CZ301926B6 - Oslabené mikroorganismy pro lécbu infekcí - Google Patents
Oslabené mikroorganismy pro lécbu infekcí Download PDFInfo
- Publication number
- CZ301926B6 CZ301926B6 CZ20014030A CZ20014030A CZ301926B6 CZ 301926 B6 CZ301926 B6 CZ 301926B6 CZ 20014030 A CZ20014030 A CZ 20014030A CZ 20014030 A CZ20014030 A CZ 20014030A CZ 301926 B6 CZ301926 B6 CZ 301926B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- aroc
- microorganism
- gene
- ssav
- salmonella
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 7
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 53
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims abstract description 31
- 101150032013 ssaV gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 claims description 7
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 claims description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract 1
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 description 45
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 32
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 241001467018 Typhis Species 0.000 description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 14
- 101100533947 Mus musculus Serpina3k gene Proteins 0.000 description 12
- 101100257418 Mus musculus Serpina3n gene Proteins 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 4
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 4
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 3
- 101000823106 Equus caballus Alpha-1-antiproteinase 2 Proteins 0.000 description 3
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010024652 Liver abscess Diseases 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 208000026426 spleen abscess Diseases 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 2
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 102100024390 Insulin gene enhancer protein ISL-2 Human genes 0.000 description 2
- 101710156777 Insulin gene enhancer protein ISL-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100038021 Steryl-sulfatase Human genes 0.000 description 2
- 108010069584 Type III Secretion Systems Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 101150116294 ssaJ gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007103 stamina Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 244000135860 Capparis spinosa subsp spinosa Species 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 102100026894 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108091006619 SLC11A1 Proteins 0.000 description 1
- 241000405383 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 Species 0.000 description 1
- 101100532785 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) sctN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 229960001443 live attenuated oral typhoid Drugs 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100001079 no serious adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000006365 organism survival Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150084005 purD gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150064735 rpmH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000279 safety data Toxicity 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229960001266 typhoid vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229940104152 vivotif Drugs 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/255—Salmonella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/42—Salmonella
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Rešení se týká mikroorganismu Salmonela majícího oslabující mutaci, která narušuje expresi genu ssaV, a oslabující mutaci, která narušuje expresi genu aroC. Mikroorganismus má tedy dvojitou mutaci, která pomáhá predcházet reaktivite mikroorganismu pri zachování úcinnosti mikroorganismu vyvolat imunitní odpoved.
Description
Oblast techniky
Tento vynález se vztahuje k oslabeným mikroorganismům, které mohou být použity v očkovacích kompozicích k prevenci nebo léčení bakteriálních nebo virových infekcí.
jo Dosavadní stav techniky
Je dobře známo, že živé oslabené mikroorganismy jsou vysoce účinnými vakcínami: imunitní odpovědi produkované nereplikující imunogeny. Jedním vysvětlením pro toto může být to, že žité oslabené kmeny vyvolají v hostiteli omezené infekce a napodobí raná stádia přirozené infek15 ce. Navíc, na rozdíl od usmrcených preparátů, živé vakcíny jsou schopny indukovat silné odezvy zprostředkované buňkou, které mohou být spojeny s jejich schopností replikovat se v buňkách obsahujících antigen, jako například v makrofázích.
Dlouhá je historie používání živých oslabených Salmonelových vakcín jako bezpečných a účin20 ných vakcín k prevenci salmonelózy u zvířat a lidí. Skutečně, živá oslabená orální vakcína proti břišnímu tyfu, Ty21a (Vivotif), vyráběná institutem Swiss Sérum Vaccine Institute, se ukázala být velmi úspěšnou vakcínou v prevenci před tyfem a byla povolena v mnoha zemích včetně Spojených států a Evropy.
Nicméně oslabení tohoto kmene bylo dosaženo použitím chemických mutagenních postupů a princip oslabení kmene není plně objasněn. Právě proto není tato vakcína dokonalá ve smyslu počtu dávek (momentálně Čtyři) a počtu živých organismů, které musí být dané pro každou dávku.
Moderní molekulární biologické postupy, spojené se vzrůstající znalostí patogeneze Salmonely, vedly k objevu několika genů, které jsou nezbytné pro růst in vivo a přežití organismů. Toto poskytlo nové geny jako cíle pro oslabení, vedení k představě, že budoucí očkovací kmeny mohou být „rozumně“ oslabeny zavedením definovaných nevratných mutací do vybraných genů, u kterých je známo, že se podílí na virulenci. Toto usnadní vývoj lepších vakcín, zejména co se týče imunogennosti, a tudíž počtu dávek, které musí být podány.
Ačkoli je dnes mnoho oslabených kmenů Salmonela známo, jen několik jich bylo kvalifikováno jako potenciální kandidáti na vakcíny pro použití na lidech. To může být částečně způsobeno potřebou udržet rovnováhu mezi imunogennosti vakcíny a možností mikroorganismu Salmonela stát se reaktivním.
Je jasné, že výběr vhodných cílů pro oslabení, který povede ke vhodnému kandidátovi na vakcínu, je komplikovaný a nemůže být jednoduše předpovězen. Vhodnost oslabeného kmene jako vhodné vakcíny může ovlivnit mnoho faktorů a bylo provedeno mnoho výzkumů za účelem nale45 zení vhodných kmenů. Například mnoho oslabených kmenů testovaných jako kandidáti na vakcíny vedlo u pacientů k vakcinémii nebo abscesům.
Z toho důvodu je potřebné vyvinout vakcínu o vysokém stupni imunogennosti se sníženou možností, že se kmen mikroorganismu navrátí do reaktivní formy, a která vykazuje dobrý bezpeč50 nostní profil s omezenými vedlejšími účinky.
Shea J.E. et al,, „ínfluence of Salmonella typhimurium Pathogenicity Island 2 Type III Secretion System on Bacterial Growth in the Mouše“, Infect. Immun., vo. 67(1), 213-219, 1999, popisuje kombinaci mutantů ssaJ a purD, přičemž mimo jiné uvádí, že mutanty ssaJ způsobují jatemí abscesy, kdy se slezina zvětší na přibližně pětinásobek její obvyklé hmotnosti.
- 1 CZ 301926 B6
Podstata vynálezu
Vynález je založen na zjištění, že dvě specifické oslabující mutace zavedené do mikroorganismu Salmonely mohou vytvořit vakcínu, která má vysoký stupeň imunogenosti a nízké riziko přeměny mikroorganismu v reaktivní formu. Výsledné očkovací kmeny vykazují dobrý profil vedlejších účinků.
První mutace je obsažena v oblasti patogenního ostrůvku 2 (Spi2) Salmonely; druhá je autoxotrofní mutace, tj. mutace která naruší expresi genu, který kóduje protein potřebný v biosyntetických cestách.
V souladu s prvním aspektem vynálezu má mikroorganismus Salmonela oslabující mutaci, která narušuje expresi genu ssaV umístěného v patogenním ostrůvku Spi2, a oslabující mutaci, která narušuje expresi genu aroC.
Mikroorganismus s výhodou dále obsahuje jeden nebo více heterologních antigenů nebo terapeutických proteinů, například antigeny proti patogenní E. coli, Shigella, hepatitidě A, B nebo C, Herpes Simplex Virus a viru lidského papilomu. Z toho důvodu mikroorganismus může působit jako dodávkový nosič zajišťující imunitu proti jiným infekcím než je Salmonela.
Mikroorganismy Salmonela mohou být použity ve výrobě léku pro nitrožílní nebo orální podávání pri léčení bakteriálních nebo virových infekcí, například pro léčení tyfu.
Oslabené mikroorganismy Salmonela tohoto vynálezu tvoří vakcíny, které překvapivě stimulují mukózní a systémovou imunitu. Dále mikroorganismy na zvířecím modelu nezpůsobují abscesy sleziny, kdežto mutanty s jednou mutací je způsobují. To je obzvláštní výhodou zde definovaných dvojitých mutantů.
Mikroorganismy a očkovací kompozice tohoto vynálezu mohou být připraveny známými technikami.
Výběr konkrétního mikroorganismu Salmonela a zvolení vhodné mutace mohou být provedeny odborníkem bez neobvyklých experimentů. Výhodným mikroorganismem je Salmonella typhimurium.
První mutace je zavedena do genu ssaV umístěného v oblasti patogenického ostrůvku 2 Salmonely, přičemž tato oblast je popsána na WO-A-9617951.
Patogenní ostrůvek 2 (Spi2) Salmonely je jedním ze dvou klasických patogenitních ostrůvků situovaných v chromozomu Salmonely. Spi2 obsahuje několik genů, které kódují vylučovací systém typu III, který se účastní transportu proteinů spojených s virulencí kódovaných Spi2 (takzvaných efektorových proteinů) ven z bakterií Salmonela a potenciálně přímo do cílových hostitelských buněk jako jsou makrofágy. Část Spi2 (aparátový gen) kóduje vylučovací aparát systému typu III. Výzkum dne zdokumentovaný několika různými skupinami ve světě říká, že Spi2 je rozhodně zásadní pro patogennost a virulenci Salmonely u myši. Mutanti Spi2 5. typhimurium jsou při testování imunity u myší podáváním léku orální, intravenózní a intraperitoneální cestou, velice oslabováni.
Aparatové geny umístěné ve Spi2 jsou dnes již dobře známy; viz například Hensel a kol., Molecular Mikrobiology (1977); 21(1): 155-167.
Mutace v genu ssaV nemusí nezbytně proběhnout uvnitř genu, aby narušila funkci. Například mutace v protiproudé regulační oblasti může také narušit funkci exprese genu vedoucí k oslabení. Mutace v intergenové oblasti může být také dostačující k narušení funkce genu.
-2CZ 301926 B6
Druhá mutace je nazývána „autoxotrofní mutací“, protože narušuje gen, který je zásadní v biosyntetické cestě. Tuto biosyntetickou cestu obsahují Salmonely, ale u savců není přítomna. Proto nemohou být mutanti závislí na metabolitech nacházejících se u léčených pacientů a obejít tak účinek mutace.
Mutace mohou být vneseny do mikroorganismu použitím jakékoliv známé techniky. S výhodou se používá mutace delecí, kdy narušení genu je způsobeno odstraněním nukleových kyselin. Nebo mohou být mutace zavedeny insercí nukleových kyselin nebo bodovou mutací. Modely pro io vkládání mutací do specifických oblastí budou odborníkovi zřejmé.
Kromě dvou mutací může také mikroorganismus Salmonela obsahovat heterologní antigeny. Oslabený mikroorganismus tak může působit jako dodávkový nosič pro podávání antigenů proti ostatním bakteriím nebo virových infekcí. Antigeny, které jsou v tomto případě vhodné pro použití, budou odborníkovi zřejmé a zahrnují:
Patogenní antigeny E. coli, tj. ETEC Antigeny Hepatitidy A, B a C Antigeny limské nemoci
Antigeny vibrio cholery Antigeny Helikobakterií Antigeny viru Herpes Simplex Antigeny lidského viru papilomu.
Tento systém má také schopnost dodávat terapeutické proteiny, například cytokiny, pro léčení pacientů, například pacientů nakažených žloutenkou. Metody pro dodávání heterologních antígenů nebo terapeutických proteinů použitím očkovacích kompozic budou odborníkovi zřejmé.
Vakcíny vyrobené použitím mikroorganismů podle vynálezu mají využití pri léčbě lidí a léčbě veterinárních infekcí.
Dvojitá mutace poskytuje účinný prostředek k oslabení mikroorganismu a poskytnutí bezpečného kandidáta pro vakcínu.
Očkovací kompozice poskytuje účinnou ochranu dokonce i u pacientů s oslabeným imunitním systémem a skýtají významně nízké riziko pro vytváření abscesů sleziny. Abscesy sleziny byly identifikovány pri použití vakcín založených na jediné mutaci, a proto nynější kompozice mohou poskytnout podstatný přínos pro pacienty.
K vytvoření očkovacích kompozic mohou být mutované mikroorganismy přítomny v kompozici spolu s jakoukoli vhodnou farmaceuticky přijatelnou přísadou, ředidlem nebo pomocnou látkou. Vhodné formulace budou odborníkovi zřejmé. Formulace mohou být vyvinuty pro jakoukoliv vhodnou cestu podávání léků. Výhodné je orální nebo intramikroorganismů, které jsou ve formulaci zapotřebí, může být určen a optimalizován odborníkem. Nicméně, obecně vzato, pacientovi může být podáno přibližně 107-101“ CFU, nejlépe okolo 108—109 CFU v jedné dávce. CFU (Colonies forming units) představují zárodky schopné tvořit kolonii.
Následující příklady popisují vynález.
-3CZ 301926 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Tento příklad popisuje přípravu mutovaného kmene označeného jako ZH9, který působí jako orální vakcína proti tyfu u lidí. Kmen je vytvořen z virulentního kmene 5. typhi Typ2, původně izolovaného z případu tyfu. Odvozený kmen má definovanou mutaci na purA a aroA.
io
Typ pro vytvoření ZH9
S. typhi Ty2 byl původně izolován v roce 1916 z jedince nakaženého tyfem a byl používán pro tvorbu všech povolených tyfových vakcín. Kmen byl získán z PHLS národní kolekce kultur v Colindale. Byl získán jako lyofilizovaná kultura, pod NCTC číslem 8385.
Klonování genu aroC 5. typhi z S. typhi Typ2 & typhi Typ2 byl izolován z dobytku a rostl v bujónu Laria Bertani (LB) přes noc. Buňky byly sesbírány a byla připravena celobuněčná DNA. Fragmenty DNA z DNA 5. typhi Typ2 byly získány částečným štěpením s restrikčním enzymem Sau3A a výsledné fragmenty byly li govány na BaznHl, štěpeny pHC79, aby se získala knihovna kosmidů DNA S. typhi Typ2, kdy E. coli HU835 byla použita jako recipient. K izolování DNA kódující aroC z DNA 5. typhi byla použita knihovna kosmidů k transdukci E. coli AB2849, která má mutaci na genu aroC a její růst je závislý na aromatických sloučeninách. Transdukční směs byla nalisována ve velmi malém médiu s nedostatkem aromatických sloučenin a inkubována při 37 °C. Po inkubaci přes noc byl zkoumán počet izolovaných kolonií. Tyto bakterie pravděpodobně vznikly jako důsledek komplementace aroC. Byl purifikován kosmid DNA jednoho z těchto kmenů. Fragment 5.2kb HindlW z tohoto kosmidů byl nakloňován do pUC18, aby vznikl plazmid pTAC2, který byl schopen komplementovat deleci aroC a AB2849, čímž se dokazuje, že obsahuje gen aroC S. typhi. Generace definované delece klonovaného aro 5. typhi Typ2
Definovaná 600pb delece byla vytvořena v klonovaném aroC genu použitím PCR. Oligo35 nukleotidové primery použité v PCR byly navrženy za použití publikované DNA sekvence genu č/toC 5. typhi (Acc. 27715). DNA 5' do genu aroC byl rozšířen z pTAC2 pomocí primerů SEKV. ID. Č. 3 a SEKV. ID. Č. 1 SEKV. ID. Č. 3 se navazuje k vektoru DNA, SEKV. ID. Č. 1 se navazuje k regionu 5' aroC. DNA 3' do genu aroC byl rozšířen použitím primerů SEKV. ID. Č. 4 a SEKV. ID. Č. 2 SEKV. ID č. 4 se navazuje k vektoru DNA, SEKV. ID. Č. 2 se navazuje k regionu 3' aroC. Výsledné PCR produkty měli Xbal místa začleněna do 5' konců kvůli usnadnění klonování. Fragmenty byly klonovány do vektoru pUC18, Výsledný konstrukt plazmídu označovaného pMIAC23 obsahuje definovanou deleci aroC (pozice 544 až 1143) ve fragmentu 4.8kb Hindlll. Fragment Hindlll je insetrován do místa 77Ζ«ίΛΠ v pUCl 8. Jedno místo Xbal je přítomno v místě delece aroC.
Zavedení mutace aroC do genomu S. typhi Typ2
Suicidní plazmid pCVD442 (Donnenberg & Kaper, Infection and Immunity, 1991; 59; 4310417) byl použit jako vektor k zavedení delece aroC do genomu 5. typhi Typ2, Fragment 4.8kb
Hindlll obsahující deleci aroC byl izolován z pMIAC23 a konce byly zarovnány, k čemuž bylo použito soupravy Stratagene DNA polishing kit. Plazmid pCVD442 byl linearizován štěpením pomocí Smál, upraven alkalickou fosfatázou a ligován k fragmentům se zarovnanými konci. Požadovaný konstrukt byl izolován a označen jako pYCVC21.
-4CZ 301926 B6 pYCVC21 byl zaveden do S. typhi Typ2 použitím standardního elektroporačního protokolu. Plazmid byl schopen integrace do genomu Typ2, s následnou rekombinací mezi homologickými regiony na plazmidu a genomu, což dalo transformanty odolné vůči ampicilinu. Tyto transformanty obsahovaly kopii původního standardního aroC a deletovanému genu aroC. Růst těchto kmenů za nepřítomnosti ampicilinu umožnilo průběh druhé rekombinace, která vedla ke ztrátě sekvencí DNA pCVD442 a jedné kopie genu aroC, buď standardní kopie nebo deletované kopie. Bakterie 5. typhi Typ2, které prošly procesem této druhé rekombinance, byly identifikovány jako deriváty citlivé na ampicilin, které jsou schopné růst za přítomnosti 5% sacharózy (pCVD442 nerse gen yíícB, který po expresi vede kfenotypům citlivým na sacharózu). Kmeny, které si io udržely pouze deletovaný gen aroC, byly zpočátku identifikovány jako kmeny, které nejsou schopné růstu na misce s minimem média bez přídavku aromatických sloučenin. Genotyp aroC byl potvrzen použitím analýzy PCR. Primery, které mají SEKV. ID. Č. 5 a SEKV. ID Č. 6, poskytly produkt 994 pb pro standardní typ aroC a 400 pb pro deletovaný gen aroC. Analýza sekvence výsledného PCR produktu potvrdila přítomnost požadované delece v 5ti jednotlivých izolátech označovaných DTY6, DTY7, DTY8, DTY9 a DTY10. Tyto kmeny byly uschovány v víalkách Microbank pro dlouhodobé uskladnění pří -70 (C. Kmen DTY8 byl vybrán pro další manipulaci.
Zavedení mutace ssaVdo mutantu DTY8 aroC S. typhi
7,5kb fragment Pstl obsahující region ssaV S.typhi byl rozšířen z přípravy celkové DNA za použití PCR a klonován do vektoru pCR2.1 (Invitrogen). Použité oligonukleotidové primery PCR, které mají SEKV. ID. Č. 7 a SEKV. ID. Č. 8, byly navrženy do sekvence 5. typhimurium SPI2. Výsledný konstrukt plazmidu byl označen pTYSV21.
Konstrukt plazmidu, který má deleci genu ssV, byl odvozen z pTYSV21 použitím opačně orientované PCR. primery navázané k 5' (SEKV. ID. Č. 9) a 3' (SEKV. ID Č. 10) oblastech otevřeného čtecího rámce ssaV byly navrženy do sekvence S. typhimurium Spi2. Restrikční místo .4vrII bylo začleněno do oblasti 5' každého primeru, místo Xbal bylo začleněno do SEKV. ID Č. 10.
Místo Xbal slouží jako značka pro ssaV mutaci, tudíž může být jednoduše detekováno restrikční analýzou. Výsledný produkt PCR byl podroben štěpení s^vrll a molekuly hlavního řetězce plazmidu byly přečištěny po agarózové gelové elektroforéze. Recirkularizace výsledných fragmentů u kohezních konců AvrlI dala požadovanou sestavu delece pYDSVl. pYDSVl obsahuje 5,5kb fragment Pstl s definovanou 1894pb deleci v otevřeném čtecím rámci ssaV.
Suicidní plazmid pCVD442 byl použit jako vektor k zavedení delece ssaV do genomu DTY8 mutantu aroC. S. typhi Ty2. Fragment 5,5kb Pstl obsahující deleci xsaFbyl izolován z pYDSVl a konce byly zarovnány působením Klenow DNA polymerázy. Plazmid pCVD442 byl linearizován štěpením se Smál, upraven pomocí alkalické fosfatázy a ligován k fragmentům se zarov40 nanými konci. Požadovaný konstrukt byl izolován a označen pYDSV214.
pYDSV214 byl elektroporaci zaveden do DTY8 5. typhi. Byly vybrány transformanty odolné vůči ampicilinu a následně pěstovány za nepřítomnosti ampicilinu, aby se poskytla ztráta sekvencí DNA pCVD442 a jedné kopie genu ssaV, bud* standardní kopie nebo deletované kopie.
Kmeny, které absolvovaly tuto druhou rekombinací, byly identifikovány jako ampicilin senzitivní kopie, odolné vůči sacharóze. Kmeny, které i uchovaly pouze eletovaný gen ssaFbyly identifikovány použitím PCR analýzy. Primery mající SEKV, ID Č. 11 SEKV. ID Č. 12 poskytly 2485pb produkt pro standardní typ ssaV a 591pb pro deletovaný gen ssaV. Sekvenční analýza výsledných produktů PCR potvrdila přítomnost požadované delece u pěti jednotlivých izolátů ZH2, ZH4,
ZH6, ZH7 a ZH9. Kmen ZH9 byl vybrán pro zpracování CGMP vzorové banky buněk.
-5CZ 301926 B6
Příklad 2
Tento příklad popisuje přípravu mutantního kmene S. typhimurium označovaného jako WT05, který má očkovací aktivitu proti lidské gastroenteritidě. Kmen je odvozen od známého lidského virulentního kmene TML S. typhimurium.
TML pro konstrukci WT05
TML byl původně izolován z pacienta trpícího gastroenterítidou a byl identifikován v laboratořích Dr. Johna Stevense na Birminghamské univerzitě. Byl lyofilizován ve Wellcome Research Laboratories a bylo mu přiděleno číslo kultury BRD 519. Kultura byla získána z Birminghamské university.
Generace definované delece klonovaného genu ssaVS. typhimurium
Plazmid (plazmid 7-2, Shea a kok; PANS, 1996; 93; 2593-2597) byl vytvořen klonováním fragmentu 7,5kb pstl izolovaného zS. typhimurium LT2 do místa Pa/11 pUC18. ssaV situován uprostřed tohoto fragmentu. Plazmidový konstrukt obsahující definovanou deleci ssaV ORF byl odvozen z plazmidu 7-2 použitím opačně orientované PCR. Příměry navázané na 5' (SEKV. ID. Č. 13) a 3' (SEKV. ID Č. 14) oblasti otevřeného čtecího rámci .sw^Lbyly navrženy pro sekvenci S. typhimurium Spi2. Restrikční místo Avrll bylo začleněno do oblasti 5' každého primem a místo Xball bylo začleněno do SEKV. ID. Č. 14. Místo Xba\ slouží jako značka pro mutaci ssaV, takže může být lehce detekováno pomocí restrikční analýzy. Výsledný produkt PCR byl podroben štěpení sTvrlI a molekuly hlavního řetězce plazmidu byly purifikovány po agarové gelové elektroforéze. Recirkularizace výsledných fragmentů u kohezních konců Avrll dala požadovanou sestavu delece označovanou pMCSVl, pMDSVl obsahuje 5,5kb fragmentu Pstl s definovanou 1849pb deleci v otevřeném čtecím rámci ssaV, v místě delece jsou restrikční místa Avrll a Xbal.
Suicidní plazmid pCVD442 byl použit jako vektor pro zavedení delece ssaV do genomu 5. typhimurimu 1ML. Fragment 5,5kb Pstl obsahující deleci s-saFbyl izolován z pMDSVl a jeho konce byly zarovnány působením Klenow DNA polymerázy. Plazmid pCVD442 byl linearizován štěpením s Smál, upraven pomocí alkalické fosfatázy a ligován k fragmentům se zarovnanými konci. Byl izolován požadovaný konstrukt a označen pMDSV22.
pMDSV22 byl zaveden do S. typhimurium TML použitím konjugace. Za tímto účelem byl konstrukt transformován do kmene E. coli S17-1 λ pír. Konjugace byla provedena podle standardních procedur. Plazmid pMDSV22 byl schopen integrace do genomu MTL po rekombinací mezi homologickými regiony na plazmid a genomu, aby dal transkonjugáty odolné vůči ampicilinu. Transkonjugát označený jako mdsv-WT2 byl vybrán pro další zpracování. Tento transkonjugát obsahuje jak kopii původního standardního ssaV, tak deletovaného genu ssaV. Byl vypěstován bez přítomnosti ampicilinu, aby došlo k druhé rekombinací, která by bedla ke ztrátě sekvencí DNA pCVD442 a jedné kopie genu ssaV, a to buď standardní kopie nebo deletované kopie. Izoiáty, které prošly touto druhou rekombinací, byla identifikovány jako ampicilin-senzitivní deriváty, které byly schopné růstu za přítomnosti 5% sacharózy (pCVD442 nese gen sacB, jehož exprese vede k fenotypům citlivým na sacharózu). Kmeny, které si ponechaly pouze deletovaný gen ssaV, byly identifikovány použitím analýzy PCR. Primery, které mají SEKV. ID Č. 15 a SEKV. ID Č. 16, poskytly produkt 2485pb pro standardní ssaV a 591pb pro deletovaný gen ssaV. Sekvenční analýza výsledných produktů PCR potvrdila přítomnost požadované delece ve čtyřech individuálních ízolátech ZH20, ZH23, ZH25 a ZH26. Tyto kmeny byly uchovány v LB a 15% glycerolu při -80 °C pro dlouhodobé skladování. Kmen ZH26 byl vybrán pro další použití.
-6CZ 301926 B6
Klonování genu aroC. S. typhimurium z 5. typhimurium TML
Genomové DNA byla izolována ze S. typhimurium TML a rozštěpena s/Zrá/III. Fragmenty Hindlll v rozmezí velikosti 5 až 6 kb byly purifikovány a ligovány k ///nJIII-rozštěpenému pBluescriptu. Ligovací směs byla použita k transformaci mutantu aroC E. coli AB2849 a klony obsahující gen aroC S. Typhimurium byly vybrány na základě jejich schopnosti komplementovat tento kmen. Analýza jednoho klonu pDACl ukázala, že obsahoval 5,2kb fragment //wcflll.
Definovaná 600pb delece byla vytvořena v klonovaném genu aroC použitím PCR. Oligonukleotidové primery byly navrženy s použitím publikované sekvence DNA genu aroC S. typhi (Acc. M27715). DNA 5' ke genu aroC byla rozšířena z pDACl použitím příměrů majících SEKV. ID Č. 19 a SEKV. ID Č. 17. SEKV. ID Č. 19 se navazuje na vektor DNA, SEKV. ID Č. 17 se navazuje na region 5' aroC. DNA 3' ke genu aroC byla rozšířena použitím primerů majících SEKV. ID Č. 20 a SEKV. ID Č. 18 SEKV. ID Č. 20 se navazuje k vektoru DNA, SEKV. ID Č. 18 se navazuje k regionu 3' aroC. Výsledné produkty PCR měly pro usnadnění klonování místa Xbal začleněná do 5' konců. Fragmenty byly klonovány do vektorů pUC18. Výsledný plazmid konstrukt pMIAC8 obsahující definovanou deleci aroC (Acc. M27715 pozice 544 až 1143) na 4,8kb fragmentu //ťwí/HI. Fragment Hindlll je vložen do místa Hindlll pUC18. Jediné místo Xbal je přítomno v místě delece.
Zavedení mutace aroC do ZH26 mutace ssaV S. typhimurium
Suicidní plazmid pCVD442 byl použit jako vektor pro zavedení delece aroC do genomu S.typhimurium TML. 4,8kb fragment Hindlll obsahující deleci aroC byl izolován zpMIAC8 a konce byly zarovnány použitím sestavy Stratagene DNAS polishing kit (Část č. 200409). Plazmid pCVD442 byl linearizován štěpením sSmal, upraven pomocí alkalické fosfatázy a ligován k fragmentům se zarovnanými konci. Požadovaný konstrukt byl izolován a označen pMCVCló. pMCVCló byl zaveden do S. typhimurium ZH26 použitím elektroporace. Byly vybrány transformanty odolné vůči ampicilinu a nechaly se růst za nepřítomnosti ampicilinu, aby se dosáhlo ztráty sekvencí DNA pCVD442 a jedné kopie genu ssaV, buď standardní kopie nebo deletované kopie. Kmeny, které absolvovaly druhou rekombinaci, byly identifikovány jako ampicilin-senzitivní deriváty, které byly schopny růstu v přítomnosti 5% sacharózy. Kmeny, které si uchovaly pouze deletovaný gen ssaV, byly na začátku identifikovány jako kmeny, které nebyly schopné růstu na misce s minimem média bez přídavku aromatických sloučenin. Genotyp aroC byl potvrzen použitím PCR analýzy. Primery mající SEKV. ID. Č. 21 a SEKV. ID. Č. 22 daly 994bp produkt pro standardní typ aroC a 400pb pro deletovaný gen aroC. Sekvenční analýza výsledných produktů PCR potvrdila přítomnost požadované delece ve čtyřech individuálních izolátech WT05, WT09, WT10 a WT12. Kmen WT05 byl vybrán pro výrobu CGMP vzorové banky buněk.
Příklad 3
Následující konstrukt byl připraven za účelem testování dvojitě mutovaných vakcín na zvířecím modelu. & typhimurium SL1344, kmen, který infikuje myši, byl použit s přítomnými jednoduchými a dvojitými mutacemi.
ssaV::aph (nepolární) mutace z 5. typhimurium 12023s byla transdukovány P22 do SL 1344, aby se získal jednoduchý mutant Spi2.
Delece aroC/pCFZ)422suicidní vektor pMCVCló byl elektroporován do kmene S. typhimurium LB5010 a byly získány merodiploidy. Merodiploid delece aroC byl potom transdukován P22 z merodiploidu LB5010 do SL 1344. Merodiploid SL 1344 byl následně analyzován použitím sacharózové selekce, za účelem získání jednoduchého mutanta aroC.
-7CZ 301926 B6
Dvojitý mutant byl vytvořen transdukcí merodiploidu P22 delece aroC zLB5010 do SL1344 ssaV::aph. Sekvence plazmidů byly analyzovány z výchozího kmene 3 merodiploidu, mutace deletovaného aroC v SL 1344 ssaV::aph pozadí.
Preklinické farmakodynamické studie na definovaných mutantech Salmonely aroC/ssaV
Mutanti Salmonely (kmen SL 1344) mající definované mutace buď v aroC, ssaV nebo kombinaci obou mutací, byly rozsáhle hodnoceny u myší BALB/C kvůli posouzení oslabení, vytrvalosti io organismů a schopnosti imunizovat vůči napadení kmenem standardního typu.
Příklad 4
Zvířata imunizovaná intravenózní cestou
Pozorování obrany
Skupiny deseti myší BALB/C byly imunizovány intravenózně s 105 a 106 SL 1344 aroC,
SL 1344 ssaV a SL 1344 aroC:: ssaV organismy vypěstovanými přes noc v bujónu LB a znovu suspendovanými v solném roztoku, pro podání. Myši byly napadeny o 6 týdnů později 105 organismy standardního typu podávanými intravenózně. Deset organismů tohoto kmene standardního typu podaných intravenózně dostačuje k usmrcení myší.
Všechny myši, jimž byl podán jednoduchý mutant aroC nebo ssaV, byly pevně chráněny po působení kterékoli dávky a přežily experiment dobře, aniž by vykazovaly jakýkoli příznak nemoci. U dvojité mutace bylo 90 % zvířat, které byly imunizovány 106 organismy, pevně chráněno. Jedno zvíře uhynulo 8 dní po napadení. U zvířat, která byla imunizována nižšími dávkami, napadení přežila pouze jedna myš.
Tento pokus ukazuje, že imunizování mutanty ssaV Salmonely jak samotné, tak v kombinaci s mutací aroC, činí myši odolné proti napadení standardními typy kmenů Salmonely.
Vytrvalost kmenů
Skupině myší bylo podáno 106 organismů tří mutantů Salmonely popsaných výše. Čtyři myši byly záměrně usmrceny v různých časových intervalech během 14 dnů a bylo provedeno sčítání organismů v játrech a slezině. Množství všech tří mutantů byla srovnatelná až do 10. dne, kdy množství organismů v každém orgánu bylo přibližně 5xlO5. Rozdíl mezi jednoduchými mutanty a dvojitými mutanty se projevil 14. den, kdy byl zaznamenán menší počet dvojitých mutantů mikroorganismů v játrech i ve slezině.
Další důležitý rozdíl mezi jednoduchými mutanty a dvojitými mutanty aroC/ssaN je v tom, že s dvojitými mutanty nedošlo během experimentu v žádném časovém období k žádnému abscesu jater. Avšak myši infikované jednoduchými mutanty měly abscesy jater během 10. a 14. dne. Toto je důležité zjištění a výrazně podporuje použití kombinace mutací pro zhodnocení přípravy vakcín.
Imunogennost
Výše uvedeným imunizovaným myším byla odebrána krev a použitím ELISA byly titrací stanoveny koncentrace protilátek proti celé buňce Salmonely. U všech tří kmenů bylo názorně dokázáno, že jsou vysoce imunogenní, vyvolávající vysoké koncentrace cirkulujícího IgG proti Salmonele.
-8CZ 301926 B6
Příklad 5
Zvířata imunizovaná orální cestou
Vytrvalost kmenů
Skupiny myší imunizovaných orálně s 5xl09 mikroorganismy každého ze tří mutantů Salmonely byly záměrně usmrceny v daných časových intervalech a byly sečteny organismy v játrech a sleio zině. Počet jednoduchých mutantů aro a jednoduchých mutantů ssaV v játrech a slezině bylo 103 a 102, v tomto pořadí, až do asi 21. dne. Potom se počty snížily. U myší, které dostaly dvojité mutanty aroC: ssaV, byly organismy po orální imunizaci v játrech a slezině prakticky nezjistitelné.
Orální imunizace a intravenózní napadení myší A-J očkovaných Salmonelou typhimurium TML aroC/ssaV (WT05)
Účelem tohoto experimentu bylo zjistit účinnost ochrany 5x109 mutantů aroC/ssaV S. typhimurium TML u modelu orální vakcinace ityr myší a intravenózního napadení. Tento model se blíže podobá lidské reakci na Salmonelu v tom, že tato zvířata jsou méně náchylná než prostředí itys.
5x109 S. typhimurium TML aroC/ssaV v objemu 0,2 ml PBS bylo sondou orálně naočkováno do žaludku deseti 6 až 8 týdnů starých myší A-J a ponecháno 8 týdnů. Dvě myší dostaly pouze BPS a sloužily jako kontrolní zvířata. Po uplynutí 8 týdnů byly napadeny tyto dvě imunizované skupi25 ny intravenózně s 107 5. typhimurium TML standardního typu. Myši byly poté sledovány po 30 dní.
Všechna zvířata byla pevně chráněna proti napadení standardním typem (100% přežití, 10/10 zvířat přežilo). Myši, jimž byl podán pouze samostatný PBS a potom byly napadeny s 5. typhimu30 rium TML standardního typu zemřelo 6 dní po začátku napadení.
V prostředí ityr se zdá, že dvojitá 5. typhimurium TML aroC/ssaV chrání myši při podání orální dávky 5x109. Toto může být důležité pro lidské poměry, protože ityr myši jsou lepší model lidské salmonelózy, ve vztahu k náchylnosti k infekci.
Byla také prováděna pozorování za účelem vyhodnocení vytrvalosti dvojitých mutantů v játrech a slezině myší. Bylo zjištěno, že dvojití mutanti přetrvávají na nižší úrovni do přibližně 21. dne. Do 28. dne mutantní kmen zmizel.
Příklad 6
Klinické testování na lidech
18 zdravých dobrovolníků bylo získáno ke kontrolovanému zkoumání „open label“, bez placeba.
Po příslušných vyšetřeních obdržel každý ze tří dobrovolníků jednu orální dávku buď 107, 108 nebo 109 CFU S. typhi ZH9 nebo S. typhimurium WT05. Mikroorganismy připravené jak je popsáno výše byly znovu rozpuštěny do příslušných dávkovačích koncentrací v konečném objemu 100 ml 2% (hmotn./obj.) roztoku uhličitanu sodného, aby se neutralizovány žaludeční kyseli50 ny. Tato kapalná suspenze byla orálně podána dobrovolníkům. Potom byli dobrovolníci 72 hodin izolováni a poté následovala post imunizace kvůli bezpečnosti a imunogennosti.
U dobrovolníků byla pozorováním, lékařskou prohlídkou a zkompletováním lékařské karty zhodnocena reakce a další nepříznivé následky spojené s vakcinací. Vedle toho byly odebrány kultury krve, stolíce a moči kvůli kvantitativnímu rozboru na vakcinémii, ztrátu a vytrvalost kmenů
-9CZ 301926 B6 vakcíny. Navíc byla měřením hladiny C-reaktivního proteinu (CRP), enzymů funkce jater (ALT) v krvi, celkového počtu bílých krvinek (WBC) a míry sedimentace erytrocytů pomocí standardních procedur získána bezpečnostní data. Tyto parametry byly měřeny v krvi odebírané denně až do 7. dne potom týdně až do 28. dne.
Analýza mukózních a systémových imunitních reakcí
Vzorky krve a slin byly shromažďovány již před imunizací a potom 7., 14., 21, a 28. den po imunizaci. Sliny a sérum byly zmrazený na -70 °C až do analýzy ELIAS. Periferní krevní jednojademé buňky byly shromážděny a analyzovány na přítomnost buněk vylučujících protilátky (ASC) použitím techniky ELISPOT.
& typhi ZH9 i X typhimurium WT05 byly dobře snášeny všemi dobrovolníky. Nebyly zaznamenány žádné závažné nepříznivé následky u žádného z dobrovolníků v každé ze 3 dávkovačích úrovní a kultury krve a moči zůstaly negativní u všech očkovaných jedinců po celou dobu testování. Tudíž imunizace sS. typhi ZH9 a S. typhimurium WT05 nevyústila ve vakcinémii. Ani jeden z podaných kmenů nevyvolal u žádného z dobrovolníků průjem nebo vytrvalou horečku s vysokými teplotami, což dále dokazuje bezpečnost kmenů vakcín. Vytrvalé vylučování nebo vakcinémie nebyly po 7 dnech pozorovány u žádné ze 3 skupin dávek S. typhi ZH9 nebo nízké dávky (107) S. typhimurium WT05.
Mukosální a systémové imunitní reakce vyvolané S. typhi ZH9
Orální imunizace s jednou nízkou dávkou (lxlO7 CFU) S. typhi ZH9 méla za následek aktivaci
S. /ypAZ-specifických IgA-vylučujících ASC detekovanou u 2 ze 3 dobrovolníků 7 dní po imunizaci. Následné testování 14. a 21. den ukázalo, že IgA ASC jsou stále detekovatelné, ale v daleko nižších hladinách a zmizely do 28. dne. U skoro všech očkovaných respondentů byl počet ASC nejvyšší 7. den. Překvapivě přijetí vyšší dávky (108 CFU) S. typhi ZH9 mělo za následek nízkou odezvu IgA ASC u pouze jednoho ze tří očkovaných jedinců. Přijetí nejvyšší dávky (lxl 09 CFU) aktivovalo IgA ASCs u 2 ze 3 dobrovolníků.
Reakce protilátek séra specifického pro Salmonelu
Orální imunizace sjednou nízkou dávkou (lxl07 CFU) S. typhi ZH9 nevyvolala IgG 5. typhi LPS-specifického séra (přestože vytvářela IgA-ASCs u 2/3 očkovaných jedinců) pri vyšetření 7., 14., 21., a 28. den. Podobně pouze 1/3 vytvářela velmi nízké hladiny flagella-specifických IgG. Nicméně přijetí 108 CFU vedlo k produkci vysokých hladin LPS- a flagella-specifických IgG u všech tří dobrovolníků. Již 7 dní po vakcinaci byly zjištěny zvýšené hladiny S. typhi LPSspecifických a flagella-specifických, které stouply 14. den a zůstávaly vysoké i 28. den. Nejvyšší dávka 109 CFU také stimulovala u 2 ze 3 očkovaných jedinců LPS- a flagella-specifické IgG, zjistitelné 7., respektive 14. den.
Závěr
Tato studie demonstrovala užitečnost mutace ssúfKjako složky jakékoli nové orální vakcíny proti tyfu. Kmen S. typhi mající pouze samotné mutace aro by u podaných dávek způsobovala vakcinémie. Mutace ssaV proto poskytují dodatečný stupeň bezpečnosti u samostatných mutací aro odstraněním vakcinémii použitím této první mutace.
ZH9 se, stejně tak jako v případě dokázání dobré tolerance, také projevil jako imunogenní u všech 3 úrovní podaných dávek. Pokud jde o stimulaci protilátek séra, střední (108 CFU) a vysoké (109 CFU) dávky se ukázaly být vysoce imunogenní, přičemž 3/3 vakcíny podané s 108 CFU a 2/3 podané s IO9 CFU vyvolávají vysoké koncentrace 5. typhi IgG LPS- a flagella-specifického séra. Tyto reakce jsou velmi povzbudivé, protože je obecně náročné vyvolat protilátky séra orální vakcinaci.
- 10CZ 301926 B6
Stejně jako ZH9 vyvolala reakce S. typhi-specifíckých protilátek na sérum, aktivovala také IgA ASC, svědčící o imunní stimulaci ve střevní (sliznici). U celkem 5/9 dobrovolníků byla vyvolána reakce & typhi LPS-specifických IgA-vylučujících buněk (ASC), která se nejevila jako závislá na dávce.
WT05 byl také docela tolerován a nebyly zjištěny žádné vakcinémie. Zajímavé je, že u žádného z dobrovolníků nebyly zjištěny žádné případy průjmů nebo příznaky gastroenteritidy. Předchozí data získaná použitím mutantního kmene TML s jednoduchou mutací aro nebo SPI2 u S. typhitú murittm podaného myším naznačovala, že dvojitý mutant aroC/ssdV může způsobovat nějaké lokální střevní účinky, například průjem nebo křeče u lidí. Absence těchto účinků dále podporuje užitečnost kombinace mutací aro a SPI2.
Příklad 7
Heterologní nosiči antigenů
Aby byla názorně dokázána užitečnost kmenů s dvojitou mutací ssdV.aroC pro expresi adoru20 čování cizích antigenů, byl transformován WT05 s plazmidem (pBRDO26) exprimujícím gen pro B podjednotku (LT-B) teplotně labilního enterotoxinu E. coli.
Myši BALB/C (m=10/skupina) byly orálně imunizovány ve dny 0 a 28 s 109 CFU (200 ml v PBS) WT05 exprimujícím pBRD026 nebo s vektorovým kmenem WT05 (kontrolním). Pro srovnání (a jako pozitivní kontrola) byla orálně imunizována skupina myší (n=5) ve dnech 0 a 28 s 10 gg čisté LT (Sigma). Negativní kontrolní myší (n=5) byly orálně imunizovány ve dnech 0 a 28 s 200 μΐ PBS. Myším byla z ocasní žíly odebrána krev. 21., 28., 35. den a srdeční punkcí 42. den, tato krevní séra a střevní výplach (pouze ze 42. dne) byly shromážděny a skladovány pri -20 °C.
Všechny myši imunizované WT05/LT-B, kromě jedné, vyvolaly IgG LT-specifický (koncentrace 3000 až 50 000) 28. den po jedné orální dávce. Žádná z kontrolních myší orálně imunizovaných s WT05 nebo PBS nevyvolala IgG LT-specifický. Orální imunizace jednou dávkou čistého LT vyvolala vyšší koncentrace LT-specifických protilátek (koncentrace 6000 až >50 000). Když byl zkoumán izotyp LT-B-specifický IgG séra, bylo zjištěno, že kmen WT05 exprimující pBRD026 vyvolával skoro výhradně LT-specifický IgG2a, znamenající tendenci k imunitní reakci THl-typu. Naopak myši imunizované čistým LT (Sigma) vyvolávaly skoro výhradně LTspecifický IgGl, označující odezvu TH2-typu. Proto exprese LT-B ve kmeni aroC/ssáV usnadňuje intenzivní zmírnění imunity. Reakce s tendencí TH1, vytvářené kmenem aroC/ssaV Salmonely, budou důležité, když jsou exprimovány antigeny z patogenních organizmů, které jsou chráněny reakcemi THl-typů.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mikroorganismus Salmonella mající oslabující mutací, která narušuje expresi genu ssaV, a oslabující mutaci, která narušuje expresi genu aroC.
- 2. Mikroorganismus podle nároku 1, který dále obsahuje heterologní antigen nebo terapeutický protein.
- 3. Mikroorganismus podle nároku 2, ve kterém antigenem je antigen hepatitidy A, B nebo C.
- 4. Mikroorganismus podle kteréhokoliv z předešlých nároků, kde mikroorganismem je Salmonella typhi Ty2.
- 5. Mikroorganismus podle kteréhokoliv z předešlých nároků, pro použití v terapii.
- 6. Očkovací kompozice obsahující mikroorganismus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, a pomocnou látku a fyziologicky přijatelné ředidlo.
- 7. Očkovací kompozice podle nároku 6, vyznačující se tím, že obsahuje 107 až 1010 CFU v jedné dávce.
- 8. Očkovací kompozice podle nároku 7, vyznačující se tím, že obsahuje 108 až 109 CFU.
- 9. Použití mikroorganismu jak byl definován ve kterémkoli z nároků 1 až 4, pro výrobu léčiva pro intravenózní podání pro léčbu systémových bakteriálních infekcí.
- 10. Použití mikroorganismu jak byl definován ve kterémkoli z nároků 1 až 4, pro výrobu léčiva v orální dávkové formě pro léčbu systémových bakteriálních infekcí.
- 11. Použití podle nároku 9 nebo nároku 10 pro léčbu tyfu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9910812.8A GB9910812D0 (en) | 1999-05-10 | 1999-05-10 | Vaccine composition |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20014030A3 CZ20014030A3 (cs) | 2002-06-12 |
| CZ301926B6 true CZ301926B6 (cs) | 2010-08-04 |
Family
ID=10853168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20014030A CZ301926B6 (cs) | 1999-05-10 | 2000-05-09 | Oslabené mikroorganismy pro lécbu infekcí |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6756042B1 (cs) |
| EP (2) | EP1702927B1 (cs) |
| JP (1) | JP4583607B2 (cs) |
| KR (2) | KR100680391B1 (cs) |
| CN (1) | CN1177863C (cs) |
| AP (1) | AP1470A (cs) |
| AT (2) | ATE457998T1 (cs) |
| AU (1) | AU763898B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI0010418B8 (cs) |
| CA (1) | CA2372553C (cs) |
| CY (1) | CY1107656T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ301926B6 (cs) |
| DE (2) | DE60043868D1 (cs) |
| DK (1) | DK1183269T3 (cs) |
| EA (1) | EA004921B1 (cs) |
| ES (1) | ES2277591T3 (cs) |
| GB (1) | GB9910812D0 (cs) |
| HU (1) | HUP0201117A3 (cs) |
| IL (3) | IL146255A0 (cs) |
| MA (1) | MA25411A1 (cs) |
| MX (1) | MXPA01011477A (cs) |
| NO (1) | NO329520B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ539260A (cs) |
| OA (1) | OA11940A (cs) |
| PT (1) | PT1183269E (cs) |
| TR (1) | TR200702949T2 (cs) |
| WO (1) | WO2000068261A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200108912B (cs) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69526377T2 (de) * | 1994-12-09 | 2002-11-07 | Microscience Ltd | Virulenzgene in der VGC2-Region von Salmonella |
| JP2002524077A (ja) * | 1998-09-04 | 2002-08-06 | クリートゲン アクチエンゲゼルシャフト | 抗原キャリヤーとしての弱毒化サルモネラｓｐｉ２突然変異体 |
| GB9910812D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
| GB0105924D0 (en) * | 2001-03-09 | 2001-04-25 | Microscience Ltd | Promoter |
| US7449178B2 (en) * | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
| US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
| WO2008153772A2 (en) * | 2007-05-25 | 2008-12-18 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Chlamydia vaccine comprising htra polypeptides |
| US8703153B2 (en) | 2008-06-16 | 2014-04-22 | Prokarium Ltd. | Salmonella vectored vaccines against Chlamydia and methods of use |
| CA2733425A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-02-11 | Emergent Product Development Uk Limited | Vaccines against clostridium difficile and methods of use |
| WO2010048322A1 (en) * | 2008-10-21 | 2010-04-29 | Emergent Product Development United Kingdom | Use of e. coli surface antigen 3 sequences for the export of heterologous antigens |
| US8481052B2 (en) | 2011-05-17 | 2013-07-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Avirulent Salmonella gallinarum variants and pharmaceutical composition using the same |
| EP3613430A2 (en) | 2013-10-11 | 2020-02-26 | Servizo Galego De Saúde (Sergas) | Live attenuated vaccines |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11541105B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-01-03 | The Research Foundation For The State University Of New York | Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance |
| US11471497B1 (en) | 2019-03-13 | 2022-10-18 | David Gordon Bermudes | Copper chelation therapeutics |
| US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
| EP3922255A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-15 | Prokarium Limited | Cancer therapy |
| EP4124342A1 (en) | 2021-07-28 | 2023-02-01 | Prokarium Limited | Cancer therapy with live attenuated bacteria |
| CA3238816A1 (en) | 2021-12-09 | 2023-06-15 | Prokarium Limited | Combination cancer therapy |
| WO2024061748A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Prokarium Limited | Salmonella strain with chromosomally integrated landing pad |
| GB202215134D0 (en) | 2022-10-13 | 2022-11-30 | Prokarium Ltd | Composition |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5876931A (en) * | 1994-12-09 | 1999-03-02 | Rpms Technology Limited | Identification of genes |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4440859A (en) * | 1977-05-27 | 1984-04-03 | The Regents Of The University Of California | Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms |
| US4704362A (en) * | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
| DK171727B1 (da) * | 1978-12-22 | 1997-04-14 | Biogen Inc | Rekombinante hepatitis B virus DNA-molekyler, værtsorganismer transformeret hermed, HBV-antigenspecifikke polypeptider, DNA-sekvenser kodende for HBV-antigenspecifikke polypeptider, metoder til påvisning af hepatitis B virus-antistoffer, metoder til fremstilling af nævnte DNA-molekyler, fremgangsmåder til fremstilling af nævnte polypeptider og midler til påvisning af HBV-infektion |
| US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| US5210035A (en) * | 1980-05-19 | 1993-05-11 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Non-reventing live vaccines |
| US4550081A (en) * | 1980-05-19 | 1985-10-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Non-reverting salmonella |
| US4837151A (en) * | 1980-05-19 | 1989-06-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University | Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen |
| US4766075A (en) * | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US4582800A (en) * | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| US4757006A (en) * | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| US4677063A (en) * | 1985-05-02 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
| US5643579A (en) * | 1984-11-01 | 1997-07-01 | American Home Products Corporation | Oral vaccines |
| US4810648A (en) * | 1986-01-08 | 1989-03-07 | Rhone Poulenc Agrochimie | Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene |
| US5397697A (en) * | 1989-01-10 | 1995-03-14 | Ciba-Geigy Corporation | Identification of plant-responsive genes of bacteria |
| FR2664614B1 (fr) | 1990-07-11 | 1992-10-16 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires. |
| SE9101433D0 (sv) | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Marianne Hansson | Recombinant dna sequence and its use |
| EP0669989A1 (en) | 1991-08-22 | 1995-09-06 | Washington University | Polynucleotide probes for salmonella |
| WO1993007266A1 (en) * | 1991-10-07 | 1993-04-15 | Idaho Research Foundation, Inc. | Genetic construct for selection of homologous recombinants on a single selective medium |
| US5356797A (en) * | 1991-11-15 | 1994-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | Membrane expression of heterologous genes |
| WO1993010246A1 (en) | 1991-11-15 | 1993-05-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
| EP0668779A4 (en) | 1992-11-06 | 1996-08-21 | Univ Minnesota | Vaccine to protect against pasteurellosis - infection by P.multocida. |
| WO1994026933A1 (en) | 1993-05-13 | 1994-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Genetic footprinting: insertional mutagenesis and genetic selection |
| AU3958895A (en) | 1994-10-18 | 1996-05-06 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
| US5700683A (en) * | 1995-02-17 | 1997-12-23 | Pathogenesis Corporation | Virulence-attenuating genetic deletions deleted from mycobacterium BCG |
| WO1997014800A1 (en) * | 1995-10-16 | 1997-04-24 | Smithkline Beecham Plc | Novel saliva binding protein |
| EP0939761A4 (en) | 1995-11-14 | 2002-07-31 | Gen Hospital Corp | SALMONELLA SECRETIED PROTEINS AND USE THEREOF |
| US6030624A (en) | 1996-08-16 | 2000-02-29 | Uab Research Foundation | Mucosal immunogens for novel vaccines |
| GB9621091D0 (en) * | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| ES2232934T3 (es) | 1997-02-14 | 2005-06-01 | MERCK & CO., INC. | Formulaciones de vacunas a base de polinucleotidos. |
| US6455323B1 (en) | 1997-07-03 | 2002-09-24 | Pharmacia & Upjohn Company | Anti-bacterial methods and materials |
| GB9804809D0 (en) | 1998-03-06 | 1998-04-29 | Wallis Timothy S | Attenuated salmonella:materials and methods relating thereto |
| US6585975B1 (en) * | 1998-04-30 | 2003-07-01 | Acambis, Inc. | Use of Salmonella vectors for vaccination against helicobacter infection |
| JP2002524077A (ja) * | 1998-09-04 | 2002-08-06 | クリートゲン アクチエンゲゼルシャフト | 抗原キャリヤーとしての弱毒化サルモネラｓｐｉ２突然変異体 |
| NZ511366A (en) * | 1998-11-09 | 2004-03-26 | Microscience Ltd | Virulence genes and proteins, and their use |
| GB9910812D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
| WO2001032697A2 (en) | 1999-11-05 | 2001-05-10 | L'unite De Recherche En Biologie Moleculaire (Urbm) Des Facultes Universitaires Notre Dame De La Paix (Fundp) | Virulence genes and proteins from brucella melitensis, and their use |
| JP3414342B2 (ja) * | 1999-11-25 | 2003-06-09 | 日本電気株式会社 | 集積回路チップの実装構造および実装方法 |
| JP2003520034A (ja) * | 1999-12-23 | 2003-07-02 | ヴィマックス リミテッド | ビルレンス遺伝子、タンパク質、およびそれらの用途 |
| GB0011108D0 (en) | 2000-05-08 | 2000-06-28 | Microscience Ltd | Virulence gene and protein and their use |
| GB0127657D0 (en) | 2001-11-19 | 2002-01-09 | Microscience Ltd | Virulence genes and proteins and their use |
| US7449178B2 (en) * | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
-
1999
- 1999-05-10 GB GBGB9910812.8A patent/GB9910812D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-05-09 KR KR1020017014154A patent/KR100680391B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 HU HU0201117A patent/HUP0201117A3/hu not_active Application Discontinuation
- 2000-05-09 ES ES00927538T patent/ES2277591T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 NZ NZ539260A patent/NZ539260A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 AU AU45932/00A patent/AU763898B2/en not_active Ceased
- 2000-05-09 PT PT00927538T patent/PT1183269E/pt unknown
- 2000-05-09 EA EA200101187A patent/EA004921B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 CA CA2372553A patent/CA2372553C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 IL IL14625500A patent/IL146255A0/xx active IP Right Grant
- 2000-05-09 TR TR2007/02949T patent/TR200702949T2/xx unknown
- 2000-05-09 KR KR1020067018279A patent/KR100811319B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 MX MXPA01011477A patent/MXPA01011477A/es active IP Right Grant
- 2000-05-09 WO PCT/GB2000/001749 patent/WO2000068261A2/en active Application Filing
- 2000-05-09 AT AT06012488T patent/ATE457998T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 EP EP06012488A patent/EP1702927B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 JP JP2000616235A patent/JP4583607B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 OA OA1200100295A patent/OA11940A/en unknown
- 2000-05-09 DE DE60043868T patent/DE60043868D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 DK DK00927538T patent/DK1183269T3/da active
- 2000-05-09 AT AT00927538T patent/ATE346090T1/de active
- 2000-05-09 EP EP00927538A patent/EP1183269B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 CZ CZ20014030A patent/CZ301926B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 AP APAP/P/2001/002317A patent/AP1470A/en active
- 2000-05-09 CN CNB00808419XA patent/CN1177863C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 DE DE60031974T patent/DE60031974T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 US US09/569,601 patent/US6756042B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 BR BRPI0010418A patent/BRPI0010418B8/pt not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-10-29 ZA ZA200108912A patent/ZA200108912B/xx unknown
- 2001-10-31 IL IL146255A patent/IL146255A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-11-08 NO NO20015464A patent/NO329520B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-11-09 MA MA26404A patent/MA25411A1/fr unknown
-
2004
- 2004-04-08 US US10/822,053 patent/US7211264B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-12-21 CY CY20061101836T patent/CY1107656T1/el unknown
-
2007
- 2007-02-01 US US11/701,214 patent/US7887816B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-29 IL IL186993A patent/IL186993A/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5876931A (en) * | 1994-12-09 | 1999-03-02 | Rpms Technology Limited | Identification of genes |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Medina E. et al.: "Pathogenicity island 2 mutants of S. typhimurium are efficient carriers for heterologous antigens and enable modulation of immune responses", Infect Immun., vol. 67(3), 1093û1099, 1999 * |
| Shea J.E. et al.: "Influence of the Salmonella typhimurium Pathogenicity Island 2 Type III Secretion System on Bacterial Growth in the Mouse", Infect. Immun., vol. 67(1), 213-219, 1999 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7887816B2 (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
| Coynault et al. | Virulence and vaccine potential of Salmonella typhlmurium mutants deficient in the expression of the RpoS (σs) regulon | |
| AU623599B2 (en) | Avirulent microbes, incapable of producing functional adenylate cyclase and cyclic amp | |
| JP2002521345A (ja) | 鳥類病原体を制御するため生きた弱毒化サルモネラワクチン | |
| US20180086794A1 (en) | Mutated salmonella enterica | |
| CA2466843A1 (en) | Salmonella vaccine | |
| US20030059442A1 (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
| CA2308691A1 (en) | Live attenuated bacteria for use in a vaccine | |
| Dougan et al. | Live attenuated Salmonella vaccines as carriers of antigens to the secretory and systemic immune systems | |
| JP4705573B2 (ja) | 弱毒細菌生ワクチン | |
| PL203551B1 (pl) | Mikroorganizm Salmonella, kompozycja szczepionki zawieraj aca mikroorganizm Salmonella i zastosowanie mikroorganizmu Salmonella | |
| AU2002223922A1 (en) | Salmonella vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20180509 |