CZ372999A3 - Syntetická sloučenina, která váže receptor kalcitoninu, reakční činidlo, scintigrafické zobrazovací činidlo, prostředek a radioterapeutické činidlo ji obsahující, komplex a sestava pro přípravu radioaktivního přípravku, způsob označení reakčního činidla a způsob jeho výroby a použití - Google Patents

Abstract

Syntetická sloučenina, kteráváže receptor kalcitoninu, má molekulovou hmotnost menší než 10 000 aje kovalentně navázánana chelátor radioaktivního kovu za vzniku reakčního činidla, které má stejnou nebo větší vazebnou afinitu na receptor kalcitoninu nežje vazebná afinita radioaktivním jodem označeného přírodního kalcitoninu na uvedený receptor. Reakční činidlo, které obsahuje uvedenou sloučeninu, scintigrafické zobrazovací činidlo, které obsahuje toto reakční činidlo, prostředek, který obsahuje toto reakční činidlo, a radioterapeutické činidlo, které obsahuje toto reakční činidlo a cytotoxický radioisotop, komplex, který se vytvoří zreagovánímreakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 s techneciem-99m, rheniem-186 nebo rheniem-188 v přítomnosti redukčního činidla, a sestava pro přípravu radiofarmaceutického přípravku, který obsahuje zatavenou nádobku obsahující předem stanovené množství shora uvedeného reakčního činidla a dostatečné množství redukčního činidlapro označení tohoto reakčního činidla techneciem-99m, rheniem-186 nebo rheniem-188. Způsob označení uvedeného reakčního činidla a způsobjeho výroby a jeho použití pro výrobu léčeivapro zobrazení místav tělu savce a pro výrobu léčivapro léčení onemocnění, pro kteréje charakteristickápřítomnost receptorůkalcitoninu. Syntetická sloučenina, která váže receptor kalcitoninu, reakční činidlo, scintigrafické zobrazovací činidlo, prostředek a radioterapeutické činidlo ji obsahující, komplex a sestava pro přípravu radioaktivního přípravku, způsob označení reakčního činidla a způsob jeho výroby a použití

Description

Syntetická sloučenina, která váže receptor kalcitoninu, reakční činidlo, scintigrafické zobrazovací činidlo, prostředek a radioterapeutické činidlo ji obsahující, komplex a sestava pro přípravu radioaktivního přípravku, způsob označení reakčního činidla a způsob jeho výroby a použití

Oblast techniky

Tento vynález se týká syntetické sloučeniny, která váže receptor kalcitoninu a je kovalentně navázána na chelátor radioaktivního kovu, takže vznikne reakčního činidlo, které má stejnou nebo větší vazebnou afinitu na receptor kalcitoninu než je vazebná afinita radioaktivním jodem označeného přírodního kalcitoninu na uvedený receptor. Je popsáno scintigrafické zobrazovací činidlo, které obsahuje toto reakční činidlo, prostředek a radioterapeutické činidlo, které obsahuje toto reakční činidlo a cytotoxický radioisotop, a komplex, který se vytvoří zreagováním tohoto reakčního činidla s cytotoxickým radioisotopem v přítomnosti redukčního činidla. Uvedené reakční činidlo lze použít pro výrobu léčiva zvláště při léčení rakoviny.

Dosavadní stav techniky

V posledních 60 letech byl dosažen velký pokrok v tendenci snižování dlouhodobé úmrtnosti na některé typy rakovin, zvláště rakoviny žaludku. Během stejné doby však tendence úmrtností na jiné typy rakovin zůstávají nezměněny nebo se dokonce zvyšují. Například rakovina plic je nejčastějším typem rakoviny na světě, která dnes představuje hlavní příčinu úmrtnosti na rakovinu u mužů a žen. Rakovina prsu je nejobvyklejší rakovinou u žen a druhou hlavní příčinou úmrtnosti žen na rakovinu. V některých zemích se zvyšuje úmrtnost na rakovinu vaječníku. Rovněž pokračují rakoviny lymfatických žláz u dětí i dospělých, jako jsou leukemie a ne-Hodgkinovy lymfomy, které představují významné příčiny úmrtnosti na rakovinu. U všech těchto rakovin je dnes cílem jejich včasná diagnosa a účinné léčení.

9 9 9 9

9 99 9

9 9 9 9

9 999 999

9 9

9 9 9 9 9 9

Před několika lety byla navržena místně směrovaná diagnosa a terapie, které umožňují in vivo zacílení příslušných míst onemocnění v těle živočicha. Obecně platí, že místně směrovaná diagnosa nebo terapie používá cílené částice, jako je protilátka specifická pro místo onemocnění nebo pro organismus, který způsobuje onemconění, která je svázána se značkou v případě diagnostického činidla nebo s cytotoxickým činidlem v případě terapeutického činidla. Existuje velmi mnoho literatury, které se týká radioaktivně označených protilátek nebo fragmentů protilátek pro účely diagnostického zobrazení. Podobně byla během těchto let navržena četná místně směrovaná terapeutická činidla, která používají monoklonální protilátky a rozmanité radioisotopy, např. jak je uvedeno v USA patentech č. 4 454 106, 4 472 509, 4 828 991, 5246 691, 5 355 394 a 5641 471, v evropských patentech 429624 a 585 986, ve spisu WO 90/15 625 a podobně. Tato činidla na bázi protilátky poskytují vedlejší účinky, které se týkají imunitních odpovědí léčeného živočicha na protilátku, i když se fragmenty protilátky nebo humanizované protilátky používají jako cílící částice.

Nevýhodám místně cílených diagnostických a terapeutických činidel na bázi protilátky se lze vyhnout, jestliže se používají cílící částice, které mají nižší molekulové hmotnosti, jako jsou peptidy specifické pro receptor nebo malé molekuly. Kondenzace peptidu nebo malé molekuly se značkou nebo cytotoxickým činidlem, za zachování specifičnosti sloučeniny na receptor, však může být technicky obtížná. Způsoby radioaktivního označení peptidů a dalších malých molekul, které zachovávají schopnost sloučeniny vázat se specificky na receptor, jsou popsány v obecně známých USA patentech č. 5 225180, 5 405 597, 5 443 815, 5 508 020, 5 552 525, 5 561 220, 5 620 675, 5 645 815, 6 654 272, 5 711 931, 5 716 596, 5 720 934 a 5 736122, v opuštěné USA patentové přihlášce č. 07/955 466 a ve spisech WO 92/13 572, WO 93/10 747, WO 93/17 719, WO 93/21 962, WO 92/23 085, WO 93/25 244, WO 94/00 489, WO 94/07 918 a WO 94/28 942. Způsoby popsané v těchto patentech a publikacích jsou zvláště vhodné pro výrobu místně směrovaných diagnostických zobrazujících činidel. USA patenty č. 5620675 a 5 716 596 a spisy WO 94/00489, WO 95/03330, WO 95/00 553, WO 95/31 221 a WO 96/04 308 φφ ··

Φ Φ 4

Φ Φ «

ΦΦΦ Φ Φ 4 • 4 φ Φ Φ Φ popisují analogy somatostatinového peptidu, které se mohou používat pro místně směrovanou radioterapii. Spis WO 95/33 497 popisuje somatostatinové analogy, gpllb/llla receptor vázající peptidy a peptidy vázající leukocyty, které se mohou používat pro místně směrovanou radiodiagnosu nebo radioterapii. Spis WO 96/30 055 popisuje peptidy vázající receptor vasoaktivního intestinálního peptidu (VIP), který se může používat pro místně směrovanou radiodiagnosu nebo radioterapii.

Nádorové buňky často příležitostně exprimují nebo nadexprimují příslušný receptor nebo receptorový subtyp, jak ukazují vazebné receptorové studie. U některých typů rakovin se markéry nádorových buněk mohou měnit podle toho, jak onemocnění postupuje, možná proto, že odráží stav onemocnění a tedy prognosu pro pacienta. Druh receptoru, který nádorová buňka exprimuje, může být charakteristický pro etiologii nádoru a může tedy poskytovat relativně specifický markér pro nádor. Například bylo ukázáno, že radioaktivně označené samotostatinové analogy se specificky vážou na neuroendokrinní nádory, melanomy, rakovinu plic a některé rakoviny prsu. Jeden takový analog, ¹¹¹ln-Octreoscan, dostal obchodní schválení pro používání při zobrazování neuroendokrinních nádorů. Druhý radioaktivně označený somatostatinový analog, ^mTc-Depreotide, má ukončenu třetí fázi klinických testů pro použití pro zobrazování nádorů plic. Bylo ukázáno, že ¹²³l-vasoaktivní intestinální peptid je cílen na adenokarcinomy tlustého střeva a žaludku.

Kalcitonin (CT) je peptid o 32 aminokyselinách, který je sekretován ze štítné žlázy jako odpověď na zvýšené hladiny vápníku v seru. Kalcitonin má četné biologické účinky, které jsou zprostředkovány kalcitoninovými receptory přítomnými na povrchu buněk v cílovém orgánu. Receptory s vysokou afinitou na CT byly identifikovány v kostech, ledvinách, plicích a v centrálním nervovém systému. V kostech CT inhibuje resorpci kostí osteokblasty, v ledvinách CT zvyšuje vylučování vápenatých iontů a v centrálním nervovém systému tento peptid indukuje analgesi, sekreci žaludeční kyseliny a inhibicí chuti. Malá množství CT byla podávána živočichům a lidem bez toxických účinků. Lososový CT je klinicky používán pro léčení kostních poruch, jako je Pagetovo onemocnění, maligní hyperkalcemie a osteoporóza. Intra• · · · venózně podávaný kalcitonin rychle mizí z krve a je primárně vylučován močí. Hlavním místy lokalizace podávaného CT jsou ledviny, játra a epifýzy dlouhých kostí.

Množství cirkulujícího CT jsou považována za markér některých typů nebo stavů rakoviny, například medulámího karcinomu štítné žlázy, rakoviny malých buněk plic, karcinoidů, rakoviny prsu a gastrointestinální rakoviny. Vysoce afinitní CT receptory byly identifikovány v lymfatických buňkách, lidských buněčných liniích rakoviny plic, lidských buněčných liniích rakoviny prsu a v primární tkáni rakoviny prsu. Findlay a spol., Biochem. J. 1981, 196, 513 až 520, popisují, že CT receptory jsou nadexprimovány v některých buněčných liniích rakoviny prsu, plic, vaječníků a lymfatických žláz.

Sekvence aminokyselin CT některých druhů (člověk, losos a úhoř) jsou uvedeny níže:

hCT CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVG.AP.amid (sekv. id. č. 1), cCT CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSG.TP.amid (sekv. id. č. 2), eCT CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTP.amid (sekv. id. č. 3) (kde jednopísmenové zkratky aminokyselin znamenají tak, jak je uvedeno v Zubay: Biochemistry, druhé vydání, MacMillan Publishing, New York 1988, str. 33, a kde podtržené aminokyseliny mezi dvěma cysteinovými zbytky v aminové koncové části peptidu znamenají disulfidovou vazbu). U těchto druhů je zachováno devět zbytků, zahrnující karboxylový koncový prolinový amid a disulfidem vázané cysteinové zbytky v polohách 1 a 7. Lososový a úhoří CT jsou účinnější než lidský CT jak in vitro tak in vivo.

Byly vyvinuty analogy CT peptidu, u nichž je chemicky labilní disulfid nahražen stabilními vazbami atom uhlíku-atom uhlíku vytvořenými mezi 2-aminokorkovou kyselinou, jak je popsáno v USA patentu č. 4 086 221. CT analogy, u nichž jsou vynechány oblasti aminového konce, střední oblast nebo karboxylový konec molekuly, vykazují pouze slabé navázání na CT receptory. Mezi zbytky 8 a 22 CT molekuly lze provést mnoho substitucí aminokyselin, takže se generují biologicky aktivní CT ana······ · · ·· · · • · · ·· · · ···· ··· · · · · · · • · · · · · · ······ • · · · ·· · · ·· «· ··· ··· ·· 44 logy. Některé CT analogy pouze s minimální sekvenční homologii s přírodní formou CT mají biologickou aktivitu podobnou aktivitě lososového CT. Upravené CT peptidové deriváty (jako je Cbz-LHKLQY-OMe) si také zachovává podstatnou vazebnou aktivitu na receptor.

Jelikož nádory mohou exprimovat nebo nadexprimovat různé receptory, pro dosažení optimálních diagnostických a terapeutických modalit proti rakovině jsou potřeba rozmanitá radiodiagnostická a radioterapeutická činidla.

Podstata vynálezu

CT receptory na povrchu buněk plicního a vaječníkového adenokarcinomu, rakoviny prsu a lymfomů lze využít jako markéry pro umístění, identifikaci a léčení těchto nádorů in vivo. Autoři předloženého vynálezu poprvé vyvinuli malé, syntetické sloučeniny, včetně peptidů odvozených od CT, které mají schopnost vázat se s vysokou afinitou na CT receptory a jsou příznivými farmakokinetiky, čímž umožňují účinnou in vivo lokalizaci diagnostických a terapeutických činidel v místech nádorů. Tato reakční činidla podle vynálezu poskytují podklad pro rychlé, cenově efektivní, neinvazivní diagnostické zobrazovací postupy, které jsou užitečné pro detekci nádorů, zjištění stavu onemocnění a vyhodnocení metastatického rozšíření nádorů, charakterizovaných expresí nebo nadexpresí CT receptorů. Reakční činidla podle vynálezu poskytují také podklad pro vyhodnocení terapeutické účinnosti dalších modalit léčení, například umístění CT-receptor exprimujících nádorových buněk s následující chirurgickou terapií, radioterapií nebo chemoterapií. Reakční činidla podle vynálezu se mohou používat také jako cílové částice pro místně řízenou radioterapii.

Tento vynález poskytuje reakční činidla vázající CT receptor, která obsahují sloučeniny vázající se na CT receptor, s výhodou CT peptidy, CT deriváty nebo CT analogy, které jsou kovalentně napojeny na chelátor radioaktivního kovu. Sloučneiny, která vážou CT receptor, používaná v reakčních činidlech podle vynálezu, mají molekulovou hmotnost menší než 10 000. V některých provedeních jsou reakční činidla • · · podle vynálezu charakterizována jako peptidy, díky přítomnosti peptidové vazby buď v té části reakčního činidla, které se váže na CT receptor, nebo přítomností peptidové vazby v chelátoru radioaktivního kovu. Reakční činidla podle vynálezu mají takovou afinitu vázat se na CT receptor, která není menší než desetina afinity radioaktivním jodem označeného přírodního CT na uvedený receptor, jestliže se srovnávají ve standardizovaných testech, jako jsou testy, které jsou níže popsány v příkladu 4. Ve výhodných provedeních mají reakční činidla podle předloženého vynálezu vazebnou afinitu k CT receptorů stejnou nebo vyšší než přírodní CT nebo radioaktivně označené části přírodního CT na uvedený receptor, jestliže se srovnávají v uvedeném standardizovaném testu.

Radiofarmaceutická činidla podle vynálezu se mohou používat jako místně specifická diagnostická nebo terapeutická činidla. Jestliže jsou označena techneciem-99m, jodem-123 a jodem-131, reakční činidla podle vynálezu se mohou používat jako scintigrafická zobrazovací činidla. Jestliže jsou označena magnetickým, paramagnetickým, supermagnetickým nebo superparamagnetickým kovem, reakční činidla podle vynálezu se mohou používat jako magnetická resonanční kontrastní činidla. Jestliže jsou označena cytotoxickými radionuklidy, reakční činidla podle vynálezu se mohou používat pro místně směrovanou radioterapii. Tento vynález poskytuje také farmaceutické prostředky, které obsahují radioaktivně označené sloučeniny vázající CT receptor podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Podle vynálezu se získávají také způsoby výroby reakčních činidel vázajících CT receptor podle vynálezu a jejich radioaktivně označených provedení.

Tento vynález poskytuje také sestavy pro přípravu radioaktivně označených sloučenin vázajících CT receptor z reakčních činidel podle vynálezu. Sestavy podle vynálezu obsahují zatavenou nádobku, která obsahuje předem stanovené množství reakčního činidla podle vynálezu a popřípadě dostatečné množství redukčního činidla pro radioaktivní označení reakčního činidla.

« · »

Tento vynález poskytuje způsoby použití radioaktivně označených reakčních činidel vázajících CT receptor podle vynálezu pro diagnosu a terapii. V jednom provedení se získávají způsoby pro použití reakčních činidel podle vynálezu v označené formě pro zobrazování míst v těle savce získáním zobrazení iv vivo. Tyto způsoby obsahují stupně podávání účinného diagnostického množství označených reakčních činidel podle vynálezu a detegování značky umístěné v místě těla savce.

Tento vynález poskytuje také způsoby zmírnění onemocnění, která je charakterizováno expresí nebo nadexpresí CT receptorů, vyznačujících se tím, že zahrnují stupeň podávání terapeuticky účinného množství radioaktivně označených reakčních činidel vázajících CT receptor podle vynálezu živočichovi.

Další aspekty a výhody předloženého vynálezu jsou zřejmé z následujícího podrobnějšího popisu výhodných provedení uvedených níže.

Podrobný popis vynálezu: Předložený vynález poskytuje reakční činidla vázající CT receptory, která jsou užitečná pro přípravu farmaceutických činidel vázajících CT receptor pro diagnosu a terapii. Pro účely tohoto vynálezu pojem sloučenina vázající CT receptor je zamýšlena tak, že zahrnuje přirozeně se vyskytující CT, fragmenty CT, analogy CT a deriváty CT, které se specificky vážou na CT receptor exprimovaný rozmanitými typy buněk rozpoznávanými zručnými odborníky z oblasti techniky. Sloučeniny, které jsou navrženy tak, že napodobují vlastnosti CT vázajícího receptor jsou také zahrnuty v této definici a jsou zahrnuty v tomto vynálezu.

Pro účely tohoto vynálezu pojem vazebná afinita CT receptoru je zamýšlen tak, že znamená vazebnou afinitu měřenou jakýmkoliv způsobem známým odborníkovi z oblasti techniky, mezi než patří, mimo jiné, ty způsoby, které měří vazebnou afinitu disociační konstantou, inhibiční konstantou nebo hodnotou IC50.

Pojem který má vazebnou afinitu na receptor CT alespoň jednu desetinu afinity radioaktivní jodem označeného CT na uvedený receptor je myšlen tak, že • · · · • * · · • · · · • · · · · · • « • · · · ♦ · · « · · · · • · · * « · · · · • · · · · • · · · · · · znamená, že disociační konstanta (Kd) reakčního činidla není menší než desetina Kd radioaktivním jodem označeného CT, jestliže se měří přímým navázáním CT receptorů nebo kompetitivním inhibičním testem CT receptorů, nebo že inhibiční konstanta (Kj) nebo IC50 reakčního činidla není desetkrát větší než radioaktivně označeného CT, jestliže se měří kompetitivním inhibičním testem CT receptorů.

Pojem který má vazebnou afinitu na receptor CT stejnou nebo větší než přírodní CT nebo než radioaktivním jodem označené částice CT na uvedený CT receptor je myšlen tak, že zahrnuje taková reakční činidla, která mají disociační konstantu (Kd) stejnou nebo větší než je disociační konstanta neoznačeného CT nebo radioaktivním jodem označeného CT, jestliže se měří přímým navázáním CT receptoru nebo kompetitivním inhibičním testem CT receptorů. Tento pojem lze interpretovat také tak, že zahrnuje reakční činidla, která mají inhibiční konstantu (K) nebo IC50 reakčního činidla stejnou nebo menší než jsou u přírodního CT nebo u radioaktivně označeného CT, jestliže se měří kompetitivním inhibičním testem CT receptorů.

Podle tohoto vynálezu mají reakční činidla podle vynálezu vazebnou afinitu k CT receptorů alespoň desetkrát větší než je afinita radioaktivně označeného přírodního CT na uvedený receptor, jestliže se srovnávají ve standardizováním testu, jak je popsáno níže. Ve výhodných provedeních mají reakční činidla podle vynálezu vazebnou afinitu k CT receptorů stejnou nebo větší než přírodní CT nebo než radioaktivně označené části přírodního CT pro uvedený receptor, jestliže se srovnávají v uvedeném standardizovaném testu.

Disociační konstanty nebo vazebné inhibiční konstanty radioafarmaceutických činidel podle vynálezu vzhledem k CT receptorů, stejně jako srovnání afinity nebo avidity takového navázání s navázáním ¹²⁵l-označeného CT samotného lze stanovovat použitím známých způsobů, jako jsou ty, které jsou uvedeny v Receptors, A Quantitative Approach, A. Levitzki, The Benjamin/Cummings Publishing Company (Kalifornie 1984). S výhodou se standardizované testy navázání CT receptorů, jako • · » · · ·

I · · · ·· · ·· · • · ·» · · · ··♦· jsou testy uvedené níže v příkladu 4, používají pro měření vazebné afinity reakčních činidel podle vynálezu na CT receptor.

Vedle sloučenin vázajících CT receptor, reakční činidla získaná tímto vynálezem obsahují chelátor radioaktivního kovu, který je kovalentně napojen na sloučeninu takovým způsobem, že vazebná specifičnost sloučeniny na CT receptor není v podstatě změněna. Jakýkoliv radioaktivním kovem označený chelátor se může kovalentně navázat na sloučeninu vázající CT receptor, takže se získá reakční činidlo podle vynálezu. Například sloučenina vázající CT receptor, s výhodou peptid, může být kovalentně napojena na chelátor obecného vzorce

C(pgp)^s-(aa)-C(pgp)^s, v němž (pgp)^s znamená atom vodíku nebo chránící skupinu thiolu a (aa) znamená jakoukoliv primární a- nebo β-aminokyselinu neobsahující thiolovou skupinu. Ve výhodném provedení tato aminokyselina znamená glycin.

Jiný příklad - chelátor radioaktivního kovu užitečný v reakčních činidlech podle vynálezu obsahuje skupinu, která obsahuje jediný thiol, obecného vzorce

A-CZ(B)-{C(R^aR^b)}„-X, v němž A znamená atom vodíku, skupinu HOOC, H₂NOC, (peptid)-NHOC, (peptid)-OOC-, R⁶2NCO nebo R^d, B znamená atom vodíku, skupinu SH, -NHR^C, -NÍRyCpeptid) nebo R^d, Z znamená atom vodíku nebo R^d, X znamená skupinu SH, -NHR^C, -N(R^c)-(peptid) nebo R^d, R^a, R^b, R^c a R^d nezávisle znamenají atom vodíku nebo přímý nebo rozvětvený řetězec nebo cyklický nižší alkyl, n znamená číslo 0, 1 nebo 2, R^c znamená alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, aminokyselinu nebo peptid obsahující 2 až 10 aminokyselin a 1) jestliže B znamená skupinu -NHR^C nebo -NÍR^-Ípeptid), X znamená skupinu SH a n znamená číslo 1 nebo 2, 2) jestliže X znamená skupinu -NHR^C nebo -N(R^c)-(peptid), B znamená skupinu SH a n znamená • · ·*· · « · · · · * · · · · · • 9 9 9 9 • · 999 999

9 9

9 9 9 9 9 číslo 1 nebo 2, 3) jestliže B znamená atom vodíku nebo R^d, A znamená skupinu HOOC, H2NOC, (peptid)-NHOC nebo (peptid)-OOC, X znamená skupinu SH a n znamená číslo 0 nebo 1, 4) jestliže A znamená atom vodíku nebo R^d, potom jestliže B znamená skupinu SH, X znamená skupinu -NHR^C nebo -N(R°)-(peptid), a jestliže X znamená skupinu SH, B znamená skupinu -NHR^C nebo -N(R^c)-(peptid) a n znamená číslo 1 nebo 2, 5) jestliže X znamená atom vodíku nebo R^d, A znamená skupinu HOOC, H2NOC, (peptid)-NHOC nebo (peptid)-OOC a B znamená skupinu SH, 6) jestliže Z znamená methyl, X znamená methyl, A znamená skupinu HOOC, H₂NOC, (peptid)-NHOC nebo (peptid)-OOC, B znamená skupinu SH a n znamená číslo 0 a 7) jestliže B znamená skupinu SH, X neznamená skupinu SH, a jestliže X znamená SH a B neznamená skupinu SH.

Výhodným provedením tohoto chelátoru radioaktivního kovu je sloučenina obecného chemického vzorce

R¹-CO-(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-Z, při čemž každá (aminokyselina)¹ a (aminokyselina)² nezávisle znamená jakoukoliv primární a- nebo β-aminokyselinu, která neobsahuje thiolovou skupinu, Z znamená skupinu obsahující thiol, která znamená cystein, homocystein, isocystein, penicilamin, 2-merkaptoethylamin nebo 3-merkaptoethylamin, a R¹ znamená nižší alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, aminokyselinu nebo peptid obsahující 2 až 10 aminokyselin. Jestliže Z znamená cystein, homocystein, isocystein nebo penicilamin, karbonylová skupina uvedené části je kovalentně navázána na hydroxylovou skupinu, skupinu NR³R⁴, kde R³ a R⁴ nezávisle znamenají atom vodíku nebo nižší alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, aminokyselinu nebo petid obsahující 2 až 10 aminokyselin, nebo

Y-(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-NHR², kde Y znamená skupinu obsahující thiol, která znamená cystein, homocystein, isocystein, penicilamin, 2-merkaptoacetát nebo 3-merkaptopropionát, každá (aminokyse«···*· « 9 99 9 9

9 9 9 · 9 9 · « · · ··« · · 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 99 9 9 99 • 999 9 9 9 9

99 99 9 ·9· 99 99 lina)¹ a (aminokyselina)² nezávisle znamená jakoukoliv primární a- nebo β-aminokyselinu, která neobsahuje thiolovou skupinu, a R² znamená atom vodíku nebo nižší alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, aminokyselinu nebo peptid obsahující 2 až 10 aminokyselin. Jestliže Y znamená cystein, homocystein, isocystein nebo penicilamin, aminová skupina uvedené části je kovalentně navázána na atom vodíku, aminokyselinu nebo peptid obsahující 2 až 10 aminokyselin.

V příslušných provedeních tohoto aspektu vynálezu je vzorec tohoto chelátoru radioaktivních kovů vybrán ze skupiny, která sestává ze sloučenin následujících obecných vzorců

-(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}n-X},

-{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}n-X}-(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²,

-(primární αω- nebo B,a>-diaminokyselina)-(aminokyselina)¹-{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}_n-X}-a

-{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}n-X}-(aminokyselina)¹-(primámí α,β- nebo α,γ-diaminokyselina), při čemž každá (aminokyselina)¹ a (aminokyselina)² nezávisle znamená jakoukoliv v přírodě se vyskytující, modifikovanou, substituovanou nebo pozměněnou a- nebo β-aminokyselinu, která neobsahuje thiolovou skupinu, A znamená atom vodíku, skupinu HOOC, H2NOC, (aminokyselina nebo peptid)-NHOC, (aminokyselina nebo peptid)-OOC- nebo R⁴, B znamená atom vodíku, skupinu SH, -NHR³, -N(R³)-(aminokyselina nebo peptid) nebo R⁴, Z znamená atom vodíku nebo R⁴, X znamená skupinu SH, -NHR³, -NtR^-íaminokyselina nebo peptid) nebo R⁴, R¹, R², R³ a R⁴ nezávisle znamenají atom vodíku nebo přímý nebo rozvětvený řetězec nebo cyklický nižší alkyl, n znamená číslo 0, 1 nebo 2, (peptid) znamená peptid ze 2 až 10 aminokyselin, a 1) jestliže B znamená skupinu -NHR³ nebo -NÍRVíaminokyselina nebo peptid), X znamená skupinu SH a n znamená číslo 1 nebo 2, 2) jestliže X znamená skupinu -NHR³ nebo -NÍR^-íaminokyselina nebo peptid), B znamená skupinu SH a n znamená číslo 1 nebo 2, 3) jestliže B znamená atom vodíku nebo R⁴, A znamená skupinu HOOC, H2NOC, (aminokyselina nebo peptid)-NHOC nebo

9 999 • 9 (aminokyselina nebo peptid)-OOC, X znamená skupinu SH a n znamená číslo 0 nebo 1,4) jestliže A znamená atom vodíku nebo R⁴, potom jestliže B znamená skupinu SH, X znamená skupinu -NHR³ nebo -N(R³)-(aminokyselina nebo peptid), a jestliže X znamená skupinu SH, B znamená skupinu -NHR³ nebo -NíR^Xaminokyselina nebo peptid) a n znamená číslo 1 nebo 2, 5) jestliže X znamená atom vodíku nebo R⁴, A znamená skupinu HOOC, H₂NOC, (aminokyselina nebo peptid)-NHOC nebo (aminokyselina nebo peptid)-OOC a B znamená skupinu SH, 6) jestliže Z znamená methyl, X znamená methyl, A znamená skupinu HOOC, H₂NOC, (aminokyselina nebo peptid)-NHOC nebo (aminokyselina nebo peptid)-OOC, B znamená skupinu SH a n znamená číslo 0, a 7) jestliže B znamená skupinu SH, X neznamená skupinu SH a jestliže X znamená SH a B neznamená skupinu SH.

Mezi specifická výhodná provedení tohoto aspektu vynálezu patří chelátory raioaktivního kovu vybrané ze skupiny sestávající ze sloučenin následujících vzorců -Gly-Gly-Cys-, Cys-Gly-Gly-, -Gly-Gly-Cys-, -(s-Lys)-Gly-Cys-, (6-Om)-Gly-Cys-, -(Y-Dab)-Gly-Cys-, -(B-Dap)-Lys-Cys- a -(B-Dap)-Gly-Cys- (V těchto vzorcích je tomu třeba rozumět tak, že ε-Lys znamená lysinový zbytek, ve kterém ε-aminová skupina, spíše než typická α-aminová skupina, je kovalentně navázána na karboxylovou skupinu přilehlé aminokyseliny za vzniku peptidové vazby; δ-Om znamená omithinový zbytek, v němž δ-aminová skupina, spíše než typická α-aminová skupina, je kovalentně navázána na karboxylovou skupinu přilehlé aminokyseliny za vzniku peptidové vazby; γ-Dab znamená zbytek 2,4-diaminomáselné kyseliny, v níž je γ-amino skupina kovalentně navázána na karboxylovou skupinu přilehlé aminokyseliny za vzniku peptidové vazby; β-Dap znamená zbytek 1,3-diaminopropionové kyseliny, v níž je β-aminová skupina kovalentně navázána na karboxylovou skupinu přilehlé aminokyseliny za vzniku peptidové vazby.).

V jiném provedení chelátor raidoaktivního kovu reakčního činidla podle vynálezu znamená bisamino-bisthiolový chelátor obecného vzorce

NH

I (CRÁ

S-(pgp)^s

9999

99

I 9 9 9 > 9 9 9

99· 999

9

9 9 9 (cr₂:

N-A-CO-peptid

I (CRÁ

S-(pgp)⁵ v němž každá R nezávisle znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl, každé (pgp)^s nezávisle znamená chránící skupinu thiolu nebo atom vodíku, m, n a p nezávisle znamenají číslo 2 nebo 3, A znamená lineární nebo cyklický nižší alkyl, aryl, heterocyklyl, jejich kombinaci nebo jejich substituované deriváty a X znamená peptid. Bisaminobisthiolový chelátor v tomto provedení podle vynálezu znamená také sloučeniny obecného vzorce

v němž každé R nezávisle znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl, m, n, a p nezávisle znamenají číslo 2 nebo 3, A znamená lineární nebo cyklický nižší alkyl, aryl, heterocyklyl, jejich kombinace nebo jejich substituované deriváty, V znamená atom vodíku nebo skupinu CO-peptid, R' znamená atom vodíku nebo peptid, a v němž jestliže V znamená atom vodíku, R¹ znamená peptid, a jestliže R' znamená atom vodíku, V znamená skupinu CO-peptid. Pro účely tohoto vynálezu chelatační částice, které mají tyto struktury, budou oznažovány jako částice BAT.

φφ ΦΦΦΦ • Φ φ · · φφ ΦΦΦΦ φφφ φ φ φφφφ φ φ φφ φ φ φ φφφφφφ • ΦΦΦ φφ φφ •Φ φφ φφφ φφφ φφ φφ

Chelátor radioaktivního kovu používaný v reakčním činidle podle vynálezu může být vybrán ze skupiny sestávající z diethylentriaminpentaoctové kyseliny (DTPA) obecného vzorce (HOOCCH₂)2N(CR2)(CR2)N(CH2COOH)(CR₂)(CR₂)N(CH2COOH), v němž každé R nezávisle znamená atom vodíku, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo aryl a jeden R je kovalentně navázán na dvojmocný linker, ethylediamintetraoctové kyseliny (EDTA) obencého vzorce (HOOCCH₂)2N(CR2)(CR2)N(CH₂COOH), v němž R nezávisle znamená atom vodíku, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo aryl a jeden R je kovalentně navázán na dvojmocný linker,

1,4,7,10-tetraazododekantetraoctové kyseliny, sloučeniny obecného vzorce

(CRA

v němž n znamená číslo 2 nebo 3 a každé R nezávisle znamená atom vodíku, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo aryl a jeden R je kovalentně navázán na sloučeninu, která váže receptor kalcitoninu, a desferrioxaminu.

Většina radioaktivních kovů může být chelatována s reakčními činidly podle vynálezu, které zahrnují shora uvedené chelátory radioaktivních kovů.

• · ·*·· • · · • · · • · · * · ♦ · ·· ·· • · · · · · • · · · · • · ··· ··· • · ·

9 9· 99

Reakční činidla podle vynálezu mohou obsahovat také chelátor radioaktivního kovu vybraný ze skupiny sestávající ze

i) skupiny obecného vzorce I

(l)a ii) skupiny obecného vzorce II

v nichž n, m a p znamenají nezávisle číslo 0 nebo 1, každé R' nezávisle znamená atom vodíku, nižší alkyl, hydroxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) nebo alkoxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) a každé R nezávisle znamená atom vodíku nebo R, kde R znamená substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl, který neobsahuje thiolovou skupinu, a jedna ze skupin R nebo R' znamená L, kde L znamená vázací skupinu dvojvazného linkeru napojenou na chelátor kovu na cílové částici, pň čemž jestliže jedna skupina R' znamená L, NR₂ znamená amin.

Ve výhodných provedeních L znamená lineární nebo větvený řetězec s 1 až 6 atomy uhlíku nebo cyklickou alkylovou skupinu, karboxylový ester, karboxamid, sulfonamid, ether, thioether, amin, alken, alkin, 1,2-, 1,3- nebo 1,4-napojený, popřípadě • 4 4444

4* 44 • · 4 4 4 · 4 4444 • 4 4 4 4 4 4 4 4

44 4 44444444 • 444 44 44 • 4 44 444 4 44 44 44 substituovaný benzenový kruh, aminokyselinu, peptid se 2 až 10 aminokyselinami nebo jejich kombinace.

Ve výhodných provedeních R znamená lineární, větvenou nebo cyklickou alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, skupinu -C_qOC_r-, -C_qNHC_r- nebo skupinu -C_qSCr, kde q a r znamenají nezávisle čísla 1 až 5, při čemž součet q+r není větší než 6, alkyl(s 1 až 6 atomy uhlíku)-X, kde X znamená hydroxylovou skupinu, substituovanmý amin, quanidin, amidin, substituovanou thiolovou skupinu, karboxylovou kyselinu, esterovou, fosfátovou nebo sulfátovou skupinu, fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu substituovanou atomem halogenu, hydroxylem, substituovaným aminem, guanidinem, amidiniem, substituovaným thiolem, etherem, fosfátem nebo sulfátem, indolovou skupinu, heterocyklickou skupinu se 1 až 6 atomy uhlíku obsahující 1 až 3 atomy dusíku, kyslíku nebo síry nebo jejich kombinace.

Podle tohoto vynálezu může mít chelátor radioaktivního kovu reakčního činidla vázajícího CT receptor obecný vzorec III

R⁶ .o ^RSM

Os^NH Hf ⁴~X. , 2 _R3 NR'R² HS

O

L-Z (lil) , v němž R¹ a R² nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, hydroxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) nebo alkoxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku), R³, R⁴, R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl, který neobsahuje thiolovou skupinu, R⁷ a R⁸ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, nižší hydroxyalkyl nebo nižší alkoxyalkyl, L znamená dvojvaznou skupinu kinekru a Z znamená CT peptid.

v « ·«· · • · · ♦ • 9 9 9 • 99 9 999

9

Mezi další výhodné chelátory kovu podle tohoto vynálezu patří chelátory obecného vzorce IV , 7 ° o

θγΝΗ HfA

R⁴“Zx, . 2 _R3 NR'_ÍsJ__r; (IV) v němž R¹ a R² nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, hydroxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) nebo alkoxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku), R³, R⁴, R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl, který neobsahuje thiolovou skupinu, a jedna ze skupinu R³, R⁴, R⁵ a R⁶ znamená skupinu Z-L-HN(CH₂)_n-, kde L znamená skupinu dvojvazného linkeru, Z znamená cílící částici, n znamená číslo od 1 do 6, R⁷ a R⁸ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, nižší hydroxyalkyl nebo nižší alkoxyalkyl a X znamená aminovou skupinu, substituovanou aminovou skupinu nebo -NR¹-Y, kde Y znamená aminokyselinu, amid aminokyseliny nebo peptid se 2 až 10 aminokyselinami.

Mezi výhodnější chelátory kovů podle vynálezu patří chelátory obecného vzorce V

(V) ·· 99

9 · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 9 9

99 999 999 99 99 • · ·*·♦ v němž R¹ a R² nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, nižší hydroxyalkyl nebo nižší alkenylalkyl, R³ a R⁴ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl, který neobsahuje thiolovou skupinu, n znamená číslo od 1 do 6, L znamená skupinu dvojvazného linkeru a Z znamená CT peptidovou částici.

Mezi další výhodnější chelatační částice patří chelátory obecného vzorce VI z-l.

r~^ ⁰

O^/NH HN<A

NH,

NH,

HS' (VI), v němž L znamená skupinu dvojvazného linkeru a Z znamená CT peptidovou částici.

Mezi nejvýhodnější chelatační částice podle vynálezu patří chelátory následujících obecných vzorců (aminokyselina)¹ -(aminokyselina)²-cystein,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-isocystein,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-homocystein,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-penicilamin,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-2-merkaptoethylamin,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-2-merkaptopropylamin,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-2-merkpato-2-methylpropylamin-a (aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-3-merkaptopropylamin-, v nichž (aminokyselina) v primární a- nenbo β-aminokyselině neobsahuje thiolovou skupinu a v nichž chelátor je napojen buď na cílovou částici nebo linkerovou skupinu kovalentní vazbou s karboxylovým koncem chelátoru nebo postranním řetězcem na jedné ze skupin aminokyselin.

• · »· · β φ· · b · · » · · · ·· ··

Mezi nejvýhodnější chelátory patří také chelátory shora uvedeného vzorce, v němž (aminokyselina)¹ znamená buď α,ω- nebo β,ω-aminokyselinu, v nichž a- nebo β-aminová skupina znamená volný amin a α,ω- nebo β,ω-aminokyselina je kovalentně napojena ω-aminovou skupinou.

Mezi další nejvýhodnější chelátory patří ty, které jsou vybrány ze skupiny sestávající ze sloučenin následujících obecných vzorců

-cystein-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina),

-isocystein-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina),

-homocystein-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina),

-penicilamin-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina),

2-merkaptooctová kyselina-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina),

2- nebo 3-merkaptopropionová kyselina-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina) a

2-merkapto-2-methylpropionová kyselina-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina), v nichž (aminokyselina) v primární a- nebo β-aminokyselině neobsahuje thiolovou skupinu a v nichž chelátor je napojen buď na cílovou částici nebo linkerovou skupinu kovalentní vazbou s aminovým koncem chelátoru nebo postranním řetězcem na jedné ze skupin aminokyselin.

Zvláště výhodné chelátory kovů jsou vybrány ze skupiny sestávající ze sloučenin následujících vzorců: -Gly-Gly-Cys-, -Arg-Gly-Cys-, -(e-Lys)-Gly-Cys-(ó-Om)-Gly-Cys-, -(y-Dab)-Gly-Cys-, -(B-Dap)-Lys-Cys- a -(B-Dap)-Gly-Cys(Označování aminokyselin v těchto vzorcích je stejné jak shora uvedeno.).

Příkladem chelátoru radioaktivního kovu shora uvedeného obecného vzorce III je Gly-Gly-Cys-, v němž chelatační částice má strukturu VII ·· »·*· ·· 99

9 9 99 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9

99 999 999 99 99

sloučenina vázající receptor kalcitoninu (VII).

Chelatační ligandy struktury VII tvoří oxotechneciové komplexy struktury Vlil

sloučenina vázající receptor kalcitoninu (Vlil).

Příkladem chelátorů radioaktivního kovu shora uvedeného obecného vzorce V je Lys-((a-peptid)-Gly-Cys.amid, který tvoří chelátor vzorce IX

Chelatační ligandy vzorce IX tvoří oxotechneciové komplexy vzorce X

99 «9

999 • 9 9 • 9 *··· • · · • · 9 • · · · • *9 · • 9 99 • 9 9 «

9 9 9

999 99« • 9

99

Příkladem reakčního činidla podle vynálezu obsahujícího chelátor radioaktivního kovu shora uvedeného obecného vzorce II je (cílová částice)-Cys-Gly-a,B-diaminopropionamid, který tvoří chelátor vzorce XI sloučenina vázající receptor kalcitoninu-HN—( o

SH H₂N (XI).

Radiodiagnostická činidla vzorce XI tvoří oxotechneciové komplexy vzorce XII sloučenina vázající receptor kalcitoninu-HN

nh₂ (XH).

V chelátorech radioaktivních kovů a reakčních činidlech vázajících CT receptor získaných podle vynálezu, která obsahují thiol kovalentně navázaný na chránící skupinu thiolu {(pgp)⁸}, může být chránící skupina thiolu stejná nebo různá a může znamenat, ale bez omezení na ně, následující skupiny:

• φ φφφφ » · · · > · · · φφφ φφ·

-CH₂-aryl (aryl znamená fenyl nebo alkylem či alkoxylem substituovaný fenyl), -CH-(aryl)₂ (aryl znamená fenyl nebo alkylem či alkoxylem substituovaný fenyl),

-C-(aryl)₃ (aryl znamená fenyl nebo alkylem či alkoxylem substituovaný fenyl), -CH₂-(4-methoxyfenyl),

-CH-(4-pyridyl)(fenyl)₂,

-C(CH₃)₃,

-9-fenylfluorenyl,

-CH₂NHCOR (R znamená nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl nebo aryl),

-CH₂-NHCOOR (R znamená nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl nebo aryl),

-CONHR (R znamená nesubstituovaný nebo substituovaný alkyl nebo aryl) nebo

-CH₂-S-CH₂-fenyl.

Výhodné chránící skupiny mají obecný vzorec -CH₂-NHCOR, v němž R znamená nižší alkyl s 1 až 8 atomy uhlíku, fenyl nebo fenyl substituovaný nižším alkylem, hydroxylem, nižší alkoxyskupinou, karboxyskupinou nebo nižší alkoxykarbonylovou skupinou. Nejvýhodnější chránící skupinou je acetamidomethylová skupina.

Jestliže reakční čindilo podle vynálezu obsahuje sloučeninu vázající CT receptor, kterou je peptid, tento peptid s výhodou obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 10

CH?CO.SNLSTX- (sekv. id. č. 10), v níž X je vybrán ze skupiny sestávající z cysteinového zbytku, homocysteinového zbytku a homohomocysteinového zbytku. Peptid může obsahovat také aminokyselinovou sekvenci id. č. 11 • · · · · · • ·

CH?C0.1NLSTX²- (sekv. id. č. 11), v níž X¹ je vybrána ze skupiny sestávající z alaninového zbytku, glycinového zbytku a serinového zbytku a X² je vybrána ze skupiny sestávající z cysteinového zbytku, homocysteinového zbytku a homohomocysteinového zbytku. Mezi tyto peptidy patří přirozeně se vyskytující lidský CT a analogy CT peptidu, jako jsou ty, které jsou specificky uvedeny v dále uvedených sekvencích aminokyselin:

CH?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 5),

CH?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 6),

CHpCO.SNLST.Cvs.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 7) a

SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 8).

Mezi zvláště výhodná provedení reakčních činidel podle vynálezu patří:

CHpCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCíBAOELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 4),

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTPfe-K)GC.amid.

CH?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH?CQ.GGCK.amid))ELHKLQTYPRTNTGSGTP.

.amid,

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH_?CO.fB-Dap)KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGS·

GTP.amid,

CH?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CHpCO.fe-K)GCE.amidúELHKLQTYPRTNTGSGTP.a mid,

CHpCO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CHpCO.GGCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid,

CH?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CHpCO.(B-Dap)KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGS.

• · · · · ·

.GTP.amid,

CH_?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.fs-K)GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.

.amid,

CH_?CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH,CO.GGCKamid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid

CH_?CQ.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH,CO.(B-DaD)KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGS.

.GTP.amid,

CH₂CO₁SNLSLCys₁VLGKLSC(CH₂CO.(8-K)GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.

.amid,

SNLSIAsu_iVLGKLSC(CH₂CO.(B-Dap)KCK.amid))ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amida

SNLST₁Acu.VLGKLSC(CH₂CO.(B-Dap)KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.

Všechny přirozeně se vyskytující aminokyseliny jsou zkracovány použitím standardních zkratek (které lze nalézt v G. Zubay: Biochemistry, druhé vydání, MacMillen Publishing, New York 1988, str. 33). Pro účely tohoto vynálezu jsou přirozeně se vyskytující aminokyseliny charakterizovány jako lipofilní (alanin, isoleucin, leucin, methionin, fenylalanin, tyrosin, prolin, tryptofan a valin a také S-alkylované deriváty cysteinu), hydrofilní (asparagin, glutamin, threonin, serin), kyselé (kyselina glutamová a kyselina aspartová), bazické (arginin, histidin a lysin), ε-Κ, δ-Om, γ-Dab a β-Dab mají shora uvedené významy. (BAT) znamená N⁶,N⁹-bis(2-merkapto-2-methyl-propyl)-6,9-diazanonanovou kyselinu, K.(BAT) a Lys.(BAT) znamenají aminokyselinu lysin acylovanou na ε-aminové skupině postranního řetězce aminokyseliny k (BAT), C(BAT) a Cys(BAT) znamenají S-(N⁶,N⁹-bis(2-merkapto-2-methylpropyl)-6,9-diazanonan-1-yl)cystein, (BAM) znamená (N¹,N⁴-bis(2-merkapto-2-methylpropyl)-1,4,10-triazadekan, (BAT-BM) znamená N-{2-(N',N'-bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl]-N⁹-(terc. butoxykarbonyl)-(N⁶,N⁹-bis(2-methyl-2-trifenyl-methylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid, (BAT-BS) znamená N-{2-(N⁶, N⁹-bis(2-sukcinimidoethyl)aminoethyl]-N',N'-bis(2-merkapto-2-methylpropyl)-6,9-diazanonanamid, (BMH) znamená bis-maleimidohexan, (BSH) znamená bis-sukcinimidohexan, (BMME) znamená bis-maleimidomethylether, (BSEE) znamená bis-sukcinimidoethylether, (BMEE) znamená bis-maleimidoethylether a (BSME) znamená bis-sukcinimidomethylether. Jak se používají zde, následující aminokyseliny a analogy aminokyselin jsou uváděny následujícími zkratkami:

• · • « · · ·· · ···

Acm znamená merkaptanovou chránící skupinu acetamidomethyl, Pen znamená penicilamin, Aca znamená 6-aminokapronovou kyselinu, Hly znamená homolysin, Apc znamená L-S-(3-aminopropyl)cystein, F_D znamená D-fenylalanin, W_D znamená D-tryptofan, Y_D znamená D-tyrosin, Cpa znamená L-(4-chlorfenyl)alanin, Thp znamená 4-amino-tetrahydrothiopyran-4-karboxylovou kyselinu, D-Nal znamená D-2-naftylalanin, Dpg znamená dipropylglycin, Nle znamená norleucin, Hcy znamená homocystein, Hhc znamená homohomocystein, Aib znamená aminoisomáslednou kyselinu, Nal znamená 2-naftylalanin, D-Nal znamená D-2-naftylalanin, Ain znamená 2-aminoindan-2-karboxylovou kyselinu, Achxa znamená 4-amino-cyklohexylalanin, Amf znamená 4-aminomethyl-fenylalanin, Aec znamená S-(2-aminoethyl)cystein, Apc znamená S-(3-aminopropyl)cystein, Aes znamená O-(2-aminoethyl)serin, Aps znamená O-(3-aminopropyl)serin, Abu znamená 2-aminomáselnou kyselinu, Nva znamená norvalin a Asu znamená 2-aminokorkovou kyselinua, pň čemž aminová koncová skupina aminokyselin peptidů obsahujících zbytek Asu je cyklizována amidovou vazbou mezi aminovou koncovou aminoskupinou a karboxylovou skupinou postranního řetězce zbytku Asu.

Podle tohoto vynálezu peptidy vázající CT receptor mohou obsahovat jeden nebo více aminokyselinových derivátů, které mají chelátor radioaktivního kovu navázán na aminokyselinový postranní řetězec. Chelátor radioaktivního kovu se s výhodou inkorporuje do peptidu na karboxylovém konci peptidu vázajícího CT receptor. Výhodněji se chelátor radioaktivního kovu inkorporuje do syntetického peptidu vázajícího CT receptor na atom síry postranního řetězce cysteinu, což odpovídá poloze 14 přírodního peptidu. Nejvýhodněji se chelátor radioaktivního kovu inkorporuje do postranního řetězce aminokyseliny peptidu vázajícího CT receptor o sekvenci id. č. 9

CH2CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 9).

• ·

Nejvýhodněji se chelátor radioaktivního kovu inkorporuje do peptidu vázající CT receptor na atom síry postranního řetězce cysteinu v poloze 13 peptidu sekv. id. č. 9 (rozlišeného zesílením v sekv. id. č. 9).

Další provedení reakčních činidel podle vynálezu obsahuje alespoň dvě syntetické sloučeniny vázající CT receptor, každá sloučenina je kovalentně navázána na chelátor radioaktivního kovu, a polyvalentní linker tvořící kovalentní vazby, která je vybrána ze skupiny sestávající z vazby na každou sloučeninu, vazby na každý chelátor a vazby na jednu sloučeninu a chelaátor jiné sloučeniny. Podle tohoto vynálezu se mohou vyskytovat také další permutace tohoto provedení. Polyvalentní linkery vhodné pro použití v tomto provedení vynálezu obsahují alespoň dvě identické funkční skupiny, které jsou schopny kovalentního navázání na CT analogy, sloučeniny vázající CT receptor, CT peptidy nebo chelátory radioaktivního kovu, nebo jsou schopny navázání jak na sloučeniny vázající CT receptor tak chelátory radioaktivního kovu. Mezi výhodné funkční skupiny patří, bez omezení, primární aminy, sekundární aminy, hydroxylové skupiny, skupiny karboxylové kyseliny nebo thiolové reaktivní skupiny. Ve výhodných provedeních polyvalentní linkery obsahují bis-sukcinimidylmethylether (BSME), bis-sukcinimidylethylether (BSEE), 4-(2,2-dimethylacetyl)benzoovou kyselinu (DMBA), N-{2-(N',N'-bis(2-sukcinimido-ethyl)aminoethyl)}-(N⁶,N⁹-bis(2-methyl-2-merkaptopropyl)-6,9-diazonanamid (BAT-BS), tris(sukcinimidylethyl)amin (TSEA), bissukcinimidohexan (BSH), 4-(O-CH₂CO-Gly-Gly-Cys. ,amid)-2-methylpropiofenon (ETAC), tris(acetamidoethyl)amin, bis-acetamidomethyl-ether, bis-acetamidoethyl-ether, α,ε-bis-acetyllysin, lysin a 1,8-bis-acetamido-3,6-dioxa-oktan nebo jejich deriváty.

Sloučeniny vázající CT receptor získané podle předloženého vynálezu se mohou chemicky syntetizovat in vitro použitím jakéhokoliv vhodného způsobu syntézy. S výhodou se CT peptidy mohou syntetizovat podle vynálezu rekombinantními způsoby. Výhodněji se CT peptidy, deriváty CT peptidu a analogy CT peptidu mohou obecně s výhodou připravovat podle předloženého vynálezu použitím syntetizátoru peptidů. CT peptidy podle tohoto vynálezu se s výhodou syntetizují kovalentním • · · • · · 9 • · 9 9 • · · ·9 napojením chelátoru radioaktivního kovu na peptid během chemické syntézy in vitro použitím způsobů dobře známých odborníkům z oblasti techniky jako syntéza peptidů v pevné fázi. Tímto způsobem se mohou do peptidu inkorporovat chelátory radioaktivních kovů místně-selektivním způsobem ve skutečně jakékoliv poloze peptidu, čímž se vyhneme snížení afinity a specifičnosti peptidu na CT receptor.

Podle tohoto vynálezu se peptidy vázající CT receptor připravují tak, že mají aminokyselinu s chráněným thiolem, typicky cysteinový zbytek, zahrnutu do peptidu. Následujícím odštěpením peptidu ze syntetické pryskyřice a cyklizaci zbytků na aminovém konci se odstraní chránící skupina thiolové skupiny a získá se prosthetická skupina obsahující chelátor radioaktivního kovu a thiolová reaktivní skupina.

Jak bylo shora uvedeno, reakční činidla vázající CT receptor podle vynálezu mohou být radioaktivně označena, takže poskytují radiodiagnostická nebo radioterapeutická činidla. Příkladem radiodiagnostické aplikace používající radioaktivně označená reakční činidla podle vynálezu je scintigrafické zobrazení, při kterém lze stanovit umístění a rozsah nádorů nesoucích CT receptor. Pojem scintigrafické zobrazovací činidlo, jak se zde používá, zahrnuje radioaktivně označené reakční činidlo, které má možnost být detegováno prostředky detegujícími radioaktivitu (včetně, ale bez omezení na ně, γ-kamery nebo scintilační detektorové sondy). U radioterapeutických provedení podle vynálezu jsou reakční činidla vázající CT receptor označena cytotoxickými radionuklidy a jsou užitečná při léčení onemocnění nebo dalších nemocí živočichů, s výhodou lidí, jako jsou onemocnění nebo nemoci, které se vyznačují expresí nebo nadexpresí CT receptorů. Mezi onemocnění nebo nemoci související s CT patří, ale bez omezení na ně, rakovina prsu, rakovina vaječníků, rakovina plic, lymfom a další onemocnění, vyznačující se růstem maligních nebo benigních nádorů vázajících sloučeniny vázající CT receptor. Tyto nádory obsahují CT nebo jeho deriváty nebo analoga expresí CT receptorů na povrchu buněk.

• <9 · · · · 4 ·

9 9 · 9 9 • ·

Jakýkoliv radioaktivní kov může tvořit komplex s reakčními činidly podle vynálezu za vzniku radiodiagnostického nebo radioterapeutického činidla. Reakční činidla podle vynálezu mohou být například radioaktivně označena techneciem-99m, jodem-125 nebo jodem-123, takže se získá scintigrafické zobrazující činidlo. Tento vynález poskytuje také reakční činidla vázající CT receptor, která jsou schopna tvořit komplex s magnetickým, paramagnetickým, supermagnetickým nebo superparamagnetickým atomem, iontem nebo částicí kovu. Reakční činidla vázající CT receptor podle vynálezu mohou být s výhodou také radioaktivně označena cytotoxickým radioisotopem vybraným ze skupiny sestávající ze skandia-47, mědi-67, galia-72, ytria-90, cínu-117m, jodu-125, jodu-131, samaria-153, gadolinia-159m, dysprosia-165, holmia-166, yterbia-175, lutecia-177, rhenia-186, rhenia-188, astatu-211, vismutu-212 a vismutu-213, takže se získá radioterapeutické činidlo.

Jestliže se reakční činidla podle vynálezu používají pro vznik komplexu radioaktivního technecia nebo rhenia, komplex s techneciem, s výhodou technistan s techneciem-99m nebo sůl rhenia ve formě rhenistanu, se nechá zreagovat s reakčním činidlem v přítomnosti redukčního činidla. Výhodným redukčním činidlem je dithioničitan, cínaté nebo železnaté ionty, nejvýhodnějším redukčním čindilem je chlorid cínatý. Komplex může být také vytvořen reakcí reakčního činidla podle tohoto vynálezu s předem vytvořeným labilním komplexem technecia nebo rhenia a další sloučeniny, známé jako přenašeč ligandu. Tento způsob je znám jako výměna ligandu a je dobře znám odborníkům z oblasti techniky. Labilní komplex se může vytvořit použitím takových přenašečů ligandů, jako je například vínan, citran, glukonát nebo mannitol. Mezi technistan technecia-99m a soli rhenia užitečné podle předloženého vynálezu patří soli s alkalickými kovy, jako je sodná sůl, amonné soli nebo nižší alkylamoniové soli.

Tento vynález zahrnuje také sestavu pro výrobu reakčních činidel označených radioaktivním kovem pro použití jako radiofarmaceutické sloučeniny. Sestava podle vynálezu obsahuje zatavenou nádobku obsahující předem stanovené množství činidla vázajícího CT receptor a popřípadě, jestliže radioaktivním kovem je těch• · · · · · · • · · · · • · · · • · · · · · · ······ • · · · · · · · ·· ·· ··· ··· ·· ·· necium-99m, rhenium-186 nebo rheniiim-188, redukční činidlo. Například se příslušné množství reakčního činidla podle vynálezu zavede do nádobky obsahující redukční činidlo, jako je chlorid cínatý, v množství, které je dostatečné pro označení reakčního činidla techneciem-99m, rheniem-186 nebo rheniem-188. Do sestavy se může zahrnout také příslušné množství přenašeče ligandů, jak byly shora popsány (jako je například vínan, citran, glukonát, glukoheptanát nebo mannitol). Sestava může také obsahovat konvenční farmaceutické pomocné materiály, jako jsou například farmaceuticky přijatelné soli pro úpravu osmotického tlaku, pufry, ochranná činidla a podobné. Tyto složky mohou být v kapalné, zmrazené nebo suché formě. Ve výhodném provedení se složky sestavy připravují v lyofilizované formě. Radioafarmaceutické prostředky označené techneciem-99m, rheniem-186 a rheniem-188 podle předloženého vynálezu se mohou pňpravovat přidáním příslušného množství technecia-99m, rhenia-186 nebo rhenia-188 nebo komplexů těchto radionuklidů do baněk a reakcí za podmínek popsaných níže v příkladech.

Sestava podle vynálezu se může připravovat také ve formě vhodné pro diagnostické zobrazení nebo jako terapeutické činidlo používající radioisotop jodu, zahrnující jod-123 a jod-131, s výhodou jod-123. V tomto provedení sestava obsahuje zatavenou nádobku obsahující předem stanovené množství reakčního činidla vázajícího CT receptor, které je schopno být radioaktivně označeno isotopem jodu.

Mezi reakční činidla vázající CT receptor vhodná pro použití v tomto provedení patří CT samotný, derivát CT, analog CT, mimetika CT a peptidomimetika CT, která se specificky vážou na CT receptor. Jestliže se v tomto provedení používají peptidová a peptidomimetická reakční činidla vázající CT receptor, tyrosinový zbytek v tomto reakčním činidle může být radioaktivně označen. Tento tyrosinový zbytek se může vyskytovat přirozeně v peptidu nebo v peptidomimetiku nebo se tyrosinový zbytek může přidat do peptidu nebo peptidomimetika v té poloze, která neporušuje navázání reakčního činidla na CT receptory. Dávka, místa a cesty podávání, příprava prostředků a podávaná specifická radioaktivita použitím sestavy podle tohoto provedení jsou zde popsány pro techneciem a rheniem označená reakční činidla pro scintigrafická a terapeutická použití.

•φ φφφφ • · φφ φφ φφ φφ φ φφ φ • · φφφφ • φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φφφ φφφ φφ ··

Zobrazovací činidla získaná podle vynálezu se používají pro zobrazování nádorů, zvláště pro zobrazování primárních a metastatických neoplastických míst vyznačujících se neoplastickými buňkami, které exprimují nebo nadexprimují CT receptory, a zvláště takové primární a zvláště metastatické buňky odvozené od nádoru prsu, plic a vaječníků, které byly klinicky nezvládnutelné detekcí použitím konvenčních způsobů. Zobrazovací činidla získaná podle předloženého vynálezu se mohou používat také pro zviditelnění takových orgánů, jako jsou ledviny nebo kosti pro diagnostikování poruch v těchto orgánech.

Pro diagnostické účely se podává efektivní diagnostické množství diagnostického nebo radiodiagnostického činidla podle vynálezu, s výhodou intravenózně. U radiodiagnostických provedení se lokalizace radioaktivního označení deteguje konvenčními způsoby, jako je γ-scintigrafie. U neradioaktivních diagnoistických provedení se lokalizace míst akumulace diganostických činidel označených paramagnetickým kovem podle vynálezu provádí způsoby zobrazení magnetickou resonancí.

Podle tohoto vynálezu se scintigrafická zobrazovací reakční činidla označená techneciem-99m podle vynálezu podávají v jediné jednotkové injektovatelné dávkové formě. Reakční činidla označená techneciem-99m získaná podle vynálezu se mohou podávat intravenózně v jakémkoliv konvenčním mediu pro intravenózní injekci, jako je vodné solné medium nebo medium krevní plasmy. Obecně má jednotková dávka, která se má podávat, radioaktivitu 0,01 mCi až 100 mCi, s výhodou 1 mCi až 20 mCi. Množství roztoku, které se má injekčně podávat v jednotkové dávce, je od 0,01 do 10 ml. Po intravenózním podání se během několika minut provede zobrazení in vivo. Zobrazení se však může provádět také, jestliže je to žádoucí, po hodinách nebo dokonce po delším období od doby, kdy bylo radiaktivně označené reakční činidlo injekčně podáno pacientovi. Ve většině případů se dostatečné množství podané dávky akumuluje v oblasti, která má být zobrazena, během 0,1 hodiny, takže je možné získat scintigrafickou fotografii. Podle tohoto vynálezu se může použít jakýkoliv konvenční způsob scintigrafického zobrazení pro diagnostické účely.

• · ··· · »· ·»

Pro účely podle tohoto vynálezu radiotherapie zahrnuje jakýkoliv terapeutický účinek v rozmezí od utišení bolesti do odstranění nádoru nebo remisi příznaků souvisejících s příslušnou rakovinou, která je léčena. Jestliže se pro terapetické účely používají reakční činidla podle vynálezu, jsou radioaktivně označena efektivním množstvím cytotoxického radioisotopu. Pro tento účel se může podávat cytotoxický radioisotop v množství od 10 mCi do 200 mCi jakoukoliv vhodnou klinickou cestou, s výhodou intravenózní injekcí.

Podle tohoto vynálezu se efektivní radiodiagnostická nebo radioterapeutická činidla mohou identifikovat následujícím způsobem. Reakční činidla podle vynálezu obsahující sloučeniny vázající CT receptor, včetně CT fragmentů, analogů CT peptidů a CT derivátů, se syntetizují zůsoby podle vynálezu a chelátor radioaktivního kovu se kovalentně naváže na tuto sloučeninu. Reakční činidla se pak uvedou do komplexu s radioaktivním kovem nebo neradioaktivním isotopem, který má chelatační vlastnost podobnou žádanému radioaktivnímu kovu, a navázání CT receptorů se pak vyhodnotí in vitro kempetitivními testy navázání, jak je zde popsáno, použitím CT označeného radioaktivním jodem. Jako příklad této metodologie se ReO používá pro vyhodnocení vhodnosti peptidů vázajících CT receptor pro použití 99m-techneciem radioaktivně označených scintigrafických zobrazovacích činidel, jak je popsáno níže v příkladu 4.

Způsoby výroby a označování těchto sloučenin jsou úplněji ilustrovány v následujících příkladech, které ilustrují některé aspekty shora popsaného vynálezu a výhodných výsledků a jsou uvedeny jako ilustrace, nikoliv jako omezení.

• 9 99

9 9 9 • 9 9 9

999 999

9

99

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza chelátorů BAT

Chelátory BAT, zvláště od S-cysteinu a od ε-aminolysinu odvozené chelátory BAT, se připravují podle způsobů současně vlastněné a současně podané USA patentové přihlášky č. 08/414 424, která je zde zahrnuta jako odkaz.

Příklad 2

Syntéza peptidů v pwevné fázi

Syntéza peptidů v pevné fázi (SPPS) se provádí v měřítku 0,25 milimolu (mmolu) použitím syntetizátoru peptidů Applied Biosystems Model 431A a použitím chránění aminového konce 9-fluorenylmethyloxykarbonylovou (Fmoc) skupinou, kondenzací se směsí dicyklohexylkarbodiimid/hydroxybezotriazol nebo 2-(1 H-benzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorfosfát/hydroxybenzotriazolu (HBRU/ /HOBT) a použitím p-hydroxymethyl-henoxymethyl-polystyrenové (HMP pryskyřice, Sasrinu™, chlortritylové pryskyřice pro karboxylový konec kyselin nebo Rink amidové pryskyřice pro karboxylový konec amidů.

Kde je to potřebné, Fmoc-Cys(BAT) a Na-Fmoc-N8-(BAT)Lys se syntetizují tak, jak je popsáno v současně vlastněné a současně podané USA patentové přihlášce č. 08/414 424, která je zde zahrnuta jako odkaz.

Kde je to potřebné, 2-chloracetylové, 2-bromacetylové a 2-brom-3-fenylpropionylové skupiny se zavádějí buď použitím příslušné 2-halogen-kyseliny jako posledního zbytku kondenzovaného během SPPS nebo zpracováním volné aminokyseliny na konci peptidů navázaného na pryskyřici buď s 2-halogenkyselinou/diisopropyl• · ··· · • φφ ·· ·· φ ♦ φ · • φφφφ • φ ··· φφφ • φ φ ··· φφ φφ karbodiimidem/N-hydroxysukcinimidem/NMP nebo anhydridem 2-halogenkyseliny/diisopropylethylaminem/NMP.

Kde je to vhodné, 2-halogenacylované peptidy vyčištěné na HPLC se cyklizují mícháním 0,1 až 1,0 mg/ml roztoku ve fosforečnanovém nebo hydrogenuhličitanovém t pufru nebo zředěném hydroxidu amonném (pH 8,0), popřípadě obsahujícím 0,5 až 1,0 ’ mM EDTA, nebo acetonitrilu či THF po dobu 1 až 48 hodin. Následuje okyselení kyselinou octovou, lyofilizace a vyčištění HPLC.

Kde je to vhodné, peptidy obsahující thiol se nechají zreagovat s komplexujícími částicemi s techneciem-99m s chráněným thiolem a obsahující chloracetylovou skupinu při pH 10 po dobu 0,5 až 4 hodiny za teploty místnosti. Následuje okyselení kyselinou octovou a odpaření roztoku, takže se získá odpovídající adukt peptid-sulfid. Odstranění chránící skupiny a vyčištění se rutinně provádějí tak, jak je to popsáno. Získá se konjugát chelátor-peptid.

Kde je to vhodné, BSME, BSEE a BSH adukty se připravují zreagováním peptidů obsahujících jeden thiol (5 až 50 mg/ml v DMF pufrovaném na pH 7 N-methylmorfolinem nebo N-ethylmorfolinem nebo 50mM pufru fosforečnanu sodného, pH 7 až 8, popřípadě obsahujícím 0,5 mM EDTA, nebo DMF, THF či acetonitrilu) s 0,5 molámími ekvivalenty BMME (bis-maleimidomethylether), BMEE (bis-maleimidoethylether) nebo BMH (bis-maleimidohexan), předem rozpuštěnými v acetonitrilu, za teploty místnosti po dobu přibližně 1 až 18 hodin. Tento roztok se zahustí a produkt se vyčistí HPLC.

Kde je to vhodné, TSEA adukty se připraví zreagováním peptidu obsahujícího jediný thiol (v koncentracích 10 až 100 mg/ml peptidu v DMF pufrovaném na pH 7 N-methylmorfolinem nebo N-ethylmorfolinem, nebo 5 až 50 mg/ml peptidu v 50mM fosforečnanu sodném, pH 7 až 8, popřípadě obsahujícím 0,5 mM EDTA, nebo DMF, THF či acetonitrilu) s 0,33 molámími ekvivalenty TMEA (tris(2-maleimidoethyl)aminu) předem rozpuštěném v acetonitrilu nebo DMF s nebo bez 1 molámího ekvivalentu

4

4 4 • ·· • 44 fl «

triethanolaminu za teploty místnosti 1 až 18 hodin. Tyto reakční směsi obsahující adukty se zahustí a adukty se pak vyčistí použitím HPLC.

Kde je to vhodné, kondenzuje se (BAM) (N¹,N⁴-bis(2-merkapto-2-methylpropyl)-1,4,10-triazadekan) s peptidem nejdříve aktivováním peptidkarboxylátu se směsí diisopropylkarbodiimid/N-hydroxysukcinimid nebo HBTU/HOBt v DMF, NMP nebo methylenchloridu. Následuje kondenzace v přítomnosti diisopropylethylaminu. Po kondenzaci se odstraní chránění konjugátů jak shora popsáno.

Kde je to vhodné, inkorporuje se (BAT) (N⁶,N⁹-bis(2-merkapto-2-methylpropyl)-6,9-diazanonanová kyselina) do peptidů jako chráněné deriváty aminokyseliny, jako je (Na(Fmoc-Ns(N-Boc)-S,S'-bistrityl-BAT)lysin (připravené z Na(Fmoc)-lysinu a Ns(N-Boc)-S,S'-bistrityl-BAT, jak je popsáno v příkladu 2 současně vlastněné a současně podané USA patentové přihlášky č. 08/044 825, která je zde zahrnuta jako odkaz) nebo jako (N(Fmoc)-S,S'-bistrityl-BAT)cystein (připravený jako je shora popsáno v příkladu 1F současně vlastněné a doprovázející USA patentové přihlášce č. 08/814 424, která je zde zahrnuta jako odkaz) během syntézy peptidu a potom se odstraní chránění po odštěpení kompletního peptidu ze syntetické pryskyřice.

Kde je to vhodné, připraví se BAT-BS (N-{2-(N',N'-bis(2-sukcinimidoethyl)aminoethyl)}-N⁶,N⁹-bis-(2-methyl-2-merkaptopropyl)-6,9-diazanonanamid)ové adukty zreagováním peptidu obsahujícího jediný thiol (v koncentracích 2 až 50 mg/ml peptidu v DMF pufrovaném na pH 7 N-methylmorfolinem nebo N-ethylmorfolinem nebo v 50mM fosforečnanu sodném (pH 7 až 8), popřípadě obsahujícím 0,5 mM EDTA, nebo DMF, THF či acetonitrilu) s 0,5 molámími ekvivalenty BAT-BM (N-{2-(N',N'-bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl)}-N⁹-(terc.butoxykarbonyl)-N⁶,N⁹-bis(2-methyl-2-trifenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamidu) předem rozpuštěném v acetonitrilu nebo THF za teploty místnosti po dobu přibližně 1 až 18 hodin. Tento roztok se pak odpaří dosucha a reakcí s 10ml TFA a 0,2 ml triethylsilanu po dobu 1 hodiny se odstraní chránění konjugátů (BAT-BS)-peptid. Roztok se zahustí, adukty produktu se vysrážejí etherem a potom se vyčistí HPLC.

·» ···· φ φ φ φ φ φ

Kde je to vhodné, prekursory peptidu se cyklizují (mezi aminovými a karboxylovými konci) reakcí chráněného postranního řetězce, N-koncového volného aminu a C-koncové volné kyseliny s difenylfosforylazidem.

Peptid vázaný na pryskyřici Sasrin™ se štěpí roztokem 1% (hmotn.) TFA v dichlormethanu. Získá se chráněný peptid. Kde je to vhodné, chráněné peptidové prekursory se cyklizují mezi aminovým a karboxylovým koncem reakcí chráněného postranního řetězce, N-koncového volného aminu a volné kyseliny na karboxylovém konci použitím difenylfosforylazidu.

Produkty navázané na HMP nebo Rink amidové pryskyřici se rutinně štěpí a chránění chráněných cyklizovaných peptidů se odstraní použitím roztoku, který obsahuje trifluoroctovou kyselinu (TFA) nebo TFA a methylenchlorid, popřípadě obsahující vodu, thioanisol, ethandithiol a triethylsilan nebo triisopropylsilan v poměrech 100:5:5:2,5:2 za teploty místnosti 0,5 až 3 hodiny. Kde je to vhodné, produkty se opětovně S-tritylují ve směsi trifenolmethanol/TFA a do peptidu se použitím (Boc)₂O znovu zavedou N-Boc skupiny.

Kde je to vhodné, thiolové funkce v peptidové nebo peptidometické sekvenci navržené pro další zpracování s prosthetickou skupinu byly chráněny použitím sloučeniny, jako je S-terc. butyl (za vzniku směsných terc.butyl-disulfidů) nebo p-methoxybenzyl. S-terc.butyl-skupiny se odstraní reakcí s roztokem dithiothreitolu nebo merkaptoethanolu, při čemž se p-methoxybenzylové skupiny odstraní použitím etherátu fluoridu boritého v kyselině trifluoroctové v přítomnosti vychytávače volných radikálů, jako je m-kresol. Protetické peptidy obsahující skupiny vázající radioaktivní kov se připraví SPPS se zakončením N-koncovou 2-halogenacetylovou skupinou. Protetická skupina se odstraní z pryskyřice a jakékoliv thiolové skupiny se chrání, například tritylovou skupinou. Halogenacylovaná sekvence se pak zkondenzuje s peptidem obsahujícím thiol za v podstatě stejných podmínek, jak shora popsáno pro « · · · · · * · 99 99

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 999 999

9 9 9

9 999 99 9 9 • · «

9 9

9 9

9 9 9

99 přípravu cyklických thiooetherů. Odstranění zbývajících chránících skupin se pak dosáhne použitím způsobů, které jsou zde popsány, takže se získá konečný produkt.

Surové peptidy se vyčistí preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) použitím kolony Waters Δ Pak C18 a gradientovou elucí 0,1% (hmotn.) trifluoroctovou kyselinou (TFA) ve vodě upravené acetonitrilem. Acetonitril se z eluovaných frakcí odpaří a ty se pak lyofilizují. Identita každého produktu se potvrdí hmotností spektrometrií bomabardováním rychlými atomy (FAB-MS) nebo ES (ES-MS).

Peptidy vázající CT receptor, syntetizované deriváty a analogy, které se zde získávají, stejně jako produkty těchto syntéz identifikované ES-MS nebo FAB-MS, jsou uvedeny níže v tabulce I.

Tabulka I peptid peptid ReO komplex

1. CH?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(BAT)ELHKLQTYPRT

NTGSGTP.amid 3679 3877*

2. CH^CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLOTYPRTNTGS

GTP.(_s-K)GC.amid 3687* 3886

3. CH?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.

GTP.amid 3373* NA

4. CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH,CO.GGCK.amid))·

ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3873* 4078

5. CH₇C0.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH_?C0·(B-Dap)KCK.

amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3777* 3975

6. CH,C0.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH9C0.fe-K)·

GCE.amid))ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3849* 4047

7. CH9CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.

·· φφφ ♦ φφφ · » φ · φ φ · φ « · φ * · φ

ΦΦ *· · · ΦΦ*

ΦΦ ·· • · · · • · · Φ ♦ · · ΦΦΦ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ

GTP.amid 3360*

8. CH_?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.GGCK.amid).

ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3762*

9. CH?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH?CO.(B-Dap)KCK· ,amid))ELHKLQTYPRTNTGS.GTP.amid 3862*

10. CH_?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.fe-K)·

GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3835

11- CH,CO.SNLST.Cvs.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.

.GTP.amid 3346*

12. CH_?CO.SNLST.Cys.VLGKLSC(CH,CO.GGCKamid).

ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3748*

13. CHyCO.SNLST.Cvs.VLGKLSCfCHoCOTB-DapY

KCK.amid)LHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3848*

14. CHpCO.SNLST.Cvs.VLGKLSCfCHoCOTs-K).

GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3820

15. SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.

.amid 3356

16. SNLST.Asu.VLGKLSCfCH,CO.(B-Dap)KCK.amid))ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3858

17. SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLQTYPRTDVGAGTP.

.amid 3338

18. SNLST.Acu.VLGKLSC(CH,CO.(B-Dap)KCK.

,amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 3841

NA

3962

4063

4033

NA

3947

4048

4019

NA

4057

NA

4040 * znamená M⁺ stanovené hmotnostní spektrometrií (ES) Pro všechny ostatní peptidy bylo M⁺ stanoveno FAB MS.

·· ···· φ · • · • * • · · • 9 ·· ·· • · ·· · · a · • · · · · · • · · ··· 999

9 9 9

999 999 99 99

Příklad 3

Obecný způsob radioaktivního označování techneciem-99m

0,1 mg peptidů připraveného jako v příkladu 2 se rozpustí v 0,1 ml nebo 0,2 ml vody nebo 0,9% (hmotn.) solného roztoku. Gluceptát technecia-99m se připraví naplněním nádobky Glucoscan (E. I. Du Pont de Nemours, lne., Wilmington, De.) 0,25 ml technistanu sodného s techneciem-99m obsahujícím až 200 mCi a nechá se stát 15 minut za teploty místnosti. K peptidů se pak přidá 25 μΙ gluceptátu technecia-99m a reakce se nechá 15 až 60 minut probíhat za teploty místnosti nebo 10 až 30 minut pň 100 °C. Potom se zfiltruje 0,2gm filtrem.

Čistota techneciem-99m označeného peptidů se stanoví HPLC na obrácených fázích za následujících podmínek: analytická kolona Waters Δ Pak C-18, 5μηη, 3,9 mm x 150 mm, byla naplněna každým radioaktivně označeným peptidem a peptidy se eluují rozpouštědlem s rychlostí průtoku 1 ml/min (Δ-Pak). Gradientová eluce se provádí gradientem 20 až 50 % (hmotn.) směsi rozpouštědlo B/rozpouštědlo A (rozpouštědlo A znamená 0,1% CF₃COOH ve vodě a rozpouštědlo B znamená 0,1% CF₃COOH ve směsi 90/10 CH₃CN/H₂O) po dobu dvaceti minut, následuje 3 minuty směs 100 % B/A.

Radioaktivní složky se detegují použitím in-line radiometrického detektoru napojeného na integrující zapisovač. Gluceptát technecia-99m a technistan sodný s techneciem-99m se za těchto podmínek eluují mezi 1 a 4 minutami, zatímco peptidy označené techneciem-99m se eluují za mnohem delší dobu. Peptidy byly detegovány in-line spektrofotometrickou detekcí při 220 nm.

Komplexy neradioaktivního rhenia byly připraveny současným rozpuštěním každého peptidového reakčního činidla podle vynálezu s jedním molárním ekvivalentem tetrabutylamonium-oxotetrabromrheničnanu (+5), který se připraví podle Cottona a spol. (Jnorg. Chem. 1996, 5, 9 až 16.) v dimethylformamidu nebo ve směsi • · · ·

acetonitril/voda a mícháním 0,5 až 5 dnů. Komplexy rhenia se isolují HPLC na obrácených fázích, jak je shora popsáno pro peptidy označené techneciem-99m, a byly charakterizovány FABMS nebo ESMS. Neradioaktivní peptidy se detegují jako peptidy in-line spektrofotometrickou detekcí při 220 nm.

Komplexy s radioaktivním rheniem, použitím například Re-186 nebo Re-188, se připraví z příslušných rhenistanových solí použitím stejného postupu jako při označování techneciem-99m nebo přidáním redukčního činidla k roztoku peptidu a rhenistanu, nebo popřípadě použitím činidla pro přenos ligandu, jako je citrát, a inkubací reakce za teploty mezi teplotou místnosti a 100 °C po dobu mezi 5 a 60 minutami.

Výsledky čištění peptidů, peptidů označených techneciem-99m a peptidů komplexovaných s ReO na HPLC jsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka II peptid peptid ReO komplex

1. CH?CO. SNLST. Hhc.VLGKLSCfBAOELHKLQTYPRT.

NTGSGTP.amid	13,7	15,6
2. CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.
GTP.(e-K)GC.amid	15,0	13,5
3. CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.
GTP.amid	19,2	NA
4. CH7CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCfCH9CO.GGCK.amid).
ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	21,2	17,8
5. CH7CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCfCH7CO.fB-Dao).
KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	12,1	12,9
6. CH9CO. SNLST. Hhc.VLGKLSCfCH,CO. ίε-Κ).
GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	11,9	12,4

7. CH?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.

» · · > · · • •to « • · · · • toto • to ·· ·· · · ·

GTP.amid	13,1	NA
8. CH,CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCřCH,CO.GGCK.amid). ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	12,4	13,5
9. CH,CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCíCH,CO.ÍB-DaDlKCK. ,amid)ELHKLQTYPRTNTGS.GTP.amid	11,0	11,8
10. CH?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.fe-K). GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	12,5	13,1
11. CH,CO.SNLST.Cvs.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.
.GTP.amid	10,7	NA
12. CH9CO.SNLST.Cvs.VLGKLSCiCH7CO.GGCK.a- mid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	9,98	11,1
13. CH7CO.SNLST.Cvs.VLGKLSCřCH,CO.ÍB-DaDY KCK.amid)LHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	8,23	9,2
14. CH,CO.SNLST.Cvs.VLGKLSCřCH,CO.Ís-Kl GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	9,98	10,7
15. SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLOTYPRTNTGSGTP. .amid	12,7	NA
16. SNLST.Asu.VLGKLSCřCH,CO.ÍB-DaD)KCK.a- mid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	10,7	11,4
17. SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLQTYPRTDVGAGTP. .amid	13,2	NA
18. SNLST.Acu.VLGKLSCíCH,CO.(B-DaD)KCK.a- mid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid	11,1	11,7

Data znamenají retenční časy při HPLC v minutách.

• «

Příklad 4

Biologické testy

A. Testy inhibice navázání

Peptidová reakční činidla v rozsahu tohoto vynálezu nebo jejich provedení komplexovaná s ReO byla testována použitím in vitro testů, které měří jejich schopnost inhibovat specifické navázání ¹²⁵I-CT na CT receptor použitím membrán z krysího mozku nebo z buněčné linie nádoru prsu a u celých buněk z buněčné linie nádoru prsu, jako je podrobně popsáno níže.

Analýzy používající psomální membránové frakce krysího mozku a T-47D buňky (získané z Americké sbírky typů kultur, American type Culture Collection, Rockville, Md., ATCC Accession No. HTB-133) byly používány pro identifikování analogů s vysokou afinitou na CT receptor způsobem podle Fishera a spol. (British J. Cancer 1977, 35, 777 až 784.). Ve stručnosti - tkáň se rozseká na malé kousky a zhomogenizuje se. Membrány se několikrát promyjí, analyzují se na obsah proteinu a použijí se v testu navázání. Mebránový protein byl inkubován s 0,1 μϋί ^-lososového CT (Amersham, Cleveland, Oh.) v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací reakčních činidel, která se mají testovat. Byla testována jak nekomplexovaná reakční činidla tak reakční činidla komplexovaná s ReO. Stoprocentní specifické navázání ¹³⁵I-CT na CT receptor bylo definováno jako rozdíl mezi úplným navázáním ¹³⁵I-CT a nespecifickým navázáním ¹²⁵I-CT měřeným v přítomnosti koncentrace saturující receptor (1 μΜ) nadbytku neoznačeného lososového CT (Sigma, St. Louis, Mo.). Koncentrace, při které testovaná reakční činidla inhibovala specifické navázání ¹²⁵I-CT z 50 %, byla definována jako ICsoVýsledky navázání na membránové prostředky CT receptorů pro každé z testovaných reakčních činidel jsou uvedeny v tabulce III. Tyto výsledky ukazují, že peptidová reakční činidla v rozsahu tohoto vynálezu a ReO komplexy těchto reak• · · • · · · • · · · • · · · ·· ·· • · · 4 • · · 4 • · · · · · 4 čních činidel se vážou s vysokou afinitou na nádorové buňky a na mozkové membrány exprimující CT receptor.

Podobné pokusy bylo prováděny s dalšími peptidovými reakčními činidly v rozsahu tohoto vynálezu použitím celých T-47D buněk a MCF-7 buněk (ATCC č. HTB-22). Testy navázání buněk byly prováděny v podstatě způsobem podle Findlaye a spol. (J. Endocrinol. 1990, 130, 321 až 326.). Ve stručnosti - buňky byly promyty v solném roztoku a resuspendovány v Hankově vyváženém solném roztoku. Jeden až dva miliony buněk byly inkubovány s 0,1 μθΐ ¹²⁵l-lososového CT v nepřítomnosti a v přítomnosti 1 μΜ neznačeného lososového CT, aby se stanovila hodnota 100% specifického navázání. Buňky se inkubují s 0,1 pCi ¹²⁵I-CT v přítomnosti nebo nepřítomnosti různých koncentrací reakčních činidel, která mají být testována, v nekomplexované a/nebo komplexované (s ReO) formě. Hodnoty IC50 byly stanoveny jak shora popsáno. Výsledky pro každé z testovaných reakčních činidel jsou uvedeny v tabulce IV.

Tabulka III

Nahražení ¹²⁵I-CT z CTR v T-47D a mozkových membránách krys CT-mimetickými peptidy struktura peptidu T-47D mozek krys

ICso Kj IC50 K

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCfBAT)ELHKLQ7YPRT.

NTGSGTP.amid 0,53 0,41 2,6 ND

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.

GTP.(e-K)GC.amid 16 12 18 ND

CH?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(BAT)ELHKLQTYPRT.

NTGSGTP.amid (ReO)

CH^CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.

1,5 1,2 3,0 ND

GTP.(e-K)GC.amid (ReO)

22 22 ND

Tabulka IV

Nahrazení ¹²⁵I-CT z T47D (buňky a membrány) a MCF-7 buněk sekvence

IC50 IC50 IC50 (nM)^x (nM)^y (nM)^z

3. CHgCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRT.

NTGSGTP.amid 1,6 nd nd

4. CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH,CO.GGCK.amid))ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid 2,6 nd nd

5. CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH_?CO.(ft-DaDY

KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 0,42 5,8

6. CH?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CK>CO.(e-K).

GCE.amid).ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 0,33 3,3 8. CH_?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CQ.GGCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 0,83 4,8

9- CH_?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.(B-Dap).

KCKamid)ELHKLQTYPRTNTGS.GTP.amid.ReO nd 0,84 nd 10. CH^CO.SNLST.Hcy.VLGKLSCfCHoCQ.fe-KY

GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 0,89 nd

12. CH_?CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH_?CQ.GGCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 1,0 5,2 13- CHgCO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH,CQ.(a-DaD).

KCK.amid)LHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 2,9 nd 14. CH?CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH>CQ.fe-K).

GCE.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 2,6 1,9 16. SNLST.Asu.VLGKLSC(CH,CQ.(B-Dap)KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 2,7 8,0 • « ·· · » · ······ • · · · « · ♦ · • · « · · · · · · · · · «·

18. SNLST.Acu.VLGKLSC(CH,CO.(B-Dap)KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid.ReO nd 0,55 7,0

CSNLSTCVLGKLSQELHKLQIYPRTNTGSGTP-NH, (lososový kalcitonin) nd nd 12,3 nd = neděláno při čemž x T-47D buněčné merrtbrány y celé T-47D buňky z celé MCF-7 buňky

Tyto výsledky ukazují, že peptidová reakční činidla v rozsahu tohoto vynálezu a ReO komplexy těchto peptidů byly schopny specifického navázání na CT receptory na celých buňkách a že reakční činidla byla silnými inhibitory CT navázání u dvou různých buněčných linií nádoru prsu exprimujících CT receptor.

B. Exprese CT receptoru v buněčných liniích rakoviny prsu

Navázání ¹²I-CT na celé buňky bylo použito pro vyhodnocení hustoty CT receptoru u sedmi různých lidských buněčných linií nádoru prsu. Místní hustota na buňku byla stanovena pro MCF-7 buňky v přítomnosti různých koncentraí CT, aby se dosáhlo nasycení na receptorech. Data pak byla linearizována způsobem podle Scatcharda a spol. (/V. Y. Acad. Sci. 1949, 51, 600 až 672.), aby se vyhodnotila hustota receptoru. Stručně - křivky nasycení byly linearizovány, hodnota Kd byla vypočtena jako -1/směrnice a hodnota B_max byla rovna průsečíku křivky s osou x. Další buněčné linie (každá z těch, které byly získány z ATTC, Rockville, Md.) byly srovnávány s buňkami MCF-7 při jediné koncentraci ¹²⁵I-CT a tak byla vyhodnocena jejich hustota CT receptoru. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce V.

Tabulka V

buněčná linie	CT receptorú/buněk.10·3
DU4475	21,5
ZR75	39,5
MDA-MB-157	51,0
MCF-7	1,000
Bt474	166
HS78T	0
T-47D	360

Tato data ukazují, že 86% (6 ze 7) testovaných buněčných linií rakoviny prsu bylo positivních na CT receptory. Cílový receptor pro reakční činidla podle vynálezu je tedy přítomen ve většině testovaných buněčných liniích rakoviny prsu. Nedávno bylo zjštěno, že cílový receptor pro reakční činidla podle vynálezu je nadexprimován u primárních rakovin prsu (Gíllespie a spol.: Int. J. Cancer1997, 73, 812 až 815.). Tyto výsledky ukazují, že CT peptidy podle vynálezu jsou vhodné pro přípravu užitečných místně specifických reakčních činidel pro diagnostikování a léčení nádorů u lidí.

C. In vivo test

Buněčné linie rakoviny prsu byly testovány na expresi receptorů. Nejlepší buněčné linie byly vybrány pro implantaci štěpu do myší s deficitem imunity. Tyto nádorové modely byly použity pro vyhodnocení nádorového cílového potenciálu in vivo vysoce afinitních peptidů identifikovaných ve shora uvedených in vivo testech.

Buňky rakoviny prsu (T47D a MCF-7) exprimující CT receptor byly implantovány do myší s deficitem imunity nebo do krys Sprague-Dawley a nádory byly nechány růst. Pro testování nových Tc-CT peptidů byly myším nebo krysám s nádorem ·· » · » · • · · • · • · • ·· · injekčně podáno přibližně 0,025 mCi při přibližně 6 mCi/10 nmolů peptidů. Zvířata byla cervikálně posunuty a staticky zobrazovány po dobu 5 minut γ-kamerou. Biologická distribuce Tc-CT peptidů byla pak stanovena vyhodnocením krve, nádoru, cílových orgánů a svalů γ-počítačem spolu se standardními podíly injektované dávky. Časové body pro biologickou distribuci byly vybrány tak, aby představovaly časnou, střední a pozdní fázi vymizení Tc-CT analogu. Studie biologické distribuce ukázaly, že optimální poměry signálů k šumu jsou v době 90 minut po injekci. Pro vyhodnocení potenciálu vybraných analogů zobrazovat nádor byl poměr radioaktivity v krvi a různých tkáních srovnáván s poměry v nádoru. Representativní data biologické distribuce po 90 minutách jsou uvedena níže v tabulce VI.

• I · « • ♦ · 1 ··· · ·«

Tabulka VI

biologická distribuce
nádor krev plíce Gl játra ledv.	PK(min)

ΡθΡ- tid druh	(%ID /g) ki	rev srv.	(% ID g) (% id)	% (% (% ID) ID) ID)	£l/2a
8 myšib	0,42	2,8 2,8	0,16 1,23/g
8 krysa			0,026 0,1 /g	4,8 3,7 45,6	1,6?	20?
2 myšia	1,6	3,3 10	0,24	5,4 5,518
4 krysa			0,027 0,53	2,0 4,0 35	1,4	19
5 krysa			0,048 0,56	4,5 5,8 31	1,6	17
6 krysa			0,044 0,10	1,82,5 32,2	1,6	21
6 králík			0,012 0,20	5,3 2,314,1
6 myšic	2,0	9,9 25	0,23 2,5/g		3,1	25,9
6 myši0	3,9	4,2 2,5	0,94 6,5/g	2,7 53
6 myši* 3	1,5	1,6 2,1	0,91 2,3/g	1,5 27

Číslování peptidů odpovídá číslování v tabulkách I až IV.

³ T-47D nádor u nahých myší ^b MCF-7 štěp rakoviny prsu u nahých myší ⁰ různé prostředky

Tomu je třeba rozumět tak, že předcházející popis zahrnuje některá specifická provedení podle vynálezu a že všechny modifikace nebo alternativy s nimi ekvivalentní jsou v duchu a rozsahu vynálezu, jak je uveden v připojených nárocích.

• *

i:

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatelé: Dean Richard T.

Bush Larry R.

Pearson Daniel A.

Lister-James John (ii) Název vynálezu: Syntetická sloučenina, která váže receptor kalcitoninu, reakční činidlo, scintigrafické zobrazovací činidlo, prostředek a radioterapeutické činidlo ji obsahující, komplex a sestava pro přípravu radioaktivního přípravku, způsob označení reakčního činidla a způsob jeho výroby a použití (iii) Počet sekvencí: 11 (iv) Korespondenční adresa:

(A) adresát: Diatide, lne.

(B) ulice: 9 Δ Drive (C) město: Londonderry (D) stát: Nh.

(E) země: USA (F) poštovní směrovací číslo: 03053 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) typ media: floppy disk (B) počítač: IBM PC compatible (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) počítačový program (software): Patentln Release #1.0, verse #1.30 (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) číslo přihlášky:

(B) datum podání:

(C) klasifikace:

(vii) Údaje o předchozí přihlášce:

(A) číslo přihlášky: USA 08/847 007 (B) datum podání: 1. května 1997 (viii) Informace o zástupci:

(A) Jméno: McDaniels Patricia A.

(B) číslo registrace: 33 194 (C) odkaz/číslo spisu: DITl 125.1 PCT (ix) Informace o spojení:

(A) telefon: (603) 437-8970 (C) telefax: (603) 437-8977 (2) Informace o sekvenci id. č. 1:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 32 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (ii) Typ molekuly: peptid (vi) Původní zdroj:

(A) organismus: kalcitonin - člověk *· ·* • · · · • · · · • ftft · · · · • · • ·· ·· • · · · · · (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: disulfidová vazba (B) umístění: 1..7 (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 32 (D) další informace: /produkt= PROLIN 32 /označení= amid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 1:

Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gin 1 5 10

Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gin Thr Ala Ile Gly 15 20 25

Val Gly Ala Pro 30 (2) Informace o sekvenci id. č. 2:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 32 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (ii) Typ molekuly: peptid ••4444 Β 4 4 4 4· · * 44 4 4 4 4 · · 4 4 44·4

4 44 · 4 · 444444 • 444 44 44 • 4 44 444 444 44 44 (vi) Původní zdroj:

(A) organismus: kalcitonin - losos (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: disulfidová vazba (B) umístění: 1..7 (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 32 (D) další informace: /produkt= PROLIN 31 /označen í= amid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 2:

Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gin 1 5 10

Glu Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly 15 20 25

Ser Gly Thr Pro

♦ · » 9 · · • · · · » • 9 99 9 999

9 9

999 99 99 (2) Informace o sekvenci id. č. 3:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 32 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (ii) Typ molekuly: peptid (vi) Původní zdroj:

(A) organismus: kalcitonin - úhoř (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: disulfidová vazba (B) umístění: 1..7 (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 32 (D) další informace: /produkt= PROLIN 3Γ /označení= amid • · (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 3:

Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gin 1 5 10

Glu Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly 15 20 25

Ala Gly Thr Pro 30 (2) Informace o sekvenci id. č. 4:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 31 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: oblast (B) umístění: 1..6 (D) další informace: /produkt= S1 je acetylovaný a X 6 znamená Hhc /označení= cyklizovaný /poznámka= Peptid je cyklizován thioetherovou vazbou mezi N-koncovou acetylovou skupinou šeřinu 1 a thiolem homocysteinu 6 • · · · · · ► *

I * ··· (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 13 (D) další informace: /produkt= C 13 /označení= BAT /poznámka= “Thiolová skupina cysteinu 13 je napojena na bisamino-bisthiolový chelátor (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 31 (D) další informace: /produkt= PROLIN 31 /označení= amid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 4:

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu 1 5 10

Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser 15 20 25

Gly Thr Pro ·· ·· • · · · • · · · • · · · · · • · • · · · • · · ·· ·· ·*· · (2) Informace o sekvenci id. č. 5:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 31 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (i i) Typ molekuly: peptid (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: oblast (B) umístění: 1..6 (D) další informace: /produkt= S1 je acetylovaný a X6 znamená Hhc /označení= cyklizovaný /poznámka= Peptid je cyklizován thioetherovou vazbou mezi N-koncovou acetylovou skupinou šeřinu 1 a thiolem homohomocysteinu 6 (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 31 (D) další informace: /produkt= PROLIN 31 /označení= amid • * 909 ·

(xi) popis sekvence: sekvence id. č. 5:

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu 1 5 10

Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser 15 20 25

Gly Thr Pro 30 (2) Informace o sekvenci id. č. 6:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 31 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: oblast (B) umístění: 1..6 (D) další informace: /produkt= S1 je acetylovaný a X6 znamená Hcy /označení= cyklizovaný /poznámka= Peptid je cyklizován thioetherovou vazbou mezi N-koncovou acetylovou skupinou šeřinu 1 a thiolem homocysteinu 6 • φ φφ φ φ φ φ • φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ · φ φ φφφ • e *φφφ > · · φφφ φ φ φ (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 31 (D) další informace: /produkt= PROLIN 31 /označení= amid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 6:

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu 1 5 10

Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser 15 20 25

Gly Thr Pro 30 (2) Informace o sekvenci id. č. 7:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 31 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (ii) Typ molekuly: peptid φ ·φ «φ φφ φφφφ φ φφφφ φ φφφ φφφ φ φ · φφφ φ φ φ φ φφφ · e φ * « * · · • φ φ φ φφ «· φ φ® ·*φφ (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: oblast (B) umístění: 1..6 (D) další informace: /produkt= S1 je acetylovaný /označení= cyklizovaný /poznámka= Peptid je cyklizován thioetherovou vazbou mezi N-koncovou acetylovou skupinou šeřinu 1 a thiolem cysteinu 6 (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 31 (D) další informace: /produkt= PROLIN 31 /označení= amid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 7:

Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu 1 5 10

Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser 15 20 25

Gly Thr Pro #· ·· • · · · • · · · ··· ··· • · ♦ · ·· ·· «··· · · • · · «· ·· • · · · · • · · < · · • · · · · · »· ·· ··· ··· (2) Informace o sekvenci id. č. 8:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 31 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: oblast (B) umístění: 1..6 (D) další informace: /produkt= X6 znamená Asu /označení= cyklizovaný /poznámka= Peptid je cyklizován vazbou mezi serinem 1 a 2-aminokorkovou kyselinou 6 (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 31 (D) další informace: /produkt= PROLIN 31 /označení= amid

(xi) popis sekvence: sekvence id. č. 8:

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu 1 5 107

Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser 15 20 25

Gly Thr Pro 30 (2) Informace o sekvenci id. č. 9:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 31 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: obojí (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: oblast (B) umístění: 1..6 (D) další informace: /produkt= S1 je acetylovaný a X6 znamená Hhc /označení= cyklizovaný /poznámka= Peptid je cyklizován thioetherovou vazbou mezi N-koncovou acetylovou skupinou šeřinu 1 a thiolem homohomocysteinu 6 (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: místně modifikovaný (B) umístění: 31 (D) další informace: /produkt= PROLIN 31 /označení= amid (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 9

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu 1 5 107

Leu His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser 15 20 25

Gly Thr Pro 30 (2) Informace o sekvenci id. č. 10:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 6 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: cirkulámí (ii) Typ molekuly: peptid ·· ·· » · · · » · · · • · · · · · • · • · · · • · • · · · (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: oblast (B) umístění: 1..6 (D) další informace: /produkt= S1 je acetylovaný a X6 znamená C, Hcy nebo Hhc /označení= cyklizovaný /poznámka= Peptid je cyklizován thioetherovou vazbou mezi N-koncovou acetylovou skupinou šeřinu 1 a thiolem X6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 10

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa

5 (2) Informace o sekvenci id. č. 11:

(i) Vlastnosti sekvence:

(A) délka: 6 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna:

(D) topologie: cirkulámí (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Vlastnosti:

(A) jméno/klíč: oblast (B) umístění: 1..6 (D) další informace: /produkt= X1 znamená A, G nebo S, X6 znamená C, Hcy nebo Hhc /označení= cyklizovaný /poznámka= Peptid je cyklizován thioetherovou vazbou mezi N-koncovým methylenem a thiolem X6 (xi) popis sekvence: sekvence id. č. 11

Xaa Asn Leu Ser Thr Xaa

Claims (36)

1. Syntetická sloučenina, která váže receptor kalcitoninu, má molekulovou hmotnost menší než 10 000 a je kovalentně navázána na chelátor radioaktivního kovu za vzniku reakčního činidla, které se vyznačuje tím, že má stejnou nebo větší vazebnou afinitu na receptor kalcitoninu než je vazebná afinita radioaktivním jodem označeného přírodního kalcitoninu na uvedený receptor.

2. Syntetická sloučenina, která váže receptor kalcitoninu, má molekulovou hmotnost menší než 10 000 a je kovalentně navázána na chelátor radioaktivního kovu za vzniku reakčního činidla, které se vyznačuje tím, že má vazebnou afinitu na receptor kalcitoninu ne menší než jedna desetina vazebné afinity radioaktivním jodem označeného přírodního kalcitoninu na uvedený receptor.

3. Reakční činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že chelátor je vybrán ze skupiny sestávající z

a) sloučeniny obecného vzorce C(pgp)^s-(aa)-C(pgp)^s, v němž (pgp)^s znamená atom vodíku nebo chránící skupinu thiolu a (aa) znamená jakoukoliv primární a- nebo β-aminokyselinu,

b) chelátoru obsahujícího skupinu, která obsahuje jediný thiol, obecného vzorce

A-CZ(B)-{C(R¹R²)}n-X, v němž A znamená atom vodíku, skupinu HOOC, H₂NOC, (aminokyselina nebo peptid)-NHOC, (aminokyselina nebo peptid)-OCOnebo R⁴,

B znamená atom vodíku, skupinu SH, -NHR³, -NíR^-íaminokyselina nebo peptid) nebo R⁴,

X znamená atom vodíku, skupinu SH, -NHR³, -N^^/aminokyselina nebo peptid) nebo R⁴, • · · · · · • · ·

Z znamená atom vodíku nebo R⁴,

R¹, R², R³ a R⁴ nezávisle znamenají atom vodíku nebo nižší přímý nebo rozvětvený řetězec nebo cyklický alkyl, n znamená číslo 0,1 nebo 2, (aminokyselina) znamená jakoukoliv primární a- nebo β-aminokyselinu, která neobsahuje thiolovou skupinu, (peptid) znamená peptid ze 2 až 10 aminokyselin, a

jestliže B znamená skupinu -NHR³ nebo -N(R³)-(aminokyselina nebo peptid), X znamená skupinu SH a n znamená číslo 1 nebo 2, jestliže X znamená skupinu -NHR³ nebo -NfRjjaminokyselina nebo peptid), B znamená skupinu SH a n znamená číslo 1 nebo 2, jestliže B znamená atom vodíku nebo R⁴, A znamená skupinu HOOC, H₂NOC, (aminokyselina nebo peptid)-NHOC nebo (aminokyselina nebo peptid)-OOC, X znamená skupinu SH a n znamená číslo 0 nebo 1, jestliže A znamená atom vodíku nebo R⁴, potom jestliže B znamená skupinu SH, X znamená skupinu -NHR³ nebo -NÍRjjaminokyselina nebo peptid), a jestliže X znamená skupinu SH, B znamená skupinu -NHR³ nebo -NÍRjjaminokyselina nebo peptid) a n znamená číslo 1 nebo 2, jestliže X znamená atom vodíku nebo R⁴, A znamená skupinu HOOC, H₂NOC, (aminokyselina nebo peptid)-NHOC nebo (aminokyselina nebo peptid)-OOC a B znamená skupinu SH, jestliže Z znamená methyl, X znamená methyl, A znamená skupinu HOOC, H₂NOC, (aminokyselina nebo peptid)-NHOC nebo (aminokyselina nebo peptid)-OOC, B znamená skupinu SH a n znamená číslo 0, jestliže B znamená skupinu SH, X neznamená skupinu SH a jestliže X znamená SH a B neznamená skupinu SH, a v němž thiolová skupina existuje v redukované formě, ·· ·· » · 9 · • · ·

99· 999 • · • · · · • · · ·

c) sloučeniny obecného vzorce

NH N-A-CO-peptid

I I (CR_:)_m (CR,)_P

S-(pgp)^s S-(pgp)^s v němž každá R nezávisle znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl, každé (pgp)^s nezávisle znamená chránící skupinu thiolu nebo atom vodíku, m, n a p nezávisle znamenají číslo 2 nebo 3,

A znamená lineární nebo cyklický nižší alkyl, aryl, heterocyklyl, jejich kombinaci nebo jejich substituovaný derivát,

d) sloučeniny obecného vzorce

NH | N-A-CH(V)NHR' (CRX (CK)_P 1 SH 1 SH

v němž každé R nezávisle znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl, m, n, a p nezávisle znamenají číslo 2 nebo 3,

A znamená lineární nebo cyklický nižší alkyl, aryl, heterocyklyl, jejich kombinaci nebo jejich substituovaný derivát,

V znamená atom vodíku nebo skupinu -CO-peptid,

R' znamená atom vodíku nebo peptid, • · · • · · · · · a v němž jestliže V znamená atom vodíku, R' znamená peptid a jestliže

R' znamená atom vodíku, V znamená skupinu -CO-peptid,

e) sloučeniny obecného vzorce v němž m, n a p nezávisle znamenají číslo 0 nebo 1, každé R' nezávisle znamená atom vodíku, nižší alkyl, hydroxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) nebo alkoxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku), každé R nezávisle znamená atom vodíku nebo R, kde R znamená substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl neobsahující thiolovou skupinu, jeden z R nebo R' znamená L, při čemž jestliže R' znamená L, -NR'₂ znamená amin, a

L znamená dvojvaznou skupinu, která váže chelátor na sloučeninu,

f) sloučeniny obecného vzorce

R R

R

R ·· « » φ φ

Β Φ Φ

ΦΦΦ <1 v němž m, η a ρ nezávisle znamenají číslo 0 nebo 1, každé R' nezávisle znamená atom vodíku, nižší alkyl, hydroxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) nebo alkoxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku), každé R nezávisle znamená atom vodíku nebo R, kde R znamená substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl neobsahující thiolovou skupinu, jeden z R nebo R' znamená L, při čemž jestliže R' znamená L, -NR'₂ znamená amin, a

L znamená dvojvaznou skupinu, která váže chelátor na sloučeninu,

g) sloučeniny obecného vzorce (HOOCCH₂)₂N(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH)(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH), v němž R nezávisle znamená atom vodíku, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo aryl a jeden R je kovalentně navázán na dvojmocný linker,

h) sloučeniny obecného vzorce (HOOCCH₂)₂N(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH), v němž R nezávisle znamená atom vodíku, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo aryl a jeden R je kovalentně navázán na dvojmocný linker,

i) 1,4,7,10-tetraazododekantetraoctové kyseliny,

j) sloučeniny obecného vzorce • · ··«* ► · · · ·· · ··· v němž n znamená číslo 2 nebo 3 a každé R nezávisle znamená atom vodíku, alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo aryl a jeden R je kovalentně navázán na sloučeninu, která váže receptor kalcitoninu, a

k) desferrioxaminu.

4. Reakční činidlo podle nároku 3, vyznačující se tím, že chelátor je vybrán ze skupiny sestávající ze sloučenin následujících obecných vzorců -(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}n-X},

-{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}_n-X}-(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²,

-(primární α,β- nebo B,y-diaminokyselina)-(aminokyselina)¹-{A-CZ(B)-{CfR^^-XJ-a

-{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}_n-X}-(aminokyselina)¹-{pnmámí α,β- nebo α,γ-diaminokyselina), pň čemž každá (aminokyselina)¹ a (aminokyselina)² nezávisle znamená jakoukoliv v přírodě se vyskytující, modifikovanou, substituovanou nebo pozměněnou a- nebo β-aminokyselinu, která neobsahuje thiolovou skupinu.

5. Reakční činidlo podle nároku 4, v y z n a č u j í c í se t í m, že chelátor je vybrán ze skupiny sestávající ze sloučenin následujících vzorců (aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-cystein,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-isocystein,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-homocystein,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-penicilamin,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-2-merkaptoethylamin,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-2-merkaptopropylamin,(aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-2-merkpato-2-methylpropylamin-a (aminokyselina)¹-(aminokyselina)²-3-merkaptopropylaminv nichž karboxylový konec nebo postranní řetězec uvedeného chelátoru je kovalentně navázán na sloučeninu.

• · · · • 9 9 9

999 <

6. Reakční činidlo podle nároku 5, vyznačující se tím, že (aminokyselina)¹ je vybrána ze skupiny sestávající z α,β-diaminokyseliny, která má volný α-amin, a β,γ-diaminokyseliny, která má volný β-amin.

7. Reakční činidlo podle nároku 4, vyznačující se tím, že chelátor je vybrán ze skupiny sestávající ze sloučenin následujících vzorců -cystein-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina), -isocystein-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina), -homocystein-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina), -penicilamin-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina), 2-merkaptooctová kyselina-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina),

2- nebo 3-merkaptooctová kyselina-(aminokyselina)-(a,ft- nebo β,γ-diaminokyselina) a

2-merkapto-2-methylpropionová kyselina-(aminokyselina)-(a,B- nebo β,γ-diaminokyselina), při čemž aminový konec nebo postranní řetězec uvedeného chelátoru je kovalentně navázán na sloučeninu.

8. Reakční činidlo podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že chelátor je vybráno ze skupiny sestávající ze sloučenin následujících vzorců

-Gly-Gly-Cys-Ala-Gly-Cys-,

-(s-Lys)-Gly-Cys-(Ó-Om)-Gly-Cys-,

-(y-Dab)-Gly-Cys-(B-Dap)-Lys-Cys-,

-(B-Dap)-Gly-Cys- a -Cys(BAT).

9. Reakční činidlo podle nároku 3, vyznačující se tím, že chelátor znamená sloučeninu obecného vzorce ·· ···· , R ο R⁵^—ο

R'

L-Z

Ft v nemz

R¹ a R² nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, hydroxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) nebo alkoxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku), R³, R⁴, R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl, který neobsahuje thiolovou skupinu,

R⁷ a R⁸ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, nižší hydroxyalkyl nebo nižší alkoxyalkyl,

L znamená dvojvaznou vázací skupinu a Z znamená peptid.

10. Reakční činidlo podle nároku 3, v y z n a č u j í c í se t í m, že chelátor znamená sloučeninu obecného vzorce

R o n// o

Cl MU UU ll

X v němž

R¹ a R² nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, hydroxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) nebo alkoxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku), φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ ·♦· φ φ φ® φ* • Φ φφφ· • · · φφφ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl, který neobsahuje thiolovou skupinu, a jedna ze skupinu R³, R⁴, R⁵ a R⁶ znamená skupinu Z-L-(CR₂)_nR⁷ a R⁸ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, nižší hydroxyalkyl nebo nižší alkoxyalkyl,

L znamená dvojvaznou vázací skupinu,

Z znamená peptid a

X znamená skupinu -NH₂, -NR¹R² nebo -NR¹-Y, kde Y znamená aminokyselinu, amid aminokyseliny nebo peptid se 2 až 20 aminokyselinami.

11. Reakční činidlo podle nároku 3, vyznačující se tím, že chelátor znamená sloučeninu obecného vzorce v němž

R¹ a R² nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, nižší alkyl, hydroxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku) nebo alkoxyalkyl(se 2 až 4 atomy uhlíku), R³, R⁴, R⁵ a R⁶ nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný nižší alkyl nebo fenyl, který neobsahuje thiolovou skupinu, n znamená číslo od 1 do 6,

L znamená dvojvaznou vázací skupinu a Z znamená peptid.

49 4449 • 9 · · • 4 99

94 99

9 9 4

9 9 9

444 499

4 4

49 44

Reakční činidlo podle nároku 3, vyznačující znamená sloučeninu obecného vzorce se t i m, že chelátor

Z-L

NH, v němž

L znamená vazebnou skupinu a Z znamená peptid.

13. Reakční činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, vyznačující se t i m, že se jako sloučenina používá peptid.

14. Reakční činidlo podle nároku 13, vyznačující se tím, že peptid má aminokyselinovou sekvenci

CHyCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 9) a chelátor je do peptidů zahrnut v postranním řetězci aminokyseliny uvedené skevence.

15. Reakční činidlo podle nároku 13, vyznačující se tím, že peptid obsahuje doménu vázající receptor kalcitoninu, která je cyklizována thioetherem.

16. Reakční činidlo podle nároku 15, v y z n a č u j i c i se t i m, že peptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci •· ·♦*·

CH?CO.SNLSTX(sekv. id. č. 10), v níž X je vybráno ze skupiny sestávající z cysteinového zbytku, homocysteinového zbytku a homohomocysteinového zbytku.

17. Reakční činidlo podle nároku 15, v y z n a č u j í c í se t í m, že peptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci

CH_?CO.X¹SNLSTX²(sekv. id. č. 11), v níž X¹ je vybráno ze skupiny sestávající z alaninového zbytku, glycinového zbytku a serinového zbytku a

X² je vybráno ze skupiny sestávající z cysteinového zbytku, homocysteinového zbytku a homohomocysteinového zbytku.

18. Reakční činidlo, vyznačující se tím, že má vzorec, který je vybrán z následující skupiny

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCíBAT)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 4),

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTPfe-K)GC.amid_:

CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH,CO.GGCK.amid))ELHKLQTYPRTNTG.

.SGTP.amid,

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH,CO.(B-Dap)KCK.amid)ELHKLQTYPRT· .NTGSGTP.amid,

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCfCH_?CQ.fe-K)GCE.amid))ELHKLQTYPRT· .NTGSGTP.amid,

CH_?CO.SNLST.Hcy.VLGKLSC(CH,CO.GGCK.amid)ELHKLQIYPRTNTG· .SGTP.amid,

CH_?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.(B-Dap)KCKamid))ELHKLQTYPRT· .NTGS.GTP.amid,

CH_?CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCfCHoCO.(8-K)GCE.amid)ELHKLQTYPRTNT· .GSGTP.amid, •4 4444

44 44 > 4 4 · » 4 4 4

444 444

4 4

44 44

CH_?CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH_?CQ.GGCKamid)ELHKLQTYPRTNTG· .SGTP.amid

CHgCO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH_?CO.(B-Dap)KCKamid)LHKLQPfPRT.

.NTGSGTP.amid,

CH_?CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH_?CO.fe-K)GCE.amid)ELHKLQIYPRTNTGS· .GTP.amid,

SNLSTAsu_iVLGKLSC(CH₂CO.(B-Dap)KCK.amid))ELHKLQTYPRTNTGSGTP.

amid,

SNLSTAcu_iVLGKLSC(CH₂CO.(B-Dap)KCK.amid)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.

.amid,

CH₂CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 5),

CH₂CO.SNLST.Hcy.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 6),

CH₂CO.SNLST.Cvs.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGS.GTP.amid (sekv. id. č. 7) a

SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amid (sekv. id. č. 8).

19. Reakční činidlo podle nároku 18, vyznačující se tím, že má vzorec CH₂CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH,CO.(E-K)GCE.amid)ELHKLQTYPRTNT· GSGTP.amid.

20. Reakční činidlo, které obsahuje

a) alespoň dvě syntetické sloučeniny, které vážou receptor kalcitoninu, při čemž každá tato sloučenina je kovalentně navázána na chelátor s radioaktivním kovem, a

b) polymemí linker tvořící kovalentní vazbu, která je vybrána ze skupiny sestávající z vazby na každou sloučeninu, vazby na každý chelátor a vazby na jednu sloučeninu a chelátor jiné sloučeniny, vyznačující se tím, že

9 99 99

99 9 99 9

9 9 9 9 9

9 9 999 999

9 9 9 ··· 99 99 ·· ·*·· g>

reakční činidlo ma molekulovou hmotnost menší než 10 000 a jestliže je chelátor chelatačně navázán na radioaktivní kov, reakční činidlo má vazebnou afinitu na receptor kalcitoninu ne menší než jednu desetinu vazebné aktivity radioaktivním jodem označeného přírodního kalcitoninu na uvedený receptor.

21. Scintigrafické zobrazovací činidlo, vyznačující se tím, že obsahuje reakční činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 a technecium-99m.

22. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje reakční činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 a cínatý ion.

23. Radioterapeutické činidlo, vyznačující se tím, že obsahuje reakční činidlo podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 a cytotoxický radioisotop.

24. Radioterapeutické činidlo podle nároku 23, v y z n a č u j í c í se t í m, že radioisotop je vybrán ze skupiny sestávající ze skandia-47, mědi-67, galia-72, ytria-90, cínu-117m, jodu-125, jodu-131, samaria-153, gadolinia-159, dysprosia-165, holmia-166, yterbia-175, lutecia-177, rhenia-186, rhenia-188, astatu-211, vismutu-212 a vismutu-213.

25. Komplex, vyznačující se tím, že se vytvoří zreagováním reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 s techneciem-99m, rheniem-186 nebo rheniem-188 v přítomnosti redukčního činidla.

26. Komplex podle nároku 25, v y z n a č u j í c í se t í m, že redukčním činidlem je cínatý ion.

27. Komplex, vyznačující se t í m, že se vytvoří označením reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 techneciem-99m výměnou ligandu komplexu předem zredukovaného techneciem-99m.

• φ 9 99 9

ΦΦ ΦΦ

9 9 · · · * · 9 9 9 9 « φ « Φ Φ ΦΦΦΦ • 9 9 9 Φ · · ΦΦΦΦΦΦ

ΦΦΦΦ Φ Φ ΦΦ φφ ·· ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ

28. Komplex, vyznačující se tím, že se vytvoří označením reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 rheniem-186 nebo rheniem-188 výměnou ligandu komplexu předem zredukovaného rheniem.

29. Sestava pro přípravu radiofarmaceutického přípravku, vyznačující se t í m, že obsahuje zatavenou nádobku obsahující předem stanovené množství reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 a dostatečné množství redukčního činidla pro označení reakčního činidla techneciem-99m, rheniem-186 nebo rheniem-188.

30. Sestava pro přípravu radioaktivního přípravku, vyznačující se tím, že obsahuje zatavenou nádobku obsahující předem stanovené množství reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20.

31. Způsob označení reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň zreagování reakčního činidla s techneciem-99m, rheniem-186 nebo rheniem-188 v přítomnosti redukčního činidla.

32. Způsob označení reakčního činidla podle nároku 30, vyznačující se t í m, že redukčním činidlem je cínatý ion.

33. Způsob výroby reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, vyznačující se t í m, že se provádí chemicky syntézou in vitro.

34. Způsob výroby reakčního činidla podle nároku 33, vyznačující se t í m, že syntéza znamená syntézu peptidu v pevné fázi.

99 99

9 9 9 9

9 9 9 9

999 999

9 9

99 99 ·· ··♦· * ·

9 9 · ·· ·· • · · · · • · Φ · · ·

9 9 9 9 Φ ·

99 99 99 9 999

35. Způsob výroby reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároku 33 nebo 34, v y značující se tím, že chelátor je během syntézy kovalentně navázán na sloučeninu.

36. Použití reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 pro výrobu léčiva pro zobrazení místa v tělu savce.

37. Použití reakčního činidla podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20 pro výrobu léčiva pro léčení onemocnění, pro které je charakteristické přítomnost receptorů kalcitoninu.