CZ300546B6

CZ300546B6 - Fyziologicky aktivní konjugát, prostredek a zpusob prípravy

Info

Publication number: CZ300546B6
Application number: CZ20012654A
Authority: CZ
Inventors: Sebastian Bailon@Pascal
Original assignee: Amgen, Inc.
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2009-06-10
Also published as: RS50928B; EA200400067A1; EP1157037A1; CA2361766A1; US20050196378A1; PL363117A1; CN1376164A; ATE246202T1; NZ513113A; US20080287659A1; PT1157037E; CA2361766C; IL144361A0; NO331787B1; ES2204509T3; BG105851A; KR20020007296A; ZA200105932B; SK10352001A3; WO2000044785A1

Abstract

V predloženém rešení jsou popsány fyziologicky aktivní konjugáty PEG-GCSF obecného vzorce I a rovnež prostredky, které obsahují smes konjugátu, u nichž m a n mohou být ruzná celá císla pro jednotlivé konjugáty ve smesi.

Description

Oblast techniky

Faktor stimulující kolonie granulocytů (GCSF) je farmaceuticky aktivní protein, který reguluje množení, diferenciaci a funkční aktivaci neutrofílních granulocytů (Metcalf, Blood67: 257 (1986); Van a kol., Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger a kol., Blood 81(1): 3158-3163 (1993); Roberts a kok, Exptl. Hematology 22: 1 156-1 163 (1994); Neben a kol., Blood 81(7): 1960-1967 (1993)). GCSF může mobilizovat kmenové buňky a prekurzorové buňky kostní dřeně a je používán pro léčení pacientů, jejichž granulocyty byly vyčerpány chemoterapií, nebo jako příprava před transplantací kostní dřeně .

Dosavadní stav techniky

Patent US 5 214 132 popisuje mutovanou formu lidského GCSF, která se tiší od přirozeného hGCSF na pozicích 1, 3, 4, 5 a 17, kde namísto přirozených GCSF aminokyselin má mutovaná forma Ala, Thr, Tyr, Arg, respektive Ser. (Viz také Kuga a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103-111 (1989)). M. Okabe a kol., (Blood 75(9): 1 788-1 793 (1. květen 1990)) popisuje derivát rhGCSF, v němž byly zaměněny aminokyseliny na pěti pozicích v N-koncové oblasti rhGCSF, který vykazoval ve dvou testech na myších a/nebo lidských buňkách kostní dřeně vyšší specifickou aktivitu než původní rhGCSF. Patent US 5 218 092 popisuje mutovanou formu lidského GCSF, která se liší od přirozeného hGCSF na pozicích 1, 3, 4, 5, 17, 145 a 147, kde namísto přirozených GCSF aminokyselin má mutovaná forma Ala, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn, respektive Ser. Obsahy patentů US 5 214 132 a US 5 218 092 jsou zde zahrnuty jako odkaz.

Biologická dostupnost proteinových léčiv, jako je GCSF, je často omezena jejich krátkým poločasem v plazmě a citlivostí k degradaci proteázou, což zabraňuje maximálně využít jejich klinické možnosti. Studie jiných terapeutických proteinů ukázaly, že takové potíže mohou být překonány konjugací proteinu k polymeru, jako je polyethylenglykol (PEG), typicky například pomocí složky kovalentně vázané jak k proteinu, tak k PEG.

U takovýchto biologických molekul konjugovaných s PEG bylo ukázáno, že mají užitečné klinické vlastnosti (Inada a kol., J. Bioact. and Compatible polymers, 5: 343 (1990); Delgado a kol., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9: 249 (1992); a Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10: 91 (1993)). Jde například o lepší fyzikální a tepelnou stabilitu, ochrana proti citlivosti k enzymatické degradaci, zvýšená rozpustnost, delší invivo poločas cirkulace a snížené vylučování, snížená imunogenita a antigenicita a snížená toxicita.

Konjugáty PEG-GCSF, které mají jinou strukturu než konjugáty, kteréjsou předmětem tohoto vynálezu, jsou popsány v publikaci evropského patentu EP 0 335 423; v publikaci evropského patentu EP 0 401 384; R. W. Niven a kok, J. Controlled Release 32: 177-189 (1994); a SatakeIshikawa a kol., Cell Structure and Function 17: 157-160 (1992)).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je nová třída PEG derivátů GCSF. Konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má amidový linker a je zobrazen dále.

Ve srovnání s nemodifikovaným GCSF (tj. GCSF bez připojeného PEG), má konjugát zvýšený poločas cirkulace a doby výskytu v plazmě, snížené vylučování a zvýšenou aktivitu tvoření granulocytů in vivo. Dále ve srovnání s PEG-GCSF konjugáty, konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má vynikající vlastnosti, pokud se týká podpory tvoření granulocytů. Jiné PEG-GCSF

- 1 CZ 300546 B6 konjugáty jsou popsány v publikaci evropského patentu EPO 335 423; v publikaci evropského patentu EP 0 401 384; a v Niven a kok, J. Controlled Release 32: 177-189 (1994). Avšak konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má odlišnou strukturu od těchto konjugátů a má vynikající vlastnosti, zvláště vykazuje dlouhodobou, vysokou aktivitu podpory tvoření granulocytů in vivo při nízké dávce.

Výhodný GCSF, který je předmětem tohoto vynálezu, je mutovaná forma GCSF, která má vlastnosti rovnocenné nebo lepší, než přirozený GCSF a má stejné způsoby použití jako GCSF. Mutovaná forma má stejnou aminokyselinovou sekvenci jako GCSF, kromě pozic 1, 3,4, 5 a 17, kde namísto přirozených aminokyselin má mutovaná forma Ala, Thr, Tyr, Arg, respektive Ser (mutovaná forma GCSF) (viz obrázek 1). Tato mutovaná forma je popsána v patentu US 5 214 132, který je zde zahrnut jako odkaz.

Fyziologicky aktivní PEG-GCSF konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má obecný vzorec I

RO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-C-NH (l)

Součástí tohoto vynálezu jsou také prostředky připravené z nárokovaných konjugátů, kde man mohou být různá celá čísla pro konjugáty v prostředku.

Konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má stejné použití jako GCSF. Konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, je zvláště užitečný pro léčení těch pacientů, jejichž granulocyty byly vyčerpány chemoterapií, nebo jako příprava před transplantací kostní dřeně stejným způsobem jako je GCSF používán pro léčení stejných stavů. Avšak konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má vylepšené vlastnosti včetnč vynikající stability, vyšší rozpustnosti, zvýšeného poločasu cirkulace a prodloužené doby výskytu v plazmě.

Nárokovaným vynálezem je fyziologicky aktivní konjugát PEG-GCSF, který má obecný vzorec I

O

RO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-C-NH-m (i) kde G je faktor stimulující kolonie granulocytů, bez těch jeho aminových skupin, které se účastní amidové vazby se strukturou PEG, jak je uvedeno v obecném vzorci I, R je nižší alkyl, n je celé číslo od 420 do 550 a m je celé číslo od 1 do 5.

Čísla n a m jsou vybrána tak, že výsledný konjugát obecného vzorce I má fyziologickou aktivitu srovnatelnou s nemodifikovaným GCSF, tato aktivita může být stejná, větší nebo představovat část odpovídající aktivity nemodifikovaného GCSF. n představuje počet ethylenoxidových zbytků v jednotce PEG. Jedna podjednotka PEG tj. OCH2CH2 má molekulovou hmotnost asi 44 daltonů. m představuje počet jednotek PEG připojených k molekule GCSF. Konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, může mít jednu, dvě, tři, čtyři, pět nebo šest jednotek PEG na molekulu GCSF. Molekulová hmotnost konjugátu (mimo molekulové hmotnosti GCSF) tedy závisí na číslech n a m.

-2CZ 300546 B6 n může mít hodnotu 420 až 550, a vytváří tak konjugát v němž každá jednotka PEG má průměrnou molekulovou hmotnost od asi 18 000 daltonů do asi 25 000 daltonů na jednu jednotku PEG. Je výhodné, když n má hodnotu 450 až 490, a vytváří tak konjugát v němž každá jednotka PEG má průměrnou molekulovou hmotnost asi 20 000 daltonů. m může mít hodnotu 1, 2, 3, 4 nebo 5.

Výhodné m je 1 až 4 a zvláště výhodné m je 2. Rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je asi od 18 000 daltonů (n=420; m=l) do asi 125 000 daltonů (n=550; m=5). Když n je 420 až 550 a m je celé číslo 1 až 4, rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je asi od 18 000 daltonů (n=420; m=l )do asi 97 000 daltonů (n=550; m=4). Molekulová hmotnost „asi“ určité číslo znalo mená, že molekulová hmotnost je v přiměřené blízkosti tohoto čísla, při zjišťování běžnými analytickými technikami.

Ve výhodném provedení konjugátu je n 450 až 490 amje 1 až 4, a v tomto případě je rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů od asi 20 000 daltonů (n-450; m=l)do asi

86 000 daltonů (n=490; m=4). V jiném výhodném konjugátu je n 420 až 550 a m je 2, v tomto případě je rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů asi od 37 000 daltonů (n=420) do asi 48 000 daltonů (n=550). Ve zvláště výhodném konjugátu je n 450 až 490 a m je 2, v tomto případě je rozsah molekulové hmotnosti PEG části konjugátů asi od 40 000 daltonů (n=450) do asi 43 000 daltonů (n=490).

R může být jakýkoli nižší alkyl, čímž je míněna alkylová skupina, která má od jednoho do šesti uhlíkových atomů, jako jsou methyl, ethyl, isopropyl atd. Jsou zahrnuty i rozvětvené alkyly. Výhodným alkylem je methyl.

Zkratkou GCSF je míněn přirozený nebo rekombinantní protein, s výhodou lidský, který je získán z jakéhokoli běžného zdroje, jako jsou tkáně, syntéza proteinů, buněčná kultura přirozených nebo rekombinantních buněk. Je sem zahrnut jakýkoli protein, který má aktivitu GCSF, jako jsou muteiny nebo jinak modifikované proteiny. Získání a izolace GCSF z přírodních nebo rekombinantních zdrojů jsou dobře známy (viz například patent US 4 810 643 a patent US 5 532 341, jejichž obsahy jsou zde zahrnuty jako odkaz). Výhodný GCSF konjugát je konjugát s GCSF Muteinem, jak je popsáno v patentu US 5 214 132.

Fyziologicky aktivní konjugát obecného vzorce I má GCSF aktivitu, čímž je míněna jakákoli část nebo násobek jakékoli známé GCSF aktivity, jak je určováno různými testy, známými v oboru.

Zvláště platí, že konjugát, který je předmětem tohoto vynálezu, má GCSF aktivitu, která se projevuje schopností zvyšovat počet PMN. Toto je známá aktivita GCSF. Tento druh aktivity konjugátu může být určen testy, které jsou v oboru dobře známé, například testy, které jsou popsány dále (viz také: Asano a kol., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2 767-2 773; Yamasaki a kol., J. Biochem. (1994) 115: 814-819; a Neben a kol., Blood (1993) 81: 1960).

Konjugát obecného vzorce I vzniká kovalentní vazbou GCSF s reakčním činidlem, kyselinou sukcinimidylpropionovou (SPA), která má obecný vzorec: II

Reakční činidlo obecného vzorce II může být získáno běžnými metodami, podle známých postupů (viz patent US 5 672 662, jehož obsah je zde zahrnut odkazem), n je stejné jako v obecném vzorci 1 výše, a je vybráno tak, aby byl vytvořen konjugát požadované molekulové hmotnosti. Jsou výhodné takové reagencie, v nichž je n od 450 do 490 (molekulová hmotnost =

-3CZ 300546 B6

000 daltonů). Jiné molekulové hmotnosti mohou být získány pomocí běžných metod změnami n u výchozího materiálu PEG-alkohol pro reakční činidlo obecného vzorce II. Reakční činidlo SPA obecného vzorce II s molekulovou hmotností 5, 10, 15 a 20 000 může být získáno od Shearwater PolymersPolymers, lne., (Huntswille, Alabama).

Reakční činidlo obecného vzorce II může být konjugováno kGCSF pomocí běžných metod. Vazba se uskutečňuje pomocí amidové vazby. Přesněji řečeno, reakční činidlo obecného vzorce II primárně reaguje s jednou nebo více primárními aminovými skupinami (například N-konec a postranní řetězce lysinu) GCSF a vytváří amidovou vazbu mezi GCSF a polymerovou kostrou PEG. NH uvedené v obecném vzorci I je odvozeno z této primární aminové skupiny (skupin) GCSF, která reaguje s reakčním činidlem obecného vzorce II a vytváří amidovou vazbu. V menším rozsahu může reakční činidlo obecného vzorce II také reagovat s hydroxylovou skupinou šeřinu na pozici 66 v GCSF a vytvořit esterovou vazbu mezi GCSF a polymerovou kostrou PEG. Podmínky reakce jsou běžně známé osobám se zkušeností v oboru a jsou detailně popsány dále.

Připojení reakčního činidla k GCSF může být provedeno běžnými metodami. V tomto vynálezu může být použit PEG o jakékoli vybrané molekulové hmotnosti (n). Například reakce může být provedena v roztoku při pH od 5 do 10, při teplotě od 4 °C do teploty místnosti, po dobu od 30 minut do 20 hodin, za použití molámího poměru reakčního činidla k proteinu od 4:1 do 30:1. Reakční podmínky mohou být vybrány tak, aby reakce směřovala k vytváření převážně požadovaného stupně substituce. Obecně platí, že nízká teplota, nízké pH (např. pH 5) a krátká doba reakce mají tendenci snižovat počet připojených PEG (nízké m). Vysoká teplota, neutrální až vysoké pH (např. pH >7) a delší doba reakce zvyšují počet připojených PEG (vyšší m). Například v případě reakčního činidla obecného vzorce II s molekulovou hmotností 5000 daltonů, při pH 7,3 a molámím poměru reakčního činidla k proteinu 30:1, teplotě 4 °C a reakční době 30 minut, vzniká převážně konjugát s jedním PEG (mono—PEG); při teplotě 4 °C a reakční době 4 hodiny vzniká převážně konjugát se dvěma PEG (di-PEG); a při teplotě místnosti a reakční době 4 hodiny vzniká převážně konjugát se třemi PEG (tri-PEG). Reakce je ukončena okyselením reakční směsi a zmražením na —20 °C. Obecně je dávána přednost pH od 7 do 7,5 a molárnímu poměru reakčního činidla k proteinu od 4:1 do 6:1.

Purifikační metody, které účinně oddělují konjugáty podle jejich rozdílných molekulových hmotností, jako je kationtová výměnná chromatografie, mohou být použity pro oddělení konjugátů podle rozdílů v náboji. Například sloupec pro výměnu kationtů může být navrstven a potom promyt ~20 mM octanem sodným, pH ~4, a potom vymýván lineárním gradientem (0 M až 0,5 M) NaCI, pufro váným při pH od 3 do 5,5, s výhodou při pH -4,5. Obsah frakcí, získaných kat iontovou výměnnou chromatografií může být určován podle molekulové hmotnosti pomocí běžných metod, například hmotnostní spektroskopií, SDS—PAGE nebo jinými známými metodami pro oddělování molekul látek podle molekulové hmotnosti. Podle toho jsou určeny frakce obsahující konjugát obecného vzorce I, který má požadovaný počet (m) připojených PEG, vyčištěny od nemodifikovaného GCSF a od konjugátů, které mají připojený jiný počet PEG.

Součástí tohoto vynálezu je prostředek z konjugátů, kde jsou zastoupeny ve specifických poměrech konjugáty, které mají různé hodnoty m. Výhodným prostředkem tohoto vynálezu je směs konjugátů, kde m-l. 2, 3 a 4. Procento konjugátů, kde m=l, je 18 až 25 %, procento konjugátů, kde m=2, je 50 až 66 %, procento konjugátů, kde m=3, je 12 až 16 % a procento konjugátů, kde iTrM. je až 5 %. Takový prostředek je připravován reakcí pegylačního reakčního činidla s GCSF v molámím poměru od 4:1 do 6:1 (nadbytek reakčního činidla). Reakce je ponechána probíhat při 4 až 8 °C po dobu 20 hodin při pH blízko 7,5. Na konci reakce je přidána kyselina octová. Konjugát je potom purifikován od zbytkového nemodifikovaného proteinu, nadbytku pegylačního reakčního činidla, ostatních nečistot a složek pufru, přítomných v průběhu reakce. Spolu s pegylovaným· proteinem, vznikají jako vedlejší reakční produkty N-hydroxysukcinimid a polyethylenglykolkarboxylová kyselina.

-4CZ 300546 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Primární struktura GCSF Muteinu

Uvedený GCSF Mutein se liší od standardního typu lidského GCSF na pozicích 1,3, 4, 5 a 17, kde namísto přirozených aminokyselin má mutein Ala, Thr, Tyr, Arg, respektive Ser.

Obrázek 2: Reagencie pro pegylaci.

Obrázek 3: Vzájemné oddělení 20 kDa GCSF Muteinu, modifikovaného pomocí PEG od formy nemodifikované PEG. Typický eluční profil pro PEG reakční směs.

Sloupec: 1 až 2 ml Fractogel® EMD SO₃ 650S.

Ekvilibrační pufr: 10 mM octan amonný, pH 4,5 Eluční pufry: 1. 0,15 M NaCl v ekvilibraěním pufru

2. 0,5 M NaCl v ekvilibraěním pufru

Obrázek 4: Aktivita PEG-GCSF Muteinu 5. den po jedné injekci

Samice myšího kmene C57BL/6J dostaly podkožně injekci obsahující 25,2 pg pegylovaných konjugátů GCSF Muteinu; 5. den po podání injekce byly odebrány vzorky žilní krve z dutiny za očnicí. Byly provedeny hematologické a leukocytové diferenciální analýzy; výsledné počty neutrofilů byly standardizovány k nosičové kontrole, prováděné v každém pokuse. Uvedené údaje představují průměr ± standardní odchylku (S.E.) ze čtyř myší ve skupině.

Obrázek 5: Zvýšení počtů PMN jako funkce hmotnosti PEG (kDa) v amidem a močovinou vázaných konjugátech PEG-GCSF Muteinu. Pro konjugáty připravené pomocí reakěního činidla SPA PMN=0,277*molekulámí hmotnost+3,95. Pro konjugáty připravené pomocí močoviny PMN=0,152* molekulární hmotnost+2,74.

Obrázek 6: Aktivita PEG-GCSF Muteinu 7. den pojedná injekci

Samice myšího kmene C57BU6J dostaly podkožně injekci obsahující 25,2 pg pegylovaných konjugátů GCSF Muteinu; 7. den po podání injekce byly odebrány vzorky žilní krve z dutiny za očnicí. Byly provedeny hematologické a leukocytové diferenciální analýzy; výsledné počty neutrofilů byly standardizovány k nosičové kontrole, prováděné v každém pokuse. Uvedené údaje představují průměr ± standardní odchylku (S.E.) ze čtyř myší ve skupině.

Obrázek 7: Test mobilizace kolonií myších PBSC

Obrázek 8: Test mobilizace kolonií myších PBSC

Obrázek 9: Test mobilizace kolonií myších PBSC

Obrázek 10: Test mobilizace kolonií myších PBSC

Obrázek 11: Test mobilizace kolonií myších PBSC

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou podány pro ilustraci zde popsaného vynálezu a žádným způsobem jej neomezují. V těchto příkladech je použit GCSF Mutein. Jiné druhy GCSF mohou být také pomocí uvedených metod konjugovány s PEG.

Příklad 1: Pegy lační reakční činidla: l.GABA amidový línker (P-6GA-1, P-12Ga-l)

Reakční činidlo GABA amidového linkeru obsahuje 2 řetězce PEG, každý s molekulovou hmotností 6000 nebo 12 000 daltonů. Struktury viz na obrázku 2-A.

-5CZ 300546 B6

2. Amidový linker (P-5 am-1, P-10am-l)

Byly připraveny amidové linkery s molekulovou hmotností 5000 a 10 000 daltonů. Strukturu viz na obrázku 2-B.

3. Amidový linker

Tímto reakčním činidlem byla komerčně dostupná kyselina sukcinimidylpropionová (SPA), připravená s PEG o molekulové hmotnosti 5, 10, 15 a 20 000 daltonů ajejich obecná struktura je zobrazena na obrázku 2-C.

4. Linker odvozený od močoviny

Toto reakční činidlo bylo připraveno s molekulami PEG 5, 10 a 25 000 daltonů a obecná struktura je zobrazena na obrázku 2-D.

5. Uretanový linker

Byly připraveny uretanové linkery o molekulové hmotnosti 10 a 20 000 daltonů a struktura je zobrazena na obrázku 2-E.

6. Uretanový linker

Jak ukazuje struktura tohoto komerčně připraveného reakěního činidla PEG o molekulové hmotnosti 36 000 daltonů, zobrazeného na obrázku 2-G, jeden konec reakěního činidla je zakončen tbutylovou skupinou. Toto reakční činidlo bylo PEG o nejvyšší molekulové hmotnosti, použitý v tomto příkladě.

7. Sulfanyluretanový linker

Strukturu tohoto pegylačního reakěního činidla je možno vidět na obrázku 2-F. Molekulová hmotnost PEG použitého v tomto reakčním činidle byla 20 000 daltonů.

Následující reakční činidla byla poskytnuta Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokyo, Japonsko): 1)G-CSF mutein označený GCSF Mutein, GCSF Mutein konjugovaný s reakčním činidlem meth oxy polyethylenglykolem s větveným řetězcem (m-PEG), obsahujícím 2 řetězce m-PEG o molekulové hmotnosti buď 6000 nebo 12 000 daltonů (PEG-GABA-NHS, viz obrázek 2A) GCSF Mutein konjugovaný s lineárním reakčním činidlem ester/amid m-PEG (viz obrázek 2B) s molekulovou hmotností 5000 a 10 000 daltonů. Reakční činidla m-PEG-sukcinimidylpropionová kyselina-NHS (PEG-SPA) o molekulových hmotnostech 5000, 10 000, 15 000 a 20 000 daltonů byla zakoupena od Shearwater Polymers (Huntsville, Alabama, viz obrázek 2C). Následující reakční činidla pro pegy láci proteinů byla připravena v Hoffmann-La Roche, lne: 1) linker m-PEG-močovina (5000, 10 000 a 25 000 daltonů, viz obrázek 2D), 2) linker m—PEGuretan (5000, 10 000 a 25 000 daltonů, viz obrázek 2E), m-PEG-sulfanyluretanový linker (10 000 a 20 000 daltonů, viz obrázek 2F) a t-butyl-m-PEG-uretanový linker s průměrnou molekulovou hmotností 36 000 daltonů byl získán od DDI Pharmaceuticals, lne. (Mountaínvíew, CA, viz obrázek 2G).

Pegy lační reakce

Faktory, které ovlivňují pegylační reakce jsou 1) pH, 2) teplota, 3) doba reakce, 4) molární poměr proteinu k reakčnímu činidlu PEG, a 5) koncentrace proteinu. Kontrolou jednoho nebo více z těchto faktorů je možno reakci řídit směrem k produkci mono-, di-, tri-, atd. PEG konjugátů. Například reakční podmínky pro reakční činidlo Shearwater Polymers SPA-PEG 5000 (N-hydroxysukcinimid) byly: 1) pH 7,3, 2) teplota 4 °C pro mono-PEG a di-PEG, a teplota místnosti pro tri PEG. 3) doba reakce 30 minut pro mono-PEG; 4 hodiny pro di-PEG a tri-PEG; a 4) molární poměr proteinu k reakčnímu činidlu 1:30. Pro všechna reakční činidla byly optimální reakční podmínky pro přípravu požadovaného druhu PEG individuálně určeny. Jsou uvedeny v tabulce 1. Reakce je ukončena okyselením reakce a zmražením na -20 °C.

Oddělení modifikovaného a volného GCSF Muteinu z reakční směsi (výměna kationtů na sulfopropylové skupině (SP))

Reakční směs obsahující přibližně 5 mg proteinu byla zředěna 10 až 20x vodou a pH bylo upraveno ledovou kyselinou octovou na 4,5. Zředěné vzorky potom byly na předem navrstvený 1 až 2 ml sloupec Fractogel EMD SO3 - 650S (EM Separations, Gibbstown, New Jersey), kteiý byl

-6 CZ 300546 B6 v rovnováze s 10 mM octanem amonným, pH 4,5. Neadsorbované reakční činidlo a vedlejší produkty reakce byly odstraněny při průtoku. Modifikovaný GCSF Mutein byl vymyt pomocí stupňovitého gradientu, za použití 0,15 M NaCI v rovnovážném pufru. Nemodifikovaný GCSF Mutein, zbývající na sloupci byl eluován pomocí 0,5 M NaCI v rovnovážném pufru. Rozdělená směs PEG konj ugátu GCSF Muteinu byla sterilována filtrací pomocí 0,2 pm filtru a uložena zmražena při -20 °C.

Charakterizace PEG konjugátů GCSF Muteinu

Určování proteinu.

Koncentrace proteinu v purifikovaných PEG konjugátech GCSF Muteinu byly zjišťovány pomocí hodnoty A₂₈₀, která se rovná 0,86 u roztoku s koncentrací 1 mg/ml. Analýza pomocí SDSPAGE

Tato analýza byla provedena za použití 12 a 15% polyakrylamidových gelů nebo 8 až 16% polyakrylamidových gradientových gelů za redukčních podmínek podle Laemmliho, Nátuře 227: 680-685, 1970.

Určení procentuálního složení v prostředku

Procentuální zastoupení každého druhu (mono-, di-, tri-, atd.) v různých reakčních směsích PEG konjugátů GCSF Muteinu bylo určováno pomocí denzitometrických měření SDS-PAGE gelů, obarvených modří Coomassie (viz tabulka 2).

Určení hmotnosti PEG v PEG konjugátech GCSF Muteinu

Celková hmotnost PEG, substituovaného v různých přípravcích byla určována podle průměrné molekulové hmotnosti PEG, určení jednotlivých PEG konjugátů (mono, di, atd.) na základě elektroforetické pohyblivosti, počtu připojených molekul PEG a na procentuálním zastoupení, určeném na základě denzitometrických měření SDS-PAGE gelů, obarvených modří Coomassie. Celková hmotnost PEG v určitém přípravku je součtem hmotností jeho jednotlivých PEG. Hmotnost jednotlivých PEG je spočítána z následující rovnice:

hmotnost PEG= molekulová hmotnost PEG x počet molekul PEG x % obsahu kde molekulová hmotnost PEG - 5000, 10 000, 20 000 daltonů počet molekul PEG = 1,2, 3 pro mono, di, respektive tri.

Hmotová spektrometrie (MALDI-TOF) byla také používána při určování celkové hmotnosti PEG. V takovém případě hmotnostní spektrum umožňovalo určení molekulové hmotnosti jednotlivých konjugátů PEG. Molekulová hmotnost PEG připojeného ke každému PEG konjugátu je sumou molekulových hmotností jednotlivých PEG konjugátů mínus molekulová hmotnost GCSF Muteinu (18 900 daltonů). Tyto hodnoty násobeny procentuálním zastoupením dávají jednotlivé hmotnosti PEG; jejich součtem je celková hmotnost PEG.

Obě metody byly použity pro určování hmotností PEG v různých přípravcích.

Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 2.

Určování hladin endotoxinů

Hladiny endotoxinů byly určovány pomocí metody LAL, podle návodu výrobce (Associates of Cápe Cod. Inc., Woods Hople, Massachusetts).

-7CZ 300546 B6

Biologické aktivity

Biologický test in vitro na buňkách M-NFS-60 a in vivo test na samici myšího kmene C57BL/6J byly provedeny tak, jak bylo dříve popsáno. (Viz Asano a kol., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773).

Výsledky a diskuse

Pegylační reakce

Výsledky obecně ukazují, že méně reaktivní reakční činidla, jako je linker odvozený od močoviny, vyžadují vyšší pH, teplotu a molámí poměr protein:reakční činidlo, a rovněž delší dobu reakce, aby bylo dosaženo požadovaného rozsahu konjugace (viz tabulky 1 a 2).

Oddělení modifikovaného a volného GCSF Muteinu z reakční směsí

Typický eluční profil je ukázán na obrázku 4. Vedle kat iontové výměnné chromatografie mohou být vyžadovány další kroky, jako je chromatografie na základě prostupování gelem, aby byly odstraněny stopy kontaminujících látek a endotoxinu, a provedena výměna pufru u konečného produktu pro uložení. Byly vypracovány účinné separační metody pomocí kationtové výměny pro rozsah 30 mg konjugátu, buď SPA (amidového) s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a uretanového s molekulovou hmotností 20 000 daltonů. Tímto postupem jsou získány téměř kvantitativní výtěžky.

Procentuální složení a hmotnost PEG

Výsledky zjišťování procentuálního složení a hmotnosti PEG jsou souhrnně uvedeny v tabulce 2. Podle našich zkušeností, v případě konjugátů s vysokou molekulovou hmotností (např. 20 000 daltonů SPA diPEG a 12 000 daltonů GABA), určování procenta druhů PEG v reakční směsi, založené na elektroforetické pohyblivosti, není příliš spolehlivé. Pro zjištění hmotnosti PEG a určení vysoké molekulové hmotnosti a vysoce substituovaných PEG konjugátů jsou zapotřebí kombinace analýz SDS-PAGE, SP-HPLC a MALDI-TOF MS. Avšak monopegylované konjugáty a konjugáty PEG, odvozené od reakčních PEG činidel s nízkou molekulovou hmotností (např. 5000 daltonů), mohou být určeny docela přesně podle jejich SDS-PAGE profilů. Hladiny endotoxinu

Pomocí metody LAL bylo detekováno <1 EU/mg endotoxinu ve všech PEG konjugátech, kromě jednoho, odvozeného pomocí uretanového reakčního činidla. V tomto PEG konjugátu byl endotoxin detekován pouze po zředění. Bylo potvrzeno, že toto není způsobeno kontaminací během ředění a proto nějaký neznámý materiál v tomto vzorku mohl, při vyšší koncentraci proteinu, způsobovat inhibici v LAL testu. Po zředění vzorku a tím i zředění inhibujícího materiálu, byl pozorován pozitivní výsledek na endotoxin.

Biologická aktivita

In vitro a in vivo biologické aktivity všech PEG konjugátů GCSF Muteinu jsou uvedeny v Tabulce 2. Obecně byl pozorován inverzní vztah mezi in vitro aktivitou a stupněm substituce, a rovněž molekulovou hmotností PEG. Na rozdíl od tohoto je se zvyšující se molekulovou hmotností substituovaného PEG pozorováno zvýšení in vivo aktivity. Tento jev je také pozorován jinými autory (Satako-Ishikawa, a kol., Cell Struct. Funct. 17(3): 157—60, 1992). Je vysloven předpoklad, že chemické připojení molekul PEG k polypeptidové kostře GCSF Muteinu způsobuje nějaké konformaění změny, které záporně ovlivňují interakce receptorlligand, a tím snižují vazebnou afinitu. Dále relativně krátká doba inkubace při in vitro testu pravděpodobně nedostačuje k dosažení vrcholu aktivity. Na druhé straně in vivo test na myších je mnohem delší (dny) a

- 8 CZ 300546 B6 je ukončen několik dní po injekci léku. Tato delší inkubační doba, spojená s prodlouženým poločasem přetrvání PEG-GCSF Muteinu v krevním oběhu, kompenzují jakoukoli ztrátu vazebné aktivity, způsobenou pegylací. Konečným výsledkem je dosažení maxima biologické aktivity in vivo. Jinou hypotézou je, že PEG-GCSF Mutein působí, když je podán injekČně myši, jako prekurzor léku. Za takové situace je PEG složka PEG-GCSF Muteinu nějakým způsobem odštěpována, což má za následek trvalé uvolňování malých množství volného GCSF Muteinu, čímž se vysvětluje udržování a zvyšování in vivo aktivity. Avšak hypotéza lékového prekurzoru nevysvětluje základní úroveň aktivity in vivo, 7 dní po podání původní dávky. Mechanizmus lékového prekurzoru je nepravděpodobný, protože amidová vazba mezi proteinem a PEG je stabilní a není io možné ji snadno rozštěpit.

Mezi 15 studovanými PEG konjugáty GCSF Muteinu, byly in vivo aktivity P-12GA-1, SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů, uretanového s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a uretanového s molekulovou hmotností 36 000 daltonů výrazně vyšší než u zbývajících prepa15 rátů (viz obrázek 4 a tabulka 2).

Obecně je možno říci, že je pozorován přímý vztah mezi molekulovou hmotností molekuly PEG a zvýšenou aktivitou in vivo. Toto je zobrazeno na obrázku 5, kde je zvýšení počtů PMN vyjádřeno jako funkce celkové hmotnosti PEG konjugátů, vázaných pomocí amidu (SPA) a PEG kon20 jugátů vázaných pomocí linkeru odvozeného od močoviny.

Výběr a charakteristiky PEG konjugátů GCSF Muteinu

Po pečlivém zhodnocení chemického principu konjugace, biologických vlastností a léčivých vlastností u 15 PEG konjugátů, byly tři z nich vybrány pro další hodnocení, a to: 1) P-12GA-1,

2) SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a 3) uretanový s molekulovou hmotností 20 000 daltonů. Pomocí SPA odvozené mono, di a triPEG konjugáty s molekulovou hmotností 20 000 daltonů, přítomné v SP-purifi kované reakční směsi, byly hodnoceny vzájemným porovnáním a ukázalo se, že všechny tři udržovaly vysokou aktivitu granulocytů u samic myšího kmene C57BL/6J po dobu 5 dnů po jedné dávce 25,2 pg (tabulka 3 a obrázek 4). Naopak, pro udržení podobné aktivity byly nutné každodenní dávky nemodifikovaného GCSF Muteinu (údaje nejsou ukázány). Ve všech případech kromě dvou (SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a P—12GA-1), se invivo aktivita navrátila na normální úroveň sedmý den po počáteční dávce podané myši (obrázek 6). Jak SPA konjugát s molekulovou hmotností 20 000 daltonů, tak konju35 gát P-12GA-1 vykazovaly zvýšenou aktivitu při nižším dávkování 8,4 pg a navrátily se na normální úroveň sedmý den po počáteční dávce (viz tabulka 3). Údaje o procentovém složení (tabulka 3) ukazují, že přípravky jak SPA konjugátu s molekulovou hmotností 20 000 daltonů, tak konjugátu P-12GA-1 obsahují přibližně 50% dimerů a zbývajících 50 % je rozděleno mezi monomer a trimer. Uretanové reakční činidlo s molekulovou hmotností 20 000 daltonů produkuje za použitých reakčních podmínek (viz tabulka 3) převážně mono-PEG deriváty. In vitro aktivita všech hodnocených PEG konjugátů, včetně převládajícího monomemího uretanového derivátu, sleduje obecnou nepřímou úměrnost ke stupni substituce a tedy rovněž k molekulové hmotnosti PEG. In vivo biologická aktivita hodnocených PEG konjugátů vykazovala přímou úměrnost k molekulové hmotnosti PEG v celém hodnoceném rozsahu molekulových hmotností (obrá45 zek 5).

Závěry

Mezi zkoušenými 15 PEG konjugáty GCSF Muteinu vykazovaly dobré profily in vivo aktivity P50 12GA-1, SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů a uretanový s molekulovou hmotností

000 daltonů. Nej lepší všeobecné vlastnosti, včetně hospodárnosti produkce, vykazoval PEGGCSF Mutein s molekulovou hmotností 20 000 daltonů.

-9CZ 300546 B6

Tabulka 1

Reakční podmínky použité pro přípravu různých PEG konfugátů

Molekulová hmotnost	chemický typ	Reakční podmínky
		PH	Teplota	Doba	Poměr
5000	močovina	10	teplota místnosti	1 hodina	1:100
5000	amid	7,3	teplota místnosti	4 hodiny	1:30
10 000	močovina	10	teplota místnosti	1 hodina	1:100
10 000	amid	7,3	teplota místnosti	4 hodiny	1:30
10 000	uretan	10	4 ^CC	1 hodina	1:30
15 000	amid	7,3	teplota místnosti	4 hodiny	1:30
20 000	amid	7,3	teplota místnosti	4 hodiny	1:30
20 000	sutfanyluretan	8	teplota místnosti	17 hodin	1:30
20 000	uretan	10	4 °C	1 hodina	1:30
25 000	močovina	10	teplota místnosti	1 hodina	1:100
36 000	uretan	8	4 °C	6 hodin	1:3

- 10CZ 300546 B6

Tabulka 2 □

c

Σ3

S

LL

CO

O

O ó

LU

Q_

-□

CD □

čf

MD

-SC ra o

ío o

Φ ra¹

Ό o

ra

O

LU

Cl

I ε

x:

ra o

co

Aktivity i

PMN (% kontroly)

536+40

539+23

CN «0 + CN rt CO

Ol + o N-

Γ 751+115

977+120

r- CN + Ν' IO CN

364+50

716+87

412+88

CN IO + CO to co

CN rt T- + 00 00 00

494+71

| 598+117 I

| 886+120 |

& 5

co Ν' CN CN

18,65

20,48

20,13

8 co CN

29,23

12,78

I 14,4 I

CN

oi 03

! 7% ¹ 25,83 1

í 25,05 I

21,85

Oi CN

| 30,03 |

M-NFS-60

£ σ»

£ ιθ

%> I

£ CD

to

o Ν’

£ CN Ν'

£ CD

£ O

| 15% i

£ o CN

S v-

£ rt

* Hmotnost přidaného PEG

b co CN

20 000 |

* * 8 r- cŇ

o o LO O) CN

31 710 |

* o o 8

! 11 350 |

O O OO CN CN

| 63 775 I

29 050 |

* « o o 00 co CN

54 000 |

| 28 440 |

L O T— 00

$

oligo

aí

8 τ-

o

CO CN

o

rt CN

Γ- ΟΟ T-

IO rt

O

o

O

o

ožení tri

51,3

Ο

27,2

53

to CN

22,9

23

41,6

36,5

CN Ν' T”

o

co K

co CN

r- T~

tn 4t

22,3

O

63

-

CN Τ- Ο

49,5

σι

03

15.4

12,6

Ν'

50

CN

54,3

47

mono

17,3

o

co o

o

_t 137

co !< CN

G> CN

29

24,7

15,8

CO r— CO

50

I 70,8

Γ 43,4

[ 36

Typ linkeru

Ό Έ <

|(b)5000 1

| (a) 5000 I

8 O o S

o 8 O

o o o to

| (c) 20 000 |

| Močovina i

| (a) 5000 |

| (a) 10 000 |

|(b)25 000 |

| Uretan |

o o o o T X?

| (c) 20 000 Π

| (a) 36 000 I

c £ 3 > C £ tfí

i (b) 20 000 |

| GABA |

|(b)5000 |

CN S

% složení a hmotnost přidaného PEG jsou vypočteny na základě denzitometrických měření SDS-PAGE gelů, barvených modří Coomassie (*), nebo pomocí MALDI-TOF hmotnostní analýzy (**) (a), (b), (c): každý představuje samostatný biologický test; jsou uvedeny údaje o PMN z pátého dne

Tabulka 3 i

Φ o

ε c

>

x:

»o ta '<D σ>

o o

JQ o

φ ňT

O o

co ω

«

E *0 c

ta >

o >.

cn φ

CL

Ο ιη □_ to ο

C ο

Ε χζ φ

’8

W

Aktivity I

PMN (% kontroly)

φ Ό l<

100 76 906

Dávka I

σι 2. CN m CN

s LO

r- Ν' Ν'

119

σ 2. Ν’ CO'

140 i

CO O

I frí

5. den

100 86 1182

cn η. CN LO CN

Ν' CO O t—

oo r- σ>

cn n!

σ =1 'Ν' co'

τ- Ο r-

co ín

222 |

WBC

7. den

8,97 I 6,1 24,58

08 2 CN in CN

24,1 |

to n· lo“

I 7,93 I

σ Ξ1 Ν' CO*

107 |

lO

s to

5. den

to tn tn CO 00 CN

CT 2 CN LO CN

| 30,03 I

co co CN

I 17,43 |

ra 2 Ν' co'

22,75 |

00 LO co'

8,35 |

M-NFS- 60

Nosič (kontrola) ND 28: jedna injekce 25,2 pg ND 28: injekce 25,2 pg denně

co

LO

r-

** Hmotnost PEG (daftonů)

46,5 |

T- co co

26,8 |

*% složení mono di tri oligo

36,0 47,0 17,0 0,0

o o cn CN CN LO cn Ν’ CO Γ-.* CN

81,8 4,0 14,2 0,0 l

Molekula PEG

12 000 GABA

20 000 SPA

20 000 uretan

Samicím myšího kmene C57BL/6J bylo podáváno 8,4 nebo 25,2 pg buď ND-28 denně„nebo jedna dávka PEG konjugátu. Pátý a sedmý den po počáteční dávce byly odebrány vzorky žiiní krve a byla provedena diferenciální analýza leukocytů.

* Na základě denzitometrických měření SDS-PAGE barvené modří Coomassie.

** Určováno pomocí MALDlTOF MS

- 12 CZ 300546 B6

Příklad 2: Příprava PEG o molekulové hmotnosti 20 000 daltonů konjugovaného s rhGCSF Muteinem

Modifikace G-CSF muteinu pomocí methoxy-PEG sukcinimidylpropionové kyseliny (SPA) byla provedena následujícím způsobem. Reakční činidlo PEG bylo rozpuštěno v destilované vodě na koncentraci -200 mg/ml a přidáno k roztoku G-CSF muteinu (-5 mg/ml) v molámím poměru od 4:1 až 6:1 (nadbytek reakčního činidla). Reakce byla ponechána probíhat při 4 až 8 °C po dobu 20 hodin při pH -7,5. Na konci reakce byla přidána ledová kyselina octová, která reakci ukončila. Pegylovaný GCSF Mutein (také označovaný jako PEGG) byl potom vyčištěn od zbytkového io nemodifikovaného muteinu, nadbytku reakčního činidla PEG a jiných nečistot a složek pufru, přítomných v průběhu modifikace. Spolu s pegylo váným proteinem jako vedlejší produkty vznikají N—hydroxy suke i nimi d a polyethylenglykolkarboxylová kyselina.

PEGG byl vyčištěn pomocí kationtové výměnné chromatografie, po níž následovala ultrafíItrace.

Sloupec pro katíontovou výměnnou chromatografii byl navrstven a promýt v 20 mM octanu sodném, pH 4,0. Eluce pomocí lineárního gradientu chloridu sodného oddělila PEGG od všech jiných složek v reakční směsi. Následně byla použita ultrafíltrace/diafiItrace pro zkoncentrování PEGG na koncentraci -4,0 mg/ml a výměnu pufru za 20 mM octan sodný, 50 mM chlorid sodný, pH 6,0.

Pět pegylačních a purifikačních cyklů, provedených za podmínek uvedených výše, bylo analyzováno pomocí kationtové výměnné chromatografie a ukázalo se, že pegylační reakce GCSF muteinu je reprodukovatelná. Bylo ukázáno, že pegylační reakce je reprodukovatelná až do množství 2,5 g na reakcí (konečný výtěžek PEGG), za následujících optimálních podmí25 nek:poměr SPA-PEG s molekulovou hmotností 20 000 daltonů:muteinu 4 až 6:1; pH -7,5, 4°C, 20 hodin. Bylo zjištěno, že průměrné procentuální složení směsi PEGG bylo 21,7% monoPEGG (%RSD=16,6), 60,3 % di-PEGG (%RSD=6,6), 15,1 % tri-PEGG (%RSD=4,0), a 2,9% tetra-PEGG (%RSD=26,1), jak je ukázáno v tabulce 4.

Tabulka 4

Relativní procentuální složení mono, di, tri a tetra-PEGG v pěti PEGG syntézách a purifikačních cyklech, zjišťované analýzou pomocí výměny kationtů

Číslo syntézy	Mono-PEGG (%RSD, pět měření)	Di-PEGG (%RSD, pět měření)	Tri-PEGG (%RSD, pět měření)	Tetra-PEGG (%RSD, pět měřen í)
1	21,9% (8,0)	60,3 % (2,2)	15,1% (2,2)	2,7 % (4,7)
2	27,5 % (2,3)	54,4% (1,0)	15,7% (0,8)	2,4% (1,2)
3	18,2% (7,1)	65,5 % (0,6)	14,3% (6,6)	2,0 % (9,3)
4	21,7% (2,7)	60,1 % (1,0)	14,8% (0,5)	3,5 % (0,9)
5	19,2% (1,8)	61,3% (0,9)	15,7% (3,7)	3,8 % (4,5)
Průměrné složení	21,7% (16,6)	60,3 % (6,6)	15,1 % (4,0)	2,9% (26,1)

Příklad 3: Mobilizace kmenových buněk periferní krve 40

Byly vyvinuty techniky jak mobilizovat jak primitivní kmenové buňky, tak aktivní prekurzory z kostní dřeně, a zvýšit počet cirkulujících zárodečných buněk v periferní krvi. Tyto stimulované

-13 CZ 300546 B6 buňky mohou být schopny zprostředkovat časné i trvalé ujmutí se štěpu po smrtelném ozáření a transplantátů kostní dřeně nebo kmenových buněk. Neben, S. Marcus, K. a Mauch P.: Mobilizace subpopulací krevních kmenových a zárodečných buněk kostní dřeně do krve po cyklofosfamidu a/nebo faktoru stimulujícím kolonie granulocytů. Blood 81: 1960 (1993). Doplňování kmenových buněk periferní krve (PBSC) může pomoci zkrátit zotavení krvetvorby u pacientů, u kterých bylo chemoterapií způsobeno nedostatečné vyvinutí kostní dřeně nebo u těch pacientů, u kteří prodělali jiný typ odstranění kostní dřeně. Roberts, A. W. a Metcalf, D.: Faktor stimulující kolonie granulocytů indukuje selektivní zvýšení počtu zárodečných buněk v periferní krvi myší. Experimental Hematology 22: 1 156 (1994). Pro stimulování mobilizace byly použity jak růstové faktory, tak chemoterapeutické léky. Bodine, D.: Mobilizace kmenových buněk periferní krve: tam kde je dým, je i oheň. Experimental Hematology 23: 293 (1995). Po stimulování PBSC byly mobilizované buňky odebrány oddělením leukocytů od krve a uchovány ve zmraženém stavu do doby, kdy budou potřeba. Nynější klinické protokoly požadují opakované odběry koncentrátů PBSC oddělením leukocytů od krve, po standardní chemoterapii vysokými dávkami (CHT) a opakované denní dávkování nebo kontinuální ínfuzi s růstovými faktory, někdy trvající dva týdny nebo déle. Brugger, W., Bross, K., Frisch, J., Dem, P., Mertelmann, R. a Kanz, L.: Mobilizace zárodečných buněk periferní krve opakovaným podáváním interleukinu-3 a faktoru stimulujícího kolonie granulocytů-makrofágů po polychemoterapii etoposidem, ifosfamidem a cis-platinou. Blood 79: 1 193 (1992). Studie popsané dále byly provedeny se dvěma myšími modely mobilizace PBSC, první model jsou normální myši a jako druhý byl použit myší chemoterapeutický model. Pokusy ukázaly, ve shodě s tímto vynálezem (PEGG), zvýšenou účinnost pegylovaného G-CSF Muteinu ve srovnání s NEUPOGENEM (G-CSF), při ovlivňování mobilizace kmenových buněk. Bylo rovněž potvrzena přednost pegylovaného muteinu vtom, že je významně snížené a mnohem účinnější dávkování.

Tyto studie hodnotily zvýšenou schopnost mobilizovaných nezralých myších PBSC, stimulovaných in vitro pomocí mnoha růstových faktorů, sedmidenním testem kolonií na agaru. Dále, vedle schopnosti vytvářet kolonie, byl zjišťován v krvi všech myší kompletní hematologický profil a byly hodnoceny absolutní počty neutrofilů (ANC). Rovněž byly určovány hladiny GCSF v séru. Po optimalizaci testu bylo provedeno několik časových pokusů, kdy byly hodnoceny vysoké a nízké dávky G-CSF. Pokusné modely zahrnovaly G^CSF a cyklofosfamidem Cytoxanem-indukovanou mobilizaci, a rovněž kombinaci léčení za pomoci jak CHT, tak cytokinu. Materiál a metody: Ve všech těchto pokusech byly použity samice myšího kmene C57BL/6J staré 6 až 10 týdnů, zakoupené od The Jackson Laboratoiy. Myším bylo v den -1 intraperitoneálně podáno buď 200 mg/kg Cytoxanu nebo samotný nosič, tj. fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok (PBS). V den 0 bylo zvířatům podáno podkožně 0,1 ml buď NEUPOGENU (GCSF), PEGG (pomocí SPA s molekulovou hmotností 20 000 daltonů pegylovaný mutein, šarže #P20W3), nebo nosič PBS, obsahující 1 % normální myší sérum. Myši, kterým byl podán Neupogen, dostávaly denně injekce se stejnou dávkou, zatímco všechny ostatní myši dostávaly nosič. V den utracení byla myši za anestézie odebrána žilní krev z dutiny za očnicí do zkumavek obsahujících EDTA. U každé skupiny byl malý objem spojené celé krve přidán ke třem paralelním, 35 mm² tkáňovým miskám, obsahujícím 1000 U/ml rekombinantního myšího (rm) interleukinu-3, 100 ng/ml rekombinantního myšího faktoru kmenových buněk a 1000 U/ml rekombinantního myšího interleukinu-6 v celkovém objemu 1 ml média RPMI 1640, doplněného 15 % fetálního hovězího séra a 0,35 % agaru Difco. Kultury na tuhém agaru byly inkubovány po dobu 1 týdne při 37 °C ve vlhké atmosféře vzduchu s 5% CO₂. Kolonie byly počítány pomocí pitevního stereomikroskopu.

Výsledky: v první uvedené studii dostávaly normální myši denně injekce 25 pg/myš NEUPOGENU ve dnech 0 až 5, nebo 1 injekci 25 pg/myš PEGG v den 0. Myši byly utraceny ve dnech 3 až 7. Jak je vidět na obrázku 7, mobilizace představovaná vytvářením kolonií byla zřetelně zvýšena ve dnech 3 a 4 u myší, kterým byl injekěně podáván NEUPOGEN, ale začala se

5. den postupně vracet na původní úroveň (přes injekci NEUPOGENU 5. den). Na druhé straně myši, kterým byl podán PEGG, vykázaly mnohem vyšší počet kolonií, a na této hladině se udržely v průběhu 7. dne.

- 14CZ 300546 B6

U chemoterapeutického modelu byl získán podobný typ výsledku. Myši v CHT skupinách dostaly injekci Cytoxanu v den -1. Některé z myší potom dostávaly v následujících dnech pouze nosič, zatímco jiné dostávaly kombinované léčení buď denní injekce NEUPOGENU ve dnech 0 až 5, nebo jednu injekci PEGG v den 0. Obrázek 8 ukazuje, že vrcholné hodnoty bylo u myší léčených Cytoxanem dosaženo ve 4. dnu a poté v následujících dnech nastal postupný návrat na základní úroveň. Jak skupina s NEUPOGENEM, tak skupina s PEGG dosáhly vrcholné hodnoty v 5. den, a vykazovaly velice zvýšené počty kolonií. Avšak úroveň u skupiny Cytoxan + PEGG zůstala v průběhu 6. a 7. dne velmi významně zvýšená ve srovnání s úrovní skupiny Cytoxan + NEUPOGEN. Obrázek 9 ukazuje synergický účinek kombinovaného léčení ve srovnání s léčením pomocí samotného Cytoxanu nebo G-CSF.

Druhá studie je ukázána na obrázcích 10 a 11. Normální myši, dostávající denní injekce nižší dávky NEUPOGENU (3 pg/myš) po dobu 10 po sobě následujících dní, vykazovaly pouze relativně nízkou hladinu mobilizace během testovaného časového období. Zvířata, kterým byla injekčně podána jedna dávka PEGG (3 pg/myš), vykazovala 4. den přibližně 5x vyšší počet mobilizovaných zárodečných buněk v periferním oběhu, třebaže výsledkem bylo jednorázové zvýšení, které v podstatě během šesti dnů pominulo.

U myší, kterým byl injekčně podáván Cytoxan, jedna dávka PEGG (3 pg/myš) indukovala zhruba odpovídající množství mobilizovaných PBSC jako NEUPOGEN (30 pg/myš), podávaný injekčně v 10 denních dávkách 3 pg/den (obrázek 11). Obě skupiny vykazovaly nejvyšší mobilizaci zárodečných buněk pátý den a velikost vrcholných hodnot byla totožná. Jediný rozdíl se zdál být ve trochu déle doznívajícím účinku NEUPOGENU. Počty kolonií u CTH myšího modelu byly 4 až lOx vyšší, než jejich počty u normálního myšího modelu.

Tyto pokusy ukazují dvě různé potenciální výhody pegylovaného muteinu před NEUPOGENEM. Zaprvé je zřejmá vyšší účinnost PEGG ve srovnání s NEUPOGENEM ve schopnosti indukovat mobilizaci PBSC, a to jak u normálních, tak u léčených myší chemoterapií. Zadruhé bylo ukázáno, že pegylovaný mutein je u myší účinnější než NEUPOGEN, a je možno použít účinnější dávkovači režim se sníženými dávkami, než jaké jsou dosud běžně u klinických produktů používány.

SEZNAM SEKVENCÍ <110> Hoffman-La Roche, Inc. <120> Konjugáty GCSF <130> 01017/36785 <140>US 09/487,133 <141> 2000-01-19 <150> US 60/117,917 <151> 1999-01-29 <160> 1 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> DISULFID <222> (36)..(42) <220>

<221> DISULFID <222> (64)..(74) <400> 1

- 15CZ 300546 B6

Ala Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys 15 10 15

Ser Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin 20 25 30

Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 35 40 45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 50 55 60

Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser 65 70 75 80

Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser 85 90 95

Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp 100 105 110

Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 115 120 125

Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 130 135 140

Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe 145 150 155 160

Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY io 1. Fyziologicky aktivní konjugát obecného vzorce I

RO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-C-NH (l)

- 16CZ 300546 B6 ve kterém G je faktor stimulující kolonie granulocytů bez své aminové skupiny nebo skupin, které vytvářejí amidovou vazbu s polyethylenglykolovou složkou v konjugátu; R je alkyl C, ₆: n je celé číslo od 420 do 550; a m je celé číslo od 1 do 5.

5 2. Konjugát podle nároku 1 vzorce I, ve kterém R je methyl.

3. Konjugát podle nároku 2 vzorce I, ve kterém n je 450 až 490.

4. Konjugát podle nároku 2 vzorce I, ve kterém m je celé číslo od 1 do 4. io

5. Konjugát podle nároku 2 vzorce I, ve kterém m je 2.

6. Konjugát podle nároku 1 vzorce I, ve kterém faktorem stimulujícím kolonie granulocytů je GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.

7. Konjugát podle nároku 1 vzorce I, ve kterém n je 450 až 490.

8. Konjugát podle nároku 1 vzorce I, ve kterém m je celé číslo od 1 do 4.

20 9. Konjugát podle nároku 8 vzorce I, ve kterém m je 2.

10. Konjugát podle nároku 1, který má delší poločas cirkulování v krevním oběhu a vyšší in vivo aktivitu stimulování granulocytů než odpovídající nekonjugovaný faktor stimulující kolonie granulocytů.

11. Konjugát podle nároku 10, ve kterém faktorem stimulujícím kolonie granulocytů je GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.

12. Konjugát podle nároku 6 vzorce I, ve kterém R je methyl; n je celé číslo od 450 do 490 a m

30 je

13. Prostředek obsahující fyziologicky aktivní konjugáty podle nároku 1 obecného vzorce I, vyznačující se tím, že m je nezávisle celé číslo od 1 do 4 a procento konjugátů, kde m je 1, je od 18 do 25 procent; procento konjugátů, kde m je 2 je od 50 do 66 procent, procento

35 konjugátů, kde m je 3 je od 12 do 16 procent a procento konjugátů, kde m je 4 je až 5 procent.

14. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že R je v každém z konjugátů methyl.

40 15. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že na R jsou v každém z konjugátů stejné.

16. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím,ženje 450 až 490.

45 17. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že v každém z konjugátů je faktorem stimulujícím kolonie granulocytů GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.

18. Prostředek podle nároku 13, kde n je v každém z konjugátů stejné a je to celé číslo od 450

50 do 490; G je GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.

19. Způsob přípravy konjugátu podle nároku 1, vyznačující se tím, že reaguje sloučenina vzorce II

- 17 CZ 300546 B6

O

II

RO(CH₂CH₂0)_nCH₂CH₂-0 (ll)

S GCSF za vzniku uvedeného konjugátu.

5 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že GCSF je GCSF Mutein, který má sekvenci uvedenou na obrázku 1.

io

11 výkresů

- 18 CZ 300546 B6

Η 00 C - <£X2íAXiXKX$(iXvJÍXlX5tvXtXL^ 170 100

10_________o

-NH*

Ťff t

X>X>jBHOOX>AOX)jO

rhQ-CSP G-CSF MUTEIN Thr¹ Ala¹ Leu³ -► Thr³ Oly⁴ -► Tyr⁴ Pro® -> Are® Cya¹⁷ •ar¹⁷

Obrázek 1: Primární struktura GCSF Muteinu

- 19CZ 300546 B6

Obrázek 2: Reakční činidla pro pegylaci

A.

GABA, Amid CH₃O(CH₃CH₃0)_nCH₃0,

CH₃O(CH₂CH2O)_nCH₂O

N 2-*ra(CH,)_mC0N

Λ^Ν ra = 2-6

B.

o

Amid

CH₃CXCHjCH,O)_nCH,OCCH,CON

c.

Amid (spa)

O ° λη

CH₃O(CH₃CHO)_nCH₃CHTON

D.

Močovina

H,C o

CH₃O(CH₃CHjO) ,, ^CHjCH^ÍT^O^^^N

E.

Uretan

CH₃O(CH₃CH₃O)_xCH₃CH₃O

F.

o

Sulfanyluretan

G.

CH,

Uretan CH₃^COCHjCH,(OCH,CH,)_nOCH,CH,OCON

.....l·-¹

-20CZ 300546 B6

Obrázek 3: Oddělení GCSF Muteinu modifikovaného PEG s molekulovou hmotností 20 000 daltonů od nemodifikovaného Typický eluční profil pro PEG reakční směs.

Sloupec: 1 až 2 ml Fractogel ® EMD SO3 650S.

Ekvilibrační puír: 10 mM oetan amonný, pH 4,5

Eluční pufry 1.0,15 M NaCI v ekvilibračním pufru
2.0,5 M NaCI v ekvilibračním pufru

-21 CZ 300546 B6

Obrázek 4: Aktivita PEG-GCSF Muteinu pátý den po jedné injekci

Samice myšího kmene C57BL/6J dostaly podkožně injekci obsahující 25,2 pg pegylovaných konjugátů mutované formy GCSF; 5. den po podání injekce byly odebrány vzorky žilní krve z dutiny za očnicí. Byly provedeny hematologické a leukocytové diferenciální analýzy; výsledné počty neutrofiíů byly standardizovány k nosičové kontrole, prováděné v každém pokuse. Uvedené údaje představují průměr ± standardní odchylku (S E.) ze čtyř myší ve skupině.

-22CZ 300546 B6

20 PMN (χΐθ’/mm³)

- * * 1 I . .

0 10 20 30 40 50 60 70

Vypočtené molekulové hmotnosti PEG (kDa)

SPA. PWNsO 2’7MW»3 35 Rceň« PMN=0.l52MW-2.74

Obrázek 5: Zvýšení počtů PMN jako funkce hmotnosti PEG (kDa) v amidem a močovinou vázaných konjugátech PEG-GCSF Muteinu,

-23 CZ 300546 B6

300 % kontroly

Obrázek 6: Aktivita PEG-GCSF Muteinu 7. den po jedné injekci

Samice myšího kmene C57BL/6J dostaly podkožně injekci obsahující 25,2 pg pegylovaných konjugátů GCSF Muteinu; 7. den po podáni injekce byly odebrány vzorky žilní krve z dutiny za očnicí. Byly provedeny heraatologické a leukocytové diferenciální analýzy; výsledné počty neutrofilů byly standardizovány k nosičové kontrole, prováděné v každém pokuse. Uvedené údaje představují průměr ± standardní odchylku (S E.) ze čtyř myší ve skupině.

-24CZ 300546 B6

Obrázek 7

Test mobilizace kolonií myších PBSC t

Den injekce

Nosič

N«upof«a -♦“PEGO

Neupogen (25 gg/myš) podaný injekčně ve dnech 0 až 5 PEGG (25 gg/myš) podaný injekčně v den 0

-25CZ 300546 B6

Obrázek 8

Test mobilizace kolonií myších PBSC

Počet koionií/jamku

Den injekce (Cytoxan = den -1)

Nosič -^»Cyttauu —ft—Cyunua*H«upof« ->-Cytox»*P£GG

Neupogen (25 gg/myš) podaný injekčně ve dnech 0 až 5 PEGG (25 gg/myš) podaný injekčně v den 0

-26CZ 300546 B6

Obrázek 9

Počet koloníi/jamku

Nosič -«-Nwpotia -»-PEGG

-*-Cytoxm*Nfupof« -W-Cywua-PEGG

Neupogen (25 pg/myš) podaný injekčně ve dnech 0 až 5 PEGG (25 pg/myš) podaný injekčně v den 0

-27CZ 300546 B6

Obrázek 10

Počet koloniiZjamku

Nosič •Nrapegm řEGO

Neupogen (3 pg/myš) podaný injckčnč ve dnech 0 až 9 PEGG (3 pg/myš) podaný injekčně v den 0

-28CZ 300546 B6

Obrázek 11

Test mobilizace kolonií myších PBSC -----Počet kolonií/jamku “**- Nosič -e-Cytoxan ~*-CywJun*N«upof«n -^>Cytoun*PEGG

Neupogen (3 pg/myš) podaný injekčné ve dnech 0 až 9 PEGO (3 pg/myš) podaný injekčné v den 0

Konec dokumentu