CZ301826B6 - Zpusob výzkumu dynamiky objemových zmen fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorku, a zarízení k provádení tohoto zpusobu - Google Patents

Abstract

Dynamika objemových zmen u fotosynteticky aktivních vzorku jako napr. u vyšších a nižších rostlin, ras, fotosyntetických bakterií, se dosud zkoumala predevším fotoakustickou metodou, která neumožnuje dynamické prímé merení transverzálních zmen techto vzorku v reálném case in vivo. Podle vynálezu se transverzální zmena (.DELTA.h) pozice povrchu mereného vzorku (1), vystaveného pusobení viditelného zárení (23), napr. aktinického svetla, merí interferometricky pomocí odrazného terce (7), který je v mechanickém kontaktu s povrchem mereného vzorku (1), a odráží mericí svazek (5), který je spolu s referencním svazkem (6) generován laserovým zdrojem (3). Z fázového rozdílu harmonických vln ve svazku interferujícího zárení (9) se zjistí transverzální zmena (.DELTA.h) pozice povrchu mereného vzorku (1). Zarízení podle vynálezu zahrnuje mj. speciální detekcní zapojení fotodetektoru (12, 14, 31), mericí jednotky (33) a základního modulu (35) s pocítacem (16), konstrukci odrazných tercu (7) pro kapalné a pevné vzorky (1), optomechanickou prenosku (19) a držák (30) pevných vzorku (1).

Description

Způsob výzkumu dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků, a zařízení k provádění tohoto způsobu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu a zařízení k výzkumu dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků, jako např. vyšších a nižších rostlin, řas, fotosyntetických bakterií, popř. částí těchto organismů. Předmětem výzkumu je kvalitativní a kvantitativní stanoio vení dynamiky objemových změn vzorků, především v závislosti na jejích fotosyntetické aktivitě, přičemž výzkum může probíhat i na rostlinách in vivo. Tento vynález vznikl za podpory grantu

GAAV ČR č. IAA600960716,

Dosavadní stav techniky

Při výzkumu fotosyntetické aktivity a fyziologického stavu rostlin se nejčastěji vychází z časově závislých změn fluorescence chlorofylu. Chlorofyl jako klíčový fotoaktivní pigment je přítomen ve všech oxygenních fotosyntetických organismech a je fotoaktivním chromoforem všech reakč20 nich center, která přeměňují zářivou energii na biochemicky dále využitelnou formu. Většina absorbované energie je fotosyntetickým aparátem využita na přenos elektronů a protonů z vody do produktů a procesů potřebných k fixaci CO₂ do struktury molekul sacharózy. Energie fotosynteticky aktivního záření (vlnová délka 400 až 700 nm) je absorbována anténními pigmenty (chlorofyly a karotenoidy) organizovanými do světlosběmých komplexů fotosystému I a foto25 systému II, poté je přenesena ve formě excitonů do reakčních center obou fotosystémů, kde je využita v kaskádě primárních fotochemických a nefotochemických dějů k fotosyntetické fixaci COj.

Vedle fotochemických reakcí je excitační energie spotřebována i na procesy nefotochemické povahy, které vedou k tepelné disipaci a fluorescenci chlorofylu. U zdravých rostlin se na fotochemické reakce spotřebuje až 80 % absorbované energie, jen 3 až 5 % představuje fluorescence chlorofylu, a zbytek (15 až 17 %) se přemění na teplo. Zvýšení účinnosti jedné složky, na kterou se mění absorbovaná energie, vede ke snížení účinnosti nejméně jedné ze dvou zbývajících složek, v souladu se zákonem zachování energie.

Podstata jednoho ze známých způsobů výzkumu fotosyntézy resp. měření její účinnosti je založena na předpokladu, že zvýšení spotřeby excitační energie na fotochemické reakce vede ke snížení intenzity fluorescence chlorofylu, která je měřena.

Tento způsob měření patří do skupiny tzv. fluorimetrických metod založených na pulzní amplitudové modulaci signálu indukované fluorescence chlorofylu. Fluorimetrie umožňuje určit a kvantifikovat přispění fotochemických a nefotochemických procesů k celkovému snížení fluorescence chlorofylu získané vyhodnocením záznamů tzv. kinetiky indukované fluorescence chlorofylu. V současné době jsou fotosyntetické aktivity rostlin při výzkumu fotosyntézy odvozovány pře45 vážně z těchto křivek, měřených za různých vnějších a vnitřních podmínek a za použití různých typů fluorimetrů.

Zveřejněná patentová přihláška DE 4 427 438 popisuje způsob výzkumu fotosyntetického systému rostlin, při kterém rostliny procházejí fázemi tmy a světla, a po temnotní fázi se ozařují velmi krátkými světelnými impulzy, generovanými laserovým zdrojem s pravoúhlým průběhem, a zaznamenává se indukované fluorescenční záření. Tato metoda je nedestruktivní, ale její nevýhoda spočívá v tom, že studuje činnost fotosystémů I a II v rostlinách a neumožňuje studovat objemovou dynamiku rostlinných tkání během fotosyntézy.

-1CZ 301826 B6

Nevýhoda fluorimetrických metod obecně spočívá v tom, že jejich pomocí nemůže být přímo měřena přeměna excitační energie na teplo. U fotosynteticky aktivních vzorků je proto potřebné provádět měření tepelného signálu současně s fluorescencí, aby bylo možno plně zkoumat způsob, jakým rostliny využívají energii absorbovanou během fotosyntézy.

Pro měření vývoje tepla a procesů souvisejících s výměnou plynů v chloroplastech a v rostlinné tkáni je známá fotoakustická metoda. Fotoakustická metoda je založena na fotoakustickém jevu tj. časovém záznamu tlakové modulace ve vzorcích, která zahrnuje akustické vlny indukované nezářivou deexcitací excitovaných stavů pigmentových molekul, vývojem plynu (O₂), fixací ío plynu (CO₂), deformací povrchu vzorku atd., jako následek absorpce frekvenčně modulovaného světla. Akustické vlny ve fotosynteticky aktivních vzorcích jsou důsledkem termální expanze v organických materiálech a okolních plynech, fotosyntetického vývoje kyslíku a příjmu CO₂.

Absorpce světla ve fotosynteticky aktivních vzorcích vede jak ke změnám dynamického tlaku uvnitř buněk rostlinné tkáně, tak i k objemovým změnám vzorku jako celku.

Nevýhody fotoakustické metody, nazývané rovněž fotoakustická spektroskopie, spočívají zejména v tom, že vzorky je nutno měřit v uzavřených měřicích celách, což je např. u rostlin problematické z hlediska jejich velikosti a možnosti umístění do cely. Tato metoda je vhodná zejména pro výzkum chloroplastových suspenzí, částí listů a tkání. Její nevýhoda spočívá v tom, že dochází k oddělení měřeného vzorku od mateřské rostliny, a tedy nelze provádět měření v tzv. in vivo stavu. Rovněž pořizovací cena zařízení pro fotoakustickou spektroskopii je velmi vysoká.

Objemové resp, rozměrové změny je obecně možné měřit např. interferometrickými a holografickými způsoby. Princip přesných interferenčních měření vzdáleností je založen na superpozici dvou koherentních světelných vln (tzn. vln s konstantním fázovým rozdílem), které jsou nasměrovány ve stejnou dobu na stejné místo. Vyhodnocení vzorů vzniklých při interferenci umožňuje velmi přesné měření délkových rozdílů v dráze světelných vln pomocí interferometru (např. tzv. Michelsonův interferometr).

Např. zveřejněná patentová přihláška WO 01/27557 popisuje systém pro interferenční deformační analýzu v reálném čase, který je upraven pro měření v průmyslovém prostředí. Fázové rozdíly měřicího a referenčního svazku se zaznamenávají pomocí hologramu.

Z další zveřejněné patentové přihlášky WO 2005/001445 je znám způsob a zařízení pro fázové diferenční měření rozměrových změn u malých biologických objektů, zejména v oblasti buněčné fyziologie a neurologie, které nemohou být v živém stavu zkoumány např. rentgenovým zářením. Systém zahrnuje metodu optické interferometrie nebo spektroskopie rozptýleného záření, popř. jejich kombinaci, a je určen ke zjišťování změn optických charakteristik měřeného vzorku, nikoli k měření dynamiky objemových změn v reálném čase.

Obdobně i zveřejněná patentová přihláška WO 2006/079013 popisuje interferometr s nízko koherentním svazkem pro měření tkání v biologickém vzorku, který směřuje světelný svazek na první vrstvu v biologickém vzorku, a přijímá světlo odražené z této vrstvy, dále směřuje světelný svazek na odrazné zařízení, a přijímá světlo odražené z odrazného zařízení. Odražené světelné svazky interferují a určují první fázi. Obdobně se určí druhá fáze. Biologický vzorek se vyhodnocuje z prvé fáze a druhé fáze. Způsob je určen pro měření aterosklerotických plátů v tepenném systému, na základě změny indexu lomu prostředí vzorku.

Dále je znám způsob a zařízení pro analýzu biologických objektů, popsaný ve zveřejněné paten50 tové přihlášce WO 2007/014 622, ve kterém se využívá prostředků digitální holografické mikrointerferometrie, zachycuje se třírozměrný obraz biologických objektů, zejména buněk, a ten se následně vyhodnocuje, mimo jiné i z hlediska jeho rozměrových a objemových změn.

Holografické techniky nelze použít při výzkumu fotosynteticky aktivních vzorků, poněvadž pri ozáření vzorku laserovým zářením by došlo k ovlivnění fotosyntézy vzorku již v důsledku samot-2CZ 301826 B6 ného tohoto měřicího ozáření, což je pro měření nežádoucí. Hologramy samy o sobě také nemají dostatečnou rozlišovací schopnost, a rovněž je problematické technicky ozářit větší objekty in vivo.

Použití známých interferenčních měřicích metod založených na laserových měřicích svazcích, které jsou využívané v jiných oblastech techniky, je u fotosynteticky aktivních vzorků rovněž problematické. Při použití intenzivních vysokoenergetických laserových svazků dojde k poškození a destrukci vzorku, např. listu rostliny, a to v důsledku toho, že více než 80 % záření měřicího svazku se při dopadu na vzorek pohltí ve vzorku a poškodí jeho tkáň. Fotosynteticky aktivní io vzorky (např. listy) mají jen velmi nízkou odrazivost, (cca 8 až 12 %) a proto není možné využít ani interferometry s nízkoenergetickým laserovým svazkem, poněvadž v tomto případě by se neodrazil měřicí svazek s dostatečnou intenzitou a nemohl by být získán interferogram potřebné kvality.

Dále je problematické využití interferometrů známých z jiných oblastí techniky z hlediska nevhodnosti jejich detekčních a měřicích parametrů, v oblastí převedení laserového interferenčního obrazce s proměnnou intenzitou záření na stínítku na elektrický signál, který je možno dále zpracovat a vyhodnotit jako změnu rozměrů vzorku.

Známý interferometrický způsob odměřování délek představuje čítání impulzů odvozených od průchodu harmonického signálu fotodetektoru uzlem (nulou), přičemž změna rozměru je získávána jako celistvý násobek vlnové délky, případně její poloviny.

Pro přesné měření fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků je žádoucí lepší rozli25 šení než je 1/2 vlnové délky použitého záření. To předpokládá přesné odměřování relativních hodnot amplitudy optického signálu z detektorů, z nichž je pak určena fáze signálu a je možno stanovit změnu rozměrů na zlomek vlnové délky.

Komplikace v tomto směru představuje nestabilní intenzita laserového svazku, která se mění v důsledku časové a teplotní nestability laserového generátoru. Problematické je rovněž zatížení snímaného signálu šumem, který je převážně generován vlastními kmity mechanického snímacího zařízení, vzniká zde mikrofonní efekt, a dále jsou snímány vibrace budovy a další náhodné signály které znemožňují přesné určení relativní amplitudy signálu z fotodetektoru a následně určení fáze. Vlastní měřený signál je zatížen rušivým signálem, obsahujícím kromě harmonic35 kých a n-harmonických složek i náhodné jevy.

Úkolem vynálezu je zdokonalit způsob interferenčního laserového měření vzdáleností a objemových změn tak, aby byl vhodný pro výzkum dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků in vivo, a vytvořit zařízení k provádění tohoto způsobu. Cílem vynálezu je zdokonalit stávající metody výzkumu a přesněji kvantifikovat a měřit procesy nefotochemické povahy při fotosyntéze, např. u kapalných vzorků, rostlinných vzorků a celých rostlin ve stavu v jakém žijí.

Podstata vynálezu

Pod pojmem „dynamika objemových změn“ se v tomto vynálezu rozumí kontinuální časový záznam změn objemu vzorku, odpovídajících rozměrovým změnám v řádu desítek nanometrů až jednotek mikrometrů, a s časovým rozlišením v řádu milisekund až desítek minut.

Absorpce světelného záření ve vyšších rostlinách (obecně ve všech fotosynteticky aktivních organismech) vyvolává dynamické tlakové změny uvnitř buněk listové tkáně, a to v důsledku vývoje molekulárního kyslíku, fixace CO₂, tepelné expanze, povrchových deformací atd. Tyto procesy způsobují detegovatelné objemové změny vzorku v řádu nejméně stovek nm. Změna

-3CZ 301826 B6 objemu vzorku tak poskytuje možnost kvantifikovat teplotní a další fotosyntetické procesy ve vzorku. Cílem je proto co nejpresněji změřit transverzální změnu rozměru vzorku.

Cíle je dosaženo způsobem výzkumu dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména foto5 synteticky aktivních vzorků vystavených působení viditelného záření, podle tohoto vynálezu. Podstata navrženého způsobu spočívá v tom, že se využívá měření transverzálních změn objemu vzorku pomocí interferenčního principu, přičemž zdrojový svazek monochromatického vysoce koherentního záření vycházející z laserového zdroje se na prvním děliči svazku rozdělí do dvou na sebe kolmých svazků. Měřicí svazek přes nastavitelné zrcadlo dopadá na odrazný terč s vyso10 ce reflexivním povrchem, který je v mechanickém kontaktu s povrchem měřeného vzorku, a referenční svazek dopadá na pevné referenční odrazové zrcadlo. Po odrazu a zpětném průchodu prvním děličem svazku spolu měřicí svazek a referenční svazek interferují, a z fázového rozdílu harmonických vln ve svazku interferujícího záření se zjistí transverzální změna pozice povrchu měřeného vzorku jako důsledek jeho objemové změny. Odrazný terč odděluje svazek intenzivní15 ho laserového záření od vlastního vzorku, takže nemůže dojít kjeho poškození při měření, ani k ovlivnění v něm probíhajících fotosyntetických procesů. Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se svazek interferujícího záření dále rozdělí na druhém děliči svazku na dva detekční svazky, kde první detekční svazek prochází první spojnou čočkou a dopadá na první fotodetektor, a druhý detekční svazek, kolmý na první detekční svazek, prochází druhou spojnou

Čočkou a je veden na druhý fotodetektor, přičemž fotodetektory jsou vůči sobě navzájem v interferogramu fázově posunuty o 90°, a signály z fotodetektorů se vedou do vyhodnocovací jednotky spojené s počítačem.

Fotodetektory mohou být např. fotodiody, fototranzistory, kanálkové násobiče, nebo tzv. ΡΓΝ (positive/intrinsitic/negative) detektory, tzn. detektory s tzv. rychlými PIN - diodami. Použití fototranzistorů má tu výhodu, že vzhledem k jejich miniaturním rozměrům je lze umístit vedle sebe do jednoho interferogramu.

Fázové posunutí fotodetektorů vůči sobě o 90° v zaznamenávaném interferogramu umožňuje při následném vyhodnocení interferogramu zjistit smysl rozměrové změny vzorku,

Z hlediska ochrany fotodetektorů před rušivým vlivem okolního rozptýleného záření je výhodné, když detekční svazky před dopadem na fotodetektory procházejí absorbéry rozptýleného záření, což jsou válcové tubusy, jejichž délka je řádovým násobkem délky fotodetektoru.

V jiném výhodném provedení se detekce a vyhodnocení svazku interferujícího záření provádí tak, že svazek interferujícího záření se opět rozdělí na druhém děliči svazku na dva detekční svazky, kde ale první detekční svazek prochází první spojnou čočkou a dopadá současně na první fotodetektor a druhý fotodetektor, přičemž tyto dva fotodetektory jsou vůči sobě navzájem v interferogramu fázově posunuty o 90°, a druhý detekční svazek, kolmý na první detekční svazek, dopadá na třetí referenční fotodetektor, který snímá celý interferenční obrazec, a signály z fotodetektorů se vedou do měřicí jednotky, která je přes interface propojena s počítačem. Výhoda tohoto způsobu spočívá v potlačení rušivých signálů stochastické povahy a ve zlepšení měřicího rozlišení. Také zde je výhodné, když detekční svazky před dopadem na fotodetektory procházejí absorbéry rozptýleného záření, aby se chránily před vlivem okolního rozptýleného záření.

Při zpracování měřených signálů se s výhodou postupuje tak, že signály z fotodetektorů se v měřicí jednotce přivádí na základní modul, kde signál třetího referenčního fotodetektoru po zpracování v zesilovači udává střední hodnotu intenzity záření jako referenční úroveň v referenčním signálu. Signály z prvního fotodetektoru a druhého fotodetektoru se po zpracování v zesilovačích a potlačení rušivých signálů aktivními filtry typu dolní propust převádějí na symetrické střídavé signály s potlačenou stejnosměrnou složkou pomocí referenčního signálu. Ze signálu prvního fotodetektoru se oddělí jeho střídavá složka a následně se pomocí tvarovače a pomocí řídicího a sekvenčního obvodu, který vysílá řídicí signály pro vzorkovací zesilovače,

-4CZ 301826 B6 odebírají vzorky střídavých signálů prvního fotodetektoru a druhého fotodetektoru pro eliminaci rušivých jevů s velkými amplitudami. Na výstupu z řídicího a sekvenčního obvodu se měří napětí odpovídající frekvenci rušivých signálů, přičemž základní modul je pomocí analogově-dígitálních převodníků a interface propojen s počítačem.

Detekce, filtrace, předzpracování a vzorkování signálů a jejich digitalizace umožňuje následné rychlé vyhodnocení změny rozměru vzorku v reálném Čase pomocí řídicího a vyhodnocovacího programu, přičemž jsou eliminovány teplotní závislosti zdroje i fotodetektoru a také rušivé signály elektrického a mechanického původu, io

Při měření vzorků v kapalném stavu je výhodné, když se odrazný terč udržuje silou povrchového napětí na hladině kapalného měřeného vzorku v kyvetě, a měření transverzální změny rozměru vzorku se tak provádí přímo v této kyvetě.

Při měření vzorků v pevném stavu, např. listů rostlin je výhodné, když odrazný terč je uložen na pohyblivé optomechanické přenosce, která je opatřena alespoň jedním kontaktním trnem dosedajícím na povrch pevného měřeného vzorku uspořádaného v držáku pevných vzorků v zatemňovací komůrce, přičemž na vzorek dopadá viditelné záření ze zdroje. Metoda je maximálně šetrná k měřenému vzorku, takže měření kapalných i pevných vzorků lze provádět ve stavu w vivo.

Dále je výhodné, když se k držáku pevných vzorků připojí fluorimetr a měří se indukovaná fluorescence chlorofylu ze vzorku, takže lze porovnávat časový průběh fluorescenční křivky s naměřenými transverzálními změnami rozměrů. Nakonec je výhodné, když v zatemňovací komůrce v držáku pevných vzorků se na povrch vzorku působí plynným médiem, ovlivňujícím fyziologický status vzorku, takže lze výzkum zaměřit na kombinaci různých fotosynteticky účinných podnětů.

Předmětem vynálezu je také zařízení pro výzkum dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků. Jeho podstata spočívá v tom, že zahrnuje interferometr pro měření transverzální změny pozice povrchu měřeného vzorku, sestávající z laserového zdroje monochromatického vysoce koherentního záření, z prvního děliče svazku rozdělujícího zdrojový svazek na měřicí svazek a referenční svazek, z nastavitelného zrcadla pro směrování měřicího svazku na vzorek, z referenčního odrazového zrcadla pro odraz referenčního svazku, a z alespoň jednoho fotodetektoru. Na tento fotodetektor dopadá svazek interferujícího záření složený z odraženého měřicího svazku a referenčního svazku přes spojnou čočku. Fotodetektor je připojen na vstup vyhodnocovací jednotky nebo měřicí jednotky propojené s počítačem. Zařízení dále zahrnuje odrazný terč s vysoce reflexivním povrchem, který je v mechanickém kontaktu s povrchem měřeného vzorku, a na který dopadá měřicí svazek.

V jednom výhodném provedení zařízení, které pracuje s dostupnou vyhodnocovací jednotkou, je v dráze svazku interferujícího záření uspořádán druhý dělič svazku, ze kterého vychází první detekční svazek procházející první spojnou čočkou a dopadající na první fotodetektor, a druhý detekční svazek, kolmý na první detekční svazek, procházející druhou spojnou čočkou a dopada45 jící na druhý fotodetektor. Fotodetektory jsou vůči sobě navzájem v zaznamenávaném interferogramu fázově posunuty o 90°, a jejich výstupy jsou připojeny na vstup vyhodnocovací jednotky spojené s počítačem. Toto zapojení umožňuje vyhodnotit a zaznamenat jak hodnotu, tak smysl změny rozměrů měřeného vzorku, v časovém rozlišení od jednotek vteřin do desítek minut, a s rozměrovou přesností odpovídající hodnotě V8, tj. v řádu desítek nanometrů.

V jiném výhodném provedení zařízení, které pracuje se speciální nově navrženou měřicí jednotkou, je v dráze svazku interferujícího záření uspořádán druhý dělič svazku, ze kterého vychází první detekční svazek procházející první spojnou čočkou a dopadající současně na první fotodetektor a druhý fotodetektor, přičemž fotodetektory jsou vůči sobě navzájem v interferogramu fázově posunuty o 90°. Druhý detekční svazek, kolmý na první detekční svazek, dopadá na třetí

-5CZ 301826 B6 referenční fotodetektor, přičemž výstupy fotodetektorů jsou připojeny na vstup měřicí jednotky propojené přes interface s počítačem. Toto provedení umožňuje vyhodnotit a zaznamenat jak hodnotu, tak smysl změny rozměrů měřeného vzorku, navíc eliminuje při měření rušivé signály stochastické povahy a zlepšuje časové i rozměrové rozlišení měření.

Z hlediska ochrany fotodetektorů před rušivým vlivem okolního rozptýleného záření je výhodné, když každý fotodetektor je opatřen absorbérem rozptýleného záření, který má tvar válcového tubusu několikrát delšího než fotodetektor, io Speciální měřicí jednotka obsahuje základní modul, který je pomocí analogově-digitálních převodníků přes interface propojen s počítačem, a na kterém jsou vstupy od prvního a druhého fotodetektoru přivedeny na zesilovače a aktivní filtry typu dolní propust pro potlačení rušivých signálů, převedeny na střídavé signály v diferenčních zesilovačích odečtením stejnosměrné složky signálu třetího referenčního fotodetektorů a vedeny do vzorkovacích zesilovačů. Signál prvního fotodetektorů je přiveden do tvarovače a pak do řídicího a sekvenčního obvodu, ze kterého vystupují řídicí signály pro odběr vzorků střídavých signálů ve vzorkovacích zesilovačích, a který je opatřen výstupem napětí odpovídajícího frekvenci rušivých signálů. Vstup od třetího referenčního fotodetektorů je přiveden na zesilovač, a jako referenční signál je přiveden na diferenční zesilovač a vyveden i jako samostatný výstup.

Zapojení základního modulu má výhodu především v tom, že na rozdíl od dosud známých zařízení nepočítá pouhé průchody měřeného signálu nulou (uzlem), ale měřené signály jsou předzpracovány, digitalizovány a vyhodnoceny tak, že rozměrové rozlišení je zlepšeno pod hodnotu V8 kde i je vlnová délka použitého záření, a časové rozlišení pokrývá škálu od jednotek mili25 sekund do desítek minut. Výhoda základního modulu spočívá i v tom, že elektronickou cestou eliminuje vliv rušivých signálů stochastické povahy na výsledek měření, a vyrovnává teplotní závislosti zdroje laserového a aktinického záření a fotodetektorů.

Vzorková část zařízení pro měření kapalných vzorkuje s výhodou řešena tak, že odrazný terč je tvořen tenkou skleněnou destičkou opatřenou na povrchu tenkou napařenou reflexivní vrstvou ze zlata, a je uspořádán na hladině kapalného měřeného vzorku v kyvetě, kde je udržován silami povrchového napětí.

Skleněná destička má s výhodou tloušťku 0,05 mm a je čtvercového tvaru o straně kratší než 4 mm, s hmotností menší než 6 mg, a síla vrstvy zlata je menší než 1 pm.

Kyveta s měřeným kapalným vzorkem je buď otevřená (pak je nutno počítat s odparem kapalné fáze vzorku), neboje překryta krycím sklem utěsněným těsnicím tmelem.

Výhodné provedení vzorkové části zařízení upravené pro měření pevných vzorků je vyřešeno tak, že odrazný terč je uspořádán na pohyblivé optomechanické přenosce, opatřené alespoň jedním kontaktním trnem dosedajícím na povrch pevného měřeného vzorku. Vzorek je přitom uspořádán v držáku pevných vzorků v zatemňovací komůrce, která je propojena se zdrojem viditelného záření dopadajícího na měřený vzorek. Laserový svazek tak nedopadá přímo na povrch měřeného vzorku, a transverzální změny objemu vzorku se pomocí přenosky převádějí do snímané transverzální změny pozice odrazného terče. Z hlediska jednoduchosti konstrukce je výhodné, když držák pevných vzorků sestává z kruhové spodní příruby a kruhové horní příruby, které jsou spolu navzájem rozebíratelně spojeny, a mezi jejich přivrácenými stranami je vytvořena zatemňovací komůrka pro měřený vzorek. V horní přírubě je vytvořen měřicí otvor pro kontaktní tm přenosky, a ve spodní přírubě je vytvořen uzavíratelný osvětlovací otvor. Toto provedení umožňuje jednoduché a rychlé vkládání a vyjímání měřeného vzorku, a snadné upnutí celého držáku se vzorkem do nezobrazeného stojanu na odpruženém optickém stole.

Dále je výhodné, když ke spodní přírubě je otočně upevněn přesuvný kryt pro zakrytí a odkrytí osvětlovacího otvoru, opatřený trubkovým nástavcem pro světlovodič připojený ke zdroji viditel-6CZ 301826 B6 ného záření a k fluorimetru. Posouváním přesuvného krytu je umožněno zatemňování nebo osvětlování vzorku. Světlovodič umožňuje jednak osvětlování vzorku viditelným zářením, zvolené intenzity a jednak také měření indukované fluorescence chlorofylu ze vzorku.

Také je výhodné, když na přivrácených stranách spodní příruby a homí příruby jsou protilehle upevněna světlo nepropouštějící a pro vzduch průlinčitá těsnění ve tvaru mezikruží, jejichž vnitřní obvod ohraničuje prostor zatemňovací komůrky. Mezi těsnění lze šetrně Fixovat plochý měřený vzorek, např. list.

Těsnění je s výhodou vytvořeno z černého měkkého pěnového materiálu, který znemožňuje světlu z okolí pronikat dovnitř zatemňovací komůrky, ale nebrání výměně plynů s okolím.

Poněvadž těsnění je průlinčité, umožňuje ventilaci plynného média ovlivňujícího fyziologický status vzorku. Pro tento účel jsou s výhodou spodní příruba i homí příruba v oblasti těsnění opat15 řeny otvory s nátrubky pro připojení plynného média, a vrtáními propojujícími nátrubky s vnitřní částí zatemňovací komůrky. Plyn tak může proniknout k povrchu měřeného vzorku v zatemňovací komůrce z obou stran, a odchází skrz průlinčité těsnění.

Ve výhodném konstrukčním provedení optomechanické přenosky je přenoska uložena v horizontální poloze na britu s možností výkyvného pohybu kolem kyvné osy. Mezi kontaktním trnem a kyvnou osou je otočně uloženo vertikálně uspořádané kyvné rameno s vyrovnávacím závažím, které nese horizontálně uspořádaný odrazný terč. Kyvné rameno zajišťuje udržení odrazného terče ve stálé horizontální poloze i při výkyvném pohybu přenosky. Upevnění odrazného terče je s výhodou provedeno tak, že na vrcholu kyvného ramene je nosič nesoucí odrazný terč tvořený podložkou z materiálu Si/SiO₂ s napařenou vysoce reflexivní tenkou vrstvou zlata.

Samotná přenoska je vytvořena ze dvou lehkých nosníků spojených alespoň jednou příčkou do tvaru „V“, kontaktní tm je upevněn v oblasti spoje „V“, a kyvné rameno je upevněno na ose otočně uložené napříč na nosnících. Odrazný terč je perpendikulámě uspořádán na vrcholu kyv30 ného ramene nad rovinou nosníků. Pro optimální vyvážení a správnou funkci přenosky jsou vzdálenosti mezi kontaktním trnem a kyvným ramenem a mezi kyvným ramenem a kyvnou osou v poměru 1 : 4, a tento poměr se bere v úvahu při přepočítávání změny transverzální pozice odrazného terče na transverzální změnu rozměrů měřeného vzorku.

Předložený způsob výzkumu dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků, a zařízení k provádění tohoto způsobu, reprezentuje novou techniku laboratorního výzkumu fotosyntézy v kapalných vzorcích, listových segmentech, neporušených listech i celých rostlinách in vivo, bez jejich destrukce či poškození, v reálném čase, což představuje hlavní výhodu oproti dosavadnímu stavu techniky. Další výhody vynálezu lze spatřovat ve zlep40 šení rozměrové přesnosti a časového rozlišení měření a eliminaci rušivých vlivů na získané výsledky. Zařízení podle vynálezu umožňuje současně s interferometrickým měřením zaznamenávat rovněž časový průběh fluorescence chlorofylu indukované v měřeném vzorku, což má zásadní význam pro kvantitativní stanovení účinností tří hlavních procesů probíhajících během fotosyntetické přeměny zářivé energie - fotochemie, teplotní disípace a fluorescence. Miniaturi45 zace jednotlivých součástí zařízení umožní v blízké budoucností využití předloženého způsobu a zařízení i pro studium a výzkum fotosyntézy v přírodních (polních) podmínkách. Zařízení podle vynálezu má dále výhodu ve výrazně nižší ceně oproti aparaturám pro fotoakustická měření.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude blíže osvětlen pomocí výkresů, na nichž znázorňují obr. 1 blokové schéma zařízení pro výzkum dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních pevných vzorků, se dvěma PÍN - detektory, komerční vyhodnocovací jednotkou a počítačem, obr. 2 blokové schéma téhož zařízení se třemi fotodetektoiy a speciálním měřicím modulem propoje-7CZ 301826 B6 ným s počítačem, obr. 3 blokové schéma zapojení měřicí jednotky, obr. 4 blokové schéma základního modulu měřicí jednotky, obr. 5 vertikální řez držákem pevných vzorků, obr. 6 pohled zespoda na spodní přírubu držáku pevných vzorků, obr, 7 půdorys optomechanické přenosky, obr. 8 bokorys optomechanické přenosky, obr. 9 detail vzorkové části zařízení upravené pro měření kapalných vzorků, obr. 10 příklad výstupů zařízení pro výzkum dynamiky objemových změn podle vynálezu.

Příklady provedení vynálezu io

Rozumí se, že dále popsané a zobrazené konkrétní příklady uskutečnění vynálezu jsou představovány pro ilustraci, nikoli jako omezení příkladů provedení vynálezu na uvedené případy. Oborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování větší či menší počet ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána. 1 tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.

Zařízení pro výzkum dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků podle vynálezu je uspořádáno na nezobrazeném optickém stole s úpravou tlumicí vibrace okolního prostředí, a na pevném laboratorním stole. Za vzorky lze považovat např. vyšší rostliny in vivo, bakterie, řasy, suspenze chloroplastů apod.

Měřený vzorek 1 může být v kapalném stavu nebo v pevném stavu. Kapalný měřený vzorek 1, zobrazený na obr. 9, je v kyvetě 42 stojící na pevné podložce 45. Kyveta 42 je uspořádána v nezobrazeném známém zařízení umožňujícím střídání temnotní fáze a fáze osvitu viditelným zářením. Na hladině měřeného vzorku X je odrazný terč 7 s vysoce reflexivním povrchem, na který dopadá měřicí svazek 5 interferometru, a který odděluje laserové záření od vzorku I.

Měřený vzorek i může být i v pevném stavu, může jít např. o listy či jiné části rostlin, popř. o celé rostliny. Měřený pevný vzorek i je fixován během výzkumu v držáku 30 pevných vzorku v zatemňovací komůrce 46, kde na něj působí viditelné záření 23 ze zdroje 22, a jeho povrch je v mechanickém kontaktu s odrazným terčem 7 s vysoce reflexivním povrchem, na který dopadá měřicí svazek 5 interferometru, a který odděluje intenzivní laserové záření od vzorku i, aby nedošlo k jeho poškození.

Vlastní způsob výzkumu dynamiky objemových změn, spočívající v měření transverzální změny Ah pozice povrchu měřeného vzorku Jjako důsledek jeho objemové změny, je schematicky znázorněn na obr. 1 až obr. 4.

Laserový zdroj 3 koherentního záření s napájecí jednotkou 28, tvořený HeNe laserem, emituje zdrojový svazek 2 monochromatického koherentního záření. Kontinuální výkon zdroje 3 je max. 15mW, průměr zdrojového svazku 2 je menší než 2 mm, vlnová délka λ = 632,8 nm. Zdrojový svazek 2 se na prvním děliči 4 svazku rozdělí do dvou na sebe kolmých směrů. Referenční svazek 6 se odráží pod úhlem 90°, dopadá na pevné referenční odrazné zrcadlo 8, a po odrazu od něho prochází zpět prvním děličem 4 svazku v přímém směru. Měřicí svazek 5 nejprve prochází v přímém směru prvním děličem 4 svazku, odráží se kolmo dolů od nastavitelného zrcadla 21, které je tvořeno standardním totálně odrazným nastavitelným zrcadlem, a dopadá na odrazný terč 7, který je v mechanickém kontaktu s povrchem měřeného vzorku 1. Odrazný terč 7 se při pohybu povrchu měřeného vzorku 1 dostává do pozice T_ která odpovídá transverzální změně Ah pozice povrchu měřeného vzorku 1, a měřicí svazek 5 se v reálném čase odráží od pozic odrazného terče 7 a 71 Po odrazu se vrací měřicí svazek 5 zpět pres nastavitelné zrcadlo 21 k prvnímu děliči 4 svazku, na kterém změní svůj směr o 90° a postupuje dále společně s odraženým referenčním svazkem 6. Oba svazky 5, 6 interferují, a z fázového rozdílu harmonických vln ve svazku interferujícího záření 9 se zjistí transverzální změna Ah pozice povrchu měřeného vzorku

1 jako důsledek jeho objemové změny.

-8CZ 301826 B6

Způsob a zařízení pro detekci, vyhodnocení a měření svazku interferujícího záření 9 jsou popsány ve dvou příkladech provedení, které odpovídají částem schématu A, B na obr. 1 a obr. 2.

V prvém příkladu provedení, znázorněném na obr. 1, se svazek interferujícího záření 9 po odrazu od pevného zrcadla 29 rozdělí na druhém děliči JO svazku na dva detekční svazky 11, ]_3. První detekční svazek 11, který prochází druhým děličem JO svazku přímo, prochází dále první spojnou čočkou 26, prochází absorbérem rozptýleného záření J7 a dopadá na první PIN (positive/íntrinsitic/negative) detektor J2. Druhý detekční svazek J3 vychází z druhého děliče JO svazku kolmo na první detekční svazek 11, odráží se pod úhlem 90° od pevného zrcadla 29', prochází druhou spojnou čočkou 27, prochází absorbérem rozptýleného záření J8 a dopadá na druhý PIN detektor J4. Signály z PIN detektorů 12, J4 se vedou do vyhodnocovací jednotky J5 spojené s počítačem J6.

Měření a vyhodnocení vzorku 1 probíhá na základě známého interferenčního principu, kde dráhový rozdíl měřícího svazku 5 a referenčního svazku 6 přímo souvisí s fázovým rozdílem harmonických vln svazku interferujícího záření 9. Výsledkem je interferenční obrazec (interferogram), tj. vhodným způsobem zobrazená soustava světlých a tmavých proužků, které reprezentují místa tzv. konstruktivní a destruktivní interference. Pohyb interferenčních proužků se v čase mění v souvislosti s pohybem odrazného terče 7 a výsledná proměnlivá intenzita svazku interferujícího záření 9 je snímána pomocí PIN detektorů 12, J4. Oba PIN detektory 12, J4 zaznamenávají identický interferogram. Jsou-li vůči sobě fázově posunuty o 90°, lze v čase identifikovat změny směru pohybu povrchu měřeného vzorku 1 v transverzální rovině, tzn. zaznamenat zda se vzorek J v tomto směru objemově zvětšuje či zmenšuje. Fotocitlivá plocha každého PIN detektoru 12, J4 je 1 cm².

Vyhodnocovací jednotka J5 a počítač J6 vyhodnocují zaznamenaný interferogram pomocí programu v prostředí MATLAB: function [rx ry]=pocetvln (x,yl, y2);

[mousx mousz mousy]=mause (x,yl, y2);

[sl s2]=size (yl);

[msl ms2]=size (mousx);

mus=l;

dir=l;

treshold=0,7;

e=0;

h=0;

prirustek=l;

for i=(l:s2); a=yl (l,i); if(dir=l); if (a>treshold); e=e+l;

iť(mus<=ms2) if(x( 1 ,i)>mousx (1 ,mus)) přírůstek—přírůstek; mus-mus+1;

-9CZ 301826 B6 end end h=h+prirustek;

ry(1,e)=h;

rx( 1 ,e)=x( 14) ; dir=-l; end end to if (dii==-1);

if (a<-treshold);

e=e+l;

if(mus<=ms2) if( x( 1 ,i)>mousx( 1 ,mus)) prinistek=-prirustek;

mus=mus+1;

end end h=h+prirustek;

ry(l,e)=h;

rx(l,e)=x(l,i);

dir=l;

end end end;

ry=ry./4.*632.8;

plot(rx,ry);

function [k 1 n]=mause(x,y,yl);

hold ofT; plot(x,y);

hold on;

plot(x,yl,'color',Y);

axis([min(x-50) max(x+50) min(y-l) max(y+l)];

i=i;

c=3;

w=0;

sign=l;

title('count up');

k(1,l)=0;

l(U)=0;

while (c~=2) [a b c]=ginput(l); if(c=3) [p q r]=ginput(1);

if(r=3) if (a<p) axis([ap q b]);

else sign=-sign;

-10CZ 301826 B6 if(sign=-l) titlefcount down'); else title( count up');

end end else axis([min(x-50) max(x+50) min(y-l) max(y+l)]); end io end if(c-l) k(l,i)=a;

i5 1(1,i>b;

w=w+sign;

n(l,i)=w;

i=i+l;

end iMUH) plot(k,l,'*','color','g);

end end k=sort(k); holdoff;

Ve druhém příkladu provedení, znázorněném na obr. 2, se svazek interferujícího záření 9 po odrazu od pevného zrcadla 29 rovněž rozdělí na druhém děliči JO svazku na dva detekční svazky

JI, 13.

První detekční svazek JJ prochází první spojnou čočkou 26 a dopadá současně na první fotodetektor J2 a druhý fotodetektor 14, oba opatřené absorbéry rozptýleného záření 17, 18 a vůči sobě navzájem v interferogramu fázově posunuté o 90°. Druhý detekční svazek J3, který vychází z druhého děliče JO svazku kolmo na první detekční svazek JJ, dopadá přímo na třetí referenční fotodetektor 3J opatřený rovněž absorbérem rozptýleného záření 32. Zatímco signály z fotodetektorů 12, J4 dávají obdobné informace pro vyhodnocení jako v prvním příkladu provedení, třetí referenční fotodetektor 3J snímá celý interferenční obrazec a udává tak střední hodnotu intenzity záření, která slouží jako referenční úroveň. Tímto způsobem se odstraní náhodné změny amplitudy způsobené použitým laserovým zdrojem 3, a je také dostatečně kompenzována teplotní závislost použitých fotodetektorů 12,14,3J·

Fotodetektory 1.2, 14, 3J mohou být např. fotodiody, jak je znázorněno ve schématu na obr. č. 2, nebo může jít o fototranzistory a jiné fotocitlivé prvky.

V případě použití fototranzistorů je díky jejich miniaturizaci aktivní fotocitlivá plocha každého z nich velká cca 3 mm², takže je lze použít vedle sebe v jednom interferogramu.

Signály z fotodetektorů 12, 14, 3J se přivádějí do speciální měřicí jednotky 33, jejíž hlavní sou50 částí je základní modul 35 obsahující zesilovače 36, aktivní filtry 37 typu dolní propust, tvarovač 38, řídicí a sekvenční obvod 39, vzorkovací zesilovače 40, přepínače signálu, budiče sběrnice, spínací obvod, převodník frekvence/napětí aj.

Signály z fotodetektorů 12, J4, 3J se v měřicí jednotce 33 přivádí do základního modulu 35. kde signál třetího referenčního fotodetektorů 31 po zpracování v zesilovači 36 udává střední hodnotu

-11 CZ 301826 B6 intenzity záření jako referenční úroveň v referenčním signálu (Sr), a signály z prvního fotodetektoru 12 a druhého fotodetektoru H se po zpracování v zesilovačích 36 a potlačení rušivých signálů aktivními filtry 37 typu dolní propust převádějí na symetrické střídavé signály Sl, $2 s potlačenou stejnosměrnou složkou pomocí referenčního signálu Sr, Dále se ze signálu prvního fotodetektoru 12 oddělí jeho střídavá složka pomocí tvarovače 38, a pomocí řídicího a sekvenčního obvodu 39, který vysílá řídicí signály S/H1 a S/H2 pro vzorkovací zesilovače 40, se odebírají vzorky střídavých signálů SJ_ a S2 prvního fotodetektoru J2 a druhého fotodetektoru .14 pro eliminaci rušivých jevů s velkými amplitudami. Na výstupu z řídicího a sekvenčního obvodu 39 se měří napětí Sf odpovídající frekvenci rušivých signálů. Základní modul 35 je pomocí tří anaio logově-digitálních převodníků 44 a interface 34 propojen s počítačem 16.

Pro potlačení rušivých signálů mechanického i elektrického původu (nežádoucích vyšších frekvencí a vyšších harmonických složek náhodných signálů) slouží aktivní filtry 37 typu dolní propust, které potlačují rušivé signály se zachováním jeho stejnosměrné složky. Základní frekvenci t5 rušivých signálů je možno monitorovat měřením napětí na výstupu Sf z převodníku frekvence/napětí v řídicím a sekvenčním obvodu 39. Signál z fotodetektoru 12, 14 interferogramu je po filtraci ve filtrech 37 pomocí referenční úrovně Sr převeden na signál symetrický střídavý Si, S2 s potlačenou stejnosměrnou složkou. Na základě signálů z fotodetektorů 12, 14, navzájem vůči sobě posunutých o 90°, je možno určit smysl transverzální změny Ah pozice povrchu měřeného vzorku 1, a zpětně z amplitudy signálu také jeho fázi, respektive velikost změny Ah rozměru vzorku i.

Pro eliminaci náhodných a některých periodických rušivých jevů velkých amplitud je základní modul 35 doplněn možností synchronního odběru okamžité hodnoty signálů Sl, S2 z fotodetek25 torů 12,14 interferogramu. Ze signálu Sl fotodetektoru 12 je oddělena jeho střídavá složka. Fáze střídavé složky signálu je pak použito pro synchronní odběr vzorků signálu Sl, S2, pomocí řídicího a sekvenčního obvodu 39, se kterým spolupracuje počítač 16,

Předzpracování výstupů měření v základním modulu 35 resp. v měřicí jednotce 33 umožňuje následné rychlé vyhodnocení dynamiky objemových změn měřeného vzorku 1 pomocí řídicího a vyhodnocovacího software.

Algoritmus programu, umožňuje vyhodnocení zaznamenaného interferogramu, tj. přepočet fázového rozdílu měřicího svazku 5 a referenčního svazku 6 na dráhový rozdíl, který je lineární mírou transverzální změny Ah pozice povrchu měřeného vzorku 1, on-line v reálném čase.

V dalším příkladu provedení, znázorněném na obr. 5 až obr. 8 je vyřešena vzorková část zařízení podle vynálezu pro měření na rostlinách in vivo, na oddělených listech rostlin, popř. na jiných částech rostlin.

Multifunkční držák 30 pevných vzorků 1, znázorněný na obr. 5 a obr. 6 umožňuje uchycení pevných vzorků 1, a to jak oddělených listů, tak součástí rostlin (např. intaktních listů, stonků) in vivo v zatemňovací komůrce 46, a manipulaci se vzorky 1 během výzkumu. Držák 30 je vyroben z hliníkové slitiny a sestává z kruhové spodní příruby 47 a kruhové homí příruby 48, které jsou navzájem spojeny na jedné straně výklopně pomocí Čepu 49 a na druhé straně pomocí aretačního šroubu 50. Mezi příruby 47 a 48 se po odklopení homí příruby 48 vloží měřený vzorek I, homí příruba 48 se přiklopí a aretuje aretačním šroubem 50. Ke spodní přírubě 42 je upevněno nosné rameno 51, které lze upnout do nezobrazeného upínacího zařízení. Uvnitř držáku 30 je vytvořena zatemňovací komůrka 46, a ve spodní přírubě 47 je vytvořen v oblasti zatemňovací komůrky 46 osvětlovací otvor 52, který lze zakrýt presuvným krytem 53 upevněným otočně na spodní straně spodní příruby 47 pomocí justážního šroubu 54. Přesuvný kryt 53 je v části své plochy plný, takže v jedné úhlové poloze zakrývá osvětlovací otvor 52, a v části své plochy je opatřen otvorem 55 s trubkovým nástavcem 56, který v druhé úhlové poloze přesuvného krytu 53 odpovídá poloze osvětlovacího otvoru 52. Do trubkového nástavce 56 se zasune nezobrazené válcové zakončení víceramenného světlovodiče, v němž některá ramena vedou viditelné záření 23 (např. aktinické

- 12CZ 301826 B6 světlo) ze zdroje 22 k povrchu měřeného vzorku i, a jedno rameno odvádí indukovanou fluorescencí 24, která může být měřena fluorimetrem 25, jak je znázorněno na obr. 1 a obr. 2. Držák 30 tak umožňuje společné nebo oddělené provádění fluorescenčních i interferenčních měření pevných vzorků 1.

V homí přírubě 48 je vytvořen měřicí otvor 57, kterým prochází kontaktní tm 20 optomechanické přenosky 19, lehce dosedá na povrch měřeného vzorku 1, a přenáší transverzální změnu Ah pozice povrchu měřeného vzorku I jako důsledek jeho objemových změn na odrazný terč 7, kde je změna pozice dynamicky sledována měřicím svazkem 5 a následně vyhodnocena na základě ΐΰ interference s referenčním svazkem 6 (viz. obr. 1 a obr. 2).

Na přivrácených stranách spodní příruby 47 a homí příruby 48 jsou těsnění 58 ve tvaru mezikruží, vytvořená z černého měkkého pěnového materiálu na bázi polyuretanu, který je neprostupný pro světlo, ale průlinčitý pro vzduch. Tato těsnění 58 umožňují jednak šetrnou fixaci vzorku 1 v definované pozici v držáku 30, jednak zatemňují část vzorku 1 v zatemňovací komůrce 46, a nakonec umožňují i ventilaci směsí plynů, zejména vzduchem obohaceným nebo ochuzeným o CO₂ a Oj v zatemňovací komůrce 46, a jejich působení na fotosyntetický aparát měřeného vzorku 1. K tomu slouží nátrubky 59 na spodní přírubě 47 a homí přírubě 48, kterými lze plyn vhánět skrze vrtání 60 do zatemňovací komůrky 46. PH výzkumu tak lze měřený vzorek 1 ovlivňovat jednak teplotou, dále zdrojem 22 viditelného záření 23, a nakonec i působením plynů přes nátrubky 59 a těsnění 58.

Optomechanická přenoska j9 slouží k přenosu transverzálních změn objemu měřeného vzorku I, upevněného v držáku 30, během výzkumu na vyšších rostlinách, a to jak u celých rostlin in vivo, tak i u jejich oddělených částí.

Přenoska 19 je tvořena dvěma nosníky 6} z lehkého materiálu, např. ze dřeva, plastu apod., které jsou navzájem spojeny do tvaru „V“ a vyztuženy příčkami 62. V oblasti spoje „V“ je kolmo na nosníky 61 upevněn kontaktní tm 20 s hrotem, který dosedá na povrch měřeného vzorku i. Pře30 noska 19 je uložena na pevném břitu 63 s možností výkyvného pohybu kolem kyvné osy 64, přičemž výkyvný pohyb probíhá ve velmi malých úhlových rozmezích, v závislosti na pohybu povrchu měřeného vzorku i tj. např. listu. Mezi kontaktním trnem 20 a kyvnou osou 64 je vertikálně uspořádáno kyvné rameno 65 $ vyrovnávacím závažím 66, které je otočně uloženo na ose 67 probíhající napříč přes nosníky 61 a uložené ve vybráních v těchto nosnících 61.. Kyvné rame35 no 65, vyrovnávací závaží 66 a osa 67 jsou z kovu. Na vrcholu kyvného ramene 65 nad nosníky 61 je na nosiči 68 horizontálně upevněn odrazný terč 7, který je tvořen vysoce odrazivou vrstvou zlata napařeného na Si/SiOj podložce. Uložení odrazného terče 7 na kyvném rameni 65 slouží k tomu, aby se při pohybu přenosky 19 v důsledku transverzální změny pozice povrchu vzorku 1 udržoval odrazný terč 7 stále v horizontální poloze i v pozici T_ odpovídající této transverzální změně. V této horizontální poloze jej udržuje právě vyrovnávací závaží 66 na konci kyvného ramene 65.

Změna pozice Todrazného terče 7 je dynamicky sledována měřicím svazkem 5 a následně vyhodnocena na základě interference s referenčním svazkem 6 (viz obr. la obr. 2).

Umístění odrazného terče 7 na přenosce 19 mezi kontaktním trnem 20 a kyvnou osou 64 je v délkovém poměru l : 4, a v odpovídajícím poměru se musí přepočítat i zaznamenaná transverzální změna pozice tak aby odpovídala velikosti transverzální změny objemu měřeného vzorku 1. Odrazný terč 7 odděluje intenzivní laserový měřicí svazek 5 od fotosynteticky aktivní listové tkáně vzorku 1, aby nedošlo ani k jejímu poškození, ani k ovlivnění fotosyntetických dějů uvnitř vzorku 1.

V jiném příkladu provedení na obr. 9 je zobrazena vzorková část zařízení podle vynálezu, upravená pro kapalné měřené vzorky 1 v kyvetě 42. s odrazným terčem 7 udržovaným silami povr55 chového napětí na hladině měřeného vzorku 1, především díky jeho malým rozměrům a malé

- 13CZ 301826 B6 hmotnosti. Odrazný terč 7 pro kapalné vzorky 1 se vyrobí tak, že tenká skleněná destička o rozměrech 18 x 18 x 0,05 mm se rozřeže na Čtvercové terče 7 se stranou 3 az 4 mm a o hmotnosti 5 až 6 mg. Povrch terčů 7 se očistí 30 %-ním roztokem kyseliny chromsírové nebo peroxidem vodíku, následně se opláchne destilovanou vodou v ultrazvukové pračce po dobu 10 až 15 min a osuší se. Na povrch terčů 7 se napaří metodou vakuového rozprašování vysoce reflexivní vrstva ze zlata o celkové tloušťce několika set nanometrů.

Měření kapalných vzorků I se provádí buďto v otevřené kyvetě 42, kdy je nutno brát v úvahu při výpočtech také odpař vodné fáze vzorku i, nebo se kyveta 42 zakryje krycím sklem 43 upevněio ným pomocí těsnicího tmelu 44.

Na obr. 10 je znázorněn příklad souběžného měření pomocí interferometru (část A) a fluorimetru (část B) na fotosynteticky aktivním vzorku i, v daném případě na izolovaných chloroplastech hrachu, v uzavřené kyvetě 42. Z interferogramu (křivka I, část A) byly vypočteny transverzální dilatační změny Ah objemu vzorku 1 (křivka 2, část A), které lze porovnat s průběhem pomalé fluorescenční indukční křivky chlorofylu a (část B).

Průmyslová využitelnost

Způsob výzkumu dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků a zařízení k provádění tohoto způsobu podle vynálezu lze využít při interferenční analýze objemových změn vzorků, jako např. vyšších a nižších rostlin, řas, fotosyntetických bakterií, částí těchto organismů, popř. i jiných fyziologicky aktivních vzorků, a to i ve stavu in vivo a prede25 vším v reálném čase.

Claims (15)

1. Způsob výzkumu dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků (1) vystavených působení zdroje (22) viditelného záření (23), prováděný na bázi

35 interferenční metody měření vzdáleností, vyznačující se tím, že zdrojový svazek (

2) monochromatického vysoce koherentního záření vycházející z laserového zdroje (3) se na prvním děliči (4) svazku rozdělí do dvou na sebe kolmých svazků (5, 6), z nichž měřicí svazek (5) pres nastavitelné zrcadlo (21) dopadá na odrazný terč (7) s vysoce reflexivním povrchem, který je v mechanickém kontaktu s povrchem měřeného vzorku (1), a referenční svazek (6)

40 dopadá na pevné referenční odrazové zrcadlo (8), po odrazu a zpětném průchodu prvním děličem (4) svazku spolu měřicí svazek (5) a referenční svazek (6) interferují, a z fázového rozdílu harmonických vln ve svazku interferujícího záření (9) se zjistí transverzální změna (Ah) pozice povrchu měřeného vzorku (1) jako důsledek jeho objemové změny.

45 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že svazek interferujícího záření (9) se rozdělí na druhém děliči (10) svazku na dva detekční svazky (11, 13), kde první detekční svazek (11) prochází první spojnou čočkou (26) a dopadá na první fotodetektor (12), a druhý detekční svazek (13), kolmý na první detekční svazek (11), prochází druhou spojnou čočkou (27) a je veden na druhý fotodetektor (14), přičemž fotodetektory (12, 14) jsou vůči sobě navzájem

50 v interferogramu fázově posunuty o 90°, detekční svazky (11, 13) před dopadem na fotodetektory (12, 14) procházejí absorbéry rozptýleného záření (17, 18), které jsou tvořeny válcovými tubusy, jejichž délka je násobkem délky fotodetektoru (12, 14), a signály z fotodetektorů (12, 14) se vedou do vyhodnocovací jednotky (15) spojené s počítačem (16).

-14CZ 301826 B6

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že svazek interferujícího záření (9) se rozdělí na druhém děliči (10) svazku na dva detekční svazky (11, 13), kde první detekční svazek (11) prochází první spojnou čočkou (26) a dopadá současně na první fotodetektor (12) a druhý fotodetektor (14), přičemž fotodetektory (12, 14) jsou vůči sobě navzájem v interfero5 gramu fázově posunuty o 90°, a druhý detekční svazek (13), kolmý na první detekční svazek (11), dopadá na třetí referenční fotodetektor (31), který snímá celý interferenční obrazec, přičemž detekční svazky (11, 13) před dopadem na fotodetektory (12, 14, 31) procházejí absorbéiy rozptýleného záření (17, 18, 32), tvořenými válcovými tubusy jejichž délka je řádovým násobkem délky fotodetektorů (12, 14, 31), a signály z fotodetektorů (12, 14, 31) se vedou do měřicí jedi o notky (33), která je přes interface (34) propojena s počítačem (16).

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že signály z fotodetektorů (12,14, 31) se v měřicí jednotce (33) přivádí na základní modul (35), kde signál třetího referenčního fotodetektorů (31) po zpracování v zesilovači (36) udává střední hodnotu intenzity záření jako

15 referenční úroveň v referenčním signálu (Sr), signály z prvního fotodetektorů (12) a druhého fotodetektorů (14) se po zpracování v zesilovačích (36) a potlačení rušivých signálů aktivními filtry (37) typu dolní propust převádějí na symetrické střídavé signály (S1, S2) s potlačenou stejnosměrnou složkou pomocí referenčního signálu (Sr), dále ze signálu prvního fotodetektorů (12) se oddělí jeho střídavá složka, přivede se do tvarovače (38), a pomocí řídicího a sekvenčního

20 obvodu (39), který vysílá řídicí signály (S/H1) a (S/H2) pro vzorkovací zesilovače (40), se odebírají vzorky střídavých signálů (Sl) a (S2) prvního fotodetektorů (12) a druhého fotodetektorů (14) pro eliminaci rušivých jevů s velkými amplitudami, a na výstupu z řídicího a sekvenčního obvodu (39) se měří napětí (Sť) odpovídající frekvenci rušivých signálů, přičemž základní modul (35) je pomocí analogově-digitálních převodníků (41) a interface (34) propojen s počítačem (16).

5. Způsob podle alespoň jednoho z nároků laž4, vyznačující se tím, že odrazný terč (7) se udržuje silou povrchového napětí na hladině kapalného měřeného vzorku (1) v kyvetě (42).

30

6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že odrazný terč (7) je uložen na pohyblivé optomechanické přenosce (19), která je opatřena alespoň jedním kontaktním trnem (20) dosedajícím na povrch pevného měřeného vzorku (l) uspořádaného v držáku (30) pevných vzorků v zatemňovací komůrce (46), přičemž na vzorek (1) dopadá viditelné záření (23) ze zdroje (22).

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že kdržáku (30) pevných vzorků se připojí fluorimetr (25) a měří se indukovaná fluorescence (24) vzorku (1).

8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že v zatemňovací komůrce

40 (46) v držáku (30) pevných vzorků se na povrch vzorku (l) působí plynným médiem ovlivňujícím fyziologický status vzorku (1).

9. Zařízení pro výzkum dynamiky objemových změn fyziologicky, zejména fotosynteticky aktivních vzorků (1) opatřené zdrojem (22) viditelného záření (23) pro iniciaci objemových změn

45 měřeného vzorku (l), vyznačující se tím, že zahrnuje interferometr pro měření transverzální změny (Áh) pozice povrchu měřeného vzorku (1), sestávající z laserového zdroje (3) monochromatického vysoce koherentního záření, z prvního děliče (4) svazku rozdělujícího zdrojový svazek (2) na měřicí svazek (5) a referenční svazek (6), z nastavitelného zrcadla (21) pro směrování měřicího svazku (5) na vzorek (1), z referenčního odrazového zrcadla (8) pro

50 odraz referenčního svazku (6), a z alespoň jednoho fotodetektorů (12, 14, 31), na který dopadá svazek interferujícího záření (9) složený z odraženého měřicího svazku (5) a referenčního svazku (6) přes spojnou čočku (26, 27), a který je připojen na vstup vyhodnocovací jednotky (15) nebo měřicího modulu (33) propojené s počítačem (16), a dále zahrnuje odrazný terč (7) s vysoce

- 15CZ 301826 B6 reflexivním povrchem, který je v mechanickém kontaktu s povrchem měřeného vzorku (1), a na který dopadá měřicí svazek (5).

10. Zařízení podle nároku 9, vyznačující se tím, že v dráze svazku interferujícího

5 záření (9) je uspořádán druhý dělič (10) svazku, ze kterého vychází první detekční svazek (11) procházející první spojnou čočkou (26) a dopadající na první fotodetektor (12), a druhý detekční svazek (13), kolmý na první detekční svazek (11), procházející druhou spojnou čočkou (27) a dopadající na druhý fotodetektor (14), přičemž fotodetektory (12, 14) jsou vůči sobě navzájem v interferogramu fázově posunuty o 90°, a jejich výstupy jsou připojeny na vstup vyhodnocovací i o jednotky (15) spojené s počítačem (16).

11. Zařízení podle nároku 9, vyznačující se tím, že v dráze svazku interferujícího záření (9) je uspořádán druhý dělič (10) svazku, ze kterého vychází první detekční svazek (11) procházející první spojnou čočkou (26) a dopadající současně na první fotodetektor (

12) a druhý

15 fotodetektor (14), přičemž fotodetektory (12, 14) jsou vůči sobě navzájem v interferogramu fázově posunuty o 90°, a druhý detekční svazek (13), kolmý na první detekční svazek (11), dopadá na třetí referenční fotodetektor (31), přičemž výstupy fotodetektorů (12, 14, 31) jsou připojeny na vstup měřicí jednotky (33) propojené přes interface (34) s počítačem (16).

20 12. Zařízení podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, že každý fotodetektor (12, 14,31) je opatřen absorbérem rozptýleného záření (17,18,32).

13. Zařízení podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že měřicí jednotka (33) obsahuje základní modul (35), který je pomocí analogově-digitálních převodníků (41) přes inter25 face (34) propojen s počítačem (16), a na kterém jsou vstupy od prvního a druhého fotodetektorů (12, 14) přivedeny na zesilovače (36) a aktivní filtry (37) typu dolní propust pro potlačení rušivých signálů, dále na diferenční zesilovače (69), kde jsou odečtením stejnosměrné složky signálu třetího referenčního fotodetektorů (31) převedeny na střídavé signály (Sl, S2) a vedeny do vzorkovacích zesilovačů (40), dále oddělená střídavá složka prvního fotodetektorů (12) je přivedena

30 do tvarovače (38) a pak do řídicího a sekvenčního obvodu (39), ze kterého vystupují řídicí signály (S/Hl) a (S/H2) pro odběr vzorků střídavých signálů (Sl, S2) ve vzorkovacích zesilovačích (40), a který je opatřen výstupem napětí (Sf) odpovídajícího frekvenci rušivých signálů, a vstup od třetího referenčního fotodetektorů (31) je přiveden na zesilovač (36), a po usměrnění je jako referenční signál (Sr) přiveden na diferenční zesilovače (69) a vyveden i jako samostatný výstup.

14. Zařízení podle alespoň jednoho z nároků 9ažl3, vyznačující se tím, že odrazný terč (7) je tvořen tenkou skleněnou destičkou opatřenou na povrchu tenkou napařenou reflexivní vrstvou ze zlata, a je uspořádán na hladině kapalného měřeného vzorku (1) v kyvetě (42),

40 15. Zařízení podle nároku 14, vyznačující se tím, že skleněná destička má tloušťku 0,05 mm a je čtvercového tvaru o straně kratší než 4 mm, s hmotností menší než 6 mg, a síla vrstvy zlata je menší než 1 pm.

16. Zařízení podle nároku 14 nebo 15, vyznačující se tím, že kyveta (42) s měře45 ným vzorkem (1) je překryta krycím sklem (43) utěsněným těsnicím tmelem (44).

17. Zařízení podle alespoň jednoho z nároků 9 až 13, vyznačující se tím, že odrazný terč (7) je uspořádán na pohyblivé optomechanické přenosce (19), opatřené alespoň jedním kontaktním trnem (20) dosedajícím na povrch pevného měřeného vzorku (1) uspořádaného

50 v držáku (30) pevných vzorků v zatemňovací komůrce (46), která je propojena se zdrojem (22) viditelného záření (23) dopadajícího na měřený vzorek (1).

18. Zařízení podle nároku 17, vyznačující se tím, že držák (30) pevných vzorků sestává z kruhové spodní příruby (47) a kruhové horní příruby (48), které jsou spolu navzájem

-16CZ 301826 B6 rozebíratelně spojeny, a mezi jejich přivracenými stranami je vytvořena zatemňovací komůrka (46) pro měřený vzorek (1), přičemž v horní přírubě (48) je vytvořen měřicí otvor (57) pro kontaktní tm (20) přenosky (19), a ve spodní přírubě (47) je vytvořen uzavíratelný osvětlovací otvor (52).

19. Zařízení podle nároku 18, vyznačující se tím, že ke spodní přírubě (47) je otočně upevněn přesuvný kryt (53) pro zakrytí a odkrytí osvětlovacího otvoru (52), opatřený trubkovým nástavcem (56) pro svčtlovodič připojený ke zdroji (22) viditelného záření (23) a k fluorimetru (25).

io

20. Zařízení podle alespoň jednoho z nároků 17 až 19, vyznačující se tím, žena přivrácených stranách spodní příruby (47) a horní příruby (48) jsou protilehle upevněna světlo nepropouštějící a pro vzduch průlinčitá těsnění (58) ve tvaru mezikruží, jejichž vnitřní obvod ohraničuje prostor zatemňovací komůrky (46), a mezi nimiž je uspořádán měřený vzorek (1),

15 přičemž těsnění (58) je z černého měkkého pěnového materiálu.

21. Zařízení podle nároku 20, vyznačující se tím, že spodní příruba (47) i horní příruba (48) jsou v oblasti těsnění (58) opatřeny nátrubky (59) pro připojení plynného média a vrtáními (60) propojujícími nátrubky (59) s vnitřní částí zatemňovací komůrky (46).

22. Zařízení podle nároku 17, vyznačující se tím, že optomechanická přenoska (19) je uložena v horizontální poloze na břitu (63) s možností výkyvného pohybu kolem kyvné osy (64) a mezi kontaktním trnem (20) a kyvnou osou (64) je otočně uloženo vertikálně uspořádané kyvné rameno (65) s vyrovnávacím závažím (66), přičemž kyvné rameno (65) nese per25 pendikulámě a horizontálně uspořádaný odrazný terč (7).

23. Zařízení podle nároku 22, vyznačující se tím, že na vrcholu kyvného ramene (65) je nosič (68) nesoucí odrazný terč (7) tvořený podložkou z materiálu Si/SiO₂ s napařenou vysoce reflexivní tenkou vrstvou zlata.

24. Zařízení podle nároku 22 nebo 23, vyznačující se tím, že přenoska (19) je vytvořena ze dvou nosníků (61) spojených alespoň jednou příčkou (62) do tvaru „V“, kontaktní tm (20) je upevněn v oblasti spoje „V“, a kyvné rameno (65) je upevněno na ose (67) otočně uložené na nosnících (61), a odrazný terč (7) je perpendikulámě uspořádán na vrcholu kyvného

35 ramene (65) nad rovinou nosníků (61).

25. Zařízení podle alespoň jednoho z nároků 22 až 24, vyznačující se tím, že vzdálenosti mezi kontaktním trnem (20) a kyvným ramenem (65) a mezi kyvným ramenem (65) a kyvnou osou (64) jsou v poměru 1 :4.