CZ361499A3 - Novel process for preparing antigenic receptors and their use - Google Patents

Abstract

Described is a method for the production of an anti-human antigen receptor that is low or not immunogenic in humans comprising the steps of selecting a combination of functionally rearranged VH and VL immunoglobulin chains wherein at least said VH chain is derived from essentially unprimed mature human B-lymphocytes or from essentially anergic human B cells and said VL chain is derived from a naturally occurring human B cell repertoire, said chains being expressed from a recombinant vector and using an in vitro display system for binding to a human antigen. Furthermore, receptors that are low or not immunogenic in humans and directed to human antigens are provided, said receptors being obtainable by the method of the invention. Said receptors are preferably antibodies or fragments thereof or immunoconjugates comprising the VH/VL chains of said antibody. In particular, receptors are described directed to human tumor antigens, preferably to the human tumor antigen 17-1A, also known as EpCAM, EGP or GA 733-2. Finally, kits useful for carrying out the method of the invention and pharmaceutical compositions comprising the aforementioned receptors are provided.

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu produkce anti-lidského antigenního receptoru, který je málo imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kterýžto způsob obsahuje kroky selekce a kombinace funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, kde alespoň uvedený řetězec VH pochází ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě nesenzibilizované (naivní), nebo z lidských B buněk, které jsou vpodstatě anergní, a zmíněný řetězec VL pochází z repertoáru přirozeně se vyskytujících lidských B buněk, přičemž uvedené řetězce jsou exprimovány pomocí rekombinantního vektoru a používají in vitro detekční (expoziční) systém na vazbu k lidskému antigenu.The present invention relates to a method of producing an anti-human antigen receptor that is poorly immunogenic or not immunogenic to humans, the method comprising the steps of selecting and combining functionally rearranged immunoglobulin VH and VL chains, wherein at least said VH chain is derived from mature human B lymphocytes they are essentially non-sensitized (naive) or substantially B-cell human B cells and said VL chain is derived from a repertoire of naturally occurring human B cells, said chains being expressed using a recombinant vector and using an in vitro detection (exposure) system for binding to a human antigen.

Předkládaný vynález se dále týká receptorů, které jsou jen slabě imunogenní nebo nejsou imunogenní pro člověka a jsou namířeny proti lidským antigenům, přičemž uvedené receptory se dají získat způsobem podle vynálezu. Uvedené receptory jsou výhodně protilátky nebo jejich fragmenty nebo imunokonjugáty obsahující řetězce VH/VL zmíněné protilátky. Receptory podle -vynálezu jsou namířeny zejména proti lidským nádorovým antigenům, výhodně proti lidskému nádorovému antigenu 17-1 A, známému také jako EpCAM, EGP nebo GA 733-2. A nakonec se předkládaný vynález týká diagnostických souprav (kitů) použitelných pro provádění způsobu podle vynálezu.The present invention further relates to receptors which are only weakly immunogenic or not immunogenic to humans and are directed against human antigens, said receptors being obtainable by the method of the invention. Said receptors are preferably antibodies or fragments thereof or immunoconjugates comprising VH / VL chains of said antibody. In particular, the receptors of the invention are directed against human tumor antigens, preferably against human tumor antigen 17-1 A, also known as EpCAM, EGP or GA 733-2. Finally, the present invention relates to diagnostic kits useful for carrying out the method of the invention.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Imunitní systémy savců, jako je lidský imunitní systém, rozpoznávají imunokompetentní buňky a molekuly, které jsou specifické pro autoantigeny. Porucha regulace imunitního systému z tohoto hlediska ,*· ': .·· '· • · · · • · · · · · • · • · · · může mít za následek autoimunitní nemoci, jako je revmatoidní artritida. Obecně je tudíž imunitní dohled vzhledem k autoreaktivním protilátkám nebo T buňkám vysoce prospěšný. Avšak může nastat případ, kdy je výhodné mít autoreaktivní protilátky, které jsou namířeny proti antigenům exprimovaným v savčím a zejména v lidském těle. Takové antigeny jsou například nádorové antigeny. Například bylo ukázáno, že lidský antigen 17-1A nebo EpCAM, povrchový glykoprotein exprimovaný buňkami jednoduchého epitelu a maligními nádory, které z něho vycházejí, je vhodný cíl pro monoklonální protilátku při léčbě rakoviny, zejména u pacientů s minimální reziduální nemocí, kteří mají diseminované nádorové buňky, které mohou později způsobit solidní metastázy, a tak zhoršit pacientovu prognózu. U pacientů s minimální reziduální kolorektální rakovinou snížila myší monoklonální protilátka specifická pro lidský' antigen 17-1A pětiletou úmrtnost o 30 % ve srovnání s neléčenými pacienty při systémové aplikaci v pěti dávkách během čtyř měsíců po chirurgickém odstranění primárního nádoru, každý pacient byl léčen celkem 900 mg protilátky (Riethmůller, Lancet, 343, 1177-1183, 1994). Ale v průběhu léčby protilátkou se u pacientů vyvinula silná protilátková reakce proti myšímu imunoglobulinu. Tyto lidské proti-myší protilátky (HAMAs) silně omezují kontinuální podávání protilátkové léčby a stoupající měrou snižují její účinnost. Kromě toho předem vytvořené HAMAs indukované dřívější protilátkovou léčbou nebo jiným kontaktem s myším imunoglobulinem mohou vážně interferovat s pozdější léčbou protilátkou.Mammalian immune systems, such as the human immune system, recognize immunocompetent cells and molecules that are specific for autoantigens. A defect in the regulation of the immune system in this regard may result in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. Thus, in general, immune surveillance with respect to autoreactive antibodies or T cells is highly beneficial. However, there may be cases where it is preferable to have autoreactive antibodies that are directed against antigens expressed in the mammalian, and particularly in the human body. Such antigens are, for example, tumor antigens. For example, human 17-1A or EpCAM antigen, a surface glycoprotein expressed by single epithelial cells and malignant tumors arising therefrom, has been shown to be a suitable target for monoclonal antibody in cancer treatment, particularly in patients with minimal residual disease who have disseminated tumor cells that can later cause solid metastases and thus worsen the patient's prognosis. In patients with minimal residual colorectal cancer, the murine monoclonal antibody specific for the human 17-1A antigen reduced the 5-year mortality by 30% compared to untreated patients at systemic administration at five doses within four months of surgical removal of the primary tumor, each patient being treated for a total of 900 mg of antibody (Riethmuller, Lancet, 343, 1177-1183, 1994). However, during antibody treatment, patients developed a strong antibody response against mouse immunoglobulin. These human anti-mouse antibodies (HAMAs) strongly limit the continuous administration of antibody treatment and increasingly reduce its efficacy. In addition, preformed HAMAs induced by prior antibody treatment or other contact with mouse immunoglobulin can seriously interfere with later antibody treatment.

Aby se předešlo těmto problémům, jsou výhodnější léčebné protilátky minimálně imunogenní. Pro dosažení tohoto cíle se může například uvažovat o tom, že léčebné protilátky⁷ nebo jejich deriváty jsou kompletně lidské svou aminokyselinovou sekvencí a imunogenní profil lidské idiotypové protilátky se minimalizuje použitím variabilních oblastí lidských imunoglobulinů, u kterých je pravděpodobné, že budou tolerovány lidským imunitním systémem.To avoid these problems, more preferred therapeutic antibodies are at least immunogenic. For example, to achieve this goal, therapeutic antibodies ⁷ or derivatives thereof may be considered to be completely human by their amino acid sequence and the immunogenic profile of a human idiotypic antibody is minimized using human immunoglobulin variable regions likely to be tolerated by the human immune system.

• ·• ·

Ale příprava lidských protilátek proti lidským antigenům čelí dvěma hlavním problémům:But the preparation of human antibodies against human antigens faces two major problems:

1) ukázalo se, že hybridom nebo jiné techniky⁷ buněčné imortalizace jsou zcela neúčinné pro vznik buněčných linií produkujících lidské protilátky ve srovnání s technologií myších hybridomů.1) Hybridoma or other cell immortalization techniques ^{7 have} been shown to be totally ineffective for the generation of human antibody producing cell lines as compared to mouse hybridoma technology.

2) autoreaktivní protilátky⁷ jsou relativně účinně zbaveny repertoáru přirozeně se vyskytujících protilátek díky⁷ mechanismu zprostředkované au to tolerance.2) autoreactive antibodies ⁷ are relatively effectively deprived of the repertoire of naturally occurring antibodies due to the ⁷ mechanism mediated and to tolerance.

Lidské protilátky se všeobecně staly dostupnější díky⁷ použitelnosti transgenních myší exprimujících lidské protilátky (Bruggemann, Immunol. Today, 17, 391-397, 1996) a díky technikám kombinační protilátkové knihovny a fágové expozice (tj. technika phage display pro kterou není dosud ustálený český⁷ termín, umožňuje detekovat gen, např. cDNA, klonovaný do fága, exponovaný po expresi v bakteriích, např. pomocí protilátek, a pak izolovat klon exprimující požadovaný gen,), které umožňují in vitro kombinaci variabilních oblastí imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců (VH a VL) a in vitro selekci podle specifické vazby antigenu (Winter, Annu. Rev. Immunol., 2, 433-455, 1994). Použitím metody fágové expozice mohou být snadno izolovány vzácné jevy⁷, jako je jedna specifická vazebná skupina z 10⁷ až 10⁹ různých párů VL/VH nebo VH/VL, což je obzvláště spolehlivé, když byl repertoár variabilních oblastí obohacen o specifické vazebné skupiny použitím B lymfocytů z imunizovaných hostitelů jako zdroje pro klonování repertoáru.Human antibodies have generally become more accessible due to the ⁷ usability of transgenic mice expressing human antibodies (Bruggemann, Immunol. Today, 17, 391-397, 1996) and combination antibody library and phage display techniques (ie, phage display technique for which Czech is not yet established). ⁷ , allows to detect a gene, e.g., cDNA, cloned into phage, exposed after expression in bacteria, e.g., by antibodies, and then isolate a clone expressing the gene of interest, which allows in vitro combination of immunoglobulin heavy and light chain variable regions (VH). and VL) and in vitro selection according to specific antigen binding (Winter, Annu. Rev. Immunol., 2, 433-455, 1994). By using the phage exposure method, rare events ⁷ such as one specific binding group of 10 ⁷ to 10 ⁹ different VL / VH or VH / VL pairs can be easily isolated, which is particularly reliable when the variable region repertoire has been enriched for specific binding groups using B lymphocytes from immunized hosts as a source for cloning the repertoire.

Avšak často je v repertoárech přirozeně se vyskytujících protilátek výskyt specifických vazebných skupin podstatně snížen. To je pravdivé zejména u případů protilátek vázajících se na autoantigeny. Náhodné kombinace oblastí VL a VH au to tolerantního hostitele mající za následek kombinační protilátkové knihovny obvyklé velikosti (10⁷ až 10⁹ nezávislých klonů) často nejsou postačující pro úspěšnou in vitro selekci autoreaktivních protilátek metodou fágové expozice.However, in the repertoire of naturally occurring antibodies, the occurrence of specific binding groups is often significantly reduced. This is particularly true for autoantigen binding antibodies. Random combinations of VL and VH regions and a tolerant host resulting in combinatorial antibody libraries of conventional size (10 ⁷ to 10 ⁹ independent clones) are often not sufficient for successful in vitro selection of autoreactive antibodies by phage display.

Jednou strategií, jak obejít tento problém, je použití velmi rozsáhlých kombinačních protilátkových knihoven, které svou velikostí kompenzují »· · · · ·4 malý výskyt autoreaktivních protilátek v přirozeně se vyskytujících repertoárech. Ale je obtížné získat kombinační protilátkové knihovny překračující velikost 10⁹ nezávislých klonů díky současnému technickému limitu účinnosti transformace plazmidové DNA do buněk E. coli.One strategy to overcome this problem is to use very large combinatorial antibody libraries that compensate for the low incidence of autoreactive antibodies in naturally occurring repertoires. However, it is difficult to obtain combination antibody libraries in excess of 10 ⁹ independent clones due to the current technical limit of the efficiency of transformation of plasmid DNA into E. coli cells.

Aby se zabránilo systematické chybě vyvolané autotolerancí v repertoárech přirozeně se vyskytujících protilátek, kdy jsou autoreaktivní protilátky⁷ zachycovány ve snížené míře a významně se snižují šance na izolaci protilátek specificky rozpoznávajících autoantigeny, byly vyvinuty postupy používající semisyntetické nebo zcela syntetické repertoáry⁷ řetězců VH a/nebo VL. Například byl klonován téměř úplný repertoár nepřestavěných segmentů lidského V genu z genomové DNA a použit pro in vitro rekombinace funkčních genů variabilní oblasti, připomínající V-Jnebo V-D-J- rekombinace in vivo (Hoogenboom, J. Mol. Biol., 227, 381388, 1992, Nissim, EMBO J., 13, 692-698, 1994, Griffiths, EMBO J., 13, 3245-3260, 1994). Obvykle je diverzita spojení V-D-/D-J- a D-segmentu, která je převážně zodpovědná za neobvyklou délku a sekvenční variabilitu těžkého řetězce CDR3, a také diverzita spojení V-J-, která přispívá k sekvenční variabilitě lehkého řetězce CDR3, imitována náhodnými sekvencemi používajícími degenerované oligonukleotidy v postupech plně syntetických a semisyntetických (Hoogenboom, 1994, viz výše, Nissim, viz výše, Griffiths, viz výše, Barbas, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89, 44574461, 1992).In order to avoid a systematic error induced by self-tolerance in the repertoires of naturally occurring antibodies, where autoreactive antibodies ^{7 are} captured to a reduced extent and the chances of isolation of antibodies specifically recognizing autoantigens are significantly reduced, procedures using semi-synthetic or fully synthetic repertoires of ⁷ VH and / or VL. For example, an almost complete repertoire of untranslated human V gene segments from genomic DNA was cloned and used for in vitro recombination of functional variable region genes resembling V-J or VDJ-recombination in vivo (Hoogenboom, J. Mol. Biol., 227, 381388, 1992, Nissim, EMBO J., 13, 692-698, 1994; Griffiths, EMBO J., 13, 3245-3260, 1994). Typically, the VD- / DJ- and D-segment junction diversity, which is largely responsible for the unusual length and sequence variability of the CDR3 heavy chain, as well as the VJ- junction diversity, which contributes to CDR3 light chain sequence variability, is imitated by random sequences using degenerate oligonucleotides. in fully synthetic and semi-synthetic procedures (Hoogenboom, 1994, supra, Nissim, supra, Griffiths, supra, Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 44574461, 1992).

Ale u párů VL/VH nebo VH/VL vybraných pro vazbu k lidskému antigenů z těchto semisyntetických nebo zcela syntetických repertoárů založených na sekvencích lidského V genu je riziko, že mohou tvořit imunogenní epitopy, které mohou u lidí indukovat nežádoucí imunitní reakci (Hoogenboom, TIBTECH, 15, 62-70, 1997), zejména oblasti CDR3 pocházející z repertoárů úplně randomizovaných (náhodných) sekvencí jsou předurčené ke tvorbě potenciálně imunogenních epitopů, protože nikdy nebyly vystaveny imunitnímu dohledu člověka, aniž by byly rozpoznány jako cizorodý antigen a v důsledku toho později eliminovány. Stejně tak to platí pro lidské protilátky z transgenních myší exprimujících ·· • · · · • · · · · · . 9.· · ».« ·• · « ♦ * * · ··«· »· lidské protilátky, protože tyto molekuly imunoglobulinů byly vybrány pro to, zeje toleruje myší, ale už ne lidský imunitní systém.However, VL / VH or VH / VL pairs selected for binding to human antigens from these semi-synthetic or fully synthetic repertoires based on human V gene sequences are at risk of forming immunogenic epitopes that can induce an unwanted immune response in humans (Hoogenboom, TIBTECH , 15, 62-70, 1997), particularly CDR3 regions derived from repertoires of completely randomized sequences are destined to generate potentially immunogenic epitopes because they have never been exposed to human immune surveillance without being recognized as a foreign antigen and consequently later eliminated. The same is true for human antibodies from transgenic mice expressing. 9. Human antibodies, because these immunoglobulin molecules were chosen to tolerate the mouse but no longer the human immune system.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Technickým problémem, který je řešen předkládaným vynálezem, bylo poskytnout způsob, který umožňuje přípravu receptorů, které jsou slabě imunogenní nebo nejsou imunogenní pro člověka a které mohou být použity pro cílení antigenů v lidském těle. Řešení uvedeného technického problému bylo dosaženo provedeními vynálezu, jejichž význaky jsou popsány v patentových nárocích.The technical problem that is solved by the present invention was to provide a method that allows the preparation of receptors that are weakly immunogenic or not immunogenic to humans and which can be used to target antigens in the human body. The solution to said technical problem has been achieved by embodiments of the invention, the features of which are described in the claims.

Předkládaný vynález se tudíž týká způsobu přípravy anti-lidského antigenního receptorů, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kterýžto způsob obsahuje kroky selekce a kombinace funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, kde alespoň uvedený řetězec VH pochází ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě nesenzibilizované (naivní), nebo z lidských B buněk, které jsou vpodstatě anergní, a zmíněný řetězec VL pochází z repertoáru přirozeně se vyskytujících lidských B buněk, uvedené řetězce jsou exprimovány pomocí rekombinantního vektoru a používají in vitro detekční (expoziční) systém pro vazbu k lidskému antigenů.Accordingly, the present invention relates to a method for preparing anti-human antigen receptors that is weakly immunogenic or not immunogenic to humans, the method comprising the steps of selecting and combining functionally rearranged immunoglobulin VH and VL chains, wherein at least said VH chain is derived from mature human B cells, which are substantially non-sensitized (naive) or substantially B-cell human B cells and said VL chain is derived from a repertoire of naturally occurring human B cells, said chains being expressed using a recombinant vector and using an in vitro detection (exposure) system for binding to human antigens.

Způsob podle předkládaného vynálezu je výhodný pro přípravu receptorů, které mohou být použity pro cílení antigenů u lidí a které samy nejsou imunogenní bud vůbec nebo alespoň ne do významné míiy. Tyto receptory mohou být výhodně použity pro léčbu celé řady nemocí jako nádorů nebo autoimunitních chorob, rejekce (odhojení) štěpu po transplantaci a infekčních nemocí, a to tím, že se cílí na buněčné receptory, a nebo k léčení nemocí alergických, zánětlivých, endokrinních a degenerativních tím, že se cílí na klíčové molekuly zapojené do patologického procesu.The method of the present invention is advantageous for the preparation of receptors that can be used to target antigens in humans and which themselves are not immunogenic either at all or at least not to a significant extent. These receptors can be advantageously used to treat a variety of diseases such as tumors or autoimmune diseases, graft rejection after transplantation and infectious diseases, by targeting cellular receptors, or to treat allergic, inflammatory, endocrine, and endocrine diseases. degenerative by targeting key molecules involved in the pathological process.

»·· *·· ··· ·««·»··· ··· ·« «·

9- . ' ·: :9-. '·::

Imunoglobulínové řetězce VH/VL receptorů předkládaného vynálezu mohou být ovšem dále zkoumány, co se týče jejich sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových sekvencí s použitím technik v oboru známých, viz např. Sambrook (Molecular Cloning, A Laboratory Manual,The immunoglobulin chains of the VH / VL receptors of the present invention may, however, be further investigated for their nucleic acid and amino acid sequences using techniques known in the art, see, eg, Sambrook (Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

1989). Jakmile byla jednou určena sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselinová sekvence, mohou být receptory podle vynálezu připraveny také jinými metodami, jako jsou syntetické nebo semisyntetické metody poskytující syntetické nebo semisyntetické receptory, nebo v transgenních myších exprimujících lidské imunoglobulínové receptory, čili receptory nesoucí vlastnosti vyjmenované výše v tomto textu a tvořené takovými syntetickými nebo semisyntetickými metodami nebo v transgenních myších jsou také zahrnuty do rámce předkládaného vynálezu.1989). Once the nucleic acid sequence or amino acid sequence has been determined, the receptors of the invention can also be prepared by other methods, such as synthetic or semisynthetic methods, providing synthetic or semisynthetic receptors, or in transgenic mice expressing human immunoglobulin receptors, or receptors bearing the properties listed above. and produced by such synthetic or semisynthetic methods or in transgenic mice are also included within the scope of the present invention.

Po navázání receptorů na lidský antigen může být receptor dále purifikován. Například nenavázané receptory, které nenesou antigenní specifitu, mohou být odstraněny promýváním. Navázaný receptor může být eluován z lidského antigenu a dále purifikován, mohou být použity další cykly exprese, vazby a selekce požadovaného receptorů, dokud není požadovaný receptor a/nebo odpovídající rekombinantní vektor izolován v čisté formě.After binding of the receptors to the human antigen, the receptor can be further purified. For example, unbound receptors that do not carry antigen specificity can be removed by washing. The bound receptor can be eluted from the human antigen and further purified, further cycles of expression, binding, and selection of the desired receptor can be used until the desired receptor and / or the corresponding recombinant vector is isolated in pure form.

Způsob předkládaného vynálezu tedy používá třídění variabilních oblastí imunoglobulinů lidským imunitním systémem. Receptory pocházejí z repertoáru vybraného ín vitro z lidských kombinačních protilátkových knihoven výlučně nebo přednostně vytvořených z repertoáru přirozeně se vyskytujících protilátek exprimovaných zralými lidskými lymfocyty B, které jsou v podstatě nesenzibilizované, nebo lidskými B buňkami, které jsou v podstatě anergní.Thus, the method of the present invention employs the classification of immunoglobulin variable regions by the human immune system. The receptors originate from a repertoire selected in vitro from human combination antibody libraries exclusively or preferentially generated from a repertoire of naturally occurring antibodies expressed by mature human B lymphocytes that are substantially non-sensitized or by human B cells that are substantially anergic.

Ale imunoglobulínové variabilní domény mohou také pocházet z celé řady dalších zdrojů, které představují tyto předem vybrané populace B buněk.However, immunoglobulin variable domains may also come from a variety of other sources that represent these pre-selected B cell populations.

Vědecký podklad pokud se týká původu B buněk fungujících jako zdroj uvedených řetězců VH nebo VL může být vysvětlen následovně:The scientific background regarding the origin of B cells acting as a source of said VH or VL chains can be explained as follows:

• · · · · ·'*· '··· · e · • · · · « · · • · • · « · • ·· * * * * * E e e * e * * e * e * e

Zralé nesenzibilizované (naivní) B lymfocyty, které exprimují IgD a IgM jako membránové antigenní receptory, vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální selekci, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními, a žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů.Mature non-sensitized (naive) B cells that express IgD and IgM as membrane antigen receptors enter the primary follicles during their journey to and between secondary lymphoid organs until they encounter a multivalent autoantigen resulting in clonal selection, or with soluble monovalent autoantigen, thereby becoming anergic, and living shortly due to exclusion from primary follicles.

Kontakt nezralých B buněk, které exprimují výlučně IgM, s autoantigenem v kostní dřeni má za následek klonální delecí nebo anergii v závislosti na valenci antigenu. Anergní B buňky, ačkoliv exprimují povrchový IgD, jsou neschopné odpovídat tímto receptorem na antigen; bez přístupu do primárních folikulů a v nepřítomnosti pomocných T buněk tyto buňky mají poločas života krátký pouze několik dnů.Contact of immature B cells that express exclusively IgM with autoantigen in the bone marrow results in clonal deletion or anergy depending on the antigen valency. Anergic B cells, although expressing surface IgD, are unable to respond to this antigen receptor; without access to primary follicles and in the absence of helper T cells, these cells have a half-life of only a few days.

Na rozdíl od toho zralé naivní B lymfocyty, které se nesetkaly s autoantigenem a mají tudíž přístup do primárních folikulů, mají poločas života dlouhý několik týdnů. Navzdory popsaným mechanismům zprostředkovávajícím autotoleranci si tyto populace dlouho žijících zralých naivních B lymfocytů stále udržují potenciálně autoreaktivní B buňky, je ale nepravděpodobné, že naleznou specifickou pomoc T buněk díky T buněčné toleranci, a tak je zadržena jejich proliferace a sekrece protilátek. Ukazuje se, že neodpovídavost B buněk na mnoho autoantigenů, které se vyskytují v nízkých hladinách, je tohoto typu, ovlivňující pomocné T buňky, ale ne B buňky. V předkládaném vynálezu jsou tyto dlouho žijící neodpovídavé potenciálně autoreaktivní zralé naivní B lymfocyty identifikovány jako nej slibnější repertoár přirozeně se vyskytujících lidských protilátek pro konstrukci kombinačních protilátkových knihoven vhodných zejména pro výběr lidských protilátek k lidským antigenům, například metodou fágové expozice.In contrast, mature naive B cells that have not encountered autoantigen and therefore have access to primary follicles have a half-life of several weeks. Despite the described mechanisms mediating autotolerance, these long-lived mature naïve B cell populations still retain potentially autoreactive B cells, but are unlikely to find specific T cell help due to T cell tolerance, thus retaining their proliferation and antibody secretion. It appears that B cell irresponsibility to many autoantigens that occur at low levels is of this type affecting helper T cells but not B cells. In the present invention, these long-lived, non-responding potentially autoreactive mature naive B cells are identified as the most promising repertoire of naturally occurring human antibodies for the construction of combinatorial antibody libraries particularly suitable for selecting human antibodies to human antigens, for example by phage display.

Lze očekávat, že tento vysoce selektovaný repertoár protilátek použitý jako základ pro předkládaný vynález, pocházející hlavně z B buněk s dlouhým poločasem života in vivo, které jsou tudíž vystaveny lidskému imunitnímu systému po delší dobu, je významně ochuzen o protilátkové ··. · · « • · ♦ · · • 9· · 99 molekuly tvořící epitopy, zejména ve vysoce variabilních oblastech CDR3, které jsou imunogenní pro lidský imunitní systém. Proto se očekává, že lidské protilátky vybrané z tohoto repertoáru protilátek mají u člověka nižší imunogenní profil, než lidské protilátky vybírané z semisyntetických nebo plně syntetických knihoven lidských protilátek.This highly selected antibody repertoire used as the basis for the present invention, predominantly derived from long-lived in vivo B cells and thus exposed to the human immune system for extended periods of time, can be expected to be significantly depleted of antibody antibodies. 99 epitope-forming molecules, particularly in highly variable regions of CDR3 that are immunogenic to the human immune system. Therefore, human antibodies selected from this antibody repertoire are expected to have a lower immunogenic profile in humans than human antibodies selected from semi-synthetic or fully synthetic human antibody libraries.

Zralé naivní (nesenzibilizované) B buňky, které jsou aktivovány kontaktem s cizorodým antigenem, zastaví exprese IgD a počnou klonální proliferaci a diferenciaci na plazmatické buňky secernující rozpustný imunoglobulin, časným stadiím protilátkové reakce dominují protilátky⁷ IgM, zatímco později jsou převládající izotypy IgG a IgA, přičemž IgE přispívá malou, ale biologicky důležitou částí protilátkové reakce. Na rozdíl od IgD-negativních zralých, antigenem aktivovaných B lymfocytů exprimujících IgM, IgG, IgA nebo IgE, IgD-pozitivní zralé naivní B buňky dosud nepodstoupily klonální proliferaci, takže kombinační IgD knihovny nezachycují nadměrně protilátkové specifity, které jsou v současné době nebo byly dříve zapojeny do imunitních reakcí obvykle řízených cizorodým antigenem, tudíž se snižuje diverzita repertoáru a plýtvá se místem v knihovně pro protilátkové kandidáty, u nichž je nepravděpodobná vazba autoantigenu. To je ve zřetelném kontrastu se stavem techniky, který doporučuje použití lidské IgM kombinační protilátkové knihovny pro in vitro selekci lidských protilátek proti lidským antigenům z repertoárů přirozeně se vyskytujících lidských protilátek (Hoogenboom, 1997, výše).Mature naive (non-sensitized) B cells, which are activated by contact with a foreign antigen, stop IgD expression and begin clonal proliferation and differentiation into soluble immunoglobulin secreting plasma cells, ⁷ IgM antibodies predominate in the early stages of antibody response, whereas IgG and IgA isotypes are predominant later wherein IgE contributes a small but biologically important part of the antibody response. Unlike IgD-negative mature, antigen-activated B cells expressing IgM, IgG, IgA or IgE, IgD-positive mature naive B cells have not yet undergone clonal proliferation, so that the combination IgD libraries do not capture excess antibody specificities that are presently or previously involved in immune responses usually driven by a foreign antigen, thus reducing the diversity of the repertoire and wasting library site for antibody candidates in which autoantigen binding is unlikely. This is in clear contrast to the prior art that recommends the use of a human IgM combination antibody library for in vitro selection of human antibodies against human antigens from repertoires of naturally occurring human antibodies (Hoogenboom, 1997, supra).

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu je uvedený antigenní receptor imunoglobulin nebo jeho fragment.In a preferred embodiment of the method of the invention said antigen receptor is an immunoglobulin or fragment thereof.

Fragment imunoglobulinu může být každý fragment, který je v oboru znám, jako jsou fragmenty Fab nebo F(ab)2.An immunoglobulin fragment can be any fragment known in the art, such as Fab or F (ab) 2 fragments.

V obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený fragment imunoglobulinu fragment Fv.In a particularly preferred embodiment of the method of the invention said immunoglobulin fragment is an Fv fragment.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu pocházejí alespoň uvedený VH a volitelně uvedený VL imunoglobulinový řetězec z repertoáru lidského IgD.In another preferred embodiment of the method of the invention at least said VH and optionally said VL immunoglobulin chain are derived from a human IgD repertoire.

« ... ΦΦ . ΦΦ •',Φ·. ....-2..·./. -Φ • · · · · • · ·Φ Φ ΦΦΦ φ φ Φ ·Φ· Φ· Φ· »φ • · * ·«... ΦΦ. ΦΦ • ', Φ ·. ....- 2 .. ·. /. -Φ · · · · · · · · Φ · · · · · · ·

Byl učiněn závěr, že tento receptor a výhodně repertoár protilátek vybraných pro nízkou imunogeničnost jsou nejlépe reprezentovány v protilátkové knihovně lidského IgD. IgD je exprimován jako membránový antigenní receptor spolu s povrchovým IgM na zralých naivních B lymfocytech, které vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální deleci, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními a pak žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů. Kromě repertoáru protilátek zralých naivních B lymfocytů, lidské IgD knihovny pouze dále představují ty krátce žijící B buňky, které se staly anergními při kontaktu s rozpustným monovalentním autoantigenem, ale je nepravděpodobné, že přispějí specifickými vazebnými skupinami k povrchovým molekulám lidské buňky připomínajícím multivalentní autoantigeny, které indukují klonální deleci B buněk namísto anergie.It was concluded that this receptor and preferably a repertoire of antibodies selected for low immunogenicity are best represented in the human IgD antibody library. IgD is expressed as a membrane antigen receptor along with surface IgM on mature naïve B lymphocytes that enter primary follicles during their journey to and between secondary lymphoid organs until they encounter a multivalent autoantigen resulting in a clonal deletion, or with soluble monovalent autoantigen, thereby becoming anergic and then living briefly due to exclusion from primary follicles. In addition to the antibody repertoire of mature naïve B cells, human IgD libraries only further represent those short-lived B cells that have become anergic upon contact with soluble monovalent autoantigen but are unlikely to contribute specific binding groups to human cell surface molecules resembling multivalent autoantigens that induce clonal deletion of B cells instead of anergy.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený in vitro detekční systém technika fágové expozice.In another preferred embodiment of the method of the invention said in vitro detection system is a phage exposure technique.

Systém fágové expozice byl v minulosti obyčejně použit pro selekci celé řady peptidů a proteinů, které se vážou na specifické cíle. Na základě této znalosti mohou být imunoglobulinové řetězce VH a VL pohodlně klonovány do vektorů, které také obsahují molekuly použitelné pro systémy fágové expozice. Takové molekuly a vektory jsou v oboru dobře známy (Winter, výše, Barbas, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2, 119-124, 1991) a není třeba je zde detailněji vysvětlovat.The phage display system has been commonly used in the past to select a variety of peptides and proteins that bind to specific targets. Based on this knowledge, VH and VL immunoglobulin chains can be conveniently cloned into vectors that also contain molecules useful for phage display systems. Such molecules and vectors are well known in the art (Winter, supra, Barbas, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 2, 119-124, 1991) and need not be explained in detail herein.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu je uvedená kombinace přestavěných řetězců exprimována v jedné nebo více různých knihovnách.In another preferred embodiment of the method of the invention said combination of rearranged chains is expressed in one or more different libraries.

Toto provedení je zejména výhodné, je-li známo, že řetězec VH nebo VL se váže na specifický cíl a vybere se odpovídající druhý řetězec V, který vytváří nebo zlepšuje vazbu.This embodiment is particularly advantageous when the VH or VL chain is known to bind to a specific target and the corresponding second V chain is selected to form or improve binding.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu uvedený lidský antigen je nádorový antigen.In another preferred embodiment of the method of the invention said human antigen is a tumor antigen.

*4 4 · 4* 4 4 · 4

».......* 4 · '· » 4 4 4»....... * 4 4

444 444 t ”9.....'·' • · • 4 4444 444 t ”9 ..... '·' • · 4 4

Jestliže lidský antigen je nádorový' antigen, je uvedený antigen výhodně exprimován na povrchu uvedeného nádoru. V tomto případě jsou řetězce VH a VL výhodně spojeny s toxinem. Vazba může být provedena na úrovni nukleové kyseliny metodami genetického inženýrství nebo na proteinové úrovni pomocí například chemické vazby/kondenzace.If the human antigen is a tumor antigen, said antigen is preferably expressed on the surface of said tumor. In this case, the VH and VL chains are preferably linked to a toxin. Binding can be performed at the nucleic acid level by genetic engineering methods or at the protein level by, for example, chemical bonding / coupling.

Je zejména výhodné, když uvedený nádorový antigen je antigen 17-1A,It is particularly preferred that said tumor antigen is a 17-1A antigen,

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu uvedený řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo uvedený řetězec VL obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321). Receptory s těmito specifickými oblastmi VH a VL, kde uvedená oblast VL může být spojena s oběmi oblastmi VH, jsou první lidské protilátky, které jsou specifické pro lidský antigen 17-1 A.In another particularly preferred embodiment of the method, said VH chain comprises one of the two sequences shown in Fig. 7 (nucleotides 1 to 381) and Fig. 8 (nucleotides 1 to 339) and / or said VL chain comprises one of the two following sequences shown in Figs. Fig. 6 (nucleotides 1 to 321) and Fig. 9 (nucleotides 1 to 321). Receptors with these specific VH and VL regions, wherein said VL region may be linked to both VH regions, are the first human antibodies that are specific for the human 17-1 A antigen.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu uvedený krok selekce zahrnujeIn another preferred embodiment of the method of the invention said selection step comprises

I) vazbu expozičního prostředku (nosiče) exprimujícího antigenní receptorI) binding the exposure agent (carrier) expressing the antigen receptor

a) na imobilizovaný cílový' antigen nebo jeho fragmenty,(a) immobilized target antigen or fragments thereof,

b) na volitelně značené buňky exprimující cílový' antigen nebo jeho fragmenty, nebo(b) optionally labeled cells expressing the target antigen or fragments thereof; or

c) na rozpustný, výhodně značený cílový antigen nebo jeho fragmenty,c) a soluble, preferably labeled target antigen or fragments thereof,

II) odmytí nespecificky navázaného expozičního prostředku (a a b) a následnou eluci specificky vázaného expozičního prostředku nespecifickými (např. pufr s nízkým pH) nebo specifickými prostředky (např. specifická protilátka k cílovému antigenu), neboII) washing off the non-specifically bound exposure agent (a and b) and subsequent elution of the specifically bound exposure agent by non-specific (eg, low pH buffer) or specific means (eg, specific antibody to the target antigen), or

III) pozitivní obohacení expozičního prostředku navázaného na cílový antigen (bac) z roztoku cílového antigenu nebo ze suspenze buněk exprimujících cílový antigen pomocí například magnetických perliček vázajících značený cílový antigen nebo značených buněk • · 99 99III) positive enrichment of the exposure agent bound to the target antigen (bac) from the target antigen solution or from a suspension of cells expressing the target antigen using, for example, magnetic beads binding labeled target antigen or labeled cells • 99 99

·.· '♦'· * 9 ··. · '♦' · * 9 ·

9 9 99 9 9

999 999999 999

99

99 99 • ·· ···· '·'· '· *· .....·· · * · • · ·99 99 • ·· ···· '·' · '· * · ..... ·· · * ·

9 99 9

9999 999999 99

II exprimujících cílový antigen, takto izolované expoziční prostředky s antigenními receptory mohou být dle volby dále množeny replikací a podrobeny dalším kolům in vitro selekce, jak se popisuje.II expressing the target antigen, the thus isolated antigenic receptor exposure compositions can optionally be further replicated and subjected to further rounds of in vitro selection as described.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu se před uvedeným selekčním krokem vybírá buď řetězec VH nebo VL pro vazbu uvedeného antigenu, spolu s náhradním řetězcem V.In a further preferred embodiment of the method of the invention, either said VH or VL chain is selected prior to said selection step for binding said antigen, together with a spare V chain.

Tento dvoustupňový postup může použít templátovou protilátku specifickou pro cílový antigen z různých druhů, například myší monoklonální protilátku proti lidskému cílovému antigenu. Nejdříve se repertoár lidských VH nebo VL spojí s jedním náhradním řetězcem VH nebo VL z myší templátové protilátky, která je exponována prostřednictvím např. vláknitého fága a vybrána in vitro vazbou antigenu. Celý rozsah knihovny je tedy přístupný výlučně repertoáru lidských VL nebo VH a mohou být izolovány kandidátní protilátky lidských řetězců VL nebo VH, které jsou schopné přispět ke specifické vazbě lidského cílového antigenu. Ve druhém kroku se náhradní variabilní oblast templátové protilátky zamění odpovídající variabilní oblastí z lidského repertoáru, a pak následuje druhé kolo in vitro selekce; celý rozsah knihovny je opět výlučně přístupný jednomu repertoáru oblastí VH nebo VL, a tak dvoustupňový postup umožňuje v podmínkách omezené velikosti knihovny screening mnohem více kandidátů oblasti VL a VH pro vazbu antigenu než jednostupňový.This two-step procedure may use a target antibody specific for a target antigen from different species, for example, a murine monoclonal antibody against a human target antigen. First, a human VH or VL repertoire is coupled to a single VH or VL replacement chain from a mouse template antibody that is exposed via, eg, filamentous phage and selected in vitro by antigen binding. Thus, the entire range of the library is accessible exclusively to the human VL or VH repertoire and candidate antibodies of human VL or VH chains that are capable of contributing to the specific binding of the human target antigen can be isolated. In a second step, the replacement variable region of the template antibody is replaced by the corresponding variable region from the human repertoire, followed by a second round of in vitro selection; again, the full extent of the library is exclusively accessible to one repertoire of the VH or VL regions, and thus the two-step procedure allows screening of many more VL and VH antigen binding candidates under single-stage conditions than a single-stage library.

Tento dvoustupňový' selekční postup pro screening lidských IgD kombinačních protilátkových knihoven metodou fágové expozice byl výhodně použit pro klonování sekvencí DNA kódujících variabilní oblasti lidských protilátek, které se specificky vážou na lidský antigen 17-1 A. Nejdříve byl spojen Fd segment těžkého řetězce (VH+CH1) myší monoklonální protilátky (Góttlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986), který' se specificky váže na lidský antigen 17-1 A, s repertoárem lidských lehkých řetězců kappa a lambda. Výsledné knihovny byly exponovány prostřednictvím vláknitého fága a proběhla selekce in vitro několika koly ·* ··<·« ft · · *This two-step phage display screening procedure for human IgD combination antibody libraries was preferably used to clone DNA sequences encoding variable regions of human antibodies that specifically bind to human 17-1 A antigen. First, the Fd segment of the heavy chain (VH + CH1) murine monoclonal antibodies (Göttlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986), which specifically binds to the human 17-1 Å antigen, with a human kappa and lambda repertoire repertoire. The resulting libraries were exposed via filamentous phage and were selected in vitro by several rounds.

9 999 „rýžování“ (specifického vychytávání) na imobilizováném rekombinantním lidském antigenu 17-1 A. Rozpustné Fab fragmenty byly exprimovány několika klony po každém kole „rýžování“ a testovaly se pomocí ELISA na vazbu antigenu. Ukázalo se, že každá silná vazebná skupina obohacená během „rýžovací“ procedury obsahuje tentýž lidský lehký řetězec kappa, což bylo potvrzeno sekvenční analýzou. Tento lidský lehký řetězec, nadále nazýván K8, byl pak spojen s knihovnou lidského těžkého řetězce IgD, která byla opět exponována prostřednictvím vláknitého fága a proběhla selekce in vitro několika koly „rýžování“ na imobilizovaném rekombinantním lidském antigenu 17-1 A. Několik Fab fragmentů bylo exprimováno několika klony po každém kole „rýžování“ a opět se testovaly pomocí ELISA na vazbu antigenu. Sekvenční analýza vazebných skupin obohacených během „rýžovací“ procedury odhalila dvě různé variabilní oblasti těžkého řetězce nazvané D4.5 a D7.2, každá z nich se spojuje s lehkým řetězcem K8 za vzniku odlišných lidských antigenních vazebných míst se specifitou pro lidský antigen 17-IA. Repertoáry lidských lehkých a těžkých řetězců se klonovaly z několika preparátů celkové RNA izolované ze vzorků lidské krve a kostní dřeně několika dárců s použitím reakce RT-PCR (reverzní transkriptáza + polymerázová řetězová reakce) specifické pro lehké řetězce kappa nebo lambda, jakož i těžké řetězce IgD. Protože je nemožné selektivně amplifikovat repertoár lehkých řetězců, které jsou spojeny s IgD těžkými řetězci in vivo, pokud nejsou pro preparát RNA purifikovány IgD pozitivní B buňky, použité knihovny lehkých řetězců nejsou omezeny na repertoár protilátek zralých naivních nebo anergních B lymfocytů. Ale díky převaze těžkého řetězce v rozpoznávání antigenu tento fakt nijak neubírá výhody IgD repertoáru pro selekci lidských protilátek k autoantigenům. Kromě toho, a to je nej důležitější, díky vystavení lidskému imunitnímu systému selekce těchto lehkých řetězců stále zaručuje nízký imunogenní profil u člověka.9,999 "panning" (specific uptake) on immobilized recombinant human 17-1 A antigen. Soluble Fab fragments were expressed by several clones after each "panning" round and tested by antigen binding ELISA. Each strong binding group enriched during the "panning" procedure was shown to contain the same human kappa light chain, as confirmed by sequence analysis. This human light chain, hereinafter referred to as K8, was then linked to a human IgD heavy chain library, which was again exposed via filamentous phage and selected in vitro by several rounds of panning on immobilized recombinant human 17-1 A antigen. Several Fab fragments were expressed by several clones after each round of panning and tested again by antigen binding ELISA. Sequence analysis of the binding groups enriched during the "panning" procedure revealed two different heavy chain variable regions termed D4.5 and D7.2, each associating with a K8 light chain to form different human antigen binding sites with specificity for the human 17-IA antigen . Human light and heavy chain repertoires were cloned from several total RNA preparations isolated from human blood and bone marrow samples from several donors using RT-PCR (reverse transcriptase + polymerase chain reaction) specific for kappa or lambda light chains as well as IgD heavy chains . Since it is impossible to selectively amplify the light chain repertoire that is associated with IgD heavy chains in vivo, unless IgD positive B cells are purified for the RNA preparation, the light chain libraries used are not limited to the antibody repertoire of mature naïve or anergic B cells. However, due to the predominance of the heavy chain in antigen recognition, this does not diminish the benefits of the IgD repertoire for selecting human antibodies to autoantigens. In addition, and most importantly, due to exposure to the human immune system, selection of these light chains still guarantees a low immunogenic profile in humans.

V dalším zvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedený náhradní řetězec myší VH nebo VL řetězec.In another particularly preferred embodiment of the method of the invention said replacement chain is a murine VH or VL chain.

• « • * · * • · · · *»· ··· • <1 ·« *·• • • <<<1 1 1 1 1 1 1 1 1

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu uvedená selekce vhodných kombinací zahrnujeIn another preferred embodiment of the method of the invention said selection of suitable combinations comprises

a) testování jednoho a téhož VH řetězce v kombinaci s velkým počtem různých VL řetězců na vazbu k uvedenému lidskému antigenů, nebo(a) testing one and the same VH chain in combination with a large number of different VL chains for binding to said human antigen, or

b) testování jednoho a téhož VL řetězce v kombinaci s velkým počtem různých VH řetězců na vazbu k uvedenému lidskému antigenů.b) testing one and the same VL chain in combination with a large number of different VH chains for binding to said human antigen.

Toto provedení se opět výhodně použije, jestliže je známo, že buď VL nebo VH řetězec specificky interaguje s lidskou cílovou molekulou. Poté může být příslušný druhý řetězec vybrán na základě výhodně zlepšené vazby na cílovou molekulu.Again, this embodiment is preferably used when either the VL or VH chain is known to specifically interact with the human target molecule. Thereafter, the respective second chain may be selected on the basis of preferably improved binding to the target molecule.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu zahrnuje uvedený způsob kroky získávání lidských řetězců VH a VL nebo odpovídajících nukleových kyselin po selekci a fúzování uvedených řetězců ke stejným nebo jiným řetězcům VH nebo VL, k imunoglobulinovým konstantním oblastem těžkých (CH) nebo lehkých (CL) řetězců nebo jejich částem, nebo k dalším biologicky aktivním molekulám, jako jsou peptidy, proteiny, nukleové kyseliny, malé organické sloučeniny, hormony, neurotransmitery, peptidomimetika, PNA (Milner, Nátuře Medicine, 1, 879880, 1995, Hupp, Cell, 83, 237-345, 1995, Gibbs a Oliff, Cell, 79, 193-198, 1994). Další funkční molekula může být spojena buď fyzikálně, např. chemickými prostředky k řetězcům VH a VL, nebo může být fúzována technikami rekombinantní DNA v oboru známými.In another preferred embodiment of the method of the invention said method comprises the steps of obtaining human VH and VL chains or corresponding nucleic acids after selecting and fusing said chains to the same or other VH or VL chains, to immunoglobulin heavy (CH) or light (CL) chain constant regions or parts thereof, or other biologically active molecules such as peptides, proteins, nucleic acids, small organic compounds, hormones, neurotransmitters, peptidomimetics, PNA (Milner, Nature Medicine, 1, 879880, 1995, Hupp, Cell, 83, 237 -345, 1995, Gibbs and Oliff, Cell, 79, 193-198, 1994). The other functional molecule may be linked either physically, e.g., by chemical means to the VH and VL chains, or may be fused to recombinant DNA techniques known in the art.

Toto provedení vynálezu je použitelné obzvláště pro vývoj specifických léků, které mohou být použity pro cílení požadovaných antigenů v lidském těle. Například, jestliže jsou zacíleny nádorové antigeny, mohou být VH a VL řetězce na úrovni nukleové kyseliny nebo aminokyselin fúzovány se skupinou toxinů, výsledkem je imunotoxin; s extracelulární částí buněčného receptoru nebo rozpustného cytokinu či jejich částí, výsledkem jsou konstrukty zesilující imunitní reakci proti nádorům; nebo s protilátkovým Fv fragmentem, výsledkem je protilátkový derivát s dvojí specifitou.This embodiment of the invention is particularly useful for developing specific drugs that can be used to target the desired antigens in the human body. For example, if tumor antigens are targeted, VH and VL chains at the nucleic acid or amino acid level may be fused to a group of toxins, resulting in an immunotoxin; with the extracellular portion of a cellular receptor or soluble cytokine, or portions thereof, resulting in constructs that enhance the immune response against tumors; or with an antibody Fv fragment resulting in a dual specificity antibody derivative.

.-. · .*»· .'.?·♦· . _e ..··.<·« '« • · · · • ·· · ·· · • · • · • · · ··· · ··.-. ·. * »·. '.? · ♦ ·. _e .. ··. <«• • · · · · .. .. .. .. .. ..

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu pocházejí uvedené konstantní oblasti řetězců z lidských IgGl nebo IgG3.In another particularly preferred embodiment of the method of the invention said chain constant regions are derived from human IgG1 or IgG3.

Konstantní oblasti řetězců z lidských IgGl nebo IgG3 se používají zejména tehdy, mají-li být buňky⁷ exprimující cílový⁷ antigen v lidském těle zničeny. V oboru je známo, že tyto podtřídy IgG účinně zprostředkovávají buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC) a přispívají ke zničení buněk rozpoznaných a navázaných těmito podtřídami protilátek.The constant regions of the chains from human IgG1 or IgG3 are used especially when cells ⁷ expressing the target ⁷ antigen are to be destroyed in the human body. It is known in the art that these IgG subclasses effectively mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and contribute to the destruction of cells recognized and bound by these antibody subclasses.

V dalším výhodném provedeni způsobu vynálezu jsou uvedené VH a/nebo VL řetězce spojeny s neproteinovým přípravkem (léčivem) s nízkou molekulovou hmotností, jako jsou radioizotopy nebo látky používané pro chemoterapii, výsledkem je specifičtější in vivo cílení uvedených přípravků.In another preferred embodiment of the method of the invention said VH and / or VL chains are linked to a low molecular weight non-protein preparation (drug), such as radioisotopes or substances used for chemotherapy, resulting in more specific in vivo targeting of said preparations.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu jsou uvedené VH nebo VL řetězce exprimovány ze sekvencí nukleových kyselin, které jsou výsledkem amplifikace metodou RT-PCR mRNA pocházející ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě nesenzibilizované (naivní), nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní.In another preferred embodiment of the method of the invention said VH or VL chains are expressed from nucleic acid sequences resulting from amplification by RT-PCR mRNA derived from mature human B lymphocytes that are substantially non-sensitized (naive) or from human B cells, which are essentially anergic.

Je výhodné amplifikovat VH nebo VL řetězce pomocí RT-PCR, jakmile byl jednou identifikován a izolován vhodný zdroj. Pro amplifikaci VH nebo VL řetězců pomocí RT-PCR se dává přednost použití mRNA z jaderných buněk lidské kostní dřeně nebo výhodněji z lidské krve, protože tyto dva tkáňové kompartmenty jsou nejsnadněji přístupné zdroje B buněk u lidí. Dále se preferuje oddělit před izolací RNA anergní B buňky⁷ nebo výhodněji zralé naivní B lymfocyty od jaderných buněk uvedených tkáňových kompartmentů použitím např. magnetických perliček nebo třídění buněk založené na průtokové cytometrii. Tento postup zaručuje, že oba VH a VL řetězce amplifikované pomocí RT-PCR pocházejí z favorizované populace B buněk. Alternativně, je-li pro amplifikaci VH nebo VL řetězců pomocí RT-PCR použita mRNA z celé frakce jaderných buněk z uvedených tkáňových kompartmentů, je výhodné amplifikovat VH oblast jako polovinu Fd segmentu těžkého řetězce (VH-CH1) lidského IgD s použitím 3'-koncového PCR primeru specifického pro IgD, např. ukázaného v tabulce 1, se kterým vzniknou výlučně PCR produkty z lidského IgD ·· ΦΦ » Φ φIt is preferred to amplify the VH or VL chains by RT-PCR once a suitable source has been identified and isolated. For the amplification of VH or VL chains by RT-PCR, it is preferred to use mRNA from human bone marrow nuclear cells, or more preferably from human blood, as these two tissue compartments are the most readily available sources of B cells in humans. It is further preferred to separate the anergic B cells ⁷ or more preferably mature naive B cells from the nuclear cells of said tissue compartments prior to RNA isolation using, for example, magnetic beads or cell sorting based on flow cytometry. This procedure ensures that both the VH and VL chains amplified by RT-PCR originate from the preferred B cell population. Alternatively, when mRNA from a whole fraction of nuclear cells from said tissue compartments is used to amplify VH or VL chains by RT-PCR, it is preferable to amplify the VH region as half of the Fd segment of the human IgD heavy chain (VH-CH1) using 3'- IgD-specific PCR primer, eg, shown in Table 1, with which only PCR products from human IgD will be produced. ·· ΦΦ »Φ φ

Φ těžkého řetězce, exprimovaného pouze v zralých naivních B lymfocytech a v anergních lidských B buňkách.Φ heavy chain, expressed only in mature naïve B cells and in anergic human B cells.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu obsahuje anti-lidský antigenní receptor, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kombinaci funkčně přestavěných VH a VL řetězců výhodně ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě naivní, nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní, a které je možno získat způsobem podle vynálezu popsaného výše.In another preferred embodiment of the method of the invention, the anti-human antigen receptor, which is weakly immunogenic or not immunogenic to humans, comprises a combination of functionally rearranged VH and VL chains, preferably from mature human B lymphocytes that are substantially naïve or from human B cells that they are substantially anergic and obtainable by the method of the invention described above.

Výhody protilátky podle vynálezu zde byly nastíněny výše. Je třeba zdůraznit, že odpovídající protilátky’ namířené proti lidským antigenům a pocházející z lidských zdrojů, které jsou pro člověka slabě imunogenní nebo nejsou imunogenní, nebyly doposud v oboru izolovány. Proto jsou protilátky podle vynálezu výchozí bod pro zcela nový’ vývoj protilátek, které mohou být použity⁷ v různých odvětvích medicíny a farmacie.The advantages of the antibody of the invention have been outlined above. It should be noted that the corresponding antibodies directed against human antigens and derived from human sources that are weakly immunogenic or non-immunogenic in humans have not been isolated in the art. Accordingly, antibodies of the invention are the starting point for a completely new 'development of antibodies that may be used in ^seven different sectors of medicine and pharmacy.

V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu je receptor protilátka nebo její fragment.In another preferred embodiment of the method of the invention, the receptor is an antibody or a fragment thereof.

V jiném výhodném provedení způsobu podle vynálezu je receptor specifický pro lidský nádorový⁷ antigen, nejvýhodněji pro lidský antigenIn another preferred embodiment of the method of the invention, the receptor is specific for a human tumor ⁷ antigen, most preferably a human antigen

17-1A.17-1A.

Vynález se dále týká receptoru, kde uvedený VH řetězec obsahuje jednu ze sekvencí ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo uvedený VL řetězec obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí ukázaných na obr. 6 (nukleotidy⁷ 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).The invention further relates to a receptor wherein said VH chain comprises one of the sequences shown in Fig. 7 (nucleotides 1 to 381) and Fig. 8 (nucleotides 1 to 339) and / or said VL chain comprises one of the two following sequences shown in Figs. 6 (nucleotides ⁷ to 321) and FIG. 9 (nucleotides 1 to 321).

Navíc se vynález týká VH řetězce nebo jeho části obsažené v receptoru podle vynálezu.In addition, the invention relates to a VH chain or a portion thereof contained in a receptor of the invention.

Vynález se také týká VL řetězce nebo jeho části obsažené v receptoru vynálezu.The invention also relates to a VL chain or a portion thereof comprised in the receptor of the invention.

V dalším obzvláště výhodném provedení způsobu vynálezu je uvedená část VH řetězce doména CDR3.In another particularly preferred embodiment of the method of the invention said VH chain portion is a CDR3 domain.

Dále se vynález týká soupravy⁷ obsahující funkčně přestavěné VH a VL řetězce imunoglobulinu, kde alespoň jeden z VH a VL řetězců pochází • · · · • · » 9 ·· · ··· • ·Furthermore, the invention relates to a kit ⁷ comprising functionally rearranged immunoglobulin VH and VL chains, wherein at least one of the VH and VL chains is derived from an immunoglobulin VH and VL chain.

99 ze zralých lidských lymfocytů B, které jsou v podstatě naivní, nebo z lidských B buněk, které jsou v podstatě anergní, uvedené řetězce jsou schopné exprese rekombinantními vektory in vitro detekčního (expozičního) systému.99 from mature human B lymphocytes that are substantially naive or from human B cells that are substantially anergic, said chains are capable of being expressed by recombinant vectors in vitro detection (exposure) system.

Souprava podle vynálezu je výhodně použita pro provádění způsobu podle vynálezu a tedy k získání receptorů požadované specifičnosti.The kit of the invention is preferably used to carry out the method of the invention and thus to obtain receptors of the desired specificity.

V uvedené soupravě je in vitro detekční systém výhodně systém fágové expozice (phage display).In said kit, the in vitro detection system is preferably a phage display system.

Vynález se dále týká protilátky vyznačující se tím, že pochází z lidských sekvencí a je specifická pro lidský antigen 17-1 A.The invention further relates to an antibody characterized in that it is derived from human sequences and is specific for the human 17-1A antigen.

Způsobem podle vynálezu byla poprvé vyvinuta lidská protilátka, která je specifická pro lidský antigen 17-1 A. Jak bylo zdůrazněno dříve, tento vývoj nebyl zanedbatelný problém, protože lidské protilátky proti lidským nádorovým antigenům jsou obvykle podrobeny mechanismům zprostředkovávajícím autotoleranci imunitního systému, což má za následek eliminaci B lymfocytů exprimujících autoreaktivní protilátky in vivo. Ze známých nádorových antigenů je antigen 17-1A mnohem siřeji exprimovaný na značné části normálních epitelových tkání než jiné nádorové antigeny, kromě své exprese na epitelových nádorech.The human antibody that is specific for the human 17-1 A antigen was first developed by the method of the invention. As pointed out earlier, this development was not a negligible problem because human antibodies against human tumor antigens are usually subjected to mechanisms mediating auto-tolerance of the immune system. the consequence of the elimination of B lymphocytes expressing autoreactive antibodies in vivo. Of the known tumor antigens, 17-1A antigen is much more widely expressed on a significant portion of normal epithelial tissues than other tumor antigens, in addition to its expression on epithelial tumors.

Antigen 17-1A se proto v současné době považuje spíše za představitele panepitelového antigenu než za nádorový antigen, za který byl pokládán v době svého prvního popisu. Pro srovnání, další takzvané nádorové antigeny nalezené na epitelových nádorech, jako erb-B2 (Her2/neu), Muc-1 (PEM) nebo Thompson-Friedreichův antigen obvykle vykazují na normálních epitelových tkáních mnohem omezenější vzorec exprese. Tudíž se očekává, že selektivní tlak autotolerance proti B lymfocytům, expriraujícím 17-1A reaktivní protilátky třebas jen s malou afinitou, je mimořádně silný, protože se zdá téměř nemožné, aby se tyto B buňky vyhnuly po delší časové období setkání s antigenem 17-1 A, díky všudypřítomnosti tohoto antigenu. Bylo překvapivě zjištěno, že z repertoáru protilátek lidských B buněk, jako jsou např. zralé naivní B lymfocyty, mohou být izolovány 17-1A specifické protilátky nebo alespoň ·· ··Therefore, antigen 17-1A is currently considered to be a representative of the panepithelial antigen rather than the tumor antigen it was considered at the time of its first description. By comparison, other so-called tumor antigens found on epithelial tumors, such as erb-B2 (Her2 / neu), Muc-1 (PEM) or Thompson-Friedreich antigen usually show a much more limited expression pattern on normal epithelial tissues. Thus, the selective pressure of autotolerance against B cells expressing 17-1A reactive antibodies, although with little affinity, is expected to be extremely strong, since it seems almost impossible for these B cells to evade for a longer period of time meeting 17-1A antigen. And, thanks to the ubiquity of this antigen. Surprisingly, it has been found that 17-1A specific antibodies or at least ·· ·· can be isolated from a repertoire of human B cell antibodies, such as mature naive B cells.

:._r< · • · · · «« · · · · «« ·» odpovídající těžké řetězce. Je známo, že tyto B buňky mají dlouhý' poločas života in vivo a už se jím podařilo vyhnout se před svou maturaci depleci navzdory' přítomnosti antigenů 17-1A dokonce i v místě maturace; anergie B buněk v případě antigenů 17-1A nenastává, protože tento typ B buněčné tolerance je vyvoláván pouze rozpustným autoantigenem. Pouze dlouho žijící B buňky, kterým se podařilo přežít navzdory své potenciální 17-1A reaktivitě, představují repertoár variabilních oblastí lidských imunoglobulinů u něhož je pravděpodobné, že bude lidským imunitním systémem dobře tolerován při použití pro konstrukcí lidských protilátek a protilátkových derivátů určených k tomu, aby byly opakovaně systémově podávány lidem, protože již byly buněčným dohledem imunitního systému prověřeny a pak byly z imunogenních sekvencí vyloučeny. Předkládaný vynález se tudíž také týká lidských protilátek specifických pro antigen 17-1A a vhodných pro opakovanou aplikaci in vivo nehledě na způsob, kterým jsou získány, protože se s velkou pravděpodobností očekává, že lidské protilátkové sekvence s uvedenou vysokou kompatibilitou in vivo budou nalezeny, například způsobem podle vynálezu, také v repertoáru B buněk zdravých lidí. Ve shodě s tím byla nyní poprvé vyvinuta lidská protilátka, která může být výhodně použita pro sledování a/ nebo zničení nádorových buněk nesoucích antigen 17-1 A.:. _{r <} • odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající odpovídající These B cells are known to have a long 'half-life in vivo and have already managed to avoid depletion prior to their maturation despite the presence of 17-1A antigens even at the maturation site; B cell anergy does not occur with 17-1A antigens because this type of B cell tolerance is induced only by soluble autoantigen. Only long-lived B cells that have survived despite their potential 17-1A reactivity represent a repertoire of variable regions of human immunoglobulins that are likely to be well tolerated by the human immune system when used for the construction of human antibodies and antibody derivatives designed to have been repeatedly administered systemically to humans because they have already been verified by cellular surveillance of the immune system and then excluded from immunogenic sequences. Accordingly, the present invention also relates to human 17-1A-specific antibodies and suitable for re-administration in vivo regardless of the manner in which they are obtained, as it is highly likely that human antibody sequences with said high in vivo compatibility will be found, for example according to the invention, also in the B cell repertoire of healthy humans. Accordingly, a human antibody has now been developed for the first time, which can advantageously be used to monitor and / or destroy 17-1 A antigen-bearing tumor cells.

Protilátka vynálezu je tudíž výhodně slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka. Ve výhodném provedení lze uvedenou protilátku získat způsobem, jak je popsán výše. V dalším výhodném provedení protilátka vynálezu rozpoznává epitop extracelulární domény antigenů 17-1 A, který výhodně obsahuje alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci peptidu č. 8, 11, 13, 14, 59, 60 a 79. VH řetězec protilátky vynálezu výhodně zahrnuje alespoň jednu CDR z jedné z následujících dvou sekvencí ukázaných na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo VL řetězec obsahuje alespoň jednu CDR z jedné z následujících dvou sekvencí ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321). Zejména výhodná je protilátka, kde uvedený VH řetězec obsahuje jednu ze dvou následujících sekvencí ukázaných naThus, the antibody of the invention is preferably weakly immunogenic or non-immunogenic to humans. In a preferred embodiment, said antibody can be obtained as described above. In another preferred embodiment, the antibody of the invention recognizes an epitope of the extracellular domain of 17-1 A antigens, which preferably comprises at least one amino acid sequence of peptide Nos. 8, 11, 13, 14, 59, 60 and 79. The VH chain of the antibody of the invention preferably comprises at least one CDR of one of the following two sequences shown in FIG. 7 (nucleotides 1 to 381) and FIG. 8 (nucleotides 1 to 339) and / or the VL chain comprises at least one CDR of one of the following two sequences shown in FIG. 321) and FIG. 9 (nucleotides 1 to 321). Particularly preferred is an antibody wherein said VH chain comprises one of the two following sequences shown in

ISIS

4« 4*44 * • · 4 44 • 4 · • · ♦ 4 • 4 · ·4 4 4 * 44 · 4 4 4 44 4 • 4 • 4 ·

4444 44 tt«4444 44 tt «

44 4444 44

44444444

4 4 4 4 • 4 ·4· 4444 4 4 4 • 4 · 4 · 444

4 44 4

444 44 44 obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo uvedený VL řetězec obsahuje jednu z následujících dvou sekvencí ukázaných na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).Fig. 7 (nucleotides 1 to 381) and Fig. 8 (nucleotides 1 to 339) and / or said VL chain comprises one of the following two sequences shown in Fig. 6 (nucleotides 1 to 321) and Fig. 9 ( nucleotides 1 to 321).

Byl učiněn závěr, že tento receptor a výhodně repertoár protilátek vybraných pro nízkou imunogeničnost jsou nejlépe reprezentovány v protilátkové knihovně lidského IgD. IgD je exprimován jako membránový⁷ antigenní receptor spolu s povrchovým IgM na zralých naivních B lymfocytech, které vstupují do primárních folikulů v průběhu své cesty do sekundárních lymfoidních orgánů (a mezi ně), dokud se nepotkají s multivalentním autoantigenem, což má za následek klonální deleci, nebo s rozpustným monovalentním autoantigenem, čímž se stanou anergními a žijí krátce díky vyloučení z primárních folikulů. Kromě zralých naivních B lymfocytů lidské IgD knihovny pouze představují repertoár protilátek krátce žijících B buněk, které se staly anergními při kontaktu s rozpustným monovalentním autoantigenem, ale je nepravděpodobné, že přispějí specifickými vazebnými skupinami k povrchovým molekulám lidské buňky připomínajícím multivalentní autoantigeny, které indukují klonální deleci B buněk namísto anergie.It was concluded that this receptor and preferably a repertoire of antibodies selected for low immunogenicity are best represented in the human IgD antibody library. IgD is expressed as a membrane ⁷ antigen receptor along with surface IgM on mature naïve B lymphocytes that enter primary follicles during their journey to and between secondary lymphoid organs until they encounter a multivalent autoantigen resulting in a clonal deletion , or with soluble monovalent autoantigen, thereby becoming anergic and living briefly due to exclusion from primary follicles. In addition to mature naive B lymphocytes, the human IgD libraries only represent a repertoire of short living B cell antibodies that have become anergic upon contact with soluble monovalent autoantigen but are unlikely to contribute specific binding groups to human cell surface molecules resembling multivalent autoantigens that induce clonal deletion B cells instead of anergy.

Kromě toho se předkládaný vynález týká farmaceutického přípravku obsahujícího alespoň jeden z výše uvedených receptorů podle vynálezu nebo jejich části, buď samotné nebo v kombinaci, a volitelně farmaceutický⁷ přijatelný nosič nebo excipient. Příklady vhodných farmaceutických nosičů jsou v oboru známy a zahrnují fyziologické roztoky pufrované fosforečnany, vodu, emulze, jako jsou emulze olej/voda, různé typy smáčedel, sterilní roztoky apod. Přípravky obsahující tyto nosiče mohou být formulovány obvyklými známými způsoby. Týto farmaceutické přípravky mohou být pacientovi podávány ve vhodné dávce. Podávání vhodných přípravků se může provádět různými způsoby, např. intravenózním, intraperitoneálním, subkutánním, intramuskulárním, lokálním nebo intradermálním podáváním.Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising at least one of the aforementioned receptors according to the invention or parts thereof, either alone or in combination, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier ⁷ or excipient. Examples of suitable pharmaceutical carriers are known in the art and include phosphate buffered saline solutions, water, emulsions such as oil / water emulsions, various types of wetting agents, sterile solutions and the like. Formulations containing these carriers can be formulated by conventional known methods. These pharmaceutical compositions may be administered to a patient at a suitable dose. Administration of suitable formulations may be by a variety of routes, eg, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, local or intradermal administration.

Vynález se tedy také týká použití receptorů, nebo jeho části, připraveného způsobem podle vynálezu pro přípravu farmaceutického • · • · - · · • · · · ··· ♦· ·· «··· ·· ··· přípravku pro léčbu, prevenci a/nebo oddálení nádoru u pacienta, výhodně když je nádor epitelového původu.Accordingly, the invention also relates to the use of the receptors, or a portion thereof, prepared by the method of the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of: preventing and / or delaying the tumor in a patient, preferably when the tumor is of epithelial origin.

Přehled obrázkůOverview of pictures

Obrázek 1: Klonovací místo pComb3H s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VL, variabilní doména lehkého řetězce, CL, konstantní doména lehkého řetězce, VH, variabilní doména těžkého řetězce, CH1, konstantní doména těžkého řetězce, LI/2, prokaryotické vedoucí sekvence. Doména označená jako gen III v pComb3H kóduje neinfekční část produktu genu III vláknitých fágů, jako např. VCSM13.Figure 1: Cloning site of pComb3H with important restriction sites. The following abbreviations were used: P, promoter, VL, light chain variable domain, CL, light chain constant domain, VH, heavy chain variable domain, CH1, heavy chain constant domain, L1 / 2, prokaryotic leader sequences. The domain designated gene III in pComb3H encodes the non-infectious portion of the gene III gene product of filamentous phages, such as VCSM13.

Obrázek 2: Schéma plazmidu pComb3H a plně exprimovaného fágu Ml3. Na pComb3H je ukázána organizace vedoucí sekvence (L}ompA, lehkého řetězce, vedoucí sekvence (L}pelB, těžkého řetězce a genu III. Plně exprimovaný fág M13 exponuje na svém povrchu fenotyp určitého protilátkového Fab fragmentu skládajícího se z lehkého řetězce a Fd segmentu (VH+CH1) těžkého řetězce spojeného s neinfekční částí produktu genu III a obsahuje odpovídající genotyp jako jednovláknovou DNA kódující těžký a lehký řetězec vystaveného Fab fragmentu. Infekční protein genu III je poskytnut pomocným fágem VCSM13.Figure 2: Scheme of plasmid pComb3H and fully expressed phage M13. PComb3H shows the organization of the leader sequence (L} ompA, light chain, leader sequence (L} pelB, heavy chain and gene III). Fully expressed phage M13 exposes the phenotype of a certain antibody Fab fragment consisting of a light chain and Fd segment ( The VH + CH1) heavy chain is linked to the non-infectious portion of the gene III product and contains the corresponding genotype as single-stranded DNA encoding the heavy and light chains of the exposed Fab fragment.

Obrázek 3: ELISA rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje Fd segment chimérického M79 a jeden lidský řetězec kappa na klon. ELISA destičky se inkubovaly přes noc s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla polyklonální proti-lidskou imunoglobulinovou protilátkou konjugovanou s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS = 2,2 azinobis(3-etylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila • 0 · ·Figure 3: ELISA of soluble Fab fragments. Periplasmic preparations of soluble Fab fragments, each containing the Fd segment of chimeric M79 and one human kappa chain per clone. ELISA plates were incubated overnight with soluble 17-1 A antigen. Detection of bound antibody Fab fragments was performed with a polyclonal peroxidase-conjugated anti-human immunoglobulin antibody. The ELISA was finally induced by the addition of ABTS substrate solution (ABTS = 2.2 azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) and substrate change was measured • 0 · ·

ve vlnové délce 405 nm (osa y). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“ druhé číslo je číslo klonu. Klony 1.5-9 mají kombinaci chimérického M79 Ed segmentu s jedním náhodným řetězcem kappa a představují negativní kontroly.at 405 nm (y-axis). Clones are represented by the x-axis, the first number denotes the panning wheel, the second number is the clone number. Clones 1.5-9 have a combination of the chimeric M79 Ed segment with a single random kappa chain and represent negative controls.

Obrázek 4: ELISA rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje k8 lehký řetězec a jeden Fd segment lidského Ig delta řetězce. ELISA destičky se inkubovaly přes noc s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla biotinylovanou polyklonální proti-lidskou protilátkou lehkého řetězce kappa, po které následoval streptavidin konjugovaný s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS = 2,2 azino-bis(3etylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila ve vlnové délce 405 nm (osa y). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“ druhé číslo je číslo klonu. Klony 1.2-6 mají kombinaci k8 lehkého řetězce s jedním náhodným Fd segmentem Ig delta těžkého řetězce a představují negativní kontroly.Figure 4: ELISA of soluble Fab fragments. Periplasmic preparations of soluble Fab fragments, each containing a κ8 light chain and one Fd segment of the human Ig delta chain. ELISA plates were incubated overnight with soluble 17-1 A antigen. Detection of bound antibody Fab fragments was performed with biotinylated polyclonal anti-human kappa light chain antibody followed by peroxidase-conjugated streptavidin. The ELISA was finally induced by the addition of ABTS substrate solution (ABTS = 2.2 azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) and the substrate change was measured at 405 nm (y-axis). Clones are represented by the x-axis, the first number denotes the panning wheel, the second number is the clone number. Clones 1.2-6 have a combination of k8 light chain with one random Fd segment of the Ig delta heavy chain and represent negative controls.

Obrázek 5: ELISA rozpustných Fab fragmentů. Periplazmatické preparáty rozpustných Fab fragmentů, z nichž každý obsahuje Fd segment D4.5 a jeden lidský řetězec kappa na klon. ELISA destičky se inkubovaly přes noc s rozpustným antigenem 17-1 A. Detekce navázaných protilátkových Fab fragmentů se prováděla biotinylovanou polyklonální proti-lidskou protilátkou lehkého řetězce kappa, po které následoval streptavidin konjugovaný s peroxidázou. Test ELISA se nakonec vyvolal přidáním substrátového roztoku ABTS (ABTS = 2,2 azino-bis(3etylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) a změna substrátu se měřila ve vlnové délce 405 nm (osa y). Klony jsou představovány osou x, první číslo vyznačuje kolo „rýžování“ druhé číslo je číslo klonu, S. je zkratka pro klony před prvním kolem selekce. Klony S.l-3 mají kombinací k8 lehkého řetězce • · 9 s jedním náhodným Fd segmentem Ig delta těžkého řetězce a představují negativní kontroly.Figure 5: ELISA of soluble Fab fragments. Periplasmic preparations of soluble Fab fragments, each containing a D4.5 Fd segment and one human kappa chain per clone. ELISA plates were incubated overnight with soluble 17-1 A antigen. Detection of bound antibody Fab fragments was performed with biotinylated polyclonal anti-human kappa light chain antibody followed by peroxidase-conjugated streptavidin. The ELISA was finally induced by the addition of ABTS substrate solution (ABTS = 2.2 azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) and the substrate change was measured at 405 nm (y-axis). Clones are represented by the x-axis, the first number denotes the panning round, the second number is the clone number, S. is the abbreviation for the clones before the first round of selection. Clones S. 1-3 have a combination of κ8 light chain ·9 with one random Fd segment of the λ delta heavy chain and represent negative controls.

Obrázek 6: DNA a proteinová sekvence variabilní oblasti lidského lehkého řetězce kappa 8. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 70 až nt 102, CDR2 nt 148 až nt 168, CDR3 nt 265 až nt 294.Figure 6: DNA and protein sequence of the human kappa light chain variable region 8. The numbers indicate the nucleotide (nt) positions, the amino acids are given by a single letter code. CDR1 comprises nt 70 to nt 102, CDR2 nt 148 to nt 168, CDR3 nt 265 to nt 294.

Obrázek 7: DNA sekvence variabilní oblasti lidského D4.5 těžkého řetězce. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 91 až nt 105, CDR2 nt 148 až nt 198, CDR3 nt 292 až nt 351. Hranice mezi variabilní oblastí těžkého řetězce a doménou CH 1 konstantní oblasti Ig delta je lokalizována mezi nt 382 a nt 383 s tím, že proteinová sekvence konstantní oblasti delta začíná v nt 384.Figure 7: DNA sequence of the human D4.5 heavy chain variable region. The numbers indicate the nucleotide (nt) positions, amino acids are given by a one letter code. CDR1 contains nt 91 to nt 105, CDR2 nt 148 to nt 198, CDR3 nt 292 to nt 351. The border between the heavy chain variable region and the CH 1 domain of the Ig delta constant region is located between nt 382 and nt 383, with the protein sequence the delta constant region starts at nt 384.

Obrázek 8: DNA sekvence variabilní oblasti lidského D7.2 těžkého řetězce. Čísla vyznačuji nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedeny jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 91 až nt 105, CDR2 nt 148 až nt 198, CDR3 nt 292 až nt 309. Hraníce mezi variabilní oblastí těžkého řetězce a doménou CH 1 konstantní oblastí Ig delta je lokalizována mezi nt 340 a nt 341 s tím, že proteinová sekvence konstantní oblasti delta začíná v nt 343.Figure 8: DNA sequence of the human D7.2 heavy chain variable region. The numbers indicate the nucleotide (nt) positions, amino acids are given by a single letter code. CDR1 contains nt 91 to nt 105, CDR2 nt 148 to nt 198, CDR3 nt 292 to nt 309. The border between the heavy chain variable region and the CH 1 domain of the Ig delta constant region is located between nt 340 and nt 341, with the protein sequence the delta constant region starts at nt 343.

Obrázek 9: DNA a proteinová sekvence variabilní oblasti lidského kappa 5.1 lehkého řetězce. Čísla vyznačují nukleotidové (nt) pozice, aminokyseliny jsou uvedepy jednopísmenným kódem. CDR1 obsahuje nt 70 až nt 102, CDR2 nt 148 až nt 168, CDR3 nt 265 až nt 294.Figure 9: DNA and protein sequence of the human kappa 5.1 light chain variable region. The numbers indicate the nucleotide (nt) positions, amino acids are indicated by a one letter code. CDR1 comprises nt 70 to nt 102, CDR2 nt 148 to nt 168, CDR3 nt 265 to nt 294.

Obrázek 10: Analýza průtokovou cytometrií protilátkových Fab fragmentů a kontrolních protilátek M79 na 17-1A pozitivních buňkách Kato pro testování vazebné aktivity periplazmatického preparátu • · obsahujícího fragment k8-D4.5-Fab. Buňky Kato se inkubovaly I) s irelevantním periplazmatickým preparátem, II) s 10 pg/ml chimérického (bivalentního !) M79, III) s periplazmatickým preparátem k8-D4.5 a IV) s periplazmatickým preparátem k8-D4.5 naředěným v poměru 1:10. Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.Figure 10: Flow cytometry analysis of antibody Fab fragments and M79 control antibodies on 17-1A positive Kato cells to test the binding activity of the periplasmic preparation containing the k8-D4.5-Fab fragment. Kato cells were incubated with I) an irrelevant periplasmic preparation, II) with 10 µg / ml chimeric (bivalent!) M79, III) with a periplasmic preparation k8-D4.5 and IV) with a periplasmic preparation k8-D4.5 diluted 1 : 10. Relative cell numbers are shown on the y-axis, relative fluorescence intensity is shown on the x-axis.

Obrázek 11: Analýza průtokovou cytometrií protilátkových Fab fragmentů a kompletních protilátek na 17-1A pozitivních buňkách Kato, buňkách CHO transfekovaných a netransfekováných 17-1 A, v uvedeném pořadí, pro testování vazebné aktivity periplazmatických preparátů (pp) obsahujících k8-D4.5-, k5.1-D4.5- nebo irelevantní k-D4.5-Fab fragmenty. Buňky’ Kato se inkubovaly I) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k5.1-D4.5-pp (plná čára) nebo II) s 20 pg/ml protilátky M79 (plná čára) nebo odpovídající myší IgG2a izotypové kontroly (přerušovaná čára). Buňky CHO transfekované 17-1A se inkubovaly III) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k5.1-D4.5-pp (plná čára), IV) s irelevantním pp (přerušovaná čára) nebo k8-D4.5-pp (plná čára) nebo V) s 20 pg/ml protilátky M79 (plná čára) nebo odpovídající myší IgG2a izotypové kontroly (přerušovaná čára). V bodech III), IV) a V) se inkubace a detekce relevantních pp (k5.1-D4.5-Fab-pp a k8-D4.5-Fab-pp, v uvedeném pořadí) a myší protilátky M79 prováděla také na netransfekovaných buňkách CHO (tečkované čáry). Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.Figure 11: Flow cytometry analysis of antibody Fab fragments and complete antibodies on 17-1A positive Kato cells, CHO cells transfected and non-transfected 17-1 A, respectively, for testing the binding activity of periplasmic preparations (pp) containing k8-D4.5- , k5.1-D4.5- or irrelevant k-D4.5-Fab fragments. Kato cells were incubated I) with irrelevant pp (dashed line) or k5.1-D4.5-pp (solid line) or II) with 20 µg / ml of M79 antibody (solid line) or corresponding mouse IgG2a isotype control (dashed) line). 17-1A transfected CHO cells were incubated III) with irrelevant pp (dashed line) or k5.1-D4.5-pp (solid line), IV) with irrelevant pp (dashed line) or k8-D4.5-pp ( solid line) or V) with 20 µg / ml M79 antibody (solid line) or the corresponding mouse IgG2a isotype control (dashed line). In points III), IV) and V), incubation and detection of relevant pp (k5.1-D4.5-Fab-pp and k8-D4.5-Fab-pp, respectively) and mouse M79 antibody were also performed on non-transfected CHO cells (dotted lines). Relative cell numbers are shown on the y-axis, relative fluorescence intensity is shown on the x-axis.

Obrázek 12: Klonovací místo pEF-ADA s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VL, variabilní doména lehkého řetězce, CL, konstantní doména lehkého řetězce, Leuc, eukaryotická vedoucí sekvence.Figure 12: Cloning site of pEF-ADA with important restriction sites. The following abbreviations were used: P, promoter, VL, light chain variable domain, CL, light chain constant domain, Leuc, eukaryotic leader sequence.

» · · · ·· · ·· ’ t *»· · · ···

Obrázek 13: Klonovací místo pEF-DHFR s důležitými restrikčními místy. Byly použity následující zkratky: P, promotor, VH, variabilní doména těžkého řetězce, CH1/2/3, konstantní doména těžkého řetězce 1/2/3, Leuc, eukaryotická vedoucí sekvence.Figure 13: Cloning site of pEF-DHFR with important restriction sites. The following abbreviations were used: P, promoter, VH, heavy chain variable domain, CH1 / 2/3, heavy chain constant domain 1/2/3, Leuc, eukaryotic leader sequence.

Obrázek 14: SDS-PAGE preparátů lidské protilátky H79. Na 12,5% polyakrylamidovém gelu v redukujících a neredukujících podmínkách se pouštělo přibližně 10 pg každé protilátky a obarvilo se Coomassie modří. Dráha 1: standard (MW [kD] pro jednotlivé pásy označené na levé straně gelu)Figure 14: SDS-PAGE of human H79 antibody preparations. Approximately 10 µg of each antibody was run on 12.5% polyacrylamide gel under reducing and non-reducing conditions and stained with Coomassie Blue. Lane 1: standard (MW [kD] for each band labeled on the left side of the gel)

Dráha 2: varianta H79 lidského IgGl (neredukční)Lane 2: human IgG1 variant H79 (non-reducing)

Dráha 3: varianta H79 lidského IgGl v redukčních podmínkáchLane 3: human IgG1 variant H79 under reducing conditions

Dráha 4: varianta H79 myšího IgGl (neredukční)Lane 4: murine IgG1 variant H79 (non-reducing)

Dráha 5: varianta H79 myšího IgGl v redukčních podmínkáchLane 5: H79 mouse IgG1 variant under reducing conditions

Obrázek 15: SDS-PAGE preparátů lidských protilátek H79 a HD70. Na 12,5% denaturujícím polyakrylamidovém gelu v neredukčních (gel 1) a redukujících (gel 2) podmínkách se pouštělo 10 pg H79 a 3,5 pg HD70 a obarvily se Coomassie modří.Figure 15: SDS-PAGE of human H79 and HD70 preparations. On a 12.5% denaturing polyacrylamide gel under non-reducing (gel 1) and reducing (gel 2) conditions, 10 µg H79 and 3.5 µg HD70 were run and stained with Coomassie Blue.

Gel 1:Gel 1:

Dráha 1: standard (MW [kD] pro jednotlivé pásy označené na levé straně gelu)Lane 1: standard (MW [kD] for each band labeled on the left side of the gel)

Dráha 2: varianta H79 lidského IgGl (neredukční)Lane 2: human IgG1 variant H79 (non-reducing)

Dráha 3: varianta HD70 lidského IgGl (neredukční)Lane 3: human IgG1 HD70 variant (non-reducing)

Gel 2:Gel 2:

Dráha 4: standard (MW [kD] pro jednotlivé pásy označené na levé straně gelu)Lane 4: standard (MW [kD] for each band labeled on the left side of the gel)

Dráha 5: varianta H79 lidského IgGl v redukčních podmínkáchLane 5: human IgG1 variant H79 under reducing conditions

Dráha 6: varianta HD70 lidského IgGl v redukčních podmínkáchLane 6: HD70 variant of human IgG1 under reducing conditions

Obrázek 16: Analýza průtokovou cytometrií buněk Kato pozitivních na 17-1A pro testování vazebné aktivity purifikovaného H79 lidského IgGl, • cFigure 16: Flow cytometry analysis of 17-1A positive Kato cells for testing the binding activity of purified H79 human IgG1;

•. · ...•. · ...

·'» ·'9 • <· '»·' 9 • <

jakož i purifikovaného H79 myšího IgGl. Buňky Kato se inkubovaly s IgG izotypovými kontrolami (10 Mg/ml lidského IgGl a myšího IgGl), pozitivními kontrolami (M79 a chimerizovaná M74 v 10 Mg/ml, obě 17-1A specifické) a s H79 lidským IgGl nebo H79 myším IgGl (každý 10 Mg/ml a 1 Mg/ml). Relativní počty buněk jsou ukázány na ose y, relativní intenzita fluorescence je ukázána na ose x.as well as purified H79 mouse IgG1. Kato cells were incubated with IgG isotype controls (10 Mg / ml human IgG1 and mouse IgG1), positive controls (M79 and chimerized M74 at 10 Mg / ml, both 17-1A specific) and H79 human IgG1 or H79 mouse IgG1 (each 10 Mg / ml and 1 Mg / ml). Relative cell numbers are shown on the y-axis, relative fluorescence intensity is shown on the x-axis.

Obrázek 17: Analýza průtokovou cytometrií protilátek (každá v koncentraci 20 Mg/ml) na buňkách Kato pozitivních na 17-1 A, na buňkách CHO transfekovaných a netransfekovaných s 17-1 A, pro testování vazebné aktivity purifikovaných protilátek H79 lidského IgGl, H79 myšího IgGl, HD70, D7.2, M79, Panorex a izotypových kontrol (lidský IgGl, myší IgGl a 2a). I) H79 lidský IgGl (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, II) H79 myší IgGl (plná čára) a myší IgG 1 izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, III) HD70 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, IV) D7.2 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, V) M79 (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, Ví) Panorex (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách Kato, VII) H79 lidský IgGl (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, VIII) H79 myší IgGl (plná čára) a myší IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, IX) HD70 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, X) D7.2 (plná čára) a lidská IgGl izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, XI) M79 (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A, XII) Panorex (plná čára) a myší IgG2a izotypová kontrola (přerušovaná čára) na buňkách CHO transfekovaných 17-1 A. Obrázky VII-XII také ukazují výsledky inkubace * · · · · ····......ζ ....-...··'.· · .· · ΣΖ . · · · • · 1 .»······ • · * . , · · a detekce relevantních protilátek na netransfekovaných buňkách CHO (tečkovaná čára).Figure 17: Flow cytometry analysis of antibodies (20 Mg / ml each) on 17-1 A positive Kato cells, on 17-1 A transfected and non-transfected CHO cells, to test the binding activity of purified human IgG1 H79, H79 murine antibodies IgG1, HD70, D7.2, M79, Panorex and isotype controls (human IgG1, mouse IgG1 and 2a). I) H79 human IgG1 (solid line) and human IgG1 isotype control (dashed line) on Kato cells, II) H79 mouse IgG1 (solid line) and mouse IgG 1 isotype control (dashed line) on Kato cells, III) HD70 (solid) line) and human IgG1 isotype control (dashed line) on Kato cells, IV) D7.2 (solid line) and human IgG1 isotype control (dashed line) on Kato cells, V) M79 (solid line) and mouse IgG2a isotype control ( dashed line) on Kato cells, VII) Panorex (solid line) and mouse IgG2a isotype control (dashed line) on Kato cells, VII) H79 human IgG1 (solid line) and human IgG1 isotype control (dashed line) on CHO cells transfected 17 -1A, VIII) H79 mouse IgG1 (solid line) and mouse IgG1 isotype control (dashed line) on CHO cells transfected with 17-1A, IX) HD70 (solid line) and human IgG1 isotype control (dashed line) per cell 17-1 A, X) D7.2 transfected cells (solid line) and human IgG1 isotype control (dashed line) on 17-1 A, XI) M79 transfected CHO cells (solid line) and mouse IgG2a isotype control (dashed line) ) on CHO cells transfected with 17-1 A, XII) Panorex (solid line) and mouse IgG2a isotype control (dashed line) on CHO cells transfected with 17-1 A. Figures VII-XII also show incubation results * ·· ...... ζ ....-... ·· '. · ·. · · ΣΖ. · · · · · 1. »······· · · *. And detection of relevant antibodies on untransfected CHO cells (dotted line).

Obrázek 18: Test buněčné toxicity závislé na protilátce značené ^5lCr. Pro měření uvolňování ⁵¹Cr se inkubovaly nestimulované lidské mononukleární buňky periferní krve (PBMC, 5 x 10⁵ buněk) jako efektorové buňky⁷ se značenými cílovými buňkami (buňky Kato značené 2 hodiny s ⁵¹Cr) a protilátkami v různých koncentracích 4 nebo 20 hodin při 37 °C. Jako negativní kontroly (H79=H79hulgGl) byly použity odpovídající nevázající izotypy (h-lgG = lidský IgGl, m-IgG2a = myší IgG2a). Specifická lýze se vypočítávala jako ((cpm, uvolňování během pokusu) - (cpm, spontánní uvolňování))/((cpm, maximální uvolňování) (cpm, spontánní uvolňování)), (cpm ~ counts per minuté = impulsy za minutu).Figure 18: ^5l Cr-labeled antibody-dependent cellular toxicity assay. To measure ⁵¹ Cr release, unstimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC, 5 x 10 ⁵ cells) were incubated as effector cells ⁷ with labeled target cells (Kato cells labeled 2 hours with ⁵¹ Cr) and antibodies at various concentrations for 4 or 20 hours at Deň: 32 ° C. The corresponding non-binding isotypes (h-IgG = human IgG1, m-IgG2a = mouse IgG2a) were used as negative controls (H79 = H79 huIgG1). The specific lysis was calculated as ((cpm, release during experiment) - (cpm, spontaneous release)) / ((cpm, maximum release) (cpm, spontaneous release)), (cpm ~ counts per minute = counts per minute).

Obrázek 19: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené M79 (pozitivní kontrola). Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s myší M79 protilátkou (IgG2a) jako pozitivní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou speroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).Figure 19: Light microscope photograph of M79-labeled human colon healthy tissue (positive control). Frozen sections of 5 nm thickness from normal mucosal tissue were incubated with mouse M79 antibody (IgG2a) as a positive control (10 µg / ml). Detection of bound mouse antibodies was performed with a polyclonal anti-mouse Ig antibody conjugated with speroxidase and labeled with carbazole (brown). Contrast staining was performed with hemalaun (blue).

Obrázek 20: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené H79 myším IgGl. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm tkáně normální sliznice se inkubovaly s myší IgG variantou protilátky H79 (10 pg/ml). Detekce navázaných myších IgGl protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).Figure 20: Light microscope photograph of H79-labeled human colon tissue of murine IgG1. Frozen sections of 5 nm thick normal mucosal tissue were incubated with mouse IgG variant H79 (10 µg / ml). Detection of bound mouse IgG1 antibodies was performed with a peroxidase-conjugated polyclonal anti-mouse Ig antibody and labeled with carbazole (brown). Contrast staining was performed with hemalaun (blue).

«»' ····*«» '····

Obrázek 21: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku značeného M79 (pozitivní kontrola). Zmražené ř&zy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly s myší M79 protilátkou (IgG2a) jako pozitivní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).Figure 21: Light microscope photograph of M79-labeled colon carcinoma (positive control). Frozen sections of 5 nm thickness from colon cancer tissue were incubated with mouse M79 antibody (IgG2a) as a positive control (10 pg / ml). Detection of bound mouse antibodies was performed with peroxidase-conjugated polyclonal anti-mouse Ig antibody and labeled with carbazole (brown). Contrast staining was performed with hemalaun (blue).

Obrázek 22: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku značeného H79 myším IgGl. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly s myší IgG variantou protilátky H79 (10 pg/ml). Detekce navázaných myších IgGl protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).Figure 22: Light microscope photograph of H79-labeled colon carcinoma mouse IgG1. Frozen sections of 5 nm thickness from colon cancer tissue were incubated with mouse IgG variant H79 (10 µg / ml). Detection of bound mouse IgG1 antibodies was performed with a peroxidase-conjugated polyclonal anti-mouse Ig antibody and labeled with carbazole (brown). Contrast staining was performed with hemalaun (blue).

Obrázek 23: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené myší izotypovou IgG2a kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s irelevantní myší ígG2a protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).Figure 23: Light microscope photograph of human healthy colon tissue labeled with mouse isotype IgG2a control. Frozen sections of 5 nm thickness from normal mucosal tissue were incubated with irrelevant mouse IgG2a antibody as a negative control (10 µg / ml). Detection of bound mouse antibodies was performed with a polyclonal anti-mouse Ig antibody conjugated with peroxidase and labeled with carbazole (brown). Contrast staining was performed with hemalaun (blue).

Obrázek 24: Fotografie ze světelného mikroskopu lidské tkáně zdravého tračníku značené izotypovou IgGl kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně normální sliznice se inkubovaly s irelevantní myší IgGl protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).Figure 24: Light microscope photograph of human colon healthy tissue labeled with isotype IgG1 control. Frozen sections of 5 nm thickness from normal mucosal tissue were incubated with irrelevant mouse IgG1 antibody as a negative control (10 µg / ml). Detection of bound mouse antibodies was performed with a polyclonal anti-mouse Ig antibody conjugated with peroxidase and labeled with carbazole (brown). Contrast staining was performed with hemalaun (blue).

« *«*

Λ·*·· · ·

Obrázek 25: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku značeného myší izotypovou IgG2a kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně z karcinomu tračníku se inkubovaly s irelevantní myší IgG2a protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální proti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).Figure 25: Light microscope photograph of colon carcinoma labeled with mouse isotype IgG2a control. Frozen sections of 5 nm thickness from colon cancer tissue were incubated with irrelevant mouse IgG2a antibody as a negative control (10 pg / ml). Detection of bound mouse antibodies was performed with a polyclonal anti-mouse Ig antibody conjugated with peroxidase and labeled with carbazole (brown). Contrast staining was performed with hemalaun (blue).

Obrázek 26: Fotografie ze světelného mikroskopu karcinomu tračníku značeného izotypovou IgGl kontrolou. Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku se inkubovaly s irelevantní myší IgGl protilátkou jako negativní kontrolou (10 pg/ml). Detekce navázaných myších protilátek se prováděla polyklonální antí-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem (hnědě). Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem (modře).Figure 26: Light microscope photograph of colon carcinoma labeled with isotype IgG1 control. Frozen sections of 5 nm thickness from colon cancer tissue were incubated with an irrelevant mouse IgG1 antibody as a negative control (10 pg / ml). Detection of bound mouse antibodies was performed with a peroxidase-conjugated polyclonal anti-mouse Ig antibody and labeled with carbazole (brown). Contrast staining was performed with hemalaun (blue).

Obrázek 27: Analýza epitopů myší protilátky M79 a lidských protilátek H79 a HD70, každá z nich je specifická pro lidský antigen 17-1 A. Protilátky se inkubovaly s mřížkou uspořádaných peptidů obsahující 119 polypeptidů ze 13 aminokyselin, vždy posunutých o dvě aminokyseliny a pokrývajících celou extracelulární aminokyselinovou sekvenci lidského antigenů 17-1 A. Peptidy byly kovalentně připojeny svými C-koncovými částmi na membránu Pep Spots (Jerini Biotools, Berlin) jako. jednotlivé body. Navázaná myší M79 protilátka byla přímo detekována na membráně Pep Spots antí-myší imunoglobulinovou protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP), po které následovala detekce chemiluminiscencí. Signály, které jsou způsobeny dík}· reaktivitě sekundární protilátky samotné s jednotlivými peptidovými body, jsou ukázány na odpovídajícím kontrolním značení membrány Pep Spots. Po subtrakci základního pozadí se ukázalo, že značení v peptidovém bodě 87, peptidových bodech 38 a 95 představuje specifickou vazbu myší protilátky ♦·« ·· · ♦Figure 27: Epitope analysis of murine M79 antibody and human H79 and HD70 antibodies, each of which is specific for the human 17-1 A antigen. Antibodies were incubated with a grid of aligned peptides containing 119 polypeptides of 13 amino acids each shifted by two amino acids and covering the entire extracellular amino acid sequence of human 17-1 antigens A. Peptides were covalently attached by their C-terminal portions to the Pep Spots membrane (Jerini Biotools, Berlin) as. individual points. Bound mouse M79 antibody was directly detected on the Pep Spots membrane with an anti-mouse horseradish peroxidase (HRP) conjugated immunoglobulin antibody followed by chemiluminescence detection. The signals due to the reactivity of the secondary antibody alone with the individual peptide points are shown on the corresponding control label of the Pep Spots membrane. After subtraction of the background, the labeling at peptide point 87, peptide points 38 and 95 was shown to be a specific binding of the murine antibody.

··»·· »

M79. Kvůli vysokému stupni zkřížené reaktivity sekundární anti-lidské imunoglobulinové protilátky konjugované s HRP s několika peptidovými body, byly navázané lidské protilátky H79 a HD70 přeneseny z membrány Pep Spots na blotovací membránu pomocí elektropřenosu a následně detekovány uvedenou anti-lidskou sekundární protilátkou a chemiluminiscencí. Specifická vazba lidské protilátky H79 byla detekována hlavně v peptidových bodech 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 a 79, ale v případě lidské protilátky HD70 nebyla detekována žádná vazba.M79. Due to the high degree of cross-reactivity of the HRP-conjugated secondary anti-human immunoglobulin antibody with several peptide points, bound human H79 and HD70 antibodies were transferred from Pep Spots membrane to the blotting membrane by electrotransmission and subsequently detected by said anti-human secondary antibody and chemiluminescence. Specific binding of human antibody H79 was detected mainly at peptide points 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 and 79, but no binding was detected for human HD70.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Přiklad 1Example 1

Konstrukce kombinačních protilátkových knihoven a fágová expoziceConstruction of Combination Antibody Libraries and Phage Exposure

Knihovna DNA fragmentů Fd lehkého řetězce lidského imunoglobulinu (Ig) a Ig těžkého řetězce byla konstruována pomocí metody RT-PCR, se sadami primerů specifických pro řetězce kappa, lambda a Fd delta, z celkové RNA izolované z lymfocytů periferní krve (PBL) a vzorků kostní dřeně ze čtyř a deseti lidských dárců, podle Chomczynského (Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987). Podle standardních metod byla syntetizována cDNA (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 2. vydání).A library of human immunoglobulin (Ig) and Ig heavy chain Fd DNA fragments was constructed by RT-PCR, with primer sets specific for kappa, lambda and Fd delta chains, from total RNA isolated from peripheral blood lymphocytes (PBL) and bone samples marrow from four and ten human donors, according to Chomczynski (Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987). CDNA was synthesized according to standard methods (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 2nd edition).

Byly vybrány následující sady primerů, které dávají vzniknout rozpoznávacím místům pro 5'- Xhol a 3'- Spěl na fragmentech těžkého řetězce a rozpoznávacím místům pro 5’- Sací a 3'- Xbal pro lehké řetězce:The following primer sets were selected that give rise to the 5'-XhoI and 3'-XbaI recognition sites for the heavy chain fragments and the 5'-XaI and 3'-XbaI light chain recognition sites:

Pro amplifikaci metodou PCR cDNA fragmentů Fd delta se pět různých specifických primerů pro 5'-VH-rodinu kombinovalo s jedním primerem pro 3’-CHl delta, pro amplifikaci PCR fragmentů kappa (K) lehkého řetězce se pět různých specifických primerů pro 5'-VK-rodinu kombinovalo s jedním primerem 3'-CK a pro amplifikaci fragmentů ., _ ..* ....For amplification by PCR of Fd delta cDNA fragments, five different 5'-VH-family specific primers were combined with one 3'-CH1 delta primer, to amplify kappa (K) light chain PCR fragments with five different 5'-specific specific primers The VK-family was combined with one primer of 3'-CK and for amplification of fragments.

• · » · · ’ ··« ♦·· ·«*· lambda (L) lehkého řetězce se pět různých specifických primerů pro 5'-VLrodinu kombinovalo s jedním primerem 3' -CL.The lambda (L) light chain was combined with five different 5'-VL family specific primers with one 3 '-CL primer.

Sady primerů pro amplifikaci DNA fragmentů Fab (5’ až 3’) jsou uvedeny v tabulce 1.Primer sets for DNA amplification of Fab fragments (5 'to 3') are shown in Table 1.

Pro amplifikaci byl použit následující program PCR:The following PCR program was used for amplification:

Denaturace v 94 °C 15 s, nasedání primerů v 52 °C s a prodloužení v 72 °C 90 s, 40 cyklů, po kterých následovalo konečné prodloužení v 72 °C 10 minut.Denaturation at 94 ° C for 15 s, primer annealing at 52 ° C s and extension at 72 ° C for 90 s, 40 cycles followed by a final extension at 72 ° C for 10 minutes.

Tabulka 1: Sady primerůTable 1: Primer Sets

Fd fragment těžkého řetězce:Fd fragment of heavy chain:

5’ primer:5 'primer:

VH 1,3,5,7: AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG VH2: CAG(AG)TCACCTTGCTCGAGTCTGG VH4: CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG VH4B: CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG VH6: CAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGG 3' primer:VH 1,3,5,7: AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG VH2: CAG (AG) TCACCTTGCTCGAGTCTGG VH4: CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG VH4B: CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG VH6: CAGGGCACAG

CD1: TGCCTTACTAGTCTCTGGCCAGCGGAAGATCD1: TGCCTTACTAGTCTCTGGCCAGCGGAAGAT

Fragment řetězce kappa:Kappa Chain Fragment:

5' primer:5 'primer:

VK1: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC VK3: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTG(AT)TGAC(AG)CAGTCTCC VK2/4: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGAC(CT)CAGTCTCC VK5: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC VK6: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTCTCC ·VK1: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC VK3: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTG (AT) TGAC (AG) CAGTCTCC VK2 / 4: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGAC (CT)

.·♦. · ♦

4 44 4

4 «4 «

44

4 ·♦·· ·· 4<4 · ♦ ·· ·· 4 <

3' primer:3 'primer:

CK1D:GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGCK1D: GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACG

GGCGAACTCAGGGCGAACTCAG

Fragment řetězce lambda:Lambda Chain Fragment:

5' primer:5 'primer:

VL1: AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCACVL1: AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC

VL2: TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTGVL2: TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG

VL3: TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTGVL3: TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG

VL4: TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTGVL4: TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG

VL5: CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCCVL5: CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCC

VL6: CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCCVL6: CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCC

VL7: CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCCVL7: CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC

VL8: CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCCVL8: CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC

3' primer:3 'primer:

CL2: CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGGCL2: CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG

450 ng fragmentů lehkého řetězce kappa (štěpených se Sací a Xbal) se ligovalo se 1400 ng fagemidu pComb3H (štěpeného se Sací a Xbal, velký DNA fragment) odvozeného z pComb (Barbas, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 7978-7982, 1991), kde pozice těžkého řetězce již byla obsazena fragmentem Fd chimerizované myší protilátky M79 (obsahující CH1 lidského IgGl) namířenému proti extracelulární části proteinu 17-1A (viz obr. 1 pro klonovací místa pComb3H).450 ng of kappa light chain fragments (digested with SacI and XbaI) were ligated with 1400 ng of phagemid pComb3H (digested with SacI and XbaI, a large DNA fragment) derived from pComb (Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7978). -7982, 1991), where the heavy chain position was already occupied by the Fd fragment of chimerized murine antibody M79 (containing human IgG1 CH1) directed against the extracellular portion of the 17-1A protein (see Figure 1 for pComb3H cloning sites).

Výsledná kombinační protilátková DNA knihovna pak byla elektroporací transformována do 300 μΐ elektrokompetentních Escherichia coli XL1 Blue (2,5 kV, kyveta s roztečí elektrod 0,2 cm, 25 FD, 200 Ohm,The resulting combinatorial antibody DNA library was then transformed by electroporation into 300 μΐ electrocompetent Escherichia coli XL1 Blue (2.5 kV, cell with 0.2 cm electrode pitch, 25 FD, 200 Ohm,

9* ♦ 9 » 9 9 «9 * ♦ 9

I 9 9 ¹ I 9 9 ¹

99« ··<99 «·· <

ř9 9999ř9 9999

9·9· ** na přístroji Bíorad Gene-Pulser), čímž vznikla knihovna o velikosti 4 x 10⁷ nezávislých klonů. Po jedné hodině fenotypové exprese se vybíraly pozitivní transformanty podle rezistence na karbenicilin kódované vektorem pComb. Po adaptaci byly tyto klony infikovány infekční dávkou 1 x 10¹² fágových částic pomocného fága VCSM13, což mělo za následek produkci a sekreci vláknitých fágů Ml3, z nichž každý obsahoval jednovláknovou pComb3H DNA kódující jeden lidský lehký řetězce a Fd segment chimérického M79 a exponoval na svém povrchu odpovídající Fab fragment jako translaění fúzi neinfekční části obalového proteinu III fága (technika fágové expozice, phage display), viz obr. 2.9 · 9 · ** on a Bíorad Gene-Pulser) to produce a library of 4 x 10 ⁷ independent clones. After one hour of phenotypic expression, positive transformants were selected for carbenicillin resistance encoded by the pComb vector. Upon adaptation, these clones were infected with an infectious dose of 1 x 10 ¹² VCSM13 helper phage particles, resulting in the production and secretion of filament M1 phages, each containing single stranded pComb3H DNA encoding one human light chain and Fd segment of chimeric M79, and exposed on its The surface corresponding Fab fragment as a translation fusion of the non-infectious portion of the phage display III protein (phage display technique), see Fig. 2.

Tato fágová knihovna nesoucí klonovaný Fah repertoár se sklidila z tkáňového supernatantu pomocí precípitace s PEG8000/NaCl a stočením, resuspendovala se v TBS/1% BSA a inkubovala se s rekombinantním s 17-1A mobilizovaným na 96 jamkových destičkách pro test ELISA. sl7-lA byl připraven, jak je popsáno (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995). Fab fágy, které se nenavázaly specificky na cílový antigen, se odstranily až deseti promývacími kroky sTBS/0,5% Tween. Ty, co se navázaly, byly eluovány s použitím HCl-glycinu, pH 2,2, a po neutralizaci eluátu s 2 M Tris, pH 12, se použily k infekci kultury nových neinfikovaných E. coli XL1 Blue. Buňky úspěšně transdukované kopií fagemida pComb, kódující Fab fragment vázající antigen, byly opět vybírány podle rezistence na karbenicilin a pak infikovány pomocným fágem VCSM13, aby se začalo druhé kolo expozice protilátek a in vitro selekce.This phage library carrying the cloned Fah repertoire was harvested from the tissue supernatant by precipitation with PEG8000 / NaCl and centrifuged, resuspended in TBS / 1% BSA and incubated with recombinant 17-1A mobilized in 96-well ELISA plates. 17-1A was prepared as described (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995). Fab phages that did not bind specifically to the target antigen were removed by up to ten wash steps with TBS / 0.5% Tween. Those bound were eluted using HCl-glycine, pH 2.2, and after neutralizing the eluate with 2 M Tris, pH 12, were used to infect cultures of new uninfected E. coli XL1 Blue. Cells successfully transduced with a copy of phagemid pComb, encoding the Fab antigen-binding fragment, were again selected for carbenicillin resistance and then infected with helper phage VCSM13 to initiate a second round of antibody exposure and in vitro selection.

Po pěti kolech produkce a selekce Fab fágů vázajících antigen byla izolována plazmidová DNA obsahující vybraný Fab repertoár.After five rounds of production and selection of Fab binding phages, plasmid DNA containing the selected Fab repertoire was isolated.

Pro produkci rozpustných Fab proteinů byl z plazmidů vyňat DNA fragment genu III, a tak se zrušila translační fúze Fd segmentu těžkého řetězce s proteinem genu III. Po opětné ligaci se tato skupina plazmidové DNA transformovala do 100 μΐ E. coli XL1 Blue, které byly učiněny kompetentními tepelným šokem, a byly vysety na LB agar s karbenicilinem (Carb). Jednotlivé kolonie se pěstovaly v 10 ml kulturách LB-Carb /20 mM <« « ·». - *· » ·· · » · ♦ · ·«· *♦· • * • · · ·For the production of soluble Fab proteins, the DNA fragment of gene III was removed from the plasmids, thus abolishing the translational fusion of the heavy chain Fd segment to the gene III protein. After re-ligation, this plasmid DNA group was transformed into 100 μΐ of E. coli XL1 Blue, which had been made by competent heat shock and plated on LB agar with carbenicillin (Carb). Individual colonies were grown in 10 ml LB-Carb / 20 mM cultures. - - - - - - - - - - - - - - - - - -

MgCla a exprese Fab se indukovala po šesti hodinách přidáním isopropylβ-D-thiogalaktosidu (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM. Tato in vitro selekce, jakož i exprese rozpustných fragmentů Fab, se prováděla podle Burtona (Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 10134-10137, 1991). Buňky- se sklízely po 20 hodinách, periplazmatické izolace se prováděly čtyřmi koly zmražení (etanol/suchý led) a rozmražení (37 °C) a testovaly se pomocí testu ELISA na přítomnost Fab fragmentů vázajících se ksl7-lA. Vazebnou aktivitu vykázalo 23 klonů z 27. Po sekvencování se ukázalo, že dva klony s nej silnějším signálem (viz obr. 3) mají totožné řetězce kappa a byly nazvány k8, viz obr. 6.MgCl1 and Fab expression was induced after six hours by adding isopropyl beta-D-thiogalactoside (IPTG) to a final concentration of 1 mM. This in vitro selection, as well as the expression of soluble Fab fragments, was performed according to Burton (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 10134-10137, 1991). Cells were harvested after 20 hours, periplasmic isolations were performed with four rounds of freezing (ethanol / dry ice) and thawing (37 ° C) and tested by ELISA for the presence of Fab fragments binding ks17-1A. 23 clones of 27 showed binding activity. After sequencing, the two strongest signal clones (see Figure 3) were shown to have identical kappa chains and were termed k8, see Figure 6.

Tento lidský lehký řetězec kappa k8 byl nyní použit jako vazebný partner pro skupinu těžkého řetězce lidského Ig delta, 2250 ng DNA Fd fragmentů lidského těžkého řetězce delta (štěpených s Xhol a Spěl) se ligovalo se 7000 ng fagemidového vektoru pComb3H (štěpeného s Xhol a Spěl, velký DNA fragment) obsahujícího DNA fragment k8 v pozici lehkého řetězce.This human kappa k8 light chain was now used as a binding partner for the human Ig delta heavy chain group, 2250 ng of human delta heavy chain DNA fragments (digested with XhoI and SpeI) were ligated with 7000 ng of phagemid vector pComb3H (digested with XhoI and SpeI) , a large DNA fragment) comprising a DNA fragment of k8 at the light chain position.

Výběr repertoáru lidského řetězce delta jako zdroje pro variabilní oblasti těžkého řetězce, které se specifický⁷ vážou na antigen 17-1 A, jsou-li spojeny s lehkým řetězcem k8, se jevilo jako nejvhodnější. Řetězce delta jsou produkovány pouze ve zralých naivních a pro autoantigen specifických anergních B buňkách, které ještě nepodstoupily proliferaci nebo proliferovat nebudou, proto je diverzita jejich repertoáru těžkých řetězců vyšší a výskyt jedné každé specifity ve srovnání s repertoárem těžkých řetězců jiných imunoglobulinových izotypů je nižší.Many of the human delta chain repertoire as source for heavy chain variable region that specifically bind to the antigen ⁷ and 17 to 1, when combined with the k8 light chain, appeared to be most suitable. Delta chains are produced only in mature naive and autoantigen-specific anergic B cells that have not yet undergone proliferation or will not proliferate, therefore the diversity of their heavy chain repertoire is higher and the incidence of one specificity is lower compared to the heavy chain repertoire of other immunoglobulin isotypes.

Transformace knihovny Fd fragmentů pComb-k8-delta do celkem 1500 μΐ E. coli XL1 Blue pěti stejnými elektroporacemi (2,5 kV, 0,2 cm kyveta, 25 FD, 200 Ohm) vedla ke konečnému počtu 1,1 x 10⁹ nezávislých klonů.Transformation of the pComb-k8-delta Fd fragment library into a total of 1500 μΐ E. coli XL1 Blue by five identical electroporations (2.5 kV, 0.2 cm cuvette, 25 FD, 200 Ohm) resulted in a final number of 1.1 x 10 ⁹ independent clones.

In vitro selekce této kombinační protilátkové knihovny se prováděla, jak je popsáno výše pro repertoár lidských lehkých řetězců. Po čtyřech kolech „rýžování“ byly z osmi klonů připraveny rozpustné Fab fragmenty.In vitro selection of this combinatorial antibody library was performed as described above for the human light chain repertoire. After four rounds of panning, soluble Fab fragments were prepared from eight clones.

·· ··*··· ·· * ·

Periplazmatické preparáty se testovaly ELISA. Jeden z klonů vykázal silnou vazbu antigenu (viz. Pbr. 4). Tento klon byl nazván D4.5 a DNA Fd delta fragmentu se sekvencovala s reverzním primerem specifickým pro delta CH1 (viz obr. 7).Periplasmic preparations were tested by ELISA. One of the clones showed strong antigen binding (see Pbr. 4). This clone was named D4.5 and the Fd delta fragment DNA was sequenced with a delta CH1-specific reverse primer (see Figure 7).

Další Fab fragment vázající s 17-1A se izoloval po dalších kolech „rýžování“, poprvé se objevil v sedmém kole s výrazně slabším signálem v testu ELISA ve srovnání s D4.5 (viz obr. 4). Klon byl označen D7.2 a opět se určila sekvence DNA s použitím primeru specifického pro delta (viz obr. 8).Another Fab fragment binding 17-1A was isolated after further rounds of panning, first appearing in the seventh round with a significantly weaker ELISA signal compared to D4.5 (see Figure 4). The clone was designated D7.2 and the DNA sequence was determined again using a delta-specific primer (see Figure 8).

Aby se identifikovaly další partneři lehkých řetězců, kteří se spojují s Fd segmentem těžkého řetězce delta za vzniku Fab fragmentu specifického pro 17-1 A, prováděl se pokus s přestavbou (reshuffling):In order to identify other light chain partners that associate with the Fd segment of the delta heavy chain to form a 17-1 specif specific Fab fragment, a reshuffling experiment was performed:

450 ng fragmentů lidského lehkého řetězce kappa a 450 ng fragmentů lidského lehkého řetězce lambda (oba štěpené se Sací a Xbal) se zvlášť ligovaly se 1400 ng fagemidu pComb3H (štěpeného se Sací a Xbal, velký DNA fragment), kde pozice těžkého řetězce již byla obsazena D4.5 Fd fragmentem.450 ng of human kappa light chain fragments and 450 ng of human lambda light chain fragments (both digested with SacI and XbaI) were separately ligated with 1400 ng of phagemid pComb3H (digested with SacI and XbaI, large DNA fragment) where the heavy chain position was already occupied D4.5 Fd fragment.

Každá z výsledných kombinačních protilátkových knihoven (kappa a lambda) pak byla elektroporací transformována do 300 μΐ elektrokompetentních Escherichia coli XL1 Blue (2,5 kV, 0,2 cm kyveta, 25 FD, 200 Ohm, na přístroji Bíorad gene-pulser), což mělo za následek knihovnu o velikosti 0,5 x 10⁷ nezávislých klonů pro knihovnu kappa al,4x 10⁷ nezávislých klonů pro knihovnu lambda. Po jedné hodině fenotypové exprese se vybíraly pozitivní transformanty podle rezistence na karbenicilin kódované vektorem pComb. Po adaptaci byly tyto klony infikovány infekční dávkou 1 x 10¹² fágových částic pomocného fága VCSM13, což mělo za následek produkci a sekreci vláknitých fágů Ml3, z nichž každý obsahoval jednovláknovou pComb3H DNA kódující jeden lidský lehký řetězce a D4.5 Fd segment těžkého řetězce a exponoval na svém povrchu odpovídající Fab fragment jako translační fúzi neinfekční části obalového proteinu III fága.Each of the resulting combinatorial antibody libraries (kappa and lambda) was then transformed by electroporation into 300 μpet electrocompetent Escherichia coli XL1 Blue (2.5 kV, 0.2 cm cuvette, 25 FD, 200 Ohm, on a Biorad gene-pulser), resulted in a library of 0.5 x 10 ⁷ independent clones for the kappa α1 library, 4x 10 ⁷ independent clones for the lambda library. After one hour of phenotypic expression, positive transformants were selected for carbenicillin resistance encoded by the pComb vector. Upon adaptation, these clones were infected with an infectious dose of 1 x 10 ¹² VCSM13 helper phage particles, resulting in the production and secretion of filament M1 phages, each containing single stranded pComb3H DNA encoding one human light chain and D4.5 Fd heavy chain segment, and exposed the corresponding Fab fragment on its surface as a translational fusion of the non-infectious portion of the phage III envelope protein.

• · ····• · ····

Obě fágové knihovny nesoucí klonované Fab repertoáry (kappa a lambda) se sklidily z tkáňového supernatantu pomocí precipitace s PEG8000/NaCl a stočením, resuspendovala se v TBS/1% BSA a inkubovala se s rekombinantním s 17-1A imobilizovaným na 96jamkových destičkách pro test ELISA. Fab fágy, které se nenavázaly specificky na cílový⁷ antigen, se odstranily až deseti promývacími kroky s TBS/0,5% Tween. Ty, co se navázaly, z obou knihoven(kappa a lambda), byly eluovány s použitím HCl-glycinu, pH 2,2, a po neutralizaci eluátu s 2M Tris, pH 12, se použily k infekci kultur nových neínfikováných E. coli XL1 Blue, jedna kultura pro knihovnu kappa a druhá pro knihovnu lambda. Buňky úspěšně transdukované kopií fagemida pComb, kódující Fab fragment vázající antigen, byly opět vybírány podle rezistence na karbenicilin a pak infikovány pomocným fágem VCSM13, aby se začalo druhé kolo expozice protilátek a in vitro selekce.Both phage libraries carrying cloned Fab repertoires (kappa and lambda) were harvested from the tissue supernatant by precipitation with PEG8000 / NaCl and centrifuged, resuspended in TBS / 1% BSA and incubated with recombinant 17-1A immobilized on 96-well ELISA plates. . Fab phages that did not specifically bind to the target ⁷ antigen were removed by up to ten wash steps with TBS / 0.5% Tween. Those bound from both libraries (kappa and lambda) were eluted using HCl-glycine, pH 2.2, and after neutralization of the eluate with 2M Tris, pH 12, were used to infect cultures of new uninfected E. coli XL1 Blue, one culture for the kappa library and the other for the lambda library. Cells successfully transduced with a copy of phagemid pComb, encoding the Fab antigen-binding fragment, were again selected for carbenicillin resistance and then infected with helper phage VCSM13 to initiate a second round of antibody exposure and in vitro selection.

Po pěti kolech produkce a selekce Fab fágů vázajících antigen se izolovala plazmidová DNA obsahující vybraný Fab repertoár z každého kola „rýžování“.After five rounds of production and selection of Fab antigen-binding phages, plasmid DNA containing the selected Fab repertoire was isolated from each round of panning.

Pro produkci rozpustných Fab proteinů byl z plazmidů vyňat DNA fragment genu III, a tak se zrušila translační fúze Fd segmentu těžkého řetězce s proteinem genu III. Po opětné ligaci se tato skupina plazmidové DNA transformovala do 100 μΐ E. coli XL1 Blue, které byly učiněny kompetentními tepelným šokem, a byly vysety na LB agar s karbenicilinem (Carb). Jednotlivé kolonie se pěstovaly v 10 ml kulturách LB-Carb /20 mM MgCL a exprese Fab se indukovala po šesti hodinách přidáním isopropylβ-D-thiogalaktosidu (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM. Buňky se sklízely po 20 hodinách, periplazmatické izolace se prováděly zmražením a rozmražením a testovaly se pomocí testu ELISA na přítomnost Fab fragmentů vázajících se k sl7-lA.For the production of soluble Fab proteins, the DNA fragment of gene III was removed from the plasmids, thus abolishing the translational fusion of the heavy chain Fd segment to the gene III protein. After re-ligation, this plasmid DNA group was transformed into 100 μΐ of E. coli XL1 Blue, which had been made by competent heat shock and plated on LB agar with carbenicillin (Carb). Single colonies were grown in 10 ml LB-Carb / 20 mM MgCL cultures and Fab expression was induced after six hours by adding isopropyl beta-D-thiogalactoside (IPTG) to a final concentration of 1 mM. Cells were harvested after 20 hours, periplasmic isolations were performed by freezing and thawing and tested by ELISA for the presence of Fab fragments binding to s17-IA.

Celkově se testovalo 45 klonů z knihovny kappa a 45 klonů z knihovny lambda pocházejících hlavně z pátého kola „rýžování“, ale do menší míry také z jiných kol, na vazbu antigenu 17-1A. Pouze jeden klon označený k5.1 (knihovna kappa), který⁷ se objevil v 5. Kole, vykazovalOverall, 45 clones from the kappa library and 45 clones from the lambda library, mainly from the fifth round of panning, but to a lesser extent from other rounds, were tested for 17-1A antigen binding. Only one clone designated k5.1 (kappa library), which ⁷ appeared in Round 5, showed

9 99 9

9 99 9

9 *9 *

999999

9 ·9 ·

♦ 9♦ 9

99

vazebnou aktivitu (viz obr. 5). Určila se sekvence DNA V-oblasti kappa 1<5.1 (viz obr. 9).binding activity (see Figure 5). The DNA sequence of the kappa V region <5.1 was determined (see Figure 9).

Příklad 2Example 2

Bakteriální exprese v E. coli XL1 BlueBacterial expression in E. coli XL1 Blue

Jak bylo již dříve uvedeno v příkladu 1, E. coli XL1 Blue transformované s pComb3H obsahující jeden lehký' řetězec a Fd segment jednoho těžkého řetězce produkují po vynětí fragmentu genu III a indukci s IPTG rozpustnou Fab v dostatečném množství. Fd segment těžkého řetězce a lehký řetězec jsou přesunovány do periplazmy, kde se spojují a tvoří funkční Fab fragmenty.As previously reported in Example 1, E. coli XL1 Blue transformed with pComb3H containing a single light chain and an Fd segment of one heavy chain produce sufficient amounts after removal of the gene III fragment and induction with IPTG soluble Fab. The Fd segment of the heavy chain and the light chain are moved to the periplasm where they combine to form functional Fab fragments.

Pro lepší periplazmatické preparáty se buňky pěstovaly v médiu SB doplněném o 20 mM MgCU a po sklizení se resuspendovaly v BS. Čtyřmi koly zmrazování v -70 °C a rozmrazování v 37 °C se tepelným šokem porušila vnější membrána bakterií a rozpustné periplazmatické proteiny obsahující Fab fragmenty byly uvolněny do supernatantu. Po odstranění neporušených buněk a buněčného detritu stočením se odebraly supernatanty obsahující protilátkové Fab fragmenty a použily se pro další práci.For better periplasmic preparations, cells were grown in SB medium supplemented with 20 mM MgCl 2 and resuspended in BS after harvest. By four rounds of freezing at -70 ° C and thawing at 37 ° C, the outer membrane of the bacteria was disrupted by heat shock and soluble periplasmic proteins containing the Fab fragments were released into the supernatant. After removal of intact cells and cell detritus by centrifugation, supernatants containing antibody Fab fragments were collected and used for further work.

Nejdříve se testovaly periplazmatické preparáty k8-D4.5-Fab a l<5.1-D4.5-Fab na vazbu k imobilizovanému antigenů sl7-lA, oba vykázaly silné ELISA signály (viz příklad 1).Periplasmic preparations of k8-D4.5-Fab and 1 < 5.1-D4.5-Fab were first tested for binding to immobilized sl7-1A antigens, both showing strong ELISA signals (see Example 1).

Detekce k8-D4.5- a k5.1-D4.5-Fab fragmentů navázaných k imobilizovanému antigenů s 17-1A se prováděla s použitím polyklonální biotinylované protilátky proti lidskému lehkému řetězci kappa (1 pg/ml PBS) detekované avídinem s konjugovanou křenovou peroxidázou (1 pg/ml PBS). Signál se vyvolal přidáním substrátového roztoku obsahujícího 2,2' azino-bis(3-etylbenz-thiazolin-6-sulfonovou kyselinu) a peroxoboritan sodný s detekoval se ve vlnové délce 405 nm.Detection of k8-D4.5- and k5.1-D4.5-Fab fragments bound to immobilized 17-1A antigens was performed using a polyclonal biotinylated anti-human kappa light chain antibody (1 µg / ml PBS) detected with horseradish conjugated avidin. peroxidase (1 µg / ml PBS). The signal was induced by the addition of a substrate solution containing 2,2 'azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) and sodium perborate with a wavelength of 405 nm.

• · ► * .··♦ • · · »♦· ♦♦· • *· ► · · · · • • • • •

Μ ··Μ ··

9·+· ·*9

Test vazby dvou 17-1A pozitivních lidských Fab fragmentů (k8-D4.5-Fab a k5.1-D4.5-Fab) na buňky Kato (buněčná linie karcinomu žaludku exprimující 17-1 A), buňky CHO transfekované 17-1A (CHO/17-1 A) a netransfekované buňky CHO, se opět prováděl na periplazmatických preparátech. Transfekované buněčné linie CHO se tvořily subklonováním DNA fragmentu kódujícího úplnou aminokyselinovou sekvenci antigenu 17-1 A, známého také jako GA733-2 (Szala, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3542-3546, 1990), do eukaryotického expresního vektoru pEF-DHFR (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995) podle standardních postupů (Sambrook, Molecular Cloníng, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Výsledný plazmid se linearizoval s Ndel a transfekoval do DHFR deficitních CHO buněk pro trvalou expresi. Exprese transmembránového 17-1A se zvýšila postupnou genovou amplifikací vyvolanou postoupným přidáváním stoupajících koncentrací inhibitoru DHFR metotrexátu (MTX) do konečné koncentrace 500 nM, rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi byly 20 nM a 100 nM (Kaufmann, Methods Enzymol., 185, 537-566, 1990).Assay of binding of two 17-1A positive human Fab fragments (k8-D4.5-Fab and k5.1-D4.5-Fab) to Kato cells (gastric cancer cell line expressing 17-1A), 17-1A transfected CHO cells (CHO / 17-1 A) and untransfected CHO cells were again performed on periplasmic preparations. Transfected CHO cell lines were generated by subcloning the DNA fragment encoding the complete amino acid sequence of the 17-1 A antigen, also known as GA733-2 (Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3542-3546, 1990), into a eukaryotic expression cell. pEF-DHFR vector (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7021-7025, 1995) according to standard procedures (Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). The resulting plasmid was linearized with NdeI and transfected into DHFR deficient CHO cells for sustained expression. Transmembrane 17-1A expression was increased by sequential gene amplification induced by the sequential addition of increasing concentrations of DHFR methotrexate (MTX) inhibitor to a final concentration of 500 nM, with differences between concentrations of 20 nM and 100 nM (Kaufmann, Methods Enzymol., 185, 537-566, 1990).

200 000 buněk (buněk Kato, CHO/17-1A nebo CHO) se inkubovalo s jedním z periplazmatických preparátů obsahujících relevantní nebo irelevantní Fab, po které následovala biotinylovaná polyklonální anti-lidská protilátka lehkého řetězce kappa (20 pg/ml PBS) a streptavidin konjugovaný s FITC. Značené buňky se pak analyzovaly průtokovou cytometrií.200,000 cells (Kato, CHO / 17-1A, or CHO cells) were incubated with one of the periplasmic preparations containing the relevant or irrelevant Fab, followed by biotinylated polyclonal anti-human kappa light chain antibody (20 µg / ml PBS) and streptavidin conjugated with FITC. The labeled cells were then analyzed by flow cytometry.

Periplazmatické preparáty obsahující k8-D4.5-Fab a k5.1-D4.5-Fab vykazovaly zřetelné signály ve srovnání s irelevantním periplazmatickým preparátem (negativní kontrola), ale netransfekované CHO buňky značeny nebyly, což dokazovalo specifičnost na antigen 17-1 A. Jako pozitivní kontrola pro buňky 17-1A pozitivní byla použita protilátka anti-17-ΙΑ M79 (Góttlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986) a myší ígG2a protilátka jako izotypová kontrola (viz obr. 10 a 11).Periplasmic preparations containing k8-D4.5-Fab and k5.1-D4.5-Fab showed distinct signals compared to irrelevant periplasmic preparation (negative control), but untransfected CHO cells were not labeled, demonstrating specificity for 17-1 A antigen Anti-17-ΙΑ M79 antibody (Göttlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986) and mouse IgG2a antibody was used as a positive control for 17-1A positive cells (see Figures 10 and 11). ).

Příklad 3Example 3

Eukaryotická exprese v buňkách CHOEukaryotic expression in CHO cells

Bakterie obvykle nejsou schopné produkovat kompletní funkční imunoglobuliny, ačkoliv exprimují funkční Fab fragmenty.Bacteria are generally unable to produce complete functional immunoglobulins, although they express functional Fab fragments.

Pro produkci kompletních funkčních protilátek se musí použít savčí buňky, a proto byly lehký řetězec k8 a variabilní doména těžkého řetězce D4.5 subklonovány do savčích expresních vektorů.Mammalian cells must be used to produce complete functional antibodies, and therefore the k8 light chain and the D4.5 heavy chain variable domain have been subcloned into mammalian expression vectors.

a) Lehké řetězce (k8 a k5.1):(a) Light chains (k8 and k5.1):

Aby vznikla vhodná koncová restrikení místa, byly DNA fragmenty k8 a k5.1 znovu amplifikovány pomocí PCR, čímž vznikly fragmenty kappa s místem Bsu36I na 5' konci, a také místa Sáli a Notl na 3' konci.In order to create appropriate terminal site restriction, the k8 and k5.1 DNA fragments were re-amplified by PCR, yielding kappa fragments with a Bsu36I site at the 5 'end as well as SalI and NotI sites at the 3' end.

Tyto fragmenty (1<8 a k5.1) byly subklonovány do plazmidu BSPOLL pomocí Bsu36I a Notl, tak se přidaly savčí vedoucí sekvence, a pak byly sekvencovány, aby se zabránilo mutacím vyvolaným PCR.These fragments (1 < 8 and k5.1) were subcloned into plasmid BSPOLL by Bsu36I and NotI, thus adding mammalian leader sequences, and then sequenced to prevent PCR-induced mutations.

S použitím EcoRl a Sáli, k8 a k5.1 byly vyňaty z BSPOLL a subklonovány do eukaiyotického expresního vektoru pEF-ADA (viz obr. 12) odvozeného z expresního vektoru pEF-DHFR (Mack, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 92, 7021-7025, 1995) nahrazením cDNA kódující myší dihydrofolátreduktázu (DHFR) cDNA kódující myší adenosindeaminázu (ADA).Using EcoR1 and SalI, k8 and k5.1, they were excised from BSPOLL and subcloned into the eukaiyotic expression vector pEF-ADA (see Figure 12) derived from the expression vector pEF-DHFR (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7021-7025 (1995) by replacing cDNA encoding murine dihydrofolate reductase (DHFR) with cDNA encoding murine adenosine deaminase (ADA).

Pro každý druh lehkého řetězce (k8 a k5.1) bylo 10⁷ buněk CHO transfekováno se 100 pg linearízované plazmídové DNA-a pak pěstováno v podmínkách vybraných dle aktivity adenosindeaminázy (ADA) kódované expresním vektorem.For each kind of light chain (k8 and k5.1), 10 ⁷ CHO cells were transfected with 100 µg of linearized plasmid DNA-and then grown under conditions selected according to the activity of adenosine deaminase (ADA) encoded by the expression vector.

Přežívající ADA pozitivní buňky se pěstovaly pro další transfekci s těžkými řetězci nesoucími variabilní doménu D4:5 nebo D7.2.Surviving ADA positive cells were cultured for further transfection with heavy chains carrying the variable domain of D4: 5 or D7.2.

·· ·*.·· · *.

• · ? :• ·? :

*·«·* · «·

b) Variabilní doména 4.5 těžkého řetězce:(b) Heavy chain variable domain 4.5:

Z Fd fragmentu D4.5 delta se opět amplifikovala variabilní oblast pomocí PCR za vzniku restrikčních míst Bsu36I na obou koncích.The variable region was again amplified from the D4.5 delta Fd fragment by PCR to generate Bsu36I restriction sites at both ends.

Výsledný DNA fragment V-D4.5 byl pak subklonován s použitím stejných restrikčních míst do eukaryotického expresního vektoru pEFDHFR již obsahujícího eukaryotickou vedoucí sekvenci, jakož i DNA fragment kódující konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl (viz obr. 13). Variabilní oblast D4.5 těžkého řetězce tak byla vložena mezi vedoucí sekvenci a konstantní oblast těžkého řetězce.The resulting DNA fragment V-D4.5 was then subcloned using the same restriction sites into a eukaryotic expression vector pEFDHFR already containing a eukaryotic leader sequence, as well as a DNA fragment encoding the human IgG1 heavy chain constant region (see Figure 13). Thus, the D4.5 heavy chain variable region was inserted between the leader sequence and the heavy chain constant region.

Variabilní oblast se sekvencovala a kompletní klon byl označen H79V-D4.5 hu IgGl.The variable region was sequenced and the complete clone was designated H79V-D4.5 hu IgG1.

Pro pozdější značení tkání byla konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl nahrazena konstantní oblastí těžkého řetězce myšího IgGl s použitím Xbal pro subklonování. Tento plazmid byl označen H79V-D4.5 MIgGI.For later tissue labeling, the human IgG1 heavy chain constant region was replaced with the murine IgG1 heavy chain constant region using XbaI for subcloning. This plasmid was designated H79V-D4.5 MIgGI.

Každá z obou variant D4.5 těžkého řetězce, lidský a myší IgGl, byla transfekována do 10⁷ CHO buněk, které již exprimovaly lehký řetězec k8. Varianta lidského IgGl byla také transfekována do buněk CHO exprimujících lehký řetězec k5.1. Pro transfekci těžkého řetězce bylo použito 100 pg linearizované plazmídové DNA.Both of the D4.5 heavy chain variants, human and murine IgG1, were transfected into 10 ⁷ CHO cells that already expressed k8 light chain. The human IgG1 variant was also transfected into CHO cells expressing the light chain k5.1. 100 pg of linearized plasmid DNA was used for heavy chain transfection.

Variabilní oblast Fd fragmentu D7.2 těžkého řetězce byla také subklonována do pEF-DHFR za vzniku plazmidu exprimujícího těžký řetězec lidského IgGl, jak je popsáno pro VD4.5. tento expresní plazmid byl pak transfekován do buněk CHO, které již exprimovaly lehký řetězec k8, jak je popsáno výše pro H79V-D4.5 hu IgGl.The variable region of the Fd fragment of D7.2 heavy chain was also subcloned into pEF-DHFR to produce a plasmid expressing the human IgG1 heavy chain as described for VD4.5. this expression plasmid was then transfected into CHO cells that already expressed the k8 light chain as described above for H79V-D4.5 hu IgG1.

Transfekované buňky byly podrobeny selekci dle aktivity ADA a DHFR, jak bylo popsáno (Kaufmann, Methods Enzymol., 185, 537-566,Transfected cells were selected for ADA and DHFR activity as described (Kaufmann, Methods Enzymol., 185, 537-566,

1990).1990).

Výsledné buněčné linie byly označeny H79-huIgGl (VD4.5huIgGlk8), H79-MIgGl (VD4.5MIgGl-kS), D7.2 (VD7.2huIgGl-k8) a HD70 (VD4.5huIgGl-k5.1).The resulting cell lines were designated H79-huIgG1 (VD4.5huIgG1-k8), H79-MIgG1 (VD4.5huIgG1-k8), D7.2 (VD7.2huIgG1-k8) and HD70 (VD4.5huIgG1-k5.1).

* · ,· ··*♦ » · · • ·* ·, · ···

Supernatanty ze čtyř různých konfluentnich 30 ml tkáňových kultur starých tři dny, z nichž každá produkovala jednu ze čtyř anti-17-ΙΑprotilátek (H79-huIgGl, H79-MIgGl, D7.2 a HD70), se testovaly pomocí ELISA na vazbu k imobilizovanému s 17-1 A. Kromě D7.2, která vykazovala v testu ELISA slabý signál, tři ostatní protilátky prokázaly silné signály, o nichž se usoudilo, že představují vazebnou afinitu v rozsahu myší protilátky M79.Supernatants from four different confluent 30 ml three day old tissue cultures, each producing one of four anti-17-ΙA antibodies (H79-huIgG1, H79-MIgG1, D7.2 and HD70), were tested by ELISA for binding to immobilized s A. In addition to D7.2, which showed a weak signal in the ELISA, three other antibodies showed strong signals that were considered to represent binding affinity within the range of murine M79 antibody.

Produkce protilátek ve velkém měřítku se prováděla v rotačních lahvích s použitím 500 ml média.Large scale antibody production was performed in rotary flasks using 500 ml medium.

Protilátky H79-huIgGl, D7.2 a HD70 se purifikovaly s použitím afinitní kolony proteinu A. Protilátka H79-MIgGl se purifikovala pomocí afinitní chromatografie s anti-myším IgG.The H79-huIgG1, D7.2 and HD70 antibodies were purified using a protein A affinity column. The H79-MIgG1 antibody was purified by affinity chromatography with anti-mouse IgG.

Čistota a molekulová hmotnost rekombinantních protilátek se určovala pomocí SDS-PAGE v redukčních a neredukčních podmínkách (obr. 14 a 15).Purity and molecular weight of recombinant antibodies were determined by SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions (Figures 14 and 15).

Purifikace proteinů a SDS-PAGE se prováděly podle standardních postupů.Protein purification and SDS-PAGE were performed according to standard procedures.

Příklad 4Example 4

Funkční analýza protilátek H79 a HD70Functional analysis of H79 and HD70 antibodies

IV. 1. Test na imobilizovaném antigenůIV. 1. Immobilized antigen test

Supematant z koníluentní 30 ml tkáňové kultury transfektant lidského a myšího IgGl staré tři dny, jakož i odpovídající preparáty purifikované protilátky, se testovaly na vazbu na imobilizovaný s 17-1A pomocí ELISA a srovnávaly se s myší M79 anti-17-ΙΑ protilátkou.Supernatant from a confluent 30 ml tissue culture of human and mouse IgG1 transfectants, three days old, as well as the corresponding purified antibody preparations, were tested for binding to immobilized with 17-1A by ELISA and compared to murine M79 anti-17-ΙΑ antibody.

Detekce se prováděla, jak je popsáno ve II.Detection was performed as described in II.

Ukázalo se, že protilátky H79 (varianty huIgGl a MIgGI) a HD70 mají velmi podobné vazebné afinity v rozsahu myší M79.H79 antibodies (huIgG1 and MIgGI variants) and HD70 have been shown to have very similar binding affinities in the range of M79 mice.

··· »·«··· »·

IV.2. Určení afinitIV.2. Determination of affinities

Měření povrchovou plazmonovou rezonancí se provádělo za použití zařízení BIACORE 2000 (Biacore AB, Freiburg, Německo). Imobilizace rekombinantního rozpustného antigenu 17-1A v každé průtokové komůrce a analýza interakce se prováděly automatickým způsobem v BIACORE 2000. Antigen se kovalentně navázal k senzorovému čipu CM5 prostřednictvím primárních aminových skupin. Po aktivaci karboxylované dextranové matrix senzorového čipu CM5 jednou injekcí 80 μΐ 0.1 Μ Nhydroxysukcinimidu/0,4 M N-etyl-N'-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimidu (NHS/EDC9) do všech čtyřech průtokových komůrek, byly průtokové komůrky 1, 2, 3 a 4 postupně zapojeny do průtokové dráhy v průběhu vtřikování antigenu s 17-1A (60 pg/ml v 10 mM acetátu sodném, pH 4,7). Různé kontaktní časy 17-1A s aktivovaným povrchem vedly k přibližně 2500 jednotkám odpovědi (RU) (9 RU v průtokové komůrce 1, 1400 RU v průtokové komůrce 2, 780 RU v průtokové komůrce 3 a 290 RU v průtokové komůrce 4). Přebytek aktivovaných esterů se blokoval injekcí 85 μΐ 1 M etanolaminu pH 5 do všech čtyřech průtokových komůrek. Vazebné pokusy se prováděly v 25 °C v pufru pH 7,4 obsahujícím 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA a 0,005% surfaktant P20. Vazebná kinetika protilátek k imobilizovanému rekombinantnímu 17-1A se určovala injikováním koncentrací protilátek v rozmezí od 0,5 do 2 μΜ. Senzorový čip se regeneroval mezi každým během 100 mM glycinem, 500 mM NaCl, 0,005% Tweenem pH 3. Asociační a disocíační rychlostní konstanty, K_on a Koff se analyzovaly s použitím vyhodnocovacího programu BIA od Biacore AB, jak popsáno (Karlsson, J. Immunol. Meth., 145, 229-240, 1991).Surface plasmon resonance measurements were performed using a BIACORE 2000 instrument (Biacore AB, Freiburg, Germany). Immobilization of recombinant soluble 17-1A antigen in each flow cell and interaction analysis were performed automatically in BIACORE 2000. The antigen was covalently coupled to the CM5 sensor chip via primary amine groups. After activation of the carboxylated dextran matrix of the CM5 sensor chip by a single injection of 80 μΐ 0.1 hyd N-hydroxysuccinimide / 0.4 M N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (NHS / EDC9) into all four flow chambers, flow chambers 1, 2, 3 and 4 were sequentially connected to the flow path during 17-1A antigen injection (60 pg / ml in 10 mM sodium acetate, pH 4.7). Different contact times of activated surface 17-1A resulted in approximately 2500 response units (RU) (9 RU in flow chamber 1, 1400 RU in flow chamber 2, 780 RU in flow chamber 3 and 290 RU in flow chamber 4). Excess activated esters were blocked by injecting 85 μΐ 1 M ethanolamine pH 5 into all four flow cells. Binding experiments were performed at 25 ° C in a pH 7.4 buffer containing 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA and 0.005% P20 surfactant. Antibody binding kinetics to immobilized recombinant 17-1A were determined by injecting antibody concentrations ranging from 0.5 to 2 μΜ. The sensor chip was regenerated between each over 100 mM glycine, 500 mM NaCl, 0.005% Tween pH 3. Association and dissociation rate constants, K _on and Koff were analyzed using a BIA evaluation program from Biacore AB as described (Karlsson, J. Immunol Meth., 145, 229-240 (1991).

Prováděly se dvě sady afinitních determinant (1. sada: M79, H79, D7.2, Panorex, 2. sada: Panorex, HD70), myší Panorex byl také zahrnut doTwo sets of affinity determinants were performed (Set 1: M79, H79, D7.2, Panorex, Set 2: Panorex, HD70), Panorex mouse was also included in

2. sady jako vnitřní reference.2. sets as internal references.

·♦·· » * · · • · · !· ♦ ·· »* · · · · ·!

··· • · • · · *··· • ·

Ukázalo se, že Kd D7.2 je pod minimální detekční hodnotou ΙΟ ⁴ M a není proto ukázána v tabulce 2.It has been shown that Kd D7.2 is below the minimum detection value ΙΟ ⁴ M and is therefore not shown in Table 2.

Tabulka 2Table 2

Rychlosti Kd, K_on a K_Off lidských a relevantních myších protilátek 17-1ARates of K d, K _on, and K _o ff of human and relevant murine antibodies 17-1A

Protilátka Antibody Kon (M^s-¹)Kon (M ^ s- ¹ ) Koff Koff K_D (M)K _D (M) 1. sada 1. set myší M79 M79 mice 6,0 x 10⁴ 6.0 x 10 ⁴ 4,5 x ΙΟ-² 4.5 x ΙΟ- ² 7,5 x 10⁷ 7.5 x 10 ⁷ lidská H79 human H79 2,1 x 10⁴ 2.1 x 10 ⁴ 7,2 x 10-³ 7.2 x 10- ³ 3,4 x 10-⁷ 3.4 x 10- ⁷ myší Panorex Panorex mouse 1,1 x 10⁵ 1.1 x 10 ⁵ 2,2 x ÍO-² 2.2 x IO ² 2,0 x 10-⁷ 2.0 x 10- ⁷ 2. sada 2. set lidská HD70 human HD70 0,9 x 10⁵ 0.9 x 10 ⁵ 3,5 x ΙΟ'² 3.5 x ΙΟ ² 3,9 x 10-⁷ 3.9 x 10- ⁷ myší Panorex Panorex mouse 1,0 x 10⁵ 1.0 x 10 ⁵ 2,7 x ΙΟ-² 2.7 x ΙΟ- ² 2,7 x 10-⁷ 2.7 x 10- ⁷

IV.3. Průtoková cytometrie eukaryotických buněk exprimujících 17-1AIV.3. Flow cytometry of eukaryotic cells expressing 17-1A

Purifikované protilátkové preparáty H79 (varianta lidského a myšího IgGl), HD70 (lidský IgGl) a D7.2 (lidský IgGl) se testovaly analýzou FACS na buňkách Kato exprimujících 17-1 A, buňkách CHO transfekovaných 17-1A a netransfekovaných buňkách CHO.Purified antibody preparations H79 (human and mouse IgG1 variant), HD70 (human IgG1) and D7.2 (human IgG1) were tested by FACS analysis on 17-1A Kato cells, 17-1A transfected CHO cells and non-transfected CHO cells.

x 10⁵ buněk se inkubovalo s purifikovanými protilátkami H79huIgGl, H79-MIgGl, HD70, D7.2, M79, Panorex, M74ch (= lidský CHIgGl lidské C kappa varianty myší anti-17-ΙΑ protilátky M74 (Góttlinger, Int. J. Cancer, 38, 47-53, 1986)), myší IgG2a, myší IgGl nebo lidský IgGl (20 pg/ml každé protilátky). Detekce protilátek navázaných na buňky sex 10 ⁵ cells were incubated with purified antibodies H79huIgG1, H79-MIgG1, HD70, D7.2, M79, Panorex, M74ch (= human CHIgG1 human C kappa variant of the mouse anti-17-ΙΑ antibody M74 (Göttlinger, Int. J. Cancer) 38, 47-53 (1986)), mouse IgG2a, mouse IgG1 or human IgG1 (20 pg / ml of each antibody). Detection of cell bound antibodies is

ΦΦ·* • φ • · φΦΦ · * • φ • · φ

φ φ · φφφφφ φ · φφφφ

....-Φ.Φ.. ** : *. ’· · • ··· ··:....- Φ.Φ .. **: *. ’· · · ··· ··:

• Φ ·· prováděla s protilátkami (každá 20 pg/ml) protí-myším IgG nebo protilidským IgG značenými FITC. Inkubace se prováděla 45-60 minut na ledu.Performed with antibodies (20 µg / ml each) to anti-mouse IgG or FITC-labeled anti-human IgG. Incubation was performed for 45-60 minutes on ice.

H79 lidský IgGl, H79 myší IgGl a HD70 vykázaly jasnou vazbu na 17-1A pozitivní buňky, jakož i M79 a Panorex. D7.2 ukázal slabou, ale významnou vazbu na 17-1A pozitivní buňky. Žádná protilátka se nenavázala na netransfekované buňky CHO a IgG kontroly byly negativní na buňkách Kato, buňkách CHO/17-1A a netransfekovaných buňkách CHO (viz obr. 16 a 17).H79 human IgG1, H79 mouse IgG1 and HD70 showed clear binding to 17-1A positive cells as well as M79 and Panorex. D7.2 showed weak but significant binding to 17-1A positive cells. No antibody bound to untransfected CHO cells and IgG controls were negative on Kato cells, CHO / 17-1A cells and untransfected CHO cells (see Figures 16 and 17).

IV.4. Buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (uvolňování ⁵¹Cr)IV.4. Antibody-dependent cellular cytotoxicity ( ⁵¹ Cr release)

Pro uvolňování ⁵¹Cr byly jako efektorové buňky izolovány mononukleární buňky lidské periferní krve (PBMC) zdravých dárců z čerstvě připravené vrstvy sražených buněk. PBMC se oddělily stočením na hustotním gradientu Ficollu s následným stočením ve 100 x g. Nestimulované PBMC (5 χ 10⁵ buněk) se přidaly do objemu 100 μΐ média RPMI 1640 s 10% FCS do každé jamky na mikrotitrační destičce s plochým dnem a inkubovaly přes noc v 37 °C. Cílové buňky se značily 2 hodiny s ⁵¹Cr. Značené cílové buňky (100 pl) a protilátky v různých koncentracích (50 pl) se přidaly k PBMC a inkubovaly 18 hodin v 37 °C. Odpovídající nevázající izotypy byly použity jako negativní kontroly. Specifická lýze se počítala jako ((cpm, uvolňování během pokusu) - (cpm, spontánní uvolňování))/((cpm, maximální uvolňování) - (cpm, spontánní uvolňování)), (cpm - counts per minuté = impulsy za minutu).To release ⁵¹ Cr, human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors were isolated from the freshly prepared clot cell layer as effector cells. PBMCs were separated by centrifugation on a Ficoll density gradient followed by centrifugation at 100 x g. Unstimulated PBMCs (5 χ 10 ⁵ cells) were added to a volume of 100 μ RP RPMI 1640 medium with 10% FCS to each well on a flat-bottom microtiter plate and incubated over noc: 37 ° C. Target cells were labeled with ⁵¹ Cr for 2 hours. Labeled target cells (100 µl) and antibodies at various concentrations (50 µl) were added to PBMC and incubated for 18 hours at 37 ° C. The corresponding non-binding isotypes were used as negative controls. The specific lysis was calculated as ((cpm, release during experiment) - (cpm, spontaneous release)) / ((cpm, maximum release) - (cpm, spontaneous release)), (cpm - counts per minute = counts per minute).

V tomto testu uvolňování ⁵¹Cr se prokázalo, že lidské anti-17-ΙΑ protilátky H79 a HD70 zprostředkovávají vysokou cytotoxicitu pro 17-1A pozitivní buněčnou linii Kato ze žaludečního karcinomu. Ukázalo se, že myší anti-17-ΙΑ protilátky M79 a Panorex zprostředkovávají usmrcování buněk na zřetelně nižší úrovni.In this ⁵¹ Cr release assay, human anti-17-ΙΑ antibodies H79 and HD70 were shown to mediate high cytotoxicity to the 17-1A positive gastric cancer Kato cell line. Mouse anti-17-ΙΑ antibodies M79 and Panorex have been shown to mediate cell killing at a markedly lower level.

·♦ * ·· ·«·« • : .· .· . :· ♦ * ·· · «·« •:. ·. ·. :

·♦·« ·· ·· ·· • · · · * · · ·«* ··· • * ·· ··♦ «« · · «* * * * * * * * *

IV.5. Test na lidských tkáníchIV.5. Test on human tissues

Zmražené řezy o tloušťce 5 nm z tkáně karcinomu tračníku a z tkáně normální sliznice tračníku se inkubovaly s myší IgG variantou protilátky H79 (10 gg/ml). V tomto pokusu byla použita myší IgGl varianta protilátky H79, aby se zabránilo nespecifickému značení způsobenému přítomností lidského imunoglobulinu v lidské tkáni. Detekce navázané H79MIgGl se prováděla polyklonální anti-myší Ig protilátkou konjugovanou s peroxidázou a značila karbazolem. Kontrastní barvení se provádělo hemalaunem.Frozen sections of 5 nm thickness from colon carcinoma tissue and normal colon mucosal tissue were incubated with mouse IgG variant H79 (10 gg / ml). In this experiment, the murine IgG1 variant of H79 was used to prevent non-specific labeling due to the presence of human immunoglobulin in human tissue. Detection of bound H79MIgG1 was performed with a polyclonal anti-mouse Ig antibody conjugated with peroxidase and labeled with carbazole. Contrast staining was performed with hemalaun.

Výsledky se vyhodnocovaly světelným mikroskopem.Results were evaluated by light microscope.

H79MIgGl a také myší monoklonální protilátka M79 (pozitivní kontrola) vykázaly silné značení v normální slizníci tračníku (M79, obr. 19, H79MIgGl, obr. 20) a slabší značení v buňkách karcinomu tračníku (M79, obr. 21, H79MIgGl, obr. 22). Na rozdíl od toho izotypové kontroly nevykázaly žádné značení v tkáních sliznice tračníku a karcinomu tračníku (M79, obr. 23 a 25 a H79MIgGl, obr. 24 a 26).H79MIgG1 and also mouse monoclonal antibody M79 (positive control) showed strong labeling in normal colon mucosa (M79, Fig. 19, H79MIgG1, Fig. 20) and weaker labeling in colon cancer cells (M79, Fig. 21, H79MIgG1, Fig. 22). ). In contrast, isotype controls showed no staining in colon and colon carcinoma tissues (M79, Figs. 23 and 25 and H79MgG1, Figs. 24 and 26).

Příklad 5Example 5

Analýza epitopů H79 a HD70Analysis of H79 and HD70 epitopes

Pro srovnání 17-1A epitopů rozpoznávaných lidskými protilátkami H79 a HD70 a myší templátovou protilátkou M79 byly syntetizovány 13-merní peptidy odvozené z aminokyselinové sekvence extracelulární části antigenu 17-1A jako jednotlivé body na membráně Pep Spots. Tyto peptidy pokrývají veškerou extracelulární aminokyselinovou sekvenci antigenu 17-1A (jak byla definován autorem Szala, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3542-3546, 1990) tak, že se překrývají v 11 aminokyselinách s každým sousedním peptidem, kdy první aminokyselina peptidu 1 je totožná s N-koncovou aminokyselinou antigenu 17-1A a poslední aminokyselina peptidu 119 je totožná s C-koncovou aminokyselinou extracelulární části antigenu 17-1A (tab. 3).To compare the 17-1A epitopes recognized by the human H79 and HD70 antibodies and the murine M79 template antibody, 13-mer peptides derived from the amino acid sequence of the extracellular portion of the 17-1A antigen were synthesized as single points on the Pep Spots membrane. These peptides cover the entire extracellular amino acid sequence of the 17-1A antigen (as defined by Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3542-3546, 1990) by overlapping in 11 amino acids with each adjacent peptide, the first amino acid of peptide 1 is identical to the N-terminal amino acid of antigen 17-1A and the last amino acid of peptide 119 is identical to the C-terminal amino acid of extracellular portion of antigen 17-1A (Table 3).

φφ • · • φ φφφ • · • φ φ

♦ e·· ···· • · • φ φ < · 2 φφφ ··· φ ♦ φφ *«♦ e ·· ···· · · • φ φ <· 2 φφφ ··· φ ♦ φφ * «

Tabulka 3Table 3

Syntetizované peptidy (čísla odpovídají číslům peptidových bodů)Synthesized peptides (numbers correspond to peptide point numbers)

I. TATFAAAQEECVCI. TATFAAAQEECVC

3. AAAQEECVCENYK3. AAAQEECVCENYK

5. EECVCENYKLAVN5. EECVCENYKLAVN

7. CENYKLAVNCFVN7. CENYKLAVNCFVN

9. KLAVNCFVNNNRQ9. KLAVNCFVNNNRQ

II. NCFVNNNRQCQCT 13. NNNRQCQCTSVGAII. NCFVNNNRQCQCT 13. NNNRQCQCTSVGA

15. QCQCTSVGAQNTV15. QCQCTSVGAQNTV

17. TSVGAQNTVICSK17. TSVGAQNTVICSK

19. AQNTVICSKLAAK19. AQNTVICSKLAAK

21. VICSKLAAKCLVM21. VICSKLAAKCLVM

23. KLAAKCLVMKAEM23. KLAAKCLVMKAEM

25. KCLVMKAEMNGSK25. KCLVMKAEMNGSK

27. MKAEMNGSKLGRR27. MKAEMNGSKLGRR

29. MNGSKLGRRAKPE29. MNGSKLGRRAKPE

31. KLGRRAKPEGALQ31. KLGRRAKPEGALQ

33. RAKPEGALQNNDG33. RAKPEGALQNNDG

35. EGALQNNDGLYDP35. EGALQNNDGLYDP

37. QNNDGLYDPDCDE37. QNNDGLYDPDCDE

39. GLYDPDCDESGLF39. GLYDPDCDESGLF

41. PDCDESGLFKAKQ41. PDCDESGLFKAKQ

43. ESGLFKAKQCNGT43. ESGLFKAKQCNGT

45. FKAKQCNGTSTCW45. FKAKQCNGTSTCW

47. QCNGTSTCWCVNT47. QCNGTSTCWCVNT

49. TSTCWCVNTAGVR49. TSTCWCVNTAGVR

51. WCVNTAGVRRTDK51. WCVNTAGVRRTDK

53. TAGVRRTDKDTEI53. TAGVRRTDKDTEI

55. RRTDKDTEITCSE55. RRTDKDTEITCSE

57. KDTEITCSERVRT57. KDTEITCSERVRT

59. ITCSERVRTYWII59. ITCSERVRTYWII

61. ERVRTYWIIIELK61. ERVRTYWIIIELK

63. TYWIIIELKHKAR63. TYWIIIELKHKAR

65. IIELKHKAREKPY65. IIELKHKAREKPY

67. KHKAREKPYDSKS67. KHKAREKPYDSKS

69. REKPYDSKSLRTA69. REKPYDSKSLRTA

71. YDSKSLRTALQKE71. YDSKSLRTALQKE

73. SLRTALQKEITTR73. SLRTALQKEITTR

75. ALQKEITTRYQLD75. ALQKEITTRYQLD

77. EITTRYQLDPKFI77. EITTRYQLDPKFI

2. TFAAAQEECVCEN2. TFAAAQEECVCEN

4.AQEECVCENYKLA4.AQEECVCENYKLA

6. CVCENYKLAVNCF6. CVCENYKLAVNCF

8. NYKLAVNCFVNNN8. NYKLAVNCFVNNN

10. AVNCFVNNNRQCQ10. AVNCFVNNNRQCQ

12. FVNNNRQCQCTSV12. FVNNNRQCQCTSV

14. NRQCQCTSVGAQN14. NRQCQCTSVGAQN

16. QCTSVGAQNTVIC16. QCTSVGAQNTVIC

18. VGAQNTVICSKLA18. VGAQNTVICSKLA

20. NTVICSKLAAKCL20. NTVICSKLAAKCL

22. CSKLAAKCLVMKA22. CSKLAAKCLVMKA

24. AAKCLVMKAEMNG24. AAKCLVMKAEMNG

26. LVMKAEMNGSKLG26. LVMKAEMNGSKLG

28. AEMNGSKLGRRAK28. AEMNGSKLGRRAK

30. GSKLGRRAKPEGA30. GSKLGRRAKPEGA

32. GRRAKPEGALQNN32. GRRAKPEGALQNN

34. KPEGALQNNDGLY34. KPEGALQNNDGLY

36. ALQNNDGLYDPDC36. ALQNNDGLYDPDC

38. NDGLYDPDCDESG38. NDGLYDPDCDESG

40. YDPDCDESGLFKA40. YDPDCDESGLFKA

42. CDESGLFKAKQCN42. CDESGLFKAKQCN

44. GLFKAKQCNGTST44. GLFKAKQCNGTST

46. AKQCNGTSTCWCV46. AKQCNGTSTCWCV

48. NGTSTCWCVNTAG48. NGTSTCWCVNTAG

50. TCWCVNTAGVRRT50. TCWCVNTAGVRRT

52. VNTAGVRRTDKDT52. VNTAGVRRTDKDT

54. GVRRTDKDTEITC54. GVRRTDKDTEITC

56. TDKDTEITCSERV56. TDKDTEITCSERV

58. TEITCSERVRTYW58. TEITCSERVRTYW

60. CSERVRTYWIIIE60. CSERVRTYWIIIE

62. VRTYWIIIELKHK62. VRTYWIIIELKHK

64. WIIIELKHKAREK64. WIIIELKHKAREK

66.ELKHKAREKPYDS66.ELKHKAREKPYDS

68. KAREKPYDSKSLR68. KAREKPYDSKSLR

70. KPYDSKSLRTALQ70. KPYDSKSLRTALQ

72. SKSLRTALQKEIT72. SKSLRTALQKEIT

74. RTALQKEITTRYQ74. RTALQKEITTRYQ

76. QKEITTRYQLDPK76. QKEITTRYQLDPK

78. TTRYQLDPKFITS • ·-·77. TTRYQLDPKFITS • · - ·

79. RYQLDPKFiTSIL 81. DPKFITSILYENN79. RYQLDPKFiTSIL 81. DPKFITSILYENN

83. ITSILYENNVITI 85. LYENNVITIDLVQ 87. NVITIDLVQNSSQ 89. IDLVQNSSQKTQN 91. QNSSQKTQNDVDI 93. QKTQNDVDIADVA 95. NDVDIADVAYYFE 97. IADVAYYFEKDVK 99. AYYFEKDVKGESL 101. EKDVKGESLFHSK 103. KGESLFHSKKMDL 105. LFHSKKMDLTVNG 107. KKMDLTVNGEQLD 109. LTVNGEQLDLDPG83. 85. ITSILYENNVITI LYENNVITIDLVQ NVITIDLVQNSSQ 87. 89. 91. IDLVQNSSQKTQN QNSSQKTQNDVDI QKTQNDVDIADVA 93. 95. 97. NDVDIADVAYYFE IADVAYYFEKDVK AYYFEKDVKGESL 99. 101. 103. EKDVKGESLFHSK KGESLFHSKKMDL LFHSKKMDLTVNG 105. 107. 109. KKMDLTVNGEQLD LTVNGEQLDLDPG

111. GEQLDLDPGQTLI 113. DLDPGQTLIYYVD 115. GQTLIYYVDEKAP 117. IYYVDEKAPEFSM 119. DEKAPEFSMQGLK111. GEQLDLDPGQTLI 113. DLDPGQTLIYYVD 115. GQTLIYYVDEKAP 117. IYYVDEKAPEFSM 119. DEKAPEFSMQGLK

80. QLDPKFITSILYE 82. KFITSILYENNVI80. QLDPKFITSILYE 82. KFITSILYENNVI

84. SILYENNVITIDL 86. ENNVITIDLVQNS 88. ITIDLVQNSSQKT 90. LVQNSSQKTQNDV 92. SSQKTQNDVDIAD 94. TQNDVDIADVAYY 96. VDIADVAYYFEKD 98. DVAYYFEKDVKGE 100. YFEKDVKGESLFH 102. DVKGESLFHSKKM 104. ESLFHSKKMDLTV 106. HSKKMDLTVNGEQ 108. MDLTVNGEQLDLD 110. VNGEQLDLDPGQT 112. QLDLDPGQTLIYY 114. DPGQTLIYYVDEK 116. TLIYYVDEKAPEF 118. YVDEKAPEFSMQG84. SILYENNVITIDL ENNVITIDLVQNS 86. 88. 90. ITIDLVQNSSQKT LVQNSSQKTQNDV SSQKTQNDVDIAD 92. 94. 96. TQNDVDIADVAYY VDIADVAYYFEKD DVAYYFEKDVKGE 98. 100. 102. YFEKDVKGESLFH DVKGESLFHSKKM ESLFHSKKMDLTV 104. 106. 108. HSKKMDLTVNGEQ MDLTVNGEQLDLD VNGEQLDLDPGQT 110. 112. 114. QLDLDPGQTLIYY DPGQTLIYYVDEK 116th TLIYYVDEKAPEF 118. YVDEKAPEFSMQG

Membrána Pep Spots se syntetizovanými peptidy se třepala 10 minut v metanolu a pak se promývala třikrát po deseti minutách v pufru TBS pH 8. Pak se membrána blokovala jednu hodinu blokovacím roztokem na bázi kasetou, který obsahoval 0,05 g/ml sacharózy, a pak se znovu třepala v TBS pH 8/0,05% Tween 20 (TBS-T). Každá z protilátek 17-IA se inkubovala při teplotě místnosti spolu s membránou tri hodiny v blokovacím roztoku (1 pg protilátky/ml). Po třech promytích v TBS-T, každé deset minut, se spolu s membránou inkubovala dvě hodiny při teplotě místnosti sekundární protilátka (protí-myší/proti-lidská, 1 pg/ml blokovacího roztoku) konjugovaná s křenovou peroxidázou (HRP). Pak se membrána promývala třikrát deset minut v TBS-T. Detekce navázaných protilátek se prováděla v případě M79 přímo na membráně Pep Spots podle protokolu výrobce chemiluminiscenčního kitu (Boehringer). Vyvolané filmy jsou ukázány na obr. 27. Membrána se regenerovala po třech promytíchThe Pep Spots membrane with synthesized peptides was shaken for 10 minutes in methanol and then washed three times for ten minutes in TBS pH 8. Then the membrane was blocked for one hour with a cassette-based blocking solution containing 0.05 g / ml sucrose and then was shaken again in TBS pH 8 / 0.05% Tween 20 (TBS-T). Each of the 17-IA antibodies was incubated at room temperature with the membrane for three hours in blocking solution (1 µg antibody / ml). After three washes in TBS-T, every ten minutes, a secondary antibody (anti-mouse / anti-human, 1 µg / ml blocking solution) conjugated with horseradish peroxidase (HRP) was incubated with the membrane for two hours at room temperature. Then the membrane was washed three times for ten minutes in TBS-T. Detection of bound antibodies was performed for M79 directly on the Pep Spots membrane according to the protocol of the chemiluminescent kit manufacturer (Boehringer). The developed films are shown in Fig. 27. The membrane was regenerated after three washes

- 33 sTBS-T (10 minut) v roztoku obsahujícím 50 mM Tris-HCl pH 6,7, 100 mM 2-merkaptoetanol a 2% (w/v) SDS 30 minut v 50 °C a pak použila znovu pro mapování epitopu další protilátky.- 33 sTBS-T (10 minutes) in a solution containing 50 mM Tris-HCl pH 6.7, 100 mM 2-mercaptoethanol and 2% (w / v) SDS for 30 minutes at 50 ° C and then used again for epitope mapping antibodies.

Kvůli vysokému stupni nespecifické vazby proti-lidské ímunoglobulinové sekundární protilátky k polypeptidovým bodům na membráně, se v případě HD70 a H79 prováděl frakcíonovaný elektropřenos na druhou přenosovou membránu následovaný detekcí s proti-lidskou sekundární protilátkou podle Rúdigera (EMBO, 16, 1501-1507, 1997). Inkubace se sekundární protilátkou a detekce protilátky na membránách se prováděla, jak je popsáno výše. Vyvolané filmy jsou ukázány na obr. 27.Due to the high degree of non-specific binding of anti-human immunoglobulin secondary antibody to the polypeptide points on the membrane, in the case of HD70 and H79, fractionated electrotransfer was performed on the second transfer membrane followed by detection with the anti-human secondary antibody according to Roudiger. ). Incubation with secondary antibody and detection of antibody on membranes was performed as described above. The developed films are shown in Fig. 27.

Jak je na tomto obrázku ukázáno (obr. 27), výsledky mapování epitopů založeného na peptidech naznačují, že epitop rozpoznávaný myší templátovou protilátkou M79, představovaný převážně peptidovými body 38 a 95, se pronikavě liší od epitopu rozpoznávaného lidskou protilátkou H79, představovanou převážně peptidovými body 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 a 79. Protože lidská protilátka HD70 vůbec neukázala detekovatelnou vazbu, může se dále předpokládat, že se její epitop také liší od epitopu myší protilátky M79 a že epitopy lidských protilátek H79 a HD70 také nejsou totožné.As shown in this figure (FIG. 27), peptide-based epitope mapping results indicate that the epitope recognized by the murine M79 template antibody, represented predominantly by peptide points 38 and 95, differs significantly from the epitope recognized by the human H79 antibody, represented predominantly by peptide points 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 and 79. Since the human HD70 antibody did not show any detectable binding at all, it can further be assumed that its epitope also differs from that of the murine M79 antibody and that the human H79 and HD70 epitopes also they are not identical.

Nepřítomnost detekovatelných vazebných signálů v případě lidské protilátky HD70 se může vysvětlit jejím možným rozpoznáváním buď konformačního, spojitého nebo nespojitého epitopu nebo epitopu částečně nebo úplně sestávajícího ze sacharidu, v každém případě lze těžko očekávat napodobení takových epitopů krátkými peptidy.The absence of detectable binding signals for the human HD70 antibody can be explained by its possible recognition of either a conformational, continuous or discontinuous epitope or an epitope partially or completely consisting of a carbohydrate, in any case it is difficult to anticipate mimicking such epitopes with short peptides.

··· ··· • ···· ··· • ·

Přehled sekvencí (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:Sequence overview (2) INFORMATION FOR SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleové kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:(A) LENGTH: 22 pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 1 SEQUENCE:

AGGTGCAGCT GCTCGAGTCT GG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:AGGTGCAGCT GCTCGAGTCT GG 22 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleové kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:(A) LENGTH: 24 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 2 SEQUENCE:

CAGAGTCACC TTGCTCGAGT CTGG 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:CAGAGTCACC TTGCTCGAGT CTGG 24 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleové kyselina (A) POPIS: /desc = „primer • ♦ • <· · · · · ······ • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:(A) LENGTH: 23 pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer • ♦ • (Xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 3:

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG 23 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:(A) LENGTH: 23 pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 4:

CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG 23 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:(A) LENGTH: 23 pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc - primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG 23 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina • · · · · · ♦ 0 · · · • « ··· 0 0 0 • · · • 0 · · · · · (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:(A) LENGTH: 30 pairs of baffles (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid · · · · · · ♦ 0 · · · · « (A) DESCRIPTION: / desc = "primer (xi) DESCRIPTION OF SEQUENCE: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 6:

TGCCTTACTA GTCTCTGGCC AGCGGAAGAT 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:TGCCTTACTA GTCTCTGGCC AGCGGAAGAT 30 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:(A) LENGTH: 38 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE IDENTIFICATION NUMBER 7:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC 38 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 8:

(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS. SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:(A) LENGTH: 40 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 8:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATTGAC AGCAGTCTCC 40 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATTGAC AGCAGTCTCC 40 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 39 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:(A) LENGTH: 39 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 9:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACC TCAGTCTCC 39 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACC TCAGTCTCC 39 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 38 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:(A) LENGTH: 38 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 10 SEQUENCE:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC 38 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 38 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:(A) LENGTH: 38 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO 11:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC 38 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC 38 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 58 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • ·(A) LENGTH: 58 bp (B) TYPE: nucleic acid • ·

I * » · • · · • · · (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:(C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULAR TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc - primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE S IDENTIFICATION NUMBER 12:

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC GAACTCAG 58 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC GAACTCAG 58 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 13:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:(A) LENGTH: 24 pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc - primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 13 SEQUENCE:

AATTTTGAGC TCACTCAGCC CCAC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:AATTTTGAGC TCACTCAGCC CCAC 24 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 14:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:(A) LENGTH: 27 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 14 SEQUENCE:

TCTGCCGAGC TCCAGCCTGC CTCCGTGTCTGCCGAGC TCCAGCCTGC CTCCGTG

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:(A) LENGTH: 27 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:

TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG 27 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG 27 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 33 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc - „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:(A) LENGTH: 33 pairs of baffles (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc - primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO 16:

TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG 33 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:(A) LENGTH: 24 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 17:

CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC • 9 • 9 • · · · · · 99₉· • · 9 « 9999 • ♦ · · 9 9 999999 • · · 9 9 · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC 9 • • • 9 · · · · · ₉ · 99 · 9 • «• ♦ 9999 · 9 9 999999 • · · · · 9 9 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:(A) LENGTH: 24 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 18:

CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC 24 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:(A) LENGTH: 24 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 19:

CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC 24 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC 24 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 27 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:(A) LENGTH: 27 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 20:

CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC • · • · • · · · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 30 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc = „primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:(A) LENGTH: 30 pairs (b) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = primer (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 21:

CGCCGTCTAG AATTATGAAC ATTCTGTAGG 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:CGCCGTCTAG AATTATGAAC ATTCTGTAGG 30 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22:

Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:Thr Ala Thr Phe Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23:

Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu 1 5Thr Phe Ala Ala Gin Glu Glu 1 5

Cys Val Cys Glu Asn 10 ·· · to · ··· ·· ··« to ···· · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:Cys Val Cys Glu Asn 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24:

Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:Ala Ala Ala Gin Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 25:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25:

Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26:

Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys 1 5Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys 1

Leu Ala Val Asn 10 ·· ·· • · · • · · • · · · · · • · ·♦ ·· • «Leu Ala Val Asn 10 ·· ··· · · · · · · · · · · · · · · ·

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27:

Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe 1.5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:Cys Val Cys Phlu 1.5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 28:

Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 29:

Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn 1 5 10 • 0 0000 • 0 · 00 00 «*·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn 1 5 10 • 0 0000 • 0 · 00 00 «* ·· (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 30:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30:

Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn As G Arg 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 31:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 31:

Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:Cys Gin ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 32:

Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr 1 5 10 • » ·· • 9 9 ·Asn Asys Asn Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr 1 5 10 • »·· • 9 9 ·

9 9 · ·· · ··» «· *··· • · · ·· • · · • · · · • · · · ···· 0· ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:9 9 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 33 9 9 · · · · · · · · · · · · · · :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 33:

Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 34:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 34:

Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 35:

Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn ¹ 5 10Asn Arg Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn ¹ 5 10

44 • · 4 4• 4 4

4 4 44 4 4

444 44»444 44 »

44

4444

4444 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:4444 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 36:

Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:Gin Cys Gin Cys Thr Ser Gly Ala Gin Asn Thr Val 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 37:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 37:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 37:

Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:Gin Cys Thr Ser Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 38:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 38:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 38:

Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys 1 5 10 • · · · • · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 39:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 39:

Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 40:Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM.40:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER SEQUENCE.40:

Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 41:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 41:

Asn Thr Val Ile 1Asn Thr Val Ile

Cys Ser Lys Leu Ala 5Cys Ser Lys Leu Ala 4

Ala Lys Cys Leu 10 ·· · · · · · · • ·· · ········ • · * · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:Ala Lys Cys Leu 10 · 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 ) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 42:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 42:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 42:

Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 43:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 43:

Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:Cys Ser Lys Leu Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 44:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 44:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 44:

Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu MetLys Ley Ala Ala Lys Ley Cys Leu Lys Ala Glu Met

10 • · · ·· · · · · * · • · · · · · · · • t « · a · ······ • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:10 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· ·· (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 45:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 45:

Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 46:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 46:

Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 47:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 47:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 47:

Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu GlyLeu Val Met Lys Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly

5 10 • · · ·5 10 • · · ·

9 9 9 9 9999999 9 9 9 999999

9 9 · ···· • 9 9 9 9 9 9999999 9 · ···· 9 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:9 9 9 9 9 9 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 48:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 48:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 48:

Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 49:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 49:

Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 50:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 50:

Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys For Glu 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 51:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 51:

Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys For Glu Gly Ala ¹ 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA:.13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 52:(A) LENGTH: .13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 52:

Lys Leu Gly 1Lys Leu Gly 2

Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:Arg Arg Ala Lys For Glu Gly Ala Leu Gin 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 53:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 53:

Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:Gly Arg Arg Ala Lys For Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 54:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 54:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 54:

Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 55:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 55:

Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:Lys For Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asp Gly Leu Tyr ¹ 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 56:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 56:

Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp ^{1 5} 10Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asp Gly Leu Tyr Asp ^{1 5} 10

Pro • · · · ·· · • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:For (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 57:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 57:

Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys ¹⁵ 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp For Asp Cys ¹⁵ 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 58:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 58:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 58:

Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp For Asp Cys Asp Glu 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 59:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 59:

Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly ¹ 5 ₁₀ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:Asn Asp Gly Leu Tyr Asp For Asp Cys Asp Glu Ser Gly ¹ 5 ₁₀ (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 60:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 60:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 60:

Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 61:Gly Leu Tyr Asp For Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 61:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA.: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 61:(A) LENGTH .: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 61:

Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 62:Tyr Asp For Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 62:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 62:

Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin 15 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 63:For Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin 15 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 63:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 63:

Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn ^{1 2 * * 5} 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 64:Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn ^{1 2 * * 5} 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 64:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 64:

Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Glv Thr 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 65:Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Glv Thr 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 65:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 65:

Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr 15 10 ·4· 444 • · • · 4 4 ·· 444 4 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 66:Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr 15 10 · 4 · 444 • · • · 4 4 ·· 444 4 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 66:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 66:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 66:

Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 67:Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 67:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 67:

Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 68:Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 68:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 68:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 68:

Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 69:Cys Val Asn Thr 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 69:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 69:

Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 70:Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 70:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 70:

Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 71:Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 71:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 71:

Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr ^{1 5} 10Thr Trp Cys Cys Asn Thr Val Ala Val Arg Gly Arg Thr ^{1 5} 10

9999

9 99 9

9 99 9

999 999999 999

99

99 •· 999 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 72:99 • · 999 9 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 72:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 72:

Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 73:Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Arg Arg Thr Asp Lys 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 73:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER SEQUENCE 73:

Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 74:Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 74:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 74:

Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile 15 10Thr Ala Gly Val Arg Arg

00 > 0 0 ·00> 0 0 ·

I 0 0 0I 0 0 0

000 000000 000

00

0000

0000 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 75:0000 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 75:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 75:

Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu lle Thr Cys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 76:Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu lle Thr Cys 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 76:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 76:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 76:

Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu lle Thr Cys Ser Glu ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 77:Arg Arg Thr Lys Asp Thr Glu lle Thr Cys Ser Glu ¹ 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 77:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 77:

Thr Asp Lys Asp Thr Glu lle Thr Cys Ser Glu Arg Val ¹ 5 io ·· 9999Thr Lys Asp Glu Asp Thr Ile Thr Cys Ser Val Glu Arg ¹ 5 io ·· 9999

74 74 99 9999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 9 9 9 99 9999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 9 9 9 2) INFORMACE 2) INFORMATION PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM FOR IDENTIFICATION SEQUENCE ČÍSLEM 78: NUMBER 78: (i) (and) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) (ii) TYP TYPE MOLEKULY: peptid MOLECULES: peptide

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 78:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 78:

Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 79:Lys Asp Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr ¹ 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 79:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 79:

Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 80:Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Arg Arg Thr Tyr Trp ¹ 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 80:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 80:

Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val· Arg Thr Tyr Trp Ile Ile 15 10 • 4 4 4Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val · Arg Thr Tyr Trp Ile Ile 15 10 • 4 4 4

4 4 4 • 944 4444 4 • 944 444

44

44 4444 44

9444 •9444 •

• 4 *• 4 *

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 81:(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 81:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 81:

Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu 1 5 10 .Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Ip Ile Ile Glu 1 5 10.

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 82:(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 82:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 82:

Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 83:Glu Leu Lys 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 83:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 83:

Val Arg Thr Tyr 1Val Arg Thr Tyr 2

Trp Ile Ile Ile Glu 5Ip Ile Ile Glu 5

Leu Lys His Lys 10 • · · • · · · · ···· ·· ··· ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 84:Leu Lys His Lys 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 84:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 84:’(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER SEQUENCE 84: '

Thr Tyr Trp lle lle lle Glu Leu Lys His Lys Ala Arg 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 85:Thr Tyr Trp lle lle lle Glu Leu Lys His Lys Ala Arg 10 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 85:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 85:

Trp lle lle lle Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 86:Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 86:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 86:

lle lle Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyrlle lle Glu Leu Lys His Arg Glu Lys Pro Tyr

10 • ·· · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 87:10 • ·· · (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 87:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 87:

Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 88:Glu Lys For Tyr Asp Ser 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 88:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 88:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 88:

Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 89:Lys Ser Lys Ser 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xí) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 89:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (s) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 89:

Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp 1 5Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp 15 5

Ser Lys Ser Leu Arg 10 ·· · ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 90:Ser Lys Ser Leu Arg 10 ·· · ··· (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 90:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 90:

Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 91:Arg Glu Lys For Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 91:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 91:

Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 92:Lys Pro Tyr Asp Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 92:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 92:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 92:

Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu 15 10Tyr Asp Ser Lys Ser Leu

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 93:(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 93:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 93:

Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 94:Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 94:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 94:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 94:

Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 95:Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 95:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 95:

Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr GinArg Thr Ala Leu Gin

10 • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 96:10 • · (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 96:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 96:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 96:

Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 97:Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 97:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 97:

Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 98:Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp For Lys 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 98:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 98:

Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 99:Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp For Lys Phe Ile 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 99:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 99:

Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe lle Thr Ser 15 10 ' (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 100:Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp For Lys Phe lle Thr Ser 15 10 '(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 100:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 100:

Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe lle Thr Ser lle Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 101:Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe lle Thr Ser lle Leu 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 101:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 101:

Gin Leu Asp Pro Lys Phe lle Thr Ser lle Leu Tyr GluGin Leu Asp Pro Lys Phe lle Thr

5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 102:5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 102:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 102:

Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 103:Asp For Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 103:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 103:

Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 104:Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 104:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 104:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 104:

Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 105:Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 105:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 105:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 105:

Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 106:Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 106:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 106:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 106:

Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 107:Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 107:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 107:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 107:

Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser ¹ 5 10 ·· ···· • · · ·· ·· ···· • · · · · ♦ · · • · · · ········ • · · · · · · ···· ·· ··· ··· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 108:Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser ¹ 5 10 ·· ························ · · · · (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 108:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 108:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 108:

Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 109:Asn Ser Ser Gin 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 109:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 109:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 109:

Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr ^{1 5} 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 110:Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr ^{1 5} 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 110:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 110:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 110:

Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser 1 5Ile Asp Leu Val Gin As Ser Ser 1 5

Gin Lys Thr Gin Asn 10 ♦· 99 9 9Gin Lys Thr Gin Asn 10 · 99 9 9

99 9 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 111:99 9 99 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 111:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 111:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 111:

Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 112:Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 112:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 112:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 112:

Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 113:Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 113:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 113:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 113:

Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp 15 10 ·· 9999Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Ile Ala Asp 15 10 ·· 9999

999 9999 9

99

99

99 9999 99

9 -9 9 9 9 9 99 -9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 99

9 » ······ • · · · ··· *·· ·· ·· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 114:9 »(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 114:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 114:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 114:

Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp 1 5Gin Lys Thr

Ile Ala Asp Val Ala 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 115:Ile Ala Asp Val Ala 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 115:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 115:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 115:

Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 116:Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 116:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 116:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 116:

Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe GluAsn Asp Val Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu

10 ··· · • · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 117:(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 117:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 117:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 117:

Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 118:Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 118:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 118:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 118:

Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 119:Ile Ala Asp Val Ala Tyr Phr Glu Lys Asp Val Lys 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 119:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 119:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 119:

Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys 1 5Asp Val Ala Tyr Phe Glu Lys 1 5

Asp Val Lys Gly Glu 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 120:Asp Val Lys Gly Glu 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 120:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 120:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 120:

Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 121:Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Glu Ser Leu 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 121:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 121:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 121:

Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 122:Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Glu Ser Leu Phe His ¹ 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 122:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 122:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 122:

Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys 1 5 10 • · · · · · • · 9 • · • 9 9 • · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 123:Glu Lys Asp Val Lys Glu Ser Leu Phe His Ser Lys 1 5 10 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 123:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER SEQUENCE 123:

Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 124:Lys Lys Met 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 124:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 124:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 124:

Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 125 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 125 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 125:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 125:

Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val ¹ 5 10 ··· 99 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 126:Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Met Asp Leu Thr Val ¹ 5 10 ··· 99 9 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 126:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 126:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 126:

Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly 1 5 IQ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 127:Leu Thr Val Asn Gly 1 5 IQ (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 127:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 127:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 127:

His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 128:His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 128:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 128:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 128:

Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu AspLys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Leu Asp

10 • · · · · · β · · · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 129:10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 129:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 129:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 129:

Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 130:Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Leu Asp Leu Asp 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 130:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 130:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 130:

Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 131:Leu Thr Val Asn Gly Glu Leu Asp Leu Asp Pro Gly 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 131:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 131:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 131:

Val Asn Gly Glu 1Val Asn Gly Glu

Gin Leu Asp Leu Asp 5Gin Leu Asp

Pro Gly Gin Thr 10 • · • ·Pro Gly Gin Thr 10

• · · • · • » · • · · • · · · · · • · · • · • » • · · · · · 92 92 2) INFORMACE 2) INFORMATION PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 132 FOR IDENTIFICATION NUMBER SEQUENCE (i) (and) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) (ii) TYP TYPE MOLEKULY: peptid MOLECULES: peptide

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 132:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 132:

Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu lle ¹ 5 io (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 133:Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp For Gly Gin Thr Leu lle ¹ 5 io (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 133:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 133:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 133:

Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu lle Tyr Tyr 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 134:Gin Leu Asp Leu Asp For Gly Gin Thr Leu lle Tyr Tyr 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 134:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 134:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 134:

Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu 1 5 lle Tyr Tyr Val Asp 10 ·· ·· » · · · » 4 4 4Asp Leu Asp Gly Gin Thr Leu 1 5 lle Tyr Tyr Val Asp 10

444 444 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 135:444 444 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 135:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 135:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 135:

Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys ^{1 5} 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 136:Asp Glu Gin Thr Leu Ile Tyr Val Asp Glu Lys ^{1 5} 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 136:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 136:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 136:

Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 137:Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro 1 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 137:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 137:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 137:

Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu PheThr Leu Ile Tyr Val Glu Glu Lys Ala Pro Glu Phe

10 • 0 •00 000 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 138:10 • 0 • 00 000 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 138:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 138:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 138:

lle Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 139:lle Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met 15 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 139:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 139:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER 139:

Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly ¹ 5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 140:Tyr Val Asp Glu Lys Ala For Glu Phe Ser Met Gin Gly ¹ 5 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 140:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 140:(A) LENGTH: 13 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) FIBER TYPE: simple (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 140:

Asp Glu Lys Ala 1Asp Glu Lys Ala 2

Pro Glu Phe Ser Met 5For Glu Phe Ser Met 5

Gin Gly Leu Lys 10 • * ··· · • ·9 · ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 141:Gin Gly Leu Lys 10 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 141:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 321 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:(A) LENGTH: 321 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: double (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURES:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..321 (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 141:(A) NAME / IDENTIFICATION: CDS (B) POSITION: 1..321 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 141:

GAG Glu 1 GAG Glu 1 CTC Leu CTC Leu CAG ATG CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC ACC CAG TCT CCA CTG Leu CTG Leu TCT Ser TCT Ser GCT Ala GCT Ala TCT Ser TCT Ser GTG Val 15 GTG Wall 15 Dec GGA Gly GGA Gly 48 48 Gin Gin Met Met Thr Gin 5 Thr Gin Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ser 10 Ser 10 GAC GAC AGA AGA GTC GTC ACC ACC ATC ATC ACT ACT TGT TGT CGG CGG ACA ACA AGT AGT CAG CAG AGC AGC ATT ATT AGC AGC AGC AGC TAT MELT 96 96 Asp Asp Arg Arg Val Wall Thr Thr Ile Ile Thr Thr Cys Cys Arg Arg Thr Thr Ser Ser Gin Gin Ser Ser Ile Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr 20 20 May 25 25 30 30 TTA TTA AAT AAT TGG TGG TAT MELT CAG CAG CAG CAG AAA AAA CCA CCA GGA GGA CAG CAG CCT CCT CCT CCT AAG AAG CTG CTG CTC CTC ATT ATT 144 144 Leu Leu Asn Asn Trp Trp Tyr Tyr Gin Gin Gin Gin Lys Lys Pro For Gly Gly Gin Gin Pro For Pro For Lys Lys Leu Leu Leu Leu Ile Ile 35 35 40 40 45 45 TAC TRAY TGG TGG GCA GCA TCT TCT ACC ACC CGG CGG GAA GAA TCC TCC GGG GGG GTC GTC CCT CCT GAC GAC CGA CGA TTC TTC AGT AGT GGC GGC 192 192 Tyr Tyr Trp Trp Ala Ala Ser Ser Thr Thr Arg Arg Glu Glu Ser Ser Gly Gly Val Wall Pro For Asp Asp Arg Arg Phe Phe Ser Ser Gly Gly 50 50 55 55 60 60 AGC AGC GGG GGG TCT TCT GGG GGG ACA ACA GAT GAT TTC TTC ACT ACT CTC CTC ACC ACC ATC ATC AGC AGC AGT AGT CTA CTA CAA CAA CCT CCT 240 240 Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Asp Asp Phe Phe Thr Thr Leu Leu Thr Thr Ile Ile Ser Ser Ser Ser Leu Leu Gin Gin Pro For 65 65 70 70 75 75 80 80 GAA GAA GAT GAT TCT TCT GCA GCA ACT ACT TAC TRAY TAC TRAY TGT TGT CAG CAG CAG CAG AGT AGT TAC TRAY GAC GAC ATC ATC CCG CCG TAC TRAY 288 288 Glu Glu Asp Asp Ser Ser Ala Ala Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Cys Cys Gin Gin Gin Gin Ser Ser Tyr Tyr Asp Asp Ile Ile Pro For Tyr Tyr 85 85 90 90 95 95 ACT ACT TTT TTT GGC GGC CAG CAG GGG GGG ACC ACC AAG AAG CTG CTG GAG GAG ATC ATC AAA AAA 321 321 Thr Thr Phe Phe Gly Gly Gin Gin Gly Gly Thr Thr Lys Lys Leu Leu Glu Glu Ile Ile Lys Lys 100 100 ALIGN! 105 105

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 142:(2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 142:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární • · · · • · · · · · · ···· • · * · · · · · • « · · ··«····» • » · · · · * «··· ·· ··· ··· ·· ·· (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 142:(A) LENGTH: 107 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear · · · · ··· · · · (Ii) MOLECULA TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: IDENTIFICATION NUMBER SEQUENCE 142:

Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ser Val 15 Wall 15 Dec Gly Gly 1 1 5 5 10 10 Asp Asp Arg Arg Val Wall Thr Thr Ile Ile Thr Thr Cys Cys Arg Arg Thr Thr Ser Ser Gin Gin Ser Ser Ile Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr 20 20 May 25 25 30 30 Leu Leu Asn Asn Trp Trp Tyr Tyr Gin Gin Gin Gin Lys Lys Pro For Gly Gly Gin Gin Pro For Pro For Lys Lys Leu Leu Leu Leu Ile Ile 35 35 40 40 45 45 Tyr Tyr Trp Trp Ala Ala Ser Ser Thr Thr Arg Arg Glu Glu Ser Ser Gly Gly Val Wall Pro For Asp Asp Arg Arg Phe Phe Ser Ser Gly Gly 50 50 55 55 60 60 Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Thr Thr Asp Asp Phe Phe Thr Thr Leu Leu Thr Thr Ile Ile Ser Ser Ser Ser Leu Leu Gin Gin Pro For 65 65 70 70 75 75 80 80 Glu Glu Asp Asp Ser Ser Ala Ala Thr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Cys Cys Gin Gin Gin Gin Ser Ser Tyr Tyr Asp Asp Ile Ile Pro For Tyr Tyr 85 85 90 90 95 95 Thr Thr Phe Phe Gly Gly Gin Gin Gly Gly Thr Thr Lys Lys Leu Leu Glu Glu Ile Ile Lys Lys

100 105 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 143:100 105 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 143:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) (AND) DÉLKA: 414 LENGTH: 414 párů bázi base pairs (B) (B) TYP: nukleová kyselina TYPE: nucleic acid (C) (C) TYP VLÁKNA: FIBER TYPE: dvoj ité double (D) (D) TOPOLOGIE: TOPOLOGY: lineární linear

(ix) ZNAKY:(ix) FEATURES:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..414 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 143:(A) NAME / DESIGNATION: CDS (B) POSITION: 1..414 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 143:

GAG GTG CAG GAG GTG CAG CTG Leu CTG Leu CTC GAG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT TCT GGG GGA GGC GTC GTG GTC CAG CCT GGG AGG GGG AGG 48 48 Glu Val Glu Val Gin 110 Gin 110 Leu Leu Glu Glu Ser Ser Gly 115 Gly 115 Gly Gly Gly Gly Val Wall Val Wall Gin 120 Gin 120 Pro For Gly Gly Arg Arg TCC TCC CTG CTG AGA AGA CTC CTC TCC TCC TGT TGT GCA GCA GCC GCC TCT TCT GGA GGA TTC TTC ACC ACC TTC TTC AGT AGT AGC AGC TAT MELT 96 96 Ser Ser Leu Leu Arg Arg Leu Leu Ser Ser Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Phe Phe Thr Thr Phe Phe Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr

125 130 135 f · · · ·125 130 135 f · · · ·

GGC ATG CAC GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC 144 144 Gly 140 Gly 140 Met Met His His Trp Trp Val Arg Gin Ala 145 Val Arg Gin Ala Pro For Gly Gly Lys 150 Lys 150 Gly Gly Leu Leu Glu Glu Trp Trp Val 155 Wall 155 GCA GCA GTT GTT ATA ATA TCA TCA TAT MELT GAT GAT GGA GGA AGT AGT AAT AAT AAA AAA TAC TRAY TAT MELT GCA GCA GAC GAC TCC TCC GTG GTG 192 192 Ala Ala Val Wall Ile Ile Ser Ser Tyr Tyr Asp Asp Gly Gly Ser Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Ala Asp Asp Ser Ser Val Wall 160 160 165 165 170 170 AAG AAG GGC GGC CGA CGA TTC TTC ACC ACC ATC ATC TCC TCC AGA AGA GAC GAC AAT AAT TCC TCC AAG AAG AAC AAC ACG ACG CTG CTG TAT MELT 240 240 Lys Lys Gly Gly Arg Arg Phe Phe Thr Thr Ile Ile Ser Ser Arg Arg Asp Asp Asn Asn Ser Ser Lys Lys Asn Asn Thr Thr Leu Leu Tyr Tyr 175 175 180 180 185 185 CTG CTG CAA CAA ATG ATG AAC AAC AGC AGC CTG CTG AGA AGA GCT GCT GAG GAG GAC GAC ACG ACG GCT GCT GTG GTG TAT MELT TAC TRAY TGT TGT 288 288 Leu Leu Gin Gin Met Met Asn Asn Ser Ser Leu Leu Arg Arg Ala Ala Glu Glu Asp Asp Thr Thr Ala Ala Val Wall Tyr Tyr Tyr Tyr Cys Cys 190 190 195 195 200 200 GCG GCG AAA AAA GAT GAT ATG ATG GGG GGG TGG TGG GGC GGC AGT AGT GGC GGC TGG TGG AGA AGA CCC CCC TAC TRAY TAC TRAY TAC TRAY TAC TRAY 336 336 Ala Ala Lys Lys Asp Asp Met Met Gly Gly Trp Trp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Trp Trp Arg Arg Pro For Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 205 205 210 210 215 215 GGT GGT ATG ATG GAC GAC GTC GTC TGG TGG GGC GGC CAA CAA GGG GGG ACC ACC ACG ACG GTC GTC ACC ACC GTC GTC TCC TCC TCA TCA GCA GCA 384 384 Gly Gly Met Met Asp Asp Val Wall Trp Trp Gly Gly Gin Gin Gly Gly Thr Thr Thr Thr Val Wall Thr Thr Val Wall Ser Ser Ser Ser Ala Ala 220 220 225 225 230 230 235 235 ccc ccc ACC ACC AAG AAG GCT GCT CCG CCG GAT GAT GTG GTG TTC TTC CCT CCT CTA CTA 414 414 Pro For Thr Thr Lys Lys Ala Ala Pro For Asp Asp Val Wall Phe Phe Pro For Leu Leu

240 245 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 144:240 245 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 144:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 138 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 144:(A) LENGTH: 138 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 144:

Glu Val 1 Glu Val Gin Gin Leu Leu 5 Leu Leu Glu Ser Glu Ser Gly Gly Gly 10 Gly Gly Gly Val Val Gin Val Gin Pro Gly Arg 15 For Gly Arg 15 Ser Ser Leu Leu Arg Arg Leu Leu Ser Ser Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Phe Phe Thr Thr Phe Phe Ser Ser Ser Tyr Ser Tyr 20 20 May 25 25 30 30 Gly Gly Met Met His His Trp Trp Val Wall Arg Arg Gin Gin Ala Ala Pro For Gly Gly Lys Lys Gly Gly Leu Leu Glu Glu Trp Val Trp Val 35 35 40 40 45 45

Ala Ala Val 50 Wall 50 lle lle Ser Ser Tyr Tyr Asp Asp Gly 55 Gly 55 Ser Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr Tyr 60 Tyr 60 Ala Ala Asp Asp Ser Ser Val Wall Lys 65 Lys 65 Gly Gly Arg Arg Phe Phe Thr Thr lle 70 lle 70 Ser Ser Arg Asp Arg Asp Asn Asn Ser 75 Ser 75 Lys Lys Asn Asn Thr Thr Leu Leu Tyr 80 Tyr 80 Leu Leu Gin Gin Met Met Asn Asn Ser 85 Ser 85 Leu Leu Arg Arg Ala Ala Glu Glu Asp 90 Asp 90 Thr Thr Ala Ala Val Wall Tyr Tyr Tyr 95 Tyr 95 Cys Cys Ala Ala Lys Lys Asp Asp Met 100 Met 100 ALIGN! Gly Gly Trp Trp Gly Gly Ser Ser Gly 105 Gly 105 Trp Trp Arg Arg Pro For Tyr Tyr Tyr 110 Tyr 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Met Met Asp 115 Asp 115 Val Wall Trp Trp Gly Gly Gin Gin Gly 120 Gly 120 Thr Thr Thr Thr Val Wall Thr Thr Val 125 Wall 125 Ser Ser Ser Ser Ala Ala Pro For Thr Thr Lys Lys Ala Ala Pro For Asp Asp Val Wall Phe Phe Pro For Leu Leu

130 135 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 145:130 135 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 145:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 372 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:(A) LENGTH: 372 bp (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: double (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURES:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..372 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 145:(A) NAME / MARKING: CDS (B) POSITION: 1..372 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 145:

GAG GTG Glu Val GAG GTG Glu Val CAG CTG CAG CTG CTC GAG CTC GAG TCT GGG Ser Gly 145 TCT GGG Ser Gly 145 GGA Gly GGA Gly GTC GTG GTA CAG GTC GTG GTA CAG CCT Pro CCT For GGG GGG Gly Gly GGG GGG Gly Gly 48 48 Gin Gin Leu Leu Leu Leu Glu Glu Val Val Val 150 Val Val Val Gin Gin 140 140 TCC TCC CTG CTG AGA AGA CTC CTC TCC TCC TGT TGT GCA GCA GCC GCC TCT TCT GGA GGA TTC TTC ACC ACC TTT TTT GAT GAT GAT GAT TAT MELT 96 96 Ser 155 Ser 155 Leu Leu Arg Arg Leu Leu Ser Ser Cys 160 Cys 160 Ala Ala Ala Ala Ser Ser Gly Gly Phe 165 Phe 165 Thr Thr Phe Phe Asp Asp Asp Asp Tyr 170 Tyr 170 GCC GCC ATG ATG CAC CAC TGG TGG GTC GTC CGC CGC CAG CAG GCT GCT CCA CCA GGC GGC AAG AAG GGG GGG CTG CTG GAG GAG TGG TGG GTG GTG 144 144 Ala Ala Met Met His His Trp Trp Val 175 Wall 175 Arg Arg Gin Gin Ala Ala Pro For Gly 180 Gly 180 Lys Lys .Gly .Gly Leu Leu Glu Glu Trp 185 Trp 185 Val Wall GCA GCA GTT GTT ATA ATA TCA TCA TAT MELT GAT GAT GGA GGA AGT AGT AAT AAT AAA AAA TAC TRAY TAT MELT GCA GCA GAC GAC TCC TCC GTG GTG 192 192 Ala Ala Val Wall lle lle Ser Ser Tyr Tyr Asp Asp Gly Gly Ser Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Ala Asp Asp Ser Ser Val Wall

190 195 200 • · · · * ·190 195 200 • · · ·

240240

* 9 · · • · · 9* 9

999 999999 999

99

AAG AAG GGC GGC CGA CGA TTC TTC ACC ACC ATC ATC TCC TCC AGA AGA GAC GAC AAT AAT TCC TCC AAG AAG AAC AAC ACG ACG CTG CTG TAT MELT Lys Lys Gly Gly Arg Arg Phe Phe Thr Thr Ile Ile Ser Ser Arg Arg Asp Asp Asn Asn Ser Ser Lys Lys Asn Asn Thr Thr Leu Leu Tyr Tyr 205 205 210 210 215 215 CTG CTG CAA CAA ATG ATG AAC AAC AGC AGC CTG CTG AGA AGA GCT GCT GAG GAG GAC GAC ACG ACG GCT GCT GTG GTG TAT MELT TAC TRAY TGT TGT Leu Leu Gin Gin Met Met Asn Asn Ser Ser Leu Leu Arg Arg Ala Ala Glu Glu Asp Asp Thr Thr Ala Ala Val Wall Tyr Tyr Tyr Tyr Cys Cys 220 220 225 225 230 230 GCG GCG AAA AAA AAG AAG GAA GAA GGC GGC TAC TRAY TGG TGG GGC GGC CAG CAG GGA GGA ACC ACC CTG CTG GTC GTC ACC ACC GTC GTC TCC TCC Ala Ala Lys Lys Lys Lys Glu Glu Gly Gly Tyr Tyr Trp Trp Gly Gly Gin Gin Gly Gly Thr Thr Leu Leu Val Wall Thr Thr Val Wall Ser Ser 235 235 240 240 245 245 250 250 TCA TCA GCA GCA CCC CCC ACC ACC AAG AAG GCT GCT CCG CCG GAT GAT GTG GTG TTC TTC CCT CCT CTA CTA Ser Ser Ala Ala Pro For Thr Thr Lys Lys Ala Ala Pro For Asp Asp Val Wall Phe Phe Pro For Leu Leu

255 260255 260

288288

336336

372 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 146:372 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 146:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 124 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 146:(A) LENGTH: 124 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 146:

Glu 1 Glu 1 Val Wall Gin Gin Leu Leu Leu 5 Leu 5 Glu Glu Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val 10 Wall 10 Val Wall Val Wall Gin Gin Pro For Gly 15 Gly 15 Dec Gly Gly Ser Ser Leu Leu Arg Arg Leu 20 Leu 20 May Ser Ser Cys Cys Ala Ala Ala Ala Ser 25 Ser 25 Gly Gly Phe Phe Thr Thr Phe Phe Asp 30 Asp 30 Asp Asp Tyr Tyr Ala Ala Met Met His 35 His 35 Trp Trp Val Wall Arg Arg Gin Gin Ala 40 Ala 40 Pro For Gly Gly Lys Lys Gly Gly Leu 45 Leu 45 Glu Glu Trp Trp Val Wall Ala Ala Val 50 Wall 50 Ile Ile Ser Ser Tyr Tyr Asp Asp Gly 55 Gly 55 Ser Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr Tyr 60 Tyr 60 Ala Ala Asp Asp Ser Ser Val Wall Lys 65 Lys 65 Gly Gly Arg Arg Phe Phe Thr Thr Ile 70 Ile 70 Ser Ser Arg Arg Asp Asp Asn Asn Ser 75 Ser 75 Lys Lys Asn Asn Thr Thr Leu Leu Tyr 80 Tyr 80 Leu Leu Gin Gin Met Met Asn Asn Ser 85 Ser 85 Leu Leu Arg Arg Ala Ala Glu Glu Asp 90 Asp 90 Thr Thr Ala Ala Val Wall Tyr Tyr Tyr 95 Tyr 95 Cys Cys Ala Ala Lys Lys Lys Lys Glu 100 Glu 100 ALIGN! Gly Gly Tyr Tyr Trp Trp Gly Gly Gin 105 Gin 105 Gly Gly Thr Thr Leu Leu Val Wall Thr 110 Thr 110 Val Wall Ser Ser

Ser Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Leu 115 120 • · « · · ·Ser Ala Pro Thr Lys Asp Pro Phu Pro Leu 115 120 • · «· · ·

100100 ALIGN!

99 ·· · · · · · · *· · • * · 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 9999 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9999 99 999 999 99 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 147:9999 99 999 999 99 99 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 147:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) DÉLKA: 321 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:(A) LENGTH: 321 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) FIBER TYPE: double (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURES:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..321 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 147:(A) NAME / DESIGNATION: CDS (B) POSITION: 1..321 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 147:

GAG Glu 125 GAG Glu 125 CTC CAG ATG CTC CAG ATG ACC CAG TCT CCA ACC CAG TCT CCA TCC Ser TCC Ser TCC CTG Ser Leu 135 TCC CTG Ser Leu TCT Ser TCT Ser GCA TCT GCA TCT GTA GGA GTA GGA 48 48 Leu Leu Gin Met Gin Met Thr Thr Gin 130 Gin 130 Ser Ser Pro For Ala Ala Ser Ser Val Wall Gly 140 Gly 140 GAC GAC AGA AGA GTC GTC ACC ACC ATC ATC ACT ACT TGC TGC CGG CGG GCA GCA AGT AGT CAG CAG AGC AGC ATT ATT AGC AGC AGC AGC TAT MELT 96 96 Asp Asp Arg Arg Val Wall Thr Thr Ile Ile Thr Thr Cys Cys Arg Arg Ala Ala Ser Ser Gin Gin Ser Ser Ile Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr 145 145 150 150 155 155 TTA TTA AAT AAT TGG TGG TAT MELT CAG CAG CAG CAG AAA AAA CCA CCA GGA GGA CAG CAG CCT CCT CCT CCT AAG AAG CTG CTG CTC CTC ATT ATT 144 144 Leu Leu Asn Asn Trp Trp Tyr Tyr Gin Gin Gin Gin Lys Lys Pro For Gly Gly Gin Gin Pro For Pro For Lys Lys Leu Leu Leu Leu Ile Ile 160 160 165 165 170 170 TAC TRAY TGG TGG GCA GCA TCT TCT ACC ACC CGG CGG GAA GAA TCC TCC GGG GGG GTC GTC CCT CCT GAC GAC CGA CGA TTC TTC AGC AGC GGC GGC 192 192 Tyr Tyr Trp Trp Ala Ala Ser Ser Thr Thr Arg Arg Glu Glu Ser Ser Gly Gly Val Wall Pro For Asp Asp Arg Arg Phe Phe Ser Ser Gly Gly 175 175 180 180 185 185 AGT AGT GAA GAA TCT TCT GGG GGG ACA ACA AAT AAT TAC TRAY ACT ACT CTC CTC ACC ACC ATC ATC AGC AGC AGC AGC CTG CTG CAG CAG CCT CCT 240 240 Ser Ser Glu Glu Ser Ser Gly Gly Thr Thr Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Leu Leu Thr Thr Ile Ile Ser Ser Ser Ser Leu Leu Gin Gin Pro For 190 190 195 195 200 200 GAA GAA GAT GAT TTT TTT GCT GCT ACT ACT TAC TRAY TTT TTT TGT TGT CAA CAA CAG CAG TCT TCT GAC GAC AGT AGT TTG TTG CCG CCG ATC ATC 288 288 Glu Glu Asp Asp Phe Phe Ala Ala Thr Thr Tyr Tyr Phe Phe Cys Cys Gin Gin Gin Gin Ser Ser Asp Asp Ser Ser Leu Leu Pro For Ile Ile 205 205 210 210 215 215 220 220 ACC ACC TTC TTC GGC GGC CAA CAA GGG GGG ACA ACA CGA CGA CTG CTG GAC GAC ATT ATT CAA CAA 321 321 Thr Thr Phe Phe Gly Gly Gin Gin Gly Gly Thr Thr Arg Arg Leu Leu Asp Asp Ile Ile Gin Gin

225 230 »9 9999225 230 »9 9999

99

99

9 • 999 • 99

9 999 99

9 9 9 • 9 9 99 9 9

999 999999 999

99

9 999 99

101 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 148:101 (2) INFORMATION FOR THE SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 148:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) DÉLKA: 107 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 148:(A) LENGTH: 107 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULA TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQUENCE WITH IDENTIFICATION NUMBER 148:

Glu Glu Leu Leu Gin Gin Met Met Thr Thr Gin Gin Ser Ser Pro For Ser Ser Ser Ser Leu Leu Ser Ser Ala Ala Ser Ser Val Wall Gly Gly 1 1 5 5 10 10 15 15 Dec Asp Asp Arg Arg Val Wall Thr Thr Ile Ile Thr Thr Cys Cys Arg Arg Ala Ala Ser Ser Gin Gin Ser Ser Ile Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr 20 20 May 25 25 30 30 Leu Leu Asn Asn Trp Trp Tyr Tyr Gin Gin Gin Gin Lys Lys Pro For Gly Gly Gin Gin Pro For Pro For Lys Lys Leu Leu Leu Leu Ile Ile 35 35 40 40 45 45 Tyr Tyr Trp Trp Ala Ala Ser Ser Thr Thr Arg Arg Glu Glu Ser Ser Gly Gly Val Wall Pro For Asp Asp Arg Arg Phe Phe Ser Ser Gly Gly 50 50 55 55 60 60 Ser Ser Glu Glu Ser Ser Gly Gly Thr Thr Asn Asn Tyr Tyr Thr Thr Leu Leu Thr Thr Ile Ile Ser Ser Ser Ser Leu Leu Gin Gin Pro For 65 65 70 70 75 75 80 80 Glu Glu Asp Asp Phe Phe Ala Ala Thr Thr Tyr Tyr Phe Phe Cys Cys Gin Gin Gin Gin Ser Ser Asp Asp Ser Ser Leu Leu Pro For Ile Ile 85 85 90 90 95 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Asp Ile GinThr Phe Gly Gin

Claims (16)

1. Způsob přípravy anti-lidského antigenního receptorů, výhodně imunoglobulinu nebo jeho fragmentu, zvláště fragmentu Fv, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, vyznačující se t í m, že tento způsob obsahuje kroky, kde se vybere kombinace funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, přičemž alespoň řetězec VH pochází z lidských v podstatě nesenzibilizovaných zralých B lymfocytů a řetězec VL pochází z přirozeně se vyskytujícího repertoáru lidských B buněk, a přičemž oba řetězce jsou exprimovány z rekombinantního vektoru, a kde se použije in vitro detekční expoziční systém, zejména systém fágové expozice, na vazbu k lidskému antigenu, zvláště nádorovému antigenu, výhodně k lidskému antigenu 17-1 A.A method for preparing anti-human antigen receptors, preferably an immunoglobulin or fragment thereof, particularly an Fv fragment, which is weakly immunogenic or not immunogenic to humans, characterized in that the method comprises the steps of selecting a combination of functionally rearranged immunoglobulin chains VH and VL, wherein at least the VH chain originates from human substantially non-sensitized mature B cells and the VL chain originates from a naturally occurring repertoire of human B cells, and wherein both chains are expressed from a recombinant vector and wherein an in vitro detection exposure system is used, in particular a phage display system for binding to a human antigen, in particular a tumor antigen, preferably a human 17-1 A antigen. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň řetězec VH a případně i řetězec VL imunoglobulinu pochází z lidského repertoáru imunoglobulinu IgD.The method of claim 1, wherein at least the immunoglobulin VH chain and optionally the VL chain are derived from a human immunoglobulin IgD repertoire. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že kombinace přestavěných řetězců je exprimována z jedné knihovny nebo z několika různých knihoven.Method according to claim 1 or 2, characterized in that the combination of rearranged chains is expressed from one library or from several different libraries. 4. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že řetězec VH Obsahuje jednu ze dvou sekvencí uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo řetězec VL obsahuje jednu ze dvou sekvencí uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the VH chain comprises one of the two sequences shown in Fig. 7 (nucleotides 1 to 381) and Fig. 8 (nucleotides 1 to 339) and / or the VL chain comprises one of two sequences. 6 (nucleotides 1 to 321) and 9 (nucleotides 1 to 321). 5. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím selekční krok obsahujeThe method of any one of the preceding claims, wherein the selection step comprises I) navázání expozičního nosiče exprimujícího antigenní receptor ·· ·· • · « · • · · · • · · · » ·I) Binding of an Exposure Carrier Expressing an Antigenic Receptor 103103 a) na imobilizovaný cílový' antigen nebo jeho fragmenty(a) immobilized target antigen or fragments thereof b) na volitelně značené buňky exprimující cílový antigen nebo jeho fragmenty,b) optionally labeled cells expressing the target antigen or fragments thereof, c) na rozpustný, výhodně značený cílový' antigen nebo jeho fragmenty,c) a soluble, preferably labeled target antigen or fragments thereof, II) odmytí nespecificky'· navázaného expozičního nosiče (a a b) a následnou eluci specificky navázaného expozičního nosiče, nebo(II) washing off the non-specifically bound exposure support (a and b) and subsequent elution of the specifically bound exposure support, or III) pozitivní obohacení expozičního nosiče vázaného na cílový antigen (b a c) z roztoku cílového antigenu nebo ze suspenze buněk exprimujících cílový antigen, tedy izolované expoziční nosiče včetně jejich antigenních receptorů se případně zmnoží replikací a pak se podrobí dalším cyklům in vitro selekce, jak jsou popsány v krocích I) až III).III) positive enrichment of the target antigen-binding exposure support (bac) from the target antigen solution or suspension of cells expressing the target antigen, i.e. isolated exposure carriers including their antigenic receptors, optionally replicated and then subjected to further in vitro selection cycles as described in steps I) through III). 6. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se t í m, že před selekčním krokem buďto řetězec VH nebo řetězec VL je selektován na vazbu k antigenu společně s náhradním řetězcem V, zvláště myším řetězcem VH nebo VL.Method according to any one of the preceding claims, characterized in that either the VH chain or the VL chain is selected for binding to the antigen together with the replacement V chain, in particular the murine VH or VL chain, prior to the selection step. 7. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se t i m, že selekce vhodné kombinace zahrnuje7. A method according to any one of the preceding claims wherein the selection of a suitable combination comprises a) testování jednoho a téhož řetězce VH v kombinaci s řadou různých řetězců VL na vazbu k uvedenému lidskému antigenu, nebo(a) testing one and the same VH chain in combination with a number of different VL chains for binding to said human antigen; or b) testování jednoho a téhož řetězce VL v kombinaci s řadou různých řetězců VH na vazbu k uvedenému lidskému antigenu.b) testing one and the same VL chain in combination with a variety of different VH chains for binding to said human antigen. 8. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že způsob dále obsahuje kroky, kdy se získají, po selekci, lidské řetězce VH a VL nebo odpovídající nukleové kyseliny a tyto řetězce se fúzují se stejnými nebo jinými řetězci VH neboThe method of any one of the preceding claims, wherein the method further comprises the steps of obtaining, after selection, human VH and VL chains or corresponding nucleic acids, and fused to the same or other VH chains, or 99 9999 99 9 9 9 99 9 9 9 99 999 999 • · • · ··999 999 • · • · ·· 99 999999 9999 104 to ♦ 9104 ♦ 9 9 99 9 9 99 9 9 9 99 9 9 9999 999999 99 9 9 99 9 9 99 9 999 9 9 VL, s imunoglobulinovými konstantními úseky těžkých (CH) nebo lehkých řetězců (CL), zvláště s konstantními úseky řetězců pocházejících z lidských IgGl nebo IgG3, nebo jejich částmi, nebo s řetězci odlišnými od imunoglobulinů, případně odpovídajícími nukleovými kyselinami, a/nebo způsob dále obsahuje kroky, kdy se získají, po selekci, lidské řetězce VH a VL, a kdy se tyto řetězce fyzicky spojí s farmaceutickými přípravky jinými než proteiny a/nebo jinými biologicky aktivními molekulami, přičemž řetězce VH a VL jsou exprimovány ze sekvencí nukleových kyselin, které jsou výsledkem RT-PCR amplifikace mRNA pocházející z v podstatě nesenzibilizovaných zralých lidských B lymfocytů.VL, with heavy (CH) or light chain (CL) immunoglobulin constant regions, particularly with constant regions of chains derived from human IgG1 or IgG3, or portions thereof, or with chains different from immunoglobulins, optionally corresponding nucleic acids, and / or method further comprising the steps of recovering, after selection, human VH and VL chains and physically linking them to pharmaceuticals other than proteins and / or other biologically active molecules, wherein the VH and VL chains are expressed from nucleic acid sequences which: are the result of RT-PCR amplification of mRNA originating from substantially non-sensitized mature human B cells. 9. Anti-lídský antigenní receptor, výhodně protilátka nebo její fragment, a zvláště receptor specifický⁷ pro lidský nádorový antigen, který je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, kterýžto receptor obsahuje kombinaci funkčně přestavěných řetězců VH a VL, přičemž alespoň řetězec VH pochází z lidských v podstatě nesenzibilizovaných zralých B lymfocytů a řetězec VL pochází z přirozeně se vyskytujícího repertoáru lidských B buněk, a přičemž uvedený anti-lidský antigenní receptor je získán způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.An anti-human antigen receptor, preferably an antibody or fragment thereof, and in particular a human tumor antigen-specific receptor ⁷ , which is weakly immunogenic or non-human immunogenic, said receptor comprising a combination of functionally rearranged VH and VL chains, wherein at least the VH chain originates from human substantially non-sensitized mature B cells and the VL chain is derived from a naturally occurring repertoire of human B cells, and wherein said anti-human antigen receptor is obtained by the method of any one of claims 1 to 8. 10. Receptor podle nároku 9, který je specifický pro nativní lidský antigen 17-1 A, přičemž zvláště, řetězec VH obsahuje jednu ze dvou sekvencí uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo řetězec VL obsahuje jednu ze dvou sekvencí uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).The receptor of claim 9, which is specific for the native human 17-1 A antigen, wherein in particular, the VH chain comprises one of two sequences shown in Figure 7 (nucleotides 1 to 381) and Figure 8 (nucleotides 1 to 339). and / or the VL chain comprises one of the two sequences shown in Figure 6 (nucleotides 1 to 321) and Figure 9 (nucleotides 1 to 321). 11. Řetězec VH nebo VL, nebo alespoň jedna CDR, zvláště CDR3, které jsou obsaženy v receptoru podle nároku 9 nebo 10.A VH or VL chain, or at least one CDR, in particular CDR3, that is contained in a receptor according to claim 9 or 10. 12. Souprava vyznačující se t i m, že obsahuje kombinaci funkčně přestavěných imunoglobulinových řetězců VH a VL, přičemž • 00 ··12. A kit comprising a combination of functionally rearranged VH and VL immunoglobulin chains, wherein: 00; 00 0 0· 000 0 0 · 0 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 · 000 0000 · 000 000 0 0 00 0 0 000 *0 *0 <0 0000 • · 0000 * 0 * 0 <0 0000 • 0 9 0 • 09 0 • 0 0 0 0 ·»·· 000 0 0 · »·· 00 105 alespoň jeden z řetězců VH nebo VL pochází z lidských v podstatě nesenzibilizovaných zralých B lymfocytů, a přičemž oba řetězce jsou exprimovány z rekombinantních vektorů in vitro expozičního systému, zvláště systému fágové expozice.At least one of the VH or VL chains is derived from human substantially non-sensitized mature B cells, and both chains are expressed from recombinant vectors in the in vitro challenge system, particularly the phage challenge system. 13. Protilátka, která je získána z lidských sekvencí a která je specifická pro nativní lidský antigen 17-1 A.13. An antibody that is derived from human sequences and that is specific for the native human 17-1 A antigen. 14. Protilátka podle nároku 13, která je slabě imunogenní nebo není imunogenní pro člověka, přičemž tato protilátka je výhodně získána způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.The antibody of claim 13, which is weakly immunogenic or not immunogenic to humans, wherein the antibody is preferably obtained by the method of any one of claims 1 to 8. 15. Protilátka podle nároku 13 nebo 14, která rozpoznává epitop extracelulární domény antigenu 17-1A a výhodně obsahuje alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci peptidů č. 8, 11, 13, 14, 59, 60, 77 a 79, zvláště kde řetězec VH obsahuje alespoň jednu CDR jedné ze sekvencí uvedených na obr. 7 (nukleotidy 1 až 381) a obr. 8 (nukleotidy 1 až 339) a/nebo řetězec VL obsahuje alespoň jednu CDR ze sekvencí uvedených na obr. 6 (nukleotidy 1 až 321) a obr. 9 (nukleotidy 1 až 321).The antibody of claim 13 or 14, which recognizes an epitope of the extracellular domain of antigen 17-1A and preferably comprises at least one amino acid sequence of peptides No. 8, 11, 13, 14, 59, 60, 77 and 79, particularly wherein the VH chain comprises at least one CDR of one of the sequences shown in FIG. 7 (nucleotides 1 to 381) and FIG. 8 (nucleotides 1 to 339) and / or the VL chain comprises at least one CDR of the sequences shown in FIG. 6 (nucleotides 1 to 321); 9 (nucleotides 1 to 321). 16. Farmaceutický⁷ přípravek vyznačující se tím, že obsahuje receptor podle nároku 9 nebo 10, řetězec VH podle nároku 11 a/nebo protilátku podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15, a případně farmaceuticky přijatelný nosič. ⁷ 16. A pharmaceutical composition characterized in that it comprises a receptor according to claim 9 or 10, a VH chain of claim 11 and / or an antibody according to any one of claims 13 to 15, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.