CZ405792A3 - Reactor for multistep synthesis of peptides - Google Patents

Abstract

This reactor for the multi-step synthesis of peptides with randomisation, consisting of a vessel (1) the bottom (10) of which is equipped with a central cone (9), and between it and the walls (17) of the vessel (1) there are chambers (2) closed from the bottom by frit (3) under which there is an outlet channel (16) connected to the siphon (4) the output of which is connected through a switching valve (15) to the inert gas storage unit (13), as well as to the waste vessel (11). The bottom part of the walls (17) of the vessel (1) form with the vertical axis of the reactor a sharp angle (alpha) within a range of 1 degree C to 89 degrees and the upper part an open angle (beta) within the range 91 degrees to 179 degrees, the vessel is equipped with the drive (14) for rotation around its vertical axis, and above the vessel (1) there are inlets (7) for solvents and agents and above the individual chambers there are inlets (6) for amino acid solutions.<IMAGE>

Description

Vynález se týká reaktoru pro multisekvenóní syntézu peptidů na pevném nosiči s randomizací.BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a solid-support multisvenue peptide synthesis reactor with randomization.

^T,t ί í Dosavadní stav techniky ^The prior art

Syntéza peptidů na pevné fázi podle R.B. Merrifielda popsaná například v publikaci Stewart J.M. and Young J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, 1985 vnesla do této oblasti syntézy peptidů i možnosti částečné nebo úplné automatizace viz, Merrifield R.B., Stewart J.M. and Jarnberg N., Apparatus for the automated synthesis of peptides, US 3,531,258; Brunfeldt K. Roepstorff P. and Halstrom J., Reaction systém , US 3,557,077; Kubodera T. , Hata I. and Makabe Η. , Apparatus for. synthesis of peptides or the like organic compounds, US 3,647,390; Von Kil Park and D. Regoli, System for the solid phase synthesis, US 3,715,190; Bridgham J. et al. Automated polypeptide Synthesis apparatus, US 4,668,476; Saneii H.H. , Solid phase synthesizer, US 4,746,490 a tím i řadu realizovaných nebo navrhovaných syntetizátorů. V zásadě se liší chemickou metodologií syntézy, nejčastěji Fmoc nebo Boc strategie: Atherton E. and Sheppard R.C., 1989, Solid phase peptide synthesis.Solid phase peptide synthesis according to R.B. Merrifield described, for example, in Stewart J.M. and Young J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, 1985, have introduced possibilities of partial or complete automation in this field of peptide synthesis, see Merrifield R.B., Stewart J.M. and Jarnberg N., Apparatus for the automated synthesis of peptides, US 3,531,258; Brunfeldt K. Roepstorff P. and Halstrom J., Reaction System, US 3,557,077; Kubodera T., Hata I. and Makabe Η. Apparatus for. synthesis of peptides or the like organic compounds, US 3,647,390; Von Kil Park and D. Regoli, System for Solid Phase Synthesis, US 3,715,190; Bridgham J. et al. Automated polypeptide Synthesis apparatus, US 4,668,476; Saneii H.H. , Solid Phase Synthesizer, US 4,746,490, and thus a variety of realized or proposed synthesizers. In principle, they differ in chemical synthesis methodology, most commonly in Fmoc or Boc strategies: Atherton E. and Sheppard R.C., 1989, Solid phase peptide synthesis.

A practical approach. IRL Oxford University Press; Barany G. and ___ Merrifield R.B.,. 1980, Solid-phase peptide synthesis, The peptides, Gross and Meienhofer (Eds.) str. 1-284, Academie Press, nebo nosičem, různé druhy polymerů, bavlna a podobně, Alternativě Carriers and Methods in Solid Phase Synthesis; Lebl Μ., Eichler J. and Bienert M.: Peptides 1990, Giralt and Andren (Eds.); str. 153-155, a nebo technickým a konstrukčním řešením.A practical approach. IRL Oxford University Press; Barany G. and ___ Merrifield R.B.,. 1980, Solid-phase peptide synthesis, The peptides, Gross and Meienhofer (Eds.) Pp. 1-284, Academic Press, or carrier, various types of polymers, cotton, and the like, Alternative Carriers and Methods in Solid Phase Synthesis; Lebl et al., Eichler, J. and Bienert, M .: Peptides 1990, Giralt and Andren (Eds.); pp. 153-155, or technical and design solutions.

V krátkosti lze syntézu peptidů popsat, jako postupné stavění řetězce z aminokyselin propojených peptidovou vazbou (-CO-NH-),Briefly, peptide synthesis can be described as sequential chain building from amino acids linked by a peptide bond (-CO-NH-),

I kdy k připojení každé následující aminokyseliny dojde po >Although the attachment of each subsequent amino acid occurs after>

odchránění aminokyseliny předchozí, za účasti aktivačního činidla. Na pevné fázi tento proces probíhá tak, že prvnídeprotecting the previous amino acid, with an activating agent involved. On the solid phase this process proceeds so that the first

-ami-nokyselina—je_navázána_vhodnýin způsobem na pevný nosič a celý peptid tak v závěru syntézy zůstává zachycen na nosiči a k jehoThe amino acid is bound in a suitable manner to a solid support and the entire peptide thus remains attached to the support at the end of the synthesis.

I získání je nutné konečné štěpení z nosiče. Obvyklými rozpouštědly užívanými k syntéze jsou dimethylformamid vhodný spíše pro Fmoc strategii, nebo dichlormethan vhodný pro Boc strategií. Pro postupné odchraňování koncových aminokyselin se užívá v případě Fmoc syntézy asi 20% piperidin v dimethylformamidu a v případě Boc syntézy asi 50% trifluoroctová kyselina v dichlormethanu. Pro finální štěpení z nosiče se používá, v případě Fmoc syntézy trifluoroctová kyselina s 5 až 10% specifických látek v různých poměrech a v případě Boc syntézy obvykle fluorovodík, někdy též s přísadami.Obtaining a final cleavage from the carrier is also required. Typical solvents used for the synthesis are dimethylformamide suitable for the Fmoc strategy, or dichloromethane suitable for the Boc strategy. About 20% piperidine in dimethylformamide is used for the sequential deprotection of terminal amino acids and about 50% trifluoroacetic acid in dichloromethane for Boc synthesis. For the final cleavage from the carrier, in the case of Fmoc synthesis, trifluoroacetic acid with 5 to 10% specific substances in various proportions is used, and in the case of Boc synthesis usually hydrogen fluoride, sometimes also with additives.

Dosud známá konstrukční řešení syntetizátorů se zaměřují na současnou syntézu maximálního množství daných peptidů nebo na syntézu pouze ' jednoho a nebo Omezeného^počtu- pept idů .v .maximálně.,. možné kvalitě a případně i množství. V nedávné době k těmto dvěma přístupům přibyl ještě další, jehož snahou je získat všechny možné kombinace aminokyselinových řetězců o zvolené délce a z předem zvolených aminokyselin a tento způsob je popsán v LamThe prior art synthesizer designs have focused on the simultaneous synthesis of the maximum amount of a given peptide or on the synthesis of only one or a limited number of peptides at most. possible quality and possibly quantity. More recently, there has been another approach to these two approaches which seeks to obtain all possible combinations of amino acid chains of a chosen length and from pre-selected amino acids, and this method is described in Lam.

K.S., Salmon S.E., Hersh E.M., Hrubý V.J., Kazmierski V.M. and Knapp R.J., A nev type of synthetic peptide library for identifiing ligandbinding activity, 1991, Nátuře vol. 354, str. 82-84; Houghten R.A., Pinilla C., Blondelle S.E. , Appel J.R., Dooley Č.T. and Cuervo J.H., Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery, 1991, Nátuře vol. 354 str. 84-86. Touto takzvanou randomizací se získá banka nebolí knihovna peptidů jejichž nejrůznější aktivity jsou předmětem dalšího imunologického testování.K.S., Salmon S.E., Hersh E.M., Hruby V.J., Kazmierski V.M. and Knapp R.J., A non-synthetic peptide library for identifying ligandbinding activity, 1991, Nature vol. 354, pp. 82-84; Houghten R.A., Pinilla C., Blondelle S.E. , Appel J.R., Dooley C.T. and Cuervo J. H., Generation and use of synthetic peptide combinatorial libraries for basic research and drug discovery, 1991, Nature vol. 354 pp. 84-86. By this so-called randomization, a bank or a library of peptides whose various activities are subject to further immunological testing is obtained.

Dosud známý reaktor pro syntézu peptidů s randomizací je tvořen trubicí, nasazenou na kruhovém tělese, po jehož obvodu jsou vytvořeny komůrky s pevným nosičem, z nichž každá je ze spodní strany opatřena fritou s výpustným kanálkem a dalším nezbytným příslušenstvím. Trubice je uzavřena hlavou s přívody roztoků aminokyselin rozpouštědel a činidel. Randomizačního procesu se v tomto reaktoru dosahuje proudem inertního plynu přiváděného do vnitřního prostoru, který způsobí vzájemného promísení obsahu všech komůrek. V tomto reaktoru je však možno použít jen malého množství polymerního nosiče a tak randomizovat poměrně krátký úsek peptidového řetězce.The prior art randomized peptide synthesis reactor consists of a tube mounted on a circular body, circumferentially formed by solid support chambers, each of which is provided with a frit with a drain channel and other necessary accessories from the underside. The tube is closed by the head with the supply of solutions of amino acids of solvents and reagents. The randomization process in this reactor is achieved by a stream of inert gas introduced into the interior space which causes the contents of all the chambers to mix together. However, only a small amount of polymeric carrier can be used in this reactor to randomize a relatively short stretch of peptide chain.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

IAND

Výše uvedený nedostatek odstraňuje reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizací , který je tvořený nádobou, jejíž dno je opatřeno středovým kuželem mezi nímž a stěnami nádoby jsou vytvořeny komůrky za spodní strany uzavřené fritou, pod níž je vytvořen výpustný kanálek, spojený se sifonem, jehož výstup je připojen přes přepínací ventil jednak k zásobníku inertního plynu a jednak k nádobě odpadu. Jeho podstata spočívá v tom, že nádoba reaktoru je opatřena pohonem pro otáčení kolem své svislé osy. Stěny nádoby ve své spodní části svírají se svislou osou reaktoru ostrý úhel a v rozmezí od 1° do 89° a v horní části tupý úhel β v rozmezí od 91° do 179° tak, aby byla vytvořena záchytná kapsa tvořící randomizační prostor ve kterém dochází při odstřeďování k randomizací. Nad nádobou jsou v její ose nad středovým kuželem a při horní části stěny nádoby umístěny přívody rozpouštědel a činidel.The above drawback removes the multi-sequence randomized peptide synthesis reactor consisting of a vessel whose bottom is provided with a central cone between which and the vessel walls are formed by chambers behind the bottom of a frit enclosed below a drain channel connected to a siphon whose outlet it is connected via a changeover valve to the inert gas tank and to the waste container. Its essence is that the reactor vessel is provided with a drive for rotation about its vertical axis. The vessel walls form an acute angle α between 1 ° and 89 ° at the bottom of the reactor and an obtuse angle β between 91 ° and 179 ° at the top to form a catch pocket forming a randomization space within which when spinning to randomization. Above the vessel, along its axis above the center cone and at the top of the vessel wall are solvent and reagent feeds.

Reaktor podle vynálezu umožňuje syntézu všech možných peptidů, tvořených kombinací daného počtu různých aminokyselin o dané délce řetězce a to oběma hlavními metodami Fmoc a Boc. Konstrukce reaktoru umožňuje vedle randomizace i jeho využití pro běžnou vícenásobnou syntézu peptidů.The reactor according to the invention allows the synthesis of all possible peptides consisting of a combination of a given number of different amino acids of a given chain length by both the main Fmoc and Boc methods. The design of the reactor enables, besides randomization, its use for common multiple peptide synthesis.

Přehled obrázků na výkreseOverview of the drawings

Na přiloženém výkresu je znázorněn reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizací, prováděnou odstředěním kuliček pevného nosiče po každém cyklu syntézy.The attached drawing shows a reactor for multi-sequence peptide synthesis with randomization by centrifuging the solid support beads after each cycle of synthesis.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizací je tvořený rotační nádobou 1, jejíž dno 10_je opatřeno středovým kuželem 9. Mezi ním a stěnami 17 nádoby 1 jsou vytvořeny oddělenéA reactor for multi-sequential synthesis of peptides with randomization consists of a rotary vessel 1, the bottom 10 of which is provided with a central cone 9. Between it and the walls 17 of the vessel 1, separate

- 4 komůrky 2 s pevným nosičem , ze spoda uzavřené fritou 3. Pod ní je vytvořen výpustný kanálek 16 ústící do společného sifonu 4 , jehož výstup je připojen přes přepínací ventil 15 buď k zásobníku 13 inertního plynu nebo k odpadní nádobě 11. která je spojena se zdrojem 12 vakua. Nad komůrkami 2 jsou umístěny přívody 6 roztoků aminokyselin a aktivačního činidla spojené se zásobníky 5 a přívody 7 rozpouštědel a činidel spojené se zásobníky 8. Spodní část stěny 17 rotační nádoby 1 svírá se svislou osou reaktoru ostrý úhel , její horní část pak tupý úhel. Stěna 17 tak vytváří po obvodu reaktoru záchytnou kapsu, t.j, randomizační prostor ve kterém se při randomizačniro procesu udržuje odstřeďovaná náplň reaktoru. Nádoba 1 je dále opatřena krokovým motorem 14. který umožňuj eT j ej í rotaci?Počet -komůrek -^ 2-oddělených, přepážkami je dán počtem aminokyselin, které mají být variovány a lze jej měnit podle konkrétní potřeby vložením bloků s požadovaným dělením. Také pro různá množství pevného nosiče lze volit blok s vyššími nebo nižšími přepážkami. Krokovací motor 14 je použit při pomalém pohybu pro dávkování promývacích rozpouštědel a při vysokých otáčkách pro vlastní randomizaci.4 a solid support chamber 2, from the bottom closed by a frit 3. Below it is formed an outlet channel 16 leading to a common siphon 4, the outlet of which is connected via a changeover valve 15 to either an inert gas tank 13 or a waste vessel 11 which is connected with a vacuum source 12. Above the chambers 2 are placed inlets 6 of amino acid solutions and activating agent connected to containers 5 and inlets 7 of solvents and reagents connected to containers 8. The lower part of the wall 17 of the rotating vessel 1 forms an acute angle with the vertical axis of the reactor. Thus, the wall 17 forms a containment pocket, i.e. a randomization space, around which the centrifugal charge of the reactor is maintained during the randomization process. The vessel 1 is further provided with a stepper motor 14 which allows the rotation to be even more. The number of chambers 12 separated by the baffles is determined by the number of amino acids to be varied and can be varied as desired by inserting blocks with the desired separation. A block with higher or lower partitions can also be selected for different amounts of solid support. The stepping motor 14 is used at slow motion for dispensing wash solvents and at high speed for self randomization.

Reaktor je vybaven zařízením k dávkování roztoků aminokyselin přiváděných ze zásobníků 8, do jednotlivých komůrekThe reactor is equipped with a device for dispensing the amino acid solutions supplied from the containers 8 into the individual chambers

2. Při pomalém otáčení krokového motoru 14 se plní všechny komůrky 2. Rozpouštědla a činidla jsou z komůrek 2 odsávána vakuem přes sifon 4, umístěný ve středovém kuželu 9 do odpadní nádoby 11. Během reakce, odchránění, promývání i při dalších operacích se obsah jednotlivých komůrek 2 promíchává Slabým proudem inertního plynu, přiváděného do spodní části reaktoru sifonem 4 a fritami 2- Tlak plynu je volen tak, aby došlo pouze k promísení obsahu v každé komůrce 2 a nikoliv mezi komůrkami navzájem. V reaktoru je možné použít jako nosiče polymerní pryskyřici. Pokud nejsou použity předem aktivované aminokyseliny, aktivační Činidlo se přidává následně, postupně do všech komůrek 2 analogicky jako je tomu u promývacího rozpouštědla. Do reaktoru je naneseno potřebné množství kuliček syntetické pryskyřice ve vhodném rozpouštědle. Odstředěním vysokou rychlostí jsou kuličky promíchány a rovnoměrně rozděleny po obvodu reaktoru. Snížením otáček nádoby i reaktoru suspenze kuliček pryskyřice rovnoměrně steče po stěnách 17 nádoby do jednotlivých komůrek 2. Kuličky pryskyřice které ulpí na stěně 17 nádoby 1 jsou spláchnuty proudem rozpouštědla z přívodu T_ umístěného při stěně 17 nádoby 1, to vše při pomalém otáčení nádoby χ. Rozpouštědlo se odsaje a po přidání roztoků jednotlivých aminokyselin, v tomto případě se do jedné komůrky 2 přidává vždy stejná aminokyselina, proběhnou reakce. . Promývání, odchránění i aktivace probíhá společně shodnými činidly pro všechny aminokyseliny a ve všech komůrkách 2 současně. Po ukončeni jednoho cyklu jsou kuličky pevného nosiče vypláchnuty proudem rozpouštědla, přiváděného do rychle se otáčejícího reaktoru, v jeho randomizačním prostoru. Po randomizaci a opláchnutí stěn 17 reaktoru se celý postup opakuje. Dávkování libovolné aminokyseliny do libovolné komůrky 2 je umožněno otáčením nádoby 1 reaktoru. Konstrukce reaktoru zůstává i2. All chambers 2 are filled while the stepper motor 14 rotates slowly. Solvents and reagents are sucked from chambers 2 through vacuum through a siphon 4 located in the center cone 9 into a waste container 11. During the reaction, deprotection, washing and other operations the contents of the individual The chambers 2 are mixed with a weak stream of inert gas supplied to the bottom of the reactor by a siphon 4 and frits 2. The gas pressure is selected so as to only mix the contents in each chamber 2 and not between the chambers. Polymeric resins can be used as carriers in the reactor. If no pre-activated amino acids are used, the activating agent is added subsequently, sequentially to all chambers 2 analogously to the washing solvent. The required amount of synthetic resin beads in a suitable solvent is applied to the reactor. By centrifuging at high speed, the beads are mixed and uniformly distributed around the reactor perimeter. By reducing the revolutions of the vessel and the reactor, the slurry of resin beads flows evenly over the walls 17 of the vessel into the individual chambers 2. The resin beads adhering to the wall 17 of the vessel 1 are flushed by the solvent stream from the inlet T located at the vessel wall 17. The solvent is aspirated and after the addition of the solutions of the individual amino acids, in this case the same amino acid is always added to one chamber 2, the reactions are carried out. . Washing, deprotection and activation are performed together with the same reagents for all amino acids and in all chambers 2 simultaneously. Upon completion of one cycle, the solid support beads are flushed with a stream of solvent fed to the rapidly rotating reactor in its randomization space. After randomizing and rinsing the reactor walls 17, the process is repeated. The dosing of any amino acid into any chamber 2 is made possible by the rotation of the reactor vessel 1. The design of the reactor remains i

stejná , mění se pouze počet a druh rozpouštědel a činidel. Reaktor umožňuje syntetizovat peptidy s randomizaci, využitím principu odstředění, kterým se vytlačuje pryskyřice z reakčního do randomizačního stěny nádoby reaktoru běžné syntézy peptidů prostoru t.j. ze separovaných komůrek prostoru, vytvořeného po vnitřním obvodu a jejich statistické rozdělení. Možnost spolu s rendomizační syntézou ve stejném reaktoru dovoluje automatizovanou přípravu peptidů, které mají randomizovanou pouze část své sekvence. Ve srovnání se známou konstrukcí reaktoru pro automatizovanou přípravu peptidů reaktor podle vynálezu umožňuje řádově vyšší objemové množství polymerního _ nosiče ,a tak i randomizaci dalšího úseku peptidového řetězce.the same, only the number and type of solvents and reagents changes. The reactor makes it possible to synthesize peptides with randomization, utilizing the centrifugation principle by which the resin is forced out of the reaction into the randomization wall of the reactor vessel of conventional space peptide synthesis, i.e., separated compartments of the space formed around the inner perimeter and their statistical distribution. The possibility, together with rendomization synthesis in the same reactor, allows automated preparation of peptides having only a randomized portion of their sequence. Compared with the known reactor design for the automated preparation of peptides, the reactor according to the invention allows an order of magnitude higher volume of polymeric carrier and thus randomizes another stretch of peptide chain.

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1, Reaktor pro multisekvenční syntézu peptidů s randomizací, tvořený nádobou, jejíž dno je opatřeno středovým kuželem, mezi nímž a stěnami nádoby jsou vytvořeny komůrky ze spodní strany uzavřené fritou, pod níž je vytvořen výpustný kanálek, spojený se sifonem, jehož výstup je připojen přes přepínací ventil jednak k zásobníku inertního plynu a jednak k nádobě odpadu, se vyznačuje tím, že nádoba (1), jejíž stěny (17) ve spodní části svírají se svislou osou reaktoru ostrý úhel a v rozmezí 1° do 89° a v horní části tupý úhel β v rozmezí od 91° do 179θ^ρ_ΓΟ _ vytvoření . záchy.tné^kapsy obsahu nádoby (1) reaktoru při odstřeďování, je opatřena pohonem (14) pro otáčení kolem její svislé osy, přičemž nad nádobou (1) jsou umístěny přívody (7) rozpouštědel a činidel a nad jednotlivými komůrkami přívody (6) roztoků aminokyselin.1, A reactor for multi-sequence synthesis of randomized peptides consisting of a vessel whose bottom is provided with a central cone between which and the vessel walls are formed chambers from the bottom frit-closed side under which a drain channel is formed connected to a siphon connected via The changeover valve to the inert gas container and to the waste container is characterized in that the container (1), whose walls (17) at the bottom form an acute angle with the vertical axis of the reactor in the range 1 ° to 89 ° and at the top an obtuse angle β ranging from 91 ° to 179θ ^ ρ _{ΓΟ ΓΟ} . catching pockets of the contents of the reactor vessel (1) during centrifugation, is provided with a drive (14) for rotation about its vertical axis, with solvent and reagent inlets (7) above the vessel (1) and inlets (6) above the individual chambers amino acid solutions. 2. Reaktor podle bodu 1 se vyznačuje tím, že přívod (7) rozpouštědel a činidel je Umístěn v ose reaktoru nad středovým kuželem (9) a při horní části stěny (17) nádoby (1) .2. The reactor according to claim 1, characterized in that the solvent and reagent supply (7) is located in the reactor axis above the central cone (9) and at the top of the wall (17) of the vessel (1).