CZ309857B6

CZ309857B6 - Hexapeptid, kompozice zahrnující tento hexapeptid a jejich topické použití

Info

Publication number: CZ309857B6
Application number: CZ2022-141A
Authority: CZ
Inventors: Iva Dolečková; Polička Dolečková Iva; Paulina ORZOL; Orzol Paulina Mgr., Ph.D.; Sergej KAREL; Sergej Karel; Kateřina Vašíčková; Jana Polášková; Gloria HUERTA ANGELES; Angeles Gloria Huerta; Petrovičová Ludmila; Vladimír Velebný
Original assignee: Contipro A.S.
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2023-12-20
Also published as: WO2023186193A1; CZ2022141A3

Abstract

Řešení se týká hexapeptidu jako zlepšovače buněk pokožky s obecným vzorcem I X-Phe-Trp-Ala-His-Lys-Lys-Z (I) kde: X je -NHX1 skupina fenylalaninu na N-terminálním konci hexapeptidu, kde X1 je vybráno ze skupiny zahrnující H, acetyl, oktanoyl, dekanoyl, lauroyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, elaidoyl, oleoyl, biotinoyl nebo lipoyl; Z je -COZ1 skupina lyzinu na C-terminálním konci hexapeptidu, kde Z1 je vybráno ze skupiny zahrnující OH, OCH3, OCH2CH3 nebo NH2; a topické kompozice zahrnující tento hexapeptid a jejich topického použití.

Description

Hexapeptid, kompozice zahrnující tento hexapeptid a jejich topické použití

Oblast techniky

Stávající vynález se týká uměle navrženého peptidu o sekvenci X-Phe-Trp-Ala-His-Lys-Lys-Z, jeho derivátů nebo komplexů s ionty kovů, topické kompozice, která je zahrnuje a jejich topického použití. Týká se zejména použití peptidů pro ošetření pokožky lidí nebo zvířat pro kosmetické nebo dermo-farmaceutické účely.

Dosavadní stav techniky

Acne vulgaris

Acne vulgaris (dále akné) je velmi běžné chronické kožní onemocnění pilosebaceousní jednotky s hlubokým negativním psychosociálním dopadem na kvalitu života pacientů. Ačkoli ovlivňuje jedince všech věků, objevuje se obvykle během adolescence a často přetrvává do dospělosti (Yentzer a kol. 2010).

Patogeneze acne vulgaris je multifaktorová se čtyřmi hlavními událostmi: hyperseborrhea, epiteliální hyperproliferace a hyperkeratinizace, kolonizace Cutibacterium acnes a zánět.

Hyperseborrhea

Zvýšená produkce kožního mazu je považována za jednu z klíčových událostí patogeneze akné. V regulaci produkce kožního mazu kůží jsou zahrnuty různé sloučeniny signálních drah, z nichž šest hormonů hraje klíčovou roli. Mezi nejvýznamnějšími stimulátory produkce kožního mazu jsou androgeny, jejichž upregulace je často spojená s vývojem akné (da Cunha, Fonseca, a Machado 2013). V kožních buňkách je testosteron, nejběžnější androgen, rychle redukován na 5α-dihydrotestosteron (DHT) 5α-reduktázou, typem I (Fritsch, Orfanos, a Zouboulis 2001). Jak testosteron, tak DHT se vážou na androgenní receptory (AR), avšak DHT je 5 až 10 krát účinnější AR agonista a je považován za hlavní androgenní hormon ve vlasových folikulech (Anderson a Liao 1968).

Epiteliální hyperproliferace a hyperkeratinizace

Další typickou událostí v patogenezi akné je hyperproliferace folikulárních keratinocytů a jejich abnormální diferenciace (Thiboutot 2000). Druhá zmíněná je spojená se zvýšenou kohezivitou korneocytů, která vede k jejich nefunkční desquamaci (Thiboutot 2000). Nahromaděná hmota keratinizovaných korneocytů společně s kožním mazem částečně brání folikulům, což vede k jejich protažení a vytvoření vhodných podmínek pro růst C. acnes (Thiboutot 2000).

Existuje několik hypotéz vysvětlujících příčinu hyperproliferace keratinocytů a změněnou diferenciaci u akné. Bylo ukázáno, že androgeny, kromě stimulace produkce kožního mazu, indukují výše zmíněné procesy a také produkci pro-zánětlivého interleukinu IL- 1α (Kumtornrut a kol. 2019; Guy a Kealey 1998). Další možný spouštěč hyperkeratinizace je nízká koncentrace esenciální mastné kyseliny, linolenové kyseliny, která je snížena v pokožce postižené akné kvůli jejímu naředění vysokým množstvím kožního mazu (Downing a kol. 1986).

Cutibacterium acnes

C. acnes je bakterie žijící na a v lidské pokožce jako část normálního lidského kožního mikrobiomu. Sídlí především hluboko v mazových folikulech v kontaktu s keratinocyty.

- 1 CZ 309857 B6

Je potvrzeno, že C. acnes hraje významnou roli v patogenezi akné (McLaughlin a kol. 2019). Zdá se, že pro vývoj akné není tak důležité celkové množství C. acnes jako přítomnost určitých kmenů C. acnes (Dréno a kol. 2018). Bylo ukázáno, že tyto kmeny spojené s akné jsou více virulentní a produkují velké množství různých prozánětlivých faktorů (Dréno a kol. 2018).

Zánět

Zánět je považován za klíčovou část v patogenezi akné. V minulosti byl zánět považován za druhotnou událost indukovanou kolonizací C. acnes. V současné době se předpokládá, že zánětlivé procesy jsou zahrnuty ve všech stádiích vývoje akné a akné je nyní považována za opravdu zánětlivé onemocnění (Tanghetti 2013).

Léčba akné

Protože akné je multifaktorové onemocnění, je doporučen přístup kombinované terapie. Typicky je vybrána kombinace povrchového retinoidu (tretinoin, isotretinoin, adapalen, tazaroten, retinol, retinaldehyd atd.) a antimikrobiální látky (např. benzoyl peroxid) jako léčba první linie (Moradi Tuchayi a kol. 2015). Hormonální, antiandrogenní terapie (orální antikoncepce, spironolakton) je často dávána ženám pro snížení produkce kožního mazu. Povrchová a orální antibiotika (erytromycin, klindamycin, doxycyklin, minocyklin a sarecyklin) jsou používána v léčbě mírné až těžké akné obvykle v kombinaci s benzoyl peroxidem nebo retinoidy. Z dalších používaných povrchových látek proti akné může být zmíněna salicylová kyselina, azelaiková kyselina, zinek, síra, niacinamid, glykolová kyselina a antimikrobiální peptidy (Liu a kol. 2020).

Zinek v léčbě akné

Hladina zinku u pacientů s akné je často významně nižší a bylo ukázáno, že její doplnění (ústně nebo topicky) zlepšuje akné (Yee a kol. 2020). Ačkoli jeho přesný mechanismus působení není zcela pochopen, současná znalost navrhuje četné mechanismy včetně protizánětlivých, antioxidačních účinků, inhibice proliferace C. acnes a inhibice 5n-reduktázy, což vede ke snížené produkci kožního mazu in vivo (Abendrot a Kalinowska-Lis 2018; Cervantes a kol. 2018).

Peptidy a léčba akné

Další slibnou skupinou sloučenin v léčbě akné jsou peptidy vykazující antimikrobiální (AMP) (Ma a kol. 2021; Melo, Dugourd a Castanho 2006; Zhang a kol. 2013), protizánětlivé (Zhang a kol. 2013) a další vlastnosti jako jsou antioxidační účinky (Mills a kol. 2016). Bylo ukázáno, že některé látky odvozené od přírodních látek nebo čistě syntetické, navržené AMP mají slibné účinky proti akné:

• Omiganan pentahydrochlorid odvozený od hovězího AMP indolicidinu (Melo, Dugourd, a Castanho 2006; Rubinchik a kol. 2009) • GDP-20 (peptidy odvozené od granulysin) (Lim a kol. 2015; Ma a kol. 2021;

McInturff, Modlin, a Kim 2005) • Peptid LZ1 (VKRWKKWWRKWKKWV-NH2) (Zhang a kol. 2013) • AMP z kůže žab ([D4k]ascaphin-8, [G4K]XT-7, [T5k]temporin-Dra, brevinin-2GU a B2RP-Era (Popovic a kol. 2012) • Peptidy (Br-p) izolované z kořene lopuchu (Arctium lappa L.) (Miazga-Karska, Michalak a Ginalska 2020)

- 2 CZ 309857 B6 • Temporin-1Dra a moronecidin (Wu, Zhang a Zhou 2020) • Bombininu podobný peptid 7 (BLP-7) z Bombina orientalis (Wu a kol. 2020) • Cathelicidin-BF byl purifikován z hadích jedů z Bungarus fasciatus (Wang a kol. 2011) • Head-to-tail cyklizovaný bakteriocin AS-48 (Cebrián a kol. 2018) • CEN1HC-Br izolovaný ze zelené mořské okurky (Han a kol. 2018) • AMP C12-50 (Nair a kol. 2017) • α-helikální kationický peptid, P5 (Sunhyo Ryu a kol. 2015) • Helicobacter pylori - odvozený syntetický antimikrobiální peptid HPA3NT3 (S. Ryu a kol. 2014) • Syntetický epinecidin-1(22-42) peptid byl odvozen z pozic 22-42 Epinephelus coioides epinecidin-1 (Pan a kol. 2009) • Enterococcus faecalis-odvozený AMP SL-5 (Kang a kol. 2009) • Bacteriocinu podobná inhibitorní látka (BLIS-podobná látka) produkovaná Streptococcus salivarius (Bowe a kol. 2006) • Syntetický, navržený AMP (Woodburn, Jaynes a Clemens 2020)

Příklady patentů popisujících použití peptidů v léčbě akné:

• WO 2021175186 A1 Použití malé molekuly krátkého peptidu v přípravku produktu pro ošetření akné (LQLWQAEER, odvozený od bFGF, 100 μg/ml, inhibuje růst sebocytů, snižuje produkci kožního mazu) • CN 111253469 A Self-assembly krátký řetězec peptid a aplikace krátkého řetězce peptidu při léčbě akné (FFLQLQAEER) • CN 107698662 A Peptidová kombinace pro ošetření akné (WKIKIDSEAE a

PNMIYSKDY) • CN 112979762 A Cyklický peptid PIZ a jeho aplikace (EYPYKHSGYYHRAV) • KR 20200101767 A Peptid s antimikrobiální aktivitou a kompozice pro antimikrobiální zahrnující totéž (KTTKS) • WO 03015809 A2 Antimikrobiální kationické peptidy a jejich formulace • WO 2005025598 A1 antibakteriální lék pro propionibakterium acnes • EP 1853620 A2 Antimikrobiální hexapeptidy

Avšak neexistuje patent ani publikace popisující jakýkoli peptid o aminokyselinové sekvenci podle stávajícího vynálezu, který je klíčový pro fyzikálně-chemické vlastnosti peptidu a také pro jeho biologickou aktivitu.

- 3 CZ 309857 B6

Mnoho výše zmíněných možností ošetření má negativní vedlejší účinky. Retinoidy zejména, ale také zinek nebo salicylová kyselina, běžně způsobují vysušení kůže, loupání, svědění, zčervenání a citlivost na slunce (Thielitz a Gollnick 2008; Cervantes a kol. 2018; Arif 2015). Znepokojující je zejména známý teratogenní účinek retinoidů pozorovaný po orálním použití (Thielitz a Gollnick 2008). Ačkoli se ukázalo, že povrchové použití retinoidů nezvyšovalo riziko poškození při narození, nejsou preventivně doporučeny pro těhotné ženy (Panchaud a kol. 2012). Použití antibiotik jako další běžný přístup při terapii akné je spojeno s vysokým rizikem selekce rezistentních bakteriálních kmenů (Walsh, Efthimiou a Dréno 2016). Proto nemohou být použita jako monoterapie a jsou doporučena pouze pro krátkodobé použití (Walsh, Efthimiou a Dréno 2016).

Ze všech těchto důvodů existuje stále potřeba pro nové, účinnější, komplexní a bezpečnější ošetření akné.

Podstata vynálezu

Překvapivě byly zjištěny nové aktivity hexapeptidu Phe-Trp-Ala-His-Lys-Lys na buňky pokožky a zlepšení stavu pokožky.

Předmět vynálezu se týká hexapeptidu jako zlepšovače buněk pokožky s obecným vzorcem I

X-Phe-Trp-Ala-His-Lys-Lys-Z (I) kde:

X je -NHX¹ skupina fenylalaninu na N-terminálním konci hexapeptidu, kde

X¹ je vybrané ze skupiny zahrnující H, acetyl, oktanoyl, dekanoyl, lauryl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, elaidoyl, oleoyl, biotinoyl nebo lipoyl. S výhodou X¹ je H.

Z je COZ¹ skupina lyzinu na C-terminálním konci hexapeptidu, kde Z¹ je vybrané ze skupiny zahrnující OH, OCH3, OCH2CH3 nebo NH2. S výhodou Z¹ je OH.

Hexapeptid podle stávajícího vynálezu zlepšuje buňky pokožky tak, že může být aplikován topicky na kůži a může se také nazývat topický hexapeptid.

Hexapeptid obecného vzorce I podle stávajícího vynálezu je s výhodou ve formě komplexu s iontem kovu vybraným ze skupiny zahrnující iont zinku, ion mědi, ion manganu nebo ion hořčíku. Ion kovu je vázán koordinačně kovalentní vaznou v komplexu. S výhodou je iontem kovu zinečnatý ion (Zn²⁺) a komplex je schematicky uveden níže jako Zn-FWAHKK komplex nebo jednoduše jako Zn-FWAHKK.

Hexapeptid obecného vzorce I podle stávajícího vynálezu může být opticky čistý nebo složený z L- nebo D-izomerů nebo jejich směsi. L-izomery, což jsou ty nacházející se v přírodě, jsou výhodné.

Hexapeptid podle stávajícího vynálezu může být ve formě solí, zejména solí kyseliny chlorovodíkové, kyseliny mravenčí nebo kyseliny octové nebo jakékoli soli běžně používané v kosmetice.

Další provedení podle stávajícího vynálezu je topická kompozice zahrnující alespoň jeden hexapeptid obecného vzorce I, jak je uvedeno výše.

- 4 CZ 309857 B6

Podle výhodného provedení topické kompozice podle stávajícího vynálezu je koncentrace hexapeptidu obecného vzorce I, jak je uvedeno výše, v rozsahu 0,0001 až 0,135 % (hmotn./hmotn.), s výhodou v rozsahu 0,001 až 0,05 % (hmotn./hmotn.), výhodněji od 0,001 do 0,0135 % (hmotn./hmotn.). Množství hexapeptidu závisí na účelu kompozice a požadovaném konečném efektu.

Stávající vynález také zahrnuje topickou kompozici, která obsahuje alespoň jeden hexapeptid podle stávajícího vynálezu ve formě pro topickou kožní aplikaci, která může být vybraná ze skupiny zahrnující krém, sérum, bezvodý gel, pastu, disperzi vezikulů, prášek, nanovlákna, makro-, mikro- nebo nanočástice nebo makro-, mikro- nebo nano-sféry, které mohou být adsorbovány na organických polymerních prášcích, mastcích, bentonitech a dalších anorganických nebo organických podpůrných materiálech.

Tato topická kompozice podle stávajícího vynálezu je ve formě krému vybraného ze skupiny zahrnující emulzi voda-v-oleji nebo olej-ve-vodě, mikro- nebo nano-emulzi.

Tato topická kompozice podle stávajícího vynálezu je ve formě séra vybraného ze skupiny zahrnující sterilní nebo nesterilní vodný nebo vodno-alkoholový roztok nebo gel.

Podle dalšího výhodného provedení je topická kompozice podle stávajícího vynálezu ve formě vybrané ze skupiny zahrnující krém nebo sérum.

V případě, že je topická kompozice podle stávajícího vynálezu ve formě krému, je koncentrace hexapeptidu obecného vzorce I, jak je uvedeno výše, v rozsahu 0,0001 až 0,135 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 0,001 % až 0,0135 % (hmotn./hmotn.).

S výhodou kompozice ve formě krému dále zahrnuje alespoň jednu kosmetickou nebo dermofarmaceutickou pomocnou látku vybranou ze skupiny zahrnující olej, vosk, máslo, emulgátor, pomocnou aktivní složku nebo konzervant.

S výhodou je množství oleje, vosku, másla nebo jejich směsi v kompozici podle stávajícího vynálezu v rozsahu 20 až 55 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 20 až 40 % (hmotn./hmotn.), výhodněji 20 až 30 % (hmotn./hmotn.). S výhodou je množství emulgátoru v kompozici podle stávajícího vynálezu v rozsahu od 1 do 20 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 2 až 15 % (hmotn./hmotn.), výhodněji 2 až 10 % (hmotn./hmotn.). S výhodou je množství další aktivní složky v kompozici podle stávajícího vynálezu v rozsahu od 0,001 do 20 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 0,001 až 10 % (hmotn./hmotn.), výhodněji 0,001 až 5 % (hmotn./hmotn.). S výhodou je množství konzervantu v kompozici podle stávajícího vynálezu v rozsahu od 0,1 do 2,5 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 0,1 až 1,5 % (hmotn./hmotn.), výhodněji 0,8 až 1,2 % (hmotn./hmotn.).

S výhodou je olej vybraný ze skupiny zahrnující arganový, kokosový, avokádový, mandlový, sezamový, olivový, slunečnicový, konopný, jojobový, makadamový, z pšeničných klíčků, marulový, mokřadkový, rýžový, makový, šípkový, meruňkový, ricinový olej, kaprylový/kaprový triglycerid; máslo je vybráno ze skupiny zahrnující kakaové máslo, bambucké máslo, ilipové máslo, kokum máslo, murumurové máslo, mangové máslo, kupuakové máslo, avokádové máslo; a vosk je vybraný ze skupiny zahrnující lanolin, včelí vosk, karnauba, kandelilový vosk a vazelínu.

S výhodou je emulgátor vybraný ze skupiny zahrnující glyceryl stearát, glyceryl kaprylát, behenyl alkohol, glyceryl behenát, cetearyl glukosid, methyl glukózu, sekvistearát, glyceryl stearát citrát, polyglyceryl-3 stearát, cetearyl olivát, lecitin, stearyl alkohol, sorbitan oleát, polysorbát, stearovou kyselinu, cetyl alkohol a cetearyl alkohol, akrylát sodný, akryloyldimethyl taurát sodný kopolymer, izohexadekan, polysorbát 80 nebo jejich směs.

- 5 CZ 309857 B6

Topická kompozice podle stávajícího vynálezu ve formě krému obsahujícího alespoň jeden hexapeptid podle stávajícího vynálezu může být také kombinována s dalšími pomocnými aktivními složkami, které mohou mít synergický nebo aditivní účinek pro zvýšení nebo rozšíření požadované aktivity popsané v tomto vynálezu. Tato další aktivní složka je vybrána ze skupiny obsahující následující látky: proti akné, proti stárnutí, proti vráskám, zesvětlující, bělicí, proti skvrnám, pigmentující, hydratační, zvlhčující, zvlhčovací, zeštíhlující, odlupovací, proti zčervenání, protizánětlivé, antioxidanty, vychytávače radikálů, proti glykaci, zvětšující objem, restrukturalizační, omlazující, regenerační, proti karbonylaci, dermo-relaxační, zlepšující stratum corneum, dermo-epidermální spojení, pevnost, elasticitu, kolagenové boostery, oční kontury (tmavé kruhy a podoční vaky), podporující prokrvení atd.

Výše uvedené další aktivní složky mohou být syntetické nebo získané z rostlin, bakterií, hub, buněčných kultur nebo jejich produkty.

S výhodou je další aktivní složka vybraná ze skupiny zahrnující vitamíny A, D, E, K, C, Bskupina, koenzym Q10, alantoin, bisabolol, bakuchiol, resveratrol, kyselinu mléčnou, aminokyseliny, benzoylperoxid, síru, azelaovou kyselinu, peptidy s výhodou acetyl hexapeptid-8, palmitoyl tripeptid-1, palmitoyl tetrapeptid-7, tripeptid-1 mědi, hexapeptid-1, palmitoyl pentapeptid-4, peptidy saccharomyces a proteiny, s výhodou rýže, sóji, quinoa nebo pšeničný protein; polysacharidy s výhodou hyaluronovou kyselinu nebo její farmaceuticky a kosmeticky přijatelnou sůl nebo derivát s výhodou oleoyl hyaluronát sodný, retinoyl hyaluronát sodný, hyaluronát krospolymer-3 sodný; karboxymethyl glukan, schizofylan, glukomanan; pantenol; močovinu; glycerin; rostlinné extrakty, s výhodou extrakt z aloe vera, heřmánkový extrakt, acai extrakt, extrakt ze zeleného čaje, extrakt z řas, ovesný extrakt, konopný extrakt, brusinkový extrakt; extrakty, fermenty, lyzáty nebo filtráty z bakterií s výhodou z Lactobacillus spp., Thalassospira spp., Bifidobacterium spp., Halobacterium spp., nebo z hub s výhodou ze Saccharomyces spp., Agaricus subrufencens, Choiromyces maendrformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grfola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus spp., Trametes versicolor, Tremella fucformis, Tuber spp., Schizophyllum commune.

S výhodou je konzervant vybraný ze skupiny zahrnující aromatické kyseliny a jejich deriváty s výhodou benzoovou kyselinu, benzoát sodný, kyselinu salicylovou, kyselinu dehydrooctovou, sorbát draselný, parabeny; alkoholy s výhodou ethanol, isopropanol, benzylalkohol, fenoxyethanol, fenethyl alkohol; imidazolové deriváty s výhodou hydantoin, imidazolidinyl močovinu; kationické povrchově aktivní látky, s výhodou benzalkonium chlorid.

Pokud je topická kompozice podle stávajícího vynálezu ve formě séra, koncentrace hexapeptidu obecného vzorce I, jak je uvedeno výše, je v rozsahu 0,001 až 0,135 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 0,001 % až 0,0135 % (hmotn./hmotn.).

S výhodou kompozice ve formě séra dále zahrnuje alespoň jednu kosmetickou nebo dermofarmaceutickou pomocnou složku vybranou ze skupiny zahrnující zahušťovadlo, pomocnou aktivní složku a konzervant, jak je definováno výše.

S výhodou je množství zahušťovadla v kompozici podle stávajícího vynálezu v rozsahu 0,1 % až 20 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 0,1 % až 5 % (hmotn./hmotn.), výhodněji 0,2 až 0,5 % (hmotn./hmotn.). S výhodou je množství pomocné aktivní složky v kompozici podle stávajícího vynálezu v rozsahu 0,001 až 20 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 0,001 až 10 % (hmotn./hmotn.), výhodněji 0,001 až 5 % (hmotn./hmotn.). S výhodou je množství konzervantu v kompozici podle stávajícího vynálezu v rozsahu 0,1 až 2,5 % (hmotn./hmotn.), s výhodou 0,1 až 1,5 % (hmotn./hmotn.), výhodněji 0,8 až 1,2 % (hmotn./hmotn.).

S výhodou je zahušťovadlo vybráno ze skupiny zahrnující xanthamovou gumu, sklerotiovou gumu, guarovou gumu, celulózovou gumu, karbomer, hydroxyethylcelulózu, kořenový extrakt

- 6 CZ 309857 B6 z Amorphophallus konjac, karagenan, pululan, lecitin, lysolecitin, akrylát sodný, akryloyldimethyltaurát sodný kopolymer, izohexadekan, polysorbát 80 nebo jejich směsi.

Topická kompozice podle stávajícího vynálezu obsahující alespoň jeden hexapeptid podle stávajícího vynálezu může být také kombinována s dalšími aktivními složkami, které mohou mít synergický nebo aditivní účinek pro zvýšení rozsahu požadované aktivity popsané ve vynálezu. Pomocná aktivní složka je vybraná ze skupiny zahrnující následující látky: proti akné, proti stárnutí, proti vráskám, zesvětlující, bělicí, proti skvrnám, pigmentující, hydratační, zvlhčující, zvlhčovací, zeštíhlující, odlupující, proti zčervenání, protizánětlivé, antioxidanty, vychytávače radikálů, proti glykaci, zvětšující objem, restrukturalizační, omlazující, regenerující, proti karbonylaci, dermo-relaxační, zlepšující stratum corneum, dermo-epidermální spojení, pevnost, elasticitu, kolagenové boostery, oční kontury (tmavé kruhy a podoční vaky), zlepšující cirkulaci krve atd.

Výše zmíněné pomocné aktivní složky mohou být syntetické nebo získané z rostlin, bakterií, hub, buněčných kultur nebo jejich produkty.

S výhodou je pomocná aktivní složka vybraná ze skupiny zahrnující vitamín C a skupinu vitamínů B; aminokyseliny, peptidy s výhodou acetyl hexapeptid-8, palmitoyl tripeptid-1, měďnatý tripeptid-1, peptidy Saccharomyces, hexapeptid-1, a proteiny s výhodou rýžový protein, sójový protein, quinoa nebo pšeničný protein; další polysacharidy s výhodou hyaluronovou kyselinu nebo její farmaceuticky a kosmeticky přijatelnou sůl nebo derivát s výhodou oleoyl hyaluronát sodný, retinoyl hyaluronát sodný, hyaluronát krospolymer-3 sodný; karboxymethyl glukan, schizophyllan, glukomanan, pantenol, močovinu, glycerin; rostlinné extrakty, s výhodou extrakt z aloe vera, heřmánkový extrakt, acai extrakt, extrakt ze zeleného čaje, extrakt z řas, ovesný extrakt, konopný extrakt, brusinkový extrakt; extrakty, fermenty, lyzáty nebo filtráty z bakterií, s výhodou z Lactobacillus spp., Thalassospira spp., Bifidobacterium spp., Halobacterium spp., nebo hub s výhodou z Saccharomyces spp., Agaricus subrufescens, Choiromyces maendrformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grfola. frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus spp., Trametes versicolor, Tremella fucformis, Tuber spp., Schizophyllum commune.

S výhodou je konzervant vybraný ze skupiny zahrnující aromatické kyseliny a jejich deriváty s výhodou kyselinu benzoovou, benzoát sodný, kyselinu salicylovou, kyselinu dehydrooctovou; sorbát draselný, parabeny; alkoholy s výhodou ethanol, isopropanol, benzylalkohol, fenoxyethanol, fenethylalkohol; imidazolové deriváty s výhodou hydantoin, imidazolidinyl močovinu; kationické povrchově aktivní látky s výhodou benzalkonium chlorid.

Všechna % uvedena níže, jsou (hmotn./hmotn.%) pokud nebude uvedeno jinak, a vztahují se k celkové hmotnosti kompozice, pokud se % týká topické kompozice podle stávajícího vynálezu.

Obecně odpovídá množství vody v kompozici podle stávajícího vynálezu ve formě krému nebo séra množství vody přidané do 100 % (hmotn./hmotn.) kompozice.

Kosmeticky a farmaceuticky přijatelné soli hyaluronové kyseliny mají být takové, které jsou tvořené z kyselin, které tvoří netoxické kyselé anionty vybrané ze skupiny zahrnující sodík, draslík, vápník, hořčík, zinek.

Nový je hexapeptid obecného vzorce I podle stávajícího vynálezu a jeho použití nebo použití kosmetických nebo dermo-farmaceutických topických kompozic podle stávajícího vynálezu obsahujících uvedený hexapeptid pro zlepšení mastného a k akné náchylného stavu pokožky a vzhledu. Konkrétněji hexapeptid podle stávajícího vynálezu inhibuje epidermální keratinizaci, snižuje produkci kožního mazu inhibicí klíčového enzymu 5n-reduktázy, má protizánětlivou aktivitu tím, že inhibuje prozánětlivé interleukiny, má antimikrobiální účinek ke Cutibacterium

- 7 CZ 309857 B6 acnes a snižuje počet lézí akné in vivo. Dále má uvedený hexapeptid podle stávajícího vynálezu také účinek proti stárnutí stimulací kolagenové syntézy a snížením vrásek in vivo.

Uvedený hexapeptid topické kompozice podle stávajícího vynálezu je určen pro mastnou a k akné náchylnou pokožku a také pro normální kůži.

Podle dalšího výhodného provedení hexapeptid podle obecného vzorce I podle stávajícího vynálezu a topická kompozice podle stávajícího vynálezu jsou určené pro použití při léčbě pokožky. S výhodou pro použití při lékařském ošetření kožní nemoci vybrané ze skupiny zahrnující akné, atopickou dermatitidu, psoriázu, nemoc odlupování kůže, ichtyózu. Nebo s výhodou pro použití pro kosmetické ošetření kůže.

Objasnění výkresů

Obr. 1 Hexapeptid FWAHKK tvoří komplex se zinkem. Spektrofotometrické stanovení schopnosti zinku tvořit komplex s FWAHKK hexapeptidem použitím dithizonu jako volného zinkového indikátoru.

Obr. 2. Zinek proniká do buněk účinněji, když je v Zn-FWAHKK komplexu. HaCaT keratinocyty byly inkubovány se Zn-FWAHKK nebo ZnSO4*7H2O (Zn) s odpovídající koncentrací 3 h. Intracelulární zinek byl vizualizován použitím fluorescenční mikroskopie.

Obr. 3. Hexapeptid FWAHKK zvyšuje buněčnou viabilitu a zabraňuje cytotoxickému účinku zinku v Zn-FWAHKK komplexu. NIH-3T3 fibroblasty byly inkubovány s FWAHKK, ZnFWAHKK nebo ZnSO4*7H2O (Zn) při odpovídajících koncentracích 48 h. Buněčná viabilita byla stanovena MTT postupem. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 v porovnání s kontrolou, pokud není uvedeno jinak.

Obr. 4. Hexapeptid FWAHKK a ZnSO4*7H2O snížil expresi genu 5n-reduktázy v porovnání s retinolem. Zn-FWAHKK komplex byl dokonce účinnější než jeho jednotlivé složky. HaCaT keratinocyty byly ošetřeny FWAHKK, Zn-FWAHKK, ZnSO4*7H2O (Zn) a retinolem 72 h. Relativní genová exprese 5n-reduktázy (gen SRD5A1) byla stanovena pomocí qRT-PCR. *p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 v porovnání s příslušnými kontrolami.

Obr. 5. Hexapeptidy FWAHKK a Zn-FWAHKK významně snížily UVB-indukovanou expresi genu IL1A vzhledem k zinku nebo retinolu. HaCaT keratinocyty byly ozářeny 10 mJ/cm² UVB a ošetřeny FWAHKK, Zn-FWAHKK, ZnSO4*7H2O (Zn) a retinolem 24 h. Relativní genová exprese IL-Ια (gen IL1A) byla stanovena qRT-PCR. *** p<0,001 v porovnání s příslušnými UVB kontrolami.

Obr. 6. Hexapeptidy FWAHKK a Zn-FWAHKK snížily expresi genů spojených s keratinocytovou diferenciací podobně jako retinol, když zinek neměl žádný takový účinek. HaCaT keratinocyty byly ošetřeny FWAHKK, Zn-FWAHKK, ZnSO4*7H2O (Zn) a retinolem 72 h. Relativní genová exprese 5n-reduktázy (gen SRD5A1) byla stanovena qRT-PCR * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 v porovnání s příslušnými kontrolami.

Obr. 7. Hexapeptidy FWAHKK a Zn-FWAHKK významně snížily UVB-indukovanou genovou expresi IL6 a IL8 v porovnání se zinkem nebo retinolem. HaCaT keratinocyty byly ozářeny 10 mJ/cm² UVB a ošetřeny FWAHKK, Zn-FWAHKK, ZnSO4*7H2O (Zn) a retinolem 24 h. Relativní genová exprese pro-zánětlivých interleukinů Il-6 a IL-8 (geny IL6 a IL8) byla stanovena qRT-PCR. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 v porovnání s příslušnými UVB kontrolami.

- 8 CZ 309857 B6

Obr. 8. Hexapeptid FWAHKK a zinek měly antimikrobiální aktivitu proti C. acnes rostoucích v suspenzi. Zn-FWAHKK měl vyšší aktivitu než jednotlivé složky. C. acnes rostoucí v suspenzi byly kultivovány s FWAHKK, Zn-FWAHKK and ZnSO4*7H2O (Zn) 72 h. Potom bylo změřeno OD590. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 v porovnání s kontrolou, pokud není uvedeno jinak.

Obr. 9. Hexapeptidy FWAHKK a Zn-FWAHKK stimulovaly kolagen 1 genovou expresi v porovnání se zinkem nebo retinolem. HaCaT keratinocyty byly ošetřeny FAWHKK, ZnFWAHKK, ZnSO4*7H2O (Zn), a retinolem 72 h. Relativní genová exprese 5a-reduktázy (gen SRD5A1) byla stanovena qRT-PCR. * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 v porovnání s příslušnými kontrolami.

Obr. 10. Zn-FWAHKK komplex měl aktivitu proti akné a proti stárnutí a je účinnější než retinol. In vivo studie na 40 dobrovolnících s pokožkou náchylnou k akné, kteří si aplikovali dvě emulze s 13,5 pg/ml Zn-FWAHKK a placebem (30 subjektů) nebo 0,2% retinol a placebo (10 subjektů) na dvou polovinách obličeje v daném pořadí jednou denně 6 týdnů. Počet lézí akné (A) byl stanoven obrazovou analýzou celoobličejových obrázků získaných VisiaCR. Hloubka vrásek vraních stop (B) byla stanovena 3D fotoaparátem. * p<0,05; ** p<0,01, *** p<0,001 v porovnání s placebem.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1. Příprava FWAHKK, Zn-FWAHKK, acetyl-FWAHKK a palmitoyl-FWAHKK peptidu

Nejdříve byl syntetizován FWAHKK peptid standardní syntézou peptidů na pevné fázi použitím Fmoc/tBu strategie na Wangově resinu (Amblard a kol. 2006).

Připojení první aminokyseliny na Wangův resin (Sunresin, Čína) bylo provedeno stříkačkovým reaktorem v dimethylformamidu (DMF) použitím diisopropylkarbodiimidu (DIC) a OxymaPure® (Iris Biotech, Německo) v 3 molárním nadbytku (meq) Fmoc-Lys(Boc)-OH přes noc. Po spojení byly zbytkové hydroxylové skupiny na resinu překryty roztokem acetanhydrid/pyridin (1/1, obj./obj.).

FWAHKK peptid byl syntetizován v 0,1 mmol škále použitím CEM Liberty Blue automatizovaného mikrovlnného peptidového syntetizéru (CEM, USA) na Wangově resinu nasyceném první Fmoc-AA. Fmoc deprotekce byly provedeny 20% pyridinem v DMF. Slučovací reakce byly provedeny použitím 5 ekvivalentů Fmoc-AA/DIC/Oxyma Pure^® v DMF.

Pro přípravu acetyl-FWAHKK a palmitoyl-FWAHKK byl N-konec syntetizovaného peptidu FWAHKK na resinu acetylován nebo palmitoylován použitím 2 meq acetandhydridu nebo palmitoylanhydridu/pyridinu (1/1, obj./obj.) v DMF 30 min při teplotě místnosti.

Štěpení peptidů (FWAHKK, acetyl-FWAHKK nebo palmitoyl-FWAHKK) z resinu bylo provedeno 30 min zvýšením teploty (38 °C) použitím CEM Razor® robustního peptidového štěpícího systému (CEM, USA) se směsí trifluoroctová kyselina/anisol/thioanisol/H2O/dichlormethan (85/2,5/2,5/5/5). Peptidy byly potom vysráženy ve studeném diethyletheru.

Surové FWAHKK a acetyl-FWAHKK peptidy byly rozpuštěny v 50% acetonitrilu, surový palmitoyl-FWAHKK byl rozpuštěn ve 100% acetonitrilu. Potom byly purifikovány na Shimadzu preparativní HPLC (série Prominence). XBridge OBD Prep Column Reversed-Phase 5 pm Sférický Hybrid, 50 mm x 50 mm byla použita pro rozdělení s průtokem 30 ml/min. Mobilní fáze byla A 0,1% HCOOH ve vodě a B acetonitril. Čistota peptidů byla ověřena PDA a MS detektorem. Purifikované peptidy byly potom lyofilizovány.

- 9 CZ 309857 B6

Pro přípravu FWAHKK hexapeptidu v komplexu se zinkem (Zn-FWAHKK) byl připraven vodný roztok 10% FWAHKK hexapeptidu a 3,52% ZnSO4*7H2O (síran zinečnatý, heptahydrát, Lachner, Česká republika) odpovídající molárnímu poměru 1:1, mícháno přes noc při teplotě místnosti a potom byl roztok lyofilizován.

Příklad 2. Schopnost FWAHKK peptidu tvořit komplex se zinkem

Schopnost FWAHKK peptidu tvořit komplex se zinkem byla vyhodnocena, jak bylo popsáno dříve s menšími modifikacemi (Catapano a kol., 2018). Stručně, 20 pl roztoku FWAHKK (0 až 600 μΜ (0 až 490 pg/ml; 0 až 0,049 hmotn./hmotn.%) připraveno, jak je popsáno v Příkladu 1) a 60 μΜ (17,3 pg/ml; 0,00173%) ZnSO4*7H2O v 15 mM HEPES, pH 6,8 byl smíchán s 20 pl 250 μΜ dithizonu v DMSO a 80 pl 15 mM HEPES, pH 6,8. Dithizon byl použit jako indikátor volného zinku. Po 30 min inkubace při teplotě místnosti (RT) byla změřena absorbance při 520 nm a byla spočítána procenta zinku v komplexu s FWAHKK peptidem.

Výsledky (obr. 1) potvrdily schopnost peptidu FWAHKK tvořit komplex se zinkem. V komplexu Zn-FWAHKK připraveném, jak je popsáno v příkladu 1, ve kterém je molární poměr FWAHKK a zinku 1:1, je přibližně 50 % zinku v komplexu s hexapeptidem.

Příklad 3. Zvýšená penetrace zinku v komplexu Zn-FWAHKK do buněk

HaCaT keratinocyty (CLS sbírka, Německo) byly kultivovány v Dubelccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 10% fetálním bovinním sérem, 0,2 mg/ml glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 0,1 mg/ml streptomycinu (vše Sigma-Aldrich, USA) při 37 °C v humidifikované atmosféře s 5% CO2.

Buňky nasazené ve vhodné hustotě na 96-jamkové destičky byly ošetřeny 1352 pg/ml (0,1352 %) Zn-FWAHKK komplexem (připraveno, jak je popsáno v příkladu 1) nebo ZnSO4*7H2O s odpovídající koncentrací (352 pg/ml (0,0352 %)) 3 h. Potom byly buňky promyty buněčným kultivačním médiem a inkubovány s 1 pM FluoZin^TM-3 AM (Invitrogen, USA), buněčným permeačním činidlem, fluorogenním Zn²⁺ - selektivním indikátorem, a 20 pM Hoechst (Abcam, UK), fluorescenční DNA barvou v buněčném kultivačním médiu 30 min při 37 °C ve tmě. Potom byly buňky opláchnuty fosfátovým fyziologickým roztokem (PBS). Fluorescence byla pozorována použitím Eclipse 50i fluorescenčního mikroskopu vybaveného DS-Fi1 kamerou (oboje Nikon, Japonsko). Výsledky (obr. 2) ukázaly, že penetrace zinku do kožních buněk byla účinnější, když byl ion v komplexu Zn-FWAHKK.

Příklad 4. FWAHKK zvyšuje buněčnou viabilitu a brání cytotoxickému účinku zinku v komplexu Zn-FWAHKK

NIH-3T3 myší embryonální fibroblasty (ATCC sbírka, USA) byly kultivovány stejným způsobem jako HaCaT keratinocyty, jak je popsáno v Příkladu 3. Buňky nasazené ve vhodné hustotě na 96-jamkové destičky byly ošetřeny FWAHKK (2,5 až 80 pg/ml (0,00025 až 0,008%)), Zn-FWAHKK (3,4 až 108 pg/ml (0,00034 až 0,0108%)) (oboje připraveno, jak je popsáno v Příkladu 1) a ZnSO4*7H2O (0,9 až 28,2 pg/ml (0,00009 až 0,00282%)) 48 h. Potom byla buněčná viabilita stanovena postupem MTT (Riss a kol., 2016). Stručně, buňky byly inkubovány s 0,5 mg/ml MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazolium bromid) v buněčném kultivačním médiu 2,5 h při 37 °C. Po odstranění MTT byla provedena lyze buněk a rozpuštění formazanu inkubací buněk se solubilizačním roztokem (45% isopropanol, 45% DMSO, 10% Triton-X, 0,3 M HCl) 30 min při RT, třepání. Absorbance byla potom měřena při 570 nm spektrofotometrem (EnVision® 2105 Multimode Destičkový Reader, Perkin, Elmer, USA). T-test byl použit pro statistické vyhodnocení výsledků.

- 10 CZ 309857 B6

Výsledky (obr. 3) ukázaly, že ZnSO4*7H2O v koncentracích od 10,6 μg/ml významně snížily buněčnou viabilitu. Na druhou stranu, FWAHKK peptid zvýšil buněčnou viabilitu a tvorba ZnFWAHKK komplexu zabránila cytotoxickému účinku zinku.

Příklad 5. Inhibice 5a-reduktázové genové exprese FWAHKK a Zn-FWAHKK

HaCaT keratinocyty (CLS sbírka, Německo) byly kultivovány, jak je popsáno v příkladu 3. Buňky nasazené ve vhodné hustotě do 6-jamkových destiček byly ošetřeny FWAHKK (1 μg/ml (0,0001%) a 10 μg/ml (0,001%)), Zn-FWAHKK (1,35 μg/ml (0,000135%) a 13,5 μg/ml (0,00135%)) (oboje připraveno, jak je popsáno v příkladu 1), ZnSO4*7H2O (Zn, 0,35 μg/ml (0,000035%) a 3,5 μg/ml (0,00035%)), a 10 μΜ retinolem (v DMSO, finální koncentrace DMSO byla 0,1%) 72 h. Kontrolní buňky byly neošetřeny nebo ošetřeny 0,1% DMSO v případě retinolové kontroly.

Potom byla exprese genu 5a-reduktázy (gen SRD5A1) stanovena kvantitativně, real-time, PCR s reverzní transkripcí (qRT-PCR), jak následuje. Celková RNA byla izolována z buněk metodou kyselé extrakce guanidin thiokyanát-fenol použitím TRI Reagentu (Sigma Aldrich, USA) podle instrukcí poskytnutých dodavatelem. Reverzní transkripce byla provedena použitím Velkokapacitního kitu cDNA reverzní transkripce (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) v GenePro termálním cykleru (Bioer Technology, Čína) podle instrukcí výrobce. Následná qPCR byla provedena specifickou TaqMan genovou expresní metodou pro SRD5A1 (qHsaCEP0052536, BioRad, CA, USA), a RPL13A (Hs04194366_g1, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) jako referenčním genem; a TaqMan Fast Advanced Master mix (všechny Thermo Fisher Scientific, MA, USA) podle doporučení dodavatele v Jednokrokovém real-time PCR cykleru (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Data byla analyzována použitím 2^-ΔΔα metody. Data byla normalizována na negativní kontroly nebo v případě retinolu na DMSO kontroly. Ttest byl použit pro statistické vyhodnocení dat.

5a-reduktáza je klíčový enzym zahrnutý v androgenně indukované produkci kožního mazu. Tento enzym konvertuje testosteron, nejběžnější androgen, na DHT, který je několikrát účinnější při stimulaci produkce kožního mazu. Výsledky (Obr. 4) ukázaly, že hexapeptid FWAHKK, ZnFWAHKK a také ZnSO4*7H2O významně snížily expresi genu 5a-reduktázy (gen SRD5A1). Komplex Zn-FWAHKK byl účinnější než jeho jednotlivé složky s odpovídajícími koncentracemi. Na druhou stranu, retinol neměl žádný významný účinek na genovou expresi 5αreduktázy.

Příklad 6. Inhibice IL-1 α genové exprese FWAHKK a Zn-FWAHKK

HaCaT keratinocyty (CLS sbírka, Německo) byly kultivovány, jak je popsáno v příkladu 3. Buňky nasazené ve vhodné hustotě na 6-jamkové destičky byly promyty v PBS a ozářeny 10 mJ/cm² UVB použitím 300 W xenonové obloukové lampy (Oriel Arc Lamp Housing, Newport, CA, USA) a 300±10 nm optickým filtrem (Newport, CA, USA). Potom byly ošetřeny FWAHKK (1μg/ml (0,0001%) a 10 μg/ml (0,001%)), Zn-FWAHKK (1,35 μg/ml (0,0001%) a 13,5 μg/ml (0,001%)) (oboje připraveno, jak je popsáno v Příkladu 1), ZnSO4*7 H2O (Zn; 0,35 μg/ml (0,000035%) a 3,5 μg/ml (0,00035%)) a 10 μM retinolu (v DMSO, finální koncentrace DMSO byla 0,1%) 24 h. Kontrolní buňky byly neošetřeny nebo ošetřeny 0,1% DMSO v případě retinolové kontroly.

IL1A genová exprese byla stanovena real-time qRT-PCR, jak je popsáno v příkladu 5, použitím specifické TaqMan genové expresní metody pro IL1A (qHsaCIP0030471, BioRad, CA, USA), a RPL13A (Hs04194366_g1, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) jako referenčního genu. Data byla analyzována použitím metody 2^-ΔΔCt. Data byla normalizována na UVB neošetřené kontroly nebo v případě retinolu na UVB DMSO kontroly. T-test byl použit pro statistické vyhodnocení výsledků.

- 11 CZ 309857 B6

IL-1 α je prozánětlivý interleukin stimulující hyperkeratinizaci folikulárních keratinocytů (Guy a Kealey 1998) v časných fázích patogeneze akné. V našich experimentech jsme indukovali IL-1α genovou expresi v HaCaT keratinocytech použitím UVB ozáření (obr. 5). Potom jsme pozorovali významnou inhibici UVB-indukované IL1A genové exprese po FWAHKKa Zn-FWAHKK ošetření, zatímco zinek a retinol neukázaly žádný účinek (obr. 5).

Příklad 7. Inhibice diferenciace keratinocytů FWAHKK a Zn-FWAHKK

HaCaT keratinocyty (CLS sbírka, Německo) byly kultivovány, jak je popsáno v příkladu 3. Buňky nasazené ve vhodné hustotě na 6-jamkové destičky byly ošetřeny FWAHKK (1 μg/ml (0,0001 %) a 10 μg/ml (0,001 %)), Zn-FWAHKK (1.35 μg/ml (0,000135 %) a 13,5 μg/ml (0,00135 %)) (oboje připraveno, jak je popsáno v příkladu 1), ZnSO4*7H2O (Zn; 0.35 μg/ml (0,000035 %) a 3.5 μg/ml (0,00035 %)) a 10 μΜ retinolu (v DMSO, finální koncentrace DMSO byla 0,1 %) pro 72 h.

Exprese vybraných genů zahrnutých v diferenciaci keratinocytů byla stanovena real-time qRTPCR, jak je popsáno v příkladu 5, použitím specifické TaqMan genové expresní metody pro FLG (Hs00856927_g1), OCLN (Hs00170162_m1), LCE2C (Hs02390636_s1), SPRR2E (qHsaCEP0055677, BioRad, CA, USA), KRT10 (Hs01043114_g1) a RPL13A (Hs04194366_g1) jako referenčního genu (všechny mimo SPRR2E Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Data byla analyzována použitím metody 2^-AACt. Data byla normalizována na neošetřené kontroly nebo v případě retinolu na DMSO kontroly. T-test byl použit pro statistické vyhodnocení výsledků.

Ukázalo se, že hexapeptid FWAHKK a také Zn-FWAHKK downregulují geny spojené s diferenciací keratinocytů stejným způsobem jako 10 μΜ retinol, zatímco zinek při odpovídajících koncentracích neměl žádný takový účinek (obr. 6).

Příklad 8. Protizánětlivý účinek FWAHKK a Zn-FWAHKK

HaCaT keratinocyty (CLS sbírka, Německo) byly kultivovány, jak je popsáno v příkladu 3. Buňky nasazené ve vhodné hustotě do 6-jamkových destiček byly promyty v PBS a ozářeny 10 mJ/cm² UVB použitím 300 W xenonové obloukové lampy (Oriel Arc Lamp Housing, Newport, CA, USA) a 300 ±10 nm optickým filtrem (Newport, CA, USA). Potom byly ošetřeny FWAHKK (1 μg/ml (0,0001 %) a 10 μg/ml (0,001 %)), Zn-FWAHKK (1,35 μg/ml (0,000135 %) a 13.5 μg/ml (0,00135 %)) (oboje připraveno, jak je popsáno v příkladu 1), ZnSO4*7H2O (Zn, 0,35 μg/ml (0,000035 %) a 3.5 μg/ml (0,00035 %)), a 10 μΜ retinolu (v DMSO, finální koncentrace DMSO byla 0,1 %) 24 h. Kontrolní buňky byly neošetřeny nebo ošetřeny 0,1% DMSO v případě retinolové kontroly.

IL1A genová exprese byla stanovena real-time qRT-PCR, jak je popsáno v příkladu 5, použitím specifické TaqMan genové expresní metody pro IL6 (Hs00174131_m1), IL8 (Hs00174103_m1), a RPL13A (Hs04194366_g1) jako referenčního genu (vše Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Data byla analyzována použitím metody 2^-AACt. Data byla normalizována na UV B neošetřené kontroly nebo v případě retinolu na UVB DMSO kontroly. T-test byl použit pro statistické vyhodnocení výsledků.

Zánět je klíčovou událostí v patogenezi akné. Indukovali jsme zánětlivé procesy jako zvýšená exprese prozánětlivých interleukinů IL-6 a IL-8 v HaCaT keratinocytech použitím UVB záření (obr. 7.) Pozorovali jsme významnou inhibici UVB-indukované IL6 a IL8 genové exprese po FWAHKK a Zn-FWAHKK ošetření podobně jako u 10 μM retinolu, zatímco zinek v odpovídajících koncentracích neukázal žádný účinek (obr. 7).

Příklad 9. Antimikrobiální aktivita FWAHKK a Zn-FWAHKK proti C. acnes

- 12 CZ 309857 B6

Cutibacterium acnes (kmen DSM 1897, DSZM sbírka, Německo) byl udržován v suspenzi v tryptickém sójovém vývaru (TSB) při 37 °C. Bakterie byly potom inokulovány ve vhodné hustotě do TSB obsahujícího FWAHKK (10 až 80 μg/ml (0,001 až 0,008 %)), Zn-FWAHKK (13,5 až 108,2 μg/ml (0,00135 až 0,01082 %)) (oboje připraveno, jak je popsáno v příkladu 1) a ZnSO4*7H2O (Zn; 3,5 až 28,2 μg/ml (0,00035 až 0,00282 %)) v 96-jamkových destičkách. Bakterie byly kultivovány 72 h při 37 °C a potom byla změřena optická hustota při 590 nm (OD590) spektrofotometrem (EnVision® 2105 Multimodální destičkový reader, PerkinElmer, USA). T-test byl použit pro statistické vyhodnocení výsledků.

Oboje - zinek a hexapeptid FWAHKK - měly slabou antimikrobiální aktivitu proti C. acnes (Obr. 8). Komplex Zn-FWAHKK byl účinnější než jednotlivé sloučeniny v odpovídajících koncentracích (obr. 8).

Příklad 10. Stimulace produkce kolagenu FWAHKK a Zn-FWAHKK

NIH-3T3 myší embryonální fibroblasty (ATCC sbírka, USA) byly kultivovány stejným způsobem jako HaCaT keratinocyty, jak je popsáno v příkladu 3. Buňky nasazené ve vhodné hustotě do 6-jamkových destiček byly ošetřeny FWAHKK (1 μg/ml (0,0001 %) a 10 pg/ml (0,001 %)), Zn-FWAHKK (1,35 pg/ml (0,000135 %) a 13.5 pg/ml (0,00135 %)) (oboje připraveno, jak je popsáno v Příkladu 1), ZnSO4*7H2O (Zn, 0,35 pg/ml (0,000035 %) a 3,5 pg/ml (0,00035 %)), a 10 μΜ retinol (v DMSO, finální koncentrace DMSO byla 0,1 %) 72 h. Kontrolní buňky byly neošetřeny nebo ošetřeny 0,1% DMSO v případě retinolové kontroly.

COL1A1 genová exprese byla stanovena real-time qRT-PCR, jak je popsáno v příkladu 5, použitím specifické TaqMan genové expresní metody pro COL1A1 (Mm00801666_g1), a RPL13A (Mm05910660_g1) jako referenčního genu (oboje Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Data byla analyzována použitím metody 2^AACt. Data byla normalizována na neošetřené kontroly nebo v případě retinolu na DMSO kontroly. T-test byl použit pro statistické vyhodnocení výsledků.

Výsledky ukázaly významnou stimulaci exprese genu kolagenu 1 po ošetření FWAHKK a ZnFWAHKK, zatímco zinek v odpovídajících koncentracích a 10 μΜ retinol neukázaly žádný účinek (obr. 9).

Příklad 11 Zn-FWAHKK zlepšuje vzhled pokožky náchylné k akné a má také účinek proti stárnutí in vivo

Provedli jsme dvojitě slepou, placebo-kontrolovanou, in vivo studii s rozdělením tváře na 40 lidských dobrovolnících (Běloši, Fitzpatrikův typ kůže I-III, ženy/muži 36/4, 18 až 49 let, průměr 30,5 roku) s mastnou, problematickou pokožkou náchylnou k akné. Tato studie byla provedena v souladu s principy Helsinské deklarace Světové lékařské asociace. Tato studie byla schválena etickým výborem Contipro a.s. a informovaný souhlas byl získán od všech dobrovolníků. Pouze zdravé subjekty bez akutních kožních poruch na tváři byly zahrnuty do studie. Další výlučná kritéria byla těhotenství, kojení, invazivní kosmetické obličejové procedury (face lift, botox, atd.) a silné kouření (> 10 cigaret na den). Aplikace jakýchkoli obličejových produktů pro péči o pokožku a také umývání obličeje nebylo dovoleno během dne měření.

Všichni dobrovolníci dostali dvě emulze: 30 dobrovolníků (ženy/muži 27/3, 18 až 48 let, průměr 31,0 roku) obdrželi emulze s 0,00135% Zn-FWAHKK (13,5 μg/ml; připravenou, jak je popsáno v příkladu 1) a placebo, a 10 dobrovolníků (ženy/muži 9/1, 24 až 49 let, průměr 28,9 roku) obdrželo emulze s 0,2% retinolem a placebo. Kompozice emulzí je popsána v tabulce 1. Dvě emulze byly aplikovány na dvě jednotlivé poloviny obličeje jednou denně večer 6 týdnů. Měření parametrů pokožky bylo provedeno na počátku studie a potom po 2, 4 a 6 týdnech.

- 13 CZ 309857 B6

Měření byla provedena po 30 min aklimatizace dobrovolníků v místnosti s kontrolovanými podmínkami (T: 20 až 22 °C; RH 40 až 45 %). Počet lézí akné byl stanoven analýzou obrázku celoobličejových obrazů získaných VisiaCR, fotoaparátem s vysokým rozlišením (Canfield Scientific, USA). Kvantifikace byla provedena použitím Image-Pro 10 analysis softwaru (Media Cybernetics, USA). Hloubka vrásek vraních nožek byla stanovena pomocí fotoaparátu Primos Lite 3D (Canfield Scientific, USA).

Výsledky ukázaly zlepšení vzhledu pokožky náchylné k akné reprezentované snížením počtu lézí akné (obr. 10A). Také se ukázalo, že Zn-FWAHKK má aktivitu proti stárnutí snížením vrásek (obr. 10B). V obou případech byl Zn-FWAHKK účinnější než 0,2% retinol.

Tabulka 1 Kompozice emulzí použitých v in vivo studii

INCI (název)	% hmotn./hmotn.
Placebo	Zn-FWAHKK	Retinol
Aqua	96,52	96,51865	96,32
Capric/Caprylic Triglyceride	1,00	1,00	1,00
Phenoxyethanol	1,00	1,00	1,00
Hydroxyethylcellulose	0,70	0,70	0,70
Tocopheryl Acetate (vitamín E)	0,50	0,50	0,50
Carbomer	0,25	0,25	0,25
Sodium Hydroxide	0,03	0,03	0,03
Retinol	-	-	0,20
Zn-FWAHKK		0,00135

Příklad 12. Kompozice emulzí s FWAHKK, Zn-FWAHKK, acetyl-FWAHKK nebo palmitoylFWAHKK

Příklad krémů (olej ve vodě emulze) obsahujících hexapeptidy stávajícího vynálezu FWAHKK, Zn-FWAHKK, acetyl-FWAHKK nebo palmitoyl-FWAHKK připravené, jak je popsáno v příkladu 1.

Tabulka 2.

Složka	INCI	Krém s: (% hmotn./hmotn.)
FWAHKK	ZnFWAHKK	AcetylFWAHKK	PalmitoylFWAHKK
Olejová fáze
Emulguj ící směs	Glyceryl Stearate, PEG-100 Stearate	5,00	5,00	5,00	5,00
Makadamový olej	Macadamia Integrifolia Seed Oil	5,00	5,00	5,00	5,00
Olivový olej	Olea Europaea Fruit Oil	4,00	4,00	4,00	3,00
Jojobový olej	Simmondsia Chinensis Seed Oil	3,00	3,00	3,00	3,00
Vitamín E
Vitamín E	Tocopheryl Acetate	1,00	1,00	1,00	1,00
Vodná fáze
Voda	Aqua	65,50	65,50	65,50	70,70
Glycerin	Glycerin	4,00	4,00	4,00	4,00
Gel maker EMU	Sodium Acrylate / Sodium	2,00	2,00	2,00	2,00

- 14 CZ 309857 B6

	Acryloyldimethyl Taurate Copolymer, Isohexadecane, Polysorbate 80
Močovina	Urea	3,00	3,00	3,00	3,00
Vitamín B3	Niacinamide	1,50	1,50	1,50	1,50
Fáze ve vodě rozpustných aktivních složek
Voda	Aqua	5,1999	5,199865	5,1999	-
FWAHKK	-	0,0001	-	-	-
ZnFWAHKK	-	-	0,000135	-	-
AcetylFWAHKK	-	-	-	0,0001	-
Fáze v oleji rozpustných aktivních složek
Olivový olej	Olea Europaea Fruit Oil	-	-	-	0,9999
PalmitoylFWAHKK	-	-	-	-	0,0001
Konzervant
Benzyl alkohol-DHA	Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid	0,80	0,80	0,80	0,80

Tabulka 3

Složka	INCI	Krém s: (% hmotn./hmotn.)
		FWAHKK	ZnFWAHKK	AcetylFWAHKK	PalmitoylFWAHKK
Olejová fáze
Lamecreme	Glyceryl Stearate, Glyceryl Stearate Citrate	6,00	6,00	6,00	6,00
Makadamový olej	Macadamia Integrifolia Seed Oil	6,00	6,00	6,00	6,00
Olivový olej	Olea Europaea Fruit Oil	16,00	16,00	16,00	15,00
Jojobový olej	Simmondsia Chinensis Seed Oil	8,00	8,00	8,00	8,00
Cetyl alkohol	Cetyl Alcohol	2,00	2,00	2,00	2,00
Vodná fáze
Voda	Aqua	47,30	47,30	47,30	47,30
Glycerin	Glycerin	4,00	4,00	4,00	4,00
Močovina	Urea	3,00	3,00	3,00	3,00
Vitamín B3	Niacinamide	1,50	1,50	1,50	1,50
Fáze ve vodě rozpustných aktivních složek
Voda	Aqua	5,189	5,18865	5,189	5,19
HyRetin	Sodium Retinoyl Hyaluronate	0,01	0,01	0,01	0,01
FWAHKK	-	0,001	-	-	-
ZnFWAHKK	-	-	0,00135	-	-

- 15 CZ 309857 B6

AcetylFWAHKK	-	-	-	0,001	-
Fáze v oleji rozpustných aktivních složek
Olivový olej	Olea Europaea Fruit Oil	-	-	-	0,999
PalmitoylFWAHKK	-	-	-	-	0,001
Konzervant
Fenoxy ethan ol	Phenoxyethanol	1,00	1,00	1,00	1,00

Tabulka 4

Složka	INCI	Krém s: (% hmotn./hmotn.
FWAHKK	ZnFWAHKK	AcetylFWAHKK	PalmitoylFWAHKK
Olejová fáze
Cetearyl alkohol	Cetearyl Alcohol	6,00	6,00	6,00	6,00
Makadamový olej	Macadamia Integrifolia Seed Oil	6,00	6,00	6,00	6.00
Olivový olej	Olea Europaea Fruit Oil	11,00	11,00	11,00	10,00
Jojobový olej	Simmondsia Chinensis Seed Oil	8,00	8,00	8,00	8,00
Glyceryl stearát SE	Glyceryl Stearate SE	2,00	2,00	2,00	2,00
Vodná fáze
Voda	Aqua	52,30	52,30	52,30	57,50
Glycerin	Glycerin	4,00	4,00	4,00	4,00
Močovina	Urea	3,00	3,00	3,00	3,00
Vitamín B3	Niacinamide	1,50	1,50	1,50	1,50
Fáze ve vodě rozpustných aktivních složek
Voda	Aqua	5,19	5,1865	5,19	-
FWAHKK	-	0,01	-	-	-
Zn-FWAHKK	-	-	0,0135	-	-
AcetylFWAHKK	-	-	-	0,01	-
Fáze v oleji rozpustných aktivních složek
Olivový olej	Olea Europaea Fruit Oil	-	-	-	0.99
PalmitoylFWAHKK	-	-	-	-	0,01
Konzervant
Fenoxyethanol	Phenoxyethanol	1,00	1,00	1,00	1,00

- 16CZ 309857 B6

Tabulka 5

Složka	INCI	Krém s: (% hmotn./hmotn.
FWAHKK	ZnFWAHKK	AcetylFWAHKK	PalmitoylFWAHKK
Olejová fáze
Mandlový olej	Prunus Amygdalus Dulcis Oil	15,00	15,00	15,00	14,00
Bambucké máslo	Butyrospermum Parkii Butter	5,00	5,00	5,00	5,00
Cetyl alkohol	Cetyl Alcohol	2,00	2,00	2,00	2,00
Glyceryl Stearát Citrát	Glyceryl Stearate Citrate	5,00	5,00	5,00	5,00
Vodná fáze
Voda	Aqua	50,90	50,90	50,90	50,90
Fáze ve vodě rozpustných aktivních složek
Voda	Aqua	10,89	10,855	10,89	10,99
Glycerin	Glycerin	4,00	4,00	4,00	4,00
Panthenol	Panthenol	2,00	2,00	2,00	2,00
TanActine	Glucomannan	0,20	0,20	0,20	0,20
Schizophyllan	Schizophyllan	0,10	0,10	0,10	0,10
Močovina	Urea	4,00	4,00	4,00	4,00
HyRetin	Sodium Retinoyl Hyaluronate	0,01	0,01	0,01	0,01
FWAHKK	-	0,10	-	-	-
Zn-FWAHKK	-	-	0,135	-	-
AcetylFWAHKK	-	-	-	0,10	-
Fáze v oleji rozpustných aktivních složek
Mandlový olej	Prunus Amygdalus Dulcis Oil	-	-	-	0,90
PalmitoylFWAHKK	-	-	-	-	0,10
Konzervant
Benzyl alkohol-DHA	Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid	0,80	0,80	0,80	0,80

Olejová a vodná fáze byly připraveny a zahřátý na 70 °C. Dále byly obě fáze smíchány a emulgovány za míchání (290 rpm/min). Potom byla emulze ochlazena na 40 °C a byla přidána fáze ve vodě rozpustných aktivních složek a/nebo vitamín E a konzervant. Konečně bylo změřeno pH a upraveno na hodnoty mezi 2,2 a 6,5 1 až. 50% kyselinou citrónovou nebo 1 až 50% KOH nebo NaOH.

o

Příklad 13. Kompozice sér s FWAHKK, Zn-FWAHKK a acetyl-FWAHKK

Příklad sér obsahujících hexapeptidy stávajícího vynálezu FWAHKK a Zn-FWAHKK připravené, jak je popsáno v příkladu 1.

- 17CZ 309857 B6

Tabulka 6

Složka	INCI	Sérum s: (% hmotn./hmotn.)
FWAHKK	ZnFWAHKK	AcetylFWAHKK
Voda	Aqua	97,7999	97,799865	97,7999
Carbopol Ultrez 10	Carbomer	0,60	0,60	0,60
30 % Hydroxid sodný	Aqua, Sodium Hydroxide	0,50	0,50	0,50
Hyaluronát sodný	Sodium Hyaluronate	0,10	0,10	0,10
FWAHKK	-	0,0001	-	-
Zn-FWAHKK	-	-	0,000135	-
Acetyl-FWAHKK	-	-	-	0,0001
Feno xy ethanol	Phenoxyethanol	1,00	1,00	1,00

Tabulka 7

Složka	INCI	Sérum s: (% hmotn./hmotn.)
FWAHKK	ZnFWAHKK	AcetylFWAHKK
Voda	Aqua	94,799	94,79865	94,799
Hyaluronát sodný	Sodium Hyaluronate	1,50	1,50	1,50
Vitamín B3	Niacinamide	1,50	1,50	1,50
TanActine	Glucomannan	0,20	0,20	0,20
FWAHKK	-	0,001	-	-
Zn-FWAHKK	-	-	0,00135	-
Acetyl-FWAHKK	-	-	-	0,001
Fenoxy ethanol	Phenoxyethanol	1,00	1,00	1,00

Tabulka 8

Složka	INCI	Sérum s: (% hmotn./hmotn.)
FWAHKK	ZnFWAHKK	AcetylFWAHKK
Voda	Aqua	95,69	90,6865	95,69
Ekogel	Lysolecithin, Sclerotium Gum, Xanthan Gum, Pullulan	1,50	1,50	1,50
Hyaluronát sodný	Sodium Hyaluronate	0,10	0,10	0,10
Vitamín B3	Niacinamide	1,50	1,50	1,50
Vitamín C	Sodium Ascorbyl Phosphate	5,00	5,00	5,00
TanActine	Glucomannan	0,20	0,20	0,20
FWAHKK	-	0,01	-	-
Zn-FWAHKK	-	-	0,0135	-
Acetyl-FWAHKK	-	-	-	0,01
Fenoxy ethanol	Phenoxyethanol	1,00	1,00	1,00

- 18 CZ 309857 B6

Tabulka 9

Složka	INCI	Sérum s: (% hmotn./	imotn.)
FWAHKK	ZnFWAHKK	AcetylFWAHKK
Voda	Aqua	92,20	92,165	92,20
Kroslinkovaný^HA	Sodium Hyaluronate and Sodium Hyaluronate Crosspolymer-3	1,50	1,50	1,50
Hyaluronát sodný	Sodium Hyaluronate	0,90	0,90	0,90
Vitamín B3	Niacinamide	1,50	1,50	1,50
Panthenol	Panthenol	1,00	1,00	1,00
Vitamín C	Sodium Ascorbyl Phosphate	1,80	1,80	1,80
TanActine	Glucomannan	0,20	0.20	0,20
FWAHKK	-	0,1	-	-
Zn-FWAHKK	-	-	0,135	-
Acetyl-FWAHKK	-	-	-	0,1
Benzyl alkoholDHA	Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid	0,80	0,80	0,80

Nejdříve byly přidány hexapeptid FWAHKK nebo Zn-FWAHKK nebo acetyl-FWAHKK a aktivní složky kromě hyaluronátu sodného a kroslinkovaného^HA do vody a míchány, dokud se zcela nerozpustily. Dále byla přidána zahušťovadla a/nebo hyaluronát sodný a kroslinkovaný^HA a směs míchána, dokud se složky zcela nerozpustily. Potom byl přidán konzervant. Konečně bylo změřeno pH a upraveno na hodnoty mezi 5,2 a 6,5 1 až 50% kyselinou citrónovou nebo 1 až 50% KOH nebo NaOH.

Přehled literatury

Abendrot, M., and U. Kalinowska-Lis. 2018. “Zinc-Containing Compounds for Personal Care Applications.” International Journal cf Cosmetic Science 40 (4): 319-27. https://doi.Org/10.l 111/ics.12463.

Amblard, Muriel, Jean-Alain Fehrentz, Jean Martinez, and Gilles Subra. 2006. “Methods and Protocols of Modern Solid Phase Peptide Synthesis.” Molecular Biotechnology 33 (3): 23954. https://doi.Org/10.1385/MB:33:3:239.

Anderson, K. M., and S. Liao. 1968. “Selective Retention of Dihydrotestosterone by Prostatic Nuclei.” Nature 219 (5151): 277-79. https://doi.org/10.1038/219277a0.

Arif, Tasleem. 2015. “Salicylic Acid as a Peeling Agent: A Comprehensive Review.” Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology 8 (August): 455-61.

https://doi.org/10.2147/CCID.S84765.

Bowe, Whitney P., Jennifer C. Filip, Joseph M. DiRienzo, Alla Volgina, and David J. Margolis. 2006. “Inhibition of Propionibacterium Acnes by Bacteriocin-like Inhibitory Substances (BLIS) Produced by Streptococcus Salivarius.” Journal cf Drugs in Dermatology: JDD 5 (9): 868-70.

Catapano, Maria Carmen, Václav Tvrdý, Jana Karlíčková, Laura Mercolini, and Přemysl Mladěnka. 2018. “A Simple, Cheap but Reliable Method for Evaluation of Zinc Chelating Properties.” Bioorganic Chemistry ΊΊ (April): 287-92.

https://doi.Org/10.1016J.bioorg.2018.01.015.

Cebrián, Rubén, Sergio Arévalo, Susana Rubino, Salvador Arias-Santiago, Maria Dolores Rojo, Manuel Montalbán-López, Manuel Martinez-Bueno, Eva Valdivia, and Mercedes Maqueda. 2018. “Control of Propionibacterium Acnes by Natural Antimicrobial Substances: Role of

- 19CZ 309857 B6 the Bacteriocin AS-48 and Lysozyme.” Scientific Reports 8 (1): 11766.

https://doi.org/10.1038/s41598-018-29580-7.

Cervantes, Jessica, Ariel E. Eber, Marina Perper, Vanessa M. Nascimento, Keyvan Nouri, and Jonette E. Keri. 2018. “The Role of Zinc in the Treatment of Acne: A Review of the Literature.” Dermatologic Therapy 31 (1). https://doi.org/10.1111/dth.12576.

Cunha, Marisa Gonzaga da, Fernando Luiz Affonso Fonseca, and Carlos D. Aparecida S. Machado. 2013. “Androgenic Hormone Profile of Adult Women with Acne.” Dermatology (Basel, Switzerland) 226 (2): 167-71. https://doi.org/10.1159/000347196.

Downing, D. T., M. E. Stewart, P. W. Wertz, and J. S. Strauss. 1986. “Essential Fatty Acids and Acne.” Journal of the American Academy of Dermatology 14 (2 Pt 1): 221-25. https://doi.org/10.1016/s0190-9622(86)70025-x.

Dréno, B., S. Pécastaings, S. Corvec, S. Veraldi, A. Khammari, and C. Roques. 2018. “Cutibacterium Acnes (Propionibacterium Acnes) and Acne Vulgaris: A Brief Look at the Latest Updates.” Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 32 (S2): 5-14. https://doi.org/10.1111/jdv.15043.

Fritsch, M., C. E. Orfanos, and C. C. Zouboulis. 2001. “Sebocytes Are the Key Regulators of Androgen Homeostasis in Human Skin.” The Journal of Investigative Dermatology 116 (5): 793-800. https://doi.org/10.1046ij.1523-1747.2001.01312.x.

Guy, R., and T. Kealey. 1998. “The Effects of Inflammatory Cytokines on the Isolated Human Sebaceous Infundibulum.” The Journal of Investigative Dermatology 110 (4): 410-15. https://doi.org/10.1046/j.1523-1747.1998.00143.x.

Han, Rui, Hans-Matti Blencke, Hao Cheng, and Chun Li. 2018. “The Antimicrobial Effect of CEN1HC-Br against Propionibacterium Acnes and Its Therapeutic and Anti-Inflammatory Effects on Acne Vulgaris.” Peptides 99 (January): 36-43.

https://doi.org/ 10.1016/j .peptides.2017.11.001.

Kang, Bong Seon, Jae-Gu Seo, Gwa-Su Lee, Jung-Hwa Kim, Sei Yeon Kim, Ye Won Han, Hoon Kang, et al. 2009. “Antimicrobial Activity of Enterocins from Enterococcus Faecalis SL-5 against Propionibacterium Acnes, the Causative Agent in Acne Vulgaris, and Its Therapeutic Effect.” Journal of Microbiology (Seoul, Korea) 47 (1): 101-9.

https://doi.org/10.1007/s12275-008-0179-y.

Kumtornrut, Chanat, Takeshi Yamauchi, Saaya Koike, Setsuya Aiba, and Kenshi Yamasaki. 2019. “Androgens Modulate Keratinocyte Differentiation Indirectly through Enhancing Growth Factor Production from Dermal Fibroblasts.” Journal of Dermatological Science 93 (3): 150-58. https://doi.org/10.1016/jjdermsci.2019.01.007.

Lim, Hee-Sun, Seung-Min Chun, Min-Gyu Soung, Jenny Kim, and Seong-Jin Kim. 2015. “Antimicrobial Efficacy of Granulysin-Derived Synthetic Peptides in Acne Vulgaris.” International Journal of Dermatology 54 (7): 853-62. https://doi.org/10.1111/ijd.12756.

Liu, Haibo, Haiyan Yu, Jun Xia, Ling Liu, Guan J. Liu, Hong Sang, and Frank Peinemann. 2020. “Topical Azelaic Acid, Salicylic Acid, Nicotinamide, Sulphur, Zinc and Fruit Acid (AlphaHydroxy Acid) for Acne.” The Cochrane Database of Systematic Reviews 5 (May):

Ma, Ziyuan, Nikolay Kochergin, Olga Olisova, and Elena Snarskaya. 2021. “Topical Antimicrobial Peptides in Combined Treatment of Acne Patients.” Journal of Cosmetic Dermatology, June. https://doi.org/10.1111/jocd.14300.

McInturff, Jamie E., Robert L. Modlin, and Jenny Kim. 2005. “The Role of Toll-like Receptors in the Pathogenesis and Treatment of Dermatological Disease.” Journal of Investigative Dermatology 125 (1): 1-8. https://doi.org/10.1111/j.0022-202X.2004.23459.x.

McLaughlin, Joseph, Steven Watterson, Alison M. Layton, Anthony J. Bjourson, Emma Barnard, and Andrew McDowell. 2019. “Propionibacterium Acnes and Acne Vulgaris: New Insights from the Integration of Population Genetic, Multi-Omic, Biochemical and Host-Microbe Studies.” Microorganisms 7 (5). https://doi.org/10.3390/microorganisms7050128.

Melo, Manuel N., Dominique Dugourd, and Miguel A. R. B. Castanho. 2006. “Omiganan Pentahydrochloride in the Front Line of Clinical Applications of Antimicrobial Peptides.” Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery 1 (2): 201-7.

https://doi.org/10.2174/157489106777452638.

- 20 CZ 309857 B6

Miazga-Karska, Malgorzata, Katarzyna Michalak, and Grazyna Ginalska. 2020. “Anti-Acne Action of Peptides Isolated from Burdock Root-Preliminary Studies and Pilot Testing.” Molecules (Basel, Switzerland) 25 (9). https://doi.org/10.3390/molecules25092027.

Mills, Otto H., Maressa C. Criscito, Todd E. Schlesinger, Robert Verdicchio, and Ernest Szoke. 2016. “Addressing Free Radical Oxidation in Acne Vulgaris.” The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology 9 (1): 25-30.

Moradi Tuchayi, Sara, Evgenia Makrantonaki, Ruta Ganceviciene, Clio Dessinioti, Steven R. Feldman, and Christos C. Zouboulis. 2015. “Acne Vulgaris.” Nature Reviews. Disease Primers 1 (September): 15029. https://doi.org/10.1038/nrdp.2015.29.

Nair, Sithara S., Olga Y. Zolotarskaya, Matthew J. Beckwith, Dennis E. Ohman, and Kenneth J. Wynne. 2017. “A Polycation Antimicrobial Peptide Mimic without Resistance Buildup against Propionibacterium Acnes.” Macromolecular Bioscience 17 (9).

https://doi.org/10.1002/mabi.201700090.

Pan, Chieh-Yu, Jyh-Yih Chen, Tai-Lang Lin, and Cheng-Hui Lin. 2009. “In Vitro Activities of Three Synthetic Peptides Derived from Epinecidin-1 and an Anti-Lipopolysaccharide Factor against Propionibacterium Acnes, Candida Albicans, and Trichomonas Vaginalis.” Peptides 30 (6): 1058-68. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2009.02.006.

Panchaud, Alice, Chantal Csajka, Paul Merlob, Christof Schaefer, Maya Berlin, Marco De Santis, Thierry Vial, et al. 2012. “Pregnancy Outcome Following Exposure to Topical Retinoids: A Multicenter Prospective Study.” The Journal of Clinical Pharmacology 52 (12): 1844-51. https://doi.org/10.1177/0091270011429566.

Popovic, Suzana, Edit Urbán, Miodrag Lukic, and J. Michael Conlon. 2012. “Peptides with Antimicrobial and Anti-Inflammatory Activities That Have Therapeutic Potential for Treatment of Acne Vulgaris.” Peptides 34 (2): 275-82.

https://doi.org/ 10.1016/j .peptides.2012.02.010.

Riss, Terry L., Richard A. Moravec, Andrew L. Niles, Sarah Duellman, Hélene A. Benink, Tracy J. Worzella, and Lisa Minor. 2016. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual [Internet]. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/.

Rubinchik, Evelina, Dominique Dugourd, Teresa Algara, Christopher Pasetka, and H. David Friedland. 2009. “Antimicrobial and Antifungal Activities of a Novel Cationic Antimicrobial Peptide, Omiganan, in Experimental Skin Colonisation Models.” International Journal of Antimicrobial Agents 34 (5): 457-61.

https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2009.05.003.

Ryu, S., Y. Park, B. Kim, S.-M. Cho, J. Lee, H.-H. Lee, C. Gurley, et al. 2014. “Inhibitory and Anti-Inflammatory Effects of the Helicobacter Pylori-Derived Antimicrobial Peptide HPA3NT3 against Propionibacterium Acnes in the Skin.” The British Journal of Dermatology 171 (6): 1358-67. https://doi.org/10.1111/bjd.13480.

Ryu, Sunhyo, Hyo Mi Han, Peter I. Song, Cheryl A. Armstrong, and Yoonkyung Park. 2015. “Suppression of Propionibacterium Acnes Infection and the Associated Inflammatory Response by the Antimicrobial Peptide P5 in Mice.” PloS One 10 (7): e0132619.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0132619.

Tanghetti, Emil A. 2013. “The Role of Inflammation in the Pathology of Acne.” The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology 6 (9): 27-35.

Thiboutot, D. M. 2000. “The Role of Follicular Hyperkeratinization in Acne.” Journal of Dermatological Treatment 11 (SUPPL. 2): 5-8.

https://doi.org/10.1080/095466300750163645.

Thielitz, Anja, and Harald Gollnick. 2008. “Topical Retinoids in Acne Vulgaris: Update on Efficacy and Safety.” American Journal of Clinical Dermatology 9 (6): 369-81.

https://doi.org/10.2165/0128071 -200809060-00003.

Walsh, Timothy R., John Efthimiou, and Brigitte Dréno. 2016. “Systematic Review of Antibiotic Resistance in Acne: An Increasing Topical and Oral Threat.” The Lancet Infectious Diseases 16 (3): e23-33. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(15)00527-7.

Wang, Yipeng, Zhiye Zhang, Lingling Chen, Huijuan Guang, Zheng Li, Hailong Yang, Jianxu Li, Dewen You, Haining Yu, and Ren Lai. 2011. “Cathelicidin-BF, a Snake Cathelicidin

- 21 CZ 309857 B6

Derived Antimicrobial Peptide, Could Be an Excellent Therapeutic Agent for Acne Vulgaris.” PloS One 6 (7): e22120. https://doi.org/10.1371/joumal.pone.0022120.

Woodburn, Kathryn W, Jesse Jaynes, and L. Edward Clemens. 2020. “Designed Antimicrobial Peptides for Topical Treatment of Antibiotic Resistant Acne Vulgaris.” Antibiotics 9 (1): 23. https://doi.org/10.3390/antibiotics9010023.

Wu, Yun, Yuanyuan Qiang, Kun Cao, Wei Zhang, and Guangxian Zhang. 2020. “Inhibitory Effect of the Antimicrobial Peptide BLP-7 against Propionibacterium Acnes and Its AntiInflammatory Effect on Acne Vulgaris.” Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology 184 (September): 109-15.

https://doi.org/ 10.1016/j .toxicon.2020.06.006.

Wu, Yun, Guangxian Zhang, and Maojun Zhou. 2020. “Inhibitory and Anti-Inflammatory Effects of Two Antimicrobial Peptides Moronecidin and Temporin-1Dra against Propionibacterium Acnes in Vitro and in Vivo.” Journal of Peptide Science: An Official Publication of the European Peptide Society 26 (7): e3255. https://doi.org/10.1002/psc.3255.

Yee, Brittany E., Phillip Richards, Jennifer Y. Sui, and Amanda Fleming Marsch. 2020. “Serum Zinc Levels and Efficacy of Zinc Treatment in Acne Vulgaris: A Systematic Review and Meta-Analysis.” Dermatologic Therapy 33 (6): e14252. https://doi.org/10.1111/dth.14252.

Yentzer, Brad A., Jeff Hick, Erin L. Reese, Adam Uhas, Steven R. Feldman, and Rajesh Balkrishnan. 2010. “Acne Vulgaris in the United States: A Descriptive Epidemiology.” Cutis 86 (2): 94-99.

Zhang, Zhiye, Lixian Mu, Jing Tang, Zilei Duan, Fengyu Wang, Lin Wei, Mingqiang Rong, and Ren Lai. 2013. “A Small Peptide with Therapeutic Potential for Inflammatory Acne Vulgaris.” PloS One 8 (8): e72923. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072923.

Claims

1. Hexapeptid obecného vzorce I

X-Phe-Trp-Ala-His-Lys-Lys-Z (I), kde:

X je -NHX¹ skupina fenylalaninu na N-terminálním konci hexapeptidu, kde X¹ je vybráno ze skupiny zahrnující H, acetyl, oktanoyl, dekanoyl, lauroyl, myristoyl, palmitoyl, stearoyl, elaidoyl, oleoyl, biotinoyl nebo lipoyl;

Z je -COZ¹ skupina lyzinu na C -terminálním konci hexapeptidu, kde Z¹ je vybráno ze skupiny zahrnující OH, OCH3, OCH2CH3 nebo NH2.

2. Kosmetická topická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje alespoň jeden hexapeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.

3. Farmaceutická topická a/nebo kosmetická topická kompozice podle nároku 9, vyznačující se tím, že pomocná aktivní složka je vybraná ze skupiny zahrnující vitamíny A, D, E, K, C, B-skupinu vitamínů, koenzym Q10, alantoin, bisabolol, bakuchiol, resveratrol, kyselinu mléčnou, aminokyseliny, benzoyl peroxid, síru, azelaovou kyselinu, peptidy s výhodou acetyl hexapeptid-8, palmitoyl tripeptid-1, palmitoyl tetrapeptid-7, měďnatý tripeptid-1, hexapeptid-1, palmitoyl pentapeptid-4, peptidy saccharomyces, a proteiny, s výhodou rýžový, sójový, quinoa nebo pšeničný protein; polysacharidy s výhodou kyselinu hyaluronovou nebo její farmaceuticky a kosmeticky přijatelnou sůl nebo derivát s výhodou oleoyl hyaluronát sodný, retinoyl hyaluronát sodný, hyaluronát krospolymer-3 sodný; karboxymethyl glukan, schizofylan, glukomanan; pantenol; močovinu; glycerin; rostlinné extrakty, s výhodou extrakt z aloe vera, heřmánkový extrakty, acai extrakt, extrakt ze zeleného čaje, extrakt z řas, ovesný extrakt, konopný extrakt, brusinkový extrakt; bakterie s výhodou Lactobacillus spp., Thalassospira spp., Bifidobacterium spp., Halobacterium spp. nebo houbové extrakty ze Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces meandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus spp., Trametes versicolor, Tremella fucformis, Tuber spp., Schizophyllum commune.

4. Farmaceutická topická a/nebo kosmetická topická kompozice podle nároku 14, vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jednu kosmetickou nebo dermo-farmaceutickou pomocnou složku vybranou ze skupiny zahrnující zahušťovadlo, pomocnou aktivní složku a konzervant, jak je definováno v nároku 13.