CZ292881B6 - Androstanová a pregnanová řada pro allosterickou modulaci GABA receptoru - Google Patents

Abstract

Sloučeniny androstanové a pregnanové řady pro modulaci komplexu GAGA.sub.A.n. receptor - chloridový ionofor ke zmírňování stresu, úzkosti, záchvatů, poruch nálady, PMS a PND a k vyvolávání anestezie, farmaceutický přípravek s jejich obsahem a jejich použití pro výrobu léčiva.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů, přípravků a sloučenin pro modulaci excitability mozku živočichů prostřednictvím komplexu receptor γ-aminomáselné kyseliny A (GABAA) - chloridový ionofor (GRC). Konkrétně je vynález zaměřen na způsoby, přípravy a sloučeniny pro modulaci excitability mozku prostřednictvím vazby na receptorové místo neurosteroidů na GRC.

Dosavadní stav techniky

Excitabilita mozku je definována jako hladina aktivace živočicha, zahrnující nepřetržitě stavy od bezvědomí po křeče a je regulována různými neurotransmitery. Neurotransmitery jsou obecně odpovědné za regulaci konduktance iontů neuronálními membránami. V klidu má neuronální membrána potenciál (neboli napětí membrány) přibližně -80 mV, přičemž vnitřní prostor buňky je vzhledem k vnějšímu prostoru negativní. Potenciál (napětí) je výsledkem iontové (K+, Na+, Cl—, organické anionty) rovnováhy na neuronální semipermeabilní membráně. Neurotransmitery jsou uchovávány v presynaptických váčcích a jsou uvolňovány pod vlivem neuronálních akčních potenciálů. Při uvolnění do synaptické štěrbiny vyvolá excitační chemický transmiter, který je acetylcholin, depolarizaci membrány (změnu potenciálu z -80 mV na -50 mV). Tento efekt je zprostředkováván postsynaptickými nikotinovými receptory, které jsou stimulovány acetylcholinem ke zvýšení propustnosti membrány pro ionty Na+. Snížený potenciál membrány stimuluje neuronální excitabilitu ve formě postsynaptického akčního potenciálu.

V případě GRC je účinek na excitabilitu mozku zprostředkováván neurotransmiterem GABA. GABA má významný vliv na celkovou excitabilitu mozku, protože je jako neurotransmiter používán až 40 % neuronů v mozku. GABA reguluje excitabilitu jednotlivých neuronů tím, že reguluje konduktanci chloridových iontů neuronální membránou. GABA interaguje s příslušným rozpoznávacím místem na GRC, a tak usnadňuje tok chloridových iontů podél elektrochemického gradientu GRC do buňky. Intracelulámí nárůst hladiny tohoto aníontu způsobuje hyperpolarizaci transmembránového potenciálu, a tudíž menší náchylnost neuronu vůči excitačním vstupům (tj. sníženou excitabilitu neuronu). Jinými slovy, čím vyšší je koncentrace chloridového iontu v neuronu, tím nižší je excitabilita mozku (hladina aktivace).

Je dobře dokumentováno, že GRC je odpovědný za zprostředkování úzkosti, záchvatové aktivity a uklidnění. GABA a léčiva, která působí jako GABA nebo usnadňují účinky GABA (například terapeuticky použitelné barbituráty a benzodiazepiny (BZ), jako je valium) tedy vykonávají své terapeutické účinky interakcí se specifickými regulačními místy na GRC.

Bylo rovněž pozorováno, že řada steroidních metabolitů interaguje s GRC a mění tak excitabilitu mozku (Majewska M.D. a d., Science 232:1004-1007 (1986); Harrison. N.L. a d., J. Pharmacol. Exp. Ther. 241:346-353 (1987)). Před tímto vynálezem nebyla terapeutická použitelnost těchto steroidních metabolitů pracovníky v oboru rozpoznána z důvodu nedostatečného pochopení síly a místa účinku. Přihlašovaný vynález se částečně týká farmaceutické aplikace znalostí, získaných na základě rozvinutějšího poznání intenzity a místa působení určitých steroidních sloučenin.

Bylo demonstrováno, že ovariální hormon progesteron a jeho metabolity mají významný vliv na excitabilitu mozku (Backstrom, T. a d., Acta Obstet. Cynecol. Scand. Suppl. 130:19-24 (1985); Pfaff, D.W. a McEwen, B.S., Science 219:808-814 (1983); gyermek a d., J. Med. Chem. 11:117 (1968); a Lambert, J. a d., Trends Pharmacol. 8:224-227 (1987)). Hladina protesteronu a jeho metagolitů se mění s fázemi menstruačního cyklu. Je dobře dokumentováno, že množství progesteronu a jeho metabolitů před nástupem menses klesá. Rovněž bylo dobře dokumentováno měsíční opakování určitých fyzických příznaků před nástupem menšen. Tyto příznaky, které

-1 CZ 292881 B6 souvisejí s premenstruálním syndromem (PMS), zahrnují stres, úzkost a migrénové bolesti hlavy (Dalton, K., Premenstrual Syndrome and Progesterone Therapy, 2. vyd., Chicago: Chicago yearbook, 1984). Pacientky s PMS mají měsíční opakování příznaků, které jsou přítomny v premenstruu a nepřítomny v postmenstruu.

Podobným způsobem bylo snížení hladiny progesteronu časově korelováno se zvýšením frekvence záchvatů u epileptických žen (tj. katameniální epilepsie: Laidlaw, J. „Catamenial epilepsy“, lancet, 1235-1237 (1956)). Přímější korelace byla pozorována s úbytkem metabolitů progesteronu (Rosciszewska a d., J. Neurol. Neurosurg. Psych. 49:47-51 (1986)). Kromě toho u pacientek s primárními generálizovanými malými záchvaty epilepsie byl časový výskyt záchvatů korelován s výskytem příznaků premenstruálního syndromu (Backstrom, T., a d., J. Psychosom. Obstet. Cyneacol. 2:8-20 (1983)). Jako účinný při léčbě pacientek s epileptickými záchvaty korelovanými s menstruačními cykly se ukázal steroid deoxykortikosteron (Aird, R.B. a gordan, g.,. Amer. Med. Soc. 145:715-719 (1951)).

Dalším syndromem, souvisejícím s nízkou hladinou protestoronu, je postnatální deprese (PND). Bezprostředně po porodu dramaticky poklesne hladina progesteronu, což vede k nástupu PND. Příznaky PND se pohybují od mírné deprese k psychóze vyžadující hospitalizaci; PND je spojena se silnou úzkostí a iritabilitou. Deprese spojené s PND nejsou přístupné léčbě klasickými antidepresivy a ženy trpícími PND vykazují zvýšený výskyt PMS (Dalton, K., 1984).

Souhrnně z těchto pozorování vyplývá zásadní role progesteronu a deoxykortikosteronu a konkrétně jejich metabolitů při homeostatické regulaci excitability mozku, která se projevuje jako zvýšení aktivity záchvatů nebo příznaky spojené s katameniální epilepsií, PMS a PND. Korelace mezi sníženou hladinou progesteronu a příznaky spojenými s PMS, PND a katameniální epilepsií (Backstrom a d., 1983; Dalton, K., 1984) inspirovala použití progesteronu při jejich léčbě (Mattson a d., in: Advances in epileptology: XVth Epilepsy Intemational Symposium, Raven Press, New York, 279-282, 1984, a Dalton, K., 1984). Progesteron však není při léčbě výše uvedených syndromů konzistentně účinný. Například neexistuje vztah dávka-odpověď pro protesteron při léčbě PMS (Maddocks a d., Obstet. gynecol. 154:573-581 (1986); Dennerstein a d., British Medical Joumal, 290:16-17 (1986)).

Patenty US 5 232 917 a US 3 953 429 popisují pregnanové sloučeniny, aktivní při modulaci GABA receptorů a způsoby takové modulace. Sloučeniny popisované v patentu US 5 232 917 jsou 3-hydroxylované pregnan-20-ony, 3,21-pregnandiol-20-ony, 3,20-pregnandioly a 3hydroxylované androstany.

Patent US 3 953 429 popisuje 3a-oxygenované steroidy androsteronové a preganonové řady, které mají anestetické vlastnosti. Zahrnují zejména sloučeniny, které mají 2a-substituent nebo nenasycenou vazbu v poloze 8(9), zvláště je-li v poloze 11 oxoskupina.

Podstata vynálezu

Vynález se týká sloučenin použitelných pro modulaci excitability mozku a pro výrobu léčiv. Na rozdíl od citovaných patentů se vynález týká 3a-hydroxylovaných derivátů steroidů, působících na nově identifikovaném místě na komplexu GR, použitelných k modulaci excitability mozku způsobem, který zmírňuje stres, úzkost, nespavost, poruchy nálady (jako je deprese), které jsou přístupné GR-aktivním prostředkům, a záchvatovou aktivitu. Přípravky a sloučeniny účinné při takového léčbě spadají do rozsahu vynálezu.

Sloučeniny používané podle vynálezu a tvořící jeho součást jsou modulátory excitability centrálního nervového systému, zprostředkované jejich schopností regulovat chloridový kanál související s komplexem receptorů GABA. Původci vynálezu experimentálně zjistili, že

-2CZ 292881 B6 sloučeniny podle vynálezu mají antikonvulzivní a anxiolytickou účinnost podobnou jako známá anxiolytika, například BZ, ale působí na konkrétním místě komplexu GR.

Vztah endogenních metagolitů progesteronu k procesům souvisejícím s reprodukcí (menstruační cyklus a těhotenství) je znám (Markér, R.E., Kamm, O. a McGrew, R.V., „Isolation of epipreganol-3-one 20 from human pregnancy urine“, J. Am. Chem. Soc. 59:616-618 (1937)). Před tímto vynálezem však nebylo známo, jak tuto poruchu léčit modulací mozkové extability použitím metabolitů progesteronu. Vynález je proto zaměřen na způsoby, přípravy a sloučeniny pro léčbu poruch modulací mozkové excitability pomocí sloučenin podle vynálezu. Příklady poruch léčitelných podle vynálezu jsou epilepsie, úzkost, prementruální syndrom (PMS), postnatální deprese (PND), poruchy nálady (jako je deprese), které jsou přístupné GR-aktivním prostředkům, a nespavost. Sloučeniny podle vynálezu mohou být používány rovněž k vyvolání anestezie.

Sloučeniny podle vynálezu jsou deriváty různých 3a-hydroxylovaných pregnan-20-onů, 3a-21-pregnandiol-20-onů, 3a-20-pregnandiolů a 3a-hydroxylovaných androstanů a jejich esterových, etherových, sulfonátových, sulfátových, fosfonátových, fosfátových, oximových (imino) a thiazolidinových derivátů, přičemž tyto deriváty se označují jako prekurzory („prodrugs“). Výraz „prekurzor“ („prodrug“) označuje derivát známého přímo působícího léčiva, který ve srovnání s léčivem má lepší uvolňovací charakteristiky a terapeutickou hodnotu a transformuje se na aktivní léčiva enzymatickým nebo chemickým procesem, viz Notáři, R.E., „Theory and Practice of Prodrug Kinetics“, Methods in Enzymology, 112:309-323 (1985); gBodor, N., „Novel Approaches in Prodrug Design“, Drugs of the Future, 6(3):165-182 (1981), a Bundgaard, H., „Design of prodrugs: Bioreversible Derivatives of Various Functional groups and Chemical Entitiens“, New York (1985). Je nutno poznamenat, že některé syntetické deriváty, tvořící součást vynálezu, nemají být pravé prekurzory, protože mají kromě výše uvedených charakteristik také vlastní aktivitu. Pro účely tohoto vynálezu se však označují jako prekurzory.

Naše studie (Gee, K.W. a d., European Joumal of Pharmacology, 136:419-423 (1987)) ukázaly, že 3a-hydroxylované steroidy, používané podle vynálezu, jsou jako modulátory komplexu GR řádově účinnější než bylo dosud uváděno (Majewska, M.D. a d. (1986) a Harrsion, N.L. a d. (1987)). Majewska a Harrison uvádějí, že 3a-hydroxylované 5-redukované steroidy mají schopnost dosahovat pouze mnohem nižší účinnosti. Naše experimentální data in vitro a in vivo ukazují, že vysoká účinnost těchto steroidů umožňuje jejich terapeutické použití při modulaci mozkové excitability přes komplex GR. Mezi nejúčinnější steroidy, použitelné podle vynálezu, patří deriváty hlavních metabolitů progesteronu a deoxykortikosteronu. Tyto steroidy mohou být terapeuticky příznivým způsobem používány konkrétně k modulaci mozkové excitability při stresu, úzkosti, nespavosti, poruchách nálady (jako je deprese), které jsou přístupné GR-aktivním prostředkům, a záchvatových poruchách. Navíc jsme prokázali, že tyto steroidy interagují se specifickým místem na komplexu gR, které je odlišné od jiných známých míst interakce (tj. barbituráty, BZ a GABA), kde již byly popsány terapeuticky příznivé účinky na stres, úzkost, spánek, poruchy nálady a záchvatové poruchy (Gee, K.W., a Yamamura, H.I., in.: Centrál Nervous Systém Disorders, str. 123-147, D.C. Horvell, ed., 1985; Lloyd, K.G. a Morselli, P.L., in: Psycholpharmacology: The Third generation of Prograss, str. 183-195. H.Y. Meltzer, ed., Raven Press., N.Y., 1987). Tyto sloučeniny jsou žádoucí pro svou trvanlivost, účinnost a orální účinnost (spolu s jinými formami aplikace).

Steroidní deriváty podle vynálezu spadají do skupiny sloučenin, které lze znázornit následujícími strukturními vzorci 1 až 6:

-3CZ 292881 B6

-4CZ 292881 B6

kde význam obecných substituentů jsou:

ve sloučeninách vzorce 1:

R je vodík, nižší alkyl, nižší alkenyl nebo nižší alkinyl,

R] je methylen, β-hydroxymethyl nebo β-kyan,

-5CZ 292881 B6 a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery a 3,20-diestery,

Výhodnou skupinu tvoří sloučeniny vzorce 2, kde R je vodík nebo nižší alkoxy. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R je vodík.

ve sloučeninách vzorce 2:

Ri je nižší alkenyl, nižší alkinyl, trifluormethyl, alkoxymethyl a monohalomethyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R] je C₂-C₄ alkenyl, C₂-C₄ alkynyl nebo trifluormethyl. Zvláště výhodné jsou sloučeniny, kde R1 je ethynyl nebo trifluormethyl.

Další výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 2, kde R₃ je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R3 je acetyl nebo β-sukcinyloxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde R₃ je acetyl. ve sloučeninách vzorce 3:

R je vodík nebo nižší alkyl, nižší alkeny nebo nižší alkynyl,

Ri je β-acetylová skupina, ketal β-hydroxyacetylové skupiny, β-trifluoracetylová skupina, |3-(hydroxyacetyl)skupina, β-hydroxyacetyl-l 7a-hydroxyskupina, β-methoxyethylacetylová skupina, p-(ethoxy)-methyl-2'-methylenacetylová skupina, P-(T-hydroxyethyl)skupina, 3~-(l'-hydroxypropyl)skupina, fl-(2'-hydroxyizopropyl)skupina, β-sukcinyloxyacetylová skupina, β-hydroxyacetylnatriumsukcinátová skupina, β-acetoxyacetylová skupina, β-sulfoxyacetylová skupina, β-methylacetylová skupina, β-chloracetylová skupina, β-ethinylová skupina nebo β-ethylová skupina, která spolu se 17-uhlíkovým atomem, na nějž je vázána, a s atomem kyslíku tvoří 17(20)epoxyskupinu a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 21-estery, 3,20-diestery a 3,21-diestery, s podmínkou, že uvedenou sloučeninou není 3a-hydroxy-5a-preg-9(ll)-en-20-on, 3a,21dihydroxy-5a-preg-9( 11 )-en-20-on neb 2 l-acetoxy-3a-hydroxy-5a-preg-9( 11 )-en-20-on nebo jejich esterové deriváty.

Výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 3, kde R je vodík nebo alkinyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R je vodík.

Další výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 3, kde Ri je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R] je acetyl nebo β-sukcinyloxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde Ri je acetyl.

Výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 3, kde R je vodík nebo alkynyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R je vodík.

Další výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 3, kde R1 je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Ri je acetyl nebo β-sukcinyloxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde R! je acetyl. ve sloučeninách vzorce 4:

R je vodík, nižší alkyl, nižší alkenyl nebo nižší alkynyl,

Ri má stejný význam jako ve vzorci 3

-6CZ 292881 B6 a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 21-estery, 3,20-diestery a 3,21-diestery, s podmínkou, že uvedenou sloučeninou není 3a-hydroxy-5[3-pregn-l-en-20-on nebo jeho 3-esterové deriváty.

Výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 4, kde Rje vodík, trifluormethyl nebo nižší alkynyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Rje vodík.

Další výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 4, kde Ri je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Ri je acetyl nebo β-sukcinyoxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde Rj je acetyl.

ve sloučenině vzorce 5:

R je vodík nebo nižší alkyl, nižší alkenyl nebo nižší alkynyl,

R] je β-formyl, methylen, β-hydroxymethyl, methoxymethyl nebo β-kyan a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery a 3,20-diestery.

ve sloučeninách vzorce 6:

R je vodík nebo nižší alkyl, nižší alkenyl nebo nižší alkynyl,

Ri je význam uvedený pro vzorce 3 a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 21-estery, 3,20-diestery a 3,21-diestery.

Výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 6, kde R je nižší alkenyl, nižší alkynyl nebo trifluormethyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Rje nižší alkinyl a trifluormethyl.

Jinou výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 6, kde Ri je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Rl je acetyl nebo β-sukcinyloxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, jde Ri je acetyl.

Další výhodné sloučeniny jsou sloučeniny vzorců 1 až 6, které jsou estery hydroxylových skupin v polohách 3 a/nebo 20. Výhodné estery jsou estery vytvořené z odpovídajících kyselin: kyseliny octové, propionové, maleinové, filmařové, askorbové, pimelové, jantarové, glutarové, bismethylensalicylové, methansulfonové, ethandisulfonové, šťavelové, vinné, salicylové, citrónové, glukonové, itakonové, glykolové, p-aminobenzoové, esteragové, glycinu a dalších a-aminokyselin, kyseliny fosforečné, sírové, glukuronové a l-methyl-l,4-dihydronikotinové.

Další ještě výhodnější skupina sloučenin zahrnuje sloučeniny vzorců 1 až 6, kde 3β substituentem je ethynyl nebo trifluormethyl a v poloze 17 steroidů je navázána jedna ze skupin β-acetyl, β-fr-hydroxyethyl) nebo 17(20)(Z)-en.

Výraz „alkyl“ se vztahuje na nasycené alifatické skupiny zahrnující skupiny s přímým řetězem, rozvětveným řetězem a cyklické skupiny, které mohou být všechny popřípadě substituovány. Vhodné alkylové skupiny zahrnují methyl, ethyl apod. a mohou být popřípadě substituovány.

-7CZ 292881 B6

Výraz „alkenyl“ se vztahuje na nenasycené skupiny, které obsahují alespoň jednu dvojnou vazbu uhlík—uhlík, a zahrnuje skupiny s přímým řetězem, rozvětveným řetězcem a cyklické skupiny, které mohou být všechny popřípadě substituovány.

Výraz „alkynyl“ se vztahuje na nenasycené uhlovodíkové skupiny, které obsahují alespoň jednu trojnou vazbu uhlík-uhlík, a zahrnuje skupiny s přímým řetězcem, rozvětveným řetězcem a cyklické skupiny, které mohou všechny popřípadě obsahovat další nenasycení. Je-li alkynylová skupina přítomna v poloze 3β, může být substituována halogenovaným nebo nehalogenovaným C] radikálem, C₂-C₆ nenasycený nebo nenasyceným halogenovaným nebo nehalogenovaným radikálem s přímým řetězce, C₃-C₆ cyklickým (cykloalkylovým) radikálem nebo C5-C6 aromatickým radikálem nebo 4, 5 nebo óčlenným C- nebo N-vázaným heterocyklickým radikálem obsahujícím 1, 2 nebo 3 heteroatomy vybrané ze skupiny zahrnující kyslík, dusík a siru s vyloučením heterocyklických radikálů se dvěma nebo více sousedícími atomy O nebo S. Výhodné alkynylové skupiny mají dva až čtyři uhlíkové atomy.

Výraz „alkoxy“ označuje ether -OR, kde R je alkyl.

Výraz „aryloxy“ označuje ether-OR, kde R je aryl.

Výraz „aryl“ se vztahuje na aromatické skupiny, které mají alespoň jeden kruh s konjugovaným systémem π elektronů, a zahrnuje karbocyklický aryl a biaryl, které mohou být popřípadě substituovány.

Výraz „karbocyklický aryl“ se vztahuje na skupiny, kde kruhové atomy na aromatickém kruhu jsou uhlíkové. Karbocyklické arylové skupiny zahrnují fenyl a naftyl, popřípadě substituované. Substituovaný fenyl má přednostně jeden až tri substituenty, kterými jsou výhodně nižší alkyl, amino, hydroxy, nižší alkoxy, halogen, nižší acyl a nitro.

Výraz „aralkyl“ se vztahuje na alkylovou skupinu substituovanou arylovou skupinou. Vhodné aralkylové skupiny zahrnují benzyl apod. a mohou být popřípadě substituovány.

Výraz „dialkylamino“ se vztahuje na skupinu -NRR“, kde R a R nezávisle představují nižší alkylové skupiny nebo společně tvoří zbytek morfolinoskupiny. Vhodné dialkylaminoskupiny zahrnují dimethylamino, diethylamino a morfolino.

Výraz „acyl“ se vztahuje na alkanoylovou skupinu -C(O)R, kde R je alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl nebo aralkyl.

Výraz „popřípadě substituovaný“ nebo „substituovaný“ se vztahuje na skupiny substituované jedním až třemi substituenty, nezávisle vybranými ze skupiny zahrnující nižší alkyl, aryl, alkenyl, alkinyl, alkoxy, amino, thio, halo, haloalkyl, trihaloalkyl, acyl, nitro, hydroxy a keto.

Výraz „nižší“ se zde uvádí v souvislosti s organickými radikály s jedním až čtyřmi uhlíkovými atomy. Může se jednat o skupiny s přímým řetězcem, rozvětveným řetězcem nebo cyklické.

Výraz „farmaceuticky přijatelné estery nebo soli“ se vztahuje na estery nebo soli vzorců 1 až 6, odvozené z kombinace sloučeniny podle vynálezu a organické nebo anorganické kyseliny.

-8CZ 292881 B6

Předmětem vynálezu je sloučenina, vybraná ze skupiny zahrnující:

a-hydroxy-3 β-(3 '-methy lbut-3 '-en-1 -yny l)-5 p-pregnan-20-on, 3a-hydroxy-3P~(3'-methylbut-3'-en-l'-ynyl)-5a-pregnan-20-on, a-hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 a-pregnan-20-on,

3a-hydroxy-3 (3-trifluormethyl-5 β-pregn-l l-en-20-on, p-(cyklopropyl)ethynyl-3a-hydroxy-5 f)-pregnan-20-on, a,20a-dihydroxy-3 β-ethyny 1-5 a-pregnan,

3a,2 l-dihydroxy-3p-ethenyl-5a-pregnan-20-on a

3a,21-dihydroxy-33-fluormethyl-5a-pregnan-20-on nebo jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 21-esteiy, 3,20-diestery nebo 3,21-diestery.

Vynález zahrnuje rovněž farmaceuticky přijatelné estery a soli uvedených sloučenin včetně adičních solí s kyselinami. Má se za to, že 3a-hydroxyl může být maskován jako farmaceuticky přijatelný ester proto, že ester se odštěpuje při přeměně prekurzoru na léčivo. V tomto případě se zde označují jako odštěpitelné estery.

Zvlášť výhodné jsou také tyto sloučeniny spadající do rozsahu vynálezu.

sodná sůl 3 a,21 -dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-19-nor-5 β-pregnan-20-on-21 -hemisukcinátu,

3a,20a-dihydroxy-21-methyl-5a-pregnanbishemisukcinát, a,21 -dihydroxy-3 β-etheny 1-5 a-pregnan-20-on-21 -hemisukcinát,

3a,2 l-dihydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-20-on-21-acetát, sodná sůl 3a,2l-dihydroxy-3β-trifluormethy 1-5β-pregnan-20-on-21-hemifumarátu,

3a,2 l-dihydroxy-3 β-ΐπΑυοιηβί1^1-5 β-pregnan-20-on-methyl-21-sukcinát, 3α-21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on-21-propionát, bis(3a,21 -dihydroxy-3 β-ίΓΪΑυοπηβ^Ι-δ β-pregnan-20-on)-21-hemisukcinát, bis(3a,2 l-dihydroxy-3 β-ethynyl-5 β-pregnan-20-on)-21-hemisukcinát a N-(3α-hydroxy-3β-methyl-5α-pregnan-20-ylidin)ethanolamin.

Příklady provedení vynálezu

Následující syntetické metody a příklady jsou zaměřeny na přípravu sloučenin, tvořících součást vynálezu.

Syntetické metody

Sloučeniny podle vynálezu je možno připravovat jakoukoli vhodnou metodou, například pomocí běžných metod, jaké jsou popsány v„Steroid Reactions“, Djerassi, publikováno 1963 Holden-Day, lne., San Francisco, on „Organic Reaction in Steroid Chemistry“, Fried and Edward, publikováno 1972 Van Nostrand-Reinhold Co., New York.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být připravovány jakoukoli vhodnou známou nebo v budoucnu vyvinutou metodou.

-9CZ 292881 B6

Obecné metody

20- Hydroxypregnany byly připravovány redukcí 20-ketopregnanů běžnými redukčními činidly.

21- Hemisukcináty byly připravovány z pregnan-20-onových derivátů, které byly nejprve brómovány molekulárním bromem na odpovídající 21-brompregnany. Brómované sloučeniny pak byly podrobovány reakci s různými diovými kyselinami, jako je kyselina jantarová, v přítomnosti aminu za vzniku 21-hydroxyesterů. Vzniklé estery diových kyselin pak byly převáděny na sodné soli běžnými metodami.

Estery je možno vytvářet reakcemi, v oboru známými, mezi hydroxylovou skupinou na výše popsaných sloučeninách a organickou kyselinou, halogenidem kyseliny, anhydridem nebo esterem, kde organickou kyselinou je například kyselina octová, propionová, maleinová, fumarová, askorbová, pimelová, jantarová, glutarová, bismethylensalicylová, methansulfonová, ethandisulfonová, šťavelová, vinná, salicylová, citrónová, glukonová, itakonová, glykolová, p-ainobenzoová, asparagová, glutamová, γ-aminomáselná, a-(2-hydroxyethylamino)-propionová, glycin a další α-aminokyseliny, kyselina fosforečná, sírová, glukorová a l-methyl-1,4dihydronikotinová.

3p-Substituenty

Halomethyl β-Monohalomethylsloučeniny podle vynálezu je možno připravovat reakcí 3-spiro-2’oxiranového steroidu se zdrojem halogenidových iontů v inertním rozpouštědle, například s tetramethylamoniumhalogenidem v toluenu, a přednostně v přítomnosti zdroje protonů, jako je kyselina octová.

Nasycený nebo nenasycený alkyl

Další 3-substituované steroidy je možno připravovat přídavkem organokovového činidla k 3-ketosteroidu, v němž mohou být ostatní reaktivní funkční skupiny podle potřeby chráněny. 3-alkynylsloučeniny je tedy možno připravovat s použitím acetylidu lithného v inertních rozpouštědlech nebo s přípravou tohoto činidla in šitu z 1,2-dibromethylenu a butyllithia jako organokovové sloučeniny. Podobně sloučeniny vzorce 1, kde R je alkenylová skupina, je možno připravovat reakcí 3-ketosteroidu s vinylorganokovovou sloučeninou, jako je vinylmagneziumbromid. Pro přípravu sloučenin obsahujících 3-alkenylovou skupinu je možno rovněž používat sloučeniny, v nichž je z místa reakce odstraněno nenasycení, jako je allylmagneziumbromid. Podobně použití alkylovaného grignardova činidla, jako je methylmagneziumjodid, vede k 3-alkylsloučeninám.

Trifluromethyl

Trifluormethylová skupina může být připravena reakcí 3-ketosteroidu s trimethyltrifluormethylsilanem, katalyzovanou fluoridovými ionty.

21-Oxidované sloučeniny

Oxidace 21-methylu tetraacetátem olova

Různé sloučeniny tohoto typu je možno připravovat sledem reakcí, při nichž se pregnan-20-on oxiduje tetraacetátem olova na 21-acetoxyderivát, acetát se hydrolyzuje na 21-alkohol a ten se acyluje vhodným derivátem hydroxylové kyseliny, jako je anhydrid nebo chlorid, nebo jiným činidlem schopným nahradit vodík v hydroxylové skupině, jako je methansulfonylchlorid.

-10CZ 292881 B6

Pregnan-17-eny

Mohou být vytvořeny reakcí 17-ketosteroidu s Wittigovým činidlem, jako je ylid vzniklý reakcí n-propyltrifenylfosfoniumbromidu se silnou bází, jako je terc.butoxid draselný.

3,20-Dioly

Pregnan-3,20-diol může být vytvořen adicí hydridu boru, jako je diboran, na dvojnou vazbu pregnan-17-enu s následnou oxidací takto vzniklého organoboranu například alkalickým peroxidem vodíku na 20-ol. Alternativně je možno pregnan-3,20-dioly vytvářet redukcí 20-onové skupiny na 20-olovou skupiny. Vhodnými činidly jsou hydridové sloučeniny, jako je borohydrid sodný, nebo rozpouštění kovů, jako je sodík, v n-propanolu apod.

Příklad 1

a) 20-Ketal 3a-hydroxy-5p-pregnan-20-onu

Směs 3ct-hydroxy-5p-pregnan-20-onu (10,8 g, 34 mmol), ethylenglykolu (45 ml) a triethylorthoformiátu (30 ml) byla míchána 5 min při teplotě místnosti. Pak byla přidána kyselina p-toluensulfonová (200 mg) a v míchání při teplotě místnosti se pokračovalo 1,5 h. Vzniklá hustá pasta byla vlita do nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (250 ml). Vysrážená pevná látka byla oddělena filtrací, důkladně promyta studenou vodou a vysušena. Polovysušený produkt byl rozpuštěn v dichlormethanu (350 ml) a sušen nad bezvodým uhličitanem draselným. Roztok ketalu pak byl přefiltrován a použit jako takový v příštím stupni.

b) 20-Ketal 5p-pregnan-3,20-dionu

Výše uvedený roztok 20-ketalu 3a-hydroxy-5|3-pregnan-20-onu v dichlormethanu byl po dobu 15 min míchán pod dusíkem s N-methylmorfolin-N-oxidem (8,8 g, 75 mmol) a práškovými molekulárními síty 4A (58 g). Pak byl přidán tetrapropylamoniumperruthenát (400 mg) a v míchání při teplotě místnosti se pokračovalo 2 h. Vzniklá tmavě zelená směs byla podrobena průchodu krátkým sloupcem Florisilu a eluována dichlormethanem. Frakce obsahující produkt (TLF) byly spojeny a odpařeny. Surový produkt pak byl překrystalován ze směsi EtOAc:hex (1:1) na titulní sloučeninu (10,3 g) ve formě dlouhých tyčinek.

c) Příprava lithného činidla z 1,2-dibromethylenu

Do lOOml tříhrdlé baňky, opatřené probubláváním, plynného dusíku, teploměrem a kapací nálevkou, byl předložen, 1,2-dibromethylen (směs cis/trans, 98 %, Andrich, 0,164 ml, 2 mmol, mw = 168, d = 2,246). Byl přidán suchý tetrahydrofuran (15 ml) a roztok byl na lázni suchý led-aceton vychlazen na -78 °C. V průběhu 10 minut bylo po kapkách přidáváno n-butyllithium (2,5 M, v THF, 1,6 ml, 4 mmol). Směs byla míchána při stejné teplotě 1 h a vzniklé činidlo bylo bezprostředně použito pro další stupeň.

d) 3 P-Ethynyl-3 a-hydroxy-5 |3-pregnan-20-on

K výše uvedenému roztoku činidla v tetrahydrofuranu, který byl udržován na -78 °C, byl po kapkách přidáván roztok 20-ketalu 5p-pregnan-3,20-dionu (180 mg, 0,5 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml). Během přídavku byla teplota udržována pod 70 °C. V míchání při této teplotě se pokračovalo 15 min (100% konverze, detekováno TLC). Chladicí lázeň byla odstraněna a ke vzniklému roztoku byla přidána 2N kyseliny chlorovodíkové (pH 6). Bylo odstraněno rozpouštědlo a zbytek byl rozpuštěn v acetonu (10 ml). Po přídavku 2N kyseliny chlorovodíkové (4 ml) byl roztok míchán 0,5 h při teplotě místnosti. Směs byla neutralizována zředěným

-11 CZ 292881 B6 roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vysrážená pevná látka (158 mg, 93%) byla získána filtrací, promyta vodou a vysušena. Surový produkt byl pak čištěn krystalizaci z ethylacetátu nebo ze směsi aceton-hexan a byla získána titulní sloučenina, t.t. 196 až 197 °C, TLC-Rf 0,45 (hexanzaceton 7:3).

Příklad 2

Dinatriumbis(hemisukcinát) 3a,20(3-dihydroxy-5p-pregnanu

K suspenzi 3a,20|3-dihydroxy-5P-pregnanu (Steraloids; 250 mg, 0,78 mmol) v 5 ml suchého pyridinu byl přidán sukcinanhydrid (200 mg, 2,0 mmol). Směs byla zahřívána celkem 10 h na 100 °C. Během zahřívání směsi bylo ve třech částech přidáno dalších 6 mmol suldinanhydridu. Tmavá směs byla zkoncentrována (0,05 mm Hg, 30 °C) k odstranění rozpouštědla a pak zahřívána na 90 °C (0,05 mm Hg) k odstranění přebytku sukcinanhydridu. Zbytek byl překrystalován ze směsi ether/hexan a získaná pevná látka byla tvořena hlavně kyselinou jantarobou. Matečný louh byl zkoncentrován a podroben sloupcové chromatografii (rychlý silikagel, eluce 95/5/0,1 CH2C12/MeOH/HOAc); získaná bílá pevná látka byla překrystalována ze směsi ether/hexan. Bis(hemisukcinát), t.t. 81 až 90 °C, byl dále převeden na disodnou sůl.

Bis(hemisukcinát) (100 mg, 0,192 mmol) byl rozpuštěn v minimálním objemu methanolu. Po kapkách byl přidán roztok hydrogenuhličitanu sodného (2 ekv., 33 mg„ 0,393 mmol) v 6 ml vody. Po 3 h byl roztok vakuově zahuštěn a poskytl bílou pevnou látku.

Příklad 3

3a-Hydroxy-3p-trifluormethyl-5a-pregnan-20-on a 3^-hydroxy-3a-trifluormethyl-5apregnan-20-on

K roztoku 5a-pregnan-3,20-dion-20-ethylenketalu (356 mg, 0,987 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (5 ml) byl přidán 0,5M F3CSi(CH3)3 (v THF; 2,5 ml, 1,25 mmol). Vzniklý bezbarvý roztok byl ochlazen na 0 °C a byl přidán n-Bu4NF.xH2O (několik kiystalů). Chladicí lázeň byla odstraněna. Byl pozorován vývin plynu (Me3SiF) a reakční roztok zežloutl. Směs byla míchána 30 min při teplotě místnosti. TLC (3:1 hexan/aceton) ukázala úplné spotřebování výchozí látky; nové skvrna se pohybovala téměř s čelem rozpouštědla. Pak byla přidána 1N kyselina chlorovodíková (cca 3 ml) a vzniklá dvoufázová směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Nyní TLC (3:1 hexan/aceton) ukázal jedinou skvrnu sRf cca 0,5. Naproti tomu při použití dichlormethanu se objevily dvě blízké skvrny, z nichž homí patřila vedlejšímu produktu. Byl přidán ether a voda. Vodná vrstva byla extrahována zpět etherem. Spojený organický podíl byl promyt nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysušen (síran hořečnatý), přefiltrován a odpařen za sníženého tlaku byla získána bílá krystalická (pěnivá) pevná látka, která byla podrobena rychlé chromatografii s elucí dichlormethanem.

Odpařením dřívějších frakcí byl získán 3a-hydroxy-3|3-triflourmethyl-5a-pregnan-20-on (10 mg).

Další elucí kolony byl získán 3(3-hydroxy-3a-trifluromethyl-5a-pregnan-20-on (200 mg), který na základě 19F NMR a gC-MS také obsahoval 1,5 % vedlejšího produktu (tj. 3a-hydroxy3p-trifluromethyl-5a-pregnan-20-onu). Za účelem odstranění této nečistoty byl učiněn pokus o překrystalování z horké směsi hexan/ethylacetát 60:40; krystaly se nevytvořily. Nakonec bylo možno získat vysoce čistý 3(3-hydroxy-3a-trifluormethyl-5a-pregnan-20-on (145 mg) opětným podrobením výše uvedené směsi 97,5:1,5 lychlé chromatografii s dichlormethanem, t.t. 181 až 183 °C.

-12CZ 292881 B6

Příklad 4 p-Hydroxy-3a-ethenyl-5|3-pregnan-20-on a 3a-hydroxy-3 |3-ethenyl-5 [3-pregnan-20-on

K roztoku 20-ketalu 5p-pregnan-3,20-dionu (1,18 kg, 3,3 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (20 ml) byl při -70 °C přidán vinylmagneziumbromid (1M v THF, 3,7 mmol, 3,7 ml). Po 5 min míchání směsi při této teplotě a 2,5 h při teplotě místnosti byl přidán nasycený roztok chloridu amonného (10 ml). Po odpaření rozpouštědla byl zbytek extrahován ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok přefiltrován a odpařen byl získán surový produkt (1,2 g). Tento surový produkt byl rozpuštěn v acetonu (20 ml). Po přídavku ln kyseliny chlorovodíkové (10 ml) byl roztok míchán 15 h při teplotě místnosti. Po odstranění rozpouštědel byl zbytek extrahován dichlormethanem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok přefiltrován a odpařením se získal surový produkt (890 mg). Tento surový produkt byl pak rozpuštěn v malém množství dichlormethanu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsi toluen:aceton (94:6) byl získán 3a-ethenyl-3p-hydroxy-5p-pregnan-20on (126 mg) jako první frakce. Další elucí stejnou směsí rozpouštědel byl získán 3(3-ethenyl-3ahydroxy-5[3-pregnan-20-on (189 mg), t.t. 113-116 °C.

Příklad 5

a) 3a-hydroxy-5a-androstan-17-on

K roztoku 3p-hydroxy-5a-androstan-17-onu (6 g) a diethylazodikarboxylátu (5,04 g) v tetrahydrofuranu (50 ml) byla přidána kyselina trifluoroctová (3,3 g) a směs zežloutla. Pak byl přidán trifenylfosfín (7,6 g). Reakční směs se odbarvila za vývinu tepla. Po 5 min byl přidán benzoát sodný a pak voda (100 ml). Směs byla extrahována methylenchloridem (3 x 80 ml) a organický podíl byl vysušen nad síranem hořečnatým. Po odstranění rozpouštědla ve vakuu byl surový produkt po dobu 1 h hydrolyzován hydroxidem draselným (10%, 10 ml) v methanolu (150 ml). Pak byla většina methanolu odstraněna ve vakuu a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid a chlorid amonný. Produkt (4,7 g, 78%) byl přečištěn chromatografií (methylenchlorid: aceton 9:1).

b) 3a-Hydroxy-2 l-methyl-5a-pregn-l 7(20)(Z)-en

3a-Hydroxy-5a-androstan-17-on (2 g, 6,9 mmol) byl přidán kWittigovu činidlu, získanému z propyltrifenylfosfiumbromidu (13,3 g) a terc-butoxidu draselného (3,9 g) v tetrahydrofuranu (20 ml). Reakční směs byla 12 h refluoxována a ochlazena na 25 °C. Pak byl přidán roztok chloridu amonného (60 ml) a organická vrstva byla oddělena dělicí nálevkou. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem (2 x 50 ml). Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Surový produkt byl přečištěn chromatografií (aceton:methylenchlorid:hexan 1:2:7a bylo získáno 0,84 g produktu (39 %). Jednalo se o směs izomerů Z a E (Z:E = 13:1).

c) 3a-Terc.butyldimethylsiloxy-2 l-methyl-5a-pregn-l 7(20)(Z)-en

Směs 5a-3a-hydroxy-21-methylpregn-17(20)(Z)-enu (0,84 g 2,66 mmol), TBDMSC1 (1,2 g, 8,0 mmol) a imidazolu (0,91 g, 13,3 mmol) v methylenchloridu (10 ml) a dimethylformamidu (30 ml) byla míchána 12 h a pak byl přidán chlorid amonný. Byla provedena extrakce methylenchloridem (3 x 40 ml) a promytím solankou (50 ml). Organický roztok byl vysušen nad uhličitanem draselným a po odstranění rozpouštědla bylo zjištěno, že je přítomno ještě určité množství dimethylformamidu. Zbytek byl proto rozpuštěn v etheru a promyt solankou

-13CZ 292881 Β6 (2 χ 50 ml) a sušen nad uhličitanem draselným. Chromatografii s hexanem bylo získáno 1,14 g čistého produktu (100 %).

d) 3a-Terc.butyldimethylsiloxy-20a-hydroxy-2 l-methyl-5a-pregnan

K roztoku 3a-terc-butyldimethylsiloxy-21-methyl-5a-pregn-17(20)(Z)-enu (1,14 g,

2,66 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) byl po kapkách při 0 °C přidán tetrahydrofuranový komplex diboranu (1M roztok v THF, 5,3 ml). Reakční směs byla ponechána ohřát se během 1 h na 25 °C. Pak byl velmi pomalu při 0 °C přidáván roztok hydroxidu sodného (20%, 10 ml) a pak peroxid vodíku (30%, 10 ml). Poté byl přidán vodný chlorid amonný a dělicí nálevkou byla oddělena tetrahydrofuranová vrstva. Vodná vrstva byla extrahována etherem (2 x 40 ml). Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Čistý produkt byl získán sloupcovou chromatografii (0,52 g, 44 %).

e) 3 a,20a-Dihydroxy-21 -methyl-5a-pregnan

Roztok připravený smísením kyseliny fluorovodíkové (48%, 5 ml) a CH3CN (30 ml) byl přidán do baňky obsahující 3a-terc-butyldimethylsiloxy-20a-hydroxy-21-methyl-5a-pregnan (0,52 g) a vznikla bílá sraženina. Reakční směs byla míchána 1 h pak zfiltrována. Bílá pevná látka byla promyta třikrát etherem a poskytla uspokojivé analytické výsledky (0,3 g, 79 %), t.t. 227 až 231 °C.

Příklad 6

3a,21 -Dihydroxy-3 p-trifluormethyl-5 β-l 9-norpregnan-20-on

K roztoku 3a-hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-19-norpregnan-20-onu (300 mg, 0,87 mmol) v toluenu (15 ml) byl přidán methanol (1 ml) a BF3.OEt2 (1,4 ml, 11,3 mmol). Vzniklá směs byla ochlazena na 0°C a byl přidán Pb(OAc)4 (0,54 g, 1,21 mmol). Reakční směs byla za míchání po dobu 45 minut ohřátá na 25 °C, pak byl přidán roztok hydrogenuhličitanu sodného (nas., 30 ml) a směs byla míchána 1 h. Byla nalita do dělicí nálevky obsahující vodu (50 ml) a extrahována etherem (3 x 40 ml). Etherový roztok byl promyt solankou (50 ml) a pak vysušen nad uhličitanem draselným. Surový produkt, získaný odstraněním rozpouštědla, byl rozpuštěn v methanolu (25 ml) a byl přidán roztok uhličitanu draselného (nas., 8 ml). Reakční směs byla míchána 5 h a pak nalita do dělicí nálevky obsahující 50 ml vody. Pak byla extrahována methylenchloridem (3 x 30 ml). Spojený extrakt byl vysušen nad uhličitanem draselným a získaná surová látka poskytla po přečištění chromatografii produkt (160 mg) spolu s 21-methoxy vedlejším produktem (40 mg). Produkt byl dále přečištěn překrystalováním z 10% acetonu v hexanu na 88 mg čistého produktu (28 %) jako bílé pevné látky, t.t. 140 až 142 °C.

Příklad 7

3P-Ethynyl-3a,20a-dihydroxy-5|3-pregnan a3|3-ethynyl-3a,20|3-dihydroxy-5|3-pregnan

K roztoku 3p-ethynyl-3a-hydroxy-53-pregnan-20-onu (0,31 g, 0,91 mmol) v methanolu (20 ml) byl přidán borohydrid sodný (200 mg, 5,3 mmol) a směs byla míchána 1 h při 25 °C. Pak byl přidán roztok chloridu amonného (50 ml) a směs byla extrahována methylenchloridem (3 x 30 ml). Chromatografii (EtOAc:Hex 3:7) byl získán 3|3-ethynyl-3a,20|3-dihydroxy-5|3pregnan (200 mg, 65 %) byl hlavní produkt; t.t. 221 až 223 °C. Vedlejší produkt 3[3-ethynyl3a,20a-dihydroxy-5fl-pregnan byl dále přečištěn další chromatografii (25 až 30% ethylacetát v hexanu, 16 mg, 5 %); t.t. 187-188 °C.

-14CZ 292881 B6

Příklad 8 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethiny 1-5 [3-pregnan-20-on a 3 a-hydroxy-3 β-ethyny 1-21 -methoxy-5 βpregnan-20-on

K roztoku 3a,21-hydroxy-3β-ethinyl-5β-pregnan-20-on-21-acetátu (725 mg, 1,81 mmol) ve 45 ml methanolu o teplotě 0 °C byl přidán 10% vodný roztok uhličitanu draselného (3,75 ml). Po 30 min míchání při teplotě místnosti byla směs ochlazena na 0 °C a byl přidán 2N vodný roztok kyseliny octové (1,8 ml). Reakční směs byla přidána do směsi ethylacetát/voda. Vodná vrstva byla extrahována dvakrát ethylacetátem a spojené organické vrstvy byly extrahovány roztokem solanky, vysušeny (síran sodný) a zkoncentrovány. Přečištěním rychlou chromatografíí (20 cm silikagelu v kloně o průměru 4 cm, eluce 2 1 směsi 20% acetonu a hexanu) bylo získáno 582 mg (90 %) diolu jako bílé pevné látky, t.t. 155,5 až 157 °C.

Při přípravě ve větším měřítku byl izolován 3a,21-diol jako méně polární nečistota, t.t 176-178,5 °C, a bylo zjištěno, že se jedná o 3a-hydroxy-3β-ethyny 1-21-methoxy-5βpregnan-20-on, vzniklý pravděpodobně jako vedlejší produkt při přípravě 21-acetátu.

Příklad 9

3β-Ethenyl-3α-hydroxy-5α-pregnan-20-on a3a-ethenyl-3β-hydroxy-5a-pregnan-20-on

K roztoku 5a-pregnan-3,20-dion-20-ketalu (720 mg, 2 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (20 ml) byl při -78 °C přidán vinylmagneziumbromid (1M vTHF, 4 mmol, 4 ml). Po 5 h míchání směsi při této teplotě byl přidán 2N roztok kyseliny chlorovodíkové (2 ml). Po odstranění rozpouštědla byl zbytek rozpuštěn v acetonu (25 ml). Po přídavku 2N kyseliny chlorovodíkové (10 ml) byl roztok míchán 15 h při teplotě místnosti. Po odstranění rozpouštědel byl zbytek extrahován methylenchloridem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (1 g). Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluemaceton (95:5) byl jako první frakce získán 3β-ethenyl-3α-hydroxy-5αpregnan-20-on (250 mg), t.t. 163 až 165 °C. Další elucí stejnou směsí rozpouštědel byl získán 3α-ethenyl-3β-hydroxy-5α-pregnan-20-on (150 mg).

Příklad 10

3a-Hydroxy-3 β-ίπίΐυοπηείΐιγί-ό β-l 9-norpregnan-20-on

K roztoku 3α-hydroxy-3β-trifluormethyl-5α-19-norpregn-17(20)(Z)-enu (2,6 g, 7,3 mmol) v tetrahydrofuranu (80 ml) byl po kapkách při 25 °C přidán tetrahydrofuranový komplex diboranu (1M roztok vTHF, 22ml). Reakce byla dokončena za 1 h, načež byl velmi pomalu přidáván při 0 °C roztok hydroxidu sodného (20%, 50 ml) a pak peroxid vodíku (30%, 30 ml). Pak byla přidána voda a tetrahydrofuranová vrstva byla oddělena v dělicí nálevce. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem (2 x 40 ml). Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Použitím rychlé kolony (hexan/aceton 1:1) bylo získáno 1,8 g produktu, který byl podroben oxidaci PCC (PCC, 2,1 g, 9,6 mmol; acetát sodný, 0,8 g, 9,6 mmol). Čistý produkt (700 mg, 26 %) byl přečištěn sloupcovou chromatografíí s použitím ethylacetátu a hexanu (15:85) jako eluentu; t.t. 151,5 až 153,0 °C.

-15CZ 292881 B6

Příklad 11

a) 3(R)-Spiro-2'-oxiran-5a-l 7P-hydroxyandrostan

Směs trimethylsulfoxoniumjodidu (6,82 g, 31 mmol) a terc.butoxidu draselného (3,5 g, 31 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) byla 1,5 h zahřívána krefluxu a pak ochlazena na 25 °C. Pak byl přidán 17p-hydroxy-5a-androstan-3-on (3 g, 10,3 mmol) a reakční směs byla míchána 2 h při 25 °C. Pak byla přidána voda a směs byla extrahována etherem (3 x 80 ml). Extrakt byl sušen nad uhličitanem draselným a odstraněním rozpouštědla byly získány 3 g dosti čistého produktu (surový výtěžek 96 %), který byl použit pro další stupeň.

b) 3p-methyl-3a-hydroxy-5a-androstan-l 7-on

K roztoku 3(R)-spiro-2'-oxiran-5a-17p-hydroxyandrostanu (3 g, 9,9 mmol) v tetrahydrofuranu (50 ml) v pod argonem byl přidán lithiumaluminiumhydrid (LAH, 1M roztok vTHF, 10 ml) a směs byla zahřívána 5 min k refluxu a pak ochlazena na 25 °C. Byl přidán roztok chloridu amonného (vod., nas., 70 ml) a směs pak byla extrahována methylenchloridem (3 x 70 ml). Organický roztok byl vysušen nad uhličitanem draselným a pak byl přidán 4-methylmorfolin-Noxid (2,9 g, 25 mmol) a mletá molekulární síta (4A, 10 g). Směs pak byla míchána 20 min, načež byl přidán tetrapropylamoniumperruthenát (200 mg). Reakce byla dokončena za 1,5 h a reakční směs byla přefiltrována přes Florisil, který byl pomyt směsí methylenchloridu a etheru (1:2). Vzniklá látka byla přečištěna chromatografii (30% EtOAc v hexanu) a poskytla produkt (2,5 g, 83 %).

c) 3β,2 l-Dimethyl-3a-hydroxy-5a-pregn-l 7(20)(Z)-en

K Wittigovu činidlu, připravenému mícháním směsi n-propyltrifenylfosfoniumbromidu (2,55 g,

6.6 mmol) v terc.-butoxidu draselného (0,75 g, 6,6 mmol) v tetrahydrofuranu (20 ml) po dobu 30 min, byl přidán 3β-methyl-3α-hydroxy-5α-androstan-17-on (0,5 g, 1,65 mmol) a směs byla zahřívána 18 h k refluxu. K reakční směsi pak byl přidán roztok chloridu amonného a byla provedena extrakce methylenchloridem. Čistý produkt (420 mg, 77 %) byl získán chromatografii (20% EtOAc v hexanu.

d) 3a,20a-Dihydroxy-3 β,2 l-dimethyl-5a-pregnan

K roztoku 3β,21-dimethyl-3α-pregn-17(20)(Z)-enu (0,42 g, 1,27 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) byl po kapkách při 0 °C přidán tetrahydrofuranový komplex diboranu (1M roztok v THF,

2.6 ml). Reakční směs byla ponechána 2 h ohřát se na 25 °C. Pak byl velmi pomalu při 0 °C přidán roztok hydroxidu sodného (2N, 10 ml) a pak peroxid vodíku (30%, 10 ml). Reakční směs byla míchána 1 h při 25 °C. Pak byl přidán vodný chlorid amonný a tetrahydrofuranová vrstva byla oddělena v dělicí nálevce. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem (2 x 40 ml). Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Produkt byl získán sloupcovou chromatografii (0,17 g, 38 %). Dále byl přečištěn rekrystalizací a bylo získáno 110 mg produktu; t.t. 200 až 203 °C.

Příklad 12

3a,2 l-Dihydroxy-3 p-trifluormethyl-5 β-pregnan-20-on

Roztok 3α,21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on-21-acetátu (1,36 g, 3,06 mmol) v methanolu (75 ml) byl ochlazen na 0 °C. Pak byl po kapkách přidán roztok uhličitanu draselného (10% vodný, 6,45 ml, 4,67 mmol). Po 1,5 h míchání při 0 °C byl po kapkách přidán roztok kyseliny octové (2N vodný, 2,5 ml, 5,0 mmol) a směs byla ponechána ohřát se na teplotu

-16CZ 292881 B6 místnosti. Byl přidán ethylacetát, methylenchlorid a voda (vždy 100 ml) a směs byla důkladně promísena. Byla izolována organická fáze, promyta vodnými roztoky hydrogenuhličitanu sodného a chloridu sodného, vysušena nad síranem horečnatým a odpařena ve vakuu. Zbytek byl přečištěn rychlou sloupcovou chromatografii (hexan/EtOAc 3:1) a poskytl bílou pevnou látku (973 mg, 79 %, t.t. 148 až 150 °C.

Příklad 13

3a,2 l-Dihydroxy-3í3-ethynyl-53-pregnan-20-on-21-hemisukcinát sodný

K roztoku 3a,21-dihydroxy-3P_ethynyl-5(3-pregnan-20-onu (535 mgm, 1,49 mmol) ve 2 ml suchého pyridinu byl při 0 °C přidán pevný sukcinanhydrid (1,2 ekv., 180 mg, 1,80 mmol). Po ohřátí na teplotu místnosti byla reakční směs 48 h míchána. Po odstranění rozpouštědla ve vakuu a trituraci zbytku s hexanem (2x10 ml) byla získána gumovitá pevná látka, která byla co nejvíce rozpuštěna v methylenchloridu a vnesena na 13 cm rychlého silikagelu v koloně o průměru 2 cm. Elucí gradientem od 5 % acetonu v methylenchloridu do 100 % acetonu bylo získáno 667 mg požadované kyseliny.

Za účelem odstranění pyridiniových solí byla kyselina rozpuštěna v ethylacetátu a extrahována ledem chlazeným 0,0IN vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové (30 ml). Organická vrstva byla vysušena síranem sodným a zkoncentrována. Zbytek, tj. 633 mg, t.t. 62 až 68 °C, byl rozpuštěn v methanolu a byl přidán vodný roztok 116 mg (0,253 mmol) hydrogenuhličitanu sodného. Po 3,5 h míchání bylo rozpouštědlo odstraněno za sníženého tlaku a zbytek byl triturován se směsí ether/hexan. Získaná světle žlutá pevná látka, hmotnost 616 mg, byla rozpustná ve vodě v množství > 20 mg/ml.

Příklad 14

3p-Fluormethyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on

Směs n-Bu4NF'xH2O (7,873 g) a benzenu (50 ml) byla přes noc refluxována s Dean-Starkovým nástavcem. Směs, která nepředstavovala čirý roztok, pak byla zkoncentrována (normální tlak) na přibližně 10 ml a ponechána vychladnout na teplotu místnosti. Pomocí jehly se dvěma konci byl k tomuto koncentrovanému roztoku přidán roztok ethylenketalu 3(R)-5a-pregnan-3-spiro-2oxiran-20-onu (2,55 g, 6,81 mmol) v suchém benzenu (15 ml + 5 ml pro promytí). Vzniklý roztok byl pomocí krátkocestného destilačního přístroje zkoncentrován na přibližně 10 ml a po dobu 15 min refluxován. Protože bylo velmi obtížné zachytit koncentrovaný reakční roztok na TLC desce, byl přidán suchý benzen (5 ml). TLC (100:1) methylenchlorid/aceton nebo 3:1 hexan/aceton) ukázala kromě dvou nových méně polárních skvrn určité množství nezreagované výchozí látky. Reakční směs byla opět zkoncentrována a pak 30 min refluoxována; TLC (po zředění směsi benzenem) nyní ukázala téměř úplné spotřebování výchozího epoxidu. Směs byla stejně jako předtím zkoncentrována a krátkou dobu refluoxována. Zde je nutno upozornit, že tato reakce probíhá pouze, je-li směs vysoce koncentrovaná. Poté, co směs zaujala teplotu místnosti (za vzniku světle žluté pevné látky), byl přidán ether a voda. Protože se nerozpustil veškerý pevný podíl, byl přidán methylenchlorid. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem. Spojené organické extrakty byly promyty vodou (x 2), vysušeny (síran sodný), přefiltrovány a odpařeny za sníženého tlaku, čímž byla získána bílá pevná látka (3,33 g), jejíž 1HNMR ukázala, že se jedná o směs 4:1 ethylenketalu 3P-fluormethyl-3a-hydroxy-5apregnan-20-onu a ethylenketalu 3a-fluor-3(3-hydroxymethyl-5a-pregnan-20-onu.

Za účelem analýzy ketalu byl k výše uvedené pevné látce přidán aceton (100 ml), voda (5 ml) a p-TsOH.H2O (143 mg, 0,572 mmol). Přídavkem kyseliny chlorovodíkové bylo pH upraveno

- 17CZ 292881 B6 na mírně kyselou hodnotu. Směs byla po krátkou dobu zahřívána teplometem po vyčeření roztoku, který pak byl zahříván 2 h při teplotě místnosti. Roztok se zakalil, a proto byl pro vyčeření přidán methylenchlorid. TLC ukázala dokončení reakce. Odpařením rozpouštědla za sníženého tlaku byla získána bílá pevná látka, ke které yl přidán methylenchlorid a voda. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem. Spojený organický podíl byl promyt nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušen (síran hořečnatý), zfiltrován a odpařen za sníženého tlaku na bílou krystalickou látku (2,5 g), jejíž 1H NMR ukázalo, že se jedná o směs 4:1 3a-fluormethyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu a 3a-fluor-3[3-hydroxymethyl-5apregnan-20-onu. Rychlou sloupcovou chromatografií této směsi s methylenchloridem jako eluentem byl získán požadovaný 3(3-fluormethyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on (1,41 g, 59%), t.t. 201 až 203 °C.

Příklad 15

3p-Ethynyl-3a,20a-dihydroxy-5a-pregnan a 3p-ethynyl-3-,20p-dihydroxy-5a-pregnan

K roztoku 3|3-ethynyl-5a-pregnan-20-onu (0,32 g, (0,94 mmol) v methanolu (20 ml) byl přidán borohydrid sodný (200 mg, 5,3 mmol) a směs byla 1 h míchána při 25 °C. Poté byl přidán roztok chloridu amonného (50 ml) a směs byla extrahována methylenchloridem (3 x 30 ml). Chromatografií (EtOAc:Hex 3:7) byl získán 3[3-ethinyl-3a,20p-dihydroxy-5a-pregnan (192 mg, 60%) jako hlavní produkt, t.t. 195,5-197,5 °C, a 3[3-ethynyl-3a,20a-dihydroxy-5a-pregnan jako vedlejší produkt (19 mg, 6 %), t.t. 210 až 215 °C (rozkl.).

Příklad 16

Bis-hemisukcinát 3a,20a-dihydroxy-2 l-methyl-5a-pregnanu

Do suché baňky obsahující 3a,20a-dihydroxy-21-methyl-5a-pregnan (350 mg, 1,05 mmol) byl přidán pyridin (bezvodý, 5 ml) a pak sukcinanhydrid (1 g, 10 mmol). Směs byla zahřívána 20 h na olejové lázni o teplotě 100 °C a pak ochlazena na 25 °C. Byla smísena s roztokem kyseliny chlorovodíkové (IN, 70 ml) a extrahována ethylacetátem (3 x 40 ml) a extrakty byly sušeny nad síranem sodným. Produkt (0,54 g) byl získán chromatografií (7 % MeOH a 0,3 % HOAc vCH2C12) a dále čištěn překrystalováním zEtOAc na 334 mg produktu (60%), tt. 159 až 162,5 °C.

Příklad 17

a) 3,3-Ethylendioxy-5p-pregn-17(20)(Z)-en

5p-Ethylendioxyandrostan-17-on (6 g) byl přidán kWittigovu činidlu, připravenému zethyltrifenylfosfoniumbromidu (15 g) a terc.butoxidu draselného (4,5 g) v tetrahydrofuranu (15 ml). Reakční směs byla 2 h refluoxována a pak ochlazena na 25 °C. Poté byl přidán methylenchlorid (80 ml) a roztok chloridu amonného (60 ml) a v dělicí nálevce byla oddělena organická vrstva. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem (2 x 50 ml). Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Většina fosforoxychloridu byla odstraněna promytím hexanem. Získaný produkt (6 g) byl rozpuštěn v acetonu (100 ml) a byla přidána kyselina chlorovodíková (2N, 10 ml). Surový produkt (5,5 g), získaný alkalickým zpracováním a extrakcí methylenchloridem, byl přečištěn chromatografií na 4,5 g produktu (83 %). Čistý stereoizomer byl získán opakovanou krystalizací z hexanu.

-18CZ 292881 Β6

b) 3a-HydiOxy-3|3-trifluromethyl-5P-pregn-l 7(20)(Z)-en

K roztoku 5(3-pregn-17(20)(Z)-en-3-onu (950 mg, 3,17 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) byl při 0 °C přidán trifluormethyltrimethylsilan (0,5M roztoku v THF, 9,5 ml). Roztok postupně hnědl a reakce byla dokončena za 30 min. Poté byla přidána voda (30 ml) a odebrána organická vrstva. Vodná vrstva byla extrahována etherem (3 x 50 ml) a organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným. Čistý produkt (680 mg, 58 %) byl izolován sloupcovou chromatografií s použitím ethylacetátu a hexanu (1:9) jako eluentu.

Příklad 18

a) 3a-Hydroxy-5P~pregn-l l-en-20-on

K roztoku 5p~pregn-l l-en-3,20-dionu (Sigma, 1,5 g, 4,77 mmol) v tetrahydrofuranu (40 ml) byl při -78 °C během 15 min pomalu přidán lithiumtriterc.-butoxyaluminiumhydrid (1M v THF,

5,7 mmol). Reakční směs byla ponechána ohřát se během 12 h na 25 °C. Směs byla rozdělena mezi chlorid amonný a ether a takto získaná surová látka byla přečištěna sloupcovou chromatografií (10 až 20% aceton v hexanu, 1,3 g produktu, 86 %).

b) 3a-Hydroxy-5p-20,20-ethylendioxypregn-l 1-en

Ke směsi 3a-hydroxy-5[3-pregn-l l-en-20-onu (1,3 g), ethylenglykolu (8 ml) a trimethylorthoformiátu (20 ml) byla přidána kyselina p-toluensulfonová (0,1 g) a reakční směs byla míchána 1 h. Obvyklým zpracování (hydrogenuhličitan sodný a ether) s následným odstraněním rozpouštědla byl získán produkt, který byl přečištěn chromatografií (aceton:Hex 1:4, 1,2 g, 81 %).

c) 5β-20,20-Ethylendioxy-5P~pregn-l l-en-3-on

Směs 3a-hydroxy-20,20-ethylendioxy-5P~pregn-ll-enu (1,2 g), acetátu sodného (0,53 g) aPCC (l,4g) byla 1 h míchána při 25 °C a pak přefiltrována přes Florisil a elucí methylenchloridem a etherem (1:2). Čistý produkt byl získán sloupcovou chromatografií (aceton.hexan 1:9, 0,71 g, 60%).

d) 3a-Hydroxy-3p-trifluormethyl-5|3-pregn-l l-en-20-on

K roztoku 5p-20-ethylendioxypregn-l l-en-3-onu (710 mg, 1,98 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) byl přidán trifluormethyltrimethylsilyl (0,5M roztok v THF, 6 ml) a pak při 0 °C tetrabutylamoniumfluorid (20 mg). Roztok postupně hnědl a reakce byla dokončena za 1 h. Byla přidána voda (30 ml) a odebrána organická vrstva. Vodná vrstva byla extrahována etherem (3 x 40 ml) a organický roztok byl vysušen nad uhličitanem draselným. Surový produkt, získaný odstraněním rozpouštědla, byl hydrolyzován kyselinou chlorovodíkovou (2N, 5 ml) v acetonu (40 ml). Čistý produkt (554 mg, 73 %) byl pak izolován sloupcovou chromatografií s použitím ethylacetátu a hexanu (1:5) jako eluentu, t.t. 160 až 162,5 °C.

Příklad 19 a,21 -Dihydroxy-3 β—ethiny 1—5 |3-pregnan-20-on-21 -acetát

K suspenzi 3p-ethinyl-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-onu (1,00 g, 2,92 mmol) ve 35 ml toluenu byly přidány 2 ml methanolu. Vzniklý roztok byl chlazen na lázni led/voda a byl přidán bezvodý BF3-Et2O (Aldrich; 5,8 mí, 5,02 g, 35,4 mmol). V několika částech byl přidán pevný tetraacetát

-19CZ 292881 B6 olova (Aldrich; 1,96 g, 4,42 mmol). Zpočátku se vytvořil světle purpurový roztok, který za stálého míchání při 0 °C měnil barvu na světle hnědou. Směs se míchala 3 h při teplotě místnosti a pak ochlazena na 0 °C. Chladná reakční směs byla přidána ke směsi 52 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, vody a drceného ledu. Vzniklá směs byla extrahována ethylacetátem (2 x 75 ml). Spojená organická vrstva byla extrahována nasyceným roztokem chloridu sodného, vysušena (síran sodný) a zkoncentrována. Surový produkt byl přečištěn sloupcovou chromatografií (25 cm rychlého silikagelu v koloně o průměru 5 cm s elucí 31 20% aceton/hexan), který poskytl 749 mg (64 %) acetátu, t.t. 196 až 198 °C

Příklad 20 a,21 -Dihydro-3 β-trifluromethy 1-5 [3-pregnan-20-on-21 -acetát

V atmosféře bezvodého argonu byl 3a-hydroxy-3P-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on (1,94 g, 5,02 mmol) rozpuštěn v toluenu (86 ml) a methanolu (5,2 ml). Pomocí injekční stříkačky byl přidán bortrifluoridetherát (10,4 ml, 84,3 mmol). Poté byl přidán tetraacetát olova (2,89 g, 6,51 mmol). Směs byla míchána po dobu 70 min, nalita do vody a extrahována třikrát methylenchloridem. Organické fáze byly spojeny, promyty vodnými roztoky hydrogenuhličitanu sodného a chloridu sodného, vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny ve vakuu na světle žlutou pevnou látku (2,18 g). Tato pevná látka byla přečištěna rychlou sloupcovou chromatografií (CH2C12/EtOAc 150:1 a hexan/EtOAc 4:1) na bílou pevnou látku (1,54 g, 69 %), t.t. 167 až 168,5 °C.

Příklad 21 a-Hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 |3-pregnan-20-on

Odkaz: Krishnamusti, R., Bellew, D.R., Surya Prakash, g.K., J. Org. Chem. 191, 56, 984.

K roztoku 5|3-pregnan-3,20-dion-20-ethylenketalu (60 mg, 0,166 mmol) v suchém tetrahydrofúranu (3 ml) byl přidán 0,5M F3CSi(CH3)3 (v THF; 0,5 ml, 0,25 mmol). Vzniklý bezbarvý roztok byl ochlazen na 0 °C a byl přidán n-Bu4NF.xH2O (několik krystalů). Chladicí lázeň byla odstraněna a směs byla ponechána ohřát se na teplotu místnosti. Na rozdíl od stejné reakce s použitím 5a-pregnan-3,20-dion-20-ethylenketalu výše uvedená reakční směs nezežloutla a rovněž nedošlo k vývinu plynu. TLC (3:1 hexan/aceton) neukázala vznik produktu. Poté byl přidán 0,5 F3CSi(CH3)3 (v THF; 0,5 ml 0,25 mml). Vzniklá směs byla míchána několik minut při teplotě místnosti. TLC ukázala novou skvrnu, která měla hodnotu Rf blízkou 1, ale bylo ještě přítomno určité množství nezreagované výchozí látky. Proto byl přidán ještě 0,5M F3CSi(CH3)3 (v THF; 0,5 ml, 0,25 mmol). Směs byla ještě krátkou dobu míchána při teplotě místnosti. Nevyskytoval se nezreagovaný výchozí keton. Byla přidána IN kyselina chlorovodíková (cca 3 ml) a vzniklá dvoufázová směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Skvrna, která se vytvořila v důsledku trifluormethylace, nyní úplně zmizela a objevily se dvě nové méně polární skvrny, z nichž spodní patří hlavnímu produktu. Směs pak byla zředěna etherem a vodou. Vodná vrstva byla promyta nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysušena (síran hořečnatý), zfiltrována a odpařena za sníženého tlaku na bílou krystalickou (pěnivou) látku. lHa 19F NMR této látky ukazují přítomnost dvou epimerů v poměru 85:15. Rozdělení těchto dvou epimerů bylo provedeno rychlou chromatografií směsí 15:1 hexan/aceton.

Odpařením dřívějších frakcí byl získán vedlejší izomer, který nebyl charakterizován a bylo předpokládáno, že se jedná o 3(3-hydroxy-3a-trifluormethyl-3[3-pregnan-20-on.

-20CZ 292881 B6

Další elucí kolony byl získán 3a-hydroxy-33-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on (50 mg).

Příklad 22

3a-Hydroxy-3|3-trifluormethyl-5|3-19-norpregn-17(20)(z)-en

K roztoku 5f3-19-norpregn-17(20)(Z)-en-3-onu (823 mg, 2,88 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) byl při 0 °C přidán trifluormethyltrimethysilan (0,5M roztok v THF, 8,6 ml). Roztok postupně hnědl a reakce byla dokončena za 30 min. Byla přidána voda (30 ml) a odebrána organická vrstva. Vodná vrstva byla extrahována etherem (3 x 50 ml) a organický roztok byl vysušen nad uhličitanem draselným. Čistý produkt (800 mg, 78 %) byl izolován sloupcovou chromatografií s použitím ethylacetátu a hexanu (1:9) jako eluentu.

Příklad 23

3a,2 l-Hydroxy-3 P~methyl-5a-pregnan-20-on-21-acetát

Roztok 3a-hydroxy-3|3-methyl-5a-pregnan-20-onu (3,00 g, 9,02 mmol) v suchém toluenu (110 ml) a methanolu (6 ml) byl vychlazen na lázni suchý led/aceton na -75 °C. Pomocí injekční stříkačky byl přidán bezvodý BF3-Et2O (Aldrich; 18 ml, 146 mmol) a pak byl po částech přidán pevný tetraacetát olova (4,39 g) 9,90 mmol). Při -75 °C nebyla zjevná žádná reakce a reakční směs byla ponechána ohřát se během 4 h na -10 °C. Během dalších 90 min byla reakční směs ponechána ohřát se na 0 °C. Podle HPLC je hlavní přítomnou látkou výchozí látka. Po 1 h při 0 °C byla reakční směs ochlazena na -15 °C a bylo přidáno dalších 1,94 g tetraacetátu olova a reakční směs byla ponechána ohřát se na 0 °C. Po 30 min poskytla HPLC (difrakční detektor) nekorigovaný poměr produktu a výchozí látky 10:1 a po dalších 45 min byla reakční směs ochlazena na -10 °C a přidána k ledem chlazené směsi 100 ml ethylacetátu, 165 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a drceného ledu. Vodná vrstvy byla promyta pokaždé dvakrát vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po vysušení nad síranem sodným bylo rozpouštědlo odstraněno a zbytek byl překrystalován z ethylacetátu a poskytl 1 g acetátu, kontaminovaného výchozí látkou. Matečný louh byl zkoncentrován ve vakuu a triturován se dvěma 100 ml podíly hexanu. Zbytek z promývání hexanem byl spojen s překiystalovanou látkou a podruhé překrystalován. Vzniklá pevná látka byla kontaminována 2,8 % výchozí látky (podle HPLC). Třetí rekrystalizací bylo získáno 1,087 g (výtěžek 31 %) acetátu, který obsahoval < 2 % výchozí látky.

Příklad 24 a,21 -Dihydroxy-5 (3-pregnan-20-on-21 -dinatriumfosfát

K roztoku 21-brom-3a-hydroxy-5|3-pregnan-20-onu (1,0 g, 2,5 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu byl při teplotě místnosti za míchání přidán dibenzylhydrogenfosfát (2,1 g, 7,55 mmol) a triethylamin (1,085 ml, 7,8 mmol). Reakční směs pak byla 2,5 h zahřívána krefluxu a pak ochlazena na teplotu místnosti. Pak byl přidán dichlormethan (25 ml) a roztok byl přenesen do dělicí nálevky, promyt IN kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušen síranem hořečnatým a zkoncentrován ve vakuu na dibenzylfosfát jako surový olej (943 mg). Olej byl rozpuštěn v ethanolu (50 ml) a bylo přidáno několik kapek kyseliny sírové. Do baňky pak bylo vloženo 400 mg 5 % Pd/C a míchaný roztok byl vystaven tlaku 1 atm. plynného vodíku při teplotě místnosti do dokončení reakce. Katalyzátor byl odfiltrován a roztok zkoncentrován na zbytek. Tento zbytek byl rozpuštěn ve směsi 4:1 methanolivoda (20 ml) a titrován 2N hydroxidem sodným do pH 11. Bylo přidáno dalších 50 ml

-21 CZ 292881 B6 methanolu a po stání po dobu 1 h při 0 °C byl odfiltrován pevný anorganický fosfát. Roztok byl zkoncentrován ve vakuu a zbytek byl promyt horkým toluenem (cca 50 ml) a pak rozpuštěn v minerálním objemu methanolu. K tomuto roztoku byl pomalu přidáván aceton do vysrážení pevné látky. Směs byla odstředěna, rozpouštědlo dekantováno a vlhká pevná látka byla přenesena do lékovky a sušena ve vakuu na titulní sloučeninu ve formě hygroskopické pevné látky.

Příklad 25

3a,2 l-Dihydroxy-3|3-methyl-5a-pregnan-20-on-21-dinatriumfosfát

K roztoku 21-brom-3a-hydroxy-3|3-methyl-5a-pregnan-20-onu (1,0 g, 2,43 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu byl při teplotě místnosti za míchání přidán dibenzylhydrogenfosfát (2,1 g, 7,3 mmol) a triethylamin (1,08 ml, 7,53 mmol). Reakční směs pak byla 4,5 h zahřívána k refluxu a pak ochlazena na teplotu místnosti. Poté byl přidán dichlormethan (25 ml) a roztok byl přenesen do dělicí nálevky, promyt IN kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušen síranem hořečnatým a zkoncentrován ve vakuu na dibenzylfosfát jako surový olej (1,025 g). Dibenzylfosfát (790 mg, 1,3 mmol) byl rozpuštěn ve směsi 2:1. EtOH:THF (30 ml) s několika kapkami kyseliny sírové, bylo přidáno 5% Pd/C (180 mg, 20% hmotn.) a při teplotě místnosti byl aplikován vodík o tlaku 345 kPa (50 psi) do dokončení reakce, detekováno TLC. Katalyzátor byl odfiltrován a filtrát byl zkoncentrován. Zbytek byl rozpuštěn ve směsi 4:1 MeOH:voda (10 ml) a titrován lm hydroxidem sodným do pH 11. K roztoku byl přidáván aceton do vysrážení snadno filtrovatelné látky, načež byla směs ochlazena na 0 °C a zfíltrována za účelem izolace 260 mg surové látky. Tato látka byla rozpuštěna ve 20 ml vody za vzniku zakaleného roztoku, který byl zfiltrován a pak zkoncentrován a poskytl 220 mg titulní sloučeniny jako bílé pevné látky.

Příklad 26

a) 20,20-Ethylendioxy-5a-pregnan-3-on

Titulní sloučenina byla připravena s celkovým výtěžkem asi 90 % z 3(3-hydroxy-5a-pregnan20-onu jako výchozí látky s použitím metody popsané pro 5[3-sloučeniny.

b) 3(3-Ethynyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on-ketal a 3a-ethynyl-3|3-hydroxy-5apregnan-20-on-20-ketal

Do 250ml tříhrdlé baňky, vybavené přívodem plynu, teploměrem a chladičem, byl předložen komplex lithiumacetylid-EDA (2,75 g, 90%, 27,5 mmol). Byl přidán suchý benzen (60 ml) a směsí byla zahřívána na olejové lázni na 50 až 55 °C a po částech byl přidáván 5a-pregnan3,20 dion-20-ketal (9 g, 25 mmol). Směs se míchala při této teplotě ještě 5 h a pak dalších 17 h při teplotě místnosti. Vzniklá suspenze byla ochlazena na 10 °C a byl přidán nasycený roztok chloridu sodného (5 ml). Rozpouštědlo bylo odstraněno a zbytek byl vyjmut do vody. Ve vodě nerozpustný produkt byl získán filtrací, promyt vodou a sušen ve vakuu. Tento surový produkt pak byl překrystalován z ethylacetátu a poskytl 3a-ethynyl-3[3-hydroxy-5a~pregnan-20-on20-ketal (3,55 g). Matečný louh byl odpařen do sucha a zbytek byl přečištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu. Eluci směsi toluen:aceton (92:8) byl získán nezreagovaný výchozí keton (1,3 g) a pak 3P-ethynyI-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on-02-ketal (1,3 g) jako druhá frakce. Další eluci stejnou směsí rozpouštědel byl získán polárnější 3a-ethynyl-3p-hydroxy5a-pregnan-20-on-20-ketal (270 mg).

-22CZ 292881 B6

c) 3 β-Ethyny 1-3 a-hydroxy-5a-pregnan-20-on

3p-Ethynyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on-20-ketal (550 mg) byl rozpuštěn ve směsi acetonu (20 ml) a 2 n kyseliny chlorovodíkové (10 ml) a směs byla míchána 15 h při teplotě místnosti. Rozpouštědla byla odpařena a zbytek byl extrahován methylenchloridem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (414 mg).

Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluen.aceton (92:8) byla získána titulní sloučenina (280 mg), t.t. 175-177 °C.

d) 3a-Ethynyl-3 P-nitrooxy-5a-pregnan-20-on

Roztok 3a-ethynyl-3[3-hydroxy-5a-pregnan-20-on-20-ketalu (2,15 g) v trichlormethanu (45 ml) byl ochlazen na -20 °C a byl přidán acetanhydrid (20 ml). Poté byla přidána dýmavá kyselina dusičná (4 ml) a směs byla při této teplotě míchána 45 min. Po ohřátí na -5 °C byl žlutý roztok nalit do směsi 2N hydroxidu sodného (70 ml) a vody (150 ml) a vznikl roztok o pH 3 až 4. Ten byl pak extrahován trichlormethanem, promyt vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, solankou, vysušen (síran hořečnatý) a odpařením byla získána titulní látka jako viskózní materiál (3 g), který byl použit jako takový pro další stupeň.

e) 3|3-Ethynyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on a 3a-ethynyl-3{3-hydroxy-5a-pregnan-20on

Surový produkt (3 g) z výše uvedeného stupně byl vyjmut do směsi tetrahydrofuranu a vody (30 ml, 1:1) a byl přidán dusičnan stříbrný (516 mg). Po 15 h míchání při teplotě místnosti byla odstraněna rozpouštědla a zbytek byl extrahován methylenchloridem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solanko, po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (2 g). Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluen:aceton (93:7) byl získán 3p-ethynyl-3a-hydroxy-5apregnan-20-on (550 mg) jako první frakce. Další elucí stejnou směsí rozpouštědel byl získán polárnější 3a-ethynyl-3[3-hydroxy-5a-pregnan-20-on (460 mg).

Příklad 27 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 (3-pregnan-20-on-21 -hemisukcinát

V atmosféře bezvodého argonu byl rozpuštěn 3a,21-dihydroxy-33-trifluormethyl-5p-pregnan20-on (920 mg, 2,29 mmol), sukcinanhydrid (457 mg, 4,57 mmol) a dimethylaminopyridin (14 mg) v bezvodém pyridinu. Po 16 h míchání byl přidán další dimethylaminopyridin (7 mg). Po dalších 3 h míchání bylo rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Zbylý pyridin byl odstraněn odpařením z toluenového roztoku. Zbytek byl přečištěn rychlou sloupcovou chromatografií (CH2C112/MeOH; gradient 100:1 až 50:1) a byl získán bílý polopevný zbytek (l,lg). Tato mírně znečištěná látka byla rozpuštěna v methylenchloridu, promyta vodou (3 x 50 ml) a vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a byla získána bílá pevná látka (883 g, 77 %).

-23CZ 292881 B6

Sodná sůl 3a,21-dihydroxy-3(3-trifluormethyl-5P-pregnan-20-on-21-hemisukcinátu

3a,2 l-Dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on-21-hemisukcinát (859 mg,

1,71 mmol) byl rozpuštěn v methanolu (35 ml). Po kapkách byl přidán hydrogenuhličitan sodný (143 mg, 1,70 mmol) ve vodě (10 ml). Byl přidán další methanol (10 ml). Po 2,5 h míchání bylo odpařeno rozpouštědlo. Zbytek byl rozetřen se směsí ether/hexan a pak s hexanem a byla získána bílá pevná látka. Byl přidán a odstraněn methanol. Byl přidán heptan a odstraněn ve vakuu. Zbytek byl rozetřen s hexanem a vysušením ve vakuu byla získána bílá pevná látka (878 mg, 98 %).

Příklad 28 β-Ethyny 1-3 α-hy droxy-5 β-pregn-l 1 -en-20-on

K roztoku cis/trans-dibromethylenu (236 mg, 1,27 mmol) v 5 ml suchého tetrahydrofuranu bylo při -78 °C po kapkách přidáno 1,6M butyllithium v hexanech (1,6 ml, 2,54 mmol) a směs byla míchána po dobu 30 min. Pak byla teplota snížena na -90 °C a pomocí kanyly byl v průběhu 10 minut přidán roztok 5β-pregn-l l-en-3,20-onu v 10 ml tetrahydrofuranu a reakční směs byla míchána dalších 30 min při -90 °C, načež byly přidány 3 ml nasyceného vodného roztoku chloridu amonného a směs míchána do teploty místnosti. Obsah rozpouštědla byl ve vakuu snížen na přibližně 5 ml a pak byla směs rozdělena mezi ethylacetát a vodu (po 25 ml) a organická vrstva byla promyta nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysušena síranem hořečnatým a zkoncentrováním ve vakuu byla získána surová pevná látka. Rychlou chromatografíí na 15,2 cm (6 in) silikagelu v koloně 2 cm se sbíráním frakcí po 10 ml a elucí směsí 95:5 toluen.aceton bylo získáno 142 mg (65,6 %) titulní sloučeniny, t.t. 147 až 150 °C.

Příklad 29 β-Τ rifluormethyl-3a-hydroxy-5a-l 9-norpregnan-20-on

Tato sloučenina byla získána jako vedlejší produkt při přípravě 3α-1^Γθχγ-3β-Ιπί1ηοπηβ11ιγ15β-19-norpregnan-20-onu (viz příklad 10). Je izolována z příslušných chromatografíckých frakcí; t.t. 178 až 179 °C.

Příklad 30 β-( 1 -Heptynyl)-3 a-hydroxy-5 β-pregnan-2 0-on

K roztoku 1-heptinu (0,327 ml, 2,5 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (15 ml) bylo při -78 °C přidáno n-butyllithium (2,5M v THF, 2,5 mmol, 1 ml). Po 1 h míchání při této teplotě byl přidán roztok cyklického 20-(1,2-ethandiylacetalu) 5β-pregnan-3,20-donu (360 mg, 1 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (15 ml) a směs byla 1 h míchána při -78 °C. Byl přidán 2N roztok kyseliny chlorovodíkové (1 ml). Bylo odstraněno rozpouštědlo a zbytek byl pak rozpuštěn v acetonu (10 ml). Po přídavku 2N kyseliny chlorovodíkové (10 ml) byl roztok 1 h míchán při teplotě místnosti. K neutralizaci kyseliny pak byl přidán nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného, byla odstraněna rozpouštědla a zbytek byl extrahován ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (400 mg). Tento surový produkt byl pak rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluen:aceton (93:7) byl získán 3β-(l-heptynyl)-3αhydroxy-3β-pregnan-20-on (260 mg) jako bezbarvá pevná látka; t.t. 121 až 123 °C.

-24CZ 292881 B6

Analogický postup byl použit k přípravě 3|3-(l-hexynyl-3a-hydroxy-5|3-pregnan-20-onu, 3β(1 -oktyny 1)-3 a-hydroxy-5 P-pregnan-20-onu, 3 β-cyklopropylethyny 1-3 a-hydroxy-5 β-pregnan-20-onu, 3[3-(3-methylbut-2-en-l-ynyl)-3a-hydroxy-5|3-pregnan-20-onu a 3β—(3,3— dimethylbutynyl)-3a-hydroxy-5|3-pregnan-20-onu.

Příklad 31

3P-Cyklopropylethynyl-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on

a) Cyklický 20-( 1,2-ethandiylacetal) 3|3-(chlor-l-pentynyl)-3a-hydroxy-5(3-pregnan-2Oonu

K roztoku 5-chlorpentinu (0,5 ml, 4,8 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (15 ml) byl při -60 °C přidáno n-butyllithium (2,4M v THF, 4,8 mmol, 2 ml). Po 0,5 h míchání směsi při -78 °C byl přidán roztok cyklického 20-(1,2-ethandiylacetalu 5|3-pregnan-3,20-dionu (560 mg, 1,56 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) a směs byla míchána 1 h při -78 °C. Chladicí lázeň byla odstraněna a ke směsi byl přidán roztok chloridu amonného (3 ml). Rozpouštědlo bylo odstraněno a zbytek byl extrahován ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solanko. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfíltrován a odpařením byl získán surový produkt (660 mg). Tento surový produkt byl použit jako takový v příštím stupni.

b) 3 β-Cyklopropylethyny 1-3 ahydroxy-5 [3-pregnan-20-on

K roztoku diizopropylaminu (0,4 ml, 3 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (15 ml) bylo při -60 °C přidáno n-butyllithium (2,5M v THF, 3 mmol, 1,2 ml). Po 0,5 h míchání směsi při -78 °C byl přidán roztok cyklického 20-(1,2-ethandiylacetalu) 3[3-(5-chlor-l-pentynyl)-3a-hydroxy-5(3pregnan-20-onu (100 mg, 0,22 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml). Chladicí lázeň byla odstraněna a směs byla míchána 0,5 h při teplotě místnosti. Byl přidán roztok chloridu amonného (3 ml). Rozpouštědlo bylo odstraněno a zbytek pak byl rozpuštěn v acetonu (40 ml). Po přídavku IN kyseliny chlorovodíkové (4 ml) byl roztok míchán 15 minut při teplotě místnosti. Byl přidán nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného k neutralizaci kyseliny. Rozpouštědla byla odstraněna a zbytek byl extrahován ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfíltrován a odpařením byl získán surový produkt (120 mg). Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluen:aceton (95:5) byl získán 3(3-(cyklopropylethinyl)-3a-hydroxy5(3-pregnan-20-on (55 mg) jako bezbarvá pevná látka; tt. 123-138 °C; TLC Rf (hexan:aceton 7:3) 0,29.

Odborníkovi je zřejmé, že výše uvedené sloučeniny se mohou vyskytovat jako směsi diastereomerů, které je možno rozdělit na jednotlivé diastereomery. Štěpení diastereomerů je možno výhodně provádět plynovou nebo kapalinovou chromatografíí nebo izolací z přírodních zdrojů. Není-li zde uvedeno jinak, zahrnují odkazy na sloučeniny podle vynálezu všechny izomery, ať jsou rozdělené nebo jako směsi.

Pokud se izomery dělí, pře vládá požadovaná farmakologická aktivita často u jednoho z diastereomerů. Jak výše uvedeno, tyto sloučeniny vykazují vysoký stupeň stereospecifíty. Největší afinitu vůči komplexu receptorů gABA mají zejména sloučeniny s 3|3-substituovaným3a-pregnanovým steroidním skeletem.

-25CZ 292881 B6

Sloučeniny podle vynálezu, což jsou netoxické, farmaceuticky přijatelné, přírodní a syntetickém přímo působící a prekurzorové formy metabolitů progesteronu, deoxykortikosteronu a androstanu, mají dosud neznámou aktivitu v mozku na komplexu receptorů GABA_a. Vynález těží z objevu tohoto dosud neznámého mechanismu a účinnosti.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu se připravují v běžných lékových formách zabudováním účinné sloučeniny podle vynálezu nebo směsi takových sloučenin uznávanými postupy do netoxického farmaceutického nosiče v netoxickém množství postačujícím k dosažení požadovaného farmakodynamického účinku u zvířecího nebo lidského subjektu. Přednostně přípravek obsahuje účinnou složku v účinném, avšak netoxickém množství, zvoleném mezi asi 1 mg až asi 500 mg účinné složky na jednotku dávky. Toto množství závisí na konkrétní požadované biologické účinnosti a na stavu pacienta. Požadované cíle přípravků a způsobů podle vynálezu jsou léčba stresu, úzkosti, PMS, PND a záchvatů, například epileptických, za účelem zlepšení nebo zamezení návalů úzkosti, svalového napětí a depresí, běžných u pacientů, trpících těmito abnormalitami centrální nervové soustavy. Dalším žádoucím cílem přípravků a způsobů podle vynálezu je léčba nespavosti a vyvolávání hypnotické aktivity. Dalším žádoucím cílem těchto přípravků a způsobů je vyvolávání anestezie, zejména intravenózní aplikací.

Použitý farmaceutický nosič může být například pevný, kapalný nebo s časovaným uvolňováním (viz například Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 14. vyd., 1970). Příklady pevných nosičů jsou laktóza, bílá hlinka, sacharóza, talek, želatina, agar, pektin, arabská guma, stearát hořečnatý, kyselina stearová, mikrokrystalická celulóza, stearát hořečnatý, kyselina stearová, mikrokrystalická celulóza, polymemí hydrogely apod. Typické kapalné nosiče jsou propylenglykol, glykofurol, vodné roztoky cyklodextrinů, sirup, arašídový olej a olivový olej a podobné emulze. Podobně může nosič nebo ředidlo zahrnovat jakoukoli známou časově zpožďující látku, jako je glycerolmonostearát nebo glyceroldistearát samotný nebo s voskem, mikrokapslemi, mikrosférami, liposomy a/nebo hydrogely.

Mohou být používány rozmanité farmaceutické formy. Používá-li se pevný nosič, může být přípravek jednoduše mletý, mikronizovaný, v oleji, tabletovaný, uložený v kapsli z tvrdé želatiny nebo s enterosolventním povlakem ve formě mikronizovaného prášku nebo pelet nebo ve formě pastilek nebo pilulek. Sloučeniny podle vynálezu mohou být rovněž podávány ve formě čípků pro rektální aplikaci. Sloučeniny mohou být zamíchány v materiálu, jako je kakaové máslo a polyethylenglykoly nebo jiný vhodný nedráždivý materiál, který je pevný za teploty místnosti, ale kapalný při teplotě rekta. Používá-li se kapalný nosič, může být preparát ve formě kapaliny, například v vampuli, nebo ve vodné nebo v nevodné suspenzi. Kapalné lékové formy vyžadují rovněž farmaceuticky přijatelné konzervační prostředky apod. Z důvodu nízkých dávek, požadovaných na základě zde uváděných údajů, je vhodnou farmaceutickou formou pro topicko aplikaci také parenterální aplikace, nosní sprej, sublingvální a bukální aplikace a transdermální náplasti s časovaným uvolňováním.

Způsob vyvolání anxiolytické, antikonvulzivní, náladu měnící (například antidepresivní) nebo hypnotické aktivity podle vynálezu spočívá vtom, že se subjektu, vyžadující tomu aktivitu, podává sloučenina podle vynálezu, obvykle ve formě výše uvedeného přípravku s farmaceutickým nosičem, v netoxickém množství dostatečném k vyvolání uvedené aktivity.

Během menses se hladina vylučovaných metabolitů mění přibližně čtyřnásobně (Rosciszewska a d., 1986). Terapie, vedoucí k potlačení příznaků, tedy znamená udržovat pacientku na vyšší hladině metabolitů progesteronu než je normální v premenstruálním stadiu pacientek s PMS. Během premenstruálního a postmentruálního stadia pacientky se monitoruje hladina aktivních a hlavních metabolitů v plasmě. Množství sloučenin podle vynálezu, podávaných buď samostatně, nebo ve směsích, se pak vypočte tak, aby dosahovalo úrovně, která vykazuje aktivitu receptorů gABA rovnou nebo vyšší než hladina metabolitů progesteronu u normálního subjektu během premenstruálního stadia.

-26CZ 292881 B6

Aplikace může být prováděna jakoukoli cestou, účinně transportující účinnou sloučeninu k receptorům GABA_a, které mají být stimulovány. Aplikace může být prováděna parenterálně, enterálně, rektálně, intravaginálně, intradermálně, intramuskulámě, sublingválně nebo nasálně; preferována je orální, intramuskulámí a dermální cesta. Například jedna dávka v transdermální náplasti může pacientce dodávat účinnou složku po dobu až jednoho týdne. Pro epileptický stav je však preferována parenterální cesta.

Účinnost v místě gR

Experimentální data in vitro i in vivo ukazují, že přirozeně se vyskytují metabolity progesteronu a deoxykortikosteronu a jejich deriváty interagují s vysokou afinitou na novém a specifickém rozpoznáváním místě na komplexu gR a usnadňují konduktanci chloridových iontů neuronálními membránami citlivými na gABA (Gee a d., 1987, Harrison a d., 1987).

Odborníkům je známo, že modulace [³⁵S]terc.butylbicyklofosforothionátovo ([³⁵S]TBPS) vazby je mírou účinnosti léčiv působících na komplex gR, která mohou mít potenciální terapeutickou hodnotu při léčbě stresu, úzkosti a záchvatových poruch (Squires, R.F., a d., ,,[³⁵S]t-butylbicyclophosphorothionate binds with high affínity to brein-specific sites coupled to gamma aminobutyric acid-Α and ion recognition site“, Mol. Pharmacol, 23:326, 1983; Lawrence, L.J. a d., „Benzodiazepine anticonvulsant aciton: gamma-aminobutyric aciddependent modulation ofthe chloride ionophore“, Biochem. Biophys. Res. Commun., 123:1130-1137; Wood a d., „In vitro charakterization of benzodiazepine receptor agonists, antagonists, inverse agonists and agonist/antagonists“, Pharmacol. Exp. Ther., 231:572-576 (1984)). Zjistili jsme, že tyto sloučeniny interagují s novým místem na komplexu gR, které se nepřekrývá s barbiturátovým, benzodiazepinovým nebo jiným dříve známým místem. Tyto sloučeniny mají navíc za přízných strukturních požadavků vysokou účinnost na komplexu GR.

Postupy k provádění tohoto testu jsou podrobně popsány v.: gee a d., 1987, (2) gee, K.W., L.J. Lawrence a H.I. Yamamura, Molecular Pharmacology, 30:218 (1986). Tyto postupy byly prováděny následujícím způsobem:

Ze samců krys Sprague-Dawley byly bezprostředně po usmrcení odebrány mozky a mozková kůra byla vyříznuta nad ledem. Byl připraven P₂ homogenizát dříve popsaným způsobem (Gee ac., 1986). Stručně řečeno byla kůra opatrně homogenizována v 0,32M sacharóze a pak odstřeďována 10 min při 1000 x g. Byl odebrán supematant a odstřeďován 20 min při 9000 x g. Získaná peleta P₂ byla suspendována jako 10% (pův. hmotnost za mokra/objem) suspenze v 50 mM Na/K fosfátového pufru (pH 7,4), 200 mm NaCl za vzniku homogenizátu.

Alikvóty homopgenizátu P₂ (0,5 mg proteinu) po 100 μΐ byly inkubovány v 2nM [³⁵S]TBPS (70 až 110 Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, MA) v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaných přirozeně se vyskytujících steroidů nebo jejich syntetických derivátů. Testované sloučeniny byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (Baker Chem. Co., Phillipsbury, NJ) a přidány v alikvotech po 5 μΐ k inkubační směsi. Inkubační směs byla doplněna pufrem na konečný objem 1 ml. Nespecifická vazba byla definována jako vazba v přítomnosti 2mM TBPS. Účinek a specifita gABA (Sigma Chem., Co., St. Louis, MO) byla hodnocena tak, že všechny testy byly prováděny v přítomnosti ABA plus (+ bikukulinu (Sigma Chem. Co.). Inkubace, udržované 90 min na 25 °C (podmínky ustáleného stavu), byly ukončeny rychlou filtrací přes filtr ze skleněných vláken (č. 32, Schleicher a Schuell, Keene, NH). Radioaktivita navázaná na filtr byl kvantifikována kapalnou scintilační spektrofotometru. Kinetická data a křivky závislosti sloučeniny/dávka [³⁵S]TBPS - odpověď byly analyzovány nelineární regresí s použitím komputerizovaných interativních postupů pro získání hodnot rychlostních konstant a IC₅o (koncentrace sloučeniny, při níž dochází k polovině maximální inhibice bazální vazby (³⁵S]TBPS).

-27CZ 292881 B6

Experimentální data, získaná v tomto testu, jsou rovněž publikována v gee a d., 1987. Data, uvedená v této práci, jsou popsána a osvětlena ve zveřejněné přihlášce PCT č. WO 93/03732, zveřejněné 4.3. 1993. Vazebné místo steroidů, identifikované v této práci, je však odlišné od místa gABA/bikukulin. Posun křivek závislosti dávka-odpověď, vyvolaný bikuline, je-li inhibice vazby [³⁵S]TBPS způsobena alfaxalonem, není paralelní. To dokazuje, že místo gABA a místa steroidů se nepřekrývají.

Druhá sada experimentů byla provedena za účelem, demonstrace, že steroidy, barbituráty a benzodiazepiny nesdílejí společné vazebné místo na receptorů GABA. Test byl proveden v souladu s výše zmíněnými postupy. Výsledná kinetická data ukazují, že disociace vazby [³⁵S]TBPS, iniciována saturační koncentrací 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu, je potencována 100 μΜ pentobarbitalem sodným. Tento efekt naznačuje, že 3a-OH-5a-pregnan-20-on (steroid) a pentabarbital (barbiturát) se vážou na nezávislá místa.

Třetí sada experimentů zkoumala interakce mezi 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onem apentabarbitalem sodným při potenciaci vazby (3H) flunitrazepamu (FLU). Tyto experimenty dále podporují tvrzení, že steroidy nesdílejí společné místo působení s benzodiazepony a barbituráty. V této sérii experimentů byl zkoumán vliv měnících se koncentrací 3a-hydroxy-5a-pregnan20-onu na vazbu (³H) FLu v přítomnosti nebo nepřítomnosti maximálně stimulující koncentraci pentabarbitalu sodného. Protože pentobarbital sodný má větší maximální účinnost při potenciaci vazby (³H) FLU nebo 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on, měl by 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on nakonec antagonizovat účinek pentabarbitalu sodného, kdyby oba kompetitivně interagovaly na stejném místě. To však pozorováno nebylo. Data tedy dále podporují náš závěr, že určité steroidy včetně sloučenin podle vynálezu interagují snovým místem nagR komplexu, odlišným od barbiturátového nebo BZ regulačního místa. V důsledku tohoto nezávislého místa působení se předpokládá, že tyto steroidní sloučeniny budou mít terapeutické profily odlišné od barviturátů a BZ.

Byly zkoumány různé sloučeniny pro stanovení jejich potenciálu jako modulátorů vazby [³⁵S]TBPS in vitro. Tyto testy byly prováděny v souladu s výše uvedenými postupy. Na základě těchto testů jsme stanovili požadavky na strukturu a aktivitu pro jejich specifickou interakci na komplexu gR a pořadí jejich účinnosti. V tabulce 1 jsou uvedeny hodnot IC₅₀ a maximální inhibice několika sloučenin včetně příkladů nárokovaných v přihlášce. IC₅o je definována jako koncentrace sloučenin, které inhibují 50 % kontrolní vazby [³⁵S]TBPS. Je ukazatelem účinnosti sloučeniny in vitro. Maximální inhibice je ukazatelem působivosti sloučeniny in vitro.

Tabulka 1

	IC50	Imax
3 |3-cyklopropylethynyl-3a-hydroxy-5 |3-pregnan-20-on	22	94
3a-hydroxy-3P-(3'-methyl-but-3'-en-l'-ynyl)-5P-pregnan-20-on	24	91
3a-hydroxy-3 ^-methyl-5 β-l 9-nor-pregnan-20-on	26	94
3a,20a-dihydroxy-21-ethyl-5a-pregnan	27	13
3 P~(cyklopropyl)ethyny 1-3 a-hydroxy-5 p-pregnan-20-on	32	97
3a,20a-dihydroxy-21-methyl-5a-pregnan	35	28
3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on	37	95
3a-hydroxy-3 P-methyl-5 |3-pregnan-20-on	37	98
3 p-ethynyl-3 a-hydroxy-5 β-ηοΓ-5 |3-pregnan-20-on	39	101
3 β-ethyny 1-3 a-hydroxy-19-nor-5 (3-pregnan-20-on	44	93
3P-(5'-chlorpentyl-l'-yl)-3a-hydroxy-5[3-pregnan-20-on	44	98
3 β-etheny 1-3 a-hydroxy-5 3~pregnan-20—on	46	100
3a-hydroxy-3[3-ethinyl-5a-pregnan-20-on	53	91

-28CZ 292881 B6

Tabulka 1 - pokračován

	ic50	Imax
3 a-hydroxy-3 β-methy 1-5 a-pregnan-20-on	62	97
bis(3a,21-dihydroxy-3 3-ethynyl-5 3-pregnan-20-on)21-hemisukcinát	68	56
3a,2 l-dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21-acetát	75	99
3a,2 l-dihydroxy-5a-pregnan-20-on (5a-THD0C)	76	100
3a-Hydroxy-3p-trifluor-methyl-19-nor-5|3-pregnan-20-on	76	100
3 a-hydroxy-21 -methy 1-5 |3-pregnan-2Q-on	78	100
3 a-hydroxy-3 β—(3 '-methy l-but-3 '-en-1 '-ynyl)-5 a-pregnan-20-on	88	95
3a-hydroxy-3 β,21 -dimethyl-5a-pregnan-20~on	89	85
3 a-hydroxy-3 β-methy 1-5 a-19-nor-pregnan-20-on	91	80
3 a,20a(S)-dihydroxy-5 a-pregnan	99	46
N-(3a-hydroxy-3β-methyl-5a-pregnan-20-ylidin)ethanolamin	101	93
3 β-ethenyl-3 a-hydroxy-5a-pregnan-20-on	113	88
3a-21-dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21-hemisukcinát	117	91
3α-21 -dihydroxy-5 fl-pregnan-20-on-21 -acetát	119	49
3a-20a-dihydroxy-3fl-methyl-5a-pregnan	116	52
3a,20-dihydroxy-20-methyl-5a-pregnan	176	40
3 a,20-d ihydroxy-3 β-ethynyl-S fl-pregnan-20-on-21 -hemisukc inát	179	82
Bis(3α,21-dihydroxy-3β-trίfluormethyl-5β-pregnan-20-on)-21hemisukcinát	189	23
3α-hydroxy-3β-fluor-methyl-5α-pregnan-20-on	200	77
3 a,20a-dihydroxy-3 β-ethynyl-S a-pregnan	202	56
3 a-hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 β-pregn-11 -en-20-on	203	99
3a,21-dihydroxy-3β-methyl-5a-pregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	211	104
3α-hydroxy-3β-trifluor-methyl-5β-pregnan-20-on	211	98
3a,2 l-dihydroxy-3 fl-methyl-5a-pregnan-20-on	216	104
3a,2 l-dihydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-20-on-21-hemisukcinát	241	92
3a-hydroxy-3 β-methyl-Sa-pregn-l l-en-20-on	242	76
3 a-hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 a-pregnan-20-on	244	76
3 a,2 l-dihydroxy-3 β-trifluormethyl-l 9-nor-5β-pregnan-20-on	246	100
3a,21-dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	251	92
3a-hydroxy-3 β-trifluormethyl-l 9-nor-5a-pregnan-20-on	251	40
3a,2 l-dihydroxy-3β-ethynyl-Sβ-pregnan-20-on, 21-acetát	251	101
3 a,2 l-dihydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-20-on	258	96
3a,21-dihydroxy-3β-methyl-5a-pregnan-5a-pregnan-20-on-21- acetát	284	93
3a,21 -dihydroxy-3 P~ethenyl-3 P-ethenyl-5a-pregnan-20-on	288	101
3 a,21 -dihydroxy-3 3-trifluormethyl-5 β-pregnan-20-on	354	102
3 a,2 l-dihydroxy-3 3-trifluormethyl-5 β-pregnan-20-on-21 -acetát	370	88
3a,2 l-dihydroxy-3 β-ethenyl-5a-pregnan-20-on-21 -hemisukcinát	377	89
3a,203-dihydroxy-3 β-methyl-S β-pregnan	455	105
3a,20a-dihydroxy-3 β,2 l-dimethyl-5a-pregnan	508	48
3α,21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-19-nor-5β-pregnan-20-on-21hemisukcinát, sodná	530	101
3a,2 l-dihydroxy-3 β-ethynyl-5β-pregnan-20-on-21-hemifumarát, sodná sůl	546	1202

-29CZ 292881 B6

Tabulka 1 - pokračování

	IC5o	Imax
3a,20a-dihydroxy-3 p-ethynyl-5 β-pregnan	557	98
3a,21 -dihydroxy-3 p-fluor-methyl-5 p-pregnan-20-on	592	101
3a,2 l-dihydroxy-3p-trifluro-methyl-5[3-pregnan-20-on-21-hemisukcinát	648	101
3 a,20 P-dihydroxy-3 β-ethyny 1-5 β-pregnan	688	77
3a,21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	712	99
3α,20β-dihydroxy-3β-ethynyl-5α-pregnan	774	107
3a,21-dihydroxy-3β-trifluor-methyl-5β-pregnan-20-on-methyl-21sukcinát	480	86
3a-hydroxy-3 β-ιηβύψ1,21,21,2 l-trifluor-methyl-5a-pregnan-20-on	915	101
3α,20β-dihydroxy-3β-methyl-5α-pregnan	924	99
3a-hydroxy-3 β-methyl-Sa-pregnan-l 6-en-20-on	955	100
3a-hydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-l 1,20-dion	958	100
21-brom-3a-hydroxy-3β-trifluor-methyl-5β-pregnan-20-on	1530	102
estradiol	>1000	I*
progesteron	>1000	I*
kortikosteron	>1000	I*
cholesterol	>1000	I*

* = inaktivní

Jak je patrné z tabulky 1, sloučeniny podle vynálezu mají nízké hodnoty IC₅₀, což je koncentrace potřebná k dosažení 50 % maximální inhibice vazby [³⁵S]TBPS, zatímco sloučeniny, jako jsou pohlavní steroidy (estradiol a progesteron), glukokortikoidy (kortikosteron) a cholesterol, s vysokými hodnotami IC₅₀, jsou v podstatě neúčinné. Předpokládá se tedy, že hormonální steroidy a cholesterol jako takové nebudou mít žádnou terapeutickou hodnotu pro indikace podle vynálezu. Pro rozlišení od hormonálních steroidů byla tato samostatná skupina steroidů nazvána neuroaktivní steroidy. Pohlavní steroidy, jako je protesteron, však mohou být v organismu metabolizovány na steroidy podobné 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu. Progesteron je tedy možno považovat za prekurzor. Data pro TBPS dobře korelují s údaji pro příjem ³⁶C1 iontů, potencovaný různými 3α-hydroxylovánými steroidy, popsanými vPurdy R.H. a d., J. Med. Chem., 33:1572-1581 (1990), a rovněž s elektrofyziologickými daty získanými měřením aktivity steroidů při potenciaci gABA-indukovaného proudu v oocytu, do něhož byly vpraveny lidské receptory gABA. To naznačuje, že test TBPS představuje přibližné měření schopnosti steroidů allostericky modulovat aktivitu Cl kanálu.

Sloučeniny s částečnou aktivitou

Z hlediska dostupnosti požadované terapeutické účinnosti pro pacienta s co nejméně nežádoucími vedlejšími účinky je podstatným aspektem vynálezu objev agonistů s částečnou aktivitou ve sloučeninách s 5a-pregnan-3a,20a-hydroxylovou, 5[3-pregnan-3a,20[3-hydroxylovou skupinou nebo derivátech a prekurzorech těchto sloučenin. Navíc vykazuje částečnou účinnost v testu TBPS také podmnožina neuroaktivních steroidů jiných než jsou tyto dvě skupiny (tabulka 1). Pro pacienty, kteří si přejí zlepšení úzkosti nebo křečí, je nežádoucí hypnóza. Pro pacienty, kteří se přejí zlepšení nespavosti, je nežádoucí anestezie. Sloučeniny popsané jako agonisté s částečnou aktivitou by mohly poskytovat požadovaný účinek s minimem nežádoucího účinku.

-30CZ 292881 B6

Kromě toho byla schopnost těchto sloučenin potencovat gABA-zprostředkované zesílení proudu Cl' v oocytu Xenopus se vstříknutými geny lidského receptorů gAGAA omezená ve srovnání s 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onem.

Při použití expresního systému oocytu Xenopus pro testování hranice účinnosti některých neuroaktivních steroidů bylo postupováno následovně. Do oocytů Xenopus laevis (stadium VI), které byly „defolikulovány“ s použitím metody štěpení kolagenázou [3 h při 18 až 23 °C, 2 mgmr¹ kolagenázy „A“ v Barthově salinickém roztoku s vynechanými solemi Ca²⁺], byly vstříknuty transkripty cRNA podjednotkových komplexů lidského vstříknuty transkripty cRNA podjednotkových komplexů lidského receptorů gABAA, αΐ, βΐ a yl. Hlavní komplex receptoru GABAa je tvořen podjednotkami αβγ. Takto ošetřené oocyty byly jednotlivě uchovávány až 9 dní při 19 až 20 °C na 96jamkových plotnách (200 μΐ na jamku normálního Barthova roztoku doplněného 50IUmr’ penicilinu, 50 mg ml’¹ streptomycinu a 100 mg ml'¹ gentomycinu). Agonistou indukovaný proud byl zaznamenáván z napětí oocytů Xenopus, odečítaného pomocí zesilovače Axoclamp 2A (Axon Instruments) v systému dvojitých elektrod při udržovacím potenciálu -60 mV. Mikroelektrody snímající napětí a průchod proudu byly vyplněny 3M KC1 a měly odpař 1 až 3 ΜΩ, měřeno ve standardním exracelulámím salinickém roztoku. Oocyty byl při teplotě místnosti (17 až 21 °C) kontinuálně promývány žabím Ringerem (120 mm NaCl, 2 mm KC1, 1,0 mm CaCl2, 5 mm HEPES pH 7,4) v množství 5 až 7 ml min’¹.

Všechny léčiva byla aplikována pomocí tohoto perfuzního systému. Steroidy (10‘² M) byly připraveny jako koncentrované zásobní roztoky buď v DMSO, nebo ethanolu a pak byly ředěny Ringerovým roztokem na příslušnou koncentraci. Konečná koncentrace DMSO a ethanolu byla 0,2 v/v, což je hodnota, která neměla žádný vliv na odpověď vyvolanou GABA. Zásobní roztoky všech ostatních léčiv byly připraveny v Ringerově roztoku. Membránové proudové reakce byly podrobeny filtraci nízkého průchodu při 100 Hz a zaznamenány pomocí přístroje FM (Racel Store 4DS) na magnetický pásek pro následnou analýzu.

Přínosy oproti progesteronu

Korelaci mezi sníženými ladinami progesteronu a příznaky souvisejícími sPMS, PND akatameniální epilepsií (Backstrom a d., 1983; Dalton, K., 1984) vedly k používání progesteronu při jejich léčbě (Mattson a d., 1984, a Dalton, 1984). Progesteron však není při léčbě výše uvedených syndromů konzistentně účinný. Například pro progesteron neexistuje vztah dávka-odpověď při léčbě PMS (Maddocks a d., 1987). Tyto výsledky jsou předvídatelné, vezmou-li se v úvahu výsledky našich studií in vitro, které demonstrují, že progesteron má velmi nízkou účinnost na komplex gR, jak je patrné z tabulky 1, v porovnání s určitými metabolity progesteronu.

Příznivý účinek progesteronu pravděpodobně souvisí s proměnnou konverzí progesteronu na aktivní metabolity progesteronu. Použití specifických metabolitů progesteronu při léčbě výše uvedených syndromů je jasně výhodnější než použití progesteronu vzhledem k vyšší účinnosti metabolitů a jejich derivátů (viz gee a d., 1987, a tabulka 1).

Žádné hormonální vedlejší účinky

Bylo rovněž demonstrováno, že neuroaktivní steroidy nemají hormonální vedlejší účinky v důsledku nízké afinity pro pregesteronové a jiné hormonální steroidní receptory. Data byla získána při testech prováděných postupy dříve popsanými v gee a d., 1988 za účelem stanovení účinku metabolitů progesteronu a jejich derivátů a progestinu R5020 na vazbu [³H]R5020 na progesteronový receptor v krysí děloze (Gee a d., 1988).

³H-progesteron (0,15 nM) byl inkubován scytosolem krysí dělohy v přítomnosti testovaných sloučenin. Po inkubaci byla stanovena specifická vazba a porovnána s kontrolní inkubací bez těchto sloučenin. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento inhibice vazby. Váže-li se sloučenina na

-31 CZ 292881 B6 progesteronový receptor s vysokou afinitou, je možno při testované koncentraci očekávat 100% inhibici vazby. Neuroaktivní steroidy vykazují menší než 10% inhibici, což ukazuje, že jsou neaktivní jako progestenické prostředky.

Dále byly studovány různé hormonální aktivity reprezentativních neuroaktivních steroidů na základě testování jejich potenciálních esterogenních, mineralokortikoidových aglukokortikoidových aktivit. Tyto aktivity byly analyzovány monitorováním schopnosti sloučenin inhibovat vazbu steroidních hormonů na odpovídající hormonové receptory. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny ve zveřejněné přihlášce PCT, zveřejněné 4.3. 1993 pod číslem WO 93/03732.

Výsledky těchto experimentů jasně ukazují, že neuroaktivní steroidy nemají silnou afinitu vůči žádnému zvýše uvedených steroidních receptorů. Nelze u nich tedy předpokládat hormonální vedlejší účinky, které by z takovéto vazby na steroidní receptoiy vyplývaly.

Antikonvulzivní účinnost

Byly rovněž prováděny experimenty za účelem zjištění fyziologické relevance interakcí neuroaktivního steroidů a gABA receptorů hodnocením schopnosti sloučenin podle vynálezu zabraňovat metrazolem vyvolaným křečím u myší. Myším byly 10 min před injekcí metrazolu injekčně vstříknuty různé dávky testovaných sloučenin podle vynálezu. Pozorováním každé myši po dobu 30 min byla stanovena doba do nástupu myoklonie (přítomnost klonické aktivity předních končetin), vyvolané metrazolem. U kontrolních myší vyvolává metrazol (85 mg/kg) křeče u 95 % zvířat. Schopnost několika sloučenin podle vynálezu chránit myší před křečemi je uvedena v tabulce 2.

Tabulka 2

Antimetrazolová aktivita neuroaktivních steroidů u myší

název	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	% ochrany
3 P-cyklopropylethynyl-3a-hydroxy-5 β-pregnan- 20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3a-Hydroxy-3 [3-(3'-methyl-but-3'-en-1 ynyl)-5 B-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	100
3a-Hydroxy-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	100
3 a-Hydroxy-3 p-methyl-5 [3-pregnan-20-on	IP	mikro rozt.	10	70
3 p-Ethynyl-3a-hydroxy-l 9-nor-5p-pregnan- 20-on	IP	50% hpbcd	10	100
3 β—Ethy ny 1—3 a-hydroxy-19-nor-5 β-pregnan20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3 β-( 1 -hexynyl)-3 a-hydroxy-5 P-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	37,5
3p-Ethenyl-3a-hydroxy-5P~pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3a-Hydroxy-3|3-ethynyl-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3a-Hydroxy-3(3-methyl-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	100
Bis(3a,21-dihydroxy-3|3-ethynyl-5|3-pregnan- 20-on)21-hemisukcinát	IP	50% hpbcd	10	37,5

-32CZ 292881 B6

Tabulka 2 - pokračování

název	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	% ochrany
3a,2 l-Dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21-acetát	IP	50% hpbcd	10	50
3a,2 l-Dihydroxy-5a-pregnan-20-on (5aTHDOC)	IP	50% hpbcd	10	87,5
3a-Hydroxy-3P~trifluor methyl-19-ηοΓ-5βpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	100
3 P-Ethynyl-3a-hydroxy-5 β-pregn-l l-en-20-on	IP	50% hpbcd	10	75
3 a-Hydroxy-3 β-(3 '-methyl-bus-3 '-en-1 -nyl)- 5 a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3a-Hydroxy-3 β-methyl-Sa-l 9-nor-pregnan- 20-on	IP	mikro rozt.	10	37,5
3a,20a(S)-Dihydroxy-5a-pregnan	IP	mikro rozt.	10	30
3β-Ethenyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	100
3a,21-ϋί1^Γοχγ-5β-ρΓββη3η-20-οη-21-acetát	IP	50% hpbcd	10	25
3α,20a-Dihydroxy-3β-methyl-5α-pregnan	IP	mikro rozt.	10	60
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethyny 1-5 β-pregnan-20on-21-hemisukdinát	IP	voda	10	50
Bis(3a,21-dihydroxy-3 β-ίΓΪΑυοπηβ^1-5βpregnan-20-on)-21 -hemisukcinát	IP	50% hpbcd	10	25
3 a-Hydroxy-3 β-fluormethy 1-5 a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	14,3
3a,2 l-Dihydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-20on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	mikro rozt.	10	11,11
3a-Hydroxy-3 ú-trifluormethyl-5 β-pregnan-20on	IP	50% hpbcd	10	62,5
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethyny 1-5 β-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	18,8
3α,21-Dihydroxy-3β-methyl-5α-pregnan-20on-21-hemisukcinát	IP	voda	10	37,5
3 a-Hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 a-pregnan-20on	IP	50% hpbcd	10	62,5
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-19-nor-5 βpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	118,8
3a,2 l-Dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	voda	10	100
3a-Hydroxy-3 β-trifluormethyl-l 9-nor-5apregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	25
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethynyl-S β-pregnan-20on-21-acetát	IP	50% hpbcd	10	62,5
3a,2 l-Dihydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-20on-21-acetát	IP	mikro rozt.	10	10
3a,2 l-Dihydroxy-3 β-ίΓΪΑυοπηεΛγΜ βpregnan-21-on	IP	50% hpbcd	10	50

-33CZ 292881 B6

Tabulka 2 - pokračování

název	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	% ochrany
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 βpregnan-20-on-21-acetát	IP	50% hpbcd	10	62,5
3 a-Hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 β-19-norpregn-17(Z)-en	IP	50% hpbcd	10	25
3a,20-Dihydroxy-3 β,2 0—d i methy 1—5 β-pregnan	IP	mikro rozt.	10	22,2
3a,20a-Dihydroxy-3 β,2 l-dimethyl-5a-pregnan	IP	dmso	10	0
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethyl-l 9-nor-5 βpregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	voda	10	50
3 a,2 l-Dihydroxy-3 β-ethynyl-S β-pregnan-20on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	voda	10	50
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 βpregnan-20-on-21-hemifúmarát, sodná sůl	IP	voda	10	50
3α,21-Dihydroxy-3β-frifluomethyl-5α-pregnan- 20-on	IP	50% hpbcd	10	25
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 βpregnan-20-on-21-hemisukcinát	IP	voda	10	50
3 a,2(^Dihydroxy-3 β-ethynyl-S β-pregnan	IP	50% hpbcd	10	25
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ΐΓΪί1υοππεΛγ1-5 βpregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	voda	10	62,5
3α,20β-Dihydroxy-3β-ethynyl-5α-pregnan	IP	50% hpbcd	10	37,5

Schopnost neuroaktivních steroidů chránit zvířata proti jiným chemickým konvulzivúm byla dále demonstrována pro 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on, 3a,21-dihydroxy-5a-pregnan-20-on a 3a-hydroxy-3p~methyl-5p-pregnan-20-on. Antikonvulzivní testy jsou podobné, jak uvedeno výše. Další chemická konvulziva jsou: metrazol (85 ng/kg), (+)bikukulin (2,7 mg/mg), pikrotoxin (3,15 mg/kg), strychnin (1,25 mg/kg) nebo vehikulum (0,9% salinického roztoku). Bezprostředně po injekci konvulziva nebo vehikula byly myši pozorovány po dobu 30 až 45 min. Byl zaznamenáván počet zvířat s tonickými a/nebo klonickými křečemi. V testu maximálního elektrošoku byl k vyvolání tonické křeče po dobu 200 ms zaváděn komeálními elektrodami proud 50 mA při 60 Hz. Schopnost sloučeniny zrušit tonickou komponentu byla definována jako konečný bod. Celkový depresní potenciál CNS byl stanoven 10 min po injekci sloučenin pomocí testu šrotující tyčí, kdy byl stanoven počet myší zůstávajících po dobu 1 min v jednom ze tří pokusů na rotující (6 min'¹) tyči. Při každý pokus byla stanovena hodnota ED₅₀ (dávka, při níž se projevuje poloviční účinek vzhledem k maximu) a je uvedena v tabulce 3. Výsledky demonstrují, že neuroaktivní steroidy jsou ve srovnání s jinými klinicky použitelnými antikonvulzivy vysoce účinné a mají profil podobný jako BZ klonazepam. Z těchto pozorování vyplývá terapeutická použitelnost těchto sloučenin jako modulátorů mozkové excitability, která je v souladu s jejich vysokou afinitou při interakci s komplexem gR in vitro.

-34CZ 292881 B6

Tabulka 3

Antikonvulzivní aktivita neuroaktivních steroidů podle vynálezu a vybraných známých antikonvulzivu myší

ED5o
sloučenina	Rr	MES	MTZ	BIS	PICRO	STR
3a5a(a)-P	30	28,6	4,9	12,3	10,2	>300
5a-THDOC(a)	22,9	26,7	8,1	17,8	5,6	>300
3a-hydroxy-3 [3-methyl-5apregnan-20-on®	246,2	> 100	6,3	61,9	35,4	> 100
klonozepam*	0,184	93	0,009	0,0086	0,043	NP
fenobarbital*	69	22	13	38	28	95
fenytoin*	65	10	NP	NP	NP	**
progabid***	—	75	30	30	105	75
valproát*	426	272	149	360	387	293

Význam zkratek: RR (rotující tyč), MES (maximální elektrošok), MTZ (metrazol), BIC (bikukulin), PICRO (pikrotoxin), STR (strychnin), NP (žádná ochrana) ^(a) Rozpuštěno ve 20% hydroxypropyl-(3-cyklodextrinu ve vodě. Steroidy byly podávány i.p.

a konvulziva s.c.

* Data o antikonvulzivech jsou z Swinyard & Woodhead, generál principles: experimental detection, quantification and evaluation of anticonvulsants, in: Antiepileptic Drugs, D.M.

Woodbury, J.K. Penry a C.E. Pippenger (ed.) str. 111 (Raven Press, New York), 1982).

Vehikulum obsahovalo 0,32 % hydroxypropylmethylcelulózy a 4 % TWEEN 80 v salinickém roztoku.

** Maximální ochrana 50 % při 55 až 100 mg/kg.

*** Chemická konvulziva v progabidové studii byla podávána i.v., všechny data z Worms a d., gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor stimulation. I. Neuropharmacological profíles of progabide (SL 76002) and SL 75102, With emphasis on their anticonvulsant spectra, Joumal 25 of Pharmacology and Experimental Therapeutics 220:660-671 (1982).

Anxiolytické účinky

Dále uvedené experimenty demonstrují, že metabolity progesteronu 3a-OH-5a-pregnan-20-on 30 a 3a-OH-5[3-pregnan-20-on jsou účinnými anxiolytiky ve čtyřech zvířecích modelech lidské úzkosti, které měří behaviorální účinky anxiolytických sloučenin. Je však nutno upozornit, že tyto dvě sloučeniny jsou uvedeny pouze pro ilustraci. V tabulkách 4 až 6 jsou rovněž uvedena data o jejich syntetických derivátech. Jako zvířecí modely pro měření behaviorálních účinků anxiolytických sloučenin byly použity tyto čtyři testy: 1) test přechodu světlo/tma, 2) zvýšené 35 křížové bludiště, 3) geller-Seifterův konfliktový test a 4) Vogelům test.

a) Test přechodu světlo/tma

Test přechodu světlo/tma (Crawley a goodwin, Pharmacol. Biochem. Behav. 13:67-70, 1980), je 40 založen na poznatku, že hlodavci mají přirozený sklon zkoumat nové prostředí, ale mají odpor k otevřeným jasně osvětleným plochám, které jejich explorační chování brzdí (Christmas a Maxwell, neuropharmacol. 9:17-29, 1980; Filé, J. Neurosci. Meth. 2:219-238, 1980). Bylo zjištěno, že různá klinicky používaná anxiolytika včetně diazepamu, klonazepamu

-35CZ 292881 B6 a pentobarbitalu zvyšují počet přechodů mezi světlou a tmavou komorou, zatímco neanxiolytická léčiva tento behaviorální účinek nevykazují (Crawley a d., Neorpharmacol. 23:531-537 (1984)).

Samci myší N.I.H Swiss-Webster (Harlan, Harlan, Indianapolis, IN) o hmotnosti 15 až 20 g byli po čtyřech umístěni do polyethylenových klecí s pilinovou podestýlkou. Chovný prostor měl kontrolované prostředí (22 °C) s dvanáctihodinovým cyklem světlo/tma (0600-1800 h). Potrava a voda byla kromě doby testu k dispozici ad libitum. Experimenty byly prováděny v době 0700 až 1500 h a skupiny byly vyrovnávány z hlediska vlivu denní doby. Myším bylo léčivo nebo vehikulum podáno jednou.

Byla použita modifikace dříve popsaných metod (Wieland a d., Br. Res. 565:263-268 (1991)). Zařízení obsahovalo dvě antumatizované zkušební komory po 2 odděleních (model RXYZCMZ16, Omnitech Electronics, Columbus, OH). Otevřené oddělení bylo s uzavřeným oddělením spojeno průchodem 7,5 x 7,5 cm. Otevřené oddělení bylo jasně osvětleno pomocí 200 W žárovky. Experimentální prostor byl udržován v temnu. V obou odděleních bylo automaticky zaznamenáváno každé přerušení infračervených paprsků připojením na počítač přes zařízení Digiscan Analyzer (Omnitech Electronics) a data byla analyzována s použitím systému Lab Animal Monitoring Systém (Omnitech Electronics).

Myším N.I.H. Swiss-Webster bylo intraperitoneálně (IP) podáno vehikulum nebo testované léčivo a po 10 min byly umístěny do středu osvětleného oddělení. Během zkušební doby 10 min byl měřen počet přechodů mezi osvětlenou a tmavou komorou, celková aktivita v osvětlené komoře a doba strávená v osvětlené komoře.

Podávání 3a-OH-5a-pregnan-20-onu a 2a-OH-5[3-pregnan-20-onu v testu přechodu světlo/tma poskytlo významnou závislost dávka-odpověď ve vztahu k počtu přechodů mezi tmavou a osvětlenou komorou. Post-hoc porovnání ukázalo, že počet přechodů při dávkách 3aOH-5apregnan-20-onu i 3a-OH-5[3-pregnan-20-onu byl při testovaných dávkách významně zvýšen oproti kontrole (Dunnettům t-test).

Jak 3a-OH-5a-pregnan-20-on, tak 3a-OH-5p-pregnan-20-on kromě toho vyvolal významné (p <0,01) zvýšení aktivity při dávce 10 až 20 mg/kg ve srovnání s kontrolou (Dunnettův t-test). Při žádné testované dávce nebyly pozorovány významné rozdíly mezi oběma sloučeninami.

b) Zvýšené křížové bludiště

Teoretický základ testu se zvýšeným křížovým bludištěm je podobný jako u testu přechodu světlo/tma. Jak je popsáno v Pelow a d., J. Neurosci. Meth. 14:149-167 (1985), zvýšené křížové bludiště je konstruováno tak, že využívá přirozené averze myší k otevřeným prostorům. Zařízení je tvořeno dvěma otevřenými a dvěma uzavřenými rameny. Test se zvýšeným křížovým bludištěm umožňuje při dvou měřeních úzkosti zjišťovat počet vstupů do otevřených ramen a dobu strávenou v otevřených ramenech, vyjádřeno v obou případech jako procento celkového počtu vstupů a celkové strávené doby jak v otevřených, tak v uzavřených ramenech.

Samci myší N.I.H. Swiss-Webster (Harlan, Indianapolis, ΓΝ) o hmotnosti 15 až 20 g byli po čtyřech umístěni do polyethylenových klecí s pilinovou podestýlkou. Chovný prostor měl kontrolované prostředí (22 °C) s dvanáctihodinovým cyklem světlo/tma (0600-1800 h). Potrava a voda byla kromě doby testu k dispozici ad libitum. Experimenty byly prováděny v době 0700 až 1500 h a skupiny byly vyrovnávány z hlediska vlivu denní doby. Myším bylo léčivo nebo vehikulum podáno jednou.

Byla použita dříve popsaná metoda (Lister, Psychopharmacol. 92:180-185 (1987)). Zařízení obsahovalo dvě otevřená ramena, kolmá ke dvěma uzavřeným ramenům, ve výšce 50 cm nad podlahou. Každé rameno mělo délku 50 cm a stěny uzavřených ramen měly výšku 40 cm.

-36CZ 292881 B6

Bludiště bylo celé vyrobeno z černého plexiskla. Nad každým otevřeným ramenem byla umístěna 200 W žárovka k dosažení silného kontrastu mezi otevřenými a uzavřenými rameny.

Po 10 min od injekce byly myši N.I.H. Swiss-Webster umístěny do středu bludiště ve směru otevřeného ramene. Během 5 min zkušební doby byl měřen počet vstupů do otevřených a uzavřených ramen a doba strávená v otevřených a uzavřených ramenech. Aby byla závislá proměnná zaznamenána, musely být v příslušném rameni všechny čtyři tlapky. Proto se nepočítá doba strávená ve středu bludiště, takže celková doba strávená v otevřených a uzavřených ramenech nemusí být rovna 5 min.

V testu se zvýšeným křížovým bludištěm vykazuje jak 3a-OH-5a-pregnan-20-on, tak 3a-OH-5(3-pregnan-20-on při různých dávkách zvýšený poměr vstupů do otevřených ramen. 3a-OH-5a-pregnan-20-on vyvolal významně zvýšený počet vstupů při 20 mg/kg (p < 0,05), zatímco 3a-OH-5(3-pregnan-20-on vyvolal významné zvýšení počtu vstupů při 5 mg/kg (p < 0,05), 7,5 mg/kg (p < 0,01) a 10 mg/kg (p < 0,01).

3a-OH-5a-pregnan-20-on i 3a-OH-5p-pregnan-20-on dále vyvolávaly zvýšení doby strávené v otevřených ramenech v závislosti na dávce. 3a-OH-5a-pregnan-20-on vyvolal významné zvýšení doby strávené v otevřených ramenech při 10 mg/kg (p < 0,01), zatímco 3a-OH-5fJ-pregnan-20-on vyvolával významné zvýšení doby strávené v otevřených ramenech při 7,5 mg/kg (p < 0,01) a 10 mg/kg (p < 0,01).

Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v přihlášce PCT, zveřejněné jako WO 93/03732 4.3.1993. V tabulce 4 jsou shrnuty anxiolytické účinnosti sloučeniny podle vynálezu pomocí testu se zvýšeným křížovým bludištěm za výše uvedených podmínek.

Tabulka 4

Anxiolytická účinnost u myší ve zvýšeném křížovém bludišti

název	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	% kontroly
3 a-Hydroxy-3 β-(3 '-methy lbut-3 '-en-1 'ynyl)-5 p-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	155
3 a-Hydroxy-5 a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	20	143,7
3 (3-Ethynyl-3 a-hydroxy-5 p-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	1	186,6
3 β-Ethyny 1-3 a-hydroxy-19-nor-5 βpregnan-20on	IP	50% hpbcd	10	172
3 β-Ethenyl-3a-hydroxy-5 β-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	151
3a-Hydroxy-3β-ethynyl-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	213
3 a-Hydroxy-3 β-methy 1-5 a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	5	165,6
3a,2 l-Dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21acetát	IP	50% hpbcd	10	133
3 a-Hydroxy-3 β-trifluormethy 1-19-nor-5 βpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	173,8
3 a-Ethynyl-3 a-hydroxy-5 β-pregn-l 1 -en- 20-on	IP	50% hpbcd	10	233

-37CZ 292881 B6

Tabulka 4 - pokračování

název	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	% kontroly
3a-Hydroxy-3 β-(3 '-methyl-but-3 '-en-1 'ynyl)-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	141
3 β-Etheny 1-3 a-hydroxy-5 a-pregnan-2 0-on	IP	50% hpbcd	10	154,3
3a,20a-Dihydroxy-3[3-methyl-5a-pregnan	IV	mikro rozt.	10	174,5
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethyny 1-5 β-pregnan20-on-21-hemisukcinát	IP	50% hpbcd	10	164,2
Bis(3a,2 l-dihydroxy-3 p-trifluormethyl-5 βpregnan-20-on)-21-hemisukcinát	IP	50% hpbcd	10	92
3a-Hydroxy-3 β-Αυοπηεί1ιγ1-5 β-pregnan- 20-on	IP	50% hpbcd	10	150,7
3 a-Hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 β-pregnan- 20-on	IP	50% hpbcd	10	197,6
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 βpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	162
3a,2 l-Dihydroxy-3 β-trifluormethyl-l 9nor-5 β-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	140
3 a-Hydroxy-3 β-trifluormethyl-19-nor-5apregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	161
3a,21 -Dihydroxy-3 β-ethynyl-5 β-pregnan20-on-21-acetát	IP	50% hpbcd	10	159
3a,2 l-Dihydroxy-3 β-ίπΑυοπηεΛγ1-5 βpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	237
3 β-Ethyny 1-3 a-hydroxy-5 β-pregnan- 11,20-dion	IP	50% hpbcd	10	235,9
3a,2 l-Dihydroxy-3 β-ίΓίίΙυοπηβΛγΙ-όβpregnan-11,20-dion	IP	50% hpbcd	10	112
3α,203-ϋΐ1^Γθχγ-3β,21·^ΐιηβΛιγ1-5αpregnan	IP	dmso	10	73
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethyl-19nor-5 β-pregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	voda	20	161,1
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethyny 1-5 β-pregnan- 20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	PO	voda	10	159
3a,21-Dihydroxy-33-trifluormethyl-5p-20on-21-hemifumarát, sodná sůl	IP	voda	50% hpbcd	126
3a,2 l-Dihydroxy-3 β-ί1υοππεΛγ1-5αpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	109
3a,20b-Dihydroxy-3 β-ethynyl-S β-pregnan	IP	dmso	10	178
3a,2 l-Dihydroxy-3 β-ίπΑυοππεΛγΙ-δ βpregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	voda	20	172,8

c) geller-Seifterův konfliktový test

Tento zvířecí model lidské úzkosti používá ke zjištění anxiolytických vlastností léčiv podmíněný stav konfliktu u krys. Krysy se pro pozitivní posílení navykají na stlačování páky dvěma způsoby (Geller a Seifter, Psychopharmacologia 1:482-492 (1960)). První spočívá ve stlačování páky

-38CZ 292881 B6 v proměnlivém schématu bez potrestání. Druhou složkou je pevné schéma, kdy po každém stlačení páky následuje pozitivní posílení a potrestání. Trestaná složka vyvolává u zvířete stav konfliktu. Netrestaná složka umožňuje pozorovat u léčiva veškeré účinky potlačující odpověď. Anxiolytická odpověď by měla zvýšit trestanou odpověď bez ovlivnění netrestané odpovědi.

Pro konfliktové experimenty byly použity albiničtí samci krys Sprague-Dawley (Charles River Labs, Wilmington, MA) o hmotnosti 250 až 300 g, kteří byli udržováni na omezené dietě pelet Purina Lab Chow s kdykoli dostupnou vodou za účelem udržení tělesné hmotnosti na 85 % z hodnoty odpovídající mladému dospělci svolným přístupem k potravě. Krysy byly umístěny jednotlivě ve dvanáctihodinovém cyklu světlo-tma se světlem zapnutým v době 0700 až 1900.

U krys byly pomocí geller-Seifertova (1960) konfliktového testu měřeny protiúzkostné (zmenšující potrestání) a odpověď potlačující účinky 3a-OH-5a-pregnan-20-onu a 3a-OH-5a-pregnan-20-onu. Během tohoto 63min testu provádějí hladové krysy odpověď spočívající ve stlačení páky, aby získaly odměnou slazené mléko. Posilovači schéma sočívá v trestné a netrestané složce, střídající se přibližně každých 15 min. Krysy byla navykány ve zkušebních komorách (Coulbom instruments), opatřených pákou upevněnou na jedné stěně, dávkovačem 0,1 ml mléka (1 díl kondenzovaného mléka Eagle, 2 díly vody) jako odměny a podlahou z kovového roštu, kterou byl udělován šok do nohou jako trest. Pro programování a zápis byl použit minipočítač DEC PDP 11/72 se systémem SKED.

Krysy byly nejprve navykány na odpověď ve schématu trvalého posilování a pak rychle přešly na schéma s proměnnými intervaly (VI) 30 s, 1 min a 2 min. Ve schématu trvalého posilování dostávaly krysy mléko pó každém stlačení páky; ve schématech VI bylo mléko k dispozici v řídkých a proměnlivých intervalech, nakonec v průměru jednou za 2 minuty. Pak byly v netrestané základní linii VI zavedeny čtyři 3min „konfliktní“ doby; první byla zahájena po 3 min průběhu VI a ostatní se střídaly mezi 12min obdobími odpovědí VI. Během konfliktních dob, které byly signalizovány světlem a zvukem, bylo opět platné schéma trvalého posilování a každé stlačení páky vedlo současně k výdeji mléka a ke krátkému (0,25 ms) testu šokem do nohou. Intenzita šoku byla původně 0,2 mA a denně byla zvyšována o 0,02 mA za účelem postupného potlačení odpovědí tvořených stlačováním páky na 5 nebo méně během konfliktní doby. Toto navykání trvalo 4 až 6 týdnů a po této době byl pozorován stabilní nízký počet odpovědí během konfliktního období a stabilní vysoký počet odpovědí v netrestaném období. Léčivem vyvolané zvýšení počtu trestaných odpovědí bylo vzato jako index anxiolytické účinnosti, zatímco snížení počtu netrestaných odpovědí byla vzata jako index potlačení odpovědi nebo uklidnění.

Dále jsou shrnuty účinky 3a-OH-5a-pregnan-20-onu a 3a-OH-5|3-pregnan-20-onu v konfliktovém testu. Obě sloučeniny vyvolaly velké zvýšení počtu trestaných odpovědí, z čehož vyplývá, že obě budou účinné jako protiúzkostné prostředky. Vrchol účinku 3α-ΟΗ-5βpregnan-20-onu byl pozorován při 2 mg/kg a u 3a-OH-5a-pregnan-20-onu při 4,4 mg/kg po subkutánní aplikaci. (Pro statistickou analýzu a z důvodu malého počtu testů při každé dávce byly všechny testy pro každou sloučeninu spojeny pro porovnání oproti kontrolním testům s vehikulem a pro příbuzná měření byl použit t-test: pro 3a-OH-5a-pregnan-20-on p < 0,02, pro 3a-OH-5P-pregnan-20-on p < 0,008).

V tabulce 5 je uveden souhrn anxiolytických aktivit sloučenin podle vynálezu zjištěných pomocí geller-Seifertova testu za výše uvedených experimentálních podmínek.

-39CZ 292881 B6

Tabulka 5

Anxiolytická účinnost u krys v geller/Seifterově testu

sloučenina	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	Geller/Seifter % kontroly
3a-Hydroxy-5^-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	2	860,5
3a-Hydroxy-5a-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	5	471,8
3 β—Ethy ny 1—3 a-hydroxy-5 P-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	2	751,1
3a-Hydroxy-3p-ethinyl-5a-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	8	830,2
3a-Hydroxy-3(3-methyl-5a-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	4	1384,6
3 a-Hydroxy-3 β-tr ifluormethy 1-19-nor-5 βpregnan-20-on	sc	50% hpbcd	4	1073,1
3β-Ethenyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on	PO	50% hpbcd	12	1092,3
3 a-Hydroxy-3 β-fluormethy 1-5 β-pregnan-20on	sc	50% hpbcd	8	1005
3 a-Hydroxy-3 β-ίπί1υοπηε0ιγ1-5 β-pregn-l 1 en-20-on	sc	50% hpbcd	4	508,3
3 a-Hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 β-pregnan- 20-on	sc	50% hpbcd	4	663,2
3 a,2 l-Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 βpregnan-20-on	sc	50% hpbcd	16	982,4
3 a-Hydroxy-3 β-ίπί1υοπηβΛγ1-5 β-19-norpregnan-17(20)-en	sc	50% hpbcd	16	1130,3
prekurzory	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	Geller/Seifter % kontroly
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 βpregnan-20-on-21-acetát	sc	50% hpbcd	8	882,8
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethynyl-S β-pregnan20-on-21-hemisukcinát	Ρθ	voda	16	1350,0
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 βpregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	po	voda	8	840,0
3 a,2 l-Dihydroxy-3 β-ϋ·ίΑυοπηβ^1-5β-19norpregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	PO	voda	8	2493,4
3 a-Hydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-20spiro-2'-( 1 ',3'-thiazolidin-4'-karboxylová kyselina)	sc	50% hpbcd	16	900,0

d) Vogelův test

Vogelův test je založen na vývoji konfliktu mezi vysoce motivovaným chováním a averzí. Silnou motivací je v tomto testu žízeň. K vyvolání motivace k napití je zvíře na 12 až 16 h zbaveno 10 přístupu kvodě. Během výcvikového období jsou zvířata vystavena zkušebním podmínkám, takže si zvyknou na picí žlábek a minimalizují strach z nového prostředí. Po výcviku se zvířatům umožní na 2 h přístup kvodě. Během této doby zvířata zkonzumují normální množství vody a potravy jako kompenzaci za dobu bez přístupu k vodě. Toto schéma však přesto vyvolává silnou motivaci k pití během doby pokusu.

Zvíře, které bylo zbaveno přístupu k vodě po dobu 12 až 16 h, se umístí do zkušební klece, kde se nechá volně pít po dobu 5 min. Tato doba slouží ke zvyknutí zvířete na prostředí a na picí žlábek. Po výcvikové době mají zvířata přístup k vodě a potravě ve své domovské kleci po dobu 2 h. Potrava je k dispozici stále. Po 24 h se zvířeti intracerebroventrikulámě podá léčivo.

-40CZ 292881 B6

Po uvedené prodlevě počítaje dobou injekce se zvíře opět umístí na 10 min do zkušební klece. Počítač zaznamenává každé olíznutí zvířete a po každém dvanáctém olíznutí udělí mírný elektrický stimul na jazyk a/nebo nohy. Elektrický stimul je tvořen proudem 0,6 mA o délce 100 ms. Tento postup vyvolá u zvířete stav konfliktu, který je redukován podáním klinicky používaných anxiolytik (tj. valia). Pro získání křivek dávka-odpověd se různým skupinám zvířat injekčně vpravují zvyšující se dávky testovaného léčiva a ve stanovenou dobu se testují.

Data z těchto měření pro některé reprezentativní sloučeniny jsou shrnuty v tabulce 6.

Tabulka 6

Antiolytická účinnost u krys ve Vogelově testu

sloučenina	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	Vogel % kontroly
3a,20a-Dihydroxy-2[3-izopropoxy-5apregnan	i.c.v.	g-CD	10 pg	169,0
3a,20-Dihydroxy-20-methyl-5apregnan	i.c.v.	g-CD	20 pg	179,0
3a,20a-Dihydroxy-2 l-methyl-5a~ pregnan	i.c.v.	g-CD	10 pg	157,9
3a,20a(S)-Dihydroxy-5a-pregnan	i.c.v.	b-CD	10 pg	193,0
3a-Hydroxy-5a-pregnan-20-on	i.c.v.	g-CD	10 pg	431,1
3 a,20a-Dihydroxy-5 β-pregnan	i.c.v.	g-CD	10 pg	283,3
3p-Fluor-3a,20a-dihydroxy-5apregnan	i.c.v.	g-CD	20 pg	264,9
3a,20a-Dihydroxy-2 l-ethyl-5apregnan	i.c.v.	g-CD	20 pg	225,8
3a,20[3-Dihydroxy-5 β-pregnan	i.c.v.	g-CD	20 pg	267,3

Prekurzoiy

Antikonvulzivní a anxiolytická aktivita prekurzorů základních sloučenin 3a-hydroxy-5apregnan-20-onu a 3a,21-dihydroxy-5a-pregnan-20-onu a jejich derivátů byla hodnocena stejným postupem, jaký je popsán výše. Po podání sloučenin bylo vyneseno procento ochrany několika prekurzory 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu proti metrazolem vyvolaným křečím proti času (tabulka 7).

Bylo testováno ještě několik dalších prekurzorů a výsledky jsou uvedeny v tabulce 8. Modifikace základních sloučenin 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu a 3a,21-dihydroxy-5a-pregnan-20onu na hydroxylech 3a a 21 různými estery zachovává jejich biologickou aktivitu a v některých případech tato modifikace vedla k prodloužení doby ochrany poskytované sloučeninou. Sloučeniny podle vynálezu tedy mohou být modifikovány, aby poskytovaly po určitou dobu antikonvulzivní a anxiolytickou účinnost s různým stupněm ochrany.

-41 CZ 292881 B6

Tabulka 7

Anti-metrazolová účinnost prekurzorových esterů 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu (3a(RCOO)-5a-pregnan-20-onu

R	% ochrany 60 mg/kg 1 h, IP
methyl	25
ethyl	75
propyl	75
butyl	33
2-propyl	75
4-heptyl	16(4 h)
cyklobutyl	17
fenyl	33
4-chlorfenyl	50
4-methoxyfenyl	17
3-pyridyl	50 (20 h)
3-( 1-methyl-l ,4-dihydroypridinyl)	63 (20 h)

Na rozdíl od benzodiazepin mohou neuroaktivní steroidy také vyvolávat anestesii. Má se za to, že jejich schopnost vyvolávat anestesii je důsledkem jejich schopnosti otevřít chloridový kanálek v nepřítomnosti GABA, přičemž tuto vlastnost benzodiazepiny nemají. Neurosteroidy mohou ío proto působit přímo v nepřítomnosti gABA na recetoru a také „nepřímo“ v přítomnosti GABA.

Toto „nepřímé“ působení se nazývá „modulace“ receptorů; Lambert a d., Trends Pharmacology Science 8:224-227(1987).

Sloučeniny podle vynálezu mohou být používány rovněž pro anestetické indikace ve vysokých 15 dávkách. Výhodným způsobem zavedení anestezie je však intravenózní aplikace (i.v.).

Anestetické vlastnosti léčiva se zjišťují u zvířat na základě schopnosti léčiva vyvolat ztrátu vzpřimovacího reflexu. Ztráta vzpřimovacího reflexu je definována jako neschopnost zvířete vzpřímit se do 30 sekund po položení na záda. Léčivo bylo aplikováno myším i.v. do boční ocasní žíly. Po podání byly myši položeny na záda a sledovány. Ilustrativní výsledky jsou 20 uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8

Anestetická účinnost neuroaktivních steroidů u myší

sloučenina	cesta	vehikulum	dávka	ztráta vzpřimovacíh o reflexu
3 a,21 -Dihydroxy-3 |3-ethynyl-5 β-pregnan20-on	iv	20% cremophor	10	100
3 (3-(Chlorethynyl-3a-hydroxy-5 β-pregnan- 20-on	iv	mikronizační roztok	20	100
3 P-Ethynyl-3a-hydroxy-5 |3-pregnan-20-on	iv	10% hpbcd	30	100
3 a-Hydroxy-3 |3-methyl-5a-pregn-l 6-en- 20-on	iv	mikronizační roztok	50	100
3a-Hydroxy-5a-pregn-9-en-20	iv	mikronizační roztok	10	100
3a-Hydroxy-17(20)(Z)-methoxymethylen- 19-nor-5a-androstan	iv	mikronizační roztok	5	75

-42CZ 292881 B6

Tabulka 8 - pokračování

sloučenina	cesta	vehikulum	dávka	ztráta vzpřimovacíh o reflexu
3 a-hydroxy-3 β-methy 1-5 P~pregnan-20-on	iv	mikronizační roztok	2,5	100
2 P-Ethoxy-3 a-hydroxy-5a-pregnan-20-on	iv	20% cremophor	5	100
2 β-F luor-3 a-hydroxy-5 a-pregnan-20-on	iv	mikronizační roztok	5	100
3a-Hydroxy-3 fJ-methyl-21-methoxymethyl5a-pregnan-20-on	iv	mikronizační roztok	20	100

Výše jsou popsána a osvětlena výhodná provedení, avšak bez překročení rozsahu vynálezu je možno provést jejich různé náhrady a modifikace. Je tedy nutno zdůraznit, že vynález je popsán pouze ilustrativním, a nikoli omezujícím způsobem.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (14)

1. Sloučenina, vybraná ze skupiny zahrnující

3a-hydroxy-3[3-(3'-methylbut-3'-en-l '-ynyl)-5P-pregnan-20-on,

3a-hydroxy-3 P-(3'-methylbut-3'-en-l '-ynyl)-5a-pregnan-20-on, 3a-hydroxy-3P-trifluormethyl-5a-pregnan-20-on, 3a-hydroxy-3p-trifluormethyl-5P-pregn-l l-en-20-on,

3 |3-(cyklopropyl)ethynyl-3 a-hydroxy-5 f3-pregnan-20-on,

3a,20a-dihydroxy-3(3-ethynyl-5a-pregnan,

3 a,2 l-dihydroxy-3 |3-ethenyl-5a-pregnan-20-on a

3a,2 l-dihydroxy-3 P-fluormethyl-5a-pregnan-20-on nebo jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 3,20-diestery nebo 3,21-diestery.

2. Sloučenina, vybraná ze skupiny zahrnující sodnou sůl 3a,2 l-dihydroxy-3 β-trifluormethyl-l 9-nor-5 [3-pregnan-20-on-21-hemisukcinátu,

3a,20a-dihydroxy-21-methyl-5a-pregnanbishemisukcinát,

3a,2 l-dihydroxy-3 [3-ethenyl-5a-pregnan-20-on-21-hemisukcinát,

3a,21-dihydroxy-3[3-methyl-5a-pregnan-20-on-21-acetát, sodnou sůl 3a,2 l-dihydroxy-3 |3-trifluormethyl-5 |3-pregnan-20-on-21-hemifumarátu,

3a,2 l-dihydroxy-3 (3-trifluormethyl-5 [3-pregnan-20-on-methyl-21-sukcinát,

3 a,21 -dihydroxy-3 p-trifluormethyl-5 p-pregnan-20-on-21-propíonát, bis(3a,2 l-dihydroxy-3 p-trifluormethyl-5 (3-pregnan-20-on)-21-hemisukcinát, bis(3a,2 l-dihydroxy-3 fJ-ethynyl-5|3-pregnan-20-on)-21-hemisukcinát a N-(3a-hydroxy-3P-methyl-5a-pregnan-20-ylidin)ethanolamin.

-43CZ 292881 B6

3. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3a-hydroxy-3p-(3'-methylbut-3'-en-l'-ynyl)-5ppregnan-20-on.

5 4. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3a-hydroxy-3|3-hydroxy-3|3-trifluormethyl-5apregnan-20-on.

5. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3a-hydroxy-3|3-trifluormethyl-5|3-pregn-l l-en-20on.

6. Sloučenina podle nároku 2, kterou je sodná sůl 3a,21-dihydroxy-3[3-trifluormethyl-19-nor5P~pregnan-20-on-21-hemisukcinátu.

7. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3|3-(cyklopropyl)ethynyl-3a-hydroxy-5|3-pregnan-

15 20-on.

8. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

20

9. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro výrobu léčiva pro léčení stresu nebo úzkosti u živočišného subjektu.

10. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro výrobu léčiva pro zmírňování záchvatové aktivity u živočišného subjektu.

11. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro výrobu léčiva pro snižování nebo zmírňování nespavosti u živočišného subjektu.

12. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro výrobu léčiva pro léčení poruch 30 nálady u živočišného subjektu.

13. Použití podle nároku 12, kde poruchy nálady představuje deprese.

14. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro výrobu léčiva pro léčení PMS nebo 35 PND u živočišného subjektu.

15. Použití sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro výrobu léčiva pro vyvolání anestezie u živočišného subjektu.