CZ293584B6

CZ293584B6 - Prostředek pro modulaci exprese lymfokinů

Info

Publication number: CZ293584B6
Application number: CZ19982329A
Authority: CZ
Inventors: Robert Tam; Kandsamy Ramasamy; Devron Averett
Original assignee: Icn Pharmaceuticals
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 2004-06-16
Also published as: DK0879056T3; UA46815C2; NO983372L; NO983372D0; WO1997026883A1; HUP9900681A2; EP0879056B1; ATE216886T1; ES2172764T3; CA2246162C; SI9720013A; EP0879056A1; BR9707154A; PL328003A1; SK283342B6; CA2246162A1; HUP9900681A3; CN1209747A; PL187439B1; PT879056E

Abstract

Je popsáno použití ribavirinu pro výrobu prostředků pro modulaci exprese lymfokinů v aktivovaných T buňkách lidského pacienta. Dále je popsáno použití ribavirinu pro výrobu prostředku pro ošetření nevirových nemocí, jako je alergie, autoimunní choroba nebo helmintóza, a pro ošetření nevirových podílů nemocí majících virový a nevirový podíl.ŕ

Description

Prostředek pro modulaci exprese lymfokinů

Oblast techniky

Vynález zahrnuje oblast výzkumu imunologie.

Dosavadní stav techniky

Lymfokiny představují skupinu polypeptidů náležící do řady cytokinů, tj. molekul, které jsou podobné molekulám hormonů a mohou ovlivňovat řadu buněčných funkcí a aktivovat spojení mezi různými buňkami. Nedávný výzkum pomohl objasnit roli lymfokinů v imunitních reakcích. Produkce lymfokinů prostřednictvím stimulátoru CD4+ (a také v CD8+) T buněk často spadá do jednoho ze dvou fenotypů, Thl a Th2, jak v myším, tak i v lidském systému (Romagnanu, 1191, Immunol Today 12: 256-257, Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol 7: 145-173). Thl buňky produkují interleukin 2 (IL-2), faktor zvýšení odumírání tkáně (TFN) a interferon gama (IFN·), tyto jsou především odpovědné za imunitu zprostředkovanou buňkami, takovou jako opožděný typ přecitlivělosti. Th2 buňky produkují interleukiny (IL-interleukin), IL--4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 a IL-13 a především se podílejí na zabezpečení optimální podpory humorální imunitní reakce, takové jako IgE a IgG4 přesun isotopických protilátek (Mosmann, 1989, Annu Rev Immunol, 7: 145-173).

Silně polarizované Thl a Th2 reakce nehrají různé role pouze v imunitních reakcích, ale mohou podporovat různé imunopatologické reakce. Thl-typ reakcí představuje diskutovanou specifickou autoimunitu orgánů, takovou jako experimentální autoimunní retinitida prostřední vrstvy oční koule (Dubey a spol., 1991, Eur Cytokine Network 2: 147-152), experimentální autoimunní encefalitida (EAE) (Beraud a spol., 1991, Cell Immunol 133: 379-389) a insulindependentní cukrovka (Hahn a spol., 1987, Eur J Immunol 18: 2037-2042), v kontaktní dermatitidě (Kapsenberg a spol., Immunol Today 12: 392-395) a při některých chronických zánětlivých onemocněních. Oproti tomu Th2-typ reakcí je zodpovědný za náchylnost k alergickým chorobám (proti běžným alergenům vnějšího okolí), takovým jako alergické astma (Walker a spol., 1992, Am Rev Resp Dis 148: 109-115) a atopická dermatitida (van der Heijden a spol., 1991, J Invest Derm 97:389-394), které jsou domněle znovu vyvolanými infekcemi zůstávající vtkaních, takovými jako např. vyvolaná helminty (Finkelman a spol, 1991, Immunoparasitol Today 12: A62-66) a Leishmania major (Caceres-Dittmar a spol., 1993, Clin Exp Immunol 91: 500 až 505), které jsou přednostně vyvolané při jistých primárních deficitech imunity, takových jako hyper-lgE syndrom (Del Přete a spol, 1989, J. Clin Invest 84: 1830-1835) a Omenns syndrom (Schandene a spol., 1993, Eur J Immunol 23: 56-60) a jsou spojovány se sníženým hyper-lgE syndromem (Del Přete a spol., 1989, J Clin Invest 84: 1830-1835) a Omenns syndromem (Schandene a spol., 1993, Eur J Immunol 23: 56-60) a se snížením schopnosti potlačit HIV replikaci (Backer a spol, 1995, Proč Soc Nat Acad Sci USA 92: 11135-11139).

Je tedy jasné, že modulace profilů lymfokinů výše uvedených stavů nemocí bude terapeuticky výhodná. Podpora Thl reakce bude nej pravděpodobněji vést ke změně Th2 fenotypů a naopak. Monoklonální protilátky (mAb) klymfokinům, lymfokiny samotné a jiná činidla, taková jako antioxidační činidla založená na thiolu (Jeannin a spol., 1995, JExp Med 182: 1785-1792) se projevily jako měnící patogenezi určitých chorob potlačením cytokinových typů podporujících chorobu, jak Thl nebo Th2. Např. intracelulámí infekce způsobené prvoky jsou omezeny pomocí IFN, ale znovu vyvolány působením IL-4, zatímco infekce vyvolané nematocidy jsou kontrolovány pomocí IL-4 a znovu vyvolávané IFN (Heinzel a spol., 1989, J. Exp Med 162: 59-72, Else a spol., 1994, J Exp Med 179: 347-351). Insulindependentní cukrovka u NOD myší před u myší a krys může být zlepšena ošetřením pomocí IL-4 nebo anti-IFN mAb ještě před plným rozvinutím choroby (Rapoport a spol., 1993, J. Exp Med 178: 87-99, Racke a spol., 1994, J Exp Med 180: 1961-1966, Cambell a spol., 1991, J Clin Invest 87. 739-742). Dodatečně, autoimunní

-1 CZ 293584 B6 vštěp hostitelské chorobě (GVHD), který je charakterizován syndromem podobným lupus erythematodes, je spojován sTh2 produkcí lymfokinů a je tlumen prostřednictvím IL-4 protilátky (Umland a spol., 1992, Clin Immunol Immunopathol 63: 66-73). Na druhé straně Thl cytokiny jsou produkovány při akutním GVHD, ve kterém dárcovské CD8+ T buňky se vyvíjí do CTL a narušují hostitelský imunní systém. Ošetření santi-IFN nebo anti-TNF mAb zlepšuje chorobu a ošetření s anti-IL-2 mAb mění akutní GVHD na autoimunní GVHD (Via a Finkelman, 1993, Int Immunol 5: 565-572).

Klinické zkoušky vlastností a rekombinantu IL-2 při ošetření HIV infekovaných pacientů bylo ve vývoji od roku 1983 (Volberding a spol, 1987, AIDS Res Hum Retroviruses, 3: 115-124). Souvislost zde přichází ze skutečnosti, že vývoj AIDS byl označen jako spojovaný se zvýšením typu produkce lymfokinů (Clerici a Shearer, 1994, Immunol Today 15: 575-581). Během doby progrese choroby vzniká u infikovaného jednotlivce snížená exprese Thl lymfokinů, takových jako IL-2 (Maggi a spol., 1987, Eur J Immunol 17: 1685-1690, Gruters a spol., 1990, Eur J Immunol 20: 1039-1044, Clerici a spol., 1993, J Clin Invest91: 759-765), průvodní jevy a zvýšená produkce Th2 lymfokinů, takových jako IL-4 a IL-10 (Clerici a spol., 1994, J Clin Invest. 768-775, Hoffman a spol., 1985, Virology 147. 326-335). T-buňky z asymtomatického nebo dlouhotrvajícího ošetření sIL-2 zvýšily jejich anti-HIV účinky, zatímco vliv IL-4 nebo IL-10 snížil jejich schopnost potlačit HIV replikaci a produkovat IL-2 (Backer a spol., 1995, Proč Soc Nat Acad Sci USA 92: 11135-11139).

Tato běžná imunomodulační terapeutika (mAbs a rekombinant cytokinů) však nejsou neomezená. Např. při vleklém ošetření monoklonální protilátkou vyvíjí hostitelská fauna protilátky proti monoklonální protilátky, které zjevně snižují riziko vyvolané imunitní reakce na tyto mAbs. Avšak tyto látky se stále ještě vyvíjejí a nové mAbs v dodatku ponechávají značné proteiny a proto mohou nastat potíže při dosažení jejich cílových lokalizací. Terapeutika založená na cytokinech jsou také imitována. Např. IL-2 ošetření autoimunní GVHD vede u myší ke vzniku akutní GVHD.

Ribavirin (l-b-D-ribofuranosyl-l,2,4-triazol-3-karboxamid) je syntetický neukleozid schopný zamezit replikaci RNA a DNA virů (Huffman a spol., 1973, Antimicrob. Agents Chemother3: 235, Sidwell a spol., 1972, Science 177:705). Byly ověřeny poznatky z dalších pozorování, že ribavirin, v dodatku k jeho protivirovým účinkům má vliv na jisté imunitní reakce (přehled Jalley a Suchil, 1984, Clinical Applications of Ribavirin: str. 93-96). Byly také ověřeny poznatky z jiných pozorování, že ribavirin ovlivňuje proliferaci mitogen- a antigen aktivovaných T a B lymfocytů. (Tam a spol., 1995 (údaje nejsou uvedeny), Peavy a spol., 1980, Infection and Immunity 29: 583-589) a dále, pokud je kombinovaný s cyklosporinem, ribavirin projevuje účinky na dlouhodobé přežívání aloimplantátu, Jolley a spol., (1988, Transplantation Proč 20: 703-706).

Dodatečně byly ověřeny pozoruhodně pokročilý předběžný výzkum díky demonstraci, že ribavirin alespoň zčásti moduluje typ cytokinů imunitní reakce podporou Thl reakce a potlačením Th2 reakce. Z pohledu do minulosti, tento objev není v rozporu s předchozím výzkumem. Za prvé, ribavirin je znám pro svoje útlumové účinky na obě funkční humorální imunitní reakce (Peavy a spol., 1981, J. Immunol 126. 861-864, Powers a spol., 1982, Antimicrob Agents Chemother 22: 108-114) a IgE-zprostředkovanou modulaci vylučování žímých buněk (Marquardt a spol., 1987, JPharmacol Exp Therapeutics 240: 145-149, (obě Th2 lymfokin zprostředkované jevy). Za druhé, ribavirin antagonizuje protivirové účinky azidothymidinu (AZT) na okrajové krevní lymfocyty u HIV pacientů (Vogt a spol., 1987, Science 235: 1376-1379). Tento objev je pozoruhodný, protože AZT snižuje IL-2 receptory (IL-2R), ale ne IL-2 expresi (Viora Camponeschi, 1995, Cell Immunol 163: 289-295). Je proto možné, aby ribavirin antagonizoval AZT modulací IL-2 exprese a zvýšením snížených úrovní IL-2R. Za třetí, ošetření ribavirinem imunooslabených pacientů pro chronické GVHD (Th2.-zprostředkovaná porucha) vede k dramatickému rozkladu nemoci, výsledek, který nenastává s běžnými imunosupresivními terapiemi, takovými jako cyklosporin a glukokortikoidy (Cassano, 1991, Bone Marrow Transplantation 7: 247-248). Konečně, ošetření ribavirinem (jeden rok) pacientů pro hepatitidu C (HCV) odhaluje méně nakupenin lymfocytů a mnohem menší poškození jater než kontrolou Placebem (Dusheiko

-2CZ 293584 B6 a spol., 1994, Hepatology 20: 206A). Tento výzkum může odrážet skutečnost, že ačkoliv převládající imunitní reakce na hepatitidu C je zprostředkovaná Thl lymfokiny, T buňky Th0/Th2 fenotypu mohou být infikovány HCV (Zigneco a spol., 1994, datum neuvedeno) a tato infekce může způsobit další destrukci hepatocytů zprostředkovanou protilátkou.

Podstata vynálezu

V souladu s aspektem předloženého vynálezu je nukleozid ribavirin podáván pacientovi s intenzitou dávek, která je efektivní pro modulaci lymfokinů v aktivovaných T buňkách, vysvětleno podrobněji, ribavirin je použit pro potlačení Th2 zprostředkované reakce T buněk a podporu Thl zprostředkované reakce T buněk.

Ribavirin je použit podle vynálezu pro léčbu nevyrovnaností exprese lymfokinů místo podávání ribavirinu, který je velmi dobře znám pro jeho antivirové účinky. Tyto nevyváženosti mohou být shledány jako průvodní jevy alergických atopických nemocí, takových jako alergické astma a atopická dermatitida, infekce zhelmintů a leischmaniózy a různých prvotních a druhotných deficitů imunity, které mohou nebo nemusí být spojeny s virovou infekcí.

Ve svém výhodném celku je ribavirin podáván pacientovi ústně s intenzitou dávek, která dosahuje úrovně krevního séra mající průměrné hodnoty 0,25 až 12,5 μΜ a nejvýhodněji průměrně 2,5 μΜ. U běžných jednotlivců je tato optimální úroveň séra vymezena přibližně 4,5 mg/kg/den hmotnosti těl, která může být podávána s intenzitou dávek od 200 až 1200 mg. Výhodná dávkování jsou rozdělena do několika menších dávek, které jsou následně podávány během celého dne.

Ribavirin byl na trhu již několik let, a proto je známo mnoho způsobů dávkování a forem podávání a mohou být použity všechny vhodné intenzity dávek a způsoby podávání. Např. ribavirin dodatečně k ústnímu podávání může být podáván intravenózně, íntramuskulámě, intraperitoneálně, místně a podobně, mohou být použity všechny způsoby, které jsou známé. Farmaceutické formulace obsahující ribavirin mohou také obsahovat jeden nebo více farmaceuticky akceptovatelných nosičů, které mohou zahrnovat masťové základy, takové jako stabilizátory (podporující dlouhodobé skladování), emulgační prostředky, pojivá, zahušťovadla, soli, ochranná činidla, rozpouštědla, disperzní prostředky, nánosy, antibakteriální a protiplísňová činidla, isotonická a absorpční útlumová činidla a podobné. Použití takových prostředků nebo činidel pro farmaceutické aktivní substance je dobře známé ze současného stavu techniky. Kromě prostředků nebo činidel, které jsou s ribavirinem neslučitelné, je uvažováno jakékoliv použití těchto prostředků a činidel v terapeutických prostředcích a přípravách, do uváděných prostředků a přípravků mohou být také inkorporovány přídavné aktivní příměsi.

Ribavirin, dodatečně k terapeutickému použití ribavirinu uvažovanému podle vynálezu, může být také použit jako laboratorní nástroj pro studium absorpce, distribuce, absorpce buněk a působení.

V popise obrázků, jakož i v příkladech provedení vynálezu použité zkratky mají následující význam:

HEPES -kyselina 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová

ELISA -enzymový imunosorpční test

FITC -fluorescein izokyanatan

RNA -kyselina ribonukleová

PCR -polymerázová řetězcová reakce cDNA -kopie deoxyribonukleové kyseliny

PMA -12-myristát-13-acetátforbolu

INF -interferon

TNF -nádorový nekrotický faktor

IL -interleukin.

-3CZ 293584 B6

Přehled obrázků na výkresech

Tabulka 1 (viz příklad 10) ukazuje klidové a PMA/jonomycinem aktivované úrovně lymfokinů, IL-2, IL-4. TFN IFN (pg/ml) v 48 a 72 hodinách, měřeno v extracelulámích supematantech, a expresi buněčného povrchu IL-2 (IL-2R) a IL-4 (IL-4R) receptorů (průměrná intensita fluorescence kanálků) z lidských T buněk.

ío Obrázek 1 ukazuje grafické znázornění vlivu ribavirinu a interferonu na extracelulámí expresi IL-2, IL—4, TNF a IFN v MA/jonomycinem aktivovaných T lymfocytech. Výsledky jsou vyjádřeny jako procenta zvýšení exprese lymfokinů následně po ošetření pouze PMA/jonomycinem.

Obrázek 2 je grafickým znázorněním vlivu 2, 10 nebo 50 mM ribavirinu za přítomnosti 15 2000 U/ml interferonu (levá část) a vlivu 500, 1000 nebo 2000 U/ml interferonu (pravá část) za přítomnosti 10 mM ribavirinu na extracelulámí expresi IL-2 (A a C) a IL-4 (B a D) v PMA/jonomycinem aktivovaných T lymfocytech.

Obrázek 3 je grafickým znázorněním vlivu ribavirinu a interferonu na IL-2, IL-4 a IFN mRNA 20 expresi v PMA/jonomycinem aktivovaných T lymfocytech.

Obrázek 4 je grafickým znázorněním vlivu Ribavirinu a interferonu na expresi buněčného povrchu IL-2 a IL—4 receptorů v PMA/jonomycinem aktivovaných T lymfocytech. Výsledky jsou vyjádřeny jako procenta zvýšení exprese receptorů lymfokinů následně po ošetření pouze 25 PMA/jonomycinem.

Obrázek 5 je grafickým znázorněním exprese intracelulámí IL-2 exprese v klidových (A a E) nebo aktivovaných CD4+ (horní část) nebo CD8+ (dolní panel) T buňkách ošetřených pouze PMA/jonomycinem (B a F) nebo za přítomnosti 10 mM ribavirinu (C a G) nebo 5000 U/ml 30 interferonu (D a H). Údaje z jednoho experimentu jsou ukázány a vyjádřeny jako procenta buněk projevujících dvojí pozitivní zbarvování pokud se jedná o IL-2 a CD4 nebo CD8.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Typy buněk a purifíkace T buněk

Okrajové krevní mononukleámí buňky (PBMC) byly isolovány ze žlutočervené vrchní vrstvy použitím Ficoll-Hypeque centrifugace s hustotním gradientem z 60 ml krve od zdravých dárců. 40 T-buňky byly následně purifikovány z PBMC použitím Lymphokwik isolačního činidla lymfocytů specifického pro T-buňky (LK-25T, One Lambda, Canora Park CA). Průměrný výnos 40 až 60 x 106 T-buněk byl následně podroben inkubaci přes noc při teplotě 37 °C v 20 až 30 ml RPMI-AP5 (PRMI-1640 médium (ICN, Costa Mesa, CA) obsahující 20 mM HEPES útlumového roztoku, pH 7,5, 5 % autologní plazma, 1 % L-glutaminu, 1 % penicilin/streptomycin a 45 0,05 % 2-merkaptoethanol) pro odstranění jakýkoliv nečistot ulpěných na buňkách. T-buňky byly ve všech zkouškách promyty RPMI-AP5 a následně umístěny do mikrotitračních desek (plátů) s 96 otvory (komůrkami) s koncentrací buněk 1 x 106 buněk/ml.

Příklad 2

Aktivace T-buněk a léčba ribavirinem

T-buňky byly aktivovány dodáním 500 mg jonomycinu a 10 mg forbol-12-myristát-13-acetátu (PMA) (Calbiochem, La Jolla, CA) a podrobeny inkubaci po dobu 48 až 72 hodin při teplotě

-4CZ 293584 B6 °C. T-buňky aktivované PMA/jonomycinem byly ošetřeny 0,5 až 50 mM ribavirinu nebo 250 až 10 000 U/ml kontrolního antivirového interferonu (Accurate, Westbury, NY) ihned po aktivaci a znovu ošetřeny po 24 hodinách. T-buňky z každého plátu byly použity pro imunofluorescenční analýzu a supematanty použité pro extracelulámí měření cytokinů. Následně po aktivaci bylo 900 ml buněčného supematantu z každého mikroplátu přeneseno na jinou mikrodesku pro analýzu produkce cytokinů pocházejících z buněk. Buňky byly následně použity v imunofluorescenční analýze, kterou byly zjištěny úrovně intracelulámích cytokinů a exprese receptorů cytokinů.

Příklad 3

Analýza extracelulámích cytokinů

Koncentrace lidských cytokinů pocházejících z buněk byly určeny v buněčných supematantech z každého mikroplátu. Aktivací vyvolané změny úrovní interleukinů-2 (IL—2) byly určeny použitím obchodně dostupného prostředku ELISA kit (R&D Systems Quantikine kit, Minneapolis, MN) nebo biologickou zkouškou použitím IL-2 odvozených typů buněk, CTLL-2/ATCC, Rockville, MD). Aktivací vyvolané změny úrovní interleukinů-4 (IL-4), faktoru zvýšení odumírání tkáně (TFN) interleukinů-8 (IL—8) (R& D Systems Quantikine kit, Minneapolis, MN) a interferonu (IFN) (Endogen, Cambridge, MA) byly určeny použitím ELISA kitů. Všechny výsledky získané použitím ELISA byly vyjádřeny v pg/ml a použitím CTLL-2 biologického testu v počtech za minutu vyjadřujících celulámí inkorporaci 3H-thymidinu závislou na IL-2 (ICN, Costa Mesa, CA) podle CTLL-2 buněk.

Příklad 4

Studia přímé imunofluorescence (Receptory cytokinů)

Buňky, pro účely přímého zabarvování povrchových buněčných antigenů protilátkami konjugovanými fluorescencí, byly dvakrát promyty isotonickým rozpouštědlem solného roztoku, pH 7,4 (Bacton Dickinson, Mansfield, Ma), resuspendovány v 50 ml isotonického rozpouštědla solného roztoku a rozděleny do dvou vzorků, jedna část vzorku byla zabarvena buď s PE-anti CD25/FITC-anti CD4, nebo s PE-krysí anti myší IgG + anti-CDwl24/FITC-anti CD4 mAb a nespecifikovaná fluorescence byla vyhodnocena zabarvením druhé části s PE/FITC-označenou kontrolní monoklonální protilátkou upravenou jako isotyp. Všechny monoklonální protilátky označené fluorescencí byly získány od Bectom Dickinson (San Jose, CA) až na anti-CDwl24, který byla získána od Pharmingen, San Diego, Ca. Inkubace byly provedeny při teplotě 4 °C v temnotě po dobu 45 minut použitím saturačních mAb koncentrací. Nezaregistrovaný štítek byl odstraněn omytím v PBS dříve než byla provedena analýza s FACScan průtokovým cytometrem (Becton Dickinson).

Hustota antigenů byl přímo určena v protékajících živých CD4+T buňkách a vyjádřena jako střední hodnota fluorescence (MCF). Povrchová exprese specifických antigenů (CDwl24, CD25) byla představena jako střední hodnota změny (MCS) získaná odečtením MCF FITC- nebo PEoznačených upravených na isotyp (IgGl) kontrolních mAb-zabarvených buněk od MCF FITCnebo PE-označených antigen-speciflkovaných mAb zabarvených buněk. Alternativně, povrchová exprese CD4+podmnožiny buněk zabarvených s CD28 mAb byla určena odečtením MCF CD28+ CD4+ od MCF CD28- CD4- buněk.

Životaschopnost kontrolních neošetřených buněk a buněk ošetřených ribavirinem a interferonem byla určena v každé dávce všech oligonukleozidů od četných dárců zabarvením vitálním barvivém, propidium-jodidem (5 mg/ml konečná koncentrace). Procentický podíl živých buněk, které vylučují propidium-jodid, byl určen průtokovou cytometrií a byl 90 % (rozmezí 90 až 99 %) u ošetření se všemi použitými koncentracemi.

-5CZ 293584 B6 fe

Příklad 5

Analýza imunofluorescence intracelulámích exprese cytokinů

Pro analýzu intracelulámí exprese IL-2 v CD4+ a CD8+ T buněčných podmnožin byly T buňky nejdříve ošetřeny poslední 4 hodiny ze 48 až 72 hodin aktivace s 10 mg Brefeldin A (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) pro minimalizaci sekrece nově syntetizovaných IL-2 do extracelulámího prostředí. Následně po aktivaci, 900 ml buněčného supematantu z každého mikroplátu bylo přemístěno na jinou mikrodesku pro analýzu produkce cytokinů odvozených z buněk. Před přímým zabarvením (30 min., 4 °C, v temnotě) s FITC konjugovanými protilátkami buněčných antigenů povrchu, CD4 a CD8, buňky byly promyty dvakrát isotonickým ředidlem solného roztoku, pH 7,4 a resuspendovány v 100 až 150 ml zabarvovacího útlumového roztoku (fosfátový tlumený roztok, pH 7,4 obsahující 1 % fetálního telecího séra (FCS) (Hyclone, Long, UT) a 0,1 % azidu sodného) a rozděleny na dva vzorky. Obarvené buňky byly promyty v 1 ml zabarveného tlumivého roztoku a peletky buněk byly resupendovány v lOOml ustalovacího roztoku (4% paraformaldehyd v PBS), následovalo odsávání supematantu. Ustálené buňky byly ponechány 20 minut při teplotě 4 °C, následně promyty v 1 ml zabarveného tlumivého roztoku a peletky buněk byly resuspendovány s promícháním v 50 ml rozpustného tlumivého roztoku (0,1% aponin (ICN, Costa Mesa, CA) v PBS). Pórovité buňky byly obarveny PE-označenou IL-2 protilátkou při teplotě 4 °C po dobu 30 minut v temnotě a následně promyty v 1 ml tlumivého roztoku upravujícího propustnost, resuspendovány v 250 ml zabarvujícího tlumivého roztoku, následovala FACS analýza.

Příklad 6

Analýzy mRNA cytokinů

Celková RNA byla oddělena z klidových T buněk a buněk ošetřených ribavirinem a interferonem a neošetřených aktivovaných T buněk použitím obchodních variant guanidimthiokyanát/fenol extrakčních technik (Trizol činidlo (GIBCO/BRL)). RNA byla promyta70% ethanolem a konečně resuspendována v 10 μΐ DEPC upravené vody.

cDNA reakce syntézy byla provedena pomocí instrukcí výrobců (Promega, Madion, WI). 1 g celkové RNA byl rychle zahřán na teplotu 65 °C po dobu 10 minut a ochlazen ledem před sloučením s 2 μΙ 10X tlumivého roztoku zpětné transkripce (100 mM Tris-HCl (pH 8,8), 500 mM KC1, 1 % Triton X-100), 5 mM MgCl, 2 μΐ 10 mM dNTPs (1 mM každé dNTP), 0,5 μΐ útlumového prostředku RNasy, 1 μΐ oligo (dT)_!5 primeru (0,5 pg/pg RNA) a 0,65 μΐ AMV zpětné transkriptázy (H. C.). Reakce byla ikubována při teplotě 42 °C po dobu 1 hodiny, dále při teplotě 95 °C po dobu 10 minut a 5 minut na ledě.

PCR reakce byla provedena použitím GeneAmp PCR kitu (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA). RT reakční směs (3 μΐ) byla v nové zkumavce sloučenina s 5 μΐ 10 X PCR tlumivého roztoku (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgC12 a 0,01 % (w/v) želatiny), 1 μΐ 10 mM dNTP a 1 U taq DNA polymerátu. Použité primery byly následující: interleukin-2, interleukin-4, interferon-g (lidský) primery (Stratagene, La Jolla, CA) a PHE7 ribozomální gen. Podmínky zesílení byly 45 sekund při teplotě 94 °C, 1 min při teplotě 57 °C a 2 minuty při teplotě 72 °C pro 35 cyklů, následovalo 8 minut při teplotě 72 °C. PCR produkty byly analyzovány v 2% gelu agarózy obsahujícím ethidiumbromid. Podle elektroforézy byly produkty PCR přemístěny na Hypond H+ membránu (Amersham, Arligton Heights, IL) v 20 X SSC přes noc a zbaveny pohyblivosti použitím 0,4 M NaOH. Skvrny byly hybridizovány s 32P-ATP označenými oligonukleotidovými sondami v Rapid-hyb tlumivém roztoku (Amersham) po dobu 1 hodiny při teplotě 42 °C. Každá cytokinová směs byla použita jako sonda značená radioaktivním izotopem (podle instrukcí). Ekvivalentní dávka byla testována prostřednictvím hybridizace sondou vyvinutou z testovacího primeru pHE7. Promyté kapky byly následně analyzovány použitím Phosphorlmageru.

-6CZ 293584 B6

Příklad 7

Vliv ribavirinu na úrovně extracelulámích cytokinů v aktivovaných T buňkách

Ošetření PMA/jonomycinem (48 až 72 hodin) lidských T buněk látkově zvýšilo úroveň všech analyzovaných cytokinů, tj. IL-2, IL-4, TNF, IFN (tabulka 2). První číslo v každé buňce ukazuje aritmetický průměr a čísla v kulatých závorkách znázorňují relevantní rozmezí, N = 4. V předložené zkoušce znázorněné na obrázku 1 dodání ribavirinu s intenzitou dávkování 0,5 až 50 mM zvyšuje aktivované úrovně Thl cytokinů, IL-2 a TNF maximálně v 5 mM (30 %) a 20 mM (36 %), jednotlivě. Oproti tomu interferon- a tlumil IL-2 a TNF expresi způsobem závislým na dávkování (rozmezí 250 až 10 000 U/ml, maximální útlum 33 % a 38 %, jednotlivě) v porovnání s úrovněmi v neošetřených aktivovaných T buňkách. Dodatečně, ribavirin zprostředkoval souhlasný pokles v aktivovaných úrovních Th2 cytokinů, IL-A (mezní útlum 74 % v 2 mM), zatímco interferon-a maximálně snížil extracelulámí IL-4 kolem 26 % (10 000 U/ml). Použití kombinací ribavirinu a interferonu, obrázek 2 ukazuje, že konstantní množství 2000 U/ml interferonu potlačilo přírůstek ribavirinu závislý na dávkování aktivovaných IL-2 úrovní (A) a zvrátil útlum aktivovaných IL-4 úrovní (C). Podobně, konstantní množství 10 mM ribavirinu zvrátilo útlumu zprostředkovaný interferonem závislý na intenzitě dávkování aktivovaných IL-2 úrovní (B) a potlačil zvýšení aktivovaných IL-4 úrovní (D).

Příklad 8

Vliv ribavirinu na úroveň cytokinů mRNA v aktivovaných T buňkách

Tyto protichůdné vlivy ribavirinu a interferonu-a na aktivované úrovně extracelulámích cytokinů byly také pozorovány v úrovni transkripce. Obrázek 3 znázorňuje, že ošetření PMA/jonomycinem lidských T-buněk látkově zvyšuje IL-2, IL-4 a IFN mRNA úrovní. Ošetření ribavirinem (2,5 a 10 mM), následně po aktivaci T buněk, zvýšilo IL-2, snížilo IL-4 a nemělo žádný vliv na IFN mRNA. Oproti tomu interferon a v 100, 2000 a 5000 U/ml snížil IL-2, zvýšil IL—4 a snížil IFN mRNA. Jednotlivé vlivy ribavirinu a interferonu a závislé na intenzitě dávkování na IL-2, TNF a IL—4 mRNA exprese se tedy shodovaly s analýzami ELISA: Tyto data ukazují, že ribavirin podporuje syntézu Thl cytokinů, IL-2 a TNF a potlačuje expresi Th2 cytokinů, IL-4 v aktivovaných lidských T buňkách.

Příklad 9

Vliv ribavirinu na úrovně receptorů IL-2 a IL-4 v aktivovaných T buňkách

Použitím FACS analýzy jsme porovnali vlivy ribavirinu a interferonu a na expresi IL-2 (CD25) a IL-4 (CDwl24) expresi receptorů v aktivovaných T buňkách. Ošetření PMA/jonomycinem zvyšuje CD25 a CDwl24 expresi z klidových úrovní 50,16 0,45 a 62,31 1,46 na aktivované úrovně 162,48 2,89 a 87,53 3,98, jednotlivě (n = 4). Podle tří předložených experimentů obrázek 4, že ribavirin (1 až 50 mM) má malý vliv na aktivované úrovně IL-2 a IL-4 receptorů, zatímco interferon a s intenzitou dávkování 250 až 10 000 U/ml snižuje IL-2 expresi receptorů a zvyšuje IL-4 expresi receptorů způsobem závislým na dávkování v porovnání s úrovněmi receptorů v kontrolních aktivovaných T buňkách. Tyto údaje tedy ukazují, že vliv ribavirinu na syntézu cytokinů působí nezávisle na expresi receptorů cytokinů. Oproti tomu, vliv ošetření interferonem a na IL-2 a IL-4 receptory koreluje s pozorováním jejich vlivu na aktivované IL-2 a IL-4 exprese.

Příklad 10

Vliv ribavirinu na intracelulámí IL-2 úrovně vCD4 a CD8+ podmnožinách aktivovaných T buněk

-7CZ 293584 B6

Testovali jsme, zda vliv ribavirinu na IL-2 expresi byl specifický k CD4- nebo CD8+ T buňkám. Intracelulámí IL-2 exprese v ustálených a propustných aktivovaných T buňkách byla určena dvoubarevnou průtokovou cytometrií použitím fluorescenčně označených protilátek na CD4 nebo CD8 a na IL-2. Obrázek 5 znázorňuje, že při ošetření ribavirinem v 10 mM roste procentický podíl CD4+ T buněk vyjadřujících IL-2 z 82 % na 91 % a procentický podíl CD8+ vyjadřující IL-2 se zvyšuje z 81 % na 91 %. Oproti tomu procentický podíl CD4+ buněk vyjadřující IL-2 a CD8+ buněk vyjadřující IL-2 při ošetření interferonem a (5 000U/ml) byl 81% a 71% jednotlivě. Tyto data ukazují, že ribavirin má vliv na intracelulámí IL-2 expresi, který nerozlišuje mezi CD4+ nebo CD8+ T buněčnými podmnožinami Oproti tonu ošetření interferonem a má malý vliv na CD4+ T buňky a stejnoměrně snižuje IL-2 expresi v CD8+ T buněčné podmnožině.

Tabulka 1

	48 h klidová	48 h aktivovaná	72 h klidová	72 h aktivovaná
IL-2	6,7 (5-9,3)	1 652 (848-2 148)	5,8 (5-9,3)	1 642 (918-1 866)
IL-4	7,5 (7,1-8,2)	209 (81-263)	8,5 (7,2-9,2)	131 (121-1 866)
TNFa	11,5(5-18)	1 573 (1 474-1 672)	8,3 (5-12)	1 894 (1 240-2 548)
IFNy	8,9(8,3-9,5)	1 285 (807-1 765)	9,3 (9,1-9,4)	2 229(1 230-3 228)
IL-2R	50,1 (40,6-59,7)	163(16,9-166,5)	60,1 (49,8-70,4)	163(160,1-166,5)
IL-4R			52,3 (42,6-59,2)	77,7 (73,5-82,1)

Tabulka 2

Koncentrace buněk na jeden otvor = 2 x 106 x 24 = 48 x 106 v 48 ml (celkový objem každého otvoru = 2000 μΐ)

	1	2	3	4	5	6
A		PMA	PMA	PMA	PMA	PMA
		ICN	ICN	ICN	ICN	ICN
				10 μΜ 1369	5 μΜ 1369	2 μΜ 1369
B	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA
	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN
	10 μΜ 3438	5 μΜ 3438	2 μΜ 3438	10 μΜ 3844	5 μΜ 3844	2μΜ3844
C	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA
	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN
	10 μΜ 4625	5 μΜ 4625	2 μΜ 4625	10 μΜ 5531	5μΜ5531	2μΜ 5531
D	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA
	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN
	10 μΜ 5676	5 μΜ 5676	2 μΜ 5676	10 μΜ 5839	5 μΜ 5839	2 μΜ 5839

Koncentrace na jeden otvor = 2 x 106 x 24 = 48 x 106 ve 48 ml (Celkový objem v každém otvoru = 2000 1)

	1	2	3	4	5	6
A	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA
	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN
	10 μΜ 6242	5 μΜ 6242	2 μΜ 6242	10 μΜ 11808	5 μΜ 11808	2 μΜ 11808
A	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA	PMA
	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN	ICN
	10μΜ 12204	5 μΜ 12204	2 μΜ 12204	ΙΟμΜΙΙΙΒ	5 μΜ RIB	2 μΜ RIB

-8CZ 293584 B6

Ribavirin se ukázal jako účinný při modifikaci exprese lymfokinů v aktivovaných T buňkách. Byly přímo uvedeny specifické celky a aplikace, ale odborníkům zkušeným v oboru bude jasná možnost dalších mnoha modifikací, aniž by se odchýlili od konceptu vynálezu. Vynález proto není zamýšlen jako limitní, mimo smysl přiložených nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití ribavirinu pro výrobu prostředku pro modulaci exprese lymfokinů v aktivovaných T buňkách lidského pacienta, přičemž ribavirin je podáván s intenzitou dávkování efektivní pro zvýšení úrovně Thl a s nížení úrovně Th2.
2. Použití ribavirinu pro výrobu prostředku pro ošetření nevirových nemocí charakterizovaných cytokinovým profilem, ve kterém Thl je sníženo pod normální úroveň a Th2 je zvýšeno nad normální úroveň.
3. Použití podle nároku 2, kde nemocí je alergie.
4. Použití podle nároku 2, kde nemocí je autoimunní choroba.
5. Použití podle nároku 2, kde nemocí je helmintóza.
6. Použití ribavirinu pro výrobu prostředku pro ošetření nevirových podílů nemoci mající virový podíl a nevirový podíl, nevirový podíl je charakterizován snížením Thl úrovní a zvýšením Th2 úrovní v aktivovaných T-lymfocytech.
7. Použití podle nároku 6, kde nemocí je prvotní deficit imunity.
8. Použití podle nároku 6, kde nemocí je druhotný deficit imunity.
9. Použití podle nároku 6, kde nemoc mající virový podíl zahrnuje nemoc způsobenou viry lidské imunodefícience.