CZ300495B6

CZ300495B6 - Protilátka se specifickou afinitou pro charakteristický epitop domény fibronektinu, konjugáty obsahující tuto protilátku a jejich použití

Info

Publication number: CZ300495B6
Application number: CZ20004216A
Authority: CZ
Inventors: Neri@Dario; Tarli@Lorenzo; Viti@Francesca; Birchler@Manfred
Original assignee: Eidgenössische Technische Hochschule Zürich
Priority date: 1998-05-11
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2009-06-03
Also published as: CN1250571C; NO327732B1; CZ20004216A3; US20070189963A1; SK16792000A3; CA2333833C; EP1084145B1; EE05435B1; PL345845A1; EE200000802A; SK286822B6; CA2333833A1; DK1084145T3; BRPI9910394A; CN1303393A; ATE301676T1; ES2247802T3; IL139452A0; HUP0102992A3; NO20005694D0

Abstract

Protilátky se subnanomolární afinitou specifickou pro charakteristický epitop ED-B domény fibronektinu, markeru angiogeneze. Protilátka je použitelná pro rychlé zacílení markeru angiogeneze. Diagnostický kit obsahující uvedenou protilátku. Konjugáty obsahující uvedené protilátky a vhodné fotoaktivní molekuly (napríklad správne vybrané fotosenzibilizacní cinidlo) a jejich použití pro selektivní, svetlem zprostredkovaný uzáver nove tvorených cév.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká protilátek se subnanomolámí afinitou specifickou pro charakteristický epitop ED-B domény fibronektinu, který je markérem angiogeneze. Také se týká použití radioaktivně značených vysoce-afinitních anti-ED-B protilátek pro detekci nově se tvořících cév in vivo a diagnostických kitů obsahujících uvedené protilátky.

Dále se vynález týká konjugátů skládajících se z uvedených protilátek a vhodné fotoaktivní molekuly (například fotosenzibilizátoru) a jejich použití v detekci a/nebo koagulaci nově vytvořených krevních cév.

Dosavadní stav techniky

Nádory nemohou růst nad určitou hranici bez toho, že by se vytvořily nové cévy (bez angiogene20 ze) a korelace mezi hustotou mikrokapilár a invazivitou nádoru byla popsána pro mnoho nádorů (Folkman, 1995, Nature Med. 1: 27-31). Kromě toho je angiogeneze podkladem mnoha očních onemocnění, která vedou ke ztrátě zraku (Lee et al., Surv. Opthalmol. 43: 245-269, 1988; Friedlander, M. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 9764-9769, 1996). Molekuly, které mohou selektivně zaměřit markéry angiogeneze, umožní diagnostiku a terapii nádorů a jiných onemoc25 není charakterizovaných vaskulámí proliferaci, jako je diabetická retinopatie a maku lární degenerace související s věkem. Markéry angiogeneze jsou exprimovány u většiny agresivních solidních nádorů a měly by být snadno přístupné pro intravenosně podané specifické ligandy (Pasqualini et al., 1997, Nature Biotechnol. 15: 542-546; Neri etal., 1997, Nature Biotechnol. 15: 1271-1275). Cílená okluse neovaskulatury může vést k infarktu nádoru a k jeho kolapsu (OReilly et al.,

1996), Nature Med. 2: 689-692; Huang et al., 1997, Science, 275: 547-550).

ED-B doména fibronektinu, sekvence o 91 aminokyselinách identická u myši, krys a člověka, která je insertována alternativním sestřihem do fibronektinové molekuly, se specificky akumuluje v okolí neovaskulatury (Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612-618) a může představovat cíl pro molekulární intervenci. Skutečně jsme nedávno za použití fluorescenční techniky ukázali, že jednořetězcové Fv protilátkové fragmenty (scFv) proti ED-B se selektivně akumulují v nádorových krevních cévách u myší s nádory a že afinita protilátky patrně určuje účinnost cílené vazby (Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271-1275; Mezinárodní patentová přihláška PCT/GB97/01412, na základě GB96/10967.3). Cílená vazba na nádor byla hodnocena 24 hodin po injekci nebo v pozdějších časových intervalech.

V oboru jsou známé různé pokusy o získání protilátek proti ED-B doméně, které by mohly být použity pro cílenou vazbu na nádor.

Peters et al. (Cell Adhesion and Communication, 1995, 3: 67-89) popisují polyklonální protilátky produkované proti antigenům neobsahujícím žádnou jinou sekvenci než intaktní ED-B doménu a ukazují, že tyto protilátky se váží přímo a specificky na tuto doménu.

Nicméně, činidla popisovaná Petersem a kol. mají řadu nevýhod: antisérum od Peterse a kol.

rozpoznává ED-B(+)-FN pouze po zpracování N-glykanasou. Toto způsobuje, že jsou tato činidla nevhodná pro aplikace jako je cílená vazba na nádory, zobrazení a terapie, protože deglykosylace nemůže být provedena in vivo. Autoři sami uvádějí, že jejich protilátky nerozpoznávají kompletní ED-B(+)-FN produkovaný savčími buňkami. Také uvádějí, že bylo nemožné produkovat monoklonální protilátky specifické pro ED-B doménu fibronektinu, i přesto, že byly pro- 1 CZ 300495 B6 dukovány protilátky proti jiným doménám fíbronektinu (jako je ED-A). V oboru je dobře známo, že polyklonální protilátky jsou nepřijatelné pro výše uvedené aplikace.

I přes roky intenzivního výzkumu v této oblasti mohou být monoklonální protilátky rozpoznávající ED-B doménu fíbronektinu bez ošetření N-glykanasou produkovány pouze za použití fágových zobrazovacích technik, jak jsou použity v předkládaném vynálezu.

Zang et al. (Matríx Biology, 1994, 14: 623-633) popisují polyklonální antisérum namířené proti psí ED-B doméně. Autoři předpokládají zkříženou reaktivitu s lidským ED-B(-)-FN, ačkoliv tato reaktivita nebyla testována. Nicméně, autoři popisují obtíže související s přípravou monoklonálních protilátek přímo rozpoznávajících ED-B doménu fíbronektinu (strana 631). Antisérum rozpoznává ED-B(+)-EN ve Westernovém přenosu pouze po zpracování N—glykanasou. Jak bylo uvedeno výše, nutnost zpracování glykanasou znemožňuje použití v aplikacích podle předkládaného vynálezu.

Rozpoznávání ED-B(+)-FN v ELISA probíhá bez nutnosti deglykosylace, ale pouze na chrupavce extrahované denaturačním činidlem (4M močovinou) a zachycené na plastu pomocí želatiny. Autoři uvádějí, že vazba EN molekuly na želatinu navázanou na plastový povrch ELISA plotny může nějakým způsobem vystavovat epitopy tak, že mohou být rozpoznány antisérem. Protože v aplikacích in vivo nemůže být FN denaturován a navázán na želatinu, mají monoklonální ligandy podle předkládaného vynálezu zřetelné výhody.

Japonské patenty JP 02 076 598 a JP 04 169 195 popisují anti-ED-B protilátky. Z těchto dokumentů není jasné, zda jsou popisovány monoklonální anti-ED-B protilátky. Kromě toho se zdá nemožné, aby jediná protilátka (jako je protilátka popisovaná v JP 02 076 598) měla antigenní determinantu v aminokyselinové sekvenci vzorce (1), (2) nebo (3):

- (1) EGIPIFEDFVDSSVGY;

- (2) YTVTGLEPGIDYDIS;

- (3) NGGESAPTTLTQQT;

z následujících důvodů:

(i) monoklonální protilátka by měla rozpoznávat dobře definovaný epitop;

(ii) trojrozměrová struktura ED-B domény fíbronektinu byla určena NMR spektroskopií. Segmenty (1), (2) a (3) se nacházejí na opačných stranách ED-B struktury a nemohou být vázány současně jednou monoklonální protilátkou.

Dále, pro demonstrování užitečnosti protilátek by mělo být uvedeno lokalizování nádoru, stejně jako důkaz barvení ED-B(+)-FN struktur v biologických vzorcích bez zpracování činidly degradujícími strukturu.

BC1 protilátka, kterou popisuje Camemolla et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 24689-24692, rozpoznává epitop na doméně 7 FN, ale ne na ED-B doméně, která je kryptická za přítomnosti EDB domény fíbronektinu. Je striktně specifická pro člověka. Proto mají BC1 protilátka a protilátky podle předkládaného vynálezu odlišnou reaktivitu. Dále, BC1 protilátka rozpoznává doménu 7 samotnou a doménu 7-8 fíbronektinu za nepřítomnosti ED-B domény (Camemolla et al., 1992, J. Biol. chem. 267: 24689-24692). Takové epitopy mohou být produkovány in vivo proteolytíckou degradací FN molekul. Výhoda činidel podle předkládaného vynálezu spočívá vtom, že mohou lokalizovat FN molekuly nebo fragmenty pouze tehdy, pokud obsahují ED-B doménu.

-2 CZ 300495 B6

Pro diagnostiku nádorů, a přesněji pro zobrazení primárních a sekundárních nádorových lézí, je imunoscintigrafie metodou volby. V tomto vyšetření jsou pacienti snímkováni vhodným přístrojem (například gamma-kamerou) poté, co jim byla injekěně podána radioaktivně značená sloučenina (například radionuklid navázaný na vhodné vehikulum). Pro scintigrafické aplikace jsou obvykle používány izotopy s krátkým poločasem emitující gamma záření, jako je technecium99m, jod—123 nebo indium—111, jejich použití minimalizuje expozici pacienta ionizujícímu záření.

Nejčastěji používaným radionuklidem na odděleních nukleární medicíny je technecium-99m io (99mTc), gamma zářič s poločasem 6 hodin. Pacienti po injekci radiofarmak na bázi 99mTc mohou být snímkováni až do 12 až 24 hodin po injekci; nicméně, akumulace nuklidu v lézi dříve je žádoucí.

Dále, pokud by byly dostupné protilátky schopné rychlé a selektivní lokalizace novotvořených krevních cév, tak by byly výzkumníci stimulováni k výzkumu nových vhodných molekul pro konjugování na protilátky, pro dosažení diagnostického a/nebo terapeutického účinku.

Podstata vynalezu

Vzhledem k potřebě radiofarmak schopných lokalizovat nádorové léze během několika hodin po injekci, která existuje v oboru nukleární medicíny, a vzhledem k informaci, že afinita protilátky patrně ovlivňuje její účinnost v cíleném průkazu angiogeneze, jsou předmětem předkládaného vynálezu protilátky specifické pro ED-B doménu fibronektinu s disociační konstantou v řádu subnanomolámím (pro přehled definic a měření afinity antigen-protilátka viz Neri et al., 1996, Trends in Biotechnol. 14: 465-470). Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou radioaktivně značené protilátky ve vhodném formátu, namířené proti ED-B doméně fibronektinu, které detekují nádorové léze již několik hodin po injekci.

Předmětem vynálezu tedy je protilátka se specifickou afinitou pro charakteristický epitop domény fibronektinu Extra Domain-B (ED-B), kde uvedená protilátka má takovou afinitu k uvedenému epitopu domény ED-B, že její disociační konstanta je menší než 1.10“⁹ M.

V dalším aspektu je předmětem předkládaného vynálezu protilátka popsaná výše pro použití pro rychlé zacílení markérů angiogeneze.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je diagnostický kit obsahující uvedenou protilátku a jedno nebo více činidel pro detekci angiogeneze.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je použití uvedené protilátky pro přípravu injekčního prostředku pro léčbu patologických stavů souvisejících s angtogenezí.

Konečně, významný aspekt předkládaného vynálezu představují konjugáty obsahující uvedené protilátky a vhodné fotoaktivní molekuly (například správně vybrané fotosenzibilizační činidlo), ajejich použití pro selektivní světlem zprostředkovanou oklusi nově vytvořených krevních cév.

Definice:

V předkládaném vynálezu jsou použity některé termíny, které mají následující významy.

Termín „protilátka“ označuje imunoglobulin, ať přirozený, nebo zcela nebo částečně připravený synteticky. Tento termín také zahrnuje jakýkoliv polypeptid nebo protein mající vazebnou doménu, která je protilátkovou vazebnou doménou nebo která je homologická k této doméně. Tyto mohou být získány z přirozených zdrojů, nebo mohou být zcela nebo částečně připraveny synte55 ticky. Příklady protilátek jsou izotypy imunoglobulinů a podtřídy jejich izotypů; fragmenty, které

-3 CZ 300495 B6 obsahují vazebnou doménu pro antigen, jako je Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; a diprotilátky. Je možné použít monoklonálních nebo jiných protilátek a použít techniky rekombínantní DNA technologie pro produkci jiných protilátek nebo chimérických molekul, které si zachovávají speciflcitu původní protilátky. Takové techniky mohou obsahovat vložení DNA kódující variabilní region imunoglobulinu nebo komplementaritu určující regiony imunoglobulinu (CDR), konstantní regiony imunoglobulinu nebo konstantní regiony plus regiony pracovních rámců různých imunoglobulinů. Viz například EP-A 184187, GB 2188638A nebo EP-A 239400. Hybridomy nebo jiné buňky produkující protilátku mohou být podrobeny genetickým mutacím nebo jiným změnám, které mohou a nemusí měnit vazebnou spécificitu produkovaných protilátek. Protože protilátky mohou být modifikovány různými způsoby, zahrnuje termín „protilátka“ jakákoliv vazebná činidla nebo substance, které obsahují vazebnou doménu s požadovanou specifickou. Proto tento termín zahrnuje fragmenty, deriváty, funkční ekvivalenty a homology protilátek, včetně jakýchkoliv polypeptidů obsahujících imunoglobulinovou vazebnou doménu, ať přirozené, nebo zcela nebo částečně připravené synteticky. Také jsou tímto termínem zahrnuty chimérické molekuly obsahující vazebnou doménu imunoglobulinů nebo její ekvivalent, fúzovanou na jiný polypeptid. Klonování a exprese chimérických protilátek je popsána v EP-A 0120694 a EP-A 0125023. Bylo prokázáno, že fragmenty celé protilátky mohou působit jako vazebné antigeny. Příklady vazebných fragmentů jsou (i) Fab fragment skládající se z VL, VH, CL a CH1 domén; (ii) Fd fragment skládající se z VH a CH1 domén; (iii) Fv fragment skládající se z VL a VH domén jedné protilátky; (iv) dAb fragment (Ward et al., 1989, Nátuře 9: 341, 544-546) skládající se z VH domény; (v) izolované CDR regiony; (vi) F(ab')2 fragmenty, bivalentní fragmenty obsahující dva vázané Fab fragmenty; (vii) jednořetězcové Fv molekuly (scFV), kde jsou VH doména a VL doména navázané pomocí polypeptidové spojovací skupiny, která umožňuje asociaci dvou domén za vzniku vazebného místa pro antigen (Bird et al., (1988), Science 242: 423 426: Huston et al., (1988), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-83); (viii) bispecifické jednořetězcové FV dimery (PCT/US92/09965) a (ix) „diprotilátky“, multivalentní nebo multispecifické fragmenty konstruované genovou fúzí (WO 94/13804; Hotliger et al., (1993), Proč. Nati, Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448). Diprotilátky jsou multimery nebo polypeptidy, kde každý polypeptid obsahuje první doménu tvořenou vazebným regionem imunoglobulinového lehkého řetězce a druhou doménu tvořenou vazebným regionem imunoglobulinového těžkého řetězce, kde tyto dvě domény jsou navázány (například pomocí peptidové spojovací skupiny), ale nejsou schopné vzájemné asociace tvořící vazebné místo pro antigen; vazebná místa pro antigen jsou tvořena asociací první domény jednoho polypeptidu v multimeru s druhou doménou jiného polypeptidu v multimeru (WO 94/13804). Pokudjsou použity bispecifické protilátky, tak mohou být použity běžné bispecifické protilátky, které mohou být připraveny různými způsoby uvedenými v Holliger and Winter, 1993, Curr. Opin. Biotech., 4: 446-449, například chemickou syntézou nebo z hybridních hybridomů, nebo mohou být použity jakékoliv fragmenty bispecifických protilátek, jak byly uvedeny výše. Než použití celých protilátek může být výhodnější použití scFv dimerů nebo diprotilátck. Diprotilátky a scFv mohou být připraveny bez Fc regionu, za použití pouze variabilních domén, což potenciálně snižuje efekt anti-idiotypové reakce. Mezi další formy bispecifických protilátek patří jednořetězcové CRAb, kteréjsou popsány v Neri et al., (1995), J. Mol. Biol. 246: 367-373),

Termín komplementaritu určující regiony (CDR) variabilních domén protilátky označuje ty hypervariabilní sekvence protilátky, které obsahují zbytky nutné pro specifické rozpoznávání antigenu. V tomto vynálezu používáme definici a číslování CDR uvedené v Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917.

Termín „funkčně ekvivalentní varianta“ označuje molekulu (variantu), která si i přes strukturální odlišnosti od jiné molekuly (původní molekuly) uchovává významnou homologii a také alespoň nějakou biologickou funkci původní molekuly, například schopnost vazby na určitý antigen nebo epitop. Varianty mohou být ve formě fragmentů, derivátů nebo mutantů. Varianty, deriváty nebo mutanty mohou být připraveny modifikací původní molekuly adicí, delecí, substitucí nebo insercí jedné nebo více aminokyselin, nebo vazbou na jinou molekulu. Tyto změny mohou být provedeny na nukleotidové nebo proteinové úrovni. Například, kódovaný polypeptid může být Fab frag-4CZ 300495 B6 ment, který je potom navázán na Fc koncovku z jiného zdroje. Alternativně může být navázán markér jako je enzym, fluorescein atd. Například, funkčně ekvivalentní varianta protilátky „A“ proti charakteristickému epitopu ED-B domény fíbronektínu může být protilátka „B“ s odlišnou sekvencí komplementaritu určujících regionů, ale rozpoznávající stejný epitop jako protilátka „A“.

Izolovali jsme rekombinantní protilátky v scFv formě z protilátkové fagové zobrazovací knihovny, které jsou specifické pro ED-B doménu fíbronektínu a které rozpoznávají ED-B(+)fibronektín ve tkáňových řezech. Jedna z těchto protilátek, El, byla upravována z hlediska afinity za zisku protilátek H10 a L19 se zlepšenou afinitou. Protilátka L19 má disociační konstantu pro ED-B doménu fíbronektínu v řádu subnanomolámích koncentrací.

Vysoko—afinitní protilátka L19 a Dl.3 (protilátka specifická pro irelevantní antigen, lysozym ze slep i čích vajec) byly radioaktivně značeny a byly injikovány do myší s nádory. B i od i stři buče v nádoru, krvi a orgánech byly stanoveny v různých časech a byly uvedeny jako procento injikované dávky na gram tkáně (%ID/g). Již 3 hodiny po injekci bylo pro L19 %ID/g (nádor) lepší než %ID/g (krev), ale nikoliv pro negativní kontrolní Dl .3. Poměry nádor:krev se zvyšovaly při pozdějších měřeních. Tato data naznačují, že vysoce-afinitní protilátka L19 může být užitečným činidlem cíleně se vázajícím na nádory, vhodným například pro í mu no scinti grafickou detekci angiogeneze.

„Fotosenzibilizační činidlo“ může být definováno jako molekula, která po ozáření a za přítomnosti vody a/nebo kyslíku, vyvolá tvorbu toxických molekul (například singletového kyslíku) schopných reakcí s bíomolekulami, které potenciálně poškozují biologické cíle jako jsou buňky, tkáně nebo tělesné kapaliny. Fotosenzibilizační činidla jsou zejména výhodná tehdy, pokud absorbují světlo při vlnových délkách vyšších než 600 nm. Skutečně je průnik světla ve tkáních a tělesných kapalinách maximální při 600 až 900 nm (Wan et al., 1981, Photochem. Photobiol. 34: 679-681). Cílené podání fotosenzibilizačního činidla následované ozářením je atraktivním způsobem pro terapii onemocnění souvisejících s angiogenezí (Yarmush, M.L. et al., Antibody Targeted photolysis, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 10: 197-252 (1993); Rowe, P.M., Lancet 351, 1496 (1998); Levý, J., Trends Biotechnol. 13: 14-18 (1995)), zejména pro selektivní ablaci oční neovaskulatury. Dostupné terapeutické modality, jako je laserová fotokoagulace, buď přímá, nebo po podání fotosenzibilizačního činidla, jsou omezeny chyběním selektivity a obvykle vedou k poškození zdravých tkání a cév (Macular Photocoagulation Study Group, Arch. Opthalm. 112: 480^488, (1994; Haimovici, R. et al., Curr. Eye Res. 16: 83-90 (1997); SchmidtErfurt, U. et al., Graefes Arch. Ciin. Exp. Opthalmol. 236: 365-374 (1998).

Z argumentů uvedených výše je zřejmé, že je mimořádně důležité objevit způsoby pro zlepšení selektivity a specificity fotosenzibilizačních činidel, například pomocí jejich konjugace na vhodné nosiče. Je pravděpodobné, že vývoj kvalitních nosičů nebude jednoduchý. Kromě toho, je pravděpodobné, že ne všechna fotosenzibilizační činidla budou vhodná k přenosu in vivo do vybraného místa. Faktory jako je chemická struktura fotosenzibilizačního činidla, jeho rozpustnost, lipofilnost, přilnavost a účinnost budou pravděpodobně zásadně ovlivňovat možnost cíleného podání a účinnost konjugátů obsahujících fotosenzibilizační činidla.

Prokázali jsme, že vysoce-afinitní L19 protilátka, specifická pro ED-B doménu fibronektinu, selektivně lokalizuje nově vytvořené krevní cévy v králičím modelu oční angiogeneze po systémovém podání. L19 protilátka, chemicky navázaná na fotosenzibilizační činidlo, kterým je sloučenina čtyřmocného cínu a chlorinu e6 a ozářená červeným světlem, způsobuje selektivní oklusi oční neovaskulatury a navozuje apoptosu příslušných endotelových buněk. Tyto výsledky dokazují, že nové oční cévy mohou být imunochemicky odlišeny od původních očních cév in vivo a naznačují, že cílené podání fotosenzibilizačních činidel následované ozářením může být účinné v léčbě očních onemocnění způsobujících slepotu a snad i jiných patologických stavů spojených s angiogenezí.

-5 CZ 300495 B6

Přehled obrázků na výkresech

Provedení předkládaného vynálezu jsou ilustrována na následujících výkresech, kde:

Obr. 1 ukazuje navrženou protilátkovou fágovou knihovnu;

Obr. 2 ukazuje 2D gely a westernový přenos lyzátu lidských melanomových COLO-38 buněk; Obr. 3A, 3B a 3C ukazují imunohistochemické pokusy na glioblastoma multiforme;

Obr. 4 ukazuje analýzu stability komplexů protilátka—(ED-B);

Obr. 5 ukazuje biodistribuci radioaktivně značených proti látkových fragmentů u myší nesoucích nádory;

Obr. 6 ukazuje aminokyselinovou sekvenci L19;

Obr. 7A a 7B ukazují králičí oči s implantovanou peletou;

Obr. 8 ukazuje imunohistochemické barvení řezů z králičí rohovky;

Obr. 9 ukazuje imunohistochemické barvení řezů ze struktur králičího oka (rohovky, duhovky a spojivky) získaných za použití červeného substrátu pro alkalickou fosfatasu a hematoxylinu; Obr. 10 ukazuje lokalizaci fluorescentně značených protilátek v oční neovaskulatuře;

Obr. 11 ukazuje makroskopický vzhled očí králíků, kterým byl injekčně podán protein navázaný na fotosenzibilizační činidlo, před a po ozáření;

Obr. 12 ukazuje mikroskopickou analýzu řezů z očních struktur králíků, kterým byl injekčně podán protein navázaný na fotosenzibilizační činidlo a kteří byli ozářeni červeným světlem.

Podrobný popis obrázků

Obr. 1 ukazuje navrženou protilátkovou fágovou knihovnu, (a) Proti látkové fragmenty jsou zobrazeny na fágu jako plil fúze, jak je schematicky uvedeno. Ve vazebném místu protilátky (přímý pohled na antigen) je Vk CDR skelet uveden žlutě a VH CDR skelet je znázorněn modře. Zbytky podrobené náhodné mutagenesi jsou v pozicích 91, 93, 94 a 96 Vk CDR3 (žlutě) a v pozicích 95, 96, 97 a 98 VH CDR3 (modře). Cb atomy těchto vedlejších řetězců jsou znázorněny tmavšími barvami. Také jsou uvedeny (šedě) zbytky CDR1 a CDR2, které mohou být mutovány pro zlepšení afinity protilátky. Za použití programu RasMol (http://www.chemistry.ucsc.edu/wipkc/teaching/rasmol.html) byly struktury scFv modelovány z pdb pole ligm (Brookhaven Protein DataBank; http://www2.ebi.ac.uk/pcserv/pdbdb.htm). (b) PCR amplifíkace a klonovací strategie pro knihovnu. DP47 a DPK.22 zárodečné templáty byly modifikovány (viz text) pro tvorbu mutací v CDR3 regionech. Geny jsou označeny obdélníčky a CDR jsou uvedeny jako očíslované obdélníčky v genech. Potom byly sestaveny VH a VL segmenty a byly klonovány do pDN332 fágemidového vektoru. Primery (od SEQ ID NO: 11 do SEQ ID NO: 18) použité při amplifikací jsou uvedeny v dolní části obrázku.

Obr. 2 ukazuje: (a) barvení stříbrem 2D-PAGE lyzátu lidských melanomových COLO-38 buněk, do kterých byl vnesen rekombinantní 7B89 obsahující ED-B. Dvě 7B89 skvrny (zakroužkované) jsou způsobeny částečnou proteolýzou His-koncovky použité pro přečištění proteinu; (b) ímunopřenos gelu, identického s gelem z obr. 2a, za použití anti-ED-B El (tabulka 1) a M2 anti-6CZ 300495 B6

FLAG protilátek jako detekčních činidel. Jsou detekovány pouze 7B89 skvrny, což potvrzuje specificitu rekombinantní protilátky izolované ze skvrny v gelu.

Obr. 3A- 3C ukazují imunohistochemické pokusy provedené na sériových řezech z gliobiastomu multiforme, které ukazují typické glomerulům podobné vaskulámí struktury barvené za použití scFV El (A), A2 (B) a G4 (C). Měřítko: 20 pm.

Obr. 4 ukazuje stabilitu komplexů protilátka-(ED-B). Analýza vazby scFV El, H10 a L19 na ED—B doménu fibronektinu. (a) BlAcore sensogramy ukazující zlepšené disociační profily získalo né po afinitu ích úpravách protilátky, (b) Nativní gelová elektroforesa scFv-(ED-B) komplexů.

Pouze vysoce-afinitní protilátka L19 může tvořit stabilní komplexy s fluorescentně značeným antigenem. Fluorescenční detekce byla provedena popsaným způsobem (Neri et al., (1996), BioTechniques, 20: 708-712). (c) Kompetice komplexu scFv-(ED-B-biotin) se 100-násobným molámím nadbytkem nebiotinylovaného ED-B, jak byla monitorována elektrochemoluminiscen15 cí za použití přístroje Origen. Byl pozorován dlouhý poločas komplexu L19-(ED-B). Plné čtverečky: L19; prázdné trojúhelníčky: H10.

Obr. 5 ukazuje biodístríbuci radioaktivně značených proti látkových fragmentů u myší nesoucích nádory. Biodistribuce v nádoru a v krvi, vyjádřené jako procento injikované dávky na gram, jsou umístěny do grafu v závislosti na čase. Také je uvedena relevantní orgánová biodistribuce.

Obr. 6 ukazuje aminokyselinovou sekvenci protilátky L19 obsahující těžký řetězec (VH), spojovací skupinu a lehký řetězec (VL).

Obr. 7A a 7B ukazují králičí oči s implantovanými polymerovými peletami namočenými do angiogenní substance.

Obr. 8 ukazuje imunohistochemické barvení řezů z králičí rohovky s novotvořenými cévami, za použití L19 protilátky.

Obr. 9 ukazuje imunohistochemické barvení řezů ze struktur oka za použití L19 protilátky. Specifické červené zabarvení je patrné okolo neovaskulámích struktur v rohovce (a), ale ne okolo krevních cév v duhovce (b) a spojivce (c). Malé šipky: epitel rohovky. Relevantní krevní cévy jsou označeny velkými šipkami. Měřítka: 50 pm.

Obr. 10 ukazuje imunofotodetekci fluorescentně značených protilátek detekujících oční angiogenezi. Silná fluorescentní rohovková neovaskularizace (označená šipkami) je pozorována u králíků, kteiým byl injekčně podán protilátkový konjugát L19-Cy5 (a), specifický pro ED-B doménu FN, ale ne u králíků, kterým byl injekčně podán protilátkový konjugát HyHEL-10-Cy5 (b).

Imunofluorescenční mikroskopie rohovkových řezů potvrdila, že L19-Cy5 (c), ale ne HyHELCy5 (d), se vyskytuje v okolí neovaskulatury v rohovce. Řezy (a,b) byly získány 8 hodin po injekci protilátky; (c,d) byly získány za použití rohovkových řezů izolovaných od králíků 24 hodin po injekci protilátky. P, peleta.

Obr. 11 ukazuje makroskopický vzhled očí králíků, kterým byly podány konjugáty obsahující fotosenzibilizační činidlo. Oko králíka, kterému byl podán L19—PS, před (a) a 16 hodin po (b) ozáření červeným světlem. Šipka označuje koagulovanou neovaskulaturu, která byla potvrzena jako hypofluorescentní oblast v Cy5 fluoroangiogramu na obr. (c) 16 hodin po ozáření. Povšimněte si, že žádná koagulace není pozorována v jiných cévních strukturách, například v dilatova50 nýeh spojivkových cévách. Pro srovnání je uveden fluoroangiogram s hyperfluorescencí propouštějících cév a příslušná barevná fotografie neléceného králičího oka je uvedena v (d) a (h). Obr. (e,fig) jsou analogické s (a,b,c), ale přísluší králíkům, kterým byl injekčně podán ovalbumin-PS a kteří byly ozářeni červeným světlem. Nebyla pozorována žádná koagulace a angiogram ukázal hyperfluorescencí propouštějících cév. Oči králíků v časném stadiu angiogeneze, kterým byl podán L19-PS, jsou uvedeny na (Í-1). Zobrazení před (I) a 16 hodin po ozáření červeným svět-7CZ 300495 B6 lem (j) ukázaly významnou a selektivní světlem indukovanou intravaskulámí koagulaci (šipka). Okluse cév (šipka) je zejména zřetelná v ozářeném oku (1) králíka bezprostředně po euthanasii, ale není detekovatelná v neozářeném oku (k) stejného králíka. P, peleta. Hroty označují komeosklerální přechod (limbus). Na všech obrázcích jsou preexistujíci dilatované spojivkové cévy viditelné nad limbem, zatímco růst rohovkové neovaskulatury může být pozorován od limbu směrem k peletě (P).

Obr. 12 ukazuje mikroskopickou analýzu selektivní okluse krevních cév. H/E řezy rohovky (a,e,b,f: nefixované; ij: fixované paraformaldehydem) králíků, kterým byl injekčně podán oval10 bumin-PS (a,e,i) nebo L19-PS (b,fj) a kteří byli ozářeni. Velké šipky představují nepoškozené (e,i) nebo zcela uzavřené (fj) krevní cévy. Oproti selektivní oklusi rohovkové neovaskulatury a omezenému perivaskulámímu postižení (eosinofilii) způsobené L19-PS po ozáření (b.j.f), nevykazují cévy ve spojivce (k) a duhovce (1) u stejného králíka známky poškození. Fluorescentní TUNEL test ukázal různý počet apoptotických buněk v řezech od ozářených králíků, kterým byl podán L19-PS (c,g), nebo oval bumin-PS (d,h). Velké šipky ukazují některé relevantní cévní struktury. Malé šipky ukazují rohovkový epitel. Měřítko: 100 pm (a-d) a 25 pm (e1).

Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace lidských scFv proti látkových fragmentů specifických pro ED-B doménu fibronektinu z protilátkové fagové zobrazovací knihovny

Lidská protilátková knihovna byla klonována za použití VH (DP47; Tomlison et al., (1992), J. Mol. Biol., 227: 776-798) a Vk (DPK22; Cox et al., (1994), Eur. J. Immunol. 24: 827-836) zárodečných genů (pro strategii klonování a amplifíkace viz obr. 1). VH složka knihovny byla vytvořena za použití částečně degenerovaných primerů (obr. 1) (od SEQ ID NO: 11 do SEQ ID NO: 18) pomocí techniky na bázi PCR pro vložení náhodných mutací v pozicích 9535 98 CDR3). VL složka knihovny byla připravena stejným způsobem, vložením náhodných mutací do pozic 91, 93, 94 a 96 CDR3. PCR reakce byly provedeny popsaným způsobem (Marks et al., (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597) VH-VL-scFv fragmenty byly připraveny pomocí PCR sestavení (obr. 1; Clackson et al., (1991), Nátuře 352: 624-628) z VH a VL segmentů přečištěných na gelu. 30 pg přečištěných VH-VL scFv fragmentů bylo dvojitě tráveno 300 jednotkami Ncol aNotl, potom byl získaný materiál ligován do 15 pg Notl/Ncol tráveného pDN332 fágemidového vektoru. pDN332 je derivát fágemidu pHENl (Hoogenboom et al., (1991), Nucl. Acids Res. 19: 4133 4137). ve kterém byla sekvence mezí Notl místem a amber kodonem před genem III nahrazena následující sekvencí kódující D3SD3-FLAG-His6 koncovku (Neri et al., (1996), Nátuře Biotechnology 14: 385-390).

Notl D D D S D D D Y K D D

5’ - GCG GCC GCA GAT GAC GAT TCC GAC GAT GAC TAC AAG GAC GAC

D DKHHHHHH amber

,. GAC GAC AAG CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAG - 3*

-8CZ 300495 B6

Transformace do TG1 kmene E. coli byly provedeny způsobem podle Marks et al. (1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597) a fágy byly připraveny podle standardních protokolů (Nissím et al., (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597). Náhodně bylo vybráno pět klonů a tyto byly sekvenovány pro ověření absence kontaminace.

Rekombinantní fibronektinové fragmenty ED-B a 7B89, obsahující jeden a čtyři homologické repetitivní sekvence typu III, v příslušném pořadí, byly exprimovány z expresních vektorů na bázi pQE12 (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) způsobem popsaným v literatuře (Camemolla et al., io 1992, Int. J. Cancer 68: 397 405).

Selekce proti rekombinantní ED-B doméně fibronektinu (Camemolla et al., 1992, Int. J. Cancer 68: 397^405; Zardí et al., 1987, EMBO J., 6: 2337-2342) byly provedeny při lOnM koncentraci za použití antigenu biotinylovaného biotin-disulfid-N—hydroxy suke Ínimid esterem (činidlo B15 4531; Sigma, Buchs, Switzerland; 10) a eluovaného z 2D gelu, a streptavidinem potažených

Dynabeads korálků (Dynal, Oslo, Norway). Pro každé kolo panelování bylo použito 1013 fágů, v 1 ml reakční směsi. Fágy byly inkubovány s antigenem ve 2% mléku/PBS (MPBS) po dobu 10 minut. Do tohoto roztoku se přidalo 100 μΐ Dynabeads (10 mg/ml; Dynal, Oslo, Norway) předem blokovaných v MPBS. Po 5 minutách míšení se korálky magneticky separovaly z roztoku a 7-krát se promyly PBS-0,1% Tween20 (PBST) a 3-krát PBS. Eluce byla provedena inkubací po dobu 2 minut s 500 μΐ 50mM dithiothreitolu (DTT), pro redukci disulfidových můstků mezi antigenem a biotinem. Korálky byly znovu zachyceny a získaný roztok byl použit pro infekci exponenciálně rostoucích TG1 E. coli buněk. Po třech kolech panelování byl eluovaný fág použit pro infekci exponenciálně rostoucích HB2151 buněk E. coli, které byly umístěny na (2xTY + 1% glukosa H- 100 pg/ml ampicílinu) - 1,5% agarové plotny. Jednotlivé kolonie byly kultivovány v 2xTY + 1% glukose + 100 pg/ml ampicilinu a byly indukovány pres noc při 30 °C 1 mM IPTG pro dosažení produkce protilátky. Vzniklé supematanty byly vyšetřovány ELIS A za použití streptavidinem potažených mikrotitračních ploten zpracovaných lOnM biotinylovaným ED-B a anti-FLAG M2 protilátkou (IBI Kodak, New Haven, CT) jako detekčním činidlem. 32 % vyšetřovaných kolonií bylo pozitivních v tomto testu a tři z nich, které měly nej silnější ELIS A signál (El, A2 a G4), byly sekvenovány a dále charakterizovány.

ELISA testy byly provedeny za použití biotinylované ED-B získaného ze skvrny v gelu, biotinylovaného EE)—B, který nebyl denaturován, ED—B navázané na sousední fibronektinové domény (rekombinantní protein obsahující 7B89 domény) a mnoha irelevantních antigenů. Protilátky El, A2 a G4 reagovaly silně a specificky se všemi třemi proteiny obsahujícími ED-B. Tato skutečnost, spolu se skutečností, že všechny tři rekombinantní protilátky mohly být přečištěny z bakteriálních supematantů za použití ED-B afin itní kolony, silně naznačuje, že rozpoznávají epitop přítomný v přirozené konformaci ED-B. Žádná reakce nebyla detekována pro fibronektinové fragmenty neobsahující ED-B doménu (data nejsou uvedena). Pro testování toho, zda mají protilátky izolované proti gelové skvrně dobrou afinitu k přirozenému antigenu, byla provedena interakční analýza v reálném čase za použití povrchové plasmonové rezonance na BIAcore přístroji, podle způsobu uvedeného v literatuře (Neri et al., (1997), Nátuře Biotechnol. 15: 1271-1275). Monomemí frakce El, A2 a G4 scFv fragmentů se vázaly na ED-B s afinitou v rozmezí 107-108

M-l (tabulka 1).

Jako další test specificity a použitelnosti protilátky byl proveden 2D-PAGE imunopřenos, při kterém byl do gelu vnesen lyzát lidské melanomové buněčné linie COLO-38, do kterého byla přidána minimální množství 7B89 proteinu obsahujícího ED-B (obr. 2). ScFv (El) barvil silně a specificky pouze 7B89 skvrnu.

Protilátky El, A2 a G4 byly použity pro imunolokaiizaci fibronektinu obsahujícího ED-B (B-FN) v kryostatových řezech z glioblastoma multiforme, což je agresivní mozkový nádor s výraznou angiogenezí. Obr. 3 ukazuje sériové řezy z glioblastoma multiforme, s typickými glo55 merulům podobnými cévními strukturami zbarvenými červeně třemi protilátkami. Imunobarvení

-9CZ 300495 B6 řezů ze vzorků glioblastoma multiforme zmrazených bezprostředně po chirurgickém odběru bylo provedeno způsobem popsaným v literatuře (Carnemolla et al., 1992, Int. J. Cancer 68: 397-405; Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612- 618). Stručně, imunobarvení bylo provedeno za použití M2-anti-FLAG protilátky (IB1 Kodak), biotinylovaných anti-myších polyklonálních protilátek (Sigma), barvicího kitu obsahujícího komplex streptavidin-biotin-alkalická fosfatasa (BioSpa, Milan, Italy) a naftol-AS-MX-fosfatu a „fast red TR (Sigma). Gillův hematoxylin byl použit jako kontrastní barvení, po kterém následovalo umístění do glycergelu (Dako, Carpenteria, CA), jak bylo popsáno dříve (Castellani et al., 1994, Int. J. Cancer 59: 612—618).

t

Pomocí podobné techniky a protilátky L19 (viz další příklad) jsme mohli také specificky barvit nově vytvořené cévy indukované implantací polymerových pelet ponořených do angiogenní substance, jako je vaskulámí endotelový růstový faktor nebo estery forbolu, do králičí rohovky.

Příklad 2: Izolace lidského scFv proti látkového fragmentu vážícího se na ED-B se subnanomolámí afinitou

ScFv(El) byl vybrán pro testování možnosti zlepšení jeho afinity pomocí omezeného počtu mutací CDR zbytků lokalizovaných na periferii vazebného místa pro antigen (obr. 1A). Kombinatoriálně jsme imitovali zbytky 31-33, 50, 52 a 54 VH protilátky a zobrazili jsme příslušný repertoár na filamentosním fágu. Tyto zbytky se často vyskytují v kontaktu s anti genem ve známých 3D-strukturách komplexů protilátka-antigen. Získaný repertoár 4 x 10⁸ klonů byl selektován pro vazbu na ED-B doménu fibronektinu. Po dvou kolech panelování a po vyšetření 96 jednotlivých klonů byla izolována protilátka s 27-krát vylepšenou afinitou (H10; tabulky 1 a 2). V souladu s jinými pozorováními pro afinitně - upravené protilátky jsme pozorovali, že zlepšená afinita byla způsobena spíše pomalejší disociací z antigenu než zlepšenými kon hodnotami (Schier et al., (1996), Gene, 169: 147-155; Ito (1995), J. Mol. Biol. 248: 729-732). Předpokládá se, že lehký řetězec protilátky přispívá méně k vazebné afinitě k antigenu, což je podporováno faktem, že jak přirozené, tak syntetické protilátky bez lehkého řetězce se mohou stále ještě vázat na antigen (Ward et al., 1989, Nátuře 341: 544-546; Hamers-Casterman et al., 1993, Nátuře 363: 446—448). Z tohoto důvodu jsme vybrali pro randomizaci pouze dva zbytky (32 a 50) VL domény, které jsou umístěny centrálně ve vazebném místu pro antigen (obr. la) ave 3D strukturách se často vyskytují v kontaktu s antigenem. Získaná knihovna, obsahující 400 klonů, byla zobrazena na fágu a byla selektována pro vazbu na antigen. Z analýz disociačních profilů za použití interakční analýzy v reálném čase provedených pomocí BIAcore přístroje (Jonsson et al., 1991, BioTechniques, 11: 620-627) a měření k_off pomocí kompetičních pokusů s elektrochemiluminiscenční detekcí, byl identifikován klon (LI9), který se vázal na ED-B doménu fibronektinu s Kd - 54 pM (tabulky 1 a 2). Pokusy s afinitu ími úpravami byly provedeny následujícím způsobem: Gen scFv (El) byl amplifikován PCR za použití primerů LMBIbís (5'-GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG-3') (SEQ ID NO: 1) aDP47CDRlfor (5-GA GCC TGG CGG ACC CAG CTC ATM NNM NNM NNGCTA AAG GTG AAT CCA GAG GCT G-3') (SEQ ID NO: 2) pro vložení náhodných mutací do pozic 31-33 v CDR1 VH (pro číslování: 28), a s příměry DP47CDRlback (5-ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CC-3') (SEQ ID NO: 3) a DP47CDR2for (5' GTC TGC GTA GTA TGT GGT ACC MNN ACT ACC MNN AAT MNN TGA GAC CCA CTC CAG CCC CTT-3') (SEQ ID NO: 4) pro náhodnou mutaci pozic 50, 52, 54 v CDR2 VIL Zbývající fragment scFv genu, v rozsahu 3'—části VH genu, peptidové spojovací skupiny a VL genu, byl amplifikován za použití primerů DP47CDR2back (5 ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG-3') (SEQ ID NO: 5) a JforNot (5-TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC TTG GCC GAA CG-3') (SEQ ID NO: 6) (94 °C, 1 minuta, 60 °C, 1 minuta, 72 °C, 1 minuta). Tři získané PCR produkty byly přečištěny na gelu a byly sestaveny PCR (21) za použití primerů LMBIbís a JforNot (94 °C, 1 minuta, 60 °C, 1 minuta, 72 °C, 1 minuta). Získaný jediný PCR produkt byl přečištěn z PCR směsi, byl dvojitě tráven Notl/Ncol a byl ligován do Notl/Ncol tráveného vektoru pDN332. V ligační směsi bylo použito přibližně 9 pg vektoru a 3 pg insertu, směs byla přečištěna fenol izací a srážením ethanolem, byla resuspendována v 50 pl sterilní vody a byla elektroporována do elektrokompetentních

-10CZ 300495 B6

TGI buněk E. coii. Získaná afinitně - upravená knihovna obsahovala 4 x 10⁸ klonů. Protilátkové - fagové částice, získané popsaným způsobem (Níssím et al., 1994, EMBO J., 13: 692-698) byly použity pro první kolo selekce na imunozkumavce potažené 7B89 (Camemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397^405). Selektované fágy byly použity pro druhé kolo panelování provedené s Βίοι iny lo vanou ED-B, po kterém následovalo zachycení na magnetických korálkách potažených streptavidinem (Dynal, Oslo, Norway; viz předchozí odstavec). Po selekci bylo přibližně 25 % klonů pozitivních v solubilním ELISA testu (pro protokol pokusu viz předchozí kapitolu). Z kandidátů pozitivních v ELISA jsme dále identifikovali jeden klon (H10, tabulka 1) s nejnižší hodnotou ko_ff podle BIAcore analýzy (Jonsson et al., 1991, BioTechniques, 11: 620 627).

Gen scFV(H10) byl amplifikován PCR za použití příměrů LMBlbis a DPKCDRlfor (5'-G TTT CTG CTG GTA CCA GGC TAA MNN GCT GCT GCT AAC ACT CTG ACT G-3') (SEQ ID NO: 7) pro vložení náhodných mutací do pozice 32 v CDR1 VL (pro číslování: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917), a s primery DPKCDRlback (5-TTA GCC TGG TAC CAG CAG AAA CC-3') (SEQ ID NO: 8) a DPKCDR2for (5 -GCC AGT GGC CCT GCT GGA TGC MNN ATA GAT GAG GAG CCT GGG AGC C-3 ) (SEQ ID NO: 9) pro vložení náhodné mutace v pozici 50 v CDR2 VL. Zbývající část scFv genu byla amplifíkována za použití oligonukleotidů DPKCDR2back (5' GCA TCC AGC AGG GCC ACT GGC-3 ) (SEQ ID NO: 10) a JforNot (94 °C, 1 minuta, 60 °C, 1 minuta, 72 °C, 1 minuta). Tri získané PCR produkty sestaveny, tráveny a klonovány do pDN332 stejně, jak bylo popsáno výše pro mutagenesi těžkého řetězce. Získaná knihovna byla inkubována s biotinylovanou ED-B ve 3% BSA po dobu 30 minut a potom byla zachycena na streptavidinem potažené mikrotitraění plotně (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) během 10 minut. Fágy byly eluovány 20mM roztokem DTT (1,4dithio-DL-threitol, Fluka) a byly použity pro infikování exponenciálně rostoucích TGI buněk. Analýza vazby supematantů z 96 kolonií na ED-B pomocí ELISA a BIAcore umožnila identifikaci klonu L19. Anti-ED-B El, G4, A2, H10 a L19 scFv protilátkové fragmenty selektivně barvily nově vytvořené cévy v řezech z agresivních nádorů (obr. 3).

Výše uvedené fragmenty anti-ED-B protilátek byly potom produkovány inokulací jedné čerstvé kolonie do 1 litru 2xTY média, jak bylo popsáno v literatuře (Pini et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 171-182) a byly afinitně přečištěny na sepharosové koloně aktivované CNBr (Pharmacia, Uppsala, Sweden), ve které bylo navázáno 10 mg 7B89 rekombinantniho proteinu obsahujícího ED-B (Camemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397—405). Po naplnění byla kolona promyta 50 ml rovnovážného pufru (PBS, 1 ml EDTA, 0,5 M NaCI). Protilátkové fragmenty byly potom eluovány 100 mM triethylaminem, ihned byly neutralizovány 1 M Hepes, pH 7 a byly dialyzovány proti PBS. Afinitní měření pomocí BIAcore byla provedena s přečištěnými protilátkami, způsobem uvedeným v literatuře (Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271-1275) (obr. 4). Analýza posunu proužků byla provedena způsobem uvedeným v literatuře (Neri et al., 1996, Nátur. Biotechnol. 14: 385-390), za použití rekombinantní ED-B fluorescenčně značené na Nkonci (Camemolla et al., 1996, Int. J. Cancer 68: 397-405; Neri et al., 1997, Nátur. Biotechnol. 15: 1271-1275) infračerveným fluoroforem Cy5 (Amersham) (obr. 4). BIAcore analýza neumožňuje přesné stanovení kinetických parametrů pro pomalé d i soc i ač ní reakce, z důvodů možného opakovaného navázání, základní nestability a dlouhých časů měření nutných pro zjištění toho, že disociační fáze probíhá podle jednoho exponenciálního profilu. Proto jsme provedli měření kinetické disociační konstanty k_off pomocí kompetičních pokusů (Neri et al., 1996, Trends in Biotechnol. 14: 465-470) (obr. 4). Stručně, anti-ED-B protilátky (30 nM) byly inkubovány s biotinylovanou ED-B (10 nM) po dobu 10 minut, za přítomnosti M2 anti-FLAG protilátky (0,5 pg/ml) a polyklonálního anti-myšího IgG (Sigma), který byl předem značen ruteniovým komplexem, jak je popsáno v literatuře (Deaver, D.R., 1995, Nátuře 377: 758-760). Do tohoto roztoku byla v paralelních reakcích v různou dobu přidávána nebiotinylovaná ED-B (1 pM). Potom byly přidány streptavidinem potažené Dynabeads, ředěné v Origen Assay pufru (Deaver, D.R., 1995, Nátuře 377: 758-760) (20 pl, 1 mg/ml) a získané směsi byly analyzovány za použití ORIGEN analyzátoru (IGEN lne., Gaithersburg, MD, USA). Tento přístroj detekuje elektrochemoluminiscenční signál (ECL), který koreluje s množstvím scFV fragmentu, který zůstává navázaný na biotinylovanou ED-B na konci kompetiční reakce. Graf ECL signálu versus kompe- 11 CZ 300495 B6 tiční doba dává profil, který může být upraven pro jedinou exponenciální křivku s charakteristickou konstantou k_off (obr. 4, tabulka 2).

Příklad 3: Zaměření nádorů pomocí vysoce afínitního radioaktivně značeného scFv specifického pro ED-B doménu fibronektinu

Radioaktivním jodem značené scFv(L19) nebo scFv(D1.3) (irelevantní protilátka specifická pro lysozym slepicích vajec) byly intravenosní injekcí podány myším s podkožně implantovaným myším F9 teratokarcinomem, rychle rostoucím agresivním nádorem, Biodistribuce protilátek byly stanoveny v různých časech (obr.4). ScFv(L19) a scFv(D1.3) byly afinitně přečištěny na antigenní koloně (Neri et al., 1997, Nátuře Biotechnol. 15: 1271-1273) a byly radioaktivně značeny jodem-125 za použití lodogen metody (Pierce, Rockford, IL, USA). Radioaktivně značené protilátkové fragmenty si zachovávaly >80% imunoreaktivitu, jak bylo určeno vnesením radioaktivně značené protilátky do antigenní kolony, po kterém následovalo stanovení radioaktivity v první a druhé výtokové frakci. Holým myším (Swiss holé myši stáří 12 týdnů, samci) s podkožně implantovaným F9 myším teratokarcinomem koloně (Neri et al., 1997, Nátuře Biotechnol. 15: 1271-1273) byly injekčně podány 3 pg (3—4 pCi) scFv ve 100 μΙ salinickém roztoku. Velikosti nádorů byly 50 až 250 mg, protože větší nádory mají tendenci ke vzniku nekrotického centra. Nicméně, při pokusech o zaměření větších nádorů (300—600 mg) bylo dosaženo v podstatě stejných výsledků. Pro každý čas byla použita tři zvířata. Myši byly utraceny humánním způsobem ajejich orgány byly zváženy a byla stanovena jejich radioaktivita. Výsledky pro reprezentativní orgány jsou vyjádřeny jako procento injikované dávky protilátky na gram tkáně (% ID/g) ScFv(L19) je rychle eliminován z krve ledvinami; oproti běžným protilátkám se neakumuluje v játrech ani jiných orgánech. 8 % injikované dávky na gram tkáně se lokalizuje v nádoru již tři hodiny po injekci; následné snížení této hodnoty je způsobeno až skutečností, že nádor zdvojuje svou velikost během 24 až 48 hodin. Poměry nádor:krev v 3, 5 a 24 hodině po injekci jsou 1,9, 3,9 a 11,8, v příslušném pořadí, pro L19, ale vždy nižší než 1,0 pro protilátku sloužící jako negativní kontrola.

Radioaktivně značený scFv(L19) se přednostně lokalizuje v nádorech již několik hodin po injekci, což ukazuje na jeho použitelnost pro imunoscintigrafickou detekci angiogeneze u pacientů.

Příklad 4: Anti-ED-B protilátky selektivně barví nově vytvořené oční krevní cévy.

Angiogeneze, tvorba nových krevních cév z preexistujících cév, je charakteristickým procesem, který je příčinou mnoha onemocnění, včetně nádorů a většiny očních onemocnění vedoucích ke ztrátě zraku. Schopnost selektivně rozpoznat a okludovat neovaskulaturu přinese nové diagnostické a terapeutické možnosti.

Zkoumali jsme, zdaje B-FN specifickým markérem oční angiogeneze a zda mohou protilátky rozpoznávající B-FN selektivně rozpoznávat oční neovaskulámí struktury in vivo po systémovém podání. Pro tento účel jsme stimulovali angiogenezi v králičí rohovce, která umožnila přímé pozorování nově vytvořených očních cév, pomocí chirurgické implantace pelet obsahujících vaskulámí endoteiový růstový faktor nebo ester forbolu (obr. 7). Sukralfatové (laskavý dar od Merck, Darmstad, Germany) /hydronové pelety obsahující buď 800 ng vaskulárního endotelového růstového faktoru (Sigma), nebo 400 ng forbol-12-myristat, 13-acetatu („PMA“, Sigma) byly implantovány do rohovky samic králíků plemene New Zealand White, způsobem popsaným v literatuře (D'Amato, R.J. et al., Proe. Nati. Aead. Sci. USA 91: 4082—4085. 1994). Angiogeneze byla indukována oběma faktory. Králíci byly sledováni denně. Při použití obou indukčních činidel byly nově vytvořené krevní cévy silně pozitivní na ED-B při imunohistochemické vyšetření. Pro všechny další pokusy byly použity PMA pelety. Imunohistochemická vyšetření ukázala, že L19 silně barví neovaskulaturu indukovanou v králičí rohovce (obr. 8, 9a), ale ne pre—existující krevní cévy oka (obr. 9b,c) a jiné tkáně k (data nejsou uvedena). Imunohistochemická vyšet-12 CZ 300495 B6 řent byla provedena způsobem popsaným v literatuře (Camemolla, B, et at, Int, J. Cancer, 68: 397-405. 1996).

Příklad 5: Lidský protilátkový fragment LI9, který se váže na ED-B se subnanomolámí afinitou, rozpoznává oční angiogenezi in vivo.

Za použití modelu angiogeneze na králičí rohovce, který byl popsán v předešlém příkladu, a imunofotodetekční techniky (Neri, D. et at. Nátuře Biotechnol. 15: 1271-1275, 1997), jsme io prokázali, že L19, chemicky navázaný na červený fluorofor Cy5, ale nikoliv protilátkový fragment (HyHEL-10)-Cy5, namířený proti irelevantnímu antigenu (obr. 10a,b), selektivně rozpoznává oční angiogenezi po íntravenosní injekci. Fluorescenční barvení rostoucích očních cév bylo jasně detekovatelné při použití L19 ihned po injekci a přetrvávalo po dobu alespoň dvou dnů, analogicky s předešlými pozorováními pro nádorovou angiogenezi. Následná imunofluorescenční mikroskopická analýza řezů z rohovky provedená ex vivo potvrdila lokalizaci L19, ale ne HyHEL-10, okolo vaskulárních struktur (obr. 10c,d). Průkaz rozpoznávání oční neovaskularizace protilátkou, společně s reaktivitou anti—B—FN protilátek u různých druhů, nabádá k dalším klinickým výzkumům. Imunofluorescenční zobrazení může být vhodné pro časnou detekci oční angiogeneze u rizikových pacientů, dříve než se léze stanou manifestními pří fluoroangiografii.

Některé metodologické podrobnosti:

Pro vyšetření imunofluorescence ex vivo a pro některá H/E barvení byly rohovky fixovány ve 4% paraformaldehydu v PBS před ponořením. Pokusy fluorescenční fotodetekce byly provedeny na králících zklidněných Acepromazinem v dávce 5 mg/kg. Pro pokusy cíleného rozpoznávání bylo 3,5 mg scFv(L19) i-Cy5<>,66 ^a 2,8 mg scFv (HyHEL-10) i-Cy5o 83 injikováno intravenosně každému králíkovi (doba injekce - 15 minut). Silná fluorescence v rohovkové neovaskulatuře byla pozorována ihned po injekci LI9, ale ne HyHEL-10, a přetrvávala několik hodin. V dalším testu na specificitu byl králíkům injekčně podán den předem scFv(HyHEL-10)-Cy5 a králíkům nega30 tivním při fotodetekci byl další den tnjikován scFv(L19)-Cy5 a bylo pozorováno silné fluorescenční barvení rohovkových nově vytvořených cév.

Pro fluorescenční detekci byly oči ozářeny wolframovou halogenovou lampou (model Schott KLI500; Zeíss, Jena, Germany) vybavenou Cy5 excitačním filtrem (Chromá, Brattieboro, VT,

USA) a dvěma světelnými kanály, jejichž konce byly umístěny přibližně 2 cm od oka. Fluorescence byla detekována chlazenou C-5985 monochromatickou CCD-kamerou (Hamatsu, Hamatsu-City, Japan), vybavenou C-upevněnou Canon Zoom čočkou (V6xl6; 16-100 mm, 1: 1,9) a Cy5 emisním filtrem o průměru 50 mm (Chromá), umístěným ve vzdálenosti 3 až 4 cm od ozařovaného oka. Akviziční časy byly 0,4 s.

Cy5 ftuoroangiografické pokusy byly provedeny se stejným vybavením, ale s íntravenosní injekci 0,25 mg Cy5-Tris (produkt reakce mezi Cy5-NHS a tris(hydroxymethyl)aminomethanem; doba injekce = 5 minut). Akviziční časy byly 0,2 s.

Protilátkové fragmenty byly ve formě scFv. Přečištění scFv(L19) a scFv(HyHEL-lO) a jejich značení N-hydroxysukcinimidovými estery (NHS) indokyaninu bylo popsáno v literatuře (Neri, D. et al.. Nátuře Biotechnol. 15: 1271-1275, 1997; Fattorusso, R. et at., 1999, Structure 7: 381390). Poměry protilátka:Cy5 při značení byly pro tyto dvě protilátky 1,5:1 a 1,2:1, v příslušném pořadí. Cy5-NHS bylo zakoupeno od Amersham Pharmacia Biotech (Zurich, Switzerland) a ovalbumin od Sugma (Buchs, Switzerland).

Po značení byly protilátkové konjugáty separovány od neinkorporovaného fluoroforu nebo fotosenzibilizátoru za použití PD-10 kolon (Amersham Pharmacia Biotech) uvedených do rovnováhy v 50 mM fosfátu, pH 7,4, 100 mM NaCI, (PBS). Imunoreaktivita proti látkových konjugátů byla měřena aflnitní chromatografií na antigenních kolonách (Neri, D. et al., Nátuře Biotechnol.

- 13 CZ 300495 B6

15: 1271-1275, 1997) a ve všech případech byla > 78%. Imunokonjugáty byly analyzovány elektroforesou na dodecylsíran sodný-polyakiy lamidových gelech a migrovaly jako proužek o MW - 30 000 Daltonů (čistota ³ 90%).

Příkladě: Lidský protilátkový fragment L19, chemicky konjugovaný na fotosenzibilizační Činidlo, kterým byl chlorin čtyřmocného cínu e₆, selektivně rozpoznává angiogenezi a způsobuje oklusi nově vytvořených cév při ozáření červeným světlem io Pro testování toho, zda může být pomocí selektivního rozpoznávání protilátkou dosaženo selektivní ablace cév, jsme injikovali králíkům L19 protilátkový fragment nebo irelevantní protein, který se nevychytává v nově vytvořených cévách (ovalbumin), navázané na fotosenzibilizační činidlo, kterým byl chlorin čtyřmocného cínu e_Ď, (které je zde označováno jako „PS“). Oči zvířat, kterým byla podána injekce, byly ozářeny červeným světlem (dávka =78 J/cm²). Representativní hodnoty jsou uvedeny na obr. 11. Nápadný makroskopicky odlišný nález byl pozorován 16 hodin po ozáření u králíků ošetřených L19-PS (obr. 1 la,b), s koagulací rohovkové neovaskulatury, ale nikoliv cév ve spojivce či jiných očních strukturách. Fuoroangiografíe s indokyaninovým fluoroforem Cy5 (obr. 1 lc) potvrdila uzávěr cév, který se projevil jako charakteristické hypofluorescentní oblasti. Naopak, hyperfluorescentní oblasti byly pozorovány v propouštějící neovaskulatu20 ře v neozářených očích (obr. 11 d,h). Žádné makroskopické a Iterace nebyly pozorovány v ozářených cévách králíků ošetřených ovalbuminem-PS (obr. 1 le-g), ani oftalmoskopicky, ani při Cy5 fluoroangiografii. Efekt ozáření cíleně podaného L19-PS konjugátu při časných stadiích rohovkové angiogeneze je uveden na obr. 11 i—1. Selektivně koagulované krevní cévy byly makroskopicky viditelné u živých zvířat (obr. 11 ij) a byly ještě zřetelnější u zvířat bezprostředně po utra25 cení (obr. 1 lk,l).

Fotodynamické poškození bylo dále zkoumáno pomocí mikroskopických technik. Po ozáření mohla být okluse cév detekována standardními technikami barvení hematoxylinem/eosinem (H/E) jak v nefixovaných, tak v paraformaldehydem Fixovaných řezech z rohovky zvířat léče30 ných L19-PS (obr. 1 lbj,f), ale ne zvířat léčených ovalbuminem-PS (obr. 1 la,e,i). Apoptosa v části rohovky cíleně rozpoznané konjugátem obsahujícím fotosenzibilizační činidlo byla jasně viditelná ve fluorescenčním TUNEL testu (obr. 1 lc,g), ale byla špatně detekovatelná u negativních kontrol (obr. 11 d,h). Vyšší zvětšení ukázalo apoptosu endotelových buněk v cévních strukturách (obr. lig). Ani v TUNEL testu (není ukázáno), ani H/E barvením (obr. 1 lk,l) nebylo detekováno žádné poškození krevních cév v duhovce, skleře Či spojivce léčených zvířat.

Selektivní fotodynamické ablace neovaskulatury bude přínosem pro léčbu očních onemocnění a jiných patologických stavů souvisejících s angiogenezi, které jsou přístupné pro ozáření pomocí světelných difuzérů nebo optických vláken. Výsledky této studie jasně ukazují, že oční neovasku40 latura může být selektivně okludována bez poškození preexi stůj ících krevních cév a normálních tkání.

Některé technické podrobnosti:

Sloučenina čtyřmocného cínu a chlorinu e₆ byla vybrána z různých fotosenzibilizačních činidel pro svou účinnost, rozpustnost a specificitu po navázání na králičí anti-myší polyklonální protilátku (Sigma). Tyto imunokonjugáty byly testovány na cílenou fotolýzu červených krvinek potažených monoklonální protilátkou specifickou pro lidský CD47 (č. 313441 A; Pharmingen, San Diego, CA, USA). Sloučenina čtyřmocného cínu a chlorinu c_(; byla připravena způsobem popsaným v literatuře (Lu, X.M. et al., J. Immunol. Methods, 156: 85-99, 1992). Pro vazbu na proteiny byla sloučenina čtyřmocného cínu a chloru e₆ (2 mg/ml) míšena po dobu 30 minut při teplotě okolí v dimethylformamidu s 10-násobným molámím nadbytkem EDC (N'3dimethylaminopropyT-Ncthylkarbodiimid. hydrochlorid, Sigma) aNHS (N-hydroxysukcinimid, Sigma). Vzniklá aktivované směs se potom přidala do 8-násobného objemu proteinového roztoku (1 mg/ml) a provedla se inkubace při teplotě okolí po dobu 1 hodiny.

- 14 CZ 300495 B6

Po značení byly protilátkové konjugáty separovány od neinkorporovaného fluoroforu nebo fotosenzibilizátoru za použití PD-10 kolon (Amersham Pharmacia Bioteeh) uvedených do rovnováhy v 50 mM fosfátu, pH 7,4, 100 mM NaCI, (PBS). Imunoreaktivíta protilátkových konjugátů byla měřena způsobem popsaným v předchozím příkladu.

V pokusech týkajících se fotodestrukce bylo králíkům podáno intravenosně 12 mg scFv(L19) , sloučeniny čtyřmocného cínu a chlorinu e_Ř «>,«) nebo 38 mg ovalbuminui - sloučeniny čtyřmocného cínu a chlorinu e₆ (o», a králíci byly drženi v temnu po dobu trvání pokusu. 8 hodin po injekci io byly králíci uvedeni do anestesie ketaminem (35 mg/kg/ xylazinem (5 mg/kg)/ acepromazinem (1 mg/kg)) a jedno ze dvou očí bylo ozařováno po dobu 13 minut Schott K.L 1500 wolframovou halogenovou lampou vybavenou Cy5 excitačním filtrem (Chromá) a dvěma světelnými kanály, jejichž konce byly umístěny přibližně 1 cm od oka. Ozářená plocha byla přibližně velikosti 1 cm a ozáření bylo provedeno dávkou 100mW/cm², jak byla změřena SL818 fotodetektorem (Newport Corp. Irvine, CA, USA). Nebylo pozorovány žádné známky diskomfortu po ozáření.

Preventivně králíci dostali po ozáření analgetika (buprenorfín 0,03 mg/kg). Pro sledování fotodestrukce byly oči vyšetřovány oftalmoskopem a byly fotografovány za použití fundus kamery KOWA SL-14 (GMP SA, Rennens, Lausanne, Switzerland). Pět králíků bylo ošetřeno konjugátem obsahujícím sloučeninu čtyřmocného cínu a chlorinu e₆ a ozářeno pouze najedno oko, zatímco druhé oko sloužilo jako vnitřní negativní kontrola. Jako další kontrola byly použiti dva králíci, kteří byly pouze ozářeni, ale nebyl jim podán žádný konjugát s fotosenzibilizátorem.

Ihned po utracení králíků nadměrnou dávkou anestetika byly bulby enukleovány, rohovky byly odstraněny, byly ponořeny do Tissue Tek (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan) a zmrazený. Pro imunofluorescenční vyšetření ex vivo a pro některé H/E barvení byly rohovky Fixovány ve 4% paraformaldehydu v PBS před tím, než byly ponořeny do Tissue Tek. Kryostatové řezy průměru 5 pm byly použity pro další mikroskopickou analýzu. Fluorescenční TUNEL testy byly provedeny podle návodu výrobce (Rooche Díagnostic, Rotkreutz, Switzerland).

Tabulka 1: Sekvence vybraných anti-ED-B protilátkových klonů

		VH řetězec			VL řetězec
Klon	31-33*	50-55*	99-102*	33*	50*	92-97*
A2	SYA	AISGSG	GLSI	Y	G	NGWYPW
G4	SYA	AISGSG	SFSF	Y	G	GGWLPY
El	SYA	AISGSG	FPFY	Y	G	TGRIPP
H10	SES	SIRGSS	FPFY	Y	G	TGRIPP
L19	SFS	SISGSS	PFPY	Y	Y	TFRIPP

Relevantní aminokyselinové pozice (*: číslování podle Tomlinson et al., 1995, EMBO J., 14: 4628—4638) protilátkových klonů izolovaných z navržených syntetických knihoven. Jednopís35 menné aminokyselinové kódy jsou použity podle standardního IUPAC názvosloví.

- 15CZ 300495 B6

Tabulka 2: Afinity anti-ED-B scFv fragmentů

Klon	kon	koff (s'¹)^B	koff (s'¹)^c	MM)*
A2	1.5 x 10⁵	2.8 x IO’³	-	l.9x IO^-1
C4	4.0 X !0⁴	3.5 x 10³	-	8.7 x 10^B
El	1.6 x I0^J	6.5 χ I O ³	-	4.1 χ 10*
H10	6.7 x 10*	5.6 x 10^u	9.9 x IO'⁵	1.5 x 10'⁹
L19	Ll x 10’	9.6 χ 10-⁵	6.0 x 10*	5.4 x 10

*) Kd = kofl/kon. Pro vysoce-afinitní ligandy H10 a L19 nejsou hodnoty k_off z BIAcore analýzy dostatečně přesné z důvodu vlivu negativně nabité karboxylované pevné dextranové matrice; Kd hodnoty jsou proto vypočítány z měření K_off získaných v kompetičních pokusech (viz příklady), koff, kinetická disociační konstanta; k_on, kinetická asociační konstanta; k₍₎, disociační konstanta. B - měření na BIAcore; C = měření pomocí kom petice s elektrochem i luminiscenční detekcí. Hodnoty jsou přesné pro +/- 50 %, podle přesného stanovení koncentrace.

Seznam sekvencí <110> EUDGENOESSISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE ZURICH <120> Specifické vazebné molekuly pro scintígrafii, konjugáty obsahující tyto molekuly a způsoby léčby angiogeneze <130> 1900PTEP <140>

<141>

<150> US 09/075338 <151> 1998-05-11 <150> US <151> 1999-04-28 < 160> 21 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <21)> 24 <212> DNA <213> Artefíciální sekvence <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: PCR primer: LMBlbis <400> 1

- 16CZ 300495 B6 gcggcccagc cggccatggc cgag 24 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence; PCR primer: DP47CDRlfor <400> 2 gagcctggcg gacccagctc atmnnmnnmn ngctaaaggt gaatccagag gctg 54 <210>3 <211> 23 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: DP47CDRlback <400>3 atgagctggg tccgccaggc tcc 23 <210>4 <211> 60 <212>DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: DP47CDR2for <400>4 ₂₅ gtctgcgtag tatgtggtac cmnnactacc mnnaatmnnt gagacccact ccagcccctt 60 <210> 5 <211> 24 <212>DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: DP47CDR2back <400>5 acatactacg cagactccgt gaag 24 <210>6 <211>53 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: JforNot <400> 6 tcattctcga cttgcggccg ctttgatttc caccttggtc ccttggccga acg 53 <210> 7 <211> 47 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: DPKCDRlfor <400> 7

- 17CZ 300495 B6 gtttctgctc gtaccaggct aamnngctgc tgctaacact ctgactg 47 <210>8 <211> 23 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: DPKCDRlback <400> 8 ttagcctggt accagcagaa. acc 23 <210>9 <211> 46 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR přiměř: DPKCDR2for <400> 9 gccagtggcc ctgctggatg cmnnatagat gaggagcctg ggagcc 46 <210> 10 <211> 21 <212>DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: DPKCDR2back <400> 10 gcatccagca gggccactgg c 21 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: DP47baNco <400> 11 gcggcccagc atgccacggc cgaggtgcag ctgttggagt ctggg 45 <210> 12 <211>55 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: CDR3for <400> 12 ggttccctgg ccccagtagt caaamnnmnn mnnmnntttc gcacagtaat atacg 55 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: PCR primer: VHpul lth

- 18CZ 300495 B6 <400> 13 gcggcccagc atgccatggc cgag 24 <210> 14 <211> 66 <212>DNA <213> Artefíciální sekvence <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: PCR primer: Jassm <400> 14 cccgctaccg ccactggacc catcgccact cgagacggtg accagggttc cctggcccca 60 ₎₀ gtagtc ₆₅ <210> 15 <211> 62 <212> DNA <213> Artefíciální sekvence <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: PCR primer: DPK22assm <400> 15 gatgggtcca gtggcggtag cgggggcgcg tcgactggcg aaattgtgtt gacgeagtct 60 cc 62 <210> 16 <211>63 <212> DNA <213> Artefíciální sekvence <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: PCR primer: DPK3for <400> 16 caccttggtc ccttggccga acgtmnncgg mnnmnnaccm nnctgctgac agtaatacac 60 tgc <210> 17 <211> 56 <212> DNA <213> Artefíciální sekvence <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: PCR primer: Jfomot <400> 17 gagtcattct cgacttgcgg ccgctttgat ttccaccttg gtcccttggc cgaacg 56 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artefíciální sekvence <220>

<223> Popis artefíciální sekvence: PCR primer: VLpul lth <400> 18 gatgggtcca gtggcggtag cggg 24

- 19CZ 300495 B6 <210> 19 <211> 116 <212> PRI <213> VH protilátky specifické pro ED-B doménu fíbronektinu 5 <400> 19

Glu Val 1

Gin Leu

Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

5

Ala Ala

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ser 25

Gly

Phe

Thr Phe

ser 30

Ser

Phe

Ser

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ile

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Lys

Pro

Phe

Pro

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115 <210> 20 <211> 14 <212> PRT io <213> protilátková spojovací skupina <400> 20

Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly 15 10

-20CZ 300495 B6 <210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> VL protilátky specifické pro ED-B doménu fibronektinu 5 <400>21

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Thr Gly Arg Ile Pro 85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

-21 CZ 300495 B6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Protilátka se specifickou afinitou pro charakteristický epitop domény fibronektinu Extra 5 Domain-B (ED-B), kde uvedená protilátka má takovou afinitu k uvedenému epitopu domény

ED-B, že její disociační konstantaje menší než 1.10 ⁹ M.
2. Protilátka podle nároku 1, kde uvedená protilátka rozpoznává ED-B(+) fibronektin. io
3. Protilátka podle nároku 1, kde uvedenou protilátkou je scFv fragment.
4. Protilátka podle nároku 3, kde uvedená protilátka je rekombinantní protilátka.
5. Protilátka podle nároku 1, kde uvedená protilátka se váže na ED-B doménu fibronektinu 15 s Kj 54 pM.
6. Protilátka podle nároku 1, mající následující aminokyselinovou sekvenci:

VH

EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF PYFDYWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO-.19), spojovací skupinu

GDGSSGGSGGASTG (SEQ ID NO;20) , íís

VL

EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY YASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QTGRIPPTFG QGTKVEIK (SEQ ID NO:21)
7. Protilátka podle nároku l, kde uvedená protilátka je radioaktivně značená.
8. Protilátka podle nároku 7, kde uvedená protilátkaje značená radioaktivním jodem.
9. Protilátka podle kteréhokoli z nároků l až 8 pro použití pro rychlé cílené zaměření markérů angiogeneze.
10. Protilátka podle nároku 9 pro použití při imunoscintigrafické detekci angiogeneze.

-22 CZ 300495 B6
11. Protilátka podle nároku 10 pro použití pro detekci onemocnění charakterizovaných vaskulární prolíferací, jako je diabetická retinopatie, stařecká makulámí degenerace nebo nádory.
12. Protilátka podle nároku 11, kde během použití protilátka lokalizuje příslušné tkáně během tří 5 až čtyř hodin, nejlépe během 3 hodin, po injekci.
13. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že zahrnuje protilátku podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 a jedno nebo více činidel nutných pro detekci angiogeneze.

io
14. Protilátka podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 pro použití v diagnostice a terapii nádorů a onemocnění charakterizovaných vaskulámí prolíferací.
15. Konjugáty, které obsahují protilátku podle nároku 1 a molekulu schopnou indukovat koagulaci krve a uzavření krevní cévy.
16. Konjugáty podle nároku 15, kde molekulou schopnou indukovat koagulaci krve a uzavření krevní cévy je fotoaktivní molekula.
17. Konjugáty podle nároku 16, kde fotoaktivní molekulou je fotosenzibilizační činidlo.
18. Konjugáty podle nároku 17, kde fotosenzibilizační činidlo absorbuje světlo vlnové délky větší než 600 nm.
19. Konjugáty podle nároku 18, kde fotosenzibilizační činidlo je derivát sloučeniny čtyřmocné25 ho cínu s chlorinem e₆.
20. Použití konjugátu podle nároku 15 pro přípravu injekčního prostředku pro léčbu patologických stavů souvisejících s angiogenezí.

30 21. Použití podle nároku 20, ve kterém je patologický stav související s angiogenezí způsoben nebo spojen s oční angiogenezí.