňkách kvasinek, je nutno odstranit vedoucí sled (sled pro sekreci). Poloha kodonu pro N-zakončení úplného proteinu CSF je znázorněna na obr. 1. Jakmile se získá požadovaný klon CSF/cDNA, je možno užít příslušné známé prostředky k dosažení exprese bílkoviny CSF, například včlenění do příslušného vektoru, přenesení vektoru do příslušné buňky hostitele, selekce a transformace buněk a pěstování transformovaných buněk k dosažení exprese CSF.In order to achieve CSF expression in prokaryotic or yeast cells, a leader sequence (secretion sequence) must be removed. The codon position for the N-terminus of the full length CSF protein is shown in Figure 1. Once the desired CSF / cDNA clone is obtained, appropriate known means can be used to achieve expression of the CSF protein, for example by incorporation into the appropriate vector. selecting and transforming the cells and growing the transformed cells to achieve CSF expression.

Takto získaná bílkovina CSF může mít methioninový zbytek na N-konci bílkoviny (jde tedy o Met-CSF). Úplné maturované (zralé) bílkoviny, produkované prokaryotickými a eukaryotickými buňkami budou mít sled aminokyselin popřípadě totožný, avšak eukaryotické buňky mohou produkovat produkt, který bude do určité'míry jinak giykosylovaný než původní přírodní produkt.The CSF protein thus obtained may have a methionine residue at the N-terminus of the protein (i.e. Met-CSF). The full-length mature proteins produced by prokaryotic and eukaryotic cells will optionally have the same amino acid sequence, but eukaryotic cells may produce a product that will be otherwise glycosylated to some extent than the original natural product.

Bílkovina CSF, k jejíž expresi došlo v příslušných prokaryotických nebo eukaryotických buňkách může být izolována a čištěna způsoby, které jsou v oboru známy. Dále je popsán nový způsob čištění, který umožňuje získat bílkovinu ňČsF^zTůre 1<οηΰ3ΊίΈΰΚΠΐΐούΓ~ί^pfírodurch~zdro j ů ve vyso-k-é----čistotě a s vysokou aktivitou.The CSF protein expressed in appropriate prokaryotic or eukaryotic cells can be isolated and purified by methods known in the art. Further, a novel purification method is described which makes it possible to obtain a protein from the sources of high purity and high activity.

26-2826-28

Tento způsob odstraňuje problémy, dříve spojené s izolací a čištěním bílkoviny s účinností CSF. Bílkovina CSF, získaná tímto způsobem, má specifickou aktivitu alespoň lxlO⁷ jednotek na mg bíloviny, s výhodou alespoň 2xl0⁷ jednotek na mg bíloviny, zvláště 4xl0⁷ jednotek na mg bíloviny, při testování na buňkách lidské kostní 'dřeně.This method eliminates the problems previously associated with protein isolation and purification with CSF activity. The CSF protein obtained by this method has a specific activity of at least 1x10 ⁷ units per mg protein, preferably at least 2x10 ⁷ units per mg protein, especially 4x10 ⁷ units per mg protein, when tested on human bone marrow cells.

Při práci uvedeným způsobem se bílkovina CSF čistí následovně: bílkovina se vysráží síranem amonným, přidávaným do vysycení na 80 %, čímž se získá peleta bílkoviny CSF, .In this process, the CSF protein is purified as follows: the protein is precipitated with ammonium sulfate added to saturation to 80% to give a pellet of CSF protein.

která se znovu suspenduje v roztoku pufru při pH 6 .až 8 a takto získaný roztok se nanese na vrchol chromatografického sloupce, sloupec se promývá pufrem s obsahem chloridu sodného a¹ odebírají se frakce s aktivitou CSF. Účinné frakce se slijí, nanesou se na sloupec C4 v reverzní fázi a sloupec se vyjímá postupně zvyšovaným množstvím acetonitrilu v koncentraci 0 až 90 % k získáni účinné frakce.which was resuspended in buffer solution at pH 6 and 8 .When the solution thus obtained was applied to a chromatography column, the column was washed with buffer containing sodium chloride and collecting ^one fraction with activity of the CSF. The active fractions were combined, applied to the reverse phase C4 column, and the column was removed sequentially with increasing amounts of acetonitrile at a concentration of 0-90% to obtain the active fraction.

Popis čištění v souvislosti s vyobrazenímDescription of cleaning in connection with the illustration

Na obr. 5 je znázorněna analýza čištěné bílkoviny CSF (SDS-PAGS) .'Figure 5 shows analysis of purified CSF protein (SDS-PAGS).

Bílkovina CSF, která má být čištěna výše uvedeným způsobem, může být získána z libovolného z.přírodních zdrojů popsaných výše jako výchozí zdroje pro genové inženýrství. Jedná se o řadu buněčných zdrojů včetně kondicionovaného média, například buněčné linie Mo nebo buněčné linie UCD MLA-144 gibona.The CSF protein to be purified as described above can be obtained from any of the natural sources described above as starting sources for genetic engineering. These are a variety of cellular sources including conditioned media, such as the Mo cell line or the UCD cell line MLA-144 of the Gibbon.

...... -BiiKovina- -CSF- může - být - -produkována také --za- použití genového inženýrství, jak je popsáno výše.The -CSF- can also be produced using genetic engineering as described above.

Výše uvedeným způsobem lze tedy čistit bílkovinu CSF z jakéhokoliv zdroje. Postupuje se tak, že se prostředí s výhodou zahustí ultrafiltrací na koncentraci bílkoviny alespoň 0,1 mg bílko- 29 viny/ml. Bílkovina se pak vysráží přidáním síranu amonného do nasycení 80 Výsledná peleta se znovu uvede v suspenzi ve vodném roztoku pufru o pH 6 ažThus, the CSF protein can be purified from any source as described above. Preferably, the medium is concentrated by ultrafiltration to a protein concentration of at least 0.1 mg protein / ml. The protein is then precipitated by the addition of ammonium sulphate to saturation. The resulting pellet is resuspended in an aqueous buffer solution of pH 6 to 6.

8. Příkladem vhodných pufrů mohou být Tris-HCl,8. Examples of suitable buffers are Tris-HCl,

HEPES, citronan sodný a podobně.HEPES, sodium citrate and the like.

Roztok v pufru se podrobí dělení chromatografií na sloupci. Vhodným materiálem pro v z použití v tomto sloupci je například oktylspharosa, DEAE-ultrogel, AcA44-ultrogel, AcA-54 ultrogel, a podobně. Je možno užít jeden nebo větší počet těchto materiálů po sobě k získání větší čistoty výsledné látkyvThe buffer solution is subjected to column chromatography. Suitable materials for use in this column are, for example, octylspharose, DEAE-ultrogel, AcA44-ultrogel, AcA-54 ultrogel, and the like. One or more of these materials in succession may be used to provide greater purity to the resulting material

Z každého sloupce se odebírají zThey are removed from each column

frakce a tyto frakce se zkoumají na účinnost CSP. Účinné frakce se slijí a zředí se kyselinou trifluoroctovou (TPA), kyselinou heptafluormáselnou (HPBA) a podobně, a materiál se nanese na sloupec zfractions and these fractions are examined for CSP activity. The active fractions were combined and diluted with trifluoroacetic acid (TPA), heptafluorobutyric acid (HPBA), and the like, and the material was applied to a column of

C4 v reverzní fázi. Sloučenina s účinností CSP se pak vymývá při použití stoupajícího množství acetonjíitrilu od 0 do 90 % v TPA nebo HFBA, s výhodou v koncentraci 0,10 /o až 0,15 fy objemových, v závislosti na použité kyselině.C4 in reverse phase. The compound with CSP activity is then eluted using increasing amounts of acetonitrile from 0 to 90% in TPA or HFBA, preferably at a concentration of 0.10 / 0 to 0.15 phy by volume, depending on the acid used.

- 30 Frakce s/ účinností CSF se analyzují na SDS polyakrylamidovém gelu elektroforézou, užije se gel o koncentraci 13,5 %, jak bylo popsáno v publikaci Lammli, U. Nátuře 227. 680 (1970). Je možno užít ještě další postupy k dosažení homogennější vCSF fractions with / activity were analyzed by SDS polyacrylamide gel by electrophoresis, using a 13.5% gel as described by Lammli, U. Nature 227, 680 (1970). Still other methods may be used to achieve a more homogeneous level

bílkoviny CSF. Čištěná bílkovina CSF po frakoionaci elektroforéaou na SDS-polyakrylamidovém gelu poskytla heterogenní bílkovinu CSF s molekulovou hmotností v rozmezí 15 000 až 26 000 jednotek. Tato zjevná heterogenita je následkem veliké glykosylace bílkoviny a je běžnou vlastností glykoproteinu. Při frakcionaci méně čistého vzorku z buněk Mo stejným způsobem s analýzou bílkoviny prokázala přítomnost další bílkoz viny s účinností CSF, jejíž molekulová hmotnost byla 28 000 až 30 000 jednotek.protein CSF. Purified CSF protein after fractionation by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gave a heterogeneous CSF protein having a molecular weight in the range of 15,000 to 26,000 units. This apparent heterogeneity is due to the high glycosylation of the protein and is a common property of the glycoprotein. Fractionation of a less pure sample from Mo cells in the same manner with protein analysis showed the presence of another CSF protein with a molecular weight of 28,000-30,000 units.

zof

Látky s účinností CSF se váží a znov z P * vu uvolňují z oktylseyarp4y, DEAE ultrogelu a sloupce C4 v reverzní fázi. Přibližně 60 % účinnosti CSF se váže na Con-A sepharosu (40 % prochází bez zachyť X cení) a je možno tuto látku pak vymýt methylmannosidem.Substances with CSF activity bind and release from P * vu from octylseyarp4y, DEAE ultrogel and reverse phase C4 column. Approximately 60% of the CSF activity binds to Con-A sepharose (40% passes without capturing X) and can then be eluted with methylmannoside.

Analýza molekulové hmotnosti rekombinantní CSF gelovou filtrací v prostředí s nízkým obsahem solí prokazuje, že přibližně 30 účinnosti i/ tvořené sloučeninou s molekulovou hmotností 19 000 je homogenní, avšak 70 % materiálu se chová jako dimer, takže se vymývá v poloze, která odpovídá molekulové hmotnosti přibližně 38 000. V případě, že se do sloupce přidá chlorid sodný v koncentraci ÍM, vymývá se veškerá účinnost v širokém vrcholu, který odpovídá sloučenině s molekulovou hmotností přibližně 19 000 jednotek.Molecular weight analysis by recombinant CSF gel filtration in a low salt environment demonstrates that approximately 30 i / efficacy of a 19,000 molecular weight compound is homogeneous, but 70% of the material behaves as a dimer, eluting at a molecular weight position 38,000. When sodium chloride is added to the column at a concentration of 1 M, all potency is eluted at a broad peak corresponding to a compound having a molecular weight of about 19,000 units.

Čištěná bílkovina CSF je stálá alespoň 16 hodin při teplotě 4 °C a pH 7,4 v 4M guanidin hydrochloridu, v 10 mM ESTA, lOwM 2-merkaptoethanolu a v 30ýe (objemová procenta) ethanolu)** Látka s účinností CSF je stálá také v 0,lýo kyselině trifluoroctové při pH 2,0 a 0,lýo kyselině trifluoroctové s 25 % objemovými acetonitrilu.The purified CSF protein is stable for at least 16 hours at 4 ° C and pH 7.4 in 4M guanidine hydrochloride, in 10mM ESTA, 10wM 2-mercaptoethanol, and in 30% (v / v) ethanol). in 0.1 L trifluoroacetic acid at pH 2.0 and 0.1 L trifluoroacetic acid with 25% v / v acetonitrile.

Jak ji/ bylo uvedeno, bílkovina CSF, získaná způsobem podle vynálezu je určena pro použití k léčbě utlumu dřeně, například při (sympromatické)granulocytophenii, která může být způsobena léčbou nádorů chemicky nebo ozářením. Mimo to je možno bílkoviny CSF , vyrobené způsobem podle vynálezu použít k léčbě těžkých infekcí. K tomuto použití se užije dávka 200 až 1000 mikrogramů denně. BílkovinaAs noted above, the CSF protein obtained by the method of the invention is intended for use in the treatment of pulp suppression, for example in (sympromatic) granulocytophenia, which may be caused by treatment of tumors chemically or by radiation. In addition, the CSF proteins produced by the method of the invention can be used to treat severe infections. A dose of 200 to 1000 micrograms per day is used. Protein

- 32 CSP se s výhodou podává nitrožilně’ spolu s vhodným farmakologickým nosičem. Příkladem vhodného nosiče může být roztok chloridu sodného a lidský sérový albumin v roztoku chloridu sodného.Preferably, the CSP is administered intravenously, together with a suitable pharmacological carrier. Examples of suitable carriers include sodium chloride solution and human serum albumin in sodium chloride solution.

Mimo to má bílkovina CSP, vyrobená způsobem podle vynálezu ještě další účinky a další použití. Bylo například prokázáno, že CSP myší aktivuje neutrofily. Bylo by možno očekávat, že CSP primátů, získaný způsobem podle vynálezu bude rovněž aktivovat neutrifily. Fyziologické funkce této bílkoviny j-sou tedy mnohotvárné. V kostní dřeni může tato látka podporovat vývoj a diferenciaci buněk, které zajištují obranu, na periferii pak aktivuje vIn addition, the CSP protein produced by the process of the invention has further effects and other uses. For example, CSP has been shown to activate neutrophils in mice. It would be expected that the primate CSP obtained by the process of the invention would also activate neutrifiles. Thus, the physiological functions of this protein are multifaceted. In the bone marrow, this substance can promote the development and differentiation of cells that provide defense, then activates

nové i existující buňky. Při místní imunologické reakci může CSP způsobit nahromadění nebo nepřítomnost neutrofilů v zanícené oblasti. Nevhodná lokalizace a/nebo aktivace neutrofilů může být jednou z příčin patofyziologie různých poruch imunologického systému, například reumatoidních arthritid.new and existing cells. In a local immunological response, CSP may cause the accumulation or absence of neutrophils in the inflamed area. Inappropriate localization and / or activation of neutrophils may be one of the causes of the pathophysiology of various disorders of the immunological system, for example rheumatoid arthritis.

......... ....... Vy_náie2 bude dále^- osvětlen v sou- vislosti s příklady, kteéé jsou určena pouze k osvět lení, nikoliv však k omezení způsobu podle vynálezu a znázorflují, jak je možno prakticky provádět způsob podfe vynálezu.......... ....... _n áie2 You will be ^- illuminated con- sequences in the examples are only intended kteéé on of lighting but not to limit the present method and znázorflují as the process according to the invention can be practiced practically.

- 33 Pokud není uvedeno jinak, jsou všech ny teplotní údaje v příkladové části přihlášky uvedeny ve stupních Celsia.Unless otherwise stated, all temperature data in the exemplary portion of the application is given in degrees Celsius.

Restrikční endonukleázy jsou užívány za podmínek a způsobem, který je doporučen jejich výrobcem. Reakce, při nichž dochází k vazbě, jsou přiváděny podle svrchu uvedené publikace Maniatise a dalších na str. 245 až 6 při použití pufru, který je popsán na str. 246 uvedené publikace a koncentrace LNA v rozmezí 1 až 100/Mg/ml při teplotě 23 °C pro, DNA se slepými konci a 16 °C pro DNA s konci, které se na sel^á snadno váží. Elektroforéza se provádí na 0,5 až 1,5% agarozovém gelu s obsahem 90 mM Tris-boritanu a 10 mM SDTA. Všechna DNA, značená radioaktivně je značena 32P.Restriction endonucleases are used under conditions and in the manner recommended by the manufacturer. Binding reactions are carried out according to Maniatise et al., Pages 245-6, using the buffer described on page 246 of this publication and LNA concentrations in the range of 1 to 100 / Mg / ml at temperature 23 ° C for DNA with blind ends and 16 ° C for DNA with ends that readily bind. Electrophoresis is performed on a 0.5-1.5% agarose gel containing 90 mM Trisborate and 10 mM SDTA. All radiolabeled DNA is 32P labeled.

Pod pojmem rapid prep” se rozumí rychlá produkce DNA bakteriofágu nebo plasmidu v malém měřítku, tak, jak je popsána například ve svrchu uvedené publikaci Maniatise a dalších na str. 365 až 373.Rapid prep refers to the rapid production of small-scale bacteriophage or plasmid DNA, as described, for example, in Maniatis et al., Pp. 365-373.

- 34 Příklad A v- 34 Example A v

Stupen 1 Linie buněk MoStep 1 Mo cell line

Buňky Mo (ATCC CRL 8066) se běžně pěstují na prostředí alfa se 6 % oxidu uhličitého nebo prostředí podle Iscova s 10 % oxidu uhličitého a 8 obsahem 20 % fetálního telecího sera (FCS), mM glutaminu, 100 jednotek/ml streptomycinu a vMo cells (ATCC CRL 8066) are routinely grown in alpha medium with 6% carbon dioxide or Iscova medium with 10% carbon dioxide and 8 containing 20% fetal calf serum (FCS), mM glutamine, 100 units / ml streptomycin and v.

100 ^ug/ml penicilinu. Buňky je nutno přeočkovávat v100 µg / ml penicillin. Cells should be re - vaccinated in

každé 4 až 5 dnů. Buňky se spočítají a pak se jimi očkují Palconovy T-175 lahve s obsahem 100 až 150 ml živného prostředí při hustotě 3 až 4 x 10^ buněk/ml. Počet buněk se zdvojnásobí za přítomnosti 20 % FCS za 4 až 7 dnů. Rychlost růstu není stálá a nikdy mor vevery 4 to 5 days. Cells are counted and then seeded with Palcon's T-175 flasks containing 100-150 ml of culture medium at a density of 3-4 x 10 6 cells / ml. The number of cells is doubled in the presence of 20% FCS in 4 to 7 days. The rate of growth is not constant and never plague in

hou buňky zcela zastavit růst, načež se náhle rychle vthe cells completely stop growing, then suddenly quickly in

rozrůstají. Buňky Mo je možno pěstovat také v prostředí, které je prosté scíra. Přežívání buněk je vare growing. Mo cells can also be grown in a serum-free environment. Cell survival is in

mnohem lepší v případě, že se buňky při přenesení z FCS do prostředí, které je sera prosté nepromývaji. Optimální hustota v prostředí, které je prosté 5 ^v z sera (SF) je 5 i 10 buněk/ml. Buňky mírně rostou, vmuch better if cells do not wash when transferred from FCS to a serum-free environment. The optimal density in an environment that is free of 5 ^v of serum (SF) is 5 and 10 cells / ml. Cells grow slightly, h

nebo alespoň si zachovávají stejný počet buněk po tři dny v prostředí, které je prosté sera, pak je vor at least retain the same number of cells for three days in a serum-free environment then in

nutno přidat 20 % FCS po dobu alespoň 4 dnů. Totoadd 20% FCS for at least 4 days. This

- 35 růstové schéma (3 dny SP), 4 dny 2P% FCS), je možno opakovat každý týden, je-li ppžadováno prostředí bez sera, a to po několik měsíců bez jakéhokol/iv zjevného poškození buněk.- 35 growth scheme (3 days SP), 4 days 2P% FCS), may be repeated weekly if serum free environment is required for several months without any obvious iv damage to the cells.

Stupen 2 Zjištování účinnosti CSPStage 2 Determining the effectiveness of CSP

A. Stanovení s použitím kostní dřeněA. Determination using bone marrow

Získá se čerstvá kostní dřen a odZ V straní se kostní úlomky, načež se dřen zředí v poměru 1 : 1 sterilním chloridem sodným s obsahem fosfátového pufru (PBS) při teplotě místnosti a pak se dřen převrství Ficoll-Paque, přibližně 30 ml BM-PBS a 6 ml Picollu. Pak se směs odstředuje při 1500 otáčkách za minutu 40 minut při teplotě místnosti. Tuk a vrstva PBS se iaoluje a odloží. Pak se pipetou odebere zakalená vrstva, která se dvakrát promyje PBS a vFresh bone marrow and bone marrow are obtained, then the marrow is diluted 1: 1 with sterile sodium chloride containing phosphate buffered saline (PBS) at room temperature and then the marrow is coated with Ficoll-Paque, approximately 30 ml BM-PBS. and 6 ml of Picoll. Then the mixture is centrifuged at 1500 rpm for 40 minutes at room temperature. The fat and PBS layer are isolated and discarded. The turbid layer was then removed by pipette and washed twice with PBS and v

pak se spočítají buňky , kterfl se pak nanesou do prostředí RPMI (GIBCO, RPMI 1640) s 10ý= PCS, inaktivovaného tepla, (HIFCS) na 3 hodiny k odstranění lnoucích buněk.cells are then counted and then plated in RPMI (GIBCO, RPMI 1640) with 10? = PCS, inactivated heat, (HIFCS) for 3 hours to remove clinging cells.

vin

Živné prostředí, které musí být čerstvé^—se—připraví—následujícím—způsobem:- 36 20 % FCSThe culture medium, which must be fresh, should be prepared as follows: - 36 20% FCS

0,3 ty- agaru, rozpuštěhého ve vodě, zchladí se na 40 °C,0,3 t-agar, dissolved in water, cooled to 40 ° C,

2x Iscoves (objemový poměr 1 : 1 v agaru) ty P/S konečné koncentrace 100/Ug/ml streptomycinu a 100 jednotek/j»l penicilinu2x Iscoves (1: 1 volume ratio in agar) those P / S final concentrations of 100 µg / ml streptomycin and 100 units / µl penicillin

M oc-thiůglycerolu ve 2x Iscoves ze zásobního roztoku o koncentraci 10 agar se zchladí na 40 % a přidají se další složky, ve vodní lázni se výsledná směs zchladí na 37 - 38 ⁰ a na této teplotě se udržuje.M-α-thioglycerol in 2 x Iscoves from a 10-agar stock solution was cooled to 40% and additional ingredients were added, and the resulting mixture was cooled to 37-38 ^° in a water bath and maintained at this temperature.

vin

Po 3 hodinách se buňky, které nelnou z z z ^V oddělí pipetou a materiál se odstředí a buňky se znovu spočítají. Přidá se 2 x 10 buněk/ml a prostředí se udržuje na vodní lázni při teplotě 37 - 38 °.After 3 hours, cells that do not contain zzz ^{V are} removed by pipette and the material is centrifuged and cells are counted again. 2 x 10 cells / ml are added and the medium is maintained in a water bath at 37-38 °.

Pak se přidá vzorek, například prostředí z buněk po transfekci v množství obvykle 10 mikrolitrů do první řady vyhloubení mikrotitrační desky ve dvojím provedení. Pak se do každého vyhloubení přidá 100 mikrolitrů buněčné -suspenze a pak ještě dalších-50-mikrolitrů buněčné suspenze do každého vyhloubení první řady. Materiál ve vyhloubeních se důkladně promísí a 50 mikrolitrů roztoku z první řady se přenese do následující řady a pak se dále postupuje po celéThen, a sample, such as transfected cell medium, is usually added in an amount of usually 10 microliters to the first row of microtiter plate wells in duplicate. Then, 100 microliters of cell suspension is added to each well and then an additional 50 microliters of cell suspension to each well of the first row. The material in the wells is mixed thoroughly and 50 microliters of solution from the first row is transferred to the next row and then proceeded all over.

- 37 plotně, čímž se získá postupné ředění vždy 1:3.- 37 plates to obtain a 1: 3 stepwise dilution.

...... „ r...... 'r

Plotna za zabalí p do parafilmu a inkubuje 10 az '15 dnů v 10 % oxidu uhličitého při teplotě 37 °C ve vlhkém prostředí, načež se počítají kolonií”The plate is wrapped in parafilm and incubated for 10 to 15 days in 10% carbon dioxide at 37 ° C in a humid environment, whereupon the colonies are counted ”

Spočítá se celé množství kolonií v každém vyhloubení. V každém pokusu se užije několik vyhloubení bez vzorku, čímž se získá základní počet kolonií. Tento počet se odečte od počtu kolonií, které se nacházejí v každém vyhloubení s obsahem vzorku. Jedna jednotka CSF je to množství, které vyvolá tvorbu jedné kolonie nad základní počet kolonií na 10^ buněk z lidské kostní dřeně v případě, že se užije 10^ buněk v jednom mililitru, a to v případě, že koncentrace CSF je pod stupněm sycení. Tato koncentrace se stanoví zředěním a srovnáním poStu kolonií při různém ředění tak, aby bylo možno určit koncentraci těsně před hladinou nasycení.The total number of colonies in each well is counted. Several wells without sample were used in each experiment to obtain a baseline colony count. This number is subtracted from the number of colonies found in each well containing the sample. One unit of CSF is the amount that induces a single colony formation above the base number of colonies per 10 µl of human bone marrow cells when 10 µl cells are used per milliliter when the CSF concentration is below the saturation level. This concentration is determined by diluting and comparing the number of colonies at various dilutions to determine the concentration just prior to the saturation level.

Při tomto stanovení se počítají kolonie, které obsahují granulocyty, monocyty nebo oba typy kolonií. Typ buněk v koloniích se stanoví odebráním kolonie a barvením buněk.In this assay, colonies containing granulocytes, monocytes or both types of colonies are counted. The type of cells in the colonies are determined by colony harvesting and cell staining.

B. Stanovení při použití buněk KG-1 vB. Assay using KG-1 v

Buňky KG-1, popsané v publikaci Blood, sv. 56, č. 3 (1980) se pěstují v prostředí vKG-1 cells, described in Blood, vol. 56, No. 3 (1980) are grown in an environment in the

podle Iscova s 10 % PCS, buňky se přeockovávají 2x 5 týdně, při každé pasáži se užije 2x 10 buněk/ml.according to Iscova with 10% PCS, cells are seeded 2x 5 weeks, 2x 10 cells / ml are used at each passage.

vin

Buňky se užijí ke stanovení pouze s pasáží 30 až 35.Cells are used for assay only at passages 30-35.

Stanovení je stejné jako při použití buněk kostní dřeně s tím rozdílem, že buňky KG-1 se pěstují v agav 3 rové směsi při použití 4 x 10 buněk/ml.The assay is the same as bone marrow cells except that KG-1 cells are grown in an agave mixture at 4 x 10 cells / ml.

Počet ji kolonií, které rostou v každém vyhloubení se stanoví po odečtení základního počtu kolonií stejným způsobem jako při použití buněk z vThe number of colonies that grow in each well is determined by subtracting the base number of colonies in the same manner as using cells from

kostní dřeně. Jedna jednotka/ml pro tyto buňky při použití CSP je ta^ koncentrace CSP, která stimuluje polovinu maximálního množství kolonií buněk KG-1 k růstu (nasycení). Maximálního počtu kolonií je možno dosáhnout tak, že se do několika vyhloubení přidá CSP až do nasycení.bone marrow. One unit / ml for these cells using CSP is that concentration of CSP that stimulates half the maximum amount of KG-1 cell colonies to grow (saturation). The maximum number of colonies can be achieved by adding CSP to several wells until saturation.

- 39 Stupen 3 Konstrukce vektoru p91023(B)- 39 Stage 3 Construction of vector p91023 (B)

Vektorem, použitým pro transformaci, byl vektor pAdD26SVpA(3), který byl popsán v publikaci Kaufman a další, Mol. Cell Biol. 2 (11)The vector used for the transformation was the vector pAdD26SVpA (3) described by Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 2 (11)

1304 - 1319 (1982). Tento vektor má strukturu, která je znázorněna na obr. 2. Tento plasmid obsahuje^gen pro dihydrofolát reduktásy myši (DHPR), který je pod transkripčním řízením hlavního promotoru adenoviru 2 (Ad2). Do adenoviru se přiřadí sled z genu pro imunoglobulin, který je přítomen mezi promotorem Ad2 a sledem DHFR a mění zakončení 5 a 3 . Místo pro polyadenylaci SV40 se nachází směrem dolů od sledu, který je kódem pro DHFR. Sled tohoto vektoru, který je odvozen od prokaryotických buněk, je vzat z pSVOd (Mellon, P., Parker, V., Gluzman, Y, a Maniatis, T., 1981, Cell 27« 279 - 288) a neobsahuje sledy z pBR322, v1304-1319 (1982). This vector has the structure shown in FIG. 2. This plasmid contains the mouse dihydrofolate reductase (DHPR) gene, which is under the transcriptional control of the adenovirus 2 (Ad2) major promoter. The sequence from the immunoglobulin gene that is present between the Ad2 promoter and the DHFR sequence is assigned to the adenovirus and alters the ends 5 and 3. The SV40 polyadenylation site is located downstream of the DHFR coding sequence. The sequence of this vector, which is derived from prokaryotic cells, is taken from pSVOd (Mellon, P., Parker, V., Gluzman, Y, and Maniatis, T., 1981, Cell 27 &apos; 279-288) and does not contain sequences from pBR322 , v

které způsobují inhibici replikace v buňkách ^savců, jak bylo popsáno v publikaci Lusky, M., a Botchan, M,which inhibit replication in mammalian cells as described in Lusky, M., and Botchan, M.

1981, Nátuře (London) 293, 79 - 81.1981, Nature 293, 79-81.

toit

Svrchu uvedený jiasraid se převede na plasmid pCVSVL2 způsobem, znázorněným na obr. 2 a na plasmid pAdD26SVpA(3) (d) tak, že se vypustí jedno_ze dvou míst pro působení restrikční endonukleásyThe above jiasraid is converted to plasmid pCVSVL2 as shown in Figure 2 and to plasmid pAdD26SVpA (3) (d) by deleting one of two restriction endonuclease sites

- 40 Pstl v původním plasmidu. Tento způsob se uskuteční částečným rozštěpením uvedeným eneymem, čímž je možno získat subpopulaci linerizovaných plasmidů, v nichž je rozštěpeno pouze jedno místo pro působení enzymu Pstl, načež se působí Klenowovým fragmentem, který se naváže k recirkulisaci plasmidů, který se pak použije k transformaci E. coli a hledají se kolonie, kter$ mají rozštěpeno místo pro působení Pstl, z- 40 PstI in the original plasmid. This method is accomplished by partial cleavage of the eneyme to yield a subpopulation of linerized plasmids in which only one PstI site is cleaved, then treated with a Klenow fragment which binds to the recirculation of the plasmids, which is then used to transform E. coli and looking for colonies having a cleavage site for the action of Pstl, z

které je uloženo poblíž zakončení 3 polyadenylováného sledu SV40.which is located near the end 3 of the polyadenylated SV40 sequence.

Vedoucí sled adenavitu a geny, získané z virů (VA-geny) se včlení do plasmidu pAdD26SVpA(3) (d) způsobem, znázorněným na obr. 2. Postupuje se tak, že se uvedený vektor rozštěpí enzymem PvuII za získání otevřené lineární molekuly, zThe leader sequence of the adenavity and the virus-derived genes (VA-genes) are inserted into the plasmid pAdD26SVpA (3) (d) as shown in FIG. 2. The vector is digested with PvuII to yield an open linear molecule, of

která se otevírá v blízkosti zakončení 3 prvního ze tří elementů, které tvoří vedoucí sled. Pak se rozštěpí plasmid pJAV 43, popsaný v publikaci Zain a další, 1979, Cell 16 S51, působením enzymu Xhol, naváže seKlenowův fragment, materiál se. rozštěpí enzymem PvuII a fragment o 140 párech baží, který obsahuje druhý element a část třetího elementu vedoucího sledu se izoluje elektroforézou na ákrylamidovém gelu (6 % v trisborátovém pufru podle svrchu uvedené publikace Maniatise a dalších (1982).which opens near the end 3 of the first of the three elements forming the leader sequence. The plasmid pJAV 43 (described in Zain et al., 1979, Cell 16 S51) was then digested with XhoI to bind the Klenow fragment, and the material was ligated. it is digested with PvuII and a 140 bp fragment containing the second element and part of the third leader element is isolated by acrylamide gel electrophoresis (6% in trisborate buffer as described in Maniatis et al. (1982), supra).

Fragment o 140 párech baží se pak naváže na plasmid pAdD26SVpA(3) (d) po štěpení enzymem PvuII. Produkt této vazby se užije k transformaci E. coli za vzniku odolnosti tohoto mikroorganismu proti tetracyklinu, kolonie se sledují způsobem podle Grunsteina a Hognesse při použití 32p-značeného vzorku hybridisací na fragment o 140 párech baží. S kolonií s pozitivní hybritizací se připraví DNA, aby bylo možno zjistit, zda rekonstruované místo pro působení PvuII se nachází na zakončení 5 nebo 3 včleněného fragmentu o 140 párech baží, čímž je možno prokázat, zda hybridizace je specifická pro druhý nebo třetí element vedoucího sledu z adenovitu. Správná orientace místa pro působení uvedeného enzymu se nachází na 5 -zakončení včleněného sledu o 140 párech baží. Takto vytvořený plasmid se označuje pTPL a je znázorněn na obr. 2.The 140 base pair fragment was then ligated to plasmid pAdD26SVpA (3) (d) after digestion with PvuII. The product of this binding was used to transform E. coli to give this microorganism resistance to tetracycline, colonies were screened by the Grunstein and Hogness method using a 32p-labeled sample by hybridization to a 140 bp fragment. DNA is prepared with a positive hybridization colony to determine whether the reconstructed PvuII site is located at the terminus of a 5 or 3 incorporated 140 base pair fragment to demonstrate whether the hybridization is specific to the second or third leader sequence. from adenovite. The correct orientation of the site of action of the enzyme is found at the 5-terminus of the 140 bp insertion sequence. The plasmid thus formed is designated pTPL and is shown in FIG. 2.

Fragment Ava II D SV40 s obsahem podpůrného sledu SV40 se získá tak, že se DNA SV40 štěpí enzymem Ava II, na zakončení se naváže Klenowův fragment po štěpení Pol I, na tyto fragmenty se ještě naváží spojovací sledy za použití enzymu Xho 1, pak se materiál štěpí enzymem Xho 1 při štěpení příslušného místa a čtyři nejdelší fragmenty (D) se izolují elektroforézou na gelu. Takto získané fragmenty se____The SV40 Ava II D fragment containing the SV40 support sequence is obtained by digesting the SV40 DNA with Ava II, terminating with a Klenow fragment after digesting with Pol I, then linking the fragments with Xho 1, then digesting with the Xho 1 enzyme. the material is cleaved by Xho 1 at the cleavage site and the four longest fragments (D) are isolated by gel electrophoresis. The fragments thus obtained are se____

- 42 naváží na plasmid pTPL po štěpení enzymem Xho 1, ěímž se získá plasmid pCYSVL2-TPL. Orientace fragmentu SV40 D v tomto plasmidu je taková, že promotor SV40 má stejnou orientaci jako hlavní promotor adenovitu.42 binds to plasmid pTPL after digestion with Xho 1 to give plasmid pCYSVL2-TPL. The orientation of the SV40 D fragment in this plasmid is such that the SV40 promoter has the same orientation as the main adenovirus promoter.

Aby bylo možno zavést geny, spojené s virem adenoviru (VA) do plasmidu pCVSVL2-TPL, ikonstruuje se nejprve plasmid pBB322, který obsahuje fragment adenoviru typ 2 Hind III B. DNA adenoviru typu 2 se rozštěpí enzymem Hind III a fragment B se izoluje elektroforézou na gelu. Takto získaný fragment se pak včlení do plasmidu pBR322, který byl předem rozštěpen enzymem Hind III. Po transformaci E. coli za získání odolnosti proti ampicilinu se rekombinantní kmeny vyhledávají tak, aby byl zjištěn kmen s fragmentem Hind III B a orientace tohoto fragmentu se stanový štěpením restrikčními enzymy. Plasmid pBR322 - Ad Hind III B obsahuje fragment adenoviru typ 2 Hfnd III B v orientaci, která je znázorněna na obr. 3.In order to introduce the genes associated with the adenovirus virus (VA) into the plasmid pCVSVL2-TPL, a plasmid pBB322 containing a fragment of type 2 Hind III B adenovirus was first constructed and the type 2 adenovirus DNA was digested with Hind III and fragment B isolated by electrophoresis. gel. The fragment thus obtained is then inserted into plasmid pBR322, which had been previously digested with Hind III. After transformation of E. coli to obtain ampicillin resistance, the recombinant strains are screened to identify a strain having a Hind III B fragment and the orientation of the fragment is determined by restriction enzyme digestion. Plasmid pBR322 - Ad Hind III B contains an adenovirus type 2 fragment of Hfnd III B in the orientation shown in Fig. 3.

Jak je zřejmé z obr. 3, geny VA je možno získat z plasmidu pBE322-Ad Hind III B štěpením pomocí enzymu Hpa I, po přidání sledů, napomáhajících k vazbě EcoRl s následným štěpením enzymem Eco Rl s isolací fragmentu o 1,4 kb. Fragment, který má zakončení po štěpení enzymem EeoRl ? · se pak naváže na místo v plasmidů pTJ&L, které bylo předtím rozštěpeno tímtéž enzymem. Po transformaci Ξ. coli HB101 a po selekci klonů odolných proti tetracyklicnu se kolonie podrobí zkoušce na hybridizaci na filtru při použití vzorku DNA, specifické pro geny $^VA, Pak se připraví DNA z klonů s pozitivní hybridižací a tento materiál se podrobí charakterizaci působením restrikčních endonukleáz. Produktem je plasmid, který se označuje p91023.As shown in Figure 3, the VA genes can be obtained from plasmid pBE322-Ad Hind III B by digestion with Hpa I, after addition of EcoR1 binding sequences followed by Eco Rl digestion with 1.4 kb fragment isolation. A fragment that has a tail after digestion with EeoR1? It then binds to a site in the plasmids pTJ & L which had previously been digested with the same enzyme. After transformation Ξ. coli HB101 and after selection of tetracyclicin-resistant clones, colonies were screened for hybridization on a filter using a DNA sample specific for $ VA VA. DNA was then prepared from positive hybridization clones and this material was subjected to restriction endonuclease characterization. The product is a plasmid called p91023.

Obě místa pro štěpení enzymem E6oRl v plasmidů p91O23 se odstraní, takže se tento plasmid úplně rozštěpí enzymem ScoRl, čímž vzniknou dva fragmenty DNA, z nichž jeden obsahuje přibližně 7Kb a druhý přibližně 1,3 Kb s obsahem Jígenů VA. Zakončení obou fragmentů se vyplní při použití Elenowova fragmentu a enzymu Poli, a pak se oba fragmenty, tj. fragment o 1,3 Kb a o Kb znovu spojí. Plasmid p91023 (A), který obsahuje děny VA je podobný plasmidů p91023, avšak do místa pro působení enzymu EeoRl jsou v obou případech včleněny^ geny VA, jak je možno prokázat Grundsteinar-Hognessovou analýzou ár^ů¥bhehím^estrikcníchuenzymŮ7 ~— --- 44 Jediné místo pro působení enzymu Pstl v plasmidu p91023(A) se odstraní a nahradí se místem pro působení enzymu EcoRl. Pak se plasmid p91O23(A) úplně rozštěpí enzymem Pstl, a pak se naváže Klenowův fragment při použití Poli a na zakončení se naváží pomocné sledy tak, aby místo místaBoth E6oR1 digestion sites in plasmids p91O23 are removed so that this plasmid is completely digested with ScoR1, resulting in two DNA fragments, one about 7Kb each and the other about 1.3 Kb containing Jig VA. The ends of both fragments are filled using the Elenow fragment and the Poli enzyme, and then the two fragments, i.e. the 1.3 Kb and Kb fragments, are recombined. Plasmid p91023 (A), which contains the VA genes, is similar to plasmid p91023, but the VA genes are both inserted into the EeoR1 site, as evidenced by Grundsteinar-Hogness analysis of estrsth-estrictionuenzymes. The single PstI site in plasmid p91023 (A) was removed and replaced with an EcoR1 site. Then, the plasmid p91O23 (A) was completely digested with PstI, and then the Klenow fragment was ligated using Poli and the helper sequences were ligated to the terminus so that instead of

A pro působení enzymu Pstl vzniklo místo pro působení enzymu EcoRl v plasmidu p91023(A). Lineární plasmid p91O23(A) s pomocnými sledy k vytvoření místa pro zAnd, for PstI, a site for EcoR1 was created in plasmid p91023 (A). Linear plasmid p91O23 (A) with auxiliary sequences to create a site for z

působení enzymu EcoRl se oddělí a úplně se rozštěpí enzymem EcoRl, načež se takto získané, fragmentythe action of EcoR1 is separated and completely digested with EcoR1 and the fragments thus obtained

B znovu naváží. Izoluje se plasmid p91023(^), jeho struktura se identifikuje a je možno prokázat, že běží o strukturu, podobnou plasmidu p91O23(A) až na to, že tento plasmid obsahuje místo pro působení enzymu EcoRl místo místa pro působení enzymu Pstl.B reweighs. Plasmid p91023 (?) Is isolated, identified and identified to be a p91O23 (A) -like structure except that the plasmid contains an EcoRl site instead of a PstI site.

Stupen 4 Příprava skupiny· cDNA <Step 4 Preparation of the · cDNA <

VIN

.......... Buňky Mo -se pěstují 16 až 20 hodin při použití ΡΗΔ a BIA ke stimulaci produkce lymphov kinů. Buňky se pak nanesou na plotny v množství 5 x 10 buněk/ml v prostředí podle Iscova s 20.......... Mo -se cells are grown for 16 to 20 hours using ΡΗΔ and BIA to stimulate the production of lymphovine kinases. Cells are then plated at 5 x 10 cells / ml in Iscova 20 medium

- 45 FCS, 0,3 °Ja objemovými PHA a 5 ng/ml TPA. Buňky se ' v oddělí odstředěním. Takto oddělení?buňky se znovu uvedou do suspenze ve 20 mi hypotonického pufru pro rozrušení buněk, chlazeného ledem (RSB pufr: 0,01M Tris-HCl, pH 7,4, 0,01M KC1, 0,0015M MgCl₂, 1 ,ug/ml i/>V ' cykloheximidu, 50 jednotek/ml RNAsfii a 5mM dithiov threitolu). Buňky se nechají nabobtnat na ledu 5 minutý, načež se mechanicky rozruší ve skleněném homogenizátoru deseti zdvihy těsně lnoucího pístu. Homoge· nát se pak odstředí při 2000 otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J6) k odstranění jader a nerozrušených buněk. Supernatant se uloží v ledu a jádra se znovu uvedou do suspenze v 10 ml RS3 a pak se tento materiál znovu odstředí při malé rychlosti. Tento dru hý supernatant se spojí s prvním supernatantem a získaný materiál se znovu odstředí při malé rychlosti k odstranění zbylých jader a nerozrušených buněk. Super natant v tomto případě se smísí přidáváním 2M KC1 až na koncentraci 0,15M KC1 a pak se znovu odstředí 30 minut při 25 000 otáčkách za minutu (rotor Beckman Sv 28), čímž se jako segment získají buněčné membrány Sediment buněčných membrán se opatrně promyje chladným RSB a pak se znovu uvede do suspenze ve 12 ml RSB s obsahem 2M sacharosy a 0,15M chloridu draselného.- 45 FCS, 0.3 ° I by volume PHA and 5 ng / ml TPA. Cells are separated by centrifugation. In this manner, the cells were resuspended in 20 ml of ice-cooled hypotonic cell disruption buffer (RSB buffer: 0.01M Tris-HCl, pH 7.4, 0.01M KCl, 0.0015M MgCl ₂ , 1.1 µg). (ml of N-cycloheximide, 50 units / ml RNAsfii and 5 mM dithium threitol). The cells were allowed to swell on ice for 5 minutes and then mechanically disrupted in a glass homogenizer of ten strokes of the tight-fitting piston. The homogenate is then centrifuged at 2000 rpm (Beckman J6 centrifuge) to remove nuclei and undisturbed cells. Store the supernatant on ice and resuspend the cores in 10 ml of RS3 and centrifuge again at low speed. This second supernatant is combined with the first supernatant and the recovered material is centrifuged again at low speed to remove residual nuclei and undisturbed cells. The super natant in this case is mixed by adding 2M KCl up to a concentration of 0.15M KCl and then centrifuged again for 30 minutes at 25,000 rpm (Beckman Sv 28 rotor) to obtain cell membranes as a segment. Carefully wash the cell membrane sediment. cold RSB and then resuspended in 12 mL RSB containing 2M sucrose and 0.15M potassium chloride.

- 46 Pak se ve zkumavkách do odstředivky (Beckman/ SV41) ý připraví diskontinuální gradient, tak, že se převrství 6 ml roztoku membrány ve 2M sacharose na 2 ml RSB s 2,5M sacbarosy a 0,15M KC1. Zkumavky se doplníA discontinuous gradient was then prepared in a centrifuge tube (Beckman / SV41) by overlaying 6 ml of the membrane solution in 2M sucrose to 2 ml RSB with 2.5M sacbarose and 0.15M KCl. Make up the tubes

2,5 ml RSB s obsahem 1,3M sacbarosy a 0,15M KC1.2.5 ml RSB containing 1.3M sacbarose and 0.15M KCl.

Tyto gradienty se pak odstředí 4 hodiny při 27 000 otáčkách za minutu (Beckman, rotor SW41) při teplotě 4 °C. Vrstva membrány, která se nachází na rozhraní mezi koncentrací 2,0M a 1,3M sacbarosy se opatrně odstraní se strany při použití ijekční stříkačky a jehly č. 18. Prakce membrány z obou gradientů se slijí a zředí jednám objemem destilované vody, načež se přidá do koncentrace 0,5 Triton X—100 a do koncentrace 0,5 % deoxycbolát. sodný, načdž se materiál extrahuje stejným objemem fenolu. Vodná vrstva se pak znovu extrahuje směsí fenolu a chloroformu v poměru 1 : 1 a nakonec stejným objemem chloroform#. Pak se RNA, vázaná na membránu vysráží přidáním chloridu sodného do koncentraci 0,25M a 2,5 objemů chladného ethanolu, načež se směs inkubuje přes noc při teplotě -20 °C. Vysrážená RBA se oddělí odstředěním 10 minut při 4000 otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J-6) a pak se materiál znovu uvede do suspenze v 1 ml destilovkné vody. Z množství 2 x 10^ buněk se získá přibližně 1 mg RNA. Pak se izoluje s celkového množstvíThese gradients are then centrifuged for 4 hours at 27,000 rpm (Beckman rotor SW41) at 4 ° C. The membrane layer, located at the interface between the 2.0M and 1.3M sacbarose concentrations, is carefully removed from the sides using a syringe and a # 18 needle. The membrane operations from both gradients are combined and diluted with one volume of distilled water, then added to a concentration of 0.5 Triton X-100 and to a concentration of 0.5% deoxycolate. sodium, then the material is extracted with an equal volume of phenol. The aqueous layer was then re-extracted with 1: 1 phenol / chloroform and finally with an equal volume of chloroform #. Then, the membrane-bound RNA is precipitated by the addition of sodium chloride to a concentration of 0.25M and 2.5 volumes of cold ethanol, followed by incubation overnight at -20 ° C. The precipitated RBA was collected by centrifugation at 4000 rpm for 10 minutes (Beckman J-6 centrifuge) and then resuspended in 1 mL distilled water. Approximately 1 mg of RNA was obtained from 2 x 10 6 cells. It is then isolated from the total amount

- 47 SNA příslušné množství mSNA chromatografií na sloupci s obsahem 0,5 ml oligo dT-celulozy. Pak se RNA zahřeje na 5 minut na teplotu 70 °C, rychle se zchladí v ledu a pak se 5x ředí při teplotě místnostik pufrem pro vazbu, který obsahge 0,5M LiCl, 0,01M Tris-HCl, o pH 7,4, 0,002M EDTA a 0,1 % SDS. SNA v tomto pufru se pak nechá projít sloupcem oligo dT-celulozy v rovnovážném stavu ve stejném pufru při teplotě místnosti, Sloupec se promyje 5 ml pufru pro vazbu a pak 5yul 0,15M LiCl,0,01M Tris-HCl o pH 7,4, 0,002M EDTA, a 0,1 % SDS. Nakonec se mRNA vymývá při použití 2 ml 0,01M Tris-HCl o pH 7,4, 0,002M EDTA a 0,1 SDS. Pak se mSNA vysráží přidáním chloridu sodného do koncentrace 0,25M a 2,5 objemjíů éthanolu a směs se ý inkubuje přes noc při teplotě -20 C. Vysrážen# mRNA se oddělí odstředěním 30 minut při 30 000 otáčkách za minutu (rotor Beckman 3V55). Supernatant se opatrně slije a peleta mRNA a znovu uvede v suspenzi v 50 ml vody. Tato suspenze se pak upraví na koncentraci O,25M chloridu sodného a pak se extrahuje směsí fenolu a chloroformu v poměru 1:1a pak třikrát chloroformem. Pak se mRNA vysráží přidáním 2,5 objemu éthanolu.- 47 SNA appropriate amount of mSNA by column chromatography containing 0.5 ml oligo dT-cellulose. The RNA is heated to 70 ° C for 5 minutes, cooled rapidly in ice, and then diluted 5 times at room temperature with binding buffer containing 0.5M LiCl, 0.01M Tris-HCl, pH 7.4, 0.002M EDTA and 0.1% SDS. The SNA in this buffer is then passed through an equilibrated oligo dT-cellulose column in the same buffer at room temperature. The column is washed with 5 ml of binding buffer and then with 5 µl of 0.15M LiCl, 0.01M Tris-HCl pH 7.4 , 0.002M EDTA, and 0.1% SDS. Finally, mRNA is eluted using 2 ml of 0.01M Tris-HCl pH 7.4, 0.002M EDTA and 0.1 SDS. Then mSNA was precipitated by adding sodium chloride to a concentration of 0.25M and 2.5 volumes of ethanol and incubated overnight at -20 ° C. The precipitated # mRNA was collected by centrifugation for 30 minutes at 30,000 rpm (Beckman 3V55 rotor). . The supernatant was carefully decanted and the mRNA pellet resuspended in 50 ml of water. This suspension is then adjusted to a concentration of 0.25M sodium chloride and then extracted with a 1: 1 mixture of phenol and chloroform then three times with chloroform. Then the mRNA is precipitated by adding 2.5 volumes of ethanol.

Směs se několikrát zmrazí a nechá roztát v lázni se —suchým—ledem _a_ethanolem a pak se 15 minut odstře- 48 vThe mixture is frozen several times and thawed in a dry-ice-ethanol bath and then centrifuged for 15 minutes in a water bath.

duje v Eppendorfově odstředivce. Supernatant se opatrně slij e a peleta mRNA se znovu uvede do suspenze ve 20 /Ul destilované vody. Konečný výtěžek je přibližně 30 /Ug mRNA.in an Eppendorf centrifuge. The supernatant was carefully decanted and the mRNA pellet resuspended in 20 µl distilled water. The final yield is approximately 30 µg mRNA.

První řetězec cDNA se připraví při použití standardních metod. Postupuje se tak, že se 10 /Ug mRNA z membrán zředí 100/ul směsi pro vznik cDNA, která obsahuje 300 mmol Tris o nH 8,4, 140 mmol KC1, 10 mmol MgClg, 1θ mmol β-merkaptoethanolu, 500 / dATP, dGTP, dCTP a dTTP, 5/Ug oligo-dT (fosforylované při průměrném rozměru 12 — 18), dále 150 yuCi 32P dCTP (400 Ci/mmol) a 20 jednotek inhibitoru ribonukleázy RNAsin. Reakce se spustí přidáním 100 jednotek reversní transkriptázy při inkubaci 30 minut při teplotě 42 °C. Pak se reakce zastaví přidáním EDTA ý do koncentrace 40 mmol a pak se RNA rozloží inkubací 20 minut v 65 °C v 0,2M hydroxidu dosného. Pak se baze neutralizuje přidáním 20/ul 2M Tris o pH 7,4. Reakční směs se pak extrahuje směsí fenolu a chloroformu a pak se provádí”zpětná extrakce při použití 50 /Ul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol EDTA (TE) a vodné fáze se slijí. Pak se cDNA s jednoduchým řetězcem převede na cDNA s dvojitým řetězcem tak, že se směs inkubuje 12 hodin při teplotě 16 °C spolu se uMThe first strand cDNA was prepared using standard methods. To do this, 10 µg of membrane mRNA is diluted with 100 µl of a cDNA formation mixture containing 300 mmol Tris with nH 8.4, 140 mmol KCl, 10 mmol MgCl 2, 1θ mmol β-mercaptoethanol, 500 µL, dGTP, dCTP and dTTP, 5 / Ug oligo-dT (phosphorylated at an average size of 12-18), as well as 150 yuCi 32P dCTP (400 Ci / mmol) and 20 units of RNAsin ribonuclease inhibitor. The reaction is started by the addition of 100 units of reverse transcriptase incubated at 42 ° C for 30 minutes. The reaction is then stopped by adding EDTA to a concentration of 40 mmol and then the RNA is decomposed by incubation for 20 minutes at 65 ° C in 0.2 M ground hydroxide. The base was then neutralized by addition of 20 µl 2M Tris pH 7.4. The reaction mixture is then extracted with a mixture of phenol and chloroform and then back-extracted using 50 µl of 10 mmol Tris pH 7.5, 1 mmol EDTA (TE) and the aqueous phases are combined. Then, the single-stranded cDNA is converted to the double-stranded cDNA by incubating the mixture for 12 hours at 16 ° C with µM.

- 49 40 jednotkami Klenowova fragmentu za přítomnosti DNA-polymerázy I ve 100/^ul reakcního prostředí, které obsahuje roztok 50 mmol fosforečnanu draselného o pH 7,4, 2,3 mmol DTT, 2-merkaptoethanok, 10 mmol- 49 40 units of Klenow fragment in the presence of DNA polymerase I in 100 ^µl reaction medium containing a solution of 50 mmol of potassium phosphate pH 7.4, 2.3 mmol of DTT, 2-mercaptoethanol, 10 mmol

MgClg, vždy 150 /Umol jednoho ze čtyř deoxynukleo32 tidtrifosfátů a 25 /uCi P dCTP. Reakce se pak zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a nevčle— něné trifosfáty se odstraní průchodem vodné p fáze přes sloupec prostředku Sephadex-G·—50 o objemu 1 ml. Vyloučené frakce se slijí a vysráží se ethanolem.MgCl 2, 150 µM each of one of the four deoxynucleo32 triphosphates and 25 µCi P dCTP. The reaction is then stopped by extraction with a mixture of phenol and chloroform and the non-incorporated triphosphates are removed by passing the aqueous phase through a 1 ml Sephadex-G · 50 column. The separated fractions were combined and precipitated with ethanol.

Peleta cDNA se promyje chladným ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze v 200 /ulThe cDNA pellet was washed with cold ethanol and then resuspended in 200 µl

20mmol třt* Tris o pH 8,0, 1 mmol EDTA, 80/umol S-adenosylmethioninu a 300 jednotek EcoRl-methylásy na 60 minut při teplotě 37 °C. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a methylovaná cDNA se isoluje vysráženým ethanolem.20 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 80 µM S-adenosylmethionine and 300 units EcoR1-methylase for 60 minutes at 37 ° C. The reaction is stopped by extraction with a mixture of phenol and chloroform and the methylated cDNA is isolated by precipitation with ethanol.

Peleta cDNA se promyje 70/c ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze ve 200 yul pufru Sl (Maniatis a další) a materiál se inkubuje s 200 jednotkami Sl-nukleásy při teplotě 30 °C celkem 30 minut. Pak se reakce zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a cDNA se isoluje vysrážením ethanolem.The cDNA pellet was washed with 70 µl ethanol and then resuspended in 200 µl of Bu buffer (Maniatis et al.) And the material was incubated with 200 units of S-nuclease at 30 ° C for 30 minutes. Then the reaction is stopped by extraction with a mixture of phenol and chloroform and the cDNA is isolated by ethanol precipitation.

- 50 Zakončení cDNA s dvojitým řetězcem se valní inkubací ve 100 yul 20 mmol Tris o pH 7,4, mmol chloridu sodného, 10 mmol 2-markaptoethanolu a 500/umol všech čtyř deoxynůkleotidtrifosfátu s 25 jednotkami Klenowova fragmentu při teplotě místnosti 30 minut. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a cDNA se isoluje vysrážením ethanolem.- 50 Termination of the double stranded cDNA was incubated in 100 µl of 20 mM Tris pH 7.4, mmol of sodium chloride, 10 mmol of 2-mercaptoethanol and 500 µmol of all four deoxynucleotide triphosphates with 25 units of Klenow fragment at room temperature for 30 minutes. The reaction is stopped by extraction with a mixture of phenol and chloroform and the cDNA is isolated by ethanol precipitation.

Takto získané cDNA se podrobí vazbě v 50 /Ul pufru s obsahem T4-ligásy (Maniatis a další) za přítomnosti 500 pMol vazných řetězců Rl se sledem pCGGAATTCCG (New England Biolabs) při použití 2000 jednotek T4-ligásy přes noc při teplotě 16 °C. Reakce se zastaví inkubací při teplotě 70 °C po dobu 20 minut, pak se reakční směs zředí na 300 mikrolitrů, takže konečná koncentrace solí je 0,1 mol NACI, 10 mmol MgCl2> 50 mmol Tris-HCl o pH 7,4. Pak se cDNA štěpí 2 minuty při teplotě 37 °C působením 7D0 jednotek enzymu EcoRI. Reakce se zastaví extrakcí směsí fe• nolu a nolem.The cDNA thus obtained was ligated in 50 µl T4-ligase-containing buffer (Maniatis et al.) In the presence of 500 µMol of R1 binding chains with the sequence of pCGGAATTCCG (New England Biolabs) using 2000 units of T4-ligase overnight at 16 ° C. . The reaction is stopped by incubation at 70 ° C for 20 minutes, then the reaction mixture is diluted to 300 microliters so that the final salt concentration is 0.1 mol NACI, 10 mmol MgCl 2> 50 mmol Tris-HCl pH 7.4. Then the cDNA was digested for 2 minutes at 37 ° C with 7D0 EcoRI units. The reaction is stopped by extraction of a mixture of phenol and nol.

zul chloroformu a cDNA. se. isoluje- vysrážením etha, Získaná peleta se znovu uvede do suspense vzul of chloroform and cDNA. se. The pellet obtained is resuspended in ethanol

TE a pak se nechá projít sloupcem s obsahem 5 ml C1-4B. Získané frakce se slijí a vysráží se ethanolem. Vysrážená cDNA se podrobí elektroforézeTE and then passed through a column containing 5 ml of C1-4B. The fractions obtained are combined and precipitated with ethanol. The precipitated cDNA was electrophoresed

- 51 na ljž> agarosovém gelu v Tris-acetátovém pufru za přítomnosti 1/Ug/ml ethidiumbromidu. Pak se cBNA o rozmetu 500 až 4000 párů baží isoluje z gelu při použití standardního postupu. Vyloučená cDNA se extrahuje směsí fenolu a chloroformu, vysráží se ethanolem a peleta (po opláchnutí ethanolem) se znovu uvede do suspenze v 50 /Ul TE. Konečný výtěžek byl 10 až 500 ng cDNA.51 on a 1 µg agarose gel in Tris-acetate buffer in the presence of 1 µg / ml ethidium bromide. The 500-4000 base pair cBNA is then isolated from the gel using a standard procedure. The precipitated cDNA was extracted with a mixture of phenol and chloroform, precipitated with ethanol, and the pellet (after rinsing with ethanol) was resuspended in 50 µl TE. The final yield was 10 to 500 ng of cDNA.

Dále bude popsána příprava vektoru pro expresi p91023(B). 500ng vektoru, rozštěpeného enzymem EcoRl a zpracovaného působením fosfatázy se podrobí vazbě se 100 ng cDNA ve 100yul reakč ního prostředí (standardní prostředí pro působení T4-ligásy) přes noc při teplotě 16 °C. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a pak se navázaná cDNA oddělí vysrážením ethanolem po přidání 5 /Ug / tRNA jako nosiče.Next, the preparation of the vector for expression of p91023 (B) will be described. 500 ng of a phosphatase digested EcoR1 vector was ligated with 100 ng of cDNA in 100 µl reaction medium (standard T4-ligase medium) overnight at 16 ° C. The reaction is stopped by extraction with a mixture of phenol and chloroform, and then the bound cDNA is separated by ethanol precipitation after addition of 5 µg / tRNA as carrier.

fF

DNA, vysrážená ethanolem se promyje 70?ó ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze ve 100/Ul TE. Tato DNA se pak užije v podílech o objemu 4 yUl k transformaci E. coli W1061 (4/ul pro transformaci v objemu lOOyUl. Každá z 25 transformovaných zkouěek se rozetře na Petriho.misku o průměru 150 mm s obsahem 1 agaru, v L-prostředí_The ethanol precipitated DNA was washed with 70% ethanol and then resuspended in 100 µl TE. This DNA was then used in 4µl aliquots to transform E. coli W1061 (4µl for 100µl transformation). Each of the 25 transformed assays was spread on a 150 mm diameter Petri plate containing 1 agar in L- environment_

- 52 s 10ýe/ml tetracyklinu (Tet-plotna) a plotny se inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Na každé plotně se vyvine přibližně 2000 kolonií, výsledkem je tedy celkem přibližně 50 000 kolonií. Každá z těchto kolonií má průměr přibližně 0,5 mm. Každá z těchto kolonií se přenese na mikrocelulózový kotouč o průměru 137 mm tak, že se na povrch agaru opatrně uloží suchý filtr, který se pak opatrně sejme. Všechny kolonie zůstanou na filtru, který se pak uloží koloniemi směrem vzhůru na čerstvou Tet-plotnu. Kolonie se nechají růst několik hodin a pak se znovu rozdělí tak, že se přesně na původní filtr uloží čerstvý zvlhčený filtr, filtry se k sobě přitlačí, pak se oddělí a každý filtr se uloží na čerstvou Tet-plotnu a plotny se inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Každá kopie se pečlivě označí, aby bylo možno uložení kolonií přesně srovnat s jejich uložením na původním filtru.52 with 10 µl / ml tetracycline (Tet-plate) and plates were incubated overnight at 37 ° C. Approximately 2000 colonies are developed on each plate, resulting in a total of approximately 50,000 colonies. Each of these colonies has a diameter of approximately 0.5 mm. Each of these colonies was transferred to a microcellulose disc of 137 mm diameter by carefully placing a dry filter on the agar surface, which was then carefully removed. All colonies remain on the filter, which is then deposited by the colonies up onto fresh Tet-plate. The colonies were allowed to grow for several hours and then resuspended by placing a freshly moistened filter exactly on the original filter, pressing the filters together, then separating and placing each filter on a fresh Tet-plate and incubating the plates overnight at temperature 37 ° C. Each copy shall be carefully marked so that the colony placement can be accurately compared to that of the original filter.

Stupen 5 Příprava směsi plasmidové DNAStep 5 Preparation of plasmid DNA mixture

Každá z 25 kopií filtrů se opatrně rozřeže skalpelem na osminy, přičemž se zaznamená orientace každé z těchto osmi ve srovnání s původním zCarefully cut each of the 25 copies of the filters into eighths with a scalpel, recording the orientation of each of the eight compared to the original

filtrem. Z každého useku se kolonie sejmou do 10 ml L-bujonu. Bakterie se oddělí odstředěním 10 minut při 3000 otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J-6) a pak se znovu uvedou do suspenze v 0,6 ml 25% sacharozy s 50 M Tris-HCl o pH 8,5 a změní se na protoplasty přidáním 0,2 ml lysozymu o koncentraci 5 mg/ml jí s následnou inkubací v ledu na dohu 5 až 10 minut. Protoplasty se pak inkubují při teplotě místnosti 10 minut, přidá se 0,125 ml SDTA o koncentraci 0,5 molů a pak se buňky rozruší přidáním 0,12 ml 10% SDS v 50 mmol Trie-DCl o pH 8,0. Rozrušený materiál se opatrně promíchá, inkubuje se 15 minut při teplotě místnosti a pak se DNA bílkovin a chroraosomů vysráží přidáním 0,3 $áml 5M NaCl. Po inkubaci v ledu na dobu 15 minut se materiál odstředí na Eppendoffově odstředivce 30 minut za chlazení. Supernatant se opatrně odstra ní, čxqiž se získá viskozní peleta DNA a bílkoviny, která se zředí přidáním 2,5 ml vody. Směs se extrahuje 1 ml fenolu, vrstvy se oddělí odstředěním (10K po dobu 10 minut, rotor Sorvall SS-34) a vodná vrstva se oddělí do nové zkumavky. DNA se vysráží přidáním 0,5 ml 5M NAfil NaCl a 7,5 ml chladného ethanolu a směs se několikrát zmrazí v lázni ethanolu a suchého ledu. Vysrážený ^materiál se oddělí odstředěním (10K, _____ _____ _ __________ l minut, Sorvall SS-34), znovu se uvede do suspanze—filter. The colonies are removed from each section into 10 ml of L-broth. The bacteria were collected by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes (Beckman J-6 centrifuge) and then resuspended in 0.6 ml of 25% sucrose with 50 M Tris-HCl pH 8.5 and converted to protoplasts by addition 0.2 ml of 5 mg / ml lysozyme followed by incubation on ice for 5 to 10 minutes. The protoplasts are then incubated at room temperature for 10 minutes, 0.125 ml of 0.5 mol SDTA is added and then cells are disrupted by the addition of 0.12 ml of 10% SDS in 50 mmol Trie-DC1 pH 8.0. The disrupted material was mixed gently, incubated for 15 minutes at room temperature, and then protein and chroraosome DNA was precipitated by the addition of 0.3 .mu.l of 5M NaCl. After incubation on ice for 15 minutes, the material is centrifuged on an Eppendoff centrifuge for 30 minutes with cooling. The supernatant was carefully removed to give a viscous DNA and protein pellet, which was diluted by adding 2.5 mL of water. The mixture was extracted with 1 mL of phenol, the layers were separated by centrifugation (10K for 10 minutes, Sorvall SS-34 rotor), and the aqueous layer was separated into a new tube. The DNA was precipitated by the addition of 0.5 ml of 5M NAfil NaCl and 7.5 ml of cold ethanol, and the mixture was frozen several times in an ethanol-dry ice bath. The precipitated material was collected by centrifugation (10K, _____ _____ _ __________1 minutes, Sorvall SS-34), and resuspended—

- 54 v 0,3 ml 0,3M octanu $. sodného a znovu se vysráží (v Eppendorfově zkumavce) přidáním 1 ml ethanolu.54 in 0.3 ml 0.3M acetate $. sodium and re-precipitated (in an Eppendorf tube) by adding 1 ml of ethanol.

Po 10 až 15 minutách v lázni se suchým ledem a ethanolem se vysrážená DNA oddělí odstředěním (5 minut v Eppendorfově odstředivce)^ výsledná peleta se znovu uvede do suspenze ve 100ριί. sterilního prostředíAfter 10 to 15 minutes in a dry ice / ethanol bath, the precipitated DNA is separated by centrifugation (5 minutes in an Eppendorf centrifuge). The resulting pellet is resuspended in 100 µm. sterile environment

TE (10 mmol Tris o pH 8, 1 mmol EDTA). Z typické /Ug zkoušky se získá 5 až 10 ag pbsmidové DNA. Každý vzorek obsahuje DNA z 200 až 500 kolonií původního filtru. Z 25 filtrů se připraví celkem 200 vzorků DNA.TE (10 mmol Tris pH 8, 1 mmol EDTA). From a typical µg assay, 5-10 g of pbmid DNA were obtained. Each sample contains DNA from 200 to 500 colonies of the original filter. A total of 200 DNA samples were prepared from 25 filters.

Stupen 6 Isolace klonů CSP ’Step 6 Isolation of CSP clones

Každý ze vzorků DNA ze stupně 5 se odděleně přenese do opičích buněk,M6 tak, jak bude dále popsáno.Each of the DNA samples of step 5 was separately transferred to monkey cells, M6, as described below.

Buňky M6 se běžně pěstují na modifikovaném Eaglově prostředí (Dulbecco, DME je možno -získat od Gibco) s obsahem 10 % fetálního telecího sera, inaktivovaného teplem (HIFCS), buňky se dvakrát týdně přeočkovávají při ředění 1 : 6. 24 ho vM6 cells are commonly grown on modified Eagle's medium (Dulbecco, DME available from Gibco) containing 10% heat-inactivated fetal calf serum (HIFCS), and the cells are re-inoculated twice a week at a 1: 6 dilution.

din po dělení v poměru 1 : 6 jsou buňky M6 připravené pro transfekci. 24 hodin před transfekcí sedin after 1: 6 division are M6 cells ready for transfection. 24 hours prior to transfection

- 55 g- 55 g

1,2 χ 10 buněk M6 naočkuje na plotnu (Cell Pactory, Ňunc) v 1,5 1 prostředí DME + 10 % HIPCS. Těsně před transfekci se plotny 2x promyjí 7 ml DME bez sera.(SP). DNA se rozpustí v 0,1 M Tris o pH 7,3 a přidá se k prostředí DME, které obsahuje 2mmol glutaminu, 100/Ug/ml strepromycinu, 100 jednotk/ml penicilinu a 0,20 mg/ml DEAE-dextránu, doplněno na 4 ml Tris-DNA roztokem.1.2 χ 10 M6 cells are plated (Cell Pactory, Inc) in 1.5 L DME + 10% HIPCS. Immediately prior to transfection, plates were washed twice with 7 ml of serum free DME (SP). The DNA was dissolved in 0.1 M Tris pH 7.3 and added to a DME medium containing 2 mmol glutamine, 100 µg / ml strepromycin, 100 units / ml penicillin and 0.20 mg / ml DEAE-dextran, supplemented with per 4 ml of Tris-DNA solution.

v ml prostředí s obsahem rozpuštěné DNA se přidají vin ml of dissolved DNA medium are added in

k plotně s obsahem buněk M6 COS a buňky se 12 hodin inkubuj í.to a plate containing M6 COS cells and incubated for 12 hours.

vin

Po inkubaci se buňky jednou nebo dvakrát promyjí 7 ml SP DME. Pak se 5 ml DME s 10 ty HIPCS, 100 jednotek/ml penicilinu, 100/Ug/ml streptomycinu, mmol glutaminu a 0,1 mmol chlorochinu přidá ke směv si a buňky se pak inkubují po dobu 2 1/2 hodiny.After incubation, cells are washed once or twice with 7 ml SP DME. Then, 5 ml of DME with 10 µ HIPCS, 100 units / ml penicillin, 100 µg / ml streptomycin, mmol glutamine and 0.1 mmol chloroquine are added to the mix and the cells are then incubated for 2 1/2 hours.

vin

Po inkubaci se buňky promyjí SP DME a přidá se 10 ml DME + 10 ty HIPCS na plotny. Po 30 hodinách se prostředí odsaje a přidá se 4 ml DME + 10 ty vAfter incubation, cells are washed with SP DME and 10 ml DME + 10 h HIPCS are added to the plates. After 30 hours, the medium is aspirated and 4 ml of DME + 10 ml are added

HIPCS na plotnu. Buňky se izolují odstraněním prostředí po 24 až 26 / hodinách další inkubace.HIPCS on the plate. Cells are harvested by removing the medium after 24-26 hours of further incubation.

Prostředí z každého vzorku se zkoumá na účinnost CSP při použití zkoušky KG-1. Pro každý vzorek, jehož účinnost CSP je positivní, je nutnoThe medium from each sample was examined for CSP activity using the KG-1 assay. It is necessary for each sample whose CSP activity is positive

- 56 vyhledat klon na původním filtru, který je příčinou této účinnosti. Například v případě positivní transfekce účinnosti CSF se odeberou všechny kolonie původního useku filtru, na němž byla nalezena tato ucin nost. Jde obvykle o přibližně 320 kolonií, které se odeberou do 3 ml L-prostředí s 10 /Ug/ml tetracyklinu- 56 search for the clone on the original filter that is causing this efficiency. For example, in the case of positive transfection of CSF efficacy, all colonies of the original filter section on which this activity was found are removed. This is usually about 320 colonies, which are collected in 3 ml of L-medium with 10 µg / ml tetracycline

Kultury se pěstují přes noc. 320 kolonií se uloží do matrice 18 x 18. Z horizontálních řad a vertikálních sloupců matrice se připraví směsi (36 směsí, poslední horizontální řada měla pouze 14 klonů). Vzorky DNA se ťA připraví z každé směsi a užijí se k ýtánsfekci buněk o (CBS). Supernatanty z takto získaného materiálu se zkouší na účinnost. Byly získány dvě positivní zkoušky, jedna ve vertikálním sloupci, druhá v horizontální řadě. Kultury, spoleňná oběma směsím obsahovala zCultures are grown overnight. 320 colonies were placed in an 18 x 18 matrix. Mixtures were prepared from the horizontal rows and vertical columns of the matrix (36 mixtures, the last horizontal row had only 14 clones). DNA samples were prepared from each mixture and used to select cells (CBS). Supernatants from the material so obtained were tested for activity. Two positive tests were obtained, one in the vertical column and the other in the horizontal row. The cultures common to both mixtures contained z

klon s uřinností CSF.clone with CSF activity.

Z kultury bylo isolováno celíkem dvanáct jednotlivých klonů a miniprep DNA pak byla » připravena z kultur o objemu 10 ml v L-prostředí, tak, jak bylo popsáno svrchu. Pak byly rozštěpeny vzorky 10 ^úlDNA z těchto zkoušek enzymem EcoRl a výsledné fragmenty DNA byly analyzovány elektroforézou na agarozovém gelu. Devět z dvanácti klonů mělo společný včleněný sled o přibližně 750 párůTwelve individual clones were isolated from the culture and miniprep DNA was prepared from 10 ml cultures in L-medium as described above. Then, 10 µl DNA samples from these assays were digested with EcoRI and the resulting DNA fragments analyzed by agarose gel electrophoresis. Nine of the twelve clones had a common insertion sequence of approximately 750 pairs

- 57 baží. DNA ze čtyř z těchto klonů a ze zbývajících tří klonů byla přenesena do bunějk M6 COS svrchu uvedeným způsobem. Supernatanty z takto provedených transfekcí byly zkoumány zkouškou KG--1 stejně jako zkouškou s použitím hxxk buněk z kostní dřeně na j V ' - · — účinnost CSF. Čtyři klony měly 750 párů baží jako společný fragment, včleněný ve správném sledu, takže v- 57 cows. DNA from four of these clones and the remaining three clones were transferred to M6 COS cells as described above. The supernatants from the transfections thus performed were examined by the KG-1 assay as well as by the assay using hxxk bone marrow cells for the CSF activity. The four clones had 750 pairs of bases as a common fragment, incorporated in the correct sequence, so that in

docházelo k expresi buňkami M6 COS ve vysokém stupni, jak bylo možno prokázat účinností CSF v obou uvedených zkouškách na rozdíl od zbývajících tří klonů. Znamená to,, že kodová oblast pro CSF musí být uložena ve včleněném sledu o 750 párech baží.there was a high degree of expression by M6 COS cells, as evidenced by CSF activity in both assays, as opposed to the remaining three clones. This means that the CSF code area must be stored in an inbuilt 750-pairs sequence.

Sled DNA, který je kódem pro CSF byl odstraněn z vektoru pro transformaci v positivním klonu rozštěpením enzymem EcoRl a jeho sled byl stanoven při použití standardní metody po podrobení fragmentů klonování i ve vektorech M13, čímž byl prokázán sled, znázorněný na obr. 1. Plasmid p91023(B) -CSF, o němž bylo poprvé prokázáno, Že řídí expresi CSF v buňkách COS byl pak označen pCSF-1. Tento plasmid byl pak uložen ve sbírce American Type Culture Collection xxxxxxtacsxaxxž v kmenu E. coli MC1061 pod číslem ATCC 39754 2. července 1984.The DNA sequence coding for the CSF was removed from the vector for transformation in the positive clone by digestion with EcoR1 and its sequence was determined using the standard method after subjecting the cloning fragments to the M13 vectors, thus demonstrating the sequence shown in Figure 1. Plasmid p91023 (B) -CSF, which was first shown to direct CSF expression in COS cells, was then designated pCSF-1. This plasmid was then deposited with the American Type Culture Collection xxxxxxtacsxaxx in E. coli strain MC1061 under ATCC number 39754 on July 2, 1984.

- 58 v- 58 v

Stupen 7 Exprese bílkoviny CSFStep 7 CSF protein expression

Opičí buňky M6 COS, transformované vektorem p91023(B) s obsahem CSP/cDNA, tak, jak byl tento materiál isolován ve stupbi 6, se pěstují způsobem popsaným ve stupni 6, čímž dochází k produkci bílkoviny CSF, která se pak nachází v živném prostře dí.M6 COS monkey cells transformed with p91023 (B) containing CSP / cDNA as isolated in step 6 were cultured as described in step 6 to produce the CSF protein, which is then found in the nutrient medium. dí.

Postupuje se tak, že se js 1 mg této DNA (pCSP-1) rozpustí v 1 ml 0,1 M Tris o pHProceed as follows: 1 mg of this DNA (pCSP-1) is dissolved in 1 ml of 0.1 M Tris at pH

7,3 a přidá se k 600 ml DME s obsahem 2 mmol glutaΛ minu, 100 jednotek/ml streptomycinu, 100 /U/ml penicilinu (P/S) a 0,25 mg/ml DEAE Dextranu s molekulovou hmotností 500 000 (Pharmacia). 600 ml roztoku v7.3 and added to 600 ml DME containing 2 mmol glutamine, 100 units / ml streptomycin, 100 / U / ml penicillin (P / S) and 0.25 mg / ml DEAE Dextran with a molecular weight of 500,000 (Pharmacia ). 600 ml solution in

SNA DEAE dextranu se přidá k buňkám M6 COS a směs se inkubuje 12 hodin při teplotě 37 °C. Po inkubaci se buňky promyjí 900 ml SP DME a pak se inkubujíThe dextran DEAE SNA was added to M6 COS cells and incubated for 12 hours at 37 ° C. After incubation, cells are washed with 900 ml SP DME and then incubated

2,5 hodin v 600 ml DNA s obsahem 0,1 mmol cblorocbinu, 10 EIPCS, 2 mmol glutaminu a P/S. Prostředí s obsahem chloy^hinu se odstraní odsáváním, buňky se promyjí SP DME a pak se přidá 1500 ml DME s 10 ^a/a HIPCS. Po 30 hodinách se buňky promyjí SP DME, prostředí se nahradí 800 ml čerstvého prostředí SP DME v2.5 hours in 600 ml of DNA containing 0.1 mmol cblorocbin, 10 EIPCS, 2 mmol glutamine and P / S. The choline containing medium is removed by suction, the cells are washed with SP DME and then 1500 ml of DME with 10 ^and / or HIPCS is added. After 30 hours, cells are washed with SP DME, replaced with 800 ml of fresh SP DME v

pak se buňky pro transfekci inkubují 24 hodin přithen the cells for transfection are incubated for 24 hours at

- 59 teplotě 37 °C. Prostředí se pak odsaje a nahradí v- 59 at 37 ° C. The environment is then aspirated and replaced in

800 ml čerstvého prostředí SP DME. Buňky se pak inkubují v tomto prostředí 24 hodin, načež se prostředí odstraní. Jakmile je to možné, zahustí se vzorky prostředí 20x ultrafiltrací pod tlakem při použití komory Amicon o objemu 2,5 1 s membránou ΣΜ5, která odděluje sloučeniny do molekulové hmotnosti 5 000.800 ml fresh SP DME. The cells are then incubated in this medium for 24 hours, after which the medium is removed. As soon as possible, the medium samples are concentrated 20x by ultrafiltration under pressure using a 2.5 L Amicon chamber with a membrane ΣΜ5, which separates the compounds to a molecular weight of 5,000.

v vv v

Stupen 8 Čištění rekombinantního CSPStep 8 Purification of recombinant CSP

200 ml koncentrovaného prostředí ze 4 1 výchozího materiálu ze stupně 7 se na 30 ýa nasytí síranem amonným přidáním pevného síranu amonného a vysrážená bílkovina se oddělí odstředěním. Supernatant se na 80 % nasytí síranem amonným přidáním dalšího pevného síranu amonného a vysrážená bílkovina se opět oddělí odstředěním. Peleta se anovu uvede do suspenze v 5 ml 20 mmol citronanu sodného o pH 6,1 s obsahem 1 M NaCl. Rozpuštěná bílkovina se nanese na sloupec o rozměrech 1,6 x 100 cm s náplní Ultrogel AcA54 v rovnovážném stavu ve stejném pufru. Účinnoét CSP se vymývá ze sloupce při molekulové hmotnosti 19 k jednotek nebo přibližně po 90 ml200 ml of concentrated medium from 4 l of the starting material from step 7 are saturated with ammonium sulfate for 30 by addition of solid ammonium sulfate and the precipitated protein is collected by centrifugation. The supernatant was saturated to 80% with ammonium sulfate by the addition of additional solid ammonium sulfate and the precipitated protein was again collected by centrifugation. The pellet was suspended in 5 ml of 20 mmol sodium citrate pH 6.1 containing 1 M NaCl. The dissolved protein is loaded onto a 1.6 x 100 cm column packed with Ultrogel AcA54 equilibrated in the same buffer. The CSP is eluted from the column at a molecular weight of 19 k units or approximately 90 ml

- 60 počátečního eluátu. Bylo pozorováno, že v případě, že se filtrace na gelu provádí při malé iontové síle, vymývá se látka s účinností CSP ze sloupce ve dvou polohách s molekulovou hmotností 19 a 38 k jednotek, z60 starting eluate. It has been observed that when gel filtration is carried out at low ionic strength, the CSP is eluted from the column at two positions with molecular weights of 19 and 38 k units,

což patrně znamená tvorbu dimerů. Účinné frakce se spojí a přidává se 10% TPA do koncentrace 0,15 % a pak se materiál nanese na sloupec prostředku Vydac C4 rozměru 0,46 x 25 cm v rovnovážném stavu v 0,1% TPA. Sloupec se vyvíjí lineárním gradientem acetonitrilu od 0 do 90 % v 0,1% TPA rychlostí 1 ml za zwhich probably means dimer formation. The active fractions were pooled and 10% TPA was added to a concentration of 0.15%, and then the material was applied to a column of 0.46 x 25 cm Vydac C4 equilibrated in 0.1% TPA. The column is developed with a linear gradient of acetonitrile from 0 to 90% in 0.1% TPA at a rate of 1 ml behind

minutu při celkovém množství 340 ml. Účinnost CSP se vymývá mezi 39 a 43 % acetonitrilu, frakce 16 až 20. Vzorek frakce 19 o objemu 20 yul hyl analyzován elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu (13,5% gel podle publikace Lammli, Nátuře 227. 680 (1970)). Bylo možno pozorovat jediný široký pás pro bílkovinu s molekulovou hmotností 18 až 26 k jednotek. Poněkud širší rozmezí pro molekulovou hmotnost CSP je běžnou vlastností giykoproteinů a patrně odráží velké, avšak měnící se množství uhlohydrátu. Bílkovina z frakce 19 byla podrobena Edmánóvě degradaci při použití zařízení pro stanovení sledu.Z přibližně 20 /Ug bílkoviny bylo možno určit sled prvních šestnácti aminokyselin jako A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W -E-H. Vysoký -výtěžek tohoto jediného sledu napovídá,minute at a total volume of 340 ml. CSP activity elutes between 39 and 43% acetonitrile, fractions 16-20. A sample of fraction 19 of 20µl volume was analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (13.5% gel according to Lammli, Nature 227. 680 (1970)). A single wide band was observed for a protein with a molecular weight of 18 to 26 k units. A somewhat wider range for the molecular weight of CSP is a common property of giycoproteins and probably reflects large but varying amounts of carbohydrate. The protein from fraction 19 was subjected to Edman degradation using a sequence assay. From approximately 20 µg of protein, the first sixteen amino acid sequence could be determined as A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W -E-H. The high yield of this single sequence suggests

- 61 že bílkovina CSP z frakce 19 byla vyčištěna až do homogenity. Biologická zkouška prokázala, že frakce 19 obsahovala 3 x 10 jednotek na jednotku absorbance &280* Protože typické bílkoviny ve vodném roztoku mají extinkční koeficient 0,8 až 1,2 jednotek absorbance Aggp* Na 1 mg bílkoviny,, specifická učin7 7 nost čištěného CSF je v rozmezí 1 x 10 až 4 x 10 jednotek/mg v případě, že se užije zkoušky s buňkami z lidské kostní dřeně.61 that the CSP protein from fraction 19 was purified to homogeneity. The bioassay showed that fraction 19 contained 3 x 10 units per absorbance unit & 280 * Because typical proteins in aqueous solution have an extinction coefficient of 0.8 to 1.2 units of Aggp absorbance * Per 1 mg protein, the specific performance of purified CSF is in the range of 1 x 10 to 4 x 10 units / mg when using human bone marrow cells.

vin

Τ·Τ ·

Příklad BExample B

Klonování CSP GibbonaCloning CSP Gibbon

Stupen 1Stage 1

Příprava mRNA z T-buněk GibbonaPreparation of mRNA from Gibbon T-cells

Vzorek linie T-buněk Gibbona, označený UCD-MLA 144 se pěstuje několik týdnů v prostře- .A Gibbon T cell line sample, designated UCD-MLA 144, was grown for several weeks in an environment.

dí REMI 1640 (Gibco) a 20^ fetálnímtelecím seru (PCS) Q v až do získání počtu 1 x 10 buněk. Tyto buňky byly zpracovávány tak, že byla indukována produkce vysoké hladiny CSF aktivací po 24 hodiny působením 10 ng/^m^ 12-0-ietradecanoylphorbol-13-acetátu (TPA v RPNI 1640RemI 1640 (Gibco) and 20 µF fetal calf serum (PCS) Q at 1 x 10 5 cells. These cells were processed to induce the production of high levels of CSF by activation for 24 hours by treatment with 10 ng / ^m 2 12-O-iodradecanoylphorbol-13-acetate (TPA in RPNI 1640)

- 62 s 1 % FCS. Pak byly buňky isolovány odstředěním 5 minut při 1000 otáčkách za minutu, byly promyty chloridem sodným s fosfátovým pufrem (PBS) a pak byly opět isolovány odstředěním.- 62 with 1% FCS. Then the cells were harvested by centrifugation for 5 minutes at 1000 rpm, washed with sodium chloride phosphate buffer (PBS) and then recovered by centrifugation.

Z těchto buněk byla připravena mRNA polysomů, vázaných na membránu (MBP) způsobem, popsa ným v příkladu A pro přípravu RNA z buněk Mo.Membrane-bound polysomes (MBP) mRNA was prepared from these cells in the manner described in Example A for the preparation of RNA from Mo cells.

Stupen 2 Reakce s cDNA Orvního řetězce yug MBP mRNA ze stupně'. 1 se zředí v reakční směsi pro přípravu cDNA v množství 50/ul, stejně jako bylo popsáno ve stupni 4 příkladu A a reakce se započne přidáním reversní transkriptázy. Směs se inkubuje 30 minut při teplotě 42 °C, pak se reakce zastaví přidáním EDTA do koncentrace 50 mmol a směs se zředí vodou na 100 /ul. Pak se směs extrahuje nejprve směsí fenolu a chloroformu a pak chloroformem. Hybridy cDNA/RNA se oddělí od nevčleněných trifosfátů chromatografií na sloupci s obsahem 2 ml Sepharose CL-4B. Vyloučená frakce se slijí a hybridy se vysráží ethanolem, výtěžek je 570 mg.Step 2 Reaction with the yug MBP mRNA of the Sequence Chain of mRNA from step '. 1 is diluted in 50 µl cDNA preparation as described in step 4 of Example A and the reaction is started by adding reverse transcriptase. The mixture was incubated at 42 ° C for 30 minutes, then quenched by addition of EDTA to 50 mmol and diluted to 100 µl with water. The mixture is then extracted first with a mixture of phenol and chloroform and then with chloroform. The cDNA / RNA hybrids were separated from the non-incorporated triphosphates by column chromatography containing 2 ml of Sepharose CL-4B. The separated fractions were combined and the hybrids precipitated with ethanol, yield 570 mg.

Pak se 10 ng cDNA s takto upraveným zakončením spojí s 50 ng plasmidu p5R322 se zakončeními G (NEN) v 10 yul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol EDTA a 100 mmol chloridu sodného. Výsledná reakční směs se inkubuje 10 minut při teplotě 68 °C a pak ještě 2 hodiny při teplotě 57 °C.Then, 10 ng of cDNA so treated was combined with 50 ng of p5R322 with G (NEN) in 10 µl of 10 mM Tris pH 7.5, 1 mmol EDTA and 100 mmol sodium chloride. The resulting reaction mixture was incubated at 68 ° C for 10 minutes and then at 57 ° C for 2 hours.

Stupen 5 Transformace bakteriíStep 5 Transformation of bacteria

Kmen E. coli MC1061 se pěstuje v vThe strain E. coli MC1061 is grown in v

L-bujonu, pak se zchladí v ledu, buňky se pskyhxjx oddělí odstředěním a přidá se chlorid vápenatý k přípravě buněk pro transformaci. Pak se 5 yul rozí toku ze stupně 4 inkubuje s 200 /ul takto připravených bakterií. Tato transformace se opakuje 15x při použití veškerého množství cDNA z předchozího stupně a materiál se nanese na plotny o průměru 15 cm s ljí agarem v L-bujonu s obsahem 10 /Ug/ml tetracyklinu. Na každé plotně vyrostlo přibližně 1000 kolonií.The L-broth is then cooled in ice, the cells are separated by centrifugation and calcium chloride is added to prepare the cells for transformation. Then, 5 µl of step 4 flow was incubated with 200 µl of the bacteria thus prepared. This transformation was repeated 15 times using all the amount of cDNA from the previous step, and the material was plated on 15 cm diameter plates with L1 agar in L-broth containing 10 µg / ml tetracycline. Approximately 1000 colonies were grown on each plate.

vin

Stupen 6 Pěstování kopiíStep 6 Growing copies

000 kolonií z transformací se jednotlivě vyjmou, přenesou se na čerstvé plotnyThe 1,000 colonies were transformed individually and transferred to fresh plates

Stupen 3 Reakce s cDNA druhého řetězceStep 3 Reaction with second strand cDNA

Peleta cDNA prvního řetězce ze stupně 2 se znovu uvede v suspenzi v 50 ml vody a provádí se syntéza druhého řetězce ve standardní^ reakční směsi při použití polymerázy I E. coli, ligázy E. coli a ribonukleázy H. Reakční směs se inkubuje přes noc při teplotě 16°C a pak hodinu při teplotě 37 °C. Reakce se zastaví přidáýním EDTA a směs se extrahuje směsí fenoku a chloroformu. Pak se cDNA oddělí od nevčleněných trifosfátů chromatografií na sloupci prostředku Sepharosa CL-4B,získané frakcer se slijí a cDNA se isoluje vysrážením etanolem.The first strand cDNA pellet from step 2 is resuspended in 50 ml of water and the second strand synthesis is carried out in a standard reaction mixture using E. coli polymerase I, E. coli ligase and ribonuclease H. The reaction mixture is incubated overnight at 16 ° C and then at 37 ° C for 1 hour. The reaction is quenched by addition of EDTA and the mixture is extracted with a mixture of fennel and chloroform. The cDNA is then separated from the non-incorporated triphosphates by Sepharosa CL-4B column chromatography, the fractions obtained are pooled and the cDNA is isolated by ethanol precipitation.

Stupen 4Stage 4

Příprava rekombinantní cDNAPreparation of recombinant cDNA

Peleta cDNA ze stupně 3 se uvede znovu do suspenze v 75 /ul vody. Pak se přidají na konce cDNA homopolymerní zakončení tak, že se přidá 10 yul roztoku cDNA k 25 /Ul standardní reakční směsi s obsahem terminální transferázy a výsledná směs se .The cDNA pellet from step 3 was resuspended in 75 µl water. Homopolymeric ends were then added to the ends of the cDNA by adding 10 µl of the cDNA solution to a 25 µL standard terminal transferase reaction mixture and the resulting mixture was added.

inkubuje 5 minut při teplotě 30 C. Reakce se zastaví přidáním EDTA do koncentrace 40 mmol a pak se směs inaktivuje teplem 10 minut při teplotě 68 °C.Incubate for 5 minutes at 30 ° C. The reaction is stopped by adding EDTA to a concentration of 40 mmol and then heat inactivated for 10 minutes at 68 ° C.

- 66 minut při teplotě 37 °C se směs smísí s 1yul 10 x T4 pufru s DNA polymerazou, přidá se ještě 1 /ul 2 mmol roztoku dCTP, dTTP, dGTP a 10/Ul ³²P dATP (lO^uCi/^ul 3000 Ci/mmol) a 3 jednotky Tr DNA polymerázy. Pak se reakční směs inkubuje 20 minut při teplotě 37 °C, přidá se 1/ul 2 mmol dATP a reakční směs se inkubuje ještě 10 minut při teplotě 37 °C.66 minutes at 37 ° C, the mixture is mixed with 1 µl of 10 x T4 DNA polymerase buffer, 1 µl of a 2 mmol solution of dCTP, dTTP, dGTP and 10 µl of ³² P dATP (10 µCi / µL 3000) is added. Ci / mmol) and 3 units of Tr DNA polymerase. The reaction mixture was then incubated for 20 minutes at 37 ° C, 1 µl of 2 mmol dATP was added and the reaction mixture was incubated for 10 minutes at 37 ° C.

Nevčleněné trifosfáty se oddělí od značené cDNA chromatografií na sloupci prostředku Sephadex G100. Pak se připraví druhý vzorek ze syntetického oligonukleotidu se sledemNon-incorporated triphosphates were separated from labeled cDNA by Sephadex G100 column chromatography. A second sample of synthetic oligonucleotide with sequence is then prepared

ATC TGG CTG CAC AG který je komplementární k zakončení oblasti, která je kódem pro CSF na té části, na níž se nachází aminoskupina. Tento oligonukleotid byl označen 32p . · < · dATP na 5 -zakončení při použití standardní reakce s polynukleotidkinásou.ATC TGG CTG CAC AG which is complementary to the terminus of the region that encodes the CSF on the amino group portion. This oligonucleotide was designated 32p. DATP at the 5-terminus using standard polynucleotide kinase reaction.

Stupen 8 Isolace klonů CS(/ cDNAStep 8 Isolation of CS (/ cDNA clones)

Při zkouškách na standardní hybridizaci bylo možno prokázat tuto hybridizaci u 45 klonů při použití pCSF-1 cDNA, označené T4. Z tě)íchto klonůIn standard hybridization assays, 45 clones were shown to hybridize using pCSF-1 cDNA, designated T4. Of these clones

- 65 v množství 500 kolonií na plotnu v mřížce a kolonie se pěstují přes noc při teplotě 37 °C. % Pak se kolonie oddělí od ploten přitlačením filtru ze suché- 65 in the amount of 500 colonies per plate in a grid and the colonies were grown overnight at 37 ° C. Then the colonies are separated from the plates by pressing the filter from the dry

Z mikrocelulozy na povrch plotny. Z každého základního filtru se připraví dvě kopie. Původní filtiy se skladují při teplotě 4 °C a na kopie se působí zásadou a pak se za tepla suší, aby byly připraveny pro hybridisaci.From microcellulose to the plate surface. Two copies are prepared from each base filter. The original filters were stored at 4 ° C and the copies were treated with alkali and then heat-dried to prepare them for hybridization.

vin

Stupen 7 Přeprava hybridisaSních vzorků, značenýchStep 7 Transport of hybridised samples, labeled

Včleněný sled cDNA z pCSP-1 byl isolován rozštěpením restrikčním enzymem EcoRl s následnou elektroforézou na agarozovém gelu při použití Tris acetátového pufru a ethidiumbromidu. Pás, obsahující fragment cDNA byl z gelu vyříznut a čištěn obvyklým způsobem.The incorporated cDNA sequence from pCSP-1 was isolated by digestion with EcoR1 followed by agarose gel electrophoresis using Tris acetate buffer and ethidium bromide. The band containing the cDNA fragment was excised from the gel and purified in the usual manner.

300 ng fragmentu cDNA bylo pak přidáno k 1 yul 10 x $ pufru pro působení T4 DNA polymerázy (0,33 M Trisacetát o pH 7,9, 0,66 M octan draselný, 0,1 M octan hořečnatý a 10 mmol dithiothreitolu) s 3 jednotkami T4 DNA polymeráty (New England Biolabs) a směs se zředí vodou na 10 yul. Po inkubaci 5 až 10300 ng of cDNA fragment was then added to 1 µl of 10 x T4 DNA polymerase buffer (0.33 M Trisacetate pH 7.9, 0.66 M potassium acetate, 0.1 M magnesium acetate and 10 mmol dithiothreitol) with 3 units of T4 DNA polymerates (New England Biolabs) and dilute the mixture to 10 µl with water. After incubation 5 to 10

- 68 nut při 1000 otáčkách za minutu, pak byly promyty chloridem sodným s obsahem fosfátového pufru (PBS) a nakonec byly buňky odděleny odstředěním.68 rpm at 1000 rpm, then washed with sodium chloride containing phosphate buffer (PBS) and finally the cells were collected by centrifugation.

Pak byla připravena cytoplasmatická RNA opatrným vThereafter, cytoplasmic RNA was prepared by caution

rozrušením buněk tak, že buňky byly uvedeny do suspenze v 50 ml chladného pufru pro rozrušení buněkby disrupting the cells by suspending the cells in 50 ml of cold disrupting buffer

X.X.

s obsahem Tritonu (pufr sestával ze 140 mmol NaCl,containing Triton (the buffer consisted of 140 mmol NaCl,

1,5 mmol MgCl^» mmol Tris o pH 8,6 a 0,5 % Triton Σ-100) s 10 mmol dithiothreitolu (BTT) a 50 jednotkami/ml RNA sin (Bbtec). Materiál byl rozdělen na dvě stejné části a každá z těchto částí byla navrstvena na 10 ml tého pufru s obsahem 20 sacharosy. Buněčná jádra byla odstraněna odstředěním při teplotě 4 °C po dobu 5 minut při 400 otáčkách za mihutu. Horní vrstva, kterou tvořil cytoplasmatický extrakt byla opatrně odstraněna a byl přidán dodecylsulfát sodný (SDS) do konečné koncentrace 1 Je. ?ak byl roztok 2x extrahován týmž objemem směsi fenolu a chloroformu v poměru 1:1a RNA byla vysrážená přidáním 2,5 objemu chladného ethanolu. Vysrážená RNA byla oddělena odstředixýěním 15 minut při 4000 otáčkách za minutu a pak bylo znovu uvedeno do suspenze ve směsi 0,01 M Tris o pH 7,5, 1 mmol EDTA, 0,25 M NaCl (pufr ΤΣ s 0,25 M NaCl) a materiál byl znovu1.5 mmol MgCl 4 · mmol Tris pH 8.6 and 0.5% Triton (100-100) with 10 mmol dithiothreitol (BTT) and 50 units / ml RNA sin (Bbtec). The material was divided into two equal portions and each portion was layered on 10 ml of 20 sucrose buffer. The cell cores were removed by centrifugation at 4 ° C for 5 minutes at 400 rpm. The top layer consisting of the cytoplasmic extract was carefully removed and sodium dodecyl sulfate (SDS) was added to a final concentration of 10. when the solution was extracted twice with an equal volume of 1: 1 phenol / chloroform and RNA was precipitated by adding 2.5 volumes of cold ethanol. Precipitated RNA was collected by centrifugation for 15 minutes at 4000 rpm and then resuspended in 0.01 M Tris pH 7.5, 1 mmol EDTA, 0.25 M NaCl (buffer ΤΣ 0.25 M NaCl). ) and the material was again

- 67 hybridizovalo přibližně 20 klonů se vzorkem, který obsahoval značený oligonukleotid. Kodová oblast jednoho z těchto klonů byla podrobena analýze sledu, přičemž bylo zjištěno, že došlo k substituci většího počtu baží, některé tyto substituce vedly k rozdílným aminokyselinám v bílkovině, k jejíž expresi došlo. Prokázané rozdíly jsou znázorněny na obr. 1 nad sledem DNA pro gen lidského CSF, tak, jak byl klonován v příkladu A.67 hybridized approximately 20 clones with a sample containing the labeled oligonucleotide. The coding region of one of these clones was subjected to sequence analysis to find that multiple bases were substituted, some of which resulted in different amino acids in the protein being expressed. The differences demonstrated are shown in Figure 1 above the DNA sequence for the human CSF gene as cloned in Example A.

FříkladCExampleC

Klonování CSF z mRNA lymfocytů z periferní krveCSF cloning from peripheral blood lymphocyte mRNA

VIN

Stupen 1 Příprava mRNA z lymfocytů z periferní krveStep 1 Preparation of mRNA from lymphocytes from peripheral blood

Lymfocyty z periferní krve byly připraveny z vedlejších produktů při výrobě plasmy vPeripheral blood lymphocytes were prepared from the byproducts of plasma production in the plasma

(poskytl Červený kříž) frakciónací při použití gradientu Ficoll-Hypaque. Bylo získáno při pěstování v prostředí RFMI-1640 za přítomnosti 5 fetálního telecího sera, 0,17 % fytohemmagluti|řinu a 10 ng/ml BIA hustoty 2 x 10^ buněk/ml celkem bylo získáno 6 x 10 buněk. Buňky byly odděleny odstředěním 5 mi- 69 vysrážen přidáním 2,5 objemu chladného ethanolu. Nakonec byla RNA oddělena odstředěním a znovu uvedena do suspenze v 5 ml vody. Celkový výtěžek byl(provided by the Red Cross) by fractionation using a Ficoll-Hypaque gradient. It was obtained when grown in RFMI-1640 medium in the presence of 5 fetal calf serum, 0.17% phytohemagglutinin and 10 ng / ml BIA density of 2 x 10 6 cells / ml a total of 6 x 10 cells were obtained. Cells were collected by centrifugation for 5 minutes and precipitated by adding 2.5 volumes of cold ethanol. Finally, the RNA was separated by centrifugation and resuspended in 5 ml of water. The overall yield was

7.5 mg.7.5 mg.

Z celkové cytoplasmatické RNA byla izolována mRNA selekcí na 4ígo dT celulóze. Pak seMRNA was isolated from total cytoplasmic RNA by selection on 4 µg dT cellulose. Then

2.5 mg veškeré SNA zahřeje na 5 minut na teplotu 65 °C. Přidá se chlorid sodný do koncentrace 0,5 M a RNA se nechá zchladnout na teplotu místnosti a pak se nechá projít sloupcem s obsahem 1 ml oligo zHeat 2.5 mg of all SNA at 65 ° C for 5 minutes. Sodium chloride is added to a concentration of 0.5 M and the RNA is allowed to cool to room temperature and then passed through a 1 ml oligo column.

dT celulózy, v rovnovážném stavu v TS + 0,5 14 chloridu sodného (pufr pro vazbu). Nenavázaná RNA se oddělí důkladným promytím sloupce tímtéž pufrem-r Vázaná mRNA se pak vymývá 3 ml vody a vysráží se přidáním 0,2 ml 4 M chloridu sodného a 2,5 objemu chladného ethanolu. Vysrážená mRNA se oddělí odstředěním 30 minut při 25 000 otáčkách za minutu. Výsledná usazenina v množství přibližně 100/Ug se znovu uvede do suspenze v 50 ^1 vody,cellulose dT, at steady state in TS + 0.5 14 sodium chloride (binding buffer). Unbound RNA is separated by thoroughly washing the column with the same buffer. The bound mRNA is then eluted with 3 ml of water and precipitated by the addition of 0.2 ml of 4 M sodium chloride and 2.5 volumes of cold ethanol. Precipitated mRNA was collected by centrifugation at 25,000 rpm for 30 minutes. The resulting pellet of approximately 100 µg is resuspended in 50 µl of water,

Stupen 2 Reakce s prvním řetězcem cDNAStep 2 Reaction with the first strand cDNA

20/ug PBL mRNA se zředí v reakční směsi s obsahem 50’/um cDNA, která obsahuje 100 mmol20 µg PBL mRNA is diluted in a reaction mixture containing 50 µm cDNA containing 100 mmol

- 70 Tris o pH 8φ4, 140 mmol KOI, 10 mmol MgC^, 10 mmol- 70 Tris pH 8φ4, 140 mmol KOI, 10 mmol MgCl 2, 10 mmol

2-merkaptoethanolu, 400/umol dATP, dGTP, dCTP a dTTP, 5 /Ug oligo-dT s průměrnou velikostí 12 — 18 a 25/uCi dCTP (400 /uCi/mmol) a 20 jednotek inhibitoru ribonukleásy RNAsin. Reakce byla spuštěna přidáním 60 jednotek reversní transkriptázy při teplótě 37 °C s následnou inkubací 30 minut při teplotě 42 °C.2-mercaptoethanol, 400 µmol dATP, dGTP, dCTP and dTTP, 5 µg oligo-dT with an average size of 12-18 and 25 µCi dCTP (400 µCi / mmol) and 20 units of RNAsin ribonuclease inhibitor. The reaction was initiated by adding 60 units of reverse transcriptase at 37 ° C followed by incubation for 30 minutes at 42 ° C.

Reakce pak byla zastavena přidáním ETDA do koncentrace 40 mmol s následnou extrakcí stejným objemem fenolu, nasyceného vodou. Fenolová fáze byla podrobena zpětné extrakci 50 /ummol pufru TE.. Vodné fáze byly slity a hybridy cDNA/RNA byly izolovány od nevčleněných trifosfátů tak, že slité vodné fáze prošly sloupcem s obsahem 5 ml prostředku Sepharose CL-4B (Sigma) v rovnovážném stavu s TE. Frakce, které prošly sloupcem, byly slity , doplněny na obsah 250 mmol chloridu sodného a nukleové kyseliny byly vysráženy přidáním 2,5 objemů chladného ethanolu. Hybridy byly odstředěny 30 minut při 40 000 otáčkách ® minutu. Výsledná usazenina 2,5 /Ug cDNA byla znovu uvedena do suspenze v 50/Ul vody.The reaction was then stopped by adding ETDA to a concentration of 40 mmol followed by extraction with an equal volume of water saturated phenol. The phenol phase was subjected to back extraction with 50 µmol of TE buffer. The aqueous phases were pooled and the cDNA / RNA hybrids were isolated from the non-incorporated triphosphates by passing the pooled aqueous phases through a column containing 5 ml Sepharose CL-4B (Sigma) at equilibrium. s TE. The fractions that passed through the column were pooled, made up to 250 mmol sodium chloride, and the nucleic acids were precipitated by adding 2.5 volumes of cold ethanol. The hybrids were centrifuged at 40,000 rpm for 30 minutes. The resulting 2.5 µg cDNA pellet was resuspended in 50 µl water.

- 71 v- 71 v

Stupen 3 Reakce s druhým řetězcem cDNAStep 3 Reaction with a second strand cDNA

Druhý řetězec cDNA byl syntetizován současným půsoebním enzymu DNA polymerazy I,The second strand of cDNA was synthesized by the co-acting enzyme DNA polymerase I,

DNA ligázy a RHAázy Η z E. coli. 50 /ul takto získané reakční směsi obsahovalo 20 mmol Iris o pH 8,0, mmol chlorido hořečnatého, 1,2 mmol EDTA, 25 /umolDNA ligases and RHAases Η from E. coli. 50 µl of the reaction mixture thus obtained contained 20 mmol of Iris pH 8.0, mmol of magnesium chloride, 1.2 mmol of EDTA, 25 µmol

NAD, vždy 100/Umol dATP, dGTP, dCTP a dTTP a 50/uCi 32NAD, always 100 / umol dATP, dGTP, dCTP and dTTP and 50 / uCi 32

P dCTP o 3000 Ci/nmol. Reakce se spustí přidáním 3 jednotek DNA polymerazy I, 0,5 jednotky DNA ligázy, a 0,75 jednotek ribonukleázy H s následnou inkubací 18. hodin při teplotě 16 °C a pak hodinu při teplotě 37 °C, načež se reakce zastaví přidáním EDTA do koncentrace 40 mmol a pak se extrahuje stejným objemem fenolu. Fenolová fáze se zpětně extrahuje 50/U.l TE, vodné fáze se slijí a cDNA se oddělí od nevčleněných trifosfátů chromatografií na sloupci prostředkuP dCTP of 3000 Ci / nmol. The reaction is initiated by the addition of 3 units of DNA polymerase I, 0.5 units of DNA ligase, and 0.75 units of ribonuclease H followed by incubation for 18 hours at 16 ° C and then an hour at 37 ° C, after which the reaction is stopped by addition of EDTA to a concentration of 40 mmol and then extracted with an equal volume of phenol. The phenol phase is back extracted with 50 µl TE, the aqueous phases are combined and the cDNA is separated from the non-incorporated triphosphates by column chromatography.

Sepharose CL-4B, tak, jak bylo popsáno svrchu v pří32 pádě prvního řetězce. V závislosti na včlenění P se první řetězec CDNA kvantitativně převedl do formy s dvojitým řetězcem.Sepharose CL-4B, as described above in the first strand case. Depending on the incorporation of P, the first strand of CDNA was quantitatively transformed into a double stranded form.

- 72 Stupen 4 Příprava rekombinantní cDNAStep 72 Preparation of recombinant cDNA

Na zakončení cDNA byly navázány homopolymerní C-sledy opatrným zahřátím 400 ng cDNA v 50 /Ul reakční směsi, která obsahovala 1 mmolHomopolymeric C-sequences were ligated to the end of the cDNA by carefully heating 400 ng of cDNA in a 50 µL reaction mixture containing 1 mmol.

2-merkaptoethanolu, 1 mmol chloridu kobaltnatébo a 9 jednotek terminální deoxynukleotidiltrasferázy minut při teplotě 30 °C. Pak byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace 40 mmol s následným zahřátím na 10 minut na teplotu 68 °C. Pak bylo 200 ng získáno cDNA navázáno na 500 ng pAT153 se zakončeními G (Amersham) v 100/ul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol ETDA a 100 mmol chloridu sodného.2-mercaptoethanol, 1 mmol of cobalt tetrachloride, and 9 units of terminal deoxynucleotide tetrasferase minutes at 30 ° C. The reaction was then quenched by the addition of EDTA to a concentration of 40 mmol, followed by heating to 68 ° C for 10 minutes. Then 200 ng of the obtained cDNA was coupled to 500 ng of pAT153 with G-ends (Amersham) in 100 µl of 10 mM Tris pH 7.5, 1 mmol ETDA and 100 mmol sodium chloride.

Vazba byla přxv prováděna 2 hodiny při teplotě 57 °C při 5 minutách předběžné inkubace při teplotě 68 °C.Binding was performed for 2 hours at 57 ° C for 5 minutes pre-incubation at 68 ° C.

Stupen 5 Transformace bakteriíStep 5 Transformation of bacteria

Pi^-ukt, získaný vazbou cDNA byl přímo užit k transformaci kmene E. coli MC1061. ___The β 1 -uct obtained by cDNA binding was directly used to transform E. coli strain MC1061. ___

Čerstvá kolonie bakterií byla užita k naočkování 50 ml L-bujonu a·byla pěstována několik hodin tak dlouho, až optická hustota při ýř 550 nm byla 0,25.A fresh colony of bacteria was used to inoculate 50 ml of L-broth and was grown for several hours until the optical density at 550 nm was 0.25.

vin

Hynky byly zchlazeny v ledu a pak byly oddělenyThe hyneas were cooled in ice and then separated

- 73 odstředěním 10 minut při 2000 otáčkách za minutu. Získaná usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 10 ml chladného 0,1 M chloridu vápenatého a pak byla ponechána v ledu po dobu 10 minut. Pak byly buňky odstředěny 5 minut/ při 2000 otáčkách za minutu, načež byly znovu uvedeny do suspanze v 2,5 ml 0,1 M chloridu vápenatého. Pak bylo 10/ul reakční směsi pro vazbu cDNA inkubováno s 200yul bakterií, na něž bylo působeno chloridem vápenatým nejprve 30 minut v ledu a pak 2 minuty při teplotě 37 °C, v- 73 by centrifugation at 2000 rpm for 10 minutes. The resulting pellet was resuspended in 10 ml of cold 0.1 M calcium chloride and then left on ice for 10 minutes. The cells were centrifuged for 5 minutes / 2000 rpm before being resuspended in 2.5 ml of 0.1 M calcium chloride. Then, 10 µl of the cDNA binding reaction mixture was incubated with 200 µl of the bacteria treated with calcium chloride first for 30 minutes on ice and then for 2 minutes at 37 ° C, at

načež bylo přidáno 0,8 ml Ιί-bujonu a buňky byly inkubovány ještě 30 minut při teplotě 37 °C.0.8 ml of β-broth was added and the cells were incubated for another 30 minutes at 37 ° C.

Bylo provedeno celkem 20 transformačních reakcí při využití veškerého množství navázané cDNA. Každá z transformač/ních směsí byla nanesena na plotny o průměru 15 cm, které obsahovaly L-bujon s obsahem 1> agaru a 10 yUg/ml tetracyklinu. Z 20 provedených transformací bylo připraveno 20 takto upravených ploten a tyto plotny byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C.'Na každé plotně vyrostlo přibližně 1500 kolonií bakterií, což znamená celkem 30 000 knt klonů.A total of 20 transformation reactions were performed using all the amount of bound cDNA. Each of the transformation mixtures was plated on 15 cm diameter plates containing L-broth containing 1> agar and 10 µg / ml tetracycline. Of the 20 transformations performed, 20 plates were prepared and incubated overnight at 37 ° C. Approximately 1500 colonies of bacteria were grown on each plate, representing a total of 30,000 knt clones.

- 74 Stupen 6 Výroba kopií- 74 Stage 6 Production of copies

Původní kolonie, rostoucí na každé plotně byly přeneseny na nitrocelulosové filtry o průměru 137 mm tak, že suchý filtr byl přitlačen na horní stranu plotny s koloniemi a pak byl opět sejmut. Z každého originálního filtru byly pak připraveny dvě totožné kopie běžným způsobem tak, aby bylo možno přesně označit části, které si odpovídají. Každý původní filtr byl opatrně úložen koloniemi vzhůru na sterilní filtrační papír (Vhatman 3 MM), nacházející se na skleněné desce.The original colonies growing on each plate were transferred to nitrocellulose filters with a diameter of 137 mm so that the dry filter was pressed against the top of the colonies plate and then removed again. Two identical copies were then prepared from each original filter in a conventional manner so as to accurately mark the parts that match. Each original filter was carefully placed upside down on sterile filter paper (Vhatman 3 MM) on a glass plate.

Pak byl na tento filtr uložen předem zvlhčený nitrocelulosový filtr, tento filtr byl přikryt druhým zA pre-moistened nitrocellulose filter was then placed on the filter and covered with the second filter

já větším úsekem filtračního papíru a filtry pak byly k sobě přitlačeny druhou skleněnou deskou.and the filters were then pressed together by a second glass plate.

Piltry byly očíslovány a byly na třech nesýmetrických místech propíchnuty špendlíí kem tak, aby bylo možno je v budoucnosti znovu přesně přiložit. Pak - by la. kopí e oddělena_ od původního.fi1 trua byla ..........The pilters were numbered and were pierced in three asymmetrical places with a pin so that they could be reloaded accurately in the future. Then - by la. spear e separated_ from the original.fi1 trua was ..........

uložena koloniemi vzhůru na novou plotnu s L-bujonem, agarem a tetracyklinem. Okamžitě bylo pak stejným způsobem přiložen další čistý filtr, čímž byla získána další kopie. Pak byl původní filtr navrácenplaced upside down on a new L-broth, agar, and tetracycline plate. Immediately, another clean filter was applied in the same way to obtain another copy. Then the original filter was returned

VIN

IAND

- 75 na agarovou plotnu a všechny plotny byly několik hodin inkubovány při teplotě 37 °C, po této době měly kolonie bakterií průměr přibližně 1 mm. Původní filtry byly skladovány při teplotě 4 °C k přípravě kopií, sloužících k hybridizaci svrchu uvedeným způsobem.- 75 per agar plate and all plates were incubated for several hours at 37 ° C, after which time the colonies of bacteria were approximately 1 mm in diameter. The original filters were stored at 4 ° C to prepare copies for hybridization as described above.

V zIn z

Stupen 7 Úprava filtrů pro hybridizaciStep 7 Adjustment of filters for hybridization

Každá kopie původního filtru, získaná ve stupni 6 byla uložena koloniemi směrem vzhůru na filtračním papíre (Whatman 3 MM), který byl zvlhčen 0,5 M hydroxidem sodným a 1,5 M chloridem sodným na 7 minut. Filtry pak byly neutralizovány, zvlhčeny na 2 minuty já 1 M Tris o pH 7,5 sEach copy of the original filter obtained in step 6 was deposited by the colonies upward on filter paper (Whatman 3 MM) which was moistened with 0.5 M sodium hydroxide and 1.5 M sodium chloride for 7 minutes. The filters were then neutralized, moistened for 2 minutes with 1 M Tris pH 7.5 sec

1,5 M chloridem sodným, načež byly znovu neutralizovány 5 až 10 minut a pak byly uloženy na filtry, zvlhčené pufrem SSC na 5 minut (0,015 M citrát sodný, 0.15 M chlorid sodný, pH 7,4), pak se filtry usuší na vzduchu, načež se zahřívají 1 až 2 hodiny ve vakuu na teplotu 80 °C.1.5 M sodium chloride, then neutralized for 5 to 10 minutes and then deposited on filters moistened with SSC buffer for 5 minutes (0.015 M sodium citrate, 0.15 M sodium chloride, pH 7.4), then the filters are dried to The mixture was heated to 80 ° C for 1 to 2 hours under vacuum.

- 76 Stupen 8 Isolace klonů cDNA CSPStep 76 Isolation of CSP cDNA clones

Kopie filtrů byly ve dvojím proc vedení uvedeny do styku s včleněnou cDNA pCSP—1 po radioaktivním označení, plasmid byl připraven způsobem podle příkladu B. S cDNA hybridizovalo 20 kolonií. 12 z těcjko kolonií bylo odděleno a pěstováno přes noc v L-bujonu pro další analýzu. Materií., který byl získán rozštěpením restrikčním enzymem rsi 1 z těcht o klonů byl poněkud nesourodý,. avšak tři z těchto klonů měly téměř plnou délku požadovaného sledu. U jednoho z těchto sledů byX, proveden zFilter copies were contacted in duplicate with the incorporated pCSP-1 cDNA after radiolabeling, the plasmid was prepared as in Example B. 20 colonies hybridized to the cDNA. 12 of these colonies were separated and grown overnight in L-broth for further analysis. The material obtained by digestion with the restriction enzyme rsi 1 from these clones was somewhat heterogeneous. however, three of these clones had nearly the full length of the desired sequence. For one of these sequences, byX is executed from

podrobný rozbor celého sledu. Sled, který byl kódem pro CSP v tomto klonu byl totožný s odpovídajícím sledem plasmidu, pCSF—1, což znamená, že obsahovaldetailed analysis of the whole sequence. The sequence that encoded the CSP in this clone was identical to the corresponding plasmid sequence, pCSF-1, which means that it contained

T v poloze 365-CSP(Ile).T at position 365-CSP (Ile).

Příklad DExample D

Čištění CSP z buněčné linie MoPurification of CSP from Mo cell line

1 prostředí z pěstování buněčné linie Mo se inkubuje 30 minut při teplotě 55 °C1 medium from Mo cell line culture is incubated for 30 minutes at 55 ° C

- 77 k inaktivaci viru HTLV-II, spojeného s touto buněčnou linií. Pak se prostředí zahustí ultrafiltrací pod tlakem při použití zařízení Pellicon Casette 2 s membránou PTGC(l/6 m ), se schopností oddělit ±x látku do molekulové hmotnosti 10 000. Bílkovina se pak Α&ή dále koncentruje vysráženám síranem amonným do nasycení na 80 %. 800 mg výsledné bílkoviny se znovu uvede do suspenze ve 100 ml 20 mmol tris(hydroxymethy1)aminomethanhydrochloridu (Tris-HCl) o pH / 7,4 a materiál se pak dialyzuje proti témuž pufru celkem 3x vždy při použití 4 1 pufru. Dialyzovaná bílkovina se pak nanese na sloupec o rozměrech 2,5/ x 10 cm s obsahem DEAE (diethylaminoethyl)-ultrogelu, v rovnovážném stavu v tomtéž pufru. Sloupec se pak promývá 800 ml 20 mmol tris-HCl o pH 4 a pak 800 ml 20 mmol tris-HCl o pH 7,4 s obsahem 0^2 M z- 77 to inactivate the HTLV-II virus associated with this cell line. The medium is then concentrated by ultrafiltration under pressure using a Pellicon Casette 2 with a PTGC membrane (1 / 6m), capable of separating ± x substance to a molecular weight of 10,000. The protein is then further concentrated by ammonium sulfate precipitation to 80% saturation. 800 mg of the resulting protein is resuspended in 100 ml of 20 mmol tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) pH / 7.4 and the material is then dialyzed against the same buffer a total of 3 times using 4 L of buffer each. The dialyzed protein is then loaded onto a 2.5 / 10 cm column containing DEAE (diethylaminoethyl) -ultrogel, equilibrated in the same buffer. The column is then washed with 800 ml of 20 mmol tris-HCl pH 4 and then with 800 ml of 20 mmol tris-HCl pH 7.4 containing 0 ^ 2 M z

chloridu sodného, čímž se počne vymývat látka s učiňz ností CSP. Odebere se řada frakcí po 10 ml, účinné frakce se slijí. Jde celkem o tři frakce, které se zahustí na 1/6 svého objemu, tj. na 5 ml ultrafiltrací pod tlakem při použití membrány Amicon ΣΜ5, která odděluje sloučeninu do molekulové hmotnosti 5000). Koncentrovaný vzorek z DEAE-sloupce se nanese na sloupec o rozměru 1,6 x 100 cm s obsahemsodium chloride, thereby eluting the substance with CSP activity. A series of 10 ml fractions were collected, the active fractions were combined. There are a total of three fractions which are concentrated to 1/6 of their volume, i.e. to 5 ml by ultrafiltration under pressure using an Amicon-5 membrane, which separates the compound to a molecular weight of 5,000). The concentrated sample from the DEAE column is applied to a 1.6 x 100 cm column containing the contents

- 78 AcA44 ultrogelu (akrylamidagarosový ultrogel s frakci i onací do 10 až 130 k jednotek molekulové hmotnosti) sloupec je v rovnovážném stavu ve 20 mmol kyseliny N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonové (HEPES), o pH 7,4 s 50 mmol chloridu sodného a 0,01 Jo polyethylenglykolu (PEG-8000). Látka s účinností CSF, která byla vymývána ze sloupce měla molekulovou hmotz nost 30 k jednotek. Účinné frakce byly slity a byla k nim přidána kyselina trifluoroctová (TPA) do koncentrace 0,15 objemových procent přidáváním 10ýj roztoku této kyseliny, načež byla získaná směs nanesena na sloupec o rozměrech 1 x 25 cm s obsahem prsstředku Vydac C^ v reversní fázi. Sloupec byl vyvíjen lineárním gradientem 0 až 90 % acetonitrilu v 0,1 % objemovýhh TFA rychlostí 4 ml/min, bylo získáno celkem 1000 ml eluátu. Látka s účinností CSP se vymývá při koncentraci acetonitrilu přibližně 47 objemových.- 78 AcA44 ultrogel (acrylamidagarose ultrogel with fraction up to 10 to 130 k molecular weight) The column is at equilibrium in 20 mmol of N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid (HEPES), pH 7.4 s 50 mmol of sodium chloride and 0.01 µl of polyethylene glycol (PEG-8000). The CSF effluent which was eluted from the column had a molecular weight of 30 k units. The active fractions were pooled and trifluoroacetic acid (TPA) was added to a concentration of 0.15% by the addition of a 10% solution of the acid, and the mixture was applied to a 1 x 25 cm column containing Vydac C 4 in reverse phase. The column was developed with a linear gradient of 0 to 90% acetonitrile in 0.1% v / v TFA at a rate of 4 mL / min to give a total of 1000 mL of eluate. The substance with CSP activity elutes at an acetonitrile concentration of approximately 47% by volume.

zof

Účinné frakce se slijí a upraví se na koncentraci 0,05 /£> objemových kyseliny heptafluormáselné (HFBA) přidáním 0,15$-j HFBA a získaný, materiál. se pak nanese na sloupec o rozměrech 0,46 x 25 cm s obsahem prostředku Vydac C^ v rovnovážném stavu ve HFBA o koncentraci 0,15 % objemových. Sloupec se vyvíjí lineárním gradientem 0 až 90 ^c/o objemových acetonitriluThe active fractions were combined and adjusted to a concentration of 0.05% by volume of heptafluorobutyric acid (HFBA) by the addition of 0.15% HFBA and the recovered material. is then applied to a 0.46 x 25 cm column containing equilibrium Vydac C1 in 0.15% HFBA. The column was developed with a linear gradient from 0 to ^{90, c} / o vol acetonitrile

- 79 v 0,15 /o objemových HFBA rychlostí 1 ml/min, získá z79 at 0.15% by volume of HFBA at a rate of 1 ml / min

se celkem 340 ml eluátu. Látka s účinností CSF se vymývá při koncentraci aeetonitrilu přibližně 53 % objemových. Účinné jsou frakce 37 až 44, každá z nich měla objem 1 pl. 0,15 ml frakce 40 hylo zahuštěno na 1/4 objemu při použití koncentračního zařízení SAVANT Speed Vac a pak bylo přidáno 40/ul 2x SDS pufru (0,125 M Tris-HCl o pH 6,8, 4 % SDS, % glycerolu a 0,004 % bromfenolové modři). Tyto vzorky byly povařeny 2 minuty a pak byly naneseny na 13,5% SDS gel způsobem podle Jí publikace Lammli, U. Nátuře 227. 680 (1970), jak je znázorněno na obr. 2. Frakce 40 měla účinnost 110 000 jednotek/ml při použití buněk kostní dřeně. To odpovídá přibliž? 7 ně 3,0 x 10 jednotek na jednu jednotku absorbance ^280’ ^^ro^°^^e typické bílkoviny mají extinkení koeficienty v rozmezí 0,8 až 1,2 jednotek -^280 ^v ligramu, má čištěný CSF specifickou účinnost v rozmezí 1 x 10 až 4 x 10 jednotek/mg. Vzorek 1/Ug čištěného GM-CSF byl podroben Sdmanově degradaci při použití zařízení, Applied Biosystems Gas Phase Microsequenator. Sled mezi zbytky 3 až 5 byl Ala Arg Ser.with a total of 340 ml of eluate. The substance with CSF activity elutes at a concentration of ateetonitrile of approximately 53% by volume. Fractions 37 to 44 are effective, each having a volume of 1 µl. 0.15 ml of fraction 40 was concentrated to 1/4 volume using a SAVANT Speed Vac concentrator, and then 40 µl 2x SDS buffer (0.125 M Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS,% glycerol and 0.004) was added. % bromophenol blue). These samples were boiled for 2 minutes and then loaded onto a 13.5% SDS gel by the method of Lammli, U. Nature 227. 680 (1970) as shown in Figure 2. Fraction 40 had an efficiency of 110,000 units / ml. using bone marrow cells. Does this approximate? 7 a 3.0 x 10 units per absorbance unit 280 ^ '^ ^ro ^ ° ^ ^e typical proteins have extinkení coefficients in the range from 0.8 to 1.2 units, - ^ ²⁸⁰ ligramu, Purified CSF has a specific activity in the range of 1 x 10 to 4 x 10 units / mg. Sample 1 / Ug of purified GM-CSF was subjected to Sdman degradation using an Applied Biosystems Gas Phase Microsequenator. The sequence between residues 3-5 was Ala Arg Ser.

Příklad ΞExample Ξ

Kotransformací a amplifikací sledu CSP v buňkách CHO byl včleněn plasmid p91023(B)-C3P do buněk DUKX-B11, které neobsahují DHPR CHO, jak bylo popsáno v publikaci Chasin a Urlaub PNAS zBy co-transforming and amplifying the CSP sequence in CHO cells, plasmid p91023 (B) -C3P was inserted into DUKX-B11 cells that do not contain DHPR CHO as described in Chasin and Urlaub PNAS of

zi, 4216 (1980), a to fúzí protoplastu, popsanou v publikaci Sandri-Goldin a další, Mol. Cell. Bio. 1, 743 - 752, 1981. Růst a udržování buněk CHO bylo popsáno v publikaci Kaufman a Sharp, J. Molx Biozi, 4216 (1980) by the protoplast fusion described by Sandri-Goldin et al., Mol. Cell. Bio. 1, 743-752, 1981. Growth and maintenance of CHO cells have been described by Kaufman and Sharp, J. Molx Bio

150. 601 - 621, 1981. Při provádění fuze protoplastů byl plasmid p91023(B)-CSP-l včleněn děr kmene150. 601-621 (1981). When protoplast fusion was performed, plasmid p91023 (B) -CSP-1 was incorporated with strain holes.

E. coli HB101 a baktenie byly pěstovány v 50'ml prostředí m9 s obsahem solí a 0,5 % aminokyselin kase inu, 0,4 glukosy, 0,012 °/a síranu hořečnatého, 5/Ug/ml thiaminu a 10/Ug/ml tetracyklinu do ádsorbance 0,6 při 600 nm. Chloramfenicol byl přidán do koncentrace 250/Ug/ml a kultura byla inkubo/vána při teplotě 37 °C k pomnožení kopií plasmidu. Pak byly buňky odstředěny při 3000 otáčkách/min po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a pak byly uvedeny do sus penze ve 2,5 ml chlazené 20a sacharosy v 50 mmol Tris-HCl o pH 8,0. Pak byl přidán lysozym, a to 0,5 ml roztoku o koncentraci 5 m$/ml v 0,25 ME. coli HB101 and Bacteria were grown in a 50'm m9 medium containing salts and 0.5% casein amino acid, 0.4 glucose, 0.012% magnesium sulfate, 5µg / ml thiamine and 10µg / ml tetracycline to an absorbance of 0.6 at 600 nm. Chloramphenicol was added to a concentration of 250 µg / ml and the culture was incubated at 37 ° C to propagate copies of the plasmid. Then the cells were centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C and then plated in 2.5 ml chilled 20a sucrose in 50 mmol Tris-HCl pH 8.0. Lysozyme was then added, with 0.5 ml of a 5 M / ml solution in 0.25 M

- 81 Tris-HCl o pH 8,0 a směs se pak uloží do ledu na minut. Pak se přidá 1 ml 0,25 M SDTA o pH 8,0 a směs se uloží do ledu na dalších 5 minut a pak se přidá 1,0 ml' 0,05 M Tris-HCl o pH 8,0 a suspenzeTris-HCl pH 8.0 and the mixture is then stored on ice for minutes. Then 1 ml of 0.25 M SDTA pH 8.0 is added and the mixture is placed on ice for a further 5 minutes and then 1.0 ml of 0.05 M Tris-HCl pH 8.0 and the suspension are added.

4· se inkubuje 15 minut při teplotě 37 C, po této době se bakterie přemění na protoplasty. Pak se suspenze pomalu zředí 20 ml předehřátého prostředí, které obsahuje 10 Jó sacharosy a 10 mmol chloridu hořečnatého, načež se směs nechá stát 15 iainutjf při teplotě 37 °C. Pak se přidá roztok protoplastu (přibližně 10⁹/ml) k buňkám DUKX-B11 bez DHPR CHO v plotnách o šesti vyhloubeních v množství přibližně 1 x 10 buněk/vyhloubení v poměru přibližně 1 až 2 x 10 protopíastu/bunka a protoplasty se peletuv jí spolu s buňkami odstředěním 8 minut při 2000 ot/min při použití odstředivky IEC model K. Po odstředění se supernatant odsaje a přidají se 2 ml roztoku polyethylenglykolu (50 g PE0-1450, Baker Chem. Co. v 50 ml prostředí) do každého vyhloubení vIncubate for 15 minutes at 37 ° C, after which time the bacteria turn into protoplasts. The suspension is then slowly diluted with 20 ml of preheated medium containing 10 µl of sucrose and 10 mmol of magnesium chloride, then allowed to stand for 15 minutes at 37 ° C. A protoplast solution (approximately 10 ⁹ / ml) is then added to DHPR CHO-free DUKX-B11 cells in six wells at about 1 x 10 cells / well at a ratio of about 1 to 2 x 10 protopastes / cell and the protoplasts are pelleted. together with cells by centrifugation at 2000 rpm for 8 minutes using an IEC model K centrifuge. After centrifugation, the supernatant is aspirated and 2 ml polyethylene glycol solution (50 g PE0-1450, Baker Chem. Co. in 50 ml medium) is added to each well. in

svrchu uvedené plotjcny. Pak se buňky znovu odstředí 90 sekund při 2000 ot/min, roztok polyethylenglykolu se odstraní a plotny se opláchnou 3x vždy 4 ml vthe above plates. The cells are centrifuged again at 90,000 rpm for 90 seconds, the polyethylene glycol solution is removed, and the plates are rinsed 3 times with 4 ml each.

prostředí/vyhloubení, Pak se buňky zpracují působením trypsinu, uvedou se do suspenze v 10 ml pro- 82 středís obsahem 10 % fetálního telecího sera a pak se odstředí ve zkumavce (konické) při 500 ót/rain v vThe cells are then treated with trypsin, suspended in 10 ml of medium containing 10% fetal calf serum, and then centrifuged in a test tube (conical) at 500 rpm in water.

běžné odstředivce. Peletované buňky ze tří vyhloubení se spojí a nanesou na plotnu o průměru 10 cm, ke každé plotně se přidá čerstvé prostředí, které obsahuje 100/Ug/ml kanamycinu, thymidinu, adenosinu, deoxyadenosinu, penicilinu a streptomycinu a 10 % dialyzovaného fetálního telecího séra. Kanamýcin se přidává k jí zamezení růstu jakýchkoliv bakterií, které by přetrvávaly při přěměně na protoplastv. Tftconventional centrifuges. The pelleted cells from the three wells were pooled and plated on a 10 cm diameter plate, fresh plate containing 100 µg / ml kanamycin, thymidine, adenosine, deoxyadenosine, penicillin and streptomycin and 10% dialyzed fetal calf serum was added to each plate. Kanamycin is added to prevent it from growing any bacteria that would persist when converted to protoplasts. Tft

Po dvou dnech byly buňky přeneseny v poměru 1 : 15 do prostředí a- s 10 % dialyzovaného fetálního tllecího sera, penicilinu a streptomyV činu, avšak bez nukleosidů. Pak bylo k buňkám přidáno totéž selektivní prostředí bez nukleosidů ještě po 4 až 5 dnech.After two days, the cells were transferred at a ratio of 1: 15 to an α- environment with 10% dialyzed fetal calf serum, penicillin and streptomy, but without nucleosides. Then the same selective nucleoside-free medium was added to the cells after 4 to 5 days.

Kolonie se objevily po 10 až 12 dnech pěstování v selektixním prostředí. Pak byly prováděny dva pokusy na selekci působením methotraxatu (MTX) a pokus na amplifikaci. V první sérii pokusů byly izolovány jednotlivě nezávisle klonované transformanty podle exprese DHFR a každý klonColonies appeared after 10 to 12 days of cultivation in a selective medium. Two methotraxate (MTX) selection experiments and an amplification experiment were then performed. In a first series of experiments, individually independently cloned transformants were isolated according to DHFR expression and each clone

- 83 byl pěstován za podmínek, při nichž dochází k amplifikaci počtu kopií cizorodé DNA, t j . při pouúžití stoupajícího množství methotrexátu. Při druhé sérii pokusů byla izolována směs nezávislých transformantů podle exprese DHFR a tato směs byla dále pěstována za podmínek, při nichž dochází k amplifikaci cizorodé DNA, tj. při stoupající koncentraci methotrexátu. Pak byly izolovány jednotlivé klon_v a analyzovány na expresi GM-CSF. Klony, které vykazovaly z v nejvyšší úroveň exprese GM-CSF byly dále pěstovány za podmínek, při nichž dochází k amplifikaci cizorodé DNA, tj. při stoupající koncentraci methotrexátu v živném prostředí.- 83 was grown under conditions in which the number of copies of foreign DNA was amplified, ie. using increasing amounts of methotrexate. In a second series of experiments, a mixture of independent transformants according to DHFR expression was isolated, and this mixture was further cultured under conditions whereby foreign DNA was amplified, i.e., increasing methotrexate concentration. Then individual clones were isolated and analyzed for _the expression of GM-CSF. Clones that showed the highest level of GM-CSF expression were further grown under conditions where foreign DNA amplification occurred, i.e., increasing concentrations of methotrexate in the culture medium.

Při jednom z pokusů bylo spojeno sedm transform^ntů DHFR⁺ v prostředí a bea nukleov sidů. Tyto buňky pak byly pěstovány při stoupající koncentraci MTX od 0,02/umoi přes 0,1 a 0,5 až doIn one experiment, seven DHFR ⁺ transformants were pooled in the environment and the nucleosides. These cells were then grown at increasing MTX concentrations from 0.02 / µm over 0.1 and 0.5 up to

ZOF

2,0/umol. Při zkoumání na účinnost GM-CSF při použití buněk KG-1 bylo možno prokázat 3000 až 12 000 jed *2.0 / µmol. Examination of the effectiveness of GM-CSF using KG-1 cells revealed 3000 to 12,000 poisons *

notek/ml. Tyto buňky pak byly klonovány v 0,5 a2,0 /umol MTX. Klony, které bjřly získány v 0,5 ^umol MTX (klony 010, D2 a B6) byly postupně podrobeny selekci na růst v 2,0/umol MTX. Při zkouškách na účinnostnotes / ml. These cells were then cloned in 0.5 and 2.0 µmol MTX. Clones that were obtained in 0.5 µmol MTX (clones 010, D2 and B6) were sequentially selected for growth at 2.0 µmol MTX. For efficiency tests

GM-CSF při pokusu s buňkami KG-1 produkovaly klono- 84 váné buněčné linie 15 000 až 300 000 jednotek/ml, z v této účinnosti. GM-CSF, produkovaný buňkami při provádění způsobu podle tohoto příkladu má sled aminokyselin, uvedený pro CSF-Thr na obr. 1.GM-CSF, when tested with KG-1 cells, produced cloned cell lines of 15,000 to 300,000 units / ml, in this potency. The GM-CSF produced by the cells in carrying out the method of this example has the amino acid sequence shown for CSF-Thr in Fig. 1.

Příklad FExample F

Exprese GM-CSF v Ξ. coliExpression of GM-CSF at Ξ. coli

Exprese GM-CSF bylo dosaženo v Ξ. coli při použití vektoru pTALC-195R, jde o materiál, který je znázorněn na obr. 6. Sled, který zGM-CSF expression was achieved at Ξ. coli using the vector pTALC-195R, this is the material shown in Figure 6.

je kódem pro GM-SSF začíná syntetickým sledem ATG CCA CCA CCT CCT TCT CCA TCT CCA TCT ACT, který určuje počátečních jedenáct zbytků aminokyselin z z l úplného GM-CSF. Zbytek sledu, který je kódem pro ě ·is the code for GM-SSF starting with a synthetic ATG sequence CCA CCA CCT CCT TCT CCA TCT CCA TCT ACT that determines the initial eleven amino acid residues of the 1 full GM-CSF. The rest of the sequence, which is the code for ·

Gíl-CSF v pTALC-185R je totožný se sledem v pCSF-1, nukleotidy 97 - 447, načež přichází sled TAB TAS TAG. Pak ihned následuje terminační sled, sestávající ze tří částí a z navázaného sledu p-UC-18, Do genu pro CSF byl včleněn gen pro odolnost proti tetracyklinu z plasmidu pBR322 s orientací opačnou než je orientace genu pro CSF 100 baží směrem dolů od sledu pUC—18. Gen pro odolnost proti tetracyklinuThe gene-CSF in pTALC-185R is identical to the sequence in pCSF-1, nucleotides 97-447, followed by the sequence TAB TAS TAG. Immediately followed by a three-part termination sequence and the linked p-UC-18 sequence. The tetracycline resistance gene from plasmid pBR322 was inserted into the CSF gene with the orientation opposite to that of the CSF 100 gene downstream of the pUC sequence. 18. Tetracycline resistance gene

- 85 nese svůj vlastní promotor. Pak se ve směru opačném než je směr hodinových ručiček nachází gen pro β-laktamásu a pak sled z pUC-18 (CoLEl) pro počátek replikace.- 85 carries its own promoter. Then, the β-lactamase gene is located in the direction opposite to the clockwise direction, followed by the sequence from pUC-18 (CoLE1) for the origin of replication.

Konečnou strukturou plasmidů před návratem ke sledu pro CSP je promotor PL. Tento promotor je v podstatě popsán v publikaci A. Skatzman a M. Rosenberg (v ”Molecular cloning, a laboratory manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, str. 419). Exprese CSP je řízena promotorem PL po tepelné indukci ve vhodném kmenu Ξ. coli jako hostiteli.The final plasmid structure before returning to the CSP sequence is the PL promoter. This promoter is essentially described in A. Skatzman and M. Rosenberg (in Molecular cloning, and laboratory manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, p. 419). CSP expression is controlled by the PL promoter after heat induction in an appropriate strain Ξ. coli as the host.

Kmenem, použitým pro všechny tyto konstrukce byl kmen ¥3110 ΙηοΙθΣδ, popsaný v publikaci R. Brent a M. Ptashne PNAs 78 (1981) 4204 - 4208The strain used for all these constructions was the strain ¥ 3110 ΙηοΙθΣδ, described in R. Brent and M. Ptashne PNAs 78 (1981) 4204 - 4208

Fragment AdNA ( -nukleotidy 34499 až 38214) byl integrován do chromosomu ¥3110 lacI^wL8 v místě lacZ. Integrace byla provedena při použití integračního vektoru, složeného ze sledů pBR325, nesoucích geny pro odolnost proti chloramfenikolu a ampicilinu a také počátek pro replikaci z pBR322, jak bylo popsáno v publikaci P. Bolivar Gene 4 (1978) 121 - 136. Fragment Λ DNA se včlení do genu lacZ, který je sám v plasmidů přítomen jako fragment, který zasahuje od místa BstEil v Lácí k místu TthillIThe AdNA fragment (nucleotides 34499 to 38214) was integrated into the chromosome ¥ 3110 lacI ^w L8 at the lacZ site. Integration was performed using an integration vector composed of pBR325 sequences carrying chloramphenicol and ampicillin resistance genes as well as an origin for replication from pBR322, as described in P. Bolivar Gene 4 (1978) 121-136. incorporates into the lacZ gene, which itself is present in the plasmids as a fragment that extends from the BstEil site in Laci to the TthillI site

- 86 směrem dolů od lacZ.·}- 86 down from lacZ. ·}

Integrace «Λ DNA do £ chromosomální kopie % lacZ bylo dosaženo bomologní rekombinací a byly získány lac⁺, na ampicilin citlivé a proti chloramfenikolu odolné kolonie. K další rekombinaci, která vedla k odstranění všech přídatných sledů plasmidů při ponechání integrovaného fragmentu }[ DNA došlo na plotnách MacConkeyho s obsahem lak+ s ?Integration of the DNA into the chromosomal copy of% lacZ was achieved by bomologic recombination and lac ⁺ , ampicillin sensitive and chloramphenicol resistant colonies were obtained. Another recombination that resulted in the removal of all additional plasmid sequences leaving the integrated fragment} [DNA occurred on lacquer + s MacConkey plates?

tosy. Počáteční fenotyp lac , amp , can se změnil — s s po druhé rekombinaci na fenotyp lac , amp , cam . Výsledný kmen byl nazván GL400 a měl vlastnosti -4* při teplotě 30 °C a A při teplotě 42 °C. Tento fenotyp prokazuje existenci funkční chromosomální kopie sůsůx alely 0Ιθ^_φ tosy. The initial phenotype of lac, amp, can changed - ss after the second recombination to the phenotype of lac, amp, cam. The resulting strain was called GL400 and had -4 * properties at 30 ° C and A at 42 ° C. This phenotype demonstrates the existence of a functional chromosomal copy of the Susx allele 0Ιθ ^ _φ

Kmen GL400 byl převeden na Ion transdukcí PL z lysátu kmene SG20252 (lae Á ul69, ara A 139 rpsl Ion Δ 100::Tnl0). TnlO byl nalezen·}The GL400 strain was converted to Ion by PL transduction from lysate of strain SG20252 (lae ul ul69, ara A 139 rpsl Ion Δ 100 :: Tn10). TnlO was found ·}

S při testech na Tet na selektivních prostředích, jak bylo popsáno v publikaci S. Maloy, V. Nunn, J. Bacteriol.145 (1981) 1110 - 1112.S in tests for Tet on selective media as described in S. Maloy, V. Nunn, J. Bacteriol. 145 (1981) 1110-1112.

Výsledný hostitelský kmen byl nazván GI413 (lacl°L8, LacZ A . (Aci, REK, N), Ion Δ 100 pTALC-l85R byl transformován na GI413. Kultura tohoto kmene, která vyrostla přes noc,The resulting host strain was named GI413 (lacl ° L8, LacZ A. (Aci, REK, N), Ion Δ 100 pTALC-l85R was transformed into GI413. The overnight culture of this strain,

- 87 byla pěstována při teplotě 30 °C v 5 ml indukčního prostředí s obsahem 7/Ug/ml tetracyklinu. Indukční prostředí obsahuje v 1 litru g aminokyselin kaseinu 6 g Na₂HP0₄.7H₂0 3 g KH₂P0₄ - 87 was grown at 30 ° C in 5 ml induction medium containing 7 µg / ml tetracycline. The induction medium contains 1 g of casein amino acids 6 g of Na ₂ HP0 ₄ .7H ₂ 0 3 g KH ₂ P0 ₄

0,5g NaCl 1 g hh₄ci fy glycerolu mg vitaminu 3^ mg ¥aCl₂.2H^0 0,2 g MgCl₂.6H₂0 ml tohoto prostředí s obsahem 7yUg/ml tetracyklinu se naočkuje 125 yul svrchu uvedené kultury a kultura se dále pěstuje na vodní lázni při teplotě 30 °C za třepání tak dlouho, až živné prostředí dosáhne optické hustoty 0,5 při Α^θ. Pak se prostředí rychle přenese do vodní lázně o teplotě 40 °C a protřepává se další 2 hodiny k dosažení syntézy GM-CSF. Buňky se oddělí a prokazuje se v0.5 g NaCl 1 g hh ₄ or phy glycerol mg vitamin 3 ^ mg ¥ aCl ₂ .2H ₄ 0 0.2 g MgCl ₂ .6H ₂ 0 ml of this medium containing 7 µg / ml tetracycline is inoculated with 125 µl of the above culture and the culture is further cultivated in a water bath at 30 ° C with shaking until the culture medium reaches an optical density of 0.5 at Α ^ θ. The medium is then rapidly transferred to a 40 ° C water bath and shaken for a further 2 hours to achieve GM-CSF synthesis. The cells are separated and shown in

obsah CSP v těchto buňkách elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu. Za těchto podmínek se GM-CSP nahromadí tak, že tvoří přibližně 5 fy buněčných bílkovin íříklad Gthe CSP content in these cells by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Under these conditions, GM-CSP accumulates to form approximately 5 phy of the cell proteins of Example G

Exprese GM-CSF v Sažharomyces cerevisiae iExpression of GM-CSF in Sazharomyces cerevisiae i

A. Konstrukce vektoruA. Construction of vector

Byl zkonstruován plasmid, který obsahoval gen pro enzym při biosyntéze uracilu (URA3) jako selekční gen při počátku replikace 2u. Plasmid byl odvozen od Ylp5, který byl popsán v publikaci Botstein a další, Gene 8, str. 17 - 24 (1979) při přidání fragmentu, obsahujícího počátek replikace z plasmidu kvasinek.A plasmid was constructed that contained the uracil biosynthesis gene (URA3) as a selection gene at the start of 2u replication. The plasmid was derived from Ylp5 as described in Botstein et al., Gene 8, pp. 17-24 (1979) by adding a fragment containing the origin of replication from the yeast plasmid.

B. Isolace genu pro glyceraldehydfosfátB. Isolation of the glyceraldehyde phosphate gene

Dehydrogenása (GPDH)Dehydrogenase (GPDH)

Dva geny pro 8282 GPDH byly isolovány z kvasnic, jak bylo popsáno v publikaci Holland a Hó 11and, Journal o f Bi o 1o g ic a 1'Chemi s try' 255 ~ str. 2596 - 2605 (19S0). Vzorek oligonukleotidu, syntetizovaný z uveřejněného sledu byl užit k isolaci genu pro GPDH ze sestavy plasmidů DNA genomu kvasnis při použití standardních způsobů. Plasmid, — 89 — který obsahuje celý gen GAP491 byl již čLo sbírky uložen dříve pod č. A TCC č. 39777.Two genes for 8282 GPDH were isolated from yeast as described in Holland and Ho 11and, Journal of Bi 10-10 g and 1'Chemi with try '255 - pp. 2596-2605 (19SO). The oligonucleotide sample synthesized from the published sequence was used to isolate the GPDH gene from the yeast genome genome plasmid DNA assembly using standard methods. The plasmid, which contains the entire GAP491 gene, was previously deposited with the collection no. A TCC No. 39777.

C. Příprava promotoru glvceraldehydfosfátdehvdroge-_ názv pro expresi heterologního genuC. Preparation of the glvceraldehyde phosphate dehydrogen promoter for the expression of a heterologous gene

Byl zkonstruován plasmid, v němž se « udržuje přirozený odstup promotoru GPDH od začátku ^w požadovaného heterologního strukturálního genu. Tohoto cíle bylo dosaženo tak, že bylo včleněné místo pro působení enzymu KpnI bezprostředně ke kodonu pro methionin na počátku strukturálního genu pro GPDH.A plasmid was constructed in which the natural distance of the GPDH promoter from the start ^{w of the} desired heterologous structural gene was maintained. This goal was achieved by incorporating a KpnI enzyme site immediately to the methionine codon at the beginning of the structural gene for GPDH.

Tato oblast byla pak včleněna do vektoru pro expresi YOpl leva sni c.This region was then incorporated into a vector for expression of YOpl leva sni c.

D. Isolace genů pro faktor ccD. Isolation of factor cc genes

Gen pro faktor a (fenomon) byl rovněž isolován z kvasnic a byl popsán v publikaci Kurjan a Herskowitz Cell, sv. 30, str. 933 - 943 (1982). Vzorek oligonukleotidu, syntetizovaného z tohoto sledu byl' užit k isolaci genu ze sestavy plasmidů DNA genomu kvasaáe. známým způsobem.The factor a (phenomenon) gene has also been isolated from yeast and has been described by Kurjan and Herskowitz Cell, Vol. 30, pp. 933-943 (1982). A sample of the oligonucleotide synthesized from this sequence was used to isolate a gene from a set of plasmids of the DNA of the quasiase genome. in a known way.

- 90 E. Příprava plasmidu pro expresi CS?90 E. Preparation of Plasmid for CS Expression?

Ze svrchu uvedených součástí a z lidského genu pro CS? byl běžným způsobem zkonstruován vektor pro expresi AJ14, znázorněný na obr.From the above components and from the human CS gene? the AJ14 expression vector shown in FIG.

1. V tomto vektoru byl odstraněn přírodní vedoucí sled CS? a byl včleněn sled, který je kódem pro úplný CS? v bezprostřední blízkosti sledu pro faktor a. Spojení mezi promotorem GPDH, pre-pro sledem pro faktor α a sledem pro úplný CS? je znázorněno dále a bylo potvrzeno tak, že byl analyzován sled dideoxynukleotidu.1. In this vector the natural leader sequence CS? and has been incorporated a sequence that is the code for a complete CS? the link between the GPDH promoter, the pre-pro sequence for factor α and the sequence for full CS? is shown below and was confirmed by analyzing the sequence of dideoxynucleotide.

AAATAAACAAAATG.CGTTTTCCTTCA .....AAA AGA GAG GCG GAAAAATAAACAAAATG.CGTTTTCCTTCA ..... AAA AGA GAG GCG GAA

GCT.GCA CCC GCC CGC TCG ...GCT.GCA CCC GCC CGC TCG ...

z *of *

JVtJVt

GM-CSFGM-CSF

Claims (23)

./ y./ y PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Vektor zahrnující gen kódující bílkovinu primátů, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr.A vector comprising a gene encoding a primate protein having the amino acid sequence shown in FIG. 1 za šipkou pro CSF-Thr, CSF-Ile nebo CSF-G, nebo její alelické nebo jiné funkční ekvivalenty, zachovávající si aktivitu GM-CSF v testu na lidské kostní dřeni, ve kterých je alespoň jedna aminokyselina přidána, nahrazena nebo odstraněna.1 after the arrow for CSF-Thr, CSF-Ile or CSF-G, or allelic or other functional equivalents thereof, retaining GM-CSF activity in a human bone marrow assay in which at least one amino acid is added, replaced or removed. 2. Vektor podle nároku 1, kde uvedený gen kóduje bílkovinu, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na ’ obr. 1 za šipkou pro CSF-Thr nebo CSF-Ile, nebo její alelické nebo jiné funkční ekvivalenty, jak jsou definovány v nárokuThe vector of claim 1, wherein said gene encodes a protein having the amino acid sequence shown in Figure 1 after the arrow for CSF-Thr or CSF-Ile, or allelic or other functional equivalents thereof, as defined in claim 1.1. 3. Vektor podle' nároku 1 nebo 2, přičemž funkční ekvivalenty GM-CSF primátů, pokud se vyčistí, mají v testu na lidské kostní dřeni aktivitu alespoň 1.10⁷ jednotek na mg bílkoviny.The vector of claim 1 or 2, wherein the functional equivalents of the primate GM-CSF, when purified, have an activity of at least 1.10 ⁷ units per mg protein in the human bone marrow assay. 4. Vektor podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený gen kóduje bílkovinu, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-Thr.The vector of claim 1 or 2, wherein said gene encodes a protein having the amino acid sequence shown in Figure 1 after the arrow for CSF-Thr. 5. Vektor podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený gen kóduje bílkovinu, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-Ile.The vector of claim 1 or 2, wherein said gene encodes a protein having the amino acid sequence shown in Figure 1 after the arrow for CSF-Ile. 6. Vektor podle nároku 1, kde uvedený gen kóduje bílkovinu, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-G.The vector of claim 1, wherein said gene encodes a protein having the amino acid sequence shown in Figure 1 after the arrow for CSF-G. -------—-------— 7 Vektor p o dle - n á r o ku 4, 5 -neb o 6, - -kde—aminoky se- - - — linová sekvence bílkoviny, kterou kóduje uvedený gen, dodatkově zahrnuje na svém. N-konci signální sekvenci, která předchází šipce na obr. 1.7 The vector according to 4, 5, or 6, - where the amino acids the - - - linear sequence of the protein encoded by said gene additionally comprises on its own. The N-terminus of the signal sequence that precedes the arrow in Figure 1. 8. Vektor podle nároku 4, 5 nebo 6, kde aminokyselinová sekvence bílkoviny, kterou kóduje uvedený gen, dodatkově zahrnuje na svém N-konci'methioninový zbytek.The vector of claim 4, 5 or 6, wherein the amino acid sequence of the protein encoded by said gene additionally comprises a methionine residue at its N-terminus. 9. Vektor podle nároku 1, kde uvedený gen zahrnuje sekvenci uvedenou na obr. 1 pro CSF-Thr nebo CSF-Ile, začínající za šipkou a končící na kodonu odpovídajícím aminokyselině v poloze 127.The vector of claim 1, wherein said gene comprises the sequence shown in Figure 1 for CSF-Thr or CSF-Ile, beginning after the arrow and ending at the codon corresponding to the amino acid at position 127. 10. Vektor podle nároku 1, kterým je plasmid p91023(B) deponovaný pod číslem ATCC 39754.The vector of claim 1 which is plasmid p91023 (B) deposited under ATCC number 39754. 11. Hostitelská buňka, která je transformována vektorem podle libovolného z nároků 1 až 10.A host cell that is transformed with a vector according to any one of claims 1 to 10. 12. Hostitelská buňka podle .nároku 11, transformovaná vektorem podle libovolného z nároků 2, 3, 4, 5, 9 nebo 10.A host cell according to claim 11, transformed with a vector according to any one of claims 2, 3, 4, 5, 9 or 10. 13. Hostitelská buňka podle nároku 11 nebo 12, která je prokarvotická.The host cell of claim 11 or 12, which is procarvotic. 14. Hostitelská buňka podle nároku 13, kterou je Escherichia coli.The host cell of claim 13, which is Escherichia coli. 15. ^Hostitelská buňka podle nároku 11 nebo 12, která je eukaryotická.The host cell of claim 11 or 12, which is eukaryotic. 16. Hostitelská buňka podle nároku 15, kterou je kvasinková buňka.The host cell of claim 15, which is a yeast cell. 17. Hostitelská buňka podle nároku 15, kterou je savčí buňka.The host cell of claim 15, which is a mammalian cell. Γ ΓΓ Γ - 93- 93 18. Hostitelská buňka podle nároku 17, kterou je buňka vaječníku čínského křečka.The host cell of claim 17, which is a Chinese hamster ovary cell. 19. Způsob výroby bílkoviny GM-CSF primátů, vyznačující se tím, že se kultivuje buňka podle libovolného z nároků 11 až 18 a izoluje se bílkovina GM-CSF.A method of producing a primate GM-CSF protein, comprising culturing a cell according to any one of claims 11 to 18 and isolating the GM-CSF protein. 20. Způsob výroby bílkoviny GM-CSF primátů, podle nároku 19, vyznačující se tím , že se kultivuje buňka podle libovolného z nároků 12 až 18 a izoluje se bílkovina GM-CSF.A method for producing a primate GM-CSF protein according to claim 19, characterized in that the cell of any one of claims 12 to 18 is cultured and the GM-CSF protein is isolated. 21. cDNA, která odpovídá genu uvedenému v libovolném z nároků 1 až IC.A cDNA that corresponds to the gene set forth in any one of claims 1 to IC. 22. cDNA podle nároku 21, která odpovídá genu uvedenému v libovolném z nároků 2, 3, 4, 5, 9 a 10.A cDNA according to claim 21 which corresponds to the gene mentioned in any one of claims 2, 3, 4, 5, 9 and 10. 23. cDNA plasmidu p91023(B), který je deponován pod číslem ATCC 39754. / \ Obr. í. ž T £* .-n / 20 i 1 '' *1'· 23. cDNA of plasmid p91023 (B) which is deposited under ATCC number 39754. / \ Giant. and. ž T £ *.-n / 20 i 1 '' * 1 '·