CZ299903B6

CZ299903B6 - Zpusob izolace polysacharidového komplexu bunecných sten z plísnových mycelií chemickou hydrolýzou

Info

Publication number: CZ299903B6
Application number: CZ20060036A
Authority: CZ
Inventors: Beran@Miloš; Adámek@Lubomír; Urban@Marian; Molík@Petr
Original assignee: Výzkumný ústav potravinárský Praha, v.v.i.
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2006-01-17
Publication date: 2008-12-29

Abstract

Rešení se týká zpusobu izolace polysacharidového komplexu bunecných sten, dále chitin - glukanovéhokomplexu, chitosanu, jejich derivátu a degradacních produktu z plísnových mycelií, neupravených nebo autolyzovaných, chemickou hydrolýzou. Suspenze mycelia o sušine 1 až 20 % hmotn. se podrobí hydrolýze v roztoku anorganické kyseliny o koncentraci 1až 25 % hmotn. pri teplote 20 až 140 .degree.C podobu 0,5 až 48 hodin, kdy se oddelí ve forme nerozpustného podílu požadovaný produkt obsahující chitin - glukanový komplex a/nebo jeho degradacní štepy. Prípadne se následne suspenze získaného chitin- glukanového komplexu o sušine 1 až 20 % hmotn. podrobí reakci v roztoku alkalického hydroxidu o koncentraci 2 až 25 % hmotn. pri teplote 60 až 140 .degree.C po dobu 0,5 až 168 hodin, pri které dochází k cástecné deacetylaci prítomného chitinu za vzniku smesi chitin - glukanového komplexu (75 až 99,9 % hmotn.) a chitosanu (0,1 až 25 % hmotn.). V takto získaném produktu prítomný chitosan je od chitin - glukanového komplexu oddelen jako druhý produkt kyselou extrakcí s následnou ultrafiltrací civysrážením po alkalizaci roztoku.

Description

Způsob izolace polysacharidového komplexu buněčných stěn z plísňových mycelií chemickou hydrolýzou

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů izolace polysacharidového komplexu plísňových buněčných stěn, dále chítin-glukanového komplexu, chitosanu, jejich derivátu a degradačních produktů z průmyslových odpadních plísňových mycelií chemickou hydrolýzou.

Dosavadní stav tec hniky

Při průmyslové výrobě kyseliny citrónové a jiných organických kyselin, antibiotik, enzymů, potravinářských barviv a některých dalších látek biotechnologickým procesem vznikají velká množství odpadního plísňového myeelia, které obvykle představuje pro výrobce obtížný odpad. Přestože je tato odpadní biomasa zdrojem mnoha cenných sloučenin, je obvykle spalována bez jakéhokoliv užitku, zaorávána do zemědělské půdy nebo dokonce ukládána na skládkách, kde se stává nezanedbatelnou ekologickou zátěží.

Buněčná stěna většiny průmyslově využívaných plísňových kmenů, pocházejících ze tříd Zygomyeetes. Basidíomyeetes, Aseomycetes nebo Deuteromycetes, je tvořena sítí polysaeharidů, bílkovin a lipidů, / odborné literatury je dobře známo, že převládajícími stavebními složkami jsou chitin a (I-»3. 1->6)-β D-glukany. Chitin je přítomen ve formě mikrovláken zakotvených

?.5 v matrici tvořenou β D-glukany. Oba polysaeharidy jsou pravděpodobně spojeny kovalentní vazbou (Nwe N„ and Stcvens W. F. (2002) Biotechnology Lctters 24, 1461 - 64). Některé z plísňových kmenů mohou vedle chitinu obsahovat v buněčných stěnách laké chitosan.

Chitin. systematickým názvem poly-N-acetyl (l->4)^-D-glukosamin, je po celulóze druhým nejrozšířenějším biopolymerem na zeměkouli. Je přítomen v mnoha živých formách, včetně hmyzu, hub a schránek korýšů. Částečnou nebo úplnou deacetylací chitinu vzniká chitosan. Stupeň deaeetylaee komerčních chitosanů se obvykle pohybuje v rozsahu 70 až 95 %.

Komerční chitosan se vyrábí deacetylací chitinu získaného izolačním postupem ze schránek korýšovitýeh organismů, které jsou získávány jako odpadní materiál při jejich zpracování,

Polykationický charakter, velká tendence vytvářet chelatační komplexy, vysoká vazebná kapacita pro vodu a lipidy a výborná biokompatibilita činí tento materiál velmi atraktivním pro mnohá průmyslová odvětví. Mezi hlavní oblasti průmyslového využití chitosanu patří zpracování odpad4o nich vod, zemědělské materiály, potravinové a knnivářské doplňky, biomedicínské a farmaceutické materiály, chromatografieká a imobilizaění média, kosmetika a textilní a papírenský průmysl. Fyzikálně-ehemické vlastnosti chitinu a chitosanu mohou být cíleně modifikovány žádoucími směry přípravou jejich různých chemických derivátů.

β-D-glukany jsou přírodní polysaeharidy složené z rozvětveného řetězce jednotek glukózy, které jsou spojeny jiným typem vazby, než mnohem známější polysaeharidy celulóza nebo škrob. V přírodě se β-D-glukany vyskytují zejména v obilovinách, kvasnicích a houbách. Jednotlivé β D-glukany se podle původu liší svou velikostí a biologickou aktivitou. Tyto polysaeharidy patří mezi účinné nespecifické imunostimulátory, látky modulující imunitní systém člověka a antioxi5f) danty. Používají sc jako běžná součást potravních doplňků. Nejčastěji se izolují z pekařského droždí nebo hlívy ústříčné. Jejich pozitivní účinky jsou důkladně zdokumentovány v odborné literatuře.

Způsob přípravy chitosan-glukanového komplexu z průmyslového myeelia několika různých plísňových rodů, včetně Penicillium sp.. popsal R. Muzzarelli v patentu publikovaném v r. 1981 (Muzzarelli R.: Chitosan-glucan complcx. method for its production and end uses, patent Π 110435! a souvisej ící patenty BL 876990, DE 2923802, FR 2432040, GB 2026516, NE 7904674. JP 55009691 a US 4282351). Chitosan-glukanový komplex je podle tohoto postupu získáván varem myeelia určitých rodů plísní v koncentrovaném roztoku silných alkálií (30 až 50 % hmotn./objem) po dobu 4 až 6 h při teplotách vyšších než teplota varu těchto roztoků při atmosferickém tlaku. Podstatná část chitinu. obsaženého ve stěnách plísňové biomasy, je za těchto podmínek dcacctvlována na cíiííusan.

Patenty RU 2043995 a US 6333399 popisují způsob přípravy chitosan-glukanového komplexu io opakovaným opracováním myeelia alkalickým roztokem a roztokem anorganické kyseliny pří zvýšených teplotách, zahrnující nakonec alkalickou deaeetylaci přítomného chitinu v 10 až 30% roztoku sodného či draselného hydroxidu s následnou neutralizací a promytím pevného podílu nerozpustného v alkalickém roztoku.

i> Patentová přihláška WO 03068824 nárokuje přípravu derivátů buněčných stěn plísňové či kvasničné biomasy a tyto produkty, chitin—glukanový komplex a ehitosan připravené popsaným postupem. Způsob sestává z přípravy chitinu nebo chitin-glukanového kopolymeru se zvýšeným obsahem chitinu a následné deaeetylace chitinu na ehitosan v následujících krocích:

- opracování biomasy alkalickým roztokem,

- vytvoření suspenze frakce biomasy nerozpustné v alkalickém prostředí v roztoku kyseliny,

- opracování této suspenze enzymy s β-glukanázovou aktivitou s cílem úplného nebo částečného odstranění β-glukanové frakce z chitin -glu káno vého kopolymeru,

- alkalická deaeetylace získané chitinové nebo chitin-glukanové frakce při zvýšené teplotě koin2? binovaná s kyselou extrakcí nebo kombinovaná alkalická a enzymová deaeetylace s pomocí deacetylačních enzymů v kyselém prostředí,

- vy srážení ehitosanu z kyselého roztoku.

Enzymový způsob izolace a oddělení ehitosanu z plísňového myeelia po výrobě kyseliny citrono3u vé s použitím proteázy produkované bakteriálním kmenem Baeillus subtilis při předčišťování polysacharidovcho komplexu buněčných stěn a deacetylačních enzymů pro deaeetylaci chitinu přítomného v tomto komplexu na ehitosan s jeho následnou izolací popisuje patent CN 1629197.

Kromě dříve zmíněných patentů existují také patenty a patentové přihlášky nárokuj ící způsob výroby ehitosanu z plísňové biomasy různých rodu (CN 1317497, JP 5184378, JP 5199892, W09004608, WO01687I4, W003086281, US 4806474, US 4195175. EP 1471148,

EP 1067197A2. US 4806474, US 2005245482) všechny založené na kombinaci alkalické hydrolýzy myeelia v koncentrovaném alkalickém roztoku spojené s deaeetylaci přítomného chitinu, za atmosférického či zvýšeného tlaku, a kyselé extrakce vzniklého ehitosanu s použitím různých w chemických činidel a za různých podmínek.

Patent US 5232842 nárokuje postup izolace ehitosanu z plísňové biomasy např. také s použitím 2 až 5% vodného roztoku hydroxidu sodného při teplotě 100 až 125 °C s následnou kyselou extrakcí, avšak vztahuje se pouze na plísňovou biomasu čeledi Mucoraceae.

Patent CN 1548461 popisuje způsob výroby ehitosanu z chitinu a příslušné výrobní zařízení s použitím opakovaného kombinovaného působení koncentrovaného roztoku hydroxidu sodného a mikrovlnného záhřevu.

Patent US 4806474 popisuje způsob výroby chitosanovč a glukanové frakce z mikrobiální biomasy, laké zahrnující působení koncentrovaného hydroxidu za horka a kyselou extrakci.

CZ 299903 Ró

Patent US 2005236328 popisuje způsob výroby chitosan-glukanového kopolymeru s poměrem glukosaminu a glukózy v rozsahu 1:5 až 5.1 z piísňové biomasy opět obvyklým způsobem kombinujícím alkalickou hydrolýzu koncentrovanými hydroxidovými roztoky a kyselou extrakci.

Komerční využití chitosanu je doposud limitováno jeho relativně vysokou cenou, vzhledem k vysoké ceně výrobního zařízení, vysokým výrobním nákladům, zapříčiněným zejména velkou spotřebou alkalického hydroxidu, velké energetické náročnosti a výkyvům v dostupnosti a kvalitě tradiční suroviny, odpadu po zpracování korýšů. Také způsob výroby chitosan-glukanového komplexu z piísňové biomasy, který je popsán ve výše zmíněných patentech 1T 1 104351. io RU 2043995 a US 6333399, je dosti materiálově a energeticky nákladný. Další nevýhodou je produkce velkého množství znečištěného roztoku odpadního alkalického hydroxidu, který představuje významnou ekologickou zátěž.

Způsoby popsané v patentech WO 03068824 a CN 1629197 sice umožňují použitím deacetylaě15 nich enzymů úsporu použitého alkalického činidla a energie, nevýhodou je však nízká účinnost těchto enzymů, vzhledem ke špatné prostorové přístupnosti chitinového řetězce, a jejich velmi vysoká cena. Z těchto důvodů se v současné době nejeví průmyslové využití těchto enzymů pro deacelylaci chitinu na chítosan reálně.

U ehitin-glukanovčho komplexu izolovaného z jiného průmyslového plísňového kmene Aspergillus niger byly zjištěny také antimutagenni, antimikrobiální a antivirální účinky (Kogan G„ Rauko P., and Machová E. (2003) Carbohydr. Res. 338 (9), 931-5; Kogan G„ et al. Advances in Chitin Science. Vol. II/Eds. Domard A.. Roberts G. A. E., and Varům K. M./, Jaques André Publisher. Lyon 1998).

Tradiční způsoby extrakce ehitin-glukanovčho komplexu či chitosanu alkalickou hydrolýzou jsou značně materiálově i energeticky náročné a neekologické. Postupy založené na použití deaccty lačních enzymů jsou nedostatečně účinné a také příliš nákladné.

to

Pod stata vynálezu

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob izolace polysacharidovčho komplexu buněčných stěn plísňových mycelií. dále chitin -glukanového komplexu, chitosanu, jejich derivátů a degradačních produktů z. průmyslových plísňových mycelií, neupravených nebo autolyzovaných, chemickou hydrolýzou, podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že se suspenze mycelia o sušině 1 až 20 % hmotn. podrobí hvdrolýze v roztoku anorganické kyseliny o koncentraci I až 25 % hmotn. při teplotě 20 až 140 °C po dobu 0,5 až 48 hodin, kdy se oddělí ve formě nerozpustného podílu produkt obsahující chitin-glukanový komplex a/nebo jeho degradační štěpy. Případně se násled49 ně suspenze získaného chitin glukanového komplexu o sušině 1 až 20 % hmotn, podrobí reakci v roztoku alkalického hydroxidu o koncentraci 2 až 25 % hmotn. při teplotě 60 až 140 °C po dobu 0.5 až 168 hodin, při které dochází k částečné deaeetylaci přítomného chitinu za vzniku směsi chitin glukanového komplexu (75 až 99,9 % hmotn.) a chitosanu (0,1 až 25 % hmotn.).

Dále je způsob podle vynálezu vyznačen tím, že v získaném produktu přítomný chítosan může být od chitin—glukanového komplexu oddělen jako druhý produkt kyselou extrakcí s následnou ultrafiltrací či vysrážením po alkalizaci roztoku. V tomto případě budou získány dva různé konečné produkty, ehitosan a chitin-glukanový komplex.

Vynález si klade za cíl dát k dispozici způsob výroby polysaeharidového komplexu buněčných stěn obsahujícího chitin-glukanový komplex (75 až 100 % hmotn.)a ehitosan (Ό až 25 % hmotn.) s různým stupněm deacetylace (60 až. 97%) a jejich chemických derivátů a degradačních produktů z průmyslových plísňových mycelií pocházejících ze tříd mikroorganizmů Zygomycetes, Basidiomyeetes, Aseoinycetes nebo Deuterornyeetes,

Podstata způsobu podle vynálezu dále spočívá v chemické hydrolýze mycelia. při které jsou odstraněny bílkoviny, lipidy, nukleové kyseliny a póly sacharidy jiné nez chitin-glukanový komplex po jejich degradaci a převedení do roztoku. Požadované produkty jsou získány jako nerozpustné podíly.

Konečným produktem muže býl chitin-glukanový komplex nebo směs chitin-glukanovčho komplexu a chiícsanu. Chitosan muže býí případně z teto směsi izolován jako další produkt. Výtěžky chítosanu jsou sice relativně nižší než u jiných způsobů, tato nevýhoda je však eliminována využitím zbývajícího chitin-glukanového komplexu, obsahujícího chitin nezreagovaný za podmíio nek uvedeného způsobu jako dalšího produktu.

Od dříve publikovaných a patentovaných postupů se tento způsob podle vynálezu liší tím, že hydrolýza mycelia probíhá nejprve v kyselém prostředí v relativně ředěných roztocích anorganických kyselin a pro dcacetylaci chitinu obsaženého ve výše specifikovaných průmyslových plísňo15 vých myceliích není používán koncentrovaný hydroxidový roztok. Při použili ředěných roztoků probíhala hydrolýza bílkovin, lipidů a nukleových kyselin účinněji v kyselém prostředí, než v alkalickém. Jako produkt není navíc využíván pouze chitosan, ale takc chitin-glukanový komplex. Způsob podle vynálezu popisuje levnější a ekologicky šetrnější způsob výroby polysacharidového komplexu buněčných stěn obsahujícího chitin-glukanový komplex a chitosan v různých po ni ě re c h v zá v i s I ost i n a pod m ί n kác h p ro ved e η í.

Výhoda způsobu podle vynálezu je v provedení chemické hydrolýzy mycelia v relativně ředěných roztocích anorganických kyselin a eventuálně alkalických hydroxidů. Při použití kombinované kyselé a alkalické hydrolýzy je možné navíc s výhodou alkalické a kyselé odpadní vody vzájemně neutralizovat a významně tak snižovat náklady na jejich další zpracování a čištění.

Mycelíum může být surové nebo předupravené autolýzou či hydrolýzou s použitím průmyslových enzymů třídy hydroláz. Obsah chítosanu, jeho molekulová hmotnost a stupeň jeho deacetylaee jsou ovlivňovány zvolenými podmínkami výrobního postupu. Mezi výše zmíněné degrajo daění produkty a chemické deriváty patří různé chitooligosacharidy, D-ghikosamin a N-acetylD-glukosamin nebo jejich soli. Pokud je v konečném produktu vyžadována přítomnost chitosanu, je nutné zařadit do výrobního postupu alkalickou hydrolýzu. která je nezbytná pro deacctylaci chitinu na chitosan. Deacetvlační reakce se obvykle provádí koncentrovanými roztoky alkalického hydroxidu. Pokud tento způsob probíhá za zvýšeného tlaku, je možno docílit významného výtěžku plísňovcho chítosanu a vysokého stupně deacetylace již při koncentracích alkalického hydroxidu v roztoku 2 až 25 % (hmotn./objem). jak je patrno z příkladu provedení. S výhodou lze použít hydroxid draselný, protože odpadní roztok po hydrolýze lze po neutralizaci jiným kyselým odpadním materiálem použít pro výrobu granulovaného hnojivá s využitím odpadního plísňového mycel ia jako nosiče.

Nerozpustné podíly získané po chemické hydrolýze jsou po důkladném promytí vodou vhodným způsobem odděleny, např. dckantaeí či odstředěním, a usušeny jako požadované produkty. Pokud byla hydrolýza provedena i v alkalickém prostředí, může být nerozpustný podíl před promytím a usušením použit pro kyselou extrakci chítosanu s jeho následným oddělením ultrafiltrací či vysrážením a usušením.

IJltrafíltracc umožňuje čištění chítosanu odstraněním anorganických nečistot a frakeionaci ehitosanu podle požadované molekulové hmotnosti.

Získaný chitin-glukanový komplex, samotný nebo ve směsi s chitosanem, či samotný chitosan. mohou být tabletovány či jinak finálně upraveny a použity jako potravinový doplněk - speciální vláknina se specifickými biologickými aktivitami.

Způsob podle vynálezu umožňuje využití stabilně dostupného zdroje biomasy stálého složení bez přítomnosti jakýchkoliv kontaminujících látek a bez sezónních výkyvů. Riziko přítomnosti bílko-4.

vin a jiných alergizujících složek a anorganických látek v případe využití produktu jako potravinového doplňku č: jako přísady potravin je v tomio případě podstatné sníženo ve srovnání s komerčními chitosany, vyrobenými z odpadů po zpracování korýšů. Navíc jsou výrobní náklady produktu podstatně nižší než u těchto komerčních chitosanú. díky významné úspoře chcmiká5 lií. zejména alkalického hydroxidu, a nižší energetické náročnosti. Způsob podle vynálezu také eliminuje množství alkalických a kyselých odpadů a je tedy ekologičtější než dosud používané způsoby. Fyziologické účinkv chiíin-giukanovýeh komplexů pro jejich orální aplikaci jsou přitom v minimálně některých případech srovnatelné s účinky kvalitních komerčních chitosanú, které se připravují jinak a nákladněji.

Podle doposud nepublikovaných výsledků původců tohoto vynálezu mají orálně aplikované chitin-glukanové komplexy izolované z průmyslových mycelií Aspergillus niger nebo Penicillium oxalicum také pozitivní vliv na metabolismus krevních lipidu a redukci tělesné hmotnosti, srovnatelný s komerčními chitosany, a na zvýšení snůšky a kvality vajec u nosných slepic. Tyto i? komplexy můžou být tudíž použity jako speciální potravinové či krmivářské doplňky s pozitivními zdravotními účinky.

Následující příklad provedení způsob podle vynálezu pouze dokládá, aniž by ho jakkoliv omezoval.

Příklad provedení

Příklad l

Příprava deacetylované frakce buněčných stěn Aspergillus niger kombinovanou kyselou a alkalickou hydrolýzou so K 5 kg odstředěného mycelia Aspergillus niger (sušina 13% hmotn.) bylo přidáno 20 litrů

M roztoku kyseliny chlorovodíkové v pitné vodě a suspenze byla udržována při teplotě 100 °C po dobu 3 h. Po vychladnutí byl pevný podíl hydrolyzovaného mycelia promyt pitnou vodou, odstředěn a usušen lyofilizací. Bylo získáno 0,34 kg suchého práškovitého materiálu světle béžové barvy obsahujícího předčištčný chitin-glukanový komplex. Tento materiál byl suspendován ve 3,7 litrech 3 M roztoku KOH a získaná suspenze byla v parním autoklávu udržována při teplotě 120 °C po dobu 2 h.

Po vychladnutí byl pevný podíl hydrolyzovaného mycelia opakovaně promyt pitnou vodou až do neutrální hodnoty pH a následně odstředěn a usušen lyofilizací. Bylo získáno 0,21 kg suchého materiálu obsahujícího 18% hmotn. chitosanú s průměrným stupněm dcacetylacc vyšším než % (stanoveno spektrofotometricky a 1II-NMR spektrometrií).

Výše popsaný způsob umožňuje vzájemnou neutralizaci kyselých a alkalických odpadních vod a významně tak snižuje náklady na jejich další zpracování a čištění.

Prů mys lová využitelnost

Polysacharidový komplex buněčných stěn obsahující chitin-glukanový komplex a případně také 5o chitosan v množství až 25 % hmotn. je vhodný jako potravinový či krmný doplněk pro snižování hladiny celkového cholesterolu, LD-cholesterolu a triacylg]vcerolů a pro snižování celkové tělesné hmotnosti a s dalšími pozitivními zdravotními účinky. Kromě využití jako potravinový či krmný doplněk je chitin-glukanový komplex vhodný i např. jako surovina pro výrobu biomateriálů pro medicínské využití či biodegradovatelných plastů.

- 6 CZ 299903 B6

Plísňový chitosan je možno využít pro přípravu různých filmů, membrán, imobilizačních a ehromatografických medií, potravinový cli doplňků, jedlých obaiů potravin, biomateriátu pro medicínské využití, jako jsou kompozitní pěnové struktury s kolagenem, nosiče pro léky a jiné biologicky aktivní látky, nanovláken apod.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob izolace polysacharidového komplexu, dále chitin-glukanového komplexu, chitosanu a jejich degradačníeh produktů zplísňových mycelií. neupravených nebo autolyzovaných. chemickou hydrolýzou, vyznačující se tím, že se suspenze myeelia o sušině 1 až

15 20 % hmotn. podrobí hydrolýze v roztoku anorganické kyseliny o koncentraci 1 až 25 % hmotn.

při teplotě 20 až. 140 °C po dobu 0,5 až 48 hodin, kdy se oddělí vc formě nerozpustného podílu požadovaný produkt obsahující chitin-glukanový komplex a/nebo jeho degradační štěpy, případně se suspenze získaného chitin-glukanového komplexu o sušině 1 až 20 % hmotn. podrobí reakci v roztoku alkalického hydroxidu o koncentraci 2 až 25 % hmotn. při teplotě 60 až 140 °C po

20 dobu 0,5 až 168 hodin, při které dochází k částečné deacetylaei přítomného chitinu za vzniku směsi chitin-glukanového komplexu (75 až 99,9 % hmotn.) a chitosanu (0.1 až 25 % hmotn.).
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že v získaném produktu přítomný chitosan je od chitin-glukanového komplexu oddělen jako druhý produkt kyselou extrakcí s nás25 lednou ultrafiltrací ěi vysrážením po alkalizaci roztoku.