CZ301451B6

CZ301451B6 - Deriváty kyseliny glukosaminylmuramové

Info

Publication number: CZ301451B6
Application number: CZ20050658A
Authority: CZ
Inventors: Ledvina@Miroslav; Džoganová@Martina; Zyka@Daniel
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie, Akademie ved CR
Priority date: 2005-10-18
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2010-03-03
Also published as: WO2007045192A1; CZ2005658A3

Abstract

Disacharidový synthon (benzyl-2-acetamido-2-deoxy-.beta.-D-glukopyranosyl-(1->4)-2-acetamido-2-deoxy-3-O-[1-(R)-karboxyethyl-.alfa.-D-glukopyranosid) vzorce I a jeho použití pri syntéze muramylových glykopeptidu založených na molekule GMDP obecného vzorce IX. Látka vzorce I se pripraví tak, že jako glykosylakceptor se pri její syntéze použije derivát kyseliny muramové vzorce II, který se pripraví z látky vzorce III. Ta se 3-O-alkylací kyselinou 2-brompropionovou a následnou esterifikací prevede na látku vzorce IV, která se prevede odštepením isopropylidenové skupiny na látku vzorce V, jejíž parciální benzoylací benzoylimidazolem se získá látka vzorce II. Reakcí látky II s 3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-.beta.-D-glukopyranosylbromidem se pripraví disacharid vzorce VI, který se prevede postupným odstranením alkalilabilních chránicích skupin na látku vzorce VII, jejíž N-acetylací se získá látka vzorce I. Synthon vzorce I se reakcí s bis(pentafluorfenyl)karbonátem prevede na látku vzorce X, která reakcí s peptidovou komponentou poskytne látku obecného vzorce XI, kde substituent X je peptidový zbytek. Odštepením chránicích skupin látky obecného vzorce XI, za podmínek daných jejich charakterem, se získá muramylový glykopeptid založený na molekule GMDP obecného vzorce IX, kde substituent X je peptidový zbytek.

Description

Deriváty kyseliny glukosaminylmuramové

Oblast techniky

Vynález se týká derivátů kyseliny glu kosám inylmuramové (kyseliny 2-amino-2-deoxy-[3-Dglukopyranosyl-(l-»4}-jV-acetylmuramové) a způsobu jejich přípravy a použití při syntéze glukosám inylmuramylových glykopeptidů, tj. disacharidových analogů murarnylových glykopeptidů.

io

Dosavadní stav techniky

Imunofarmaka představují novou skupinu léčiv, která má již nezastupitelnou úlohu v moderní klinické praxí. Narušení obranyschopnosti organismu v důsledku negativních změn životního prostředí, nárůst výskytu patogenních mikroorganismů rezistentních k antibiotikům, a infekčních chorob poškozujících imunitu (např. AIDS), stejně jako časté používání imunosuprimujících léčebných postupů, např. při rádio- a chemoterapii nádorových onemocnění a po transplantacích, představují závažný medicínský problém. Rovněž současný trend přejít od živých vakcín k bezpečnějším semisyntetickým, rekombinantním a syntetickým vakcínám vyžaduje nová strukturně definovaná adjuvans. Proto je v poslední době věnována značná pozornost vývoji látek s imunostimulační aktivitou, s cílem získat: a) bezpečná, strukturně definovaná adjuvans pro proteinové, peptidové a DNA-vakcíny, b) stimulátory nespecifické antiinfekční a protinádorové imunity, c) stimulátory krvetvorby (hemopoézy).

Peptidoglykan n = 10 -100; GMDP π - 1 Obr. 1 Peptidoglykan i jeho fragmenty

Významnými představiteli této skupiny látek jsou muramylové glykopeptidy, tj. látky odvozené od fragmentů peptidoglykanu buněčné bakteriální stěny (Obr. 1). Jedná se především o látky odvozené od minimální imunoadjuvantní jednotky, „muramyldipeptidu“ (MDP) a základní opakující se disacharid-d i peptidové jednotky, „glukosám inyl-muramyl-dipeptidu“ (GMDP).

V uplynulých dvou desetiletí bylo syntetizováno značné množství analogů MDP a několik analogů GMDP, s cílem zvýšit strukturními změnami specifícitu terapeutického účinku a potlačit nežádoucí vedlejší projevy, zejména pyrogenitu. Toto úsilí poskytlo několik látek, které se staly předmětem zájmu farmaceutického průmyslu (pro přehled lit?⁴).

Z látek odvozených od MDP je jako terapeutikum nejdále ve vývoji preparát Romurtid™ (MDPLys-L-18) založený na molekule MDP prodloužené v peptidové části o lysin substituovaný stea40 roylovým zbytkem. Romurtid™ je méně pyrogenní než MDP a úspěšně prošel klinickými zkouškami, Hlavním směrem jeho praktické aplikace je stimulace krvetvorby poškozené u pacientů podrobených radioterapii nebo chemoterapii³“⁵. Urychlení normalizace počtu neutrofilů v periferní krvi je důležité z hlediska snížení rizika infekce u imunosuprimovaných pacientů⁰’⁷. Romurtid™ je rovněž schopen zvýšit přirozenou imunitu proti virovým⁸ a bakteriálním^9,10 infekcím a nádorovému bujení¹'.

GMDP má ve srovnání s MDP vyšší imunoadjuvantní aktivitu a je méně pyrogenní. Proto se látky odvozené od GMDP jeví perspektivnější jako potenciální imunoterapeutika, než látky odvo- 1 CZ 301451 B6 zené od MDP². Na molekule GMDP založený preparát Likopid™ je prvním imunoterapeutikem typu muramylových glykopeptidů zavedeným do klinické praxe. Likopid byl vyvinut a registrován ruskou firmou Peptek jako imunoterapeutikum s širokou aplikační oblastí. Jedná se o posílení imunity a prevenci infekcí komplikujících post-traumatické, post-operativní, post-chemo a radioterapeutické období pacientů . Dále je to léčba infekčních onemocnění, jako jsou tuberkulóza, cervikální lidský papilomavirus, oftalmické herpetické infekce, psoriáza (nežidová i exsudativní forma) a léčba hnisavých a zánětlivých procesů. Při léčbě infekčních onemocnění Likopid může být použit samostatně nebo v kombinaci s antibiotiky a antivirálními látkami¹³. Vedlejší účinky léku jsou u pacientů spojeny s pyrogenitou vázanou na jeho aktivní složku GMDP.

Firma ImmunoTherapeutics, lne., North Dakota, USA, vyvíjí lipofílní analogy GMDP, tj. „disacharidtripeptid—glyceroldipalmitáť‘ (DTP-GDP), modifikovaný v karboxyterminální části peptidového řetězce glycerol-dipalmitátovým zbytkem, a jemu strukturně blízku GMTP-N-DPG, modifikovaný v karboxyterminální části peptidového řetězce dipalmitoylpropylamidovým zbyt15 kem. DTP-GDP byl navržen jako potenciální imunoterapeutikum nádorových onemocnění¹⁴. Látka aplikovaná v liposomech je účinná při terapii metastázujících nádorů jater¹⁵. DTP-GDP prošel úspěšně fází II klinických zkoušek, ale je silně pyrogenní¹⁵. Jeho hlavními vedlejšími účinky jsou, vedle zvýšené teploty, třesavka, nevolnost a hypotenze. GMTP-N-DPG se ukazuje být perspektivní jako adjuvants k navození buněčné imunity při konstrukci vakcín nové generace proti některým závažným infekčním onemocněním (např. AIDS, tuberkulóze a malárii)^16,17.

Některé z výše jmenovaných analogů jsou součástí vyráběných adjuvans. Jako příklady lze uvést Gerbu Adjuvant™, jehož součástí je GMDP (CC Biotech Corporation, USA), ImmTher™, obsahující DTP-GDP a Theramide™ obsahující strukturně DTP-DPP (GMTP-N-DPG) (Immuno25 Therapeutics, USA); ref¹⁸.

Hlavním problémem při syntéze muramylových glykopeptidů odvozených od GMDP je dostupnost jejich sacharidové složky. Syntéza oligosacharidů představuje stále náročný úkol, zejména pak u sekvencí obsahujících jednotky odvozené od D-glukopyranosy spojené β(1—>4) glykosi30 dickou vazbou, s ohledem na nízkou reaktivitu OH(4) skupiny’⁹“²³. Dosud známé syntetické postupy pro přípravu disacharidové komponenty GMDP představují náročný proces charakterizovaný značným počtem syntetických stupňů a s tím spojenou nízkou efektivitou. Tyto syntézy lze rozdělit, podle glykosylakceptoru použitého při gly kosy lační reakci, která je klíčovým krokem při výstavbě disacharidové jednotky, do třech skupin; (a) glykosyíace s acyklickým prekurzorem kyseliny muramové^24,25, (b) glykosyíace s cyklickým prekurzorem kyseliny muramové²⁶“²⁸, (c) glykosyíace s cyklickým derivátem kyseliny muramové^29-30. Proto se v oblasti syntézy GMDP a od něj odvozených analogů uplatňuje vedle syntézy de novo i sem i syntetický přístup. Příprava cukerné složky je založena na biotechnologickém procesu přípravy bakteriální masy fermentaci, parciální enzymatické hydrolýze bakteriálních stěn a náročné izolaci disacharidové jednotky pomocí chromatografických technik. Takto získaná sacharidová komponenta, tj. kyselina 2-acetamido-2-deoxy-J3~D-glukopyranosyl-( 1 ->4)-/V-acetylmuramová (β-D-GlcN Ac-( 1 —>4)—

MurNAc), je následně kondenzována s peptidovou komponentou¹⁷'³⁴’³⁶. Semisyntetický postup je aplikován jak ruskou firmou Peptek při přípravě účinné složky léčiva Likopid ^M (GMDP), tak i firmou ImmunoTherapeutics, lne. z USA pří přípravě analogů GMDP (DTP-GDP) a GMTP-N45 DPG) vyvíjených jako imunoterapeutika, a modifikovaných v karboxyterminální části peptidového řetězce lipofilním zbytkem. Přes zdánlivou jednoduchost semisyntetického postupu jsou jeho nevýhodou špatná reprodukovatelnost a standardizace biotechnologického procesu produkce disacharidové komponenty. Přitom reprodukovatelnost a standardizace výrobních procesů je jedním z hlavních kriterií při výrobě léčiv ajejich substancí.

Omezujícím faktorem při zavádění imunoterapeutik založených na GMDP do praxe je komplikovaná dostupnost jejich disacharidové složky, tj. kyseliny 2-acetamido-2-deoxy-|3-D-glukopyranosyl-(l-»4)-/V-acetylmuramové (p-D-GlcNAc-(]->4)-MurNAc). respektive jejích derivátů. Tento problém řeší předmětný vynález vypracováním efektivní syntézy dísacharidového

-2CZ 301451 B6 synthonu umožňujícího racionální syntézu muramylových glykopeptidů, založených na molekule

GMDP.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou: a) Disacharidový synthon vzorce I,

a ] s b) Způsob přípravy disacharidového synthonu vzorce I.

Při syntéze disacharidového synthonu vzorce I byl jako glykosyldonor použit 3,4,Mri-<3-acetyl2-deoxy-2-ftalimido-p-D-glukopyranosylbromid získaný dvoustupňovou syntézou podle lit^37,38z komerčně dostupného hydrochloridu D-glukosaminu. Jako glykosylakceptor byl použit derivát kyseliny muramové, tj. benzy l-2-acetamido-6-0-benzoy l-2-deoxy-3-O-[ 1 -(R)(methoxykarbonyl)ethyl]-a-D-glukopyranosid vzorce II,

jehož příprava je rovněž předmětem vynálezu.

Syntéza glykosylackeptoru vzorce II vychází z benzyl-2-acetamído-2-deoxy-4,6-Q-isopropyliden-a-D-glukopvranosidu vzorce III, (CH₃)₂C—O

získaného ve dvou syntetických krocích podle lit.³⁹ z komerčně dostupného /V-acetyl-D-glukosaminu. ^{35 * * *}

3-O-Alkylací látky vzorce III racemickou kyselinou 2-brompropionovou nebo jejím (S)~stereoisomerem v polárním aprotickém rozpouštědle a v přítomnosti silné báze (s výhodou v dioxanu nebo tetrahydrofuranu za přítomností hydridu sodného) a následnou esterifikací vzniklé kyseliny reakcí s diazomethanem nebo její soli reakcí s methyljodidem se získá benzyl-2-acetamido-2-3CZ 301451 B6 deoxy-4,6-0-isopropyliden-3-0-[l-(R)-(methoxykarbonyl)ethyl]-a-D-glukopyranosid vzorce IV.

Acetátová chránící skupina látky vzorce IV se odstraní kyselou solvolýzou, s výhodou působením iontoměniče Dowex 50 v H⁺ cyklu v suchém methanolu nebo zahříváním ve vodné kyselině octové, za vzniku benzy l-2~acetamido-2-deoxy--3-O-[ lJR)-( methoxy karbony l)ethyl]-a--Dglukopyranosidu vzorce V.

v

Parciální benzoylací látky V, s výhodou reakcí s benzoylimidazolem v dichlormethanu, se získá glykosylakceptor vzorce II.

cooch₃ π

Reakcí 3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-p-D-glukopyranosylbromidu, jako glykosyldonoru, s glykosylakceptorem vzorce II v aprotickém rozpouštědle, promotovanou solemi těž20 kých kovů (s výhodou v dichlormethanu za přítomnosti trifluormethansulfonanu stříbrného jako promotoru) se získá benzy 1-3,4,6-tri-Oacetyl-2-deoxy-2-ftalimido-p-D-glukopyranosy 1(1 >4)-2-acetamido--6-í?-benzoyl-2-deoxy-3-f?-[ l-{Rý-(rnethoxykarbony l)ethyl~a-D-glukopyranosid vzorce VI.

Postupným odstraněním alkal i labilních chránících skupin (tj. acetylové, benzoylové, methy (esterové a ftalimidové), s výhodou působením methoxidu sodného v methanolu, hydroxidu sodného ve vodě a n-butylaminu v methanolu, se získá benzyl-2-amino-2-deoxy-(3~D-glukopyranosyl30 (1 - >4)-2-acetamido-2-deoxy -3- <9-[ l-(R)-karboxyethyl]-a-D-glukopyranosid vzorce VII.

-4CZ 301451 Bó

Λ-acetylací látky vzorce VII působením anhydridu kyseliny octové ve vodě se získá disacharido5 vý synthon vzorce I.

c) Použití disacharidové synthonu vzorce 1 při syntéze muramylových glykopeptidů založených na molekule GMDP obecného vzorce IX,

kde substituent X je peptidový zbytek.

Reakcí disacharidového synthonu vzorce I s bis(pentafluorfenyl)karbonátem v polárním aprotic15 kém rozpouštědle v přítomnosti báze, s výhodou v VA-dimethylformamidu za přítomnosti NmethyImorfolínu, se získá benzyl-2-acetamido-2-deoxy-p-I>-glukopyranosyl-(l->4)-2-aceb amido-2-deoxy-3-<7-[ l-(R)-(pentanuorfenoxykarbonyl)ethyll-a-D-glukopyranosid vzorce X (kde PfP - pentafluorfenyl).

Reakcí pentafluorfenylesteru X (kde PfP = pentafluorfenyl) s peptidovou komponentou v polárním aprotickém rozpouštědle v přítomnosti báze, s výhodou v N,JV-dimethylformámidu za přítomnosti triethylaminu nebo /V-methylmorfolinu, se získá chráněný glykopeptid obecného vzorce XI,

kde substituent X je peptidový zbytek. Například reakcí s benzyl esterem L-alanyl-D-isogluta30 minu (dostupným podle lit.⁴⁰) se získá benzyl ester V-{2-O-[benzyl-2-acetamido-2-deoxy-p-5CZ 301451 B6

D-glukopyranosyl-(l->4)-2-acetamÍdo-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl]-(RH^aktoyl}-L-alanyl-D-isoglutaminu (XI, kde substituent X je L-Ala-D-iso-Oln-OBn).

Hydrogenolytickým odštěpením benzylové chránící skupiny z redukujícího konce sacharidové části a chránících skupin štěpitelných za těchto podmínek z peptidového řetězce (benzylové nebo benzyloxy karbony lové) glykopeptidu obecného vzorce XI (s výhodou za použití paladiového katalyzátoru na uhlí v kyselině octové), se získá glykopeptid obecného vzorce IX. Například hydrogenolýzou benzylových skupin benzyl esteru JV-{2-O-[benzyl-2-acetamido-2-deoxy-[3D-glukopyranosyl-(l->4)-2-acetamido-2,3-dideoxy’a-D-gIukopyranosid-3-yl]-(RHakio toyl}-L-alanyl-D-isoglutaminu (XI, kde substituent X je L-Ala-D-iso-Gln-OBn) na paladiovém katalyzátoru na uhlí v kyselině octové se získá 2-acetamido-2-deoxy-J3~D-glukopyranosyl-(l-»4)-yV-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (GMDP) (IX, kde substituent X je LAla-D-iso-Gln-OH).

Předmětem vynálezu je následovně doložen příklady provedení, aniž se tím jakkoliv omezuje.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

K míchanému roztoku benzyl-2-acetamido-2-deoxy~4,6-CMsopropyliden-a-D-glukopyranosidu vzorce III (24,6 g, 70 mmol) v suchém dioxanu (270 ml) se při teplotě místnosti přidá hydrid sodný (9,0 g, 375 mmol) a směs se za míchání zahřívá 2 h na 90 °C. Směs se ochladí na teplotu místnosti, přidá se kyselina 2-brompropionová (9,0 ml, 100 mmol) a směs se míchání zahřívá 6 h na 65 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti, se přebytečný hydrid rozloží vodou; ke směsi se za míchání přidá pevný oxid uhličitý a voda (20 ml). Směs se za vakua odpaří. Odparek se rozpustí ve vodě (450 ml) a roztok se za míchání a chlazení ledem zneutralizuje 5% vodným roztokem hydrogensíranu sodného. Vyloučený produkt se extrahuje octanem ethylnatým (3 x 200 ml), extrakt se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a za vakua odpaří na objem cca 100 ml. K odparku se za míchání a chlazení ledem přidá roztok diazomethanu v diethyletheru do trvale žlutého zbarvení. Po 30 min se přebytečný diazomethan rozloží kyselinou octovou, směs se za vakua odpaří a odparek se chromatografuje na sloupci silikagelu v soustavě octan ethylnatý 35 toluen(2;l).

Homogenní frakce o vyšší R_F hodnotě se za vakua odpaří a získaný krystalický odparek 19,6 g (64,0 %) benz\l-2-acetam ido-2-dcoxy>, 6-O-i sopro py I i den-3-f>-[ 1-(RH methoxy karbony 1)ethyl]-a-D-glukopyranosidu vzorce IV se bez další purifíkace deisopropylidenuje (viz příklady

3 a 4). Krystalizaci odparku ze směsi toluen - diethylether - petro lether se připraví analytický vzorek látky vzorce IV ve výtěžku 76,5%; t.t. 123 °C, [a]_Ď+139 (c 0,5, chloroform). Pro C₂₂H_3]NO₈ vypočteno: relativní molekulová hmotnost 437,5, monoisotopická hmotnost 437,2. FAB MS, m/z: 438,4 [Μ + H]*, 460,3 [M + Naf. Pro C₂₂H₃,NO₈ (437,5) vypočteno: 60,40 % C; 7,14 % H; 3,20 % N; nalezeno: 60,23 % C, 7,28 % H, 3,27 % N.

Odpařením homogenní frakce o nižší R_F hodnotě se získá 9,0 g (29,4 %) sirupovitého odparku benzy l-2-acetamido-2-deoxy-4,6-ř3-isopropyliden-3 0[l-(S)(methoxy karbony l)ethyl]-aD-glukopyranosidu který stáním prokrystaluje; t.t. 83 °C; [a]_D +77 (c 0,5, chloroform). Pro C₂₂H_3]NO₈ vypočteno: relativní molekulová hmotnost 437,5, monoisotopická hmotnost 437,2.

FAB MS, m/z 438,3 [M + Hf, 460,3 [M + Naf. Pro C₂₂H₃iNO₈ (437,5) vypočteno: 60,40 % C; 7,14 % Η; 3,20 % Ν; nalezeno: 60,51 % C, 7,23 % H, 3,18 % Ν.

-6CZ 301451 Bó

Příklad 2

Hydrid sodný suspendovaný v minerálním oleji (60%; 1,2 g, 30 mmol) se pod argonem promyje suchým hexanem (3x5 ml) a suspenduje se v suchém tetrahydrofuranu (10 ml). K míchané sus5 pensi při teplotě místnosti přidá roztok benzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-6Msopropyliden-<xD-glukopyranosidu vzorce III (3,5 g, 10 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (20 ml) a směs se za míchání zahřívá 2,5 h na 50 °C. Ke směsi se během 2 h přidá roztok kyseliny (S)_2-brompropionové (1,1 ml, 12 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (10 ml) a směs se za míchání zahřívá dalších 8 h na 50 °C. Směs se ochladí na teplotu místnosti a za míchání se přidá methyljodid (1,0 ml, to 16 mmol) a směs se míchá pri teplotě místnosti 24 h. Přebytečný hydrid se rozloží suchým methanolem (2,0 ml) a pevným oxidem uhličitým a směs se za vakua odpaří. Odparek se vezme mezi octan ethylnatý (60 ml) a vodu (20 ml), organická vrstva se oddělí, promyje vodou (2 x 20 ml), vysuší bezvodým síranem hořečnatým a za vakua odpaří. Odparek se zfiltruje přes sloupec silikagelu v soustavě octan ethylnatý - toluen (2 : 1) a filtrát se za vakua odpaří. Krystalizaci produktu ze směsi toluen - diethylether - petrolether se získá 3,3 g (75,4 %) benzyl-2-acetamidí>-z-dcoxy--4_r6-0-isopropyliden-3-<9-[l-(R)-(mcthoxykarbonyl)ethy!]-íi-D-ghikopyranosidu vzorce IV shodného s látkou vzorce IV, která se připraví postupem podle příkladu 1.

Příklad 3

K roztoku benzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-i$opropyliden-3-0-[l-(RHmethoxykarbonyl)-ethyl]-a-D-glukopyranosidu vzorce IV (87,5 g, 200 mmol) v suchém methanolu (500 ml) se přidá iontoměnič Dowex 50 v H⁺ cyklu (35 g) a směs se míchá 2 h při teplotě místnosti. Prů25 běh reakce se monitoruje pomocí TLC v soustavě chloroform - methanol (10: 1). Iontoměnič se odfiltruje, promyje methanolem (2 x 400 ml) a filtrát se za vakua odpaří. Výtěžek 78,7 g (99,0 %) krystalického benzyl-2-acetamido-2-deoxy-3-O-[l-(R)-(methoxykarbonyl)-ethyl]-a-D-glukopyranosidu vzorce V, který se bez další purifikace benzoyluje (viz příklad 5). Krystalizaci produktu ze směsi octan ethylnatý - diethylether se připraví analytický vzorek látky vzorce V; t.t.

134 až 138 °C, [a]_D +152 (c 0,5, chloroform); lit.⁴¹ tt. 130 až 132 °C, [a]D +145 (c 1,0, chloroform); lit.⁴² t.t. 120 až 122 °C, [a]D + 137 (c, 0,9, chloroform); lit.⁴³ [ct]D +127 (c 1,0, chloroform). Pro CííH^NOg vypočteno: relativní molekulová hmotnost 397,4, mono isotop i cká hmotnost 397,2. ESI MS, mfz\ 420,3 [M + Na]^T. Pro C19H₂₇NO₈ (397,4) vypočteno: 57,42 % C, 6,85 % H, 3,52 % N; nalezeno: 57,17 % C, 6,88 % H, 3,49 % N.

Příklad 4

Bcnzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-Ísopropyliden-3-0-[l-(R)-(methoxykarbonyl)ethyl]-a40 D-glukopyranosid vzorce IV (8,8 g, 20 mmol) se zahřívá za míchání ve směsi kyselina octová voda (1 : 1, 80 ml) 30 min na 90 °C. Směs se za vakua odpaří a odparek se /krystalizuje směsi octan ethylnatý - diethylether. Výtěžek 6,2 g (78,0 %) benzyl-2-acetamido-2-deoxy-3-Q-[l(R)-(methoxykarbonyl)ethyl]-a-D-glukopyranosidu vzorce V, shodného s látkou vzorce V, která se připraví postupem podle příkladu 3.

Příklad 5

K míchané suspensi benzy l-2-acetaniido-2-~deoxy-3-<9-[l-(R)-( methoxy karbony l)ethvl]-a50 D-glukopyranosidu vzorce V (79,5 g, 200 mmol) v suchém dichlormethanu (500 ml) se při 0 °C přidá roztok benzoylimidazolu (37,9 g, 220 mmol) v suchém dichlormethanu (150 ml). Směs se míchá 30 min při 0 °C a ponechá stát nejméně 24 h při teplotě místnosti. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v soustavě chloroform - methanol (10 : 1) a v soustavě toluen - octan ethylnatý (1 : 1). Směs se zředí chloroformem (1000 ml) a získaný roztok se promyje 5% vodným

-7CZ 301451 B6 roztokem hydrogensíranu sodného (700 ml), vodou (1000 ml) a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného (1000 ml), vysuší bezvodým síranem horečnatým a za vakua odpaří. Výtěžek

99,3 g (99,0 %) krystalického benzyl-2-acetamido-6-ú-benzoyl-2-deoxy-3-G-[l -{R)(methoxy karbony l)ethyl-a-D-glukopyranos idu vzorce II, který lze bez další purifikace použít jako glykosylakceptor k syntéze disacharidu (viz příklad 6). Krystalízaci produktu ze směsi toluen - heptan se připraví analytický vzorek látky vzorce II ve výtěžku 90,0%; t.t. 133 až 135 °C, [a]_D +85 (c 0,3, chloroform). Lit.⁴⁴ t.t. 98 až 100 ^ŮC, [ct]D +81 (c 1,0, chloroform) Pro C20H31NO9 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 501,5, monoisotopička hmotnost 501,2. FAB MS, m/z: 502,1 [M + H]⁺, 524,3 [M + Na]⁺. Pro C26H₃iNO₉ (501,5) vypočteno: 62,27 % C,

6,23 % H, 2,79 % N; nalezeno: 62,58 % C, 6,45 % H, 2,66 % N.

Příklad 6

Směs benzyl-2-acetamÍdo-6~0~benzoyl-2-deoxy-3-0-[l-(R}-(methoxykarbonyl)ethyl-a-Dglukopyranosidu vzorce II (50,2 g, 100 mmol) a trifluormethansulfonanu stříbrného (46,3 g, 180 mmol) se suší 6 h při teplotě místnosti a tlaku 1,32 Pa. Pod argonem se přidá suchý dichlormethan (300 ml). Směs se ochladí na -30 °C a za míchání se během 1 h přidá roztok 3,4,6—tri—O— acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-(3-D-gIukopyranosyl brom idu (89,7 g, 180 mmol) v suchém dichlormethanu (300 ml). Směs se míchá 1 h při -30 °C a 2 h při -20 °C. Ke směsi se za míchání při -20 °C přidá pyridin (50 ml) a po vystoupení teploty na teplotu místnosti se směs zředí chloroformem (1000 ml) a zfiltruje. Filtrát se promyje ochlazeným (+4 °C) nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (1000 ml), vodou (1000 ml) a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného (1000 ml), vysuší se bezvodým síranem hořečnatým, za vakua odpaří a za vakua kodestiluje s toluenem (2 x 500 ml). Chromatografií odparku na sloupci silikagelu v soustavě octan ethylnatý - toluen (2 : 1) se získá 78,1 g (85,0 %) benzy 1-3,4,ó-tri-Ú-acety 1-2deoxy-2-ftalimidu-(3-D-glukopyranosyl-(l-»4)-2-acetamido-6-O-benzoyl-2-deoxy-3-0[l-(R)-(methoxykarbonyl)ethyl-a-D-glukopyranosidu vzorce VI ve formě pevné pěny; [a]p +37 (c 0,1, chloroform). Pro C40H50N2O18 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 918,9, monoisotopická hmotnost 918,3. ESI MS, m/z: 941,5 [M + Na]\ Pro C4₆H5oN₂Oi8 (918,9) vypočteno: 60,13 % C, 5,48 % H, 3,05 % N; nalezeno: 60,33 % C, 5,45 % H, 2,86 % N.

Příklad 7

Roztok benzyl-3,4,6-tri-ť7-acetyl-2-deoxy-2-ftalimidu-P-D-glukopyranosyI-( 1 ->4)-2-acetamido-6-O-benzoyl-2-deoxy-3-č)-[ 1-(R)-( methoxy karbony !)ethyl-a-D-glukopyranosidu vzorce VI (18,4 g, 20 mmol) v 0,01 M roztoku methoxidu sodného v suchém methanolu (500 ml) se nechá stát 48 h při laboratorní teplotě a směs se zneutralizuje přidáním iontoměniče

Dowexu 50 v pyridinovém cyklu, lontoměnič se odfiltruje, promyje methanolem (200 ml) a filtrát se za vakua odpaří. Odparek se za míchání zahřívá v 0,25 M vodném roztoku hydroxidu sodného (550 ml) na 60 °C 3,5 h. Po ochlazení na teplotu místnosti je směs zneutralizována iontoměničem Dowex 50 v pyridinovém cyklu. lontoměnič se odfiltruje, promyje methanolem (200 ml) a filtrát se za vakua odpaří. Odparek se za míchání zahřívá v 0,25 M vodném roztoku hydroxidu sodného (550 ml) na 60 °C 3,5 h. Po ochlazení na teplotu místnosti je směs zneutralizována iontoměničem Dowex 50 v pyridinovém cyklu. lontoměnič se odfiltruje, promyje vodou (100 ml), eluát se za vakua odpaří a odparek se za vakua kodestiluje se suchým methanolem (3 x 80 ml). Odparek se rozpustí ve směsi methanolu a n-butylaminu (4:1, 300 ml) a roztok se zahřívá v takové nádobě 11 h na 85 - 90 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti se směs za vakua odpa50 ří a odparek se extrahuje diethyletherem (3 x 150 ml). Nerozpustný zbytek se rozpustí ve vodě (250 ml), pH roztoku se kyselinou mravenčí upraví na pH 4 a roztok se nalije na sloupec iontoměniče Dowex 50 v amoniovém cyklu (800 ml). Sloupec iontoměniče se promyje vodou (1500 ml) a produkt se z iontoměniče uvolní promytím 5% vodným amoniakem (1000 ml). Eluát se za vakua odpaří. Získaný benzyl-2-amino-2-deoxy-|3-D-glukopyranosyl-(l-»4)-2-acet-8CZ 301451 B6 amido-2-deoxy-3-0-[l-(R)-karboxyethyl-a-D-glukopyranosid vzorce Vil se bez další purifikace A-acetyluje (viz příklad 8). Analytický vzorek látky vzorce VII se připraví krystalizaci z ethanolu; t.t. 183 až 185 °C; [a]_D +109 (c 0,2, voda). Pro C₂₄H₃₆N₂O|₂ vypočteno: relativní molekulová hmotnost 544,6, monoisotopická hmotnost 544,2. ESI MS, m/z: 545,0 [M + H]⁺,

567,3 [M + Na] \

Příklad 8 ίο K míchanému roztoku benzyl-2-amino-2-deoxy-[3-D-glukopyranosyl-(l->4)-2“acetamido-2deoxy-3-í9-[14R)~karboxyethyl-a-D-gIukopyranosÍdu vzorce VII (získaného v příkladě 7) ve vodě (160 ml) se při teplotě místnosti postupně během 15 min přidá anhydrid kyseliny octové (20 ml). Po 30 min se přidá další podíl anhydridů kyseliny octové (20 ml) a v míchání se pokračuje po dobu 2 h. Roztok se za vakua odpaří, odparek se rozpustí ve vodě a roztok se nalije na sloupec iontoměniče Dowex 50 v pyridiniovém cyklu (300 ml). Iontoměnič se promyje vodou (700 ml) a eíuát se za vakua odpaří a odparek se lyofilizuje z vody. Výtěžek 7.1 g (60,5 %) benzyl-2-amino-2-deoxy-(3-D-glukopyranosyl-( 1 ~>4)-2-acetamido-2-deoxy-3-(9-[ l-(R)-karboxyethyl-a-D-glukopyranosidu vzorce I, vzhledem k množství látky vzorce VI; [a]_D +70 (c 0,2, voda). Pro C₂óH₃8N₂O₅₃ vypočteno: relativní molekulová hmotnost 586,6, monoisotopická hmotnost 586,2, ESI MS, m/z: 609,4 [M + Na]⁺. Pro C₂₆H₃₈N₂O,₃ (586,6) vypočteno: 53,24 % C, 6,53 % H, 4,78 % N; nalezeno: 53,05 % C, 6,82 % H, 4,55 % N.

Příklad 9

K míchanému roztoku benzyl-2-amino-2-deoxy-[3-D-glukopyranosyl-(l->4)-2~acetamido_2deoxy-3-0-[l-(R)-karboxyethyl-<x-D-glukopyranosÍdu vzorce I (587 mg, 1 mmol) v N,Ndimethylformamidu (4 ml) se při teplotě místnosti přidá bis(pentafluorfenyl)karbonát (434 mg, 1,1 mmol) a 4-methylmorfolin (0,11 ml, 1 mmol) a směs se míchá jednu hodinu. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC v ethanolu. Přidá se dioxan (20 ml) a směs se lyofilizuje. Opakovanou lyofilizací produktu z dioxanu se získá 723 mg (96,0%) benzyl-2-acetamido-2-deoxy-|3D-glukopyranosyI-( 1 -»4)-2-acetamido-2-deoxy-3-<?-[ l-(R)-(pentafluorfenoxy karbony I)ethyl-a-D-glukopyranosidu vzorce X, který se bez další purifikace kondenzuje s peptidovou komponentou (viz příklad 10). Pro (C₃₂H37F₅N₂Oi₃) vypočteno: relativní molekulová hmotnost

752,6, monoisotopická hmotnost 752,2. ESI MS, m/z: 775,6 [M + Na]⁺.

Příklad 10

K míchanému roztoku benzyl-2-amino-2-deoxy-(3-D-glukopyranosyl-(l-»4)-2-acetamido-2deoxy-3-O-[ l-(R)-(pentafluorfenoxykarbonyl)ethyl-a-D-glukopyranosidu vzorce X (753 mg, 1 mmol) se pří 0 °C přidá roztok L-AIa-D-iso-GIn-OBn (615 mg, 2mmol) a A-methylmorfoiinu (0,30 ml, 2,73 mmol) v pyridinu (6 ml) a v míchání se pokračuje 20 h při +5 °C. Směs se za vakua odpaří a odparek se za vakua kodestiluje s kyselinou octovou (10 ml) a chromatografuje na koloně silikagelu C18 v soustavě voda - methanol (lineární gradient: 0^30 %, 60 min). Lyofilizací odparku homogenní frakce z vody se získá 744 mg (85,0 %) benzyl esteru Y-{2-O-[benzyl2-acetamido-2-deoxy~P-D-gIukopyranosyl-(l->4}-2-acetamído-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl]-(R)-laktoyl}-L-alanyl-D-Ísoglutaminu obecného vzorce XI (kde substituent X je L-Ala-D iso-Gln-OBn); [a]_D +50 (c 0,4, 50% methanol ve vodě). Pro (C^^NsO^) vypoč50 teno: relativní molekulová hmotnost 875,9, monoisotopická hmotnost 875,4. ESI MS, m/z: 898,4 [M + Naf. Pro C₄|H_S7N_SO,₆ (875,9) vypočteno: 56,22 % C, 6,56% H, 8,00% N; nalezeno: 55,81 % C, 6,60 % H, 7,90 % N.

-9CZ 301451 B6

Příklad 11

Benzylester V-{2-í?-[benzyl-2-acetamido-2-deoxy-3~D-glukopyranosyl-( 1 ->4)-2-acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyrano$id-3-yl]-(R)-laktoyl}-L-alanyl-D-isoglutaniinu obec5 ného vzorce XI (kde substituent X je L-Ala-D-iso-Gln-OBn) (876 mg, 1 mmol) se hydrogenolyzuje vodíkem na 5% paladiovém katalyzátoru na uhlí (300 mg) v kyselině octové (14 ml) při teplotě místností 48 h. Po propláchnutí aparatury argonem se katalyzátor odfiltruje, promyje 50% kyselinou octovou (30) a filtrát za vakua odpaří. Odparek se chromatografuje na koloně silikagelu 08 v soustavě voda - methanol (lineární gradient: 0-»20 %, 60 min). Lyofilizaci odparku io homogenní frakce z vody se získá 612 mg (88,0%) 2-acetamido-2-deoxy-p-D-glukopyranosy Η1 ->4)-zV-acety lmuramy l-L-alany l-D-isoglutaminu obecného vzorce IX (kde substituent X je L-Ala-D-iso-GIn-OH); [a]_D -3 (c 0,3, voda); lit.²⁷ [ot]D -2 (c 1,0, voda). Pro (C27H45N5OI6) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 695,7, monoisotopická hmotnost 695,3. ESI MS, m/z\ 718,5 [M + Na]⁺. Pro C27H₄₅N₅O,₆ (695,7) vypočteno: 46,62 % C, 6,52 % H, 10,07 % N; naleželí no: 46,21 % C, 6,85 % H, 9,96 % N.

Struktura výše jmenovaných látek byla dále jednoznačně prokázána jejích 'H a ¹'C NMR spektry.

Průmyslová využitelnost

Látky podle vynálezu lze využít v základním výzkumu, farmaceutickém průmyslu a v humánním a veterinárním lékařství.

Literatura

1. Adam A., in: Synthetic Adjuvants, p. 1. John Wiley and Sons, New York 2004.

2. Andronova T. M., Ivanov V. T.: Soviet Medical Reviews; Sectin D, Immunology Reviews Ser. 1991, 4, 1.

jo 3. Azuma I.: Vaccine 1992,10, 1000.

4. Baschang G,: Tetrahedron 1989,45, 6331,

5. Híraoka A., Masaoka T., Satoh T., Ota K., Oyama A., Horiuchi A., Hasegawa H., Nagai K., Kosaki M., Kanemaru A.: Arzneimittel-Forschung 1988, 38, 1499.

6. Furuse K., Sakuma A.: Arzneimittel-Forschung 1989, 39, 915.

7. Khaidukov S, V., Komaleva R. L,, Nesmeyanov V. A.: International Journal of Immunopharmacology 1995,17, 903.

8. Yoo Y. C., Yoshímatsu K., Koike Y., Hatsuse R., Yamanishi K., Tanishita O., Arikawa J., Azuma I.: Vaccine 1998, 76,216.

9. Namba K., Nakajima R., Otani T., Azuma I.: Vaccine 1996,14, 1149.

10. Nikí Y., Tatara O.: Advances in Experimental Medicine and Biology 1992, 319, 185.

11. Yoo Y. C., Park S. Y., Lee Κ. B., Azuma 1.: Journal of Microbiology and Biotechnology 2000,10, 399.

12. Aston R. (Biokine Technology Ltd., UK): WO 93/10148.

13. Aston R., Maitchouk I., Andronova T, M, (Peptech (Uk) Limited, UK): WO 96/09063.

14. VosikaG. J., Comelius D. A., Bennek J. A., Sadlik J. R., Gilbert C. W.: Molecular Biotherapy 1990, 2, 50.

15. Vosika G. J., Comelius D. A., Gilbert C. W., Sadlik J. R., Bennek J. A., Doyle A., Hertsgaard D.: Journal of Immunotherapy 1991,10, 256.

16. Fast D. J., Vosika G. J.: Vaccine 1997, 75,1748.

17. Vosika G. J. (Endorex Corporation, USA): WO 97/43308.

-10CZ 3(11451 B6

18. Powell M. F., Newman M. J.: Vaccine design, (M. F. Powell, M. J. Newmamn Eds.), p, 141, Plenům Press, New York 1995.

19. Banoub J., Boullanger P., Lafont D.: Chemical Reviews 1992, 92, 1167.

20. Garegg P. J.: Advances in Carbohydrate Chemistry and Bíochemistry 1997,52,179.

21. Paulsen H.: Angewandte Chemie-lntemational Edition in English 1982,21, 155.

22. Schmidt R. R., Kinzy W.: Advances in Carbohydratw Chemistry and Bíochemistry 1994, 50,

21.

23. Sinay P.: Pure and Applied Chemistry 1991, 63, 519.

24. Inage M., Imoto M., Kambayashi Y., Kusumoto S., Shiba T.: Tetrahedron Letters, 1980, 21, io 3767.

25. Kusumoto S., Yamamoto K., Imoto M., Inage M., Tsuj imoto M-, Kotani S., Shiba T.: Bulletion of the Chemical Society of Japan 1986, 59, 1411.

26. Durette P. L„ Meítzner E. P.: Carbohydrate Research 1981, 89, 279.

27. Kisu M., Kaneda Y., Shimizu R., Ilasegawa A., Azumal,: Carbohydrate Research 1982,

704,253.

28. Durette P. L. (Merck and Co., Inc. USA): EP 018 901.

29. Kantoci D., Keglevic D., Derome A. E.: Carbohydrate Research 1987,162,227.

30. Kusumato S., Imoto M., OgikuT., Shiba T.: Bulletion of the Chemical Society of Japan 1986, 59, 1419.

31. Termín A., Schmidt R. R.: Liebigs Annalen der Chemie 1989, 789.

32. Termín A., Schmidt R. R.: Liebigs Annalen der Chemie 1992, 527.

33. Vosika G. J. (Endorex Corporation, USA): WO 97/12894.

34. Bezrukova E. J. (Bezrukov, Mikhail Vasilievich, Russia and Bezrukova, Elena Jurievna, RU): WO 97/10259.

35. Bistricenko A. (Bistricenko, Andrejs Latvia and Jermolajevs, Jevgenijs): LV 10963.

36. Vosika G. J. (Immuno Therapeutics, Inc. USA): WO 90/00396.

37. Farkaš J., Ledvina M., Brokeš J., Ježek J., Zajíček J., Zaoral M.: Carbohydrate Research 1987,163, 63.

38. Veselý J,, Ledvina M., Jindřich J., Šaman D., Trnka T.: Collection of Czechoslovak Chemi30 cal Communications 2003, 68, 1264.

39. Ledvina M., Farkaš J., Zajíček J., Ježek J., Zaoral M.: Collection of Czechoslovak Chemical Communications 1989, 54, 2784.

40. Zaoral M., Ježek J., Straka R., Mašek K.: Collection of Czechoslovak Chemical Communications 1978, 43,1977.

41. Keglevic D., Pongracic M.: Carbohydrate Research 1984, 735, 85.

42. Flowers Η. M., Jeanloz R.: Journal of Organic Chemistry 1963, 28,2983.

43. Arita H., Fukukawa K„ Matsushima Y.: Bulletion of the Chemical Society of Japan 1972, 45, 3611.

44. Hasegawa A., Kaneda Y., Amano M., Kiso M., Azuma L: Agricultural and Biological

Chemistry 1978, 42, 2187.

Claims

5 1. Disacharidový synthon vzorce I
2. Způsob přípravy látky vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, žejakoglyio kosylakceptor se při její syntéze použije derivát kyseliny muramové vzorce II který se připraví z látky vzorce III přičemž látka vzorce III se 3—O—alky lácí kyselinou 2-brompropionovou a následnou esterifikací převede na látku vzorce IV která se převede odštěpením isopropylidenové skupiny na látku vzorce V

- 12 CZ 301451 B6 ta se parciální benzoylací benzoylimidazolem převede na glykosylakceptor vzorce II

COOCH3

II

5 který reakcí s 3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-2-ftalimido-fM)-glukopyranosylbromÍdem, jako glykosyldonorem, poskytne disacharid vzorce VI

10 ten se převede postupným odstraněním alkalilabilních chránících skupin, tj. acetylové, benzoylové, methy testerové a ftalimidové, na látku vzorce VII

15 která V-acetylací poskytne disacharidový synthon vzorce I.
3. Použití dísacharidového synthonu vzorce I podle nároku 1 při syntéze muramylových glykopeptidů založených na molekule GMDP obecného vzorce IX kde substituent X je peptidový zbytek, přičemž se disacharidový synthon vzorce I reakcí s bis(pentafluorfenyl)karbonátem převede na látku vzorce X, kde PfP = pentafluorfenyl,

- 13CZ 301451 B6 která se reakcí s peptidovou komponentou převede na látku obecného vzorce XI kde substituent X je peptidový zbytek, ta odštěpením chránících skupin za podmínek daných jejich charakterem poskytne látku obecného vzorce IX kde substituent X je peptidový zbytek.