CZ31206U1 - A preparation for preserving human or animal cells at very low temperatures - Google Patents

Description

Oblast technikyTechnical field

Technické řešení se týká prostředku pro uchování lidských nebo zvířecích buněk při velmi nízkých teplotách.The invention relates to a means for preserving human or animal cells at very low temperatures.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Kmenové buňky jsou pro svůj multipotentní potenciál velmi ceněná frakce v biofarmaceutickém průmyslu. Jejich omezená životnost ex vivo je v současné době řešena jejich kiyoprezervací, tj. hlubokým zmražením na teplotu -18 °C až -196 °C. Hluboce zamražené kmenové buňky je možné kdykoliv v případě potřeby použít a jejich životnost je v takovém stavu prodloužena o několik let. Klíčovým krokem v celém procesu mražení kmenových buněk je roztok, ve kterém jsou buňky uloženy. Jeho složení je zásadní prd výsledné vlastnosti buněk po jejich rozmražení. Z hlediska biofarmaceutického průmyslu a současných pravidel pro použití buněk k terapeutickým účelům je žádoucí, aby rozmražené buňky bylo možné přímo aplikovat pacientovi bez dalších kroků promývání či centrifugace buněk. Tento fakt klade velké nároky především na složení roztoku s ohledem na bezpečnost jednotlivých komponent v roztoku obsažených. Pro kryoprezervaci buněk se běžně používá dimethylsulfoxid (DMSO), ethylen glykol či glycerol. Nevýhoda použití těchto kryoprotektivních látek je jejich nezanedbatelná cytoxicita a významné nežádoucí vedlejší účinky při podání pacientům. Proto jsou vyvíjeny kryoprotektivní roztoky, které jsou primárně založeny na použití netoxických složek při zachování kryoprezervačních vlastností.Stem cells are a highly valued fraction in the biopharmaceutical industry because of their multipotent potential. Their limited ex vivo lifetime is currently addressed by their kiyopreservation, i.e. by deep freezing to -18 ° C to -196 ° C. Deep-frozen stem cells can be used at any time if necessary and their life span is extended by several years. A key step in the whole process of freezing stem cells is the solution in which the cells are stored. Its composition is a fundamental fart of the resulting properties of cells after thawing them. From the viewpoint of the biopharmaceutical industry and current rules for the use of cells for therapeutic purposes, it is desirable that thawed cells can be directly applied to a patient without further steps of washing or centrifuging the cells. This fact places great demands on the composition of the solution with regard to the safety of the individual components contained in the solution. Dimethylsulfoxide (DMSO), ethylene glycol or glycerol are commonly used for cryopreservation of cells. The disadvantages of using these cryoprotectants are their insignificant cytoxicity and significant adverse side effects when administered to patients. Therefore, cryoprotective solutions are being developed which are primarily based on the use of non-toxic components while maintaining cryopreservation properties.

Jako velmi potentní složka kryoprotektivních roztoků se ukazuje trehalóza. Trehalóza, disacharid glukózy, je syntetizována nižšími organizmy v případech, kdy jsou vystaveny stresu, chladu, vysokým teplotám nebo vysušení, je známa jako protistresový faktor. Trehalóza, na rozdíl od DMSO, neprochází buněčnou membránou a při mražení chrání buňky extracelulámě díky mírné dehydrataci buněk.Trehalose appears to be a very potent component of cryoprotective solutions. Trehalose, a glucose disaccharide, is synthesized by lower organisms when exposed to stress, cold, high temperatures or dryness, known as an anti-stress factor. Unlike DMSO, trehalose does not cross the cell membrane and protects the cells in extracellular conditions due to moderate dehydration of the cells.

Dash a kolektiv testovali trehalózu (Curr Stem Cell Res Ther., 2008) pro mražení rybích embryonálních kmenových buněk. Přidaná trehalóza do kryoprotektivního roztoku obsahujícího DMSO zvýšila viabilitu rozmražených buněk.Dash et al. Tested trehalose (Curr Stem Cell Res Ther., 2008) for freezing fish embryonic stem cells. Adding trehalose to a cryoprotective solution containing DMSO increased viability of thawed cells.

Velmi pozitivní účinek 1M roztoku trehalózy na mražení kmenových CD34+ buněk izolovaných z periferní krve popisuje Martinetti (Biomed Rep., 2017).A very positive effect of 1M trehalose solution on freezing of peripheral blood isolated CD34 + cells is described by Martinetti (Biomed Rep., 2017).

Použití extracelulámí a také intracelulámí trehalózy v kryoroztoku příznivě ovlivňuje vitalitu rozmražených kmenových buněk izolovaných z pupečníkové krve (Motta a kol., Cryobiology, 2014).The use of extracellular as well as intracellular trehalose in cryoprotection positively affects the vitality of thawed stem cells isolated from cord blood (Motta et al., Cryobiology, 2014).

Campbell a kolektiv popisuje (Cryobiology, 2012) výhodné použití 0,2 až 0,4M roztoku trehalózy v kombinaci s uhličitanem sodným a kultivačním médiem EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium) pro mražení hovězích endotheliálních buněk.Campbell et al. (Cryobiology, 2012) discloses the preferred use of a 0.2-0.4M trehalose solution in combination with sodium carbonate and Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) for freezing bovine endothelial cells.

Velice výhodná se ukazuje 24 hodinová preinkubace buněk s trehalózou před samotným procesem mražení. Výhodu preinkubace buněk 200mM roztokem trehalózy také popisuje Petrenko a kol. (Cryo Letters. 2014).A 24 hour preincubation of the cells with trehalose before the freezing process itself appears to be very advantageous. The advantage of preincubating cells with a 200 mM trehalose solution is also described by Petrenko et al. (Cryo Letters 2014).

Patentová přihláška CN105961374 popisuje kryoprotektivní roztok pro uchování mesenchymálních kmenových buněk. Tento roztok obsahuje zejména polyethylen glykol a albumin, přičemž jako jednu ze složek obsahuje i trehalózu.Patent application CN105961374 discloses a cryoprotective solution for the preservation of mesenchymal stem cells. This solution mainly contains polyethylene glycol and albumin, and also contains trehalose as one of the components.

Přihláška CN105494317 popisuje zamražení kmenových buněk izolovaných z tukové tkáně v roztoku obsahujícím zejména lipoprotein, trehalózu a glycerin.Application CN105494317 discloses freezing of stem cells isolated from adipose tissue in a solution containing mainly lipoprotein, trehalose and glycerin.

Patentová přihláška CN104012519 popisuje výhodnou kombinaci trehalózy a erytropoietinu v kryoprotektivním roztoku.Patent application CN104012519 describes a preferred combination of trehalose and erythropoietin in a cryoprotective solution.

Patentová přihláška US2011008300 popisuje výhodné použití roztoku s obsahem trehalózy a glycerinu pro kryoprezervaci tukové tkáně.US2011008300 describes the preferred use of a solution containing trehalose and glycerin for cryopreservation of adipose tissue.

-1 CZ 31206 Ul-1 CZ 31206 Ul

Patentová přihláška KR20140046690 popisuje mražení prasečích spermatogonálních buněk v roztoku obsahujícím 200mM trehalózy, fetální hovězí sérum. DMSO a kultivační médium Alpha MEM (Alpha Modification of Eagle’s Minimum Essential Media).Patent application KR20140046690 describes freezing porcine spermatogonal cells in a solution containing 200 mM trehalose, fetal bovine serum. DMSO and Alpha Modification of Eagle's Minimum Essential Media (MEM).

Obdobně, přihláška CN102578077 je zaměřena na problematiku mražení mesenchymálních kmenových buněk v kryoroztoku obsahujícím DMSO, trehalózu a další komponenty. Kryoroztok je použit bez obsahu séra.Similarly, CN102578077 is directed to the problem of freezing of mesenchymal stem cells in cryo solution containing DMSO, trehalose and other components. The cryo solution is serum-free.

Korejský patent KR20120078094 popisuje výhodnou kombinaci DMSO, trehalózy, katalasy akaspasového inhibitoru zVAD-fmk pro mražení kmenových buněk izolovaných z plodové vody.Korean patent KR20120078094 discloses a preferred combination of DMSO, trehalose, a catalase and anaspase inhibitor of VAD-fmk for freezing stem cells isolated from amniotic fluid.

Roztok obsahující trehalózu a další farmaceuticky použitelné ingredience je popsán v české patentové přihlášce PV 2016-284. Přihláška popisuje hypothermické skladování buněk v tomto roztoku při teplotě snížené až na -4 °C.A solution containing trehalose and other pharmaceutically useful ingredients is described in Czech patent application PV 2016-284. The application describes the hypothermic storage of cells in this solution at a temperature lowered to -4 ° C.

Dosud známá řešení neumožňují hluboké zmražení za použití farmaceuticky nekompatibilních složek, což výrazně v klinické praxi znemožňuje bezprostřední využití takových roztoků po rozmražení.The prior art solutions do not allow deep freezing using pharmaceutically incompatible ingredients, which in clinical practice makes it impossible to immediately use such solutions after thawing.

Podstata technického řešeníThe essence of the technical solution

Výše uvedené nedostatky odstraňuje prostředek pro uchování kmenových buněk při velmi nízkých teplotách, který je tvořen vodným roztokem trehalózy, který obsahuje disacharid trehalózu v množství 60 až 900 mmol/1, s výhodou 200 až 900 mmol/1 a nejvýhodněji 300 až 900 mmol/1.The aforementioned drawbacks are remedied by a very low temperature stem cell preservation composition comprising an aqueous solution of trehalose which contains trehalose disaccharide in an amount of 60 to 900 mmol / l, preferably 200 to 900 mmol / l and most preferably 300 to 900 mmol / l. .

Roztok se může skládat pouze z vody a trehalózy v množství 60 až 900 mmol//l, přičemž pH roztoku může být, v závislosti na použité vodě, 7 až 8, zpravidla však je hodnota pH 7,1 až 7,6.The solution may consist only of water and trehalose in an amount of 60 to 900 mmol / l, the pH of the solution being, depending on the water used, 7 to 8, but in general the pH is 7.1 to 7.6.

Ve výhodném provedení roztok sestává z pufrovaného vodného roztoku trehalózy, který obsahuje jednoduché soli pro tlumení výkyvů pH, přičemž pH roztoku je 7,1 až 7,6, a přičemž celková osmolarita roztoku není vyšší než 900 mosmol/1. Osmolaritou se v této přihlášce rozumí osmolarita vypočtená způsobem v této oblasti techniky obvyklým, nebo, v případě že by byla vyšší než vypočtená, osmolarita změřená.In a preferred embodiment, the solution consists of a buffered aqueous trehalose solution containing simple salts for buffering pH fluctuations, wherein the pH of the solution is 7.1 to 7.6, and wherein the total osmolarity of the solution is not greater than 900 mosmol / L. Osmolarity in this application is understood to mean the osmolarity calculated in a manner known in the art or, if higher than the calculated one, the osmolarity measured.

Tento roztok s výhodou obsahuje jako nezbytné složky kationty K⁺ v množství 20 až 50 mmol//l, kationty Na⁺ v množství 20 až 80 mmol/1, anionty Cl množství 0,5 až 40 mmol/1, anionty PO4³' a/nebo HPO4²’ a/nebo H₂PO₄' v celkovém množství 20 až 65 mmol/1, a trehalózu v množství minimálně 60 mmol/1, s výhodou minimálně 200 mmol/1, ještě výhodněji minimálně 300 mmol/1. Horní mez obsahu trehalózy je určena tím, že celková osmolarita roztoku nemá být vyšší než 900 mosmol/1. Horní mez obsahu trehalózy v pufrovaném roztoku je tedy o množství disociovaných solí nižší než 900 mosmol/1. Koncentrace uvedených složek jsou v rámci uvedeného rozmezí voleny tak, aby hodnota pH roztoku byla 7,1 až 7,6. V nejjednodušším provedení technického řešení nemusí prostředek obsahovat žádné další záměrně přidávané složky. V každém případě, optimální celková osmolarita roztoku není vyšší než 900 mosmol/1.This solution preferably contains 20-50 mmol / l of K ⁺ cations, 20-80 mmol / l of Na ⁺ , 0.5-40 mmol / l of anion C1, PO4 ³ 'anions and and / or HPO4 ² 'and / or H ₂ PO ₄ ' in a total amount of 20 to 65 mmol / L, and trehalose in an amount of at least 60 mmol / L, preferably at least 200 mmol / L, even more preferably at least 300 mmol / L. The upper limit of trehalose is determined by the total osmolarity of the solution being not more than 900 mosmol / l. Thus, the upper limit of trehalose content in the buffered solution is less than 900 mosmol / L of the dissociated salts. Concentrations of said components are selected within the range so that the pH of the solution is 7.1 to 7.6. In the simplest embodiment, the composition need not include any additional deliberately added ingredients. In any case, the optimum total osmolarity of the solution is not more than 900 mosmol / L.

V dalších provedeních technického řešení roztok dále může obsahovat kationty Mg²⁺ a/nebo Ca²⁺ v celkovém množství 0 až 2 mmol//l a anionty SO4²’ a/nebo HSO4 v celkovém množství 0 až 2 mmol/1. Jestliže jsou kationty Mg²⁺ a/nebo Ca²⁺ přítomny jako záměrně přidaná složka, jsou v roztoku obsaženy v celkovém množství 0,1 až 2 mmol//l. Jestliže jsou anionty SO4²' a/nebo HSO4 přítomny jako záměrně přidaná složka, jsou v roztoku obsaženy v celkovém množství 0,5 až 2 mmol/1.In other embodiments, the solution may further comprise cations of Mg ²⁺ and / or Ca ²⁺ in a total amount of 0 to 2 mmol / l and anions of SO ^{4 2} 'and / or HSO 4 in a total amount of 0 to 2 mmol / l. If the Mg ²⁺ and / or Ca ²⁺ cations are present as a deliberately added component, they are contained in the solution in a total amount of 0.1 to 2 mmol / l. If the SO4 ² 'and / or HSO4 anions are present as a deliberately added component, they are present in the solution in a total amount of 0.5 to 2 mmol / l.

Ve výhodném provedení technického řešení roztok obsahuje kationty K⁺ v množství 28 až 32 mmol/1, kationty Na⁺ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Mg²⁺ a/nebo Ca²⁺ v celkovém množství 0,4 až 1,2 mmol/1, anionty Cl v množství 0,5 až 20 mmol/1, anionty PO4³' a/nebo HPO4² a/nebo H2PO⁴' v celkovém množství 40 až 50 mmol/1, anionty SO4² a/nebo HSO₄ v celkovém množství 0,9 až 1,2 mmol/1.In a preferred embodiment, the solution contains K ⁺ cations in an amount of 28 to 32 mmol / l, Na ⁺ cations in an amount of 20 to 50 mmol / l, Mg ²⁺ and / or Ca ²⁺ cations in a total amount of 0.4 to 1, 2 mmol / l, anions Cl of 0.5 to 20 mmol / l, anions PO4 ³ 'and / or HPO4 ² and / or H2PO ⁴ ' in a total amount of 40 to 50 mmol / l, anions SO4 ² and / or HSO ₄ in a total amount of 0.9 to 1.2 mmol / l.

Ve zvláště výhodných provedeních technického řešení roztok obsahuje trehalózu v množství 200 až 400 mmol/1.In particularly preferred embodiments, the solution contains trehalose in an amount of 200 to 400 mmol / l.

-2CZ 31206 Ul-2EN 31206 Ul

Zvláště výhodné je, když vodný roztok neobsahuje vedle kationtů K⁺, kationtů Na⁺, kationtů Mg²⁺ a/nebo Ca²⁺, aniontů CF, aniontů PO4³' a/nebo HPO4²' a/nebo H2PO4’, aniontů SO₄ ²' a/nebo HSO4’ a trehalózy žádné další záměrně přidané složky. Samozřejmě nelze vyloučit, že v roztoku jsou stopová množství látek, jejichž přítomnost je podmíněna výrobou nebo jinak náhodná.It is particularly preferred that the aqueous solution does not contain, in addition to K ⁺ cations, Na ⁺ cations, Mg ²⁺ and / or Ca ²⁺ cations, CF anions, PO ^{4 3} 'and / or HPO ^{4 2} ' and / or H2PO4 ', SO ₄ anions ² 'and / or HSO4' and trehalose no other intentionally added components. Of course, it cannot be excluded that there are trace amounts of substances in the solution, the presence of which is conditioned by production or otherwise accidental.

Konkrétněji, prostředek podle technického řešení je určen k uskladnění buněk při nízkých a velmi nízkých teplotách od -5 °C až do -273 °C. Prostředek podle technického řešení je zvláště vhodný k uskladnění kmenových buněk při teplotách od -18 °C do -196 °C, s výhodou -60 °C až -196 °C, nej častěji -80 °C až -196 °C. Režim mražení prostředku podle technického řešení může mít různý průběh. Může být použito programovatelných mrazicích jednotek (např. IceCube; SY-LAB) či dalších teplotně optimalizovaných zařízení: Mr. Frosty™ (Thermo Fisher Scientific) či CoolCell® (BioCision). S výhodou lze suspenzi buněk v prostředku dle technického řešení mrazit také přímým uložením vzorku do par tekutého dusíku. Tekutý dusík či jeho páry jsou z pohledu mražení i uskladnění vzorku nej vhodnější.More specifically, the composition of the present invention is intended to store cells at low and very low temperatures from -5 ° C to -273 ° C. The composition of the present invention is particularly suitable for storing stem cells at temperatures from -18 ° C to -196 ° C, preferably -60 ° C to -196 ° C, most often -80 ° C to -196 ° C. The freezing mode of the device according to the invention may have a different course. Programmable freezers (eg IceCube; SY-LAB) or other temperature optimized devices can be used: Frosty ™ (Thermo Fisher Scientific) or CoolCell® (BioCision). Advantageously, the suspension of cells in the composition according to the invention can also be frozen by directly depositing the sample in liquid nitrogen vapors. Liquid nitrogen or its vapors are best suited for freezing and sample storage.

Prostředek podle technického řešení se skládá z farmaceuticky přijatelných sloučenin a může být použit přímo k aplikaci kmenových buněk, které jsou v něm zmraženy. Po rozmražení kmenových buněk je zajištěna jejich dostatečná životaschopnost.The composition of the invention consists of pharmaceutically acceptable compounds and can be used directly to deliver the stem cells frozen therein. After thawing of the stem cells their sufficient viability is ensured.

Prostředek podle technického řešení je určen zejména pro mrazové uchování mezenchymálních kmenových buněk získaných z kostní dřeně, tukové tkáně, periferní krve nebo z extraembryonálních tkání (placenta, pupečník, pupečníková krev) nebo embryonálních, nervových, indukovaných nebo limbálních kmenových buněk savců včetně člověka. Může sloužit také k uchování kmenových buněk uchycených na biologickém nosiči. Z podstaty samotného technického řešení, tedy osmotický vliv roztoku na buňky před zmražením vč. stabilizace buněčné membrány, je možné očekávat pozitivní vliv roztoku také na jiné buněčné typy.The composition according to the invention is particularly intended for the freezing preservation of mesenchymal stem cells obtained from bone marrow, adipose tissue, peripheral blood or extraembryonic tissues (placenta, umbilical cord, cord blood) or embryonic, neural, induced or limbal stem cells of mammals including humans. It can also serve to preserve stem cells attached to a biological carrier. By the nature of the technical solution itself, ie the osmotic effect of the solution on the cells before freezing incl. stabilization of the cell membrane, a positive effect of the solution on other cell types can also be expected.

Kmenové buňky uchované v prostředku podle technického řešení mohou být po rozmražení aplikovány bez nutnosti odmytí tohoto prostředku přímo pacientovi zejména intravenózně, intraarteriálně, intramuskulámě, subkutánně, subkunjunktiviálně nebo intratekálně, a to buď samostatně, nebo s nosičem.Stem cells retained in the composition of the present invention can be administered directly to a patient, after thawing, without the need to wash the composition directly, especially intravenously, intraarterially, intramuscularly, subcutaneously, subcunjunctivally or intrathecally, either alone or with a carrier.

Nosičem kmenových buněk může být biodegradabilní i nedegradabilní materiál. Nosičem mohou být funkční biomateriály. Může se jednat o syntetické biokompatibilní polymery (kyselina polylaktidová PLA, kyselina polyglykolová PGA, polyethylenglykol PEG, polykaprolakton PCL, polyhydroxybutyrát PHB a další), přírodní polymery a polysacharidy (kolagen typu I, hyaluronová kyselina, fibrin, chitosan, celulóza, škrob a další) nebo extracelulámí matrice (ECM) ve formě hydrogelu, nanovláken nebo mikrovláken. Alternativně se pro aplikace, které počítají s nosičem, mohou kultivace kmenových buněk provádět v přítomnosti těchto nosičů a společně uchovávat a aplikovat v prostředku podle technického řešení.The carrier of the stem cells may be biodegradable or non-degradable material. The carrier may be functional biomaterials. They can be synthetic biocompatible polymers (polylactidic acid PLA, polyglycolic acid PGA, polyethylene glycol PEG, polycaprolactone PCL, polyhydroxybutyrate PHB and others), natural polymers and polysaccharides (collagen type I, hyaluronic acid, fibrin, chitosan, cellulose, starch and others) or extracellular matrix (ECM) in the form of hydrogel, nanofibres or microfibers. Alternatively, for carrier-counting applications, stem cell cultures can be carried out in the presence of these carriers and co-stored and applied in a composition according to the invention.

Vhodný roztok trehalózy o koncentraci trehalózy v množství 60 až 900 mmol/1, s výhodou 300 až 900 mmol/1, je možné použít k dlouhodobému uskladnění hluboce zmražených mezenchymálních kmenových buněk. Hlubokým zmražením se rozumí zmražení na velmi nízké teploty od -18 °C do -196 °C. Nižší teploty jsou také možné, i když méně praktické. Dlouhodobým uskladněním se rozumí uskladnění po dobu více než tří dnů, ale i několika týdnů nebo měsíců, například až pěti let.A suitable trehalose solution having a trehalose concentration of 60 to 900 mmol / l, preferably 300 to 900 mmol / l, can be used for long-term storage of deep-frozen mesenchymal stem cells. Deep freezing means freezing at very low temperatures from -18 ° C to -196 ° C. Lower temperatures are also possible, although less practical. Long-term storage means storage for more than three days, but also for several weeks or months, for example up to five years.

Pufrovaný vodný roztok trehalózy, obsahující trehalózu v množství 200 až 400 mmol/1, kationty K⁺ v množství 28 až 32 mmol/1, kationty Na⁺ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Mg²⁺ a/nebo Ca²⁺ v celkovém množství 0,4 až 1,2 mmol/1, anionty CF v množství 0,5 až 20 mmol/1, anionty PO4³' a/nebo HPO4²' a/nebo Η₂ΡΟ₄' v celkovém množství 40 až 50 mmol/1, anionty SO₄ ²' a/nebo HSO4' v celkovém množství 0,9 až 1,2 mmol/1, je možné použít zejména k dlouhodobému uskladnění hluboce zmražených mezenchymálních kmenových buněk.Buffered aqueous trehalose solution containing 200 to 400 mmol / l trehalose, 28 to 32 mmol / l K ⁺ cations, 20 to 50 mmol / l Na ⁺ cations, Mg ²⁺ and / or Ca ²⁺ cations in an amount of 0.4 to 1.2 mmol / l, CF anions of 0.5 to 20 mmol / l, PO4 ³ 'and / or HPO4 ² ' anions and / or Η ₂ ΡΟ ₄ 'in a total amount of 40 to 50 mmol / l, SO ₄ ² 'and / or HSO4' anions in a total amount of 0.9 to 1.2 mmol / l, can be used especially for long-term storage of deep-frozen mesenchymal stem cells.

-3CZ 31206 Ul-3EN 31206 Ul

Příklady uskutečnění technického řešeníExamples of technical solutions

Příklad 1: Izolace a kultivace MSCs z kostní dřeně (BM-MSCs)Example 1: Isolation and cultivation of bone marrow MSCs (BM-MSCs)

Aspirace kostní dřeně byla provedena trepanobioptickou jehlou, která je součástí odběrového setu obsahujícího fyziologický roztok s heparinem a gentamicinem. Po transportu kostní dřeně do prostor pro sterilní zpracování biologického materiálu byl vzorek smíchán s infíizním roztokem Geloíusinu. Množství přidaného Gelofusinu odpovídalo 25 % objemu kostní dřeně. Směs sedimentovala 10 až 30 minut a poté byla odebrána vrstva prstence mononukleámích buněk. V odebrané vrstvě buněk byla analyzována buněčnost směsi hematologickým analyzátorem. Do každé z připravených kultivačních lahví o ploše 75 cm² bylo přidáno 10 ml kompletního kultivačního média (médium Alpha MEM Eagle obsahující 5% lidský destičkový lyzát a gentamicin) a definované množství suspenze izolovaných buněk (5 až 10 milionů jaderných buněk) pro nasazení primokultury. Kultivace buněk probíhala pri teplotě 37 ± 0,5 °C a 5 % CO₂. V průběhu kultivace buněk probíhala průběžná výměna kompletního kultivačního média s případným oplachem buněk pomocí 10 ml pufru PBS na jednu kultivační láhev. Dle množství rostoucích buněk probíhalo jejich pasážování, tedy řízené enzymatické odloučení adherujících buněk a jejich přenesení na větší kultivační plochu. Tento proces vždy začal optickou kontrolou kultury pod mikroskopem; optimální pro růst kultury bylo dosažení 80 až 90% pokrytí buněk kultivačního dna. Pro pasážování bylo nutné odsátí kultivačního média, oplach kultury 10 ml pufru PBS a přidání 1 ml roztoku enzymu TrypLE Selecí CTS. Kultivační lahve byly cca 4 minuty inknbovány při 37 ± 0,5 °C. Správný průběh enzymatické reakce byl kontrolován pod mikroskopem. Pokud se buňky pohybovaly s proudící kapalinou po poklepání kultivační lahve, byl do každé lahve přidán 1 ml iníuzního roztoku 20% HSA (lidský sérový albumin) a 6 ml pufru PBS. Tato směs byla promíchána jemným nasátím a vysátím z pipety a byla převedena do centrifugační zkumavky a centrifugována (230 g, 5 minut). Peleta buněk byla resuspendována v kompletním kultivačním médiu a suspenze buněk rozdělena na požadované množství kultivačních lahví. Třetím pasážováním buněk bylo dosaženo finální suspenze buněk. Ta byla navíc ještě jednou promyta pufrem PBS a centrifugována (230 g, 5 minut). Pro vytvoření přípravku podle provedení technického řešení byla peleta získaná výše uvedeným postupem resuspendována v roztoku přípravku uvedeném v příkladu 2A (s 250 mM trehalózou, který je dále označován TR-250), 2B (s 300 mM trehalózou, označovaném TR-300), 2C (s 350 mM trehalózou, označovaném TR-350), 2D (s 400 mM trehalózou, označovaném TR-400) a 2E (pouze vodný roztok s 400 mM trehalózou označovaném TRH-400). Značkou mM nebo také mmol/1 je označován počet milimolů v litru roztoku.Bone marrow aspiration was performed with a trepanobioptic needle, which is part of a collection set containing saline with heparin and gentamicin. After the bone marrow was transported to the sterile processing area of the biological material, the sample was mixed with an infusion solution of Gellusin. The amount of Gelofusin added corresponded to 25% of the bone marrow volume. The mixture sedimented for 10 to 30 minutes and then the mononuclear cell ring layer was removed. In the harvested cell layer, the cellularity of the mixture was analyzed by a hematology analyzer. 10 ml of complete culture medium (Alpha MEM Eagle medium containing 5% human platelet lysate and gentamicin) was added to each of the 75 cm ² culture flasks prepared and a defined amount of isolated cell suspension (5 to 10 million nuclear cells) was used for primoculture. The cells were cultured at 37 ± 0.5 ° C and 5% CO ₂ . During cell culture, the complete culture medium was continuously exchanged with optional cell rinsing with 10 ml PBS buffer per culture flask. Depending on the number of growing cells, their passage, that is, the controlled enzymatic separation of adherent cells and their transfer to a larger cultivation area. This process has always begun by optical inspection of the culture under a microscope; optimal for the growth of the culture was to achieve 80 to 90% coverage of the culture bottom cells. Passage required aspirating the culture medium, rinsing the culture with 10 ml PBS buffer and adding 1 ml TrypLE enzyme solution by CTS selection. The culture flasks were incubated at 37 ± 0.5 ° C for about 4 minutes. The correct course of the enzymatic reaction was checked under a microscope. If the cells were moving with the flowing liquid after tapping the culture flask, 1 ml of 20% HSA (human serum albumin) infusion solution and 6 ml PBS buffer were added to each flask. This mixture was mixed by gentle suction and pipet suction and transferred to a centrifuge tube and centrifuged (230 g, 5 minutes). The cell pellet was resuspended in complete culture medium and the cell suspension was divided into the required number of culture flasks. The third passage of the cells resulted in a final cell suspension. This was additionally washed once with PBS and centrifuged (230 g, 5 minutes). To form the formulation of the invention, the pellet obtained by the above procedure was resuspended in a solution of the formulation of Example 2A (with 250 mM trehalose, hereinafter referred to as TR-250), 2B (with 300 mM trehalose, referred to as TR-300), 2C. (with 350 mM trehalose, termed TR-350), 2D (with 400 mM trehalose, termed TR-400), and 2E (only aqueous solution with 400 mM trehalose, termed TRH-400). The mM or mmol / L is the number of millimoles per liter of solution.

Obsah zmražených kmenových buněk byl zpravidla 5 x 10⁵ až 1 x 10⁷ MSCs/ml. Takto připravená suspenze buněk byla průběžně míchána lehkým protřepáním po dobu nejméně deseti minut při pokojové teplotě. Zároveň byla stanovena viabilita vstupní suspenze buněk. Následně byla suspenze (TR-250 a TR-300) uložena do mrazáku o teplotě -70 °C v mrazicím zařízení CoolCell® (BioCision). Paralelně byly vzorky uloženy přímo do teploty -70 °C či do -196 °C na dobu 24 hodin (tabulka 1). V tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty viability buněk zmražených pouhým uložením do teploty -196 °C, nicméně buňky jsou v suspenzi v různých roztocích (TR-350, TR400 a TRH-400). Následně byly všechny vzorky uloženy do Dewarovy nádoby obsahující tekutý dusík. Po jejich rozmražení ve vodní lázni pri 37 °C byly vzorky testovány dle příkladu 3.The frozen stem cell content was generally 5 x 10 ⁵ to 1 x 10 ⁷ MSCs / ml. The cell suspension thus prepared was continuously stirred by shaking gently for at least ten minutes at room temperature. At the same time, viability of the cell suspension was determined. Subsequently, the suspension (TR-250 and TR-300) was placed in a -70 ° C freezer in a CoolCell® freezer (BioCision). In parallel, samples were stored directly at -70 ° C or -196 ° C for 24 hours (Table 1). Table 2 shows the viability values of cells frozen by mere storage at -196 ° C, but cells are suspended in various solutions (TR-350, TR400 and TRH-400). Subsequently, all samples were placed in a Dewar flask containing liquid nitrogen. After thawing in a water bath at 37 ° C, the samples were tested according to Example 3.

Příklad 2: Možné přípravy 100 ml roztoku podle technického řešeníExample 2: Possible preparation of 100 ml solution according to the invention

Příklad 2A. Příprava roztoku podle technického řešení s 250 mM trehalózou (TR-250)Example 2A. Preparation of solution according to the invention with 250 mM trehalose (TR-250)

Navážíme 0,408 g KH₂PO₄ a 0,213 g Na₂HPO₄, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCl₂ x 2H₂O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO₄ a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 9,45 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 358 mosmol/1.Weigh 0.408 g KH ₂ PO ₄ and 0.213 g Na ₂ HPO ₄ , dissolve in 20 ml distilled water; weigh 0.007 g of CaCl ₂ x 2H ₂ O and dissolve in 10 ml of distilled water; weighed 0.012 g MgSO ₄ and dissolved in 10 ml of distilled water. Mix the prepared solutions and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 9.45 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 358 mosmol / L.

-4CZ 31206 Ul-4EN 31206 Ul

Příklad 2B. Příprava roztoku podle technického řešení s 300 mM trehalózou (TR-300)Example 2B. Preparation of solution according to the invention with 300 mM trehalose (TR-300)

Navážíme 0,408 g KH₂PO₄ a 0,213 g Na₂HPO₄, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCl₂ x 2H₂O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO₄ a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 11,34 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 408 mosmol/1.Weigh 0.408 g KH ₂ PO ₄ and 0.213 g Na ₂ HPO ₄ , dissolve in 20 ml distilled water; weigh 0.007 g of CaCl ₂ x 2H ₂ O and dissolve in 10 ml of distilled water; weighed 0.012 g MgSO ₄ and dissolved in 10 ml of distilled water. Mix the prepared solutions and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 11.34 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 408 mosmol / L.

Příklad 2C. Příprava roztoku podle technického řešení s 350 mM trehalózou (TR-350)Example 2C. Preparation of solution according to the invention with 350 mM trehalose (TR-350)

Navážíme 0,408 g KH₂PO₄ a 0,213 g Na₂HPO₄, rozpustíme v 20 ml destilované vody, navážíme 0,007 g CaCl₂ x 2H₂O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO₄ a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 13,23 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 458 mosmol/1.Weigh 0,408 g KH ₂ PO ₄ and 0,213 g Na ₂ HPO ₄ , dissolve in 20 ml distilled water, weigh 0,007 g CaCl ₂ x 2H ₂ O and dissolve in 10 ml distilled water; weighed 0.012 g MgSO ₄ and dissolved in 10 ml of distilled water. Mix the prepared solutions and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 13.23 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 458 mosmol / L.

Příklad 2D. Příprava roztoku podle technického řešení s 400 mM trehalózou (TR-400)Example 2D. Preparation of the solution according to the invention with 400 mM trehalose (TR-400)

Navážíme 0,408 g KH₂PO₄ a 0,213 g Na₂HPO₄, rozpustíme v 20 ml destilované vody; navážíme 0,007 g CaCl₂ x 2H₂O a rozpustíme v 10 ml destilované vody; navážíme 0,012 g MgSO₄ a rozpustíme v 10 ml destilované vody. Takto připravené roztoky smícháme a upravíme pH na hodnotu 7,4. Poté ve směsi rozpustíme 15,12 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 508 mosmol/1.Weigh 0.408 g KH ₂ PO ₄ and 0.213 g Na ₂ HPO ₄ , dissolve in 20 ml distilled water; weigh 0.007 g of CaCl ₂ x 2H ₂ O and dissolve in 10 ml of distilled water; weighed 0.012 g MgSO ₄ and dissolved in 10 ml of distilled water. Mix the prepared solutions and adjust the pH to 7.4. Then dissolve 15.12 g of trehalose in the mixture and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 508 mosmol / L.

Příklad 2E. Příprava vodného nepufrovaného roztoku podle technického řešení s 400 mM trehalózou (TRH-400)Example 2E. Preparation of aqueous non-buffered solution according to technical solution with 400 mM trehalose (TRH-400)

Navážíme a rozpustíme 15,12 g trehalózy a konečný objem upravíme destilovanou vodou na 100 ml. Výsledná osmolarita roztoku je 400 mosmol/1.Weigh and dissolve 15.12 g of trehalose and adjust the final volume to 100 ml with distilled water. The resulting osmolarity of the solution is 400 mosmol / L.

Příklad 3: Životaschopnost BM-MSCs po jejich zmražení a následném rozmražení (uskladnění v tekutém dusíku)Example 3: Viability of BM-MSCs after freezing and subsequent thawing (storage in liquid nitrogen)

Byla hodnocena životaschopnost MSCs izolovaných z lidské kostní dřeně uchovaných v roztoku TR-250, TR-300, TR-350, TR-400 a TRH-400 ihned po jejich rozmražení. Nejprve byla suspenze barvena propidium jodidem a viabilita buněk stanovena metodou průtokové cytometrie. Viabilita stanovená barvením propidium jodidem odráží životaschopnost jednotlivých buněk v suspenzi. Propidium jodid je látka, která neprostupuje membránou živých buněk. U poškozených a neživotaschopných buněk se propidium jodid váže na DNA. Životaschopnost BM-MSCs sledovaná barvením propidium jodidem bezprostředně po rozmražení dosahovala více než 50 % u vzorků zmražených šokovým uložením do -70 °C či do -196 °C (tabulka 1). Nejvhodnější se ukazuje právě přímé uložení suspense buněk v prostředku dle technického řešení do -70 °C či -196 °C v roztoku TR-250 i TR-300 (tabulka 1). Nejlepších výsledků bylo ovšem dosaženo při použití roztoku TR-400 s nejvyšší koncentrací trehalózy. Ten chrání buňky před poškozením mrazem nejvíce, viabilita buněk se po rozmražení pohybuje nad 60 % (tabulka 2).The viability of MSCs isolated from human bone marrow stored in TR-250, TR-300, TR-350, TR-400 and TRH-400 solutions immediately after thawing was evaluated. First, the suspension was stained with propidium iodide and cell viability was determined by flow cytometry. The viability determined by propidium iodide staining reflects the viability of individual cells in suspension. Propidium iodide is a substance that does not cross the living cell membrane. In damaged and non-viable cells, propidium iodide binds to DNA. The viability of BM-MSCs as measured by propidium iodide staining immediately after thawing was greater than 50% in samples frozen by shock storage at -70 ° C or -196 ° C (Table 1). The direct deposition of the cell suspension in the formulation according to the invention up to -70 ° C or -196 ° C in both TR-250 and TR-300 solution (Table 1) is most suitable. However, the best results were obtained using the TR-400 solution with the highest trehalose concentration. This protects the cells most from frost damage, the viability of the cells above 60% after thawing (Table 2).

-5CZ 31206 Ul-5GB 31206 Ul

Tabulka 1 - MSCs z kostní dřeně, viabilita buněk v roztoku TR-250 a TR-300 v různých režimech mraženíTable 1 - Bone marrow MSCs, cell viability in TR-250 and TR-300 solutions in different freezing regimes

Tabulka 2 - MSCs z kostní dřeně, viabilita buněk uložených přímo do -196 °C v různých roztocích dle technického řešeníTable 2 - MSCs from bone marrow, viability of cells deposited directly at -196 ° C in various solutions according to the technical solution

Rozmražené buňky byly paralelně také testovány pomocí následné kultivace a byla sledována jejich schopnost adherence na kultivační plastik a jejich morfologické vlastnosti. Základní vlastností mesenchymálních kmenových buněk je jejich schopnost adherence na kultivační plastik. Z morfologického hlediska mají životaschopné mesenchymální kmenové buňky protáhlý fibroblastový tvar. Bylo vysazeno stejné objemové množství buněk odpovídající počtu 100 000 buněk ío v čerstvém stavu na 24 jamkovou kultivační desku. Po 48 hodinách byly buňky hodnoceny pod mikroskopem. Nejvyšší míra adheze byla pozorována u suspenze buněk mražených přímým uložením do -70 °C či -196 °C v roztoku dle technického řešení (TR-250, TR-300, TR-350 a TR400). Všechny adherované buňky odpovídaly morfologii mesenchymálních kmenových buněk.Thawed cells were also tested in parallel by subsequent cultivation and their ability to adherence to the culture plastic and their morphological properties were monitored. The basic property of mesenchymal stem cells is their ability to adherence to culture plastic. From a morphological point of view, viable mesenchymal stem cells have an elongated fibroblast shape. An equal volume of cells corresponding to 100,000 fresh cells per 24-well culture plate was seeded. After 48 hours, the cells were scanned under a microscope. The highest rate of adhesion was observed with a suspension of cells frozen by direct storage at -70 ° C or -196 ° C in solution according to the invention (TR-250, TR-300, TR-350 and TR400). All adhered cells corresponded to the mesenchymal stem cell morphology.

Tato pozorování jsou v souladu s pozorováním při detekci viability pomocí propidium jodidu.These observations are consistent with the observations in the viability detection by propidium iodide.

Orientačními pokusy bylo zjištěno, že obsah trehalózy může být i vyšší než 400 mmol/1, avšak její účinek se již nijak významně nezvyšuje, přičemž při celkové osmolaritě vyšší než 900 již je roztok farmaceuticky nevhodný, a naopak obsah trehalózy nižší než 60 mmol/1 nemá již pozorovatelný vliv.By tentative experiments it was found that the content of trehalose may be higher than 400 mmol / l, but its effect does not increase significantly anymore, with a total osmolarity of more than 900 the solution is already unsuitable, while the content of trehalose is lower than 60 mmol / l no longer has an observable effect.

Claims (6)

2o 1. Prostředek pro uchování lidských nebo zvířecích buněk při velmi nízkých teplotách, vyznačující se tím, že je tvořen vodným roztokem trehalózy, který obsahuje trehalózu v množství 60 až 900 mmol/1, přičemž roztok může dále obsahovat kationty K⁺ v množstvíA composition for maintaining human or animal cells at very low temperatures, characterized in that it comprises an aqueous solution of trehalose which contains trehalose in an amount of 60 to 900 mmol / l, wherein the solution may further comprise K ⁺ cations in an amount of -6CZ 31206 Ul-6EN 31206 Ul 0 až 50 mmol/1, kationty Na⁺ v množství 0 až 80 mmol/1, anionty Cl· v množství 0 až 40 mmol/1, anionty PO4³ a/nebo HPO4²' a/nebo H2PO4 v celkovém množství 0 až 65 mmol/1, kationty Mg²⁺ a/nebo Ca²⁺ v celkovém množství 0 až 2 mmol/1, anionty SO4²' a/nebo HSO₄ v celkovém množství 0 až 2 mmol/1, přičemž pH roztoku je 7,1 až 7,6, a přičemž celková osmolarita roztoku není vyšší než 900 mosmol/1.0 to 50 mmol / l, Na ⁺ cations 0 to 80 mmol / l, Cl anions 0 to 40 mmol / l, PO4 ³ and / or HPO4 ² 'and / or H2PO4 anions in total 0 to 65 mmol / l, cations Mg ²⁺ and / or Ca ²⁺ in a total amount of 0 to 2 mmol / l, anions SO ^{4 2} 'and / or HSO ₄ in a total amount of 0 to 2 mmol / l, the pH of the solution being 7.1 to 7.6, and wherein the total osmolarity of the solution is not more than 900 mosmol / L. 2. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok sestává výlučně z trehalózy, vody a popřípadě stopových množství doprovodných rozpuštěných látek.Composition according to claim 1, characterized in that the solution consists exclusively of trehalose, water and optionally trace amounts of co-solutes. 3. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok obsahuje kationty K⁺ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Na⁺ v množství 20 až 80 mmol/1, anionty Cl' v množství 0,5 až 40 mmol/1, anionty PO4³' a/nebo HPO4²' a/nebo H₂PO₄' v celkovém množství 20 až 65 mmol/1.Composition according to claim 1, characterized in that the solution contains K ⁺ cations in an amount of 20 to 50 mmol / l, Na ⁺ cations in an amount of 20 to 80 mmol / l, and anions Cl 'in an amount of 0.5 to 40 mmol / l. 1, anions PO ^{4 3} 'and / or HPO ^{4 2} ' and / or H ₂ PO ₄ 'in a total amount of 20 to 65 mmol / l. 4. Prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že roztok obsahuje kationty Mg²⁺ a/nebo Ca²⁺ v celkovém množství 0,1 až 2 mmol/1, anionty SO4²' a/nebo HSO4' v celkovém množství 0,5 až 2 mmol/1.Composition according to claim 3, characterized in that the solution contains Mg ²⁺ and / or Ca ²⁺ cations in a total amount of 0.1 to 2 mmol / l, SO ^{4 2} 'and / or HSO4' anions in a total amount of 0, 5 to 2 mmol / l. 5. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že roztok obsahuje trehalózu v množství 200 až 400 mmol/1, kationty K⁺ v množství 28 až 32 mmol/1, kationty Na⁺ v množství 20 až 50 mmol/1, kationty Mg²⁺ a/nebo Ca²⁺ v celkovém množství 0,4 až 1,2 mmol/1, anionty CT v množství 0,5 až 20 mmol/1, anionty PO4³ a/nebo HPO4²' a/nebo H2PO4' v celkovém množství 40 až 50 mmol/1, anionty SO4²' a/nebo HSO4 v celkovém množství 0,9 až 1,2 mmol/1.Composition according to claim 1, characterized in that the solution contains trehalose in an amount of 200 to 400 mmol / l, K ⁺ cations in an amount of 28 to 32 mmol / l, Na ⁺ cations in an amount of 20 to 50 mmol / l, Mg cations ²⁺ and / or Ca ²⁺ in a total amount of 0.4 to 1.2 mmol / l, anions CT in an amount of 0.5 to 20 mmol / l, anions PO4 ³ and / or HPO4 ² 'and / or H2PO4' v a total amount of 40 to 50 mmol / l, anions SO4 ² 'and / or HSO4 in a total amount of 0.9 to 1.2 mmol / l. 6. Prostředek podle některého z nároků 1 nebo 3 až 5, vyznačující se tím, že roztok sestává výlučně z trehalózy, vody, alespoň některého kationtu ze skupiny kationtů K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ a alespoň některého aniontu ze skupiny aniontů Cl', PO4³', HPO4²', H2PO4', SO4²', HSO4', a popřípadě stopových množství doprovodných rozpuštěných látek.Composition according to one of Claims 1 or 3 to 5, characterized in that the solution consists exclusively of trehalose, water, at least some cation from the group of cations K ⁺ , Na ⁺ , Ca ²⁺ , Mg ²⁺ and at least some anion of groups of anions C1 ', PO4 ³ ', HPO4 ² ', H2PO4', SO4 ² ', HSO4', and optionally trace amounts of concomitant solutes. 7. Prostředek podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že uchovávané buňky jsou mezenchymální kmenové buňky.The composition of claim 5 or 6, wherein the cells to be stored are mesenchymal stem cells.