CZ287028B6 - Derivatives of nitrogen mustard with attached amino acid radicals, process of their preparation and pharmaceutical composition and two-component system in which the derivatives are comprised - Google Patents

Abstract

In the present invention there are disclosed precursors of the general formula I in which Re1 and Re2 represent independently on each other a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, the group of the general formula {OSOi2Me} or {OSOi2-phenyl group}, X represents an oxygen atom, the group NH or the group -{CHi2-} and Y represents an oxygen atom. Those precursors are substrates for carboxypeptidase G2 (CPG2) and provide more efficient cytotoxic therapeutical substances if compared with so far known products of CPG2-catalyzed reactions. In the present invention there are also described a pharmaceutical composition and a two-component system in which those precursors are contained as well as a process for preparing those precursors. The preparation process consists for instance in reaction the compound of the general formula XVIII with the compound of the general formula II, in which the general symbols have corresponding meanings.

Description

Deriváty dusíkatého yperitu svázanými zbytky aminokyselin, způsob jejich přípravy a farmaceutická kompozice a dvojsložkový systém tyto deriváty obsahujícíNitrogen mustard derivatives bound by amino acid residues, process for their preparation and pharmaceutical composition and a two-component system containing these derivatives

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká derivátů dusíkatého yperitu s vázanými zbytky aminokyselin, sloučenin, použitelných při protilátkou směrované terapii za použití prekurzoru účinné látky a enzymu, který je vázán protilátkou k místu požadovaného účinku a který je schopen konvertovat v místě účinku prekurzor účinné látky na účinnou látku (terapie ADEPT - antibody directed enzyme prodrug therapy), způsobu jejich přípravy, farmaceutického prostředku sjejich obsahem a dvousložkového systému obsahujícího 1) konjugát enzymu a protilátky nebo fragmentu protilátky a 2) sloučeninu podle vynálezu. Uvedené sloučeniny jsou obzvláště zajímavé jako prekurzory farmakologicky účinných látek v kombinaci s karboxypeptidázami G, zejména v kombinaci s karboxypeptidázou G2 CPG2).The present invention relates to nitrogen mustard derivatives with bound amino acid residues, compounds useful in antibody-directed therapy using an prodrug and an enzyme that is bound by the antibody to the site of action and capable of converting the prodrug into an active substance at the site of action ADEPT (antibody directed enzyme prodrug therapy), a process for their preparation, a pharmaceutical composition thereof and a two-component system comprising 1) an enzyme-antibody conjugate or antibody fragment, and 2) a compound of the invention. Said compounds are of particular interest as prodrugs of pharmacologically active substances in combination with carboxypeptidases G, in particular in combination with carboxypeptidase G2 (CPG2).

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Až dosud bylo nalezeno mnoho cytotoxických sloučenin, které jsou potenciálně použitelné při chemoterapii. Dusíkaté yperity tvoří důležitou skupinu takových cytotoxických sloučenin. Klinické použití těchto cytotoxických sloučenin obecně a dusíkatých yperitů zvláště bylo až dosud omezeno vzhledem k nedostatečné selektivitě cytotoxického účinku mezi nádorovými buňkami a normálními zdravými buňkami.To date, many cytotoxic compounds have been found that are potentially useful in chemotherapy. Nitrogen mustards form an important group of such cytotoxic compounds. The clinical use of these cytotoxic compounds in general and nitrogen mustards in particular has hitherto been limited due to the lack of selectivity of the cytotoxic effect between tumor cells and normal healthy cells.

Jedna z možností, jak překonat tento problém, spočívá v použití tak zvaných prekurzorů farmakologicky účinných látek, které jsou deriváty cytotoxických účinných látek, a to často relativně jednoduchými deriváty, a jejichž cytotoxický účinek je ve srovnání s účinkem mateřských účinných látek výrazně redukován. Bylo navrženo podávat pacientovi tyto prekurzory účinných látek v režimu, při kterém se prekurzor konvertuje na farmakologicky účinnou látku pouze v oblasti zamýšleného místa účinku.One way to overcome this problem is to use so-called pharmacologically active prodrugs, which are derivatives of cytotoxic drugs, often relatively simple derivatives, and whose cytotoxic effect is significantly reduced compared to that of the parent drugs. It has been proposed to administer these prodrugs to a patient in a regimen whereby the prodrug is converted to a pharmacologically active agent only in the region of the intended site of action.

Jeden z takových režimů spočívá ve vázání mateřského dusíkatého yperitu s aminokyselinou za vzniku prekurzoru účinné látky, který může být opět převeden na mateřský dusíkatý yperit v místě zamýšleného účinku působením enzymu. Tento režim může být realizován použitím konjugátu protilátka/enzym v kombinaci s prekurzorem účinné látky. Konjugát protilátka/enzym se vytvoří z protilátky, která je selektivní vůči nádoru, a enzymu, který konverzuje prekurzor účinné látky na samotnou cytotoxicky účinnou látku. V klinické praxi se pacientovi nejdříve podá uvedený konjugát protilátka/enzym a tento konjugát se ponechá vázat na nádor. Po uplynutí určité vhodné časové periody, umožňující vyloučení konjugátu protilátka/enzym ze zbývající části těla prosté nádorů, se pacientovi podá prekurzor cytotoxicky účinné látky. Konverze tohoto prekurzoru působením lokalizovaného enzymu na cytotoxickou účinnou látku probíhá takto převážně v oblasti nádoru. Takový systém je popsán v mezinárodní patentové přihlášce PCT/GB88/00181 publikované jako WO88/07378 a v patentu US 4,975,278.One such regimen is to bind the parent nitrogen mustard to the amino acid to form a prodrug which can be converted to the parent nitrogen mustard again at the site of the intended action by the enzyme. This regimen can be implemented using an antibody / enzyme conjugate in combination with a prodrug. The antibody / enzyme conjugate is formed from a tumor-selective antibody and an enzyme that converts the prodrug to a cytotoxic drug alone. In clinical practice, the patient is first administered said antibody / enzyme conjugate and allowed to bind to the tumor. After a suitable period of time to allow the exclusion of the antibody / enzyme conjugate from the rest of the body free of tumors, the patient is administered a precursor of a cytotoxic drug. The conversion of this precursor by the action of a localized enzyme to the cytotoxic active agent thus takes place predominantly in the tumor region. Such a system is described in International Patent Application PCT / GB88 / 00181 published as WO88 / 07378 and US Patent 4,975,278.

Známé prekurzory cytotoxicky účinných látek pro ADEPT štěpené CGP poskytují jako jejich mateřské účinné látky yperity s vázanou kyselinou benzoovou. Nicméně je zapotřebí, aby bylo možné štěpením karboxypeptidázami produkovat další účinné látky za účelem zvýšení terapeutické potence vůči nádorovým buňkám. Dále je třeba zvýšit selektivitu terapie ADEPT s CPG, tzn. zvýšit poměr toxicity vůči rakovinným buňkám k toxicitě vůči zdravým buňkám.Known precursors of cytotoxically active agents for ADPT cleaved by CGP provide mustard with bound benzoic acid as their parent active agents. However, it is desirable to be able to produce additional active compounds by cleavage with carboxypeptidases in order to increase therapeutic potency against tumor cells. Further, the selectivity of ADEPT therapy with CPG should be increased; increase the ratio of toxicity to cancer cells to that of healthy cells.

-1 CZ 287028 B6-1 CZ 287028 B6

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Vynález je založen na nalezení nových prekurzorů účinných látek pro použití při terapii ADEPT, které jsou štěpitelné karboxypeptidázami G a které takto poskytují významně účinnější cytotoxicky účinné látky, než jakými jsou produkty CPG-katalyzovaných reakcí. PG přirozeně působí jako enzym odbourávající foláty, které specificky hydrolyzuje kyselinu glutamovou a kyselinu asparagovou zfolátových derivátů (Sherwood, R. F. a kol., Eur. J. Biochem. (1985), 148, 447-453). Karboxypeptidázy G nerozpoznávají neklasické folátové analogické deriváty (Kalghatgi, K. K. a kol., Cancer Research (1979), 39, 3441-3445) a jsou proto považovány v ohledu specifikujícím specifičnost k substrátu za konzervativní. S překvapením bylo zjištěno, že prekurzory účinných látek podle vynálezu představují substráty pro karboxypeptidázy G, jakými jsou CPG1, avšak zejména CPG2. Enzym CPG2 je expopeptidázou specifickou pro Lglutamát. Je známé hydrolyzovat zbytek kyseliny glutamové od kyseliny listové a jejích analogů a kyseliny glutamyl-p-aminobenzoové štěpením v úrovni -CO-NH- parciální struktury aromatický kruh- CO-NH-Glu. V rámci vynálezu je parciální strukturou pro srovnávací účely aromatický kruh-X-CO-NH-Glu, ve které X znamená skupinu -NH-, -O- nebo CH₂-, čímž se změní vzdálenost mezi místem štěpení a aromatickým kruhem a distribuce elektronů podél vazby -CO-NH-, zejména v případě, kdy X znamená NH nebo O. Nemohlo být předem zřejmé, že karboxypeptidáza G2 bude schopna přizpůsobit se i těmto prostorovým a elektronovým rozdílům. Sloučeniny, ve kterých X znamená skupinu -CH₂-, byly popsány vChemical Abstracts 75 (5), 2. 8. 1971, abstract č. 36603m a v Karpavicius a kol., Izv. Acad. Nauk. SSSR, Ser Khim. č. 9, 1970, 2150-2153 (viz sloučeniny VI, VIII, IX a XI v tabulce 1).The invention is based on the discovery of novel prodrugs for use in the treatment of ADEPT which are cleavable by carboxypeptidase G and which thus provide significantly more potent cytotoxically active substances than the products of CPG-catalyzed reactions. PG naturally acts as a folate-degrading enzyme that specifically hydrolyzes glutamic acid and aspartic acid from folate derivatives (Sherwood, RF et al., Eur. J. Biochem. (1985), 148, 447-453). Carboxypeptidases G do not recognize non-classical folate analogous derivatives (Kalghatgi, KK et al., Cancer Research (1979), 39, 3441-3445) and are therefore considered conservative with respect to substrate specificity. Surprisingly, it has been found that the prodrugs of the present invention are substrates for carboxypeptidase G such as CPG1, but particularly CPG2. The CPG2 enzyme is an L-glutamate-specific expopeptidase. It is known to hydrolyze the glutamic acid residue from folic acid and its analogues and glutamyl-p-aminobenzoic acid by cleavage at the -CO-NH- level of the aromatic ring -CO-NH-Glu partial structure. Within the framework of the invention, the partial structure for comparison purposes is the aromatic ring-X-CO-NH-Glu in which X is -NH-, -O- or CH ₂ - thereby changing the distance between the cleavage site and the aromatic ring and electron distribution along the -CO-NH- bond, especially when X is NH or O. It could not be understood in advance that the carboxypeptidase G2 would be able to adapt to these spatial and electron differences. Compounds in which X is -CH ₂ - have been described in Chemical Abstracts 75 (5), Aug 2, 1971, abstract # 36603m and in Karpavicius et al., Izv. Acad. Nauk. USSR, Ser Khim. No. 9, 1970, 2150-2153 (see compounds VI, VIII, IX and XI in Table 1).

Předmětem vynálezu jsou sloučeniny, které jsou prekurzorovými substráty pro karboxypeptidázy G a které mají obecný vzorec IThe present invention provides compounds which are precursor substrates for carboxypeptidase G and having the general formula I

ve kterémin which

R¹ a R² každý nezávisle znamená atom chloru, atom bromu, atom jodu, skupinu OSO₂Me nebo OSCLfenyl, kde fenylový zbytek je případně substituován 1,2,3,4 nebo 5 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, skupinu -CN a skupinu -NO₂,R ¹ and R ² each independently represent chlorine, bromine, iodine, OSO ₂ Me or OSCLphenyl, wherein the phenyl moiety is optionally substituted with 1,2,3,4 or 5 substituents independently selected from the group consisting of alkyl containing 1 to 4 carbon atoms, halogen, -CN, and -NO ₂ ,

R^laaR^2a každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo halogenalkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,R ^{1a and} R ^2a each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a haloalkyl group having 1 to 4 carbon atoms,

R³ a R⁴ každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo halogenalkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,R ³ and R ⁴ each independently represent a hydrogen atom, a (C 1 -C 4) alkyl group or a (C 1 -C 4) haloalkyl group,

R^5a, R^5b, R^5c a R^5d každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, která případně obsahuje jednu dvojnou vazbu nebo jednu trojnou vazbu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, kyanoskupinu, skupinu -NH₂, skupinu -CONR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ mají níže uvedenýR ^5a , R ^5b , R ^5c and R ^5d each independently represent a hydrogen atom, a (C 1 -C 4) alkyl group optionally containing one double bond or one triple bond, a (C 1 -C 4) alkoxy group, a halogen atom, cyano, -NH ₂ , -CONR ⁷ R ⁸ , wherein R ⁷ and R ⁸ have the following

-2CZ 287028 B6 význam, skupinu -NH-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -N-(alkyl)₂, ve které každý alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a alkanoylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů nebo-2C-287028 B6, -NH-alkyl in which the alkyl moiety contains 1 to 4 carbon atoms, -N- (alkyl) ₂ in which each alkyl moiety contains 1 to 4 carbon atoms, and alkanoyl containing 2 to 4 carbon atoms Or 5 carbon atoms

R'^a a R^5b společně znamenajíR ^a and R ^5b together represent

a) alkylenovou skupinu obsahující 4 uhlíkové atomy, která případně má jednu dvojnou vazbu,(a) an alkylene group containing 4 carbon atoms optionally having one double bond,

b) alkylenovou skupinu obsahující 3 uhlíkové atomy nebo(b) an alkylene group containing 3 carbon atoms; or

c) skupinu -CH=CH-CH=CH- skupinu -CH=CH-CH₂- nebo skupinu -CH₂CH=CH-, přičemž každá z těchto skupin je případně substituována 1,2,3 nebo 4 substituenty z nichž každý je nezávisle zvolen z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, kyano-skupinu, nitro-skupinu, alkanoylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů a skupinu -CONR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ mají níže uvedené významy,c) -CH = CH-CH = CH- -CH = CH-CH ₂ - or -CH ₂ CH = CH-, each of which is optionally substituted with 1,2,3 or 4 substituents each is independently selected from the group consisting of (C 1 -C 4) alkyl, (C 1 -C 4) alkoxy, halogen, cyano, nitro, (C 2 -C 5) alkanoyl, and -CONR ⁷ R ⁸ , wherein R ⁷ and R ⁸ are as defined below,

X znamená atom kyslíku, skupinu NH nebo skupinu -CH₂-,X is O, NH or -CH ₂ -,

Y znamená atom kyslíku,Y is an oxygen atom,

Z znamená skupinu -V-W, ve které V znamená skupinu CH₂-T-, ve které T znamená skupinu -CHr-, -O-, -S-, -(SO)- nebo -(SO₂)-, s výhradou spočívající v tom, že když V jako druhý atom obsahuje atom síry nebo atom kyslíku, potom W je jiný než -COOH, přičemž uvedená skupina V případně dále nese na uhlíku jeden nebo dva substituenty Q¹ nebo/a Q², přičemž Q¹ a Q² každý nezávisle znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo atom halogenu nebo když Q¹ a Q² jsou vázány k přilehlým uhlíkovým atomům, potom mohou Q¹ a Q² dodatečně znamenat alkylenovou skupinu obsahující 3 nebo 4 uhlíkové atomy, která je případně substituována 1, 2, 3 nebo 4 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a atom halogenu, aZ represents a group -VW where V is -CH ₂ -T- in which T represents a group -CH, -O-, -S-, - (SO) - or - (SO ₂₎ -, with the proviso wherein when V as the second atom contains a sulfur or oxygen atom, then W is other than -COOH, wherein said V group optionally further carries on carbon one or two substituents Q ¹ and / or Q ² , wherein Q ¹ and Q ² each independently represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a halogen atom or when Q ¹ and Q ² are attached to adjacent carbon atoms, then Q ¹ and Q ^{2 may} additionally represent an alkylene group having 3 or 4 carbon atoms, which is optionally substituted with 1, 2, 3 or 4 substituents independently selected from the group consisting of (1-4C) alkyl and halogen, and

W znamenáW stands for

A) skupinu COOH,(A) the COOH group,

B) skupinu -(C=O)-O-R⁶, ve které R⁶ znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů nebo arylovou skupinu definovanou níže v C),B) - (C = O) -OR ⁶ , wherein R ⁶ is C 1 -C 6 alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl, or aryl as defined in C below,

C) skupinu -(C=O)-NR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ každý nezávisle znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů, arylovou skupinu, heteroarylovou skupinu připojenou k dusíku přes uhlík nebo aralkylovou skupinu obsahující 7 až 9 uhlíkových atomů, přičemž arylová skupina znamená fenylovou skupinu, heteroarylová skupina znamená 5nebo 6—člennou kruhovou skupinu obsahující 1 až 3 heteroatomy zvolené z množiny zahrnující atom dusíku a atom síry, samotný arylový zbytek, heteroarylový zbytek a arylový zbytek aralkylové skupiny může být na uhlíku substituován 1 až 4 substituenty zvolenými z množiny zahrnující skupinu -COOH, skupinu -OH, skupinu NH₂, skupinu -CH₂-NH₂, skupinu -(CH2)i_4-COOH, tetrazol-5-ylovou skupinu a skupinu -SO₃H a alky lový zbytek může případně nést methylovou skupinu,C) - (C = O) -NR ⁷ R ⁸ , wherein R ⁷ and R ⁸ each independently represent hydrogen or C 1 -C 6 alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl, aryl, heteroaryl a group attached to nitrogen via a carbon or a (C7 -C9) aralkyl group wherein the aryl group is a phenyl group, the heteroaryl group is a 5 or 6-membered ring group having 1 to 3 heteroatoms selected from nitrogen and sulfur, the aryl radical itself , the heteroaryl radical and the aryl radical of the aralkyl group may be substituted on carbon by 1 to 4 substituents selected from the group consisting of -COOH, -OH, NH ₂ , -CH ₂ -NH ₂ , - (CH 2) 1-4 -COOH, the tetrazol-5-yl group and the -SO ₃ H group and the alkyl radical may optionally carry a methyl group,

D) skupinu -SO₂NHR⁹, ve kterém R⁹ má význam uvedený pro R⁷ a navíc znamená skupinu -CF₃, skupinu -CH₂CF₃ nebo výše uvedenou arylovou skupinu,D) -SO ₂ NHR ⁹ in which R ⁹ is as defined for R ⁷ and in addition is -CF ₃ , -CH ₂ CF ₃ or the above-mentioned aryl group,

E) skupinu SO₃R¹⁰, ve které R¹⁰ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů,E) SO ₃ R ¹⁰ in which R ¹⁰ represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms,

F) skupinu PO₃R^I0R¹⁰, ve které symboly R¹⁰, které mohou být stejné nebo odlišné, mají výše uvedený význam,F) a group PO ₃ R ^I0 R ¹⁰ where R ^10, which may be the same or different, are as defined above,

G) tetrazol-5-ylovou skupinu,G) tetrazol-5-yl,

H) skupinu -CONH-SO₂Rⁿ, ve které R¹¹ znamenáH) -CONH-SO ₂ R ^n, in which R ¹¹ represents

a) cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 7 uhlíkových atomů,a) cycloalkyl group containing 3 to 7 carbon atoms,

b) alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, která je případně substituována substituenty zvolenými z množiny zahrnující níže definovanou arylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu CF₃ nebo atom halogenu ab) an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which is optionally substituted with substituents selected from the group consisting of an aryl group as defined below, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a CF ₃ group or a halogen atom; and

c) perfluoralkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, přičemž arylová skupina znamená fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu mající 1 až 5 substituentů, které jsou zvoleny z množiny zahrnující atom halogenu, skupinu -NO₂, skupinu -CF₃, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -NH₂, skupinu -NHCOCH₃, skupinu -CONH₂, skupinu -OCH₂COOH, skupinu -NH-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -N-(alkyl)₂, ve které každý alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -NHCOOalkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -OH, skupinu -COOH, skupinu -CN a skupinu -COO-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a skupinu -M-Het, ve které M znamená S, SO nebo SO₂ a Het znamená 5- nebo 6-členný heterocyklický aromatický kruh, který je připojen k M přes uhlíkový atom aromatického kruhu, přičemž uvedený aromatický kruh obsahuje 1, 2, 3 nebo 4 heteroatomy zvolené z množiny zahrnující atom kyslíku, atom dusíku a atom síry a je případně substituován na uhlíkových atomech kruhu 1, 2, 3 nebo 4 substituenty zvolenými z množiny zahrnující skupinu -OH, -SH, -CN, -CF₃, NH₂ a atom halogenu, s výhradou spočívající v tom, že do rozsahu sloučenin obecného vzorce I nespadají kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorpropyl)amino/fenyl/acetylamino)pentadiová, 5-methylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentadiové, kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentadiová,c) a perfluoroalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, wherein the aryl group is a phenyl group or a phenyl group having 1 to 5 substituents selected from the group consisting of halogen, -NO ₂ , -CF ₃ , alkyl of 1 to 6 C 4 -C 4 alkoxy, C 1 -C 4 alkoxy, -NH ₂ , -NHCOCH ₃ , -CONH ₂ , -OCH ₂ COOH, -NH-alkyl in which the alkyl moiety contains 1 to 4 carbon atoms atoms, -N- (alkyl) ₂ , in which each alkyl radical contains 1 to 4 carbon atoms, -NHCOOalkyl, wherein the alkyl radical contains 1 to 4 carbon atoms, -OH, -COOH, -CN, and a -COO-alkyl group in which the alkyl moiety contains 1 to 4 carbon atoms and a -M-Het group in which M represents S, SO or SO ₂ and Het represents a 5- or 6-membered heterocyclic aromatic ring which is attached to M through carbon an aromatic ring atom, wherein said aromatic ring contains 1, 2, 3 or 4 heteroatoms selected from oxygen, nitrogen and sulfur and is optionally substituted on ring carbon atoms with 1, 2, 3, or 4 substituents selected from the group consisting of -OH, -SH, -CN, -CF ₃ , NH _2, and a halogen atom, with the proviso that 2- (2- / 4- / bis- (2-chloropropyl) acid is excluded from the compounds of Formula I 5-methyl ester of 2- (2- / 4- / bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino) pentadioic acid, 2- (2- / 4- / bis- (amino) phenyl) 2-chloroethyl) amino (phenyl) acetylamino) pentadiene,

5-ethylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentadiové a kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)-4-karbamoylmáselná.2- (2- / 4- / Bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino) pentadienoic acid 5-ethyl ester and 2- (2- / 4- / bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl) acetylamino acid ) -4-Carbamoylbutyric acid.

Sloučeniny obecného vzorce I mají alespoň jeden asymetrický uhlíkový atom, který je uhlíkový atom nesoucí substituent -COOH v obecném vzorci I. Kromě toho sloučeniny obecného vzorce I v závislosti na významech obecných symbolů R¹, R², R³, R⁴, Q* a Q² mohou obsahovat další asymetrické uhlíkové atomy. Je samozřejmé, že vynález zahrnuje všechny takové formy sloučenin obecného vzorce I, včetně jejich racemických forem a individuálních optických izomerů, které mají využitelné fyziologické vlastnosti zde definovaných kompozic podle vynálezu, přičemž pro odborníka je známou skutečností, jakými způsoby mohou být takové izomery odděleny a jakými způsoby lze stanovit jejich fyziologické vlastnosti. Sloučeniny podle vynálezu mají výhodně konfiguraci L na uhlíkovém atomu nesoucím substituent -COOH v obecném vzorci I.Compounds of formula I have at least one asymmetric carbon atom, which is a carbon atom bearing the -COOH substituent in formula I. In addition, compounds of formula I, depending on the meanings of R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , Q * and Q ² may contain other asymmetric carbon atoms. It is to be understood that the invention encompasses all such forms of the compounds of formula I, including their racemic forms and individual optical isomers, having useful physiological properties of the compositions of the invention defined herein, and it is well known to those skilled in the art by what methods such isomers can be separated and their physiological properties can be determined by methods. The compounds of the invention preferably have the L configuration on the carbon atom bearing the -COOH substituent in Formula I.

Vynález zahrnuje i soli sloučenin obecného vzorce I. Je třeba uvést, že pro farmaceutické použití musí být tyto soli farmaceuticky přijatelné, i když ostatní soli mohou být použity například přiThe invention also includes salts of the compounds of formula I. It should be noted that for pharmaceutical use these salts must be pharmaceutically acceptable, although other salts may be used, for example, in

-4CZ 287028 B6 přípravě sloučenin obecného vzorce I a jejich farmaceuticky přijatelných solí. Také mohou být připraveny polymorfní formy sloučenin podle vynálezu a tyto formy rovněž tvoří součást vynálezu.The preparation of compounds of formula (I) and pharmaceutically acceptable salts thereof. Polymorphic forms of the compounds of the invention may also be prepared and form part of the invention.

V případě, že některý ze zde uvedených obecných substituentů obsahuje alkylovou skupinu, potom takovou skupinou může být přímá nebo rozvětvená alkylová skupina. V případě, že některý ze zde uvedených obecných substituentů znamená nebo obsahuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, potom taková skupina výhodně obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy a znamená například methylovou skupinu, ethylovou skupinu, n-propylovou skupinu nebo isopropylovou skupinu, výhodně methylovou skupinu a ethylovou skupinu, avšak zejména methylovou skupinu. V případě, že některý ze zde uvedených obecných substituentů znamená nebo obsahuje alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, potom takovou skupinou může například být methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina nebo isopropylová skupina, výhodně methylová skupina a ethylová skupina, avšak zejména methylová skupina.When any of the general substituents mentioned herein contains an alkyl group, such a group may be a straight or branched alkyl group. When any of the general substituents mentioned herein represents or contains an alkyl group containing 1 to 6 carbon atoms, such group preferably contains 1 to 4 carbon atoms and is, for example, methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl, preferably methyl and ethyl, but especially methyl. When one of the general substituents mentioned herein denotes or contains an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, it may be, for example, methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl, preferably methyl and ethyl, but especially methyl.

Výhodnými významy pro obecné symboly R¹ a R² jsou atom jodu, atom bromu, atom chloru, skupina OSO2Me a OSO2-fenyl, kde fenyl je substituován 1 nebo 2 (zejména 1) substituenty, které zde byly definovány, v poloze 2 nebo/a v poloze 4. Obzvláště výhodnými významy obecných symbolů R¹ a R² jsou atom jodu, atom bromu, atom chloru a skupina -SO2Me. Výhodným významem obecných symbolů R^la a R^2a je atom vodíku nebo skupina -CH₃, avšak zejména atom vodíku.Preferred values for general R ¹ and R ² are iodine, bromine, chlorine, a group OSO2 and OSO2 phenyl wherein phenyl is substituted with 1 or 2 (especially 1) substituents as defined herein, in position 2 and / or and at position 4. Especially preferred meanings of the symbols R ¹ and R ² are iodine, bromine, chlorine and -SO 2 group. A preferred value of R ^1a and R ^2a is hydrogen or -CH ₃ , but especially hydrogen.

Výhodnými významy obecných symbolů R³ a R⁴ jsou atom vodíku, methylová skupina a skupina CF₃, avšak zejména atom vodíku.Preferred meanings of the symbols R ³ and R ⁴ are hydrogen, methyl and _CF3, but especially hydrogen.

Výhodnými významy obecných symbolů R^5a až R^5d jsou atom vodíku, atom fluoru, atom chloru, methylová skupina, skupina -CONH₂ a skupina CN. V případě, že existuje substituce na fenylovém kruhu tak, že alespoň jeden z R'^a, R^5b, R^5c a R'^d je jiný než atom vodíku, potom je výhodné, když pouze jeden nebo dva z R^5a, R^5b, R^3C a R^5d jsou jiné než atom vodíku. Za těchto okolností je dále výhodné, když R^5b a R^5d znamenají atom vodíku a když R^3a nebo/a R^5c jsou jiné než atom vodíku.Preferred meanings of R ^5a to R ^5d are hydrogen, fluorine, chlorine, methyl, -CONH _2, and CN. In case there is substitution on the phenyl ring such that at least one of R ^a, R ^5b, R ^5c and R ^d is other than hydrogen, it is preferred that only one or two of R ^5a, R ^5b, R ^3C and R ^5d are other than hydrogen. In these circumstances, it is further preferred that R ^5b and R ^5d are hydrogen and that R ^3a and / or R ^5c are other than hydrogen.

Výhodnými významy obecných symbolů X jsou atom kyslíku nebo skupinu NH, zejména atom kyslíku. V rámci jiného provedení vynálezu je obzvláště výhodné, jestliže X znamená skupinu NH.Preferred meanings of X are oxygen or NH, especially oxygen. In another embodiment of the invention, it is particularly preferred that X is NH.

Výhodným významem obecného symbolu V je skupina -CH₂-CH2-. V rámci dalšího provedení podle vynálezu je výhodným významem obecného symbolu V v případě, že W znamená tetrazol5-ylovou skupinu, skupina -CH₂-S-A preferred value for V is -CH ₂ -CH _{2 -} . In another embodiment of the present invention, when V is tetrazol-5-yl, -CH ₂ -S-

V případě, že W znamená skupinu podle C), potom je arylovou skupinou výhodně substituovaná fenylová skupina a heteroarylovou skupinou je výhodně 5- nebo 6-členný kruh obsahující 1 nebo 2 heteroatomy, jakými jsou výhodně atomy dusíku, jakým je pyridylový nebo pyrimidinylový kruh. Výhodnými substituenty samotného arylového zbytku, heteroarylové zbytku nebo arylového zbytku aralkylové skupiny jsou skupina -COOH, skupina -CH₂-COOH nebo tetrazol-5-ylová skupina.When W represents a group according to C), the aryl group is preferably a substituted phenyl group and the heteroaryl group is preferably a 5- or 6-membered ring containing 1 or 2 heteroatoms, such as preferably nitrogen atoms, such as a pyridyl or pyrimidinyl ring. Preferred substituents of the aryl radical, heteroaryl radical or aryl radical of the aralkyl group are -COOH, -CH ₂ -COOH or tetrazol-5-yl.

V případě, že W znamená skupinu podle Hb), kde W znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, která je případně substituována arylovým zbytkem, potom je případně substituovanou arylovou skupinou výhodně fenylová skupina substituovaná skupinou -CONH₂, skupinou -OCHr-COOH nebo/a skupinou -COOH, avšak zejména nesubstituovaná fenylová skupina.In the case where W represents a group according to Hb), wherein W represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which is optionally substituted by an aryl radical, then the optionally substituted aryl group is preferably a phenyl group substituted by -CONH ₂ , -OCH 2 -COOH and / or -COOH, but especially unsubstituted phenyl.

-5CZ 287028 B6-5GB 287028 B6

V případě, že W znamená skupinu podle I), potom Het výhodně znamená 5- nebo 6-členný heterocyklický aromatický kruh obsahující 1, 2, 3 nebo 4 dusíkové atomy. Výhodně je dusík jediným přítomným heteroatomem v kruhu. Specifické skupiny takto zahrnují pyridylovou skupinu, pyrrolylovou skupinu, 1, 2,3-triazinylovou skupinu a 1,2,4-triazinylovou skupinu.When W represents a group according to I), Het preferably represents a 5- or 6-membered heterocyclic aromatic ring containing 1, 2, 3 or 4 nitrogen atoms. Preferably, nitrogen is the only heteroatom present in the ring. Specific groups thus include a pyridyl group, a pyrrolyl group, a 1,2,3-triazinyl group and a 1,2,4-triazinyl group.

Obzvláštními významy obecného symbolu W jsou významy uvedené v A), B), ), E), F), G) a I) a výhodnými významy obecného symbolu W jsou významy uvedené v A), B), C), G) a I), kteréžto významy byly detailně vymezeny výše.Particular meanings of W are as defined in A), B),), E), F), G) and I) and preferred meanings of W are as defined in A), B), C), G) and I), which meanings have been defined in detail above.

Zvláštnější významy obecného symbolu W jsou:The more specific meanings of the general symbol W are:

-COOH,-COOH,

-CONH₂,-CONH ₂ ,

-CONHR⁸, kde R⁸ má výše definovaný význam, zejména kde R⁸ znamená fenylovou skupinu, tetrazol-5-yl,-CONHR ⁸ , wherein R ⁸ is as defined above, especially wherein R ⁸ is phenyl, tetrazol-5-yl,

-CONH-SO2R¹¹, kde R¹¹ má významy podle výše uvedených definic b) a c) a-CONH-SO ² R ¹¹ , wherein R ¹¹ is as defined in b) and c) above

-M-Het, kde M znamená atom síry a Het znamená 5-členný heterocyklický aromatický kruh se 3 nebo 4 heteroatomy, který je případně substituován na uhlíku, když heterocyklický kruh obsahuje 3 heteroatomy, atomem halogenu nebo kyano-skupinou.-M-Het wherein M represents a sulfur atom and Het represents a 5-membered heterocyclic aromatic ring with 3 or 4 heteroatoms optionally substituted on carbon when the heterocyclic ring contains 3 heteroatoms, a halogen atom or a cyano group.

V případě, že W znamená skupinu -CONH-SO₂R^h, ve které R¹¹ znamená perfluoralkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, potom má tato perfluoralkylová skupina výhodně 1 až 4 uhlíkové atomy, zejména 1 nebo 2 uhlíkové atomy.When W represents a -CONH-SO ₂ R ^h group in which R ¹¹ represents a perfluoroalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, the perfluoroalkyl group preferably has 1 to 4 carbon atoms, in particular 1 or 2 carbon atoms.

Zvláštnějšími významy obecného symbolu W jsou skupina -COOH, tetrazol-5-ylová skupina nebo skupina -CONH-aryl, ve které má arylový zbytek význam uvedený ve výše uvedené definici C). V tomto kontextu arylová skupina výhodně znamená substituovanou fenylovou skupinu, přičemž výhodnými substituenty v tomto případě jsou skupina -COOH, skupina -CH2COOH nebo tetrazol-5-ylová skupina.More specific values of W are -COOH, tetrazol-5-yl or -CONH-aryl, in which the aryl radical is as defined in the above definition C). In this context, an aryl group preferably represents a substituted phenyl group, with preferred substituents in this case being -COOH, -CH 2 COOH or tetrazol-5-yl.

Výhodnými specifickými sloučeninami podle vynálezu, pokud jde o jejich použitelnost v terapii ADEPT, jsou:Preferred specific compounds of the invention with respect to their utility in ADEPT therapy are:

kyselina (S)-2-(4-/bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino)-4-(lH-l,2,3,4-tetrazol-5yl)máselná a její soli, kyselina N-(4-/bis(2-chlorethyl)amino/-3-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamová a její soli, kyselina N-(4-/bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamová a její soli, přičemž obzvláště výhodnou sloučeninou je kyselina N-(4-/bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová a její soli. Dalšími výhodnými sloučeninami, které při testech vykazovaly dobrou účinnost, jsou kyselina N-(4/bis-(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová a její soli a gama-(3,5-dikarboxy)anilidem kyseliny 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové a jeho soli.(S) -2- (4- / bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonylamino) -4- (1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl) butyric acid and its salts, N- (4- (bis (2-chloroethyl) amino) -3-fluorophenylcarbamoyl) -L-glutamic acid and its salts, N- (4- / bis (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L-glutamic acid and its salts, with particularly preferred the compound is N- (4- [bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid and its salts. Other preferred compounds which have shown good activity in the tests are N- (4 / bis- (2-iodoethyl) amino / phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid and its salts and gamma- (3,5-dicarboxy) anilide 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid and its salts.

Zajímavé specifické podskupiny sloučenin podle vynálezu mohou být získány zvolením libovolné z výše uvedených specifických nebo generických definic obecných symbolů R¹ a R⁴, R^5a až R^5d, X, Y, W, Q¹ nebo Q² a to buď samostatně nebo v kombinaci s libovolnou další specifickou nebo generickou definicí obecných symbolů R¹ až R⁴, R^5a až R^?d, X, Y, W, Q¹ nebo Q² a to buď samostatně nebo v kombinaci s libovolnou další specifickou nebo generickou definicí obecných symbolů R¹ až R⁴, R^5a až R^5d, X, Y, W, Q¹ nebo Q².Interesting specific subgroups of compounds of the invention may be obtained by selecting any of the above specific or generic definitions of R ¹ and R ⁴ , R ^5a through R ^5d , X, Y, W, Q ¹ or Q ² , either alone or in combination with any other specific or generic definition of the general symbols R ¹ to R ⁴ , R ^5a to R ^7d , X, Y, W, Q ¹ or Q ² , either alone or in combination with any other specific or generic definition of the general symbols R ¹ to R ⁴ , R ^5a to R ^5d , X, Y, W, Q ¹ or Q ² .

-6CZ 287028 B6-6GB 287028 B6

Navíc jsou farmakologicky účinné látky produkované CPG-štěpením testovaných sloučenin podle vynálezu v rámci účinné terapie ADEPT méně stabilní za fyziologických podmínek, než známé léčivové produkty reakcí katalyzovaných CPG2. Tato snížená stabilita zaručuje nižší toxicitu pro zdravé buňky, než je tomu v případě léčiv majících stabilitu, která je obdobná se stabilitou známých produktů reakcí katalyzovaných CPG v rámci terapie ADEPT, a to v případě, kdy určité množství účinné látky produkované v nádorovém místě uniká do celkového krevního oběhu. Provedené testy ukázaly, že dokonce 15 minut po intravenózním podání účinné látky (jde o účinnou látku a nikoliv o její prekurzor) nebylo možné tuto účinnou látku v krevní plazmě detekovat.In addition, the pharmacologically active substances produced by CPG-cleavage of the test compounds of the invention are less stable under physiological conditions in the effective therapy of ADEPT than the known drug products of CPG2-catalyzed reactions. This reduced stability guarantees lower toxicity to healthy cells than drugs having stability that is similar to the known CPG catalysed reaction products in ADEPT therapy when a certain amount of active substance produced at the tumor site leaks into total blood circulation. The tests carried out showed that even 15 minutes after intravenous administration of the active substance (it is the active substance and not its precursor) it was not possible to detect the active substance in the blood plasma.

Sloučeniny podle vynálezu tvoří soli s různými anorganickými a organickými kyselinami a bázemi a tyto soli tvoří rovněž součást vynálezu. Uvedené soli zahrnují amonné soli, soli alkalických kovů, jako sodné a draselné soli, solí kovů alkalických zemin, jako vápenaté a hořečnaté soli, soli s organickými bázemi, například dicyklohexylaminové soli a N-methyl-Dglukaminové soli, soli s aminokyselinami, jakými jsou arginin, lysin, a podobně. Také mohou být připraveny soli s organickými a anorganickými kyselinami, jakými jsou například kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina methansulfonová, kyselina toluensulfonová a kyselina kafrsulfonová. Výhodně jsou těmito kyselinami silné kyseliny mající pK_a menší nebo rovnou 2 a zejména mající pK_a menší nebo rovnou 1. Výhodné jsou fyziologicky přijatelné soli, i když užitečné jsou i ostatní soli, například pro izolaci nebo přečištění získaných produktů.The compounds of the invention form salts with various inorganic and organic acids and bases, and these salts also form part of the invention. Said salts include ammonium salts, alkali metal salts such as sodium and potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium salts, salts with organic bases such as dicyclohexylamine salts and N-methyl-D-glucamine salts, amino acid salts such as arginine , lysine, and the like. Salts with organic and inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, toluenesulfonic acid and camphorsulfonic acid can also be prepared. Preferably, these acids are strong acids having a pK _and less than or equal to 2, and especially having a pK _and less than or equal to 1. Physiologically acceptable salts are preferred, although other salts are also useful, for example, for isolating or purifying the products obtained.

Tyto soli mohou být připraveny konvenčními způsoby, například reakcí produktu ve formě volné báze nebo volné kyseliny s jedním nebo více ekvivalenty příslušné kyseliny nebo příslušné báze v rozpouštědle nebo v prostředí, ve kterém je vytvořená sůl nerozpustná, nebo v rozpouštědle, jakým je voda, která se potom odstraní za vakua nebo lyofilizací, nebo výměnou kationtu jedné soli za jiný kation na vhodné iontoměničové pryskyřici.These salts may be prepared by conventional means, for example by reacting the free base or free acid product with one or more equivalents of the appropriate acid or base in a solvent or environment in which the salt formed is insoluble or in a solvent such as water which is then removed under vacuum or lyophilization, or by exchanging one salt cation for another cation on a suitable ion exchange resin.

Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I a jejich solí, jehož podstata spočívá v odstranění ochranných skupin ve sloučenině obecného vzorce laThe present invention further provides a process for the preparation of compounds of the formula I and their salts, which comprises removing the protecting groups in a compound of the formula Ia.

ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a, R^5b, R^5c, R^sd, X, Y, Q¹ a Q² mají výše uvedené významy a Z¹ znamená výše definovaný Z s výhradou spočívající v tom, že když W znamená karboxylovou skupinu, potom je tato skupina přítomna v chráněné formě (jako Pr²) a Pr¹ rovněž znamená karboxylovou skupinu v chráněné formě (může být stejná s Pr² nebo odlišná od Pr²), a v případném převedení takto získané sloučeniny obecného vzorce na její sůl.wherein R ¹ , R ² , R ^1a , R ^2a , R ³ , R ⁴ , R ^5a , R ^5b , R ^5c , R ^d , X, Y, Q ¹ and Q ² are as defined above and Z ¹ is as defined above defined by Z with the proviso that when W represents a carboxyl group, this group is present in a protected form (such as Pr ² ) and Pr ¹ also represents a carboxyl group in a protected form (may be the same as Pr ² or different from Pr ² ), and optionally converting the thus obtained compound of the formula to a salt thereof.

Pr¹ a Pr² mohou takto například znamenat benzyloxykarbonylové skupiny, terc.butyloxykarbonylové skupiny, 2-(trimethylsilyl)ethylesterové skupiny, dimethyl-terc.butylsilylesterové skupiny, difenylmethylesterové skupiny, tetrahydropyranesterové skupiny, methoxyethoxymethylesterové skupiny nebo benzyloxymethylesterové skupiny nebo jiné obecně známé ochranné skupiny karboxylové funkce, například esterotvomé ochranné skupiny, přičemž odstranění těchto ochranných skupin se provádí hydrogenolýzou nebo kyselou katalýzou (Greene, T. W. a Wuts, P. G. M. in Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vyd. WileyInterscience, 1990).For example, Pr ¹ and Pr ² may be benzyloxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl, 2- (trimethylsilyl) ethyl ester, dimethyl tert-butylsilyl ester, diphenylmethyl ester groups, tetrahydropyranester groups, methoxyethoxymethyl ester groups or benzyloxymethyl ester groups or other known carboxymethyl ester groups functions, such as ester-forming protecting groups, and removal of these protecting groups is accomplished by hydrogenolysis or acid catalysis (Greene, TW and Wuts, PGM in Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed. WileyInterscience, 1990).

V případě, že Pr¹ nebo/a Pr² znamená benzyloxykarbonylovou skupinu, potom se odstranění ochranné skupiny výhodně provádí hydrogenací. Tato hydrogenace může být provedena libovolným vhodným způsobem, například v přítomnosti platiny nebo Raneyova niklu, avšak výhodně se tato hydrogenace provádí za použití hydrogenačního katalyzátoru tvořeného paladiem na uhlí. Hydrogenace se výhodně provádí v přítomnosti inertního rozpouštědla, výhodně v přítomnosti aprotického rozpouštědla, zejména v přítomnosti ethylacetátu, tetrahydrofuranu nebo polárního aprotického rozpouštědla, jakým je dimethylformamid, výhodně při teplotě 0 až 100 °C, výhodněji při teplotě 15 až 50 °C a zejména při okolní teplotě. Hydrogenace se výhodně provádí po dobu 1 až 24 hodin.Where Pr ¹ and / or Pr ² is a benzyloxycarbonyl group, the deprotection is preferably carried out by hydrogenation. The hydrogenation can be carried out in any suitable manner, for example in the presence of platinum or Raney nickel, but preferably the hydrogenation is carried out using a palladium-on-carbon hydrogenation catalyst. The hydrogenation is preferably carried out in the presence of an inert solvent, preferably in the presence of an aprotic solvent, in particular in the presence of ethyl acetate, tetrahydrofuran or a polar aprotic solvent such as dimethylformamide, preferably at 0 to 100 ° C, more preferably at 15 to 50 ° C. ambient temperature. The hydrogenation is preferably carried out for 1 to 24 hours.

V případě, že Pr¹ nebo/a Pr² znamená terc.butyloxykarbonylovou skupinu, potom může být odstranění ochranných skupin provedeno v přítomnosti kyseliny, výhodně v přítomnosti silné kyseliny, jakou je kyselina trifluoroctová, kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina jodovodíková nebo kyselina mravenčí. V případě, že je žádoucí použít rozpouštědlo, potom jsou výhodnými rozpouštědly inertní aprotická rozpouštědla, jako methylenchlorid nebo diethylether. Reakce se vhodně provádí při teplotě 0 až 100 °C, vhodněji při teplotě 0 až 30 °C a zejména při okolní teplotě.Where Pr ¹ and / or Pr ² is a tert-butyloxycarbonyl group, deprotection may be carried out in the presence of an acid, preferably in the presence of a strong acid such as trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid or formic acid . If it is desired to use a solvent, preferred solvents are inert aprotic solvents such as methylene chloride or diethyl ether. The reaction is suitably carried out at a temperature of 0 to 100 ° C, more preferably at a temperature of 0 to 30 ° C, and especially at ambient temperature.

Sloučeniny obecného vzorce la, ve kterém X znamená atom kyslíku a Y znamená atom kyslíku, a jejich soli mohou být připraveny tak, že se sloučenina obecného vzorce IICompounds of formula Ia in which X is oxygen and Y is oxygen, and salts thereof may be prepared by reacting a compound of formula II

(II), ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a, R^5b, R^5c a R^5d mají výše uvedené významy, X znamená atom kyslíku, Y znamená atom kyslíku a L znamená odlučitelný atom nebo odlučitelnou skupinu, uvede v reakci se sloučeninou obecného vzorce III(II) wherein R ¹ , R ² , R ^1a , R ^2a , R ³ , R ⁴ , R ^5a , R ^5b , R ^5c and R ^5d are as defined above, X is an oxygen atom, Y is an oxygen atom, and L is a separable atom or a separable group, reacted with a compound of formula III

Pr¹ Pr ¹

IAND

NH₂-CH-Z' (III), ve kterém Pr¹ a Z¹ mají výše uvedené významy, za vzniku sloučeniny obecného vzorce la, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce la případně převede na její sůl. Výhodně L znamená atom chloru, atom bromu, atom jodu, 4-nitrofenoxy-skupinu. Vhodně se reakce provádí v přítomnosti rozpouštědla při teplotě -10 až 100 °C, a výhodně se tato reakce provádí při teplotě 20 až 50 °C.NH ₂ -CH-Z '(III), in which Pr ¹ and Z ¹ have the meanings given above, to give a compound of formula Ia, then optionally converting the compound of formula Ia to a salt thereof. Preferably L is chlorine, bromine, iodine, 4-nitrophenoxy. Suitably the reaction is carried out in the presence of a solvent at a temperature of -10 to 100 ° C, and preferably this reaction is carried out at a temperature of 20 to 50 ° C.

Výhodně se reakce provádí v přítomnosti organického rozpouštědla (zejména chloroformu, ethylacetátu, toluenu, dimethylformamidu a methylenchloridu, výhodně při teplotě 5 až 50 °C a výhodně po dobu 1 až 24 hodin. Sloučeniny obecného vzorce II tvoří také součást vynálezu, přičemž tyto sloučeniny mohou být například připraveny reakcí odpovídajícího fenolu obsahujícího anilinoyperitovou skupinu buď s arylchlorformiátem, například nitrofenylPreferably the reaction is carried out in the presence of an organic solvent (especially chloroform, ethyl acetate, toluene, dimethylformamide and methylene chloride, preferably at a temperature of 5 to 50 ° C and preferably for a period of 1 to 24 hours). be prepared, for example, by reacting the corresponding anilinoyperite-containing phenol with either an aryl chloroformate, for example nitrophenyl

-8CZ 287028 B6 chlorformiátem (zejména 4-nitrofenylchlorformiátem) nebo s fosgenem za vzniku sloučeniny obecného vzorce II.287028 B6 with chloroformate (especially 4-nitrophenylchloroformate) or with phosgene to form a compound of formula II.

Reakce se výhodně provádí v přítomnosti organického rozpouštědla (zejména ethylacetátu nebo chloroformu), výhodně při teplotě 15 až 50 °C (zejména při okolní teplotě), výhodně po dobu 1 až 10 hodin.The reaction is preferably carried out in the presence of an organic solvent (especially ethyl acetate or chloroform), preferably at a temperature of 15 to 50 ° C (especially at ambient temperature), preferably for 1 to 10 hours.

Sloučeniny obecného vzorce III, ve kterém W znamená výše definovanou skupinu C), mohou být připraveny ze sloučenin obecného vzorce III, ve kterém W znamená výše definovanou skupinu B) za použití standardních reakčních podmínek. Výhodné reakční podmínky zahrnují reakci s dusíkatými nukleofilními činidly (zejména s amoniakem nebo primárním nebo sekundárním aminem), výhodně při teplotě 25 až 50 °C a výhodně po dobu asi 24 hodin.Compounds of formula III in which W is a group C as defined above may be prepared from compounds of formula III in which W is a group B) as defined above using standard reaction conditions. Preferred reaction conditions include reaction with nitrogenous nucleophilic agents (especially ammonia or a primary or secondary amine), preferably at a temperature of 25 to 50 ° C and preferably for about 24 hours.

Sloučeniny obecného vzorce III, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, mohou být připraveny zodpovídajícího nitrilu známými postupy, například postupem popsaným W. G. Finneganem a kol. v JACS, 80, 1978,3909, a následným odstraněním ochranné skupiny aminové funkce (Pr³) za vzniku sloučenin obecného vzorce III, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu.Compounds of formula III in which W represents a tetrazol-5-yl group may be prepared from the corresponding nitrile by known methods, for example as described by WG Finnegan et al. in JACS, 80, 1978, 3909, followed by deprotection of the amino function (Pr ³ ) to give compounds of formula III wherein W is tetrazol-5-yl.

Sloučeniny obecného vzorce ΙΠ, ve kterém W znamená výše definovanou skupinu I), mohou být připraveny redukcí sloučenin obecného vzorce XV, který je definován dále, na odpovídající primární alkohol za použití standardních reakčních podmínek (zejména za použití diboranu nebo směsného anhydridu a následné redukce borohydridem sodným). Odpovídající primární alkohol se konvertuje standardními postupy, například za použití methansulfonylchloridu a trimethylaminu při teplotě 0 °C v přítomnosti methylenchloridu, na odlučitelnou skupinu, jakou je atom bromu, atom jodu nebo mesylátová skupina, přičemž tato skupina se vytěsní skupinou obecného vzorce XVICompounds of formula ΙΠ in which W is a group I as defined above may be prepared by reduction of compounds of formula XV, as defined below, to the corresponding primary alcohol using standard reaction conditions (particularly using diborane or mixed anhydride followed by reduction with borohydride sodium). The corresponding primary alcohol is converted by a standard procedure, for example using methanesulfonyl chloride and trimethylamine at 0 ° C in the presence of methylene chloride, to a separable group such as bromine, iodine or mesylate, displaced by XVI

HS-Het (XVI), ve kterém Het má výše uvedený význam pro W = I), čímž se po zpracování za oxidačních podmínek získají sloučeniny obecného vzorce XVIIHS-Het (XVI), in which Het is as defined above for W = I), to give compounds of formula XVII after treatment under oxidizing conditions

Pr³ Pr ³

IAND

Pr¹ - CH-Z¹ (XVII), ve kterém Z¹¹¹ znamená výše definovaný Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená -S-Het, ~(S=O)-Het nebo -SCL-Het a Pr¹ a Pr³ jsou chráněnými karboxylovými skupinami resp. skupinami -NH₂, které byly definovány výše. Vhodné oxidační podmínky zahrnují působení oxidačního činidla, zejména působení kyseliny 3-chlorperbenzoové. Odstranění ochranné skupiny -NH₂ ve sloučeninách obecného vzorce XVII se provádí za výše definovaných standardních podmínek za vzniku sloučeniny obecného vzorce III, ve kterém W znamená výše definovanou skupinu I).Pr ¹ - CH-Z ¹ (XVII), wherein Z ¹¹¹ is Z as defined above, with the proviso that W represents -S-Het, ~ (S = O) -Het or -SCL-Het and Pr ¹ and Pr ³ are protected carboxyl groups respectively. -NH ₂ groups as defined above. Suitable oxidation conditions include treatment with an oxidizing agent, in particular treatment with 3-chloroperbenzoic acid. Removal of the -NH ₂ protecting group in compounds of formula XVII is carried out under the standard conditions defined above to give a compound of formula III in which W is a group I) as defined above.

Sloučeniny obecného vzorce la, ve kterém X znamená skupinu NH a Y znamená atom kyslíku, a jejich soli mohou být připraveny tak, že se sloučenina obecného vzorce IVCompounds of formula Ia in which X is NH and Y is oxygen, and salts thereof may be prepared by reacting a compound of formula IV

-9CZ 287028 B6 (IV),-9EN 287028 B6 (IV)

ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴ a R^5a až R^5d mají výše uvedené významy, nebo její sůl uvede v reakci s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce III za vzniku sloučeniny. Ia, načež se tato sloučenina případně převede na její sůl. Tato reakce může být například provedena v přítomnosti organického rozpouštědla, výhodně polárního aprotického rozpouštědla, zejména methylenchloridu nebo ethylacetátu, výhodně při okolní teplotě a výhodně po dobu asi 1 až 5 hodin.wherein R ¹ , R ² , R ^1a , R ^2a , R ³ , R ⁴ and R ^5a to R ^5d are as defined above, or a salt thereof reacts with a compound of formula III as defined above to form a compound. The compound is optionally converted to a salt thereof. This reaction may, for example, be carried out in the presence of an organic solvent, preferably a polar aprotic solvent, in particular methylene chloride or ethyl acetate, preferably at ambient temperature and preferably for about 1 to 5 hours.

Sloučeniny obecného vzorce IV a jejich soli mohou být připraveny tak, že se sloučeninaCompounds of formula (IV) and salts thereof may be prepared by compounding

(V), ve kterém(V) in which

R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴ a R^5a až R^5d mají výše uvedené významy, uvede v reakci se sloučeninou obecného vzorceR ¹ , R ² , R ^1a , R ^2a , R ³ , R ⁴ and R ^5a to R ^5d have the meanings given above, in reaction with a compound of the general formula

L'-(C=O)-L², ve kterém L¹ a L² znamenají odštěpitelné skupiny, za vzniku sloučeniny obecného vzorce IV. Významy L¹ a L² zahrnují atom chloru, skupinu CC1₃, imidazolylovou skupinu a aryloxyskupinu, zejména fenoxy-skupinu. Výhodně se reakce provádí v přítomnosti organického rozpouštědla, výhodně polárního aprotického rozpouštědla, zejména ethylacetátu, při teplotě 5 až 25 °C a po dobu asi 15 minut.L '- (C = O) -L ² , wherein L ¹ and L ² are leaving groups, to form a compound of formula IV. The meanings of L ¹ and L ² include chlorine, CCl ₃ , imidazolyl and aryloxy, especially phenoxy. Preferably, the reaction is carried out in the presence of an organic solvent, preferably a polar aprotic solvent, in particular ethyl acetate, at a temperature of 5 to 25 ° C and for about 15 minutes.

Sloučeniny obecného vzorce Ia, ve kterém X znamená skupinu -CH2- a Y znamená atom kyslíku, a jejich soli se připraví tak, že se sloučenina obecného vzorce II nebo její sůl, která byly definovány výše, s výhradou spočívající v tom, že X znamená skupinu -CH2-, Y znamená atom kyslíku a L výhodně znamená pentafluorfenoxy-skupinu, atom chloru, skupinu -O-(CO)-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 6 uhlíkových atomů, výhodně rozvětvenou alkylovou skupinu, zejména alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, a produkt odpovídající kyseliny fenyloctové obsahující anilino-yperit zreagovaný s karbodiimidem (zejména dicyklohexylkarbodiimidem) uvede v reakci svýše definovanou sloučeninou obecného vzorce III za standardních reakčních podmínek (například provedením reakce v přítomnosti polárního aprotického rozpouštědla, jakým je dimethylformamid, ethylacetát nebo tetrahydrofuran, poCompounds of formula (Ia) in which X is -CH2- and Y is oxygen, and salts thereof are prepared by reacting a compound of formula (II) or a salt thereof as defined above, with the proviso that X is -CH 2 -, Y is O and L preferably is pentafluorophenoxy, chloro, -O- (CO) -alkyl, wherein the alkyl moiety contains 1 to 6 carbon atoms, preferably a branched alkyl group, especially an alkyl group containing And the corresponding anilino-mustard reacted phenylacetic acid product with carbodiimide (especially dicyclohexylcarbodiimide) reacts with the above-defined compound of formula III under standard reaction conditions (e.g., by carrying out the reaction in the presence of a polar aprotic solvent such as dimethylformamide, ethyl acetate). or tetrahydrofuran, po

-10CZ 287028 B6 dobu 1 až 2 hodin při teplotě 20 až 50 °C za vzniku sloučeniny obecného vzorce la, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce la případně převede na její sůl.The mixture of formula (Ia) thus obtained is optionally converted to a salt thereof.

Sloučeniny obecného vzorce II mohou být připraveny za použití standardních postupů z odpovídajících fenyloctových sloučenin obsahující anilino-yperitovou skupinu.Compounds of formula (II) may be prepared using standard procedures from the corresponding phenylacetic compounds containing an anilino-mustard group.

Sloučeniny obecného vzorce la, ve kterém W znamená skupinu H) /(tj. skupinu -CONHSO2R¹¹), nebo její soli se připraví tak, že se sloučenina obecného vzorce III, který byl definován výše, s výhradou spočívající vtom, že W znamená pouze skupinu H), uvede v reakci svýše definovanou sloučeninou obecného vzorce II za použití o sobě známých reakčních podmínek za vzniku sloučeniny obecného vzorce la, ve kterém W znamená skupinu H), načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce la případně převede na její sůl. Tato reakce se výhodně provádí v přítomnosti organického rozpouštědla, výhodně polárního aprotického rozpouštědla, zejména ethylacetátu nebo dichlormethanu, výhodně při teplotě 5 až 50 °C, zejména při okolní teplotě, a výhodně po dobu 1 až 5 hodin.Compounds of formula Ia wherein W is H) / (i.e., -CONHSO 2 R ^11), or its salt is prepared by reacting a compound of formula III as defined above, with the proviso in the fact that W represents only reacting a compound of formula (II) with a compound of the formula (II) using reaction conditions known per se to form a compound of formula (Ia) in which W represents a group (H), then optionally converting the compound of formula (Ia) to a salt thereof. This reaction is preferably carried out in the presence of an organic solvent, preferably a polar aprotic solvent, in particular ethyl acetate or dichloromethane, preferably at a temperature of 5 to 50 ° C, especially at ambient temperature, and preferably for 1 to 5 hours.

Sloučeniny obecného vzorce III mohou být připraveny odstraněním ochranné skupiny aminové funkce ve sloučenině obecného vzorce XICompounds of formula III may be prepared by deprotection of the amine function in a compound of formula XI

Pr³ Pr ³

IAND

Pr¹ - CH-Z¹ (XI), ve kterém Pr¹ znamená karboxylovou skupinu ve výše definované chráněné formě, Pr³ znamená skupinu -NH2 v chráněné formě, zejména benzyloxykarbonylový derivát nebo ftalimido-derivát této skupiny, a Z¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená skupinu H), za o sobě známých reakčních podmínek, Čímž se získá sloučenina obecného vzorce III, ve kterém W znamená skupinu H), načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce III případně převede na její sůl. Tato reakce se výhodně provádí hydrogenací v přítomnosti paladia na uhlí a v organickém rozpouštědle, výhodně v polárním aprotickém rozpouštědle, zejména v ethylacetátu nebo tetrahydrofuranu, výhodně při okolní teplotě a výhodně po dobu 1 až 24 hodin. Uvedené odstranění ochranné skupiny může být rovněž výhodně provedeno v přítomnosti kyseliny bromovodíkové v kyselině octové, výhodně při okolní teplotě a výhodně po dobu 1 až 24 hodin.Pr ¹ -CH-Z ¹ (XI), wherein Pr ¹ is a carboxyl group in a protected form as defined above, Pr ³ is a -NH ² group in a protected form, in particular a benzyloxycarbonyl derivative or a phthalimido derivative thereof, and Z ¹ is as defined above with the proviso that W is a group H) under reaction conditions known per se to give a compound of the formula III in which W is a group H), whereupon the compound of the formula III thus obtained is optionally converted into her salt. This reaction is preferably carried out by hydrogenation in the presence of palladium on carbon and in an organic solvent, preferably in a polar aprotic solvent, in particular ethyl acetate or tetrahydrofuran, preferably at ambient temperature and preferably for 1 to 24 hours. Said deprotection can also be advantageously carried out in the presence of hydrobromic acid in acetic acid, preferably at ambient temperature and preferably for 1 to 24 hours.

Sloučeniny obecného vzorce XI mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce XVCompounds of formula XI may be prepared by reacting a compound of formula XV

Pr³ Pr ³

IAND

Pr¹ - CH-Z¹¹ (XV), ve kterém Pr¹ a Pr³ mají výše uvedené významy a Z¹¹ znamená výše uvedený obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená pouze skupinu COOH, se sloučeninou obecného vzorcePr ¹ - CH-Z ¹¹ (XV), wherein Pr ¹ and Pr ³ have the meanings given above and Z ¹¹ is the aforementioned general symbol Z, with the proviso that W represents only COOH, with a compound of the general formula

R¹¹SO₂NH₂ ve kterém R¹¹ má význam definovaný v definici W = H), za vzniku sloučeniny obecného vzorce XI, přičemž se použijí standardní reakční podmínky. Tyto standardní reakční podmínky zahrnují provedení reakce v inertním rozpouštědle, zejména v dichlormethanu, v přítomnosti karbodiimidu, zejména dicyklohexylkarbodiimidu, a báze, zejména 4-(N,N-dimethylamino)piperidinu.R ¹¹ SO ₂ NH ₂ wherein R ¹¹ is as defined in the definition of W = H) to give a compound of formula XI using standard reaction conditions. These standard reaction conditions include carrying out the reaction in an inert solvent, in particular dichloromethane, in the presence of a carbodiimide, in particular dicyclohexylcarbodiimide, and a base, in particular 4- (N, N-dimethylamino) piperidine.

-11CZ 287028 B6-11EN 287028 B6

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterém W znamená následující výše definované skupiny: D) (tj. -SO₂NHR⁹), E) (tj. -SO3R¹⁰) a F) (tj. -PO3R^I0R¹⁰), jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce XVIIIaAnother object of the invention is a process for preparing compounds of formula I wherein W represents the following groups as hereinbefore defined: D) (i.e. -SO ₂ NHR ^9), e) (i.e. -SO 3 R ¹⁰⁾ and F) (i.e. ^I0 -PO3R R ¹⁰ ), characterized in that the compound of formula XVIIIa

NH₂ INH ₂ I

HOOC-CH-Z¹¹¹¹ (XVIIIa), ve kterém Z¹¹¹¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená následující výše definované skupiny: D) (tj. -SO₂NHR⁹), E) (tj. -SO3R¹⁰) a F) (tj. -PO3R¹⁰R¹⁰), uvede v reakci svýše definovanou sloučeninou obecného vzorce II za standardních podmínek nebo s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce V za standardních podmínek, přičemž se získá sloučenina obecného vzorce I, ve kterém W znamená skupiny D), E) a F), načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl. Uvedené standardní podmínky zahrnují provedení reakce sbází, zejména s triethylaminem, v přítomnosti organického rozpouštědla, výhodně aprotického polárního rozpouštědla, zejména dichlormethanu, výhodně při okolní teplotě.HOOC-CH-Z ¹¹¹¹ (XVIIIa), wherein Z ¹¹¹¹ is Z as defined above, with the proviso that W is as defined above: D) (ie -SO ₂ NHR ⁹ ), E) (ie -SO ³ R ¹⁰ ) and F) (i.e. -PO ³ R ¹⁰ R ¹⁰ ), reacts with a compound of formula II as defined above under standard conditions or with a compound of formula V as defined above under standard conditions to obtain a compound of formula I, in which W represents groups D), E) and F), whereupon the compound of formula I thus obtained is optionally converted into a salt thereof. Said standard conditions include carrying out the reaction with a base, in particular triethylamine, in the presence of an organic solvent, preferably an aprotic polar solvent, especially dichloromethane, preferably at ambient temperature.

Sloučeniny obecného vzorce XVIIIa jsou známými sloučeninami (komerčně jsou dostupné u firmy Sigma Chemical Co.), nebo mohou být připraveny standardními metodami.Compounds of formula XVIIIa are known compounds (commercially available from Sigma Chemical Co.) or can be prepared by standard methods.

Sloučeniny výše definovaného obecného vzorce Ia, ve kterém X znamená skupinu NH nebo atom kyslíku, Y znamená atom kyslíku, R¹ a R² znamenají atom chloru, atom bromu, atom jodu nebo skupinu OSO₂Me, zejména atom chloru, R^la znamená atom vodíku, R^2a znamená atom vodíku, R³ znamená atom vodíku a R⁴ znamená atom vodíku, a jejich solí, jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce XIXCompounds of formula (Ia) as defined above in which X is NH or O, Y is O, R ¹ and R ² are chlorine, bromine, iodine or OSO ₂ Me, especially chlorine, R ^1a is atom hydrogen, R ^2a is a hydrogen atom, R ³ is a hydrogen atom, and R ⁴ is a hydrogen atom, and salts thereof, characterized in that the compound of formula XIX

HOHIM

HOHIM

(XIX), ve kterém R^5a až R^5d a Z¹ mají výše definované významy a X znamená atom kyslíku nebo skupinu NH, uvede v reakci buď s fosforečným halogenačním činidlem, jakým je zejména chlorid fosforečný, nebo s thionylchloridem v přítomnosti organického rozpouštědla, kterým je výhodně nepolární aprotické rozpouštědlo, zejména methylenchlorid, výhodně za zahřívání na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 1 až 2 hodin, zejména po dobu 90 minut, nebo s methylsulfonylchloridem v přítomnosti organického rozpouštědla, kterým je výhodně polární aprotické rozpouštědlo, zejména pyridin, za vzniku sloučeniny obecného vzorce Ia, ve kterém X znamená atom kyslíku nebo skupinu NH,(XIX), in which R ^5a to R ^5d and Z ¹ are as defined above and X represents an oxygen atom or an NH group, reacts either with a phosphorus halogenating agent such as phosphorus pentachloride or with thionyl chloride in the presence of an organic solvent, which is preferably a non-polar aprotic solvent, in particular methylene chloride, preferably under reflux for 1 to 2 hours, in particular 90 minutes, or with methylsulfonyl chloride in the presence of an organic solvent, which is preferably a polar aprotic solvent, in particular pyridine, to form a compound of formula (Ia) wherein X is O or NH,

Y znamená atom kyslíku, R¹ a R² znamenají atom bromu, atom jodu, skupinu OSO₂Me nebo atom chloru, R^la znamená atom vodíku, R^2a znamená atom vodíku, R³ znamená atom vodíku a R⁴ znamená atom vodíku, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce Ia převede na její sůl.Y is oxygen, R ¹ and R ² represent bromine, iodine, OSO ₂ Me or Cl, R ^la is hydrogen, R ^2a is hydrogen, R ³ is hydrogen and R ⁴ is hydrogen, then the compound of formula (Ia) thus obtained is converted to its salt.

V případě, že se použije methylsulfonylchlorid, mohou být hydroxy-skupiny ve sloučenině obecného vzorce XIX převedeny buď na atom chloru nebo/a na skupinu OSO₂Me v závislosti na použité reakční teplotě. Dichlorované sloučeniny (tj. když R¹ = R² = Cl) mohou být vhodněWhen methylsulfonyl chloride is used, the hydroxy groups in the compound of formula (XIX) can be converted either to a chlorine atom and / or to an OSO ₂ Me group depending on the reaction temperature used. Dichlorinated compounds (i.e., when R ¹ = R ² = Cl) may be suitably

-12CZ 287028 B6 získány provedením uvedené reakce při teplotě 70 °C po dobu 15 minut, zatímco odpovídající sloučenina, ve které R¹ znamená atom chloru a R² znamená skupinu OSO₂Me mohou být vhodně získány provedením reakce při teplotě 50 °C po dobu 10 minut.Obtained from carrying out said reaction at 70 ° C for 15 minutes, whereas the corresponding compound in which R ¹ represents a chlorine atom and R ² represents an OSO ₂ Me group can conveniently be obtained by carrying out the reaction at 50 ° C for a period of time 10 minutes.

V případě, že R¹ a R² znamenají atom bromu a R¹ a R² znamenají atom jodu, potom se methansulfonylchlorid výhodně nahradí methansulfonylanhydridem, čímž se eliminují problémy související s konkurencí halogenů při reakci. Sloučenina obecného vzorce XIX (0,002M) se rozpustí v chloroformu (30 ml). Při okolní teplotě se přidá triethylamin (1,12 ml) a methylsulfonylanhydrid (0,008M) a směs se míchá po dobu 2 hodin, načež se promyje vodou, ío Takto získaný produkt se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje a odpaří za vzniku oleje. Tento olej se rozpustí v bezvodém dimethylformamidu a k získanému roztoku se přidá lithiumbromid (nebo brom, 0,005M) a směs se míchá při teplotě 80 °C po dobu 2 hodin, načež se ochladí, nalije do vody a extrahuje etherem. Takto získaný produkt se vysuší nad síranem hořečnatým, zfiltruje, odpaří k suchu a přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií.When R ¹ and R ² are bromine and R ¹ and R ² are iodine, the methanesulfonyl chloride is preferably replaced with methanesulfonyl anhydride, eliminating the problems associated with the competition of halogens in the reaction. The compound of formula XIX (0.002M) was dissolved in chloroform (30 mL). Triethylamine (1.12 mL) and methylsulfonyl anhydride (0.008M) were added at room temperature and the mixture was stirred for 2 hours, then washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered, and evaporated to an oil. This oil was dissolved in anhydrous dimethylformamide and lithium bromide (or bromine, 0.005M) was added and the mixture was stirred at 80 ° C for 2 hours, then cooled, poured into water and extracted with ether. The product thus obtained is dried over magnesium sulphate, filtered, evaporated to dryness and purified by flash column chromatography.

Sloučeniny obecného vzorce XIX mohou být připraveny reakcí sloučeniny obecného vzorce XXCompounds of formula (XIX) may be prepared by reacting a compound of formula (XX)

(XX), ve kterém R’^a až R^5d mají výše uvedené významy, R* znamená skupinu -N=C=O nebo skupinu -O-CO-L, kde L znamená výše definovanou odlučitelnou skupinu, se sloučeninou obecného vzorce III za vzniku sloučeniny obecného vzorce XXI(XX), in which R ' ^a to R ^5d have the meanings given above, R * is -N = C = O or -O-CO-L, wherein L is a leaving group as defined above, with a compound of formula III after to form a compound of formula XXI

(XXI), ve kterém R^5a až R^5d, Pr¹ a Z¹ mají výše uvedené významy a X znamená atom kyslíku nebo skupinu NH. Takto získaná sloučenina se hydrogenuje, výhodně v přítomnosti paladia na uhlí, za vzniku sloučeniny odpovídající obecnému vzorci XXI, avšak se skupinou -NH₂ na místo skupiny -NO₂. Takto získaná sloučenina se uvede v reakci s ethylenoxidem za kyselých vodných 30 podmínek, výhodně v přítomnosti kyseliny octové a vody v poměru 1:1, výhodně po dobu 1 až 2 dnů, výhodně při okolní teplotě, za vzniku sloučeniny obecného vzorce XIX. Příklad takového postupuje ilustrován reakčním schématem 5.(XXI), wherein R ^5a to R ^5d , Pr ¹ and Z ¹ are as defined above and X represents an oxygen atom or an NH group. The compound thus obtained is hydrogenated, preferably in the presence of palladium on carbon, to give a compound corresponding to formula XXI, but with the -NH ₂ group in place of the -NO ₂ group. The compound thus obtained is reacted with ethylene oxide under acidic aqueous conditions, preferably in the presence of acetic acid and water in a ratio of 1: 1, preferably for 1 to 2 days, preferably at ambient temperature, to give a compound of formula XIX. An example of such a procedure is illustrated by Reaction Scheme 5.

Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, spočívá v tom, že se sloučenina obecného vzorce XVIIIbA process for the preparation of compounds of formula I wherein W is tetrazol-5-yl is characterized in that the compound of formula XVIIIb

NH₂ NH ₂

IAND

HOOC - CH - Z¹¹¹¹ (XVIIIb), ve kterém Z¹¹¹¹ znamená výše definovaný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, uvede v reakci s výše definovanou sloučeninou obecného vzorce IIHOOC-CH-Z ¹¹¹¹ (XVIIIb), wherein Z ¹¹¹¹ is Z as defined above, with the proviso that W is tetrazol-5-yl, reacts with a compound of formula II as defined above

-13CZ 287028 B6 za standardních podmínek za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl. Uvedené standardní podmínky zahrnují provedení reakce v polárním aprotickém rozpouštědle, zejména v dimethylformamidu, v přítomnosti báze, výhodně 5 dimethylaminopyridinu, zejména triethylaminu, po dobu alespoň 2 hodin, výhodně po dobu 20 hodin, při teplotě 20 až 50 °C, zejména při teplotě 25 °C).Under standard conditions, a compound of formula I wherein W is tetrazol-5-yl is converted to a salt thereof. Said standard conditions include carrying out the reaction in a polar aprotic solvent, in particular dimethylformamide, in the presence of a base, preferably 5 dimethylaminopyridine, in particular triethylamine, for at least 2 hours, preferably 20 hours, at 20 to 50 ° C, in particular 25 ° C).

Cytotoxická potence prekurzorů a účinných látek in vitroCytotoxic potency of precursors and active substances in vitro

Cytotoxická potence prekurzorů, prekurzorů plus enzymu a účinných látek in vitro byla měřena testem na stanovení cytotoxicity, který je analogický s testem, který byl popsán Skehanem a kol. vJ. Nati. Cancer Inst 82, 1107-1112, 1990. Buňky LoVo (ECACC No: 87060101) se zředí v médiu DMEM (obsahujícím 10 % fetálního telecího séra, 1 % glutaminu a 0,2 % gentamycinu) distribuovaného na 96 jamkové mikrotitrační plotně, přičemž každá jamka obsahuje 2500 buněk, načež se plotna inkubuje při teplotě 37 °C v atmosféře s 5% obsahem oxidu uhličitého. K těmto buňkám se přidají různé koncentrace prekurzorů, odpovídající účinné látky jakožto kontrolní pokus nebo prekurzorů plus enzymu (1 jednotka CPG2-aktivity/jamka, přičemž jedna jednotka enzymu je množství potřebné k hydrolýze 1 pmolu methotrexaátu/min/ml při 37 °C), načež se buňky inkubují buď 1 hodinu nebo 24 hodin a potom se promyjí. Přidá se čerstvé médium a 20 buňky se inkubují při teplotě 37 °C v atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého. Tři dny po přidání sloučeniny se k buňkám přidá TCA (16% finální koncentrace), načež se přidáním barviva SRB vyhodnotí množství buněčného proteinu adhezujícího k plotně (Skehan a kol.). Měří se optická hustota při 540 nm a tato se vyjádří jako procentický podíl z OD540 v kontrolních jamkách, do kterých nebyla přidána žádná sloučenina. Potence byla vyjádřena jako koncentrace 25 nezbytná k redukci buněčného růstu na 50 % (IC50). Samotný prekurzor by měl obecně mít při testu nízkou účinnost ve srovnání s účinností prekurzorů v přítomnosti CPG2 (enzym CPG2 je nezbytný ke konverzi prekurzorů na účinnou látku). Přímé přidání chemicky syntetizované účinné látky (zde již není zapotřebí konverze pomocí CPG2) představuje při tomto testu kontrolní pokus.The cytotoxic potency of precursors, precursors plus enzyme, and active ingredients in vitro was measured by a cytotoxicity assay analogous to that described by Skehan et al. vJ. Nati. Cancer Inst 82, 1107-1112, 1990. Dilute LoVo cells (ECACC No: 87060101) in DMEM medium (containing 10% fetal calf serum, 1% glutamine and 0.2% gentamycin) distributed on a 96 well microtiter plate, each The well contains 2500 cells and the plate is incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% carbon dioxide. Different concentrations of precursors, corresponding active ingredient as control or precursors plus enzyme are added to these cells (1 unit CPG2-activity / well, one unit of enzyme being the amount required to hydrolyze 1 pmole of methotrexate / min / ml at 37 ° C), after which the cells are incubated for either 1 hour or 24 hours and then washed. Fresh medium is added and 20 cells are incubated at 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. Three days after compound addition, TCA (16% final concentration) was added to the cells, and the amount of cellular protein adhering to the plate was evaluated by adding SRB dye (Skehan et al.). The optical density at 540 nm was measured and expressed as a percentage of OD540 in control wells to which no compound was added. Potency was expressed as the concentration of 25 necessary to reduce cell growth to 50% (IC 50). The precursor itself should generally have a low potency in the assay as compared to that of the precursors in the presence of CPG2 (the CPG2 enzyme is necessary to convert the precursors to the active agent). The direct addition of the chemically synthesized active substance (no CPG2 conversion required here) is a control experiment in this assay.

Za použití výše popsané metody byly vyhodnoceny reprezentativní testované sloučeniny podle vynálezu, přičemž bylo zjištěno, že tyto sloučeniny vykazují po 1 hodině poměr účinnosti v přítomnosti CPG2 k účinnosti v nepřítomnosti CPG2, který je roven alespoň 10, čímž je prokázáno, že sloučeniny podle vynálezu budou v rámci výše uvedené terapie účinné a 35 použitelné.Using the method described above, representative test compounds of the invention were evaluated and found to exhibit, after 1 hour, a potency ratio in the presence of CPG2 to a potency in the absence of CPG2 of at least 10, thereby demonstrating that the compounds of the invention within the above therapy effective and 35 usable.

Dalším předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá vtom, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl jako prekurzor léčivé (účinné) látky v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.Another object of the invention is a pharmaceutical composition comprising at least one compound of formula I or a physiologically acceptable salt thereof as a prodrug in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

Tato kompozice bude vhodně obsahovat účinné množství prekurzorů, kteiý je určen k použití s konjugátem CPG (výhodně CPG2)-protilátka selektivní na nádor, který je již lokalizován na nádoru.The composition will suitably contain an effective amount of prodrugs for use with a CPG (preferably CPG2) -tumor-selective antibody conjugate that is already localized to the tumor.

Uvedená kompozice může mít formu sterilní kompozice pro injekci obsahující alespoň jednu 45 sloučeninu obecného vzorce I nebo fyziologicky přijatelnou sůl uvedené sloučeniny jako prekurzor léčivé látky v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Tato kompozice bude vhodně obsahovat účinné množství prekurzorů.Said composition may be in the form of a sterile injectable composition comprising at least one compound of Formula I or a physiologically acceptable salt of said compound as a prodrug in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The composition will suitably contain an effective amount of precursors.

Dalším předmětem vynálezu je dvousložkový systém, jehož jedna složka je určena k použití 50 s druhou složkou a jehož podstata spočívá v tom, že obsahujeA further object of the invention is a two-component system, one component of which is intended to be used with the other component and which comprises:

i) první složku, kterou je protilátka nebo její fragment, které jsou schopné vázat se k danému antigenu, přičemž tato protilátka nebo její fragment jsou konjugovány s enzymem CPGi) a first component which is an antibody or fragment thereof capable of binding to said antigen, said antibody or fragment thereof being conjugated to a CPG enzyme

-14CZ 287028 B6 (výhodně s karboxypeptidázou G2), který je schopný převést sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl na cytotoxickou léčivou látku, a ii) druhou složku, kterou je sloučenina obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelná sůl, které jsou konvertovatelné působením CPG (výhodně karboxypeptidázy G2) na cytotoxickou léčivou látku.(Preferably with carboxypeptidase G2) which is capable of converting a compound of formula I or a physiologically acceptable salt thereof into a cytotoxic drug substance, and ii) a second component which is a compound of formula I or a physiologically acceptable salt thereof which are convertible by treating the cytotoxic drug with CPG (preferably carboxypeptidase G2).

Uvedená protilátka nebo její fragment jsou výhodně schopné vázat se na antigen sdružený s nádorem.Said antibody or fragment thereof is preferably capable of binding to a tumor associated antigen.

Protilátkou, která je schopná vázat se na antigen sdružený s nádorem, je myší monoklonální protilátka A5B7. Tato protilátka A5B7 se váže k lidskému karcinoembryonálnímu antigenu (CEA - carcinoembryonic antigen) a tato protilátka je obzvláště vhodná pro zaměření (cílení) kolorektálních karcinomů. Protilátka A4B7 je komerčně dostupná u firmy DAKO Ltd., 16 Manor Courtyard, Hughenden Avenue, Hign Wycombe, Bucks HP 13 5RE, Anglie. Fragmenty protilátky mohou být připraveny z celé IgG-protilátky konvenčním způsobem, jako například fragmenty F(ab')₂, popsané Mariani-m M. a kol. (1991), Molecular Immunology 28, 69-77. Obecně by konjugát protilátka (nebo fragment proti látky )-enzym měl být alespoň dvouvalenční, tj. aby byl schopný vázat se alespoň na 2 antigeny sdružené s nádorem (které mohou být stejné nebo odlišné). Molekuly protilátky mohou být humanizovány známými postupy, například „CDRroubováním“ popsaným v EP239400 nebo roubováním kompletních variabilních oblastí na lidské konstantní oblasti, popsaným v patentu US 4816567. Tyto humanizované protilátky mohou být použity za účelem snížení imunogenicity protilátky (nebo fragmentu protilátky). Humanizovaná verze protilátky A5B7 byla popsána v PCT W092/01059.The antibody that is capable of binding to a tumor-associated antigen is the mouse monoclonal antibody A5B7. This A5B7 antibody binds to the human carcinoembryonic antigen (CEA) and is particularly useful for targeting colorectal cancers. A4B7 is commercially available from DAKO Ltd., 16 Manor Courtyard, Hughenden Avenue, Hign Wycombe, Bucks HP 13 5RE, England. Antibody fragments can be prepared from whole IgG antibodies in a conventional manner, such as the F (ab ') ₂ fragments described by Mariani M. et al. (1991) Molecular Immunology 28: 69-77. Generally, the antibody (or anti-agent fragment) -enzyme conjugate should be at least bivalent, ie, capable of binding to at least 2 tumor-associated antigens (which may be the same or different). Antibody molecules can be humanized by known techniques, for example, by "CDRing" described in EP239400 or by grafting complete variable regions to human constant regions, as described in US Patent No. 4,816,567. These humanized antibodies can be used to reduce the immunogenicity of an antibody (or antibody fragment). A humanized version of A5B7 has been described in PCT WO92 / 01059.

Hybridomy, které produkují monoklonální protilátku A5B7, jsou uloženy v Evropské sbírce živočišných buněčných struktur (European Collection of Animal Cell Cultures, Division of Biologics, PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Velká Británie). Tyto hybridomy byly deponovány 14. července 1993 a bylo jim přiděleno depozitní číslo 9307411. Protilátka A5B7 může být z deponovaných hybridomů získána známými standardními postupy, které jsou například popsány C. Fenge-m, E. Fraune-m a K. Schurgerl-em v „Production of Biologicals from Animal Cells in Culture“ (vyd. JR. Griffiths a B. Meignier) Butterworth-Heinemann, 1991, 262-265 a BL. Anderson-em a ML. Gruenberger-em v „Comercial Production of Monoclonal Antibodies“ (vyd. S. Seaver), Marcel Dekker, 1987, 175-195. Tyto buňky mohou čas od času vyžadovat reklonování limitováním zředění za účelem dobré úrovně produkce protilátky.Hybridomas that produce the monoclonal antibody A5B7 are deposited in the European Collection of Animal Cell Cultures, Division of Biologics, PHLS Center for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. These hybridomas were deposited on July 14, 1993 and assigned deposit number 9307411. The A5B7 antibody can be obtained from the deposited hybridomas by known standard procedures, such as described by C. Fenge, E. Fraune and K. Schurgerl in "Production of Biologicals from Animal Cells in Culture" (ed. JR. Griffiths and B. Meignier) Butterworth-Heinemann, 1991, 262-265 and BL. Anderson and ML. Gruenberger in "Comercial Production of Monoclonal Antibodies" (ed. S. Seaver), Marcel Dekker, 1987, 175-195. These cells may require recloning from time to time by limiting dilution for good levels of antibody production.

Byly také popsány další protilátky, které jsou vhodné pro použití v rámci terapie ADEPT. Protilátka BW 431/26 je popsána H. J. Haisma-em a kol. v Cancer Immunol. Immunother., 34: 343-348 (1992). Protilátky L6, 96.5 a 1F5 byly popsány v evropském patentu 302 473. Protilátka 16.88 byla popsána v mezinárodní patentové přihlášce W090/07929. Protilátka CEM231 byla popsána v evropském patentu 382 411. Protilátky HMFG-1 a HMFG-11 (Unipath Ltd, Basingstoke, Hants, Velká Británie) reagují s mucinoidní glykoproteinovou molekulou na mléčnětukových globulámích membránách a mohou být použity pro zaměření rakoviny prsu a rakoviny vaječníků. Protilátka SM3 (Chemicon Intemational Ltd, Londýn, Velká Británie) reaguje s jádrovým proteinem mucinu a může být použita pro zaměření rakoviny prsu a rakoviny vaječníků. Protilátka 85A12 (Unipath Ltd., Basingstoke, Hants, Velká Británie) a ZCEA1 (Pierce Chemical Company, Cester, Velká Británie) reaguje s nádorovým antigenem CEA. Protilátka PR4D1 (Serotec, Oxford, Velká Británie) reaguje s antigenem sdruženým s nádorem v tračníku. Protilátka E29 (Dako Ltd., High Wycombe, Velká Británie) reaguje s epitheliálním membránovým antigenem. Protilátka C242 je dostupná u firmy CANAG Diagnostics, Gothenberg, Švédsko.Other antibodies that are suitable for use in the treatment of ADEPT have also been described. Antibody BW 431/26 is described by H. J. Haisma et al. in Cancer Immunol. Immunother. 34: 343-348 (1992). Antibodies L6, 96.5 and 1F5 have been described in European Patent 302,473. Antibody 16.88 has been described in International Patent Application WO90 / 07929. Antibody CEM231 has been described in European Patent 382,411. Antibodies HMFG-1 and HMFG-11 (Unipath Ltd, Basingstoke, Hants, UK) react with a mucinoid glycoprotein molecule on milk-fat globular membranes and can be used to target breast cancer and ovarian cancer. The SM3 antibody (Chemicon Intemational Ltd, London, UK) reacts with the mucin core protein and can be used to target breast cancer and ovarian cancer. Antibody 85A12 (Unipath Ltd., Basingstoke, Hants, UK) and ZCEA1 (Pierce Chemical Company, Cester, UK) react with the tumor antigen CEA. PR4D1 antibody (Serotec, Oxford, UK) reacts with colon-associated antigen. Antibody E29 (Dako Ltd., High Wycombe, UK) reacts with an epithelial membrane antigen. The C242 antibody is available from CANAG Diagnostics, Gothenberg, Sweden.

-15CZ 287028 B6-15GB 287028 B6

Obecně jsou protilátky použitelné v rámci terapie ADEPT málo intemalizovány nádorovými buňkami, které tyto protilátky zaměřují (rozpoznávají). To umožňuje depozici enzymu schopného konvertovat cílený prekurzor na jeho léčivou látku na buněčném povrchu a takto tvořit léčivou látku v místě nádoru z cirkulujícího prekurzoru účinné látky. Uvedená intemalizace protilátky může být stanovena známými technikami, které jsou například popsané Jafrezou-em a kol. vCancer Research 52: 1352 (1992) a Press-em a kol. vCancer Research, 48:2249 (1988).In general, antibodies useful in ADEPT therapy are little intemalized by the tumor cells that target these antibodies. This allows the deposition of an enzyme capable of converting a targeted prodrug to its drug substance on the cell surface and thereby forming the drug substance at the tumor site from the circulating drug precursor. Said intemalization of the antibody may be determined by known techniques such as those described by Jafrezou et al. in Cancer Research 52: 1352 (1992) and Press et al. in Cancer Research, 48: 2249 (1988).

Purifikace CPG2 zPseudomonas RS-16 ve velkém měřítku byla popsána Sherwood-em a kol. vEur. J. Biochem., 148, 447-453, (1985). Příprava F(ab’)₂ a IgG protilátek kopulovaných k enzymu CPG může být provedena známými postupy a byla například popsána v PCT WO 89/10140. CPG může být získán z Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Velká Británie. CPG2 může být rovněž získán rekombinantními technikami. Nukleotid kódující sekvenci pro CPG2 byl publikován N. P. Minton-em a kol. v Gene, 31 (1984), 31-38. Exprese kódující sekvence byla indikována v E.coli (S. P. Chambers a kol. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1988), 29, 572-578) a v Saccharomyces cerevisiae (L. E. Clarke a kol. J. Gen Microbiol, (1985), 131, 897-904). Celková syntéza genu byla popsána M Edwards-em v Am. Biotec. Lab (1987), 5, 38-44. Exprese heterologových proteinů v E.coli byla popsána F. A. O. Marston-en v DNA Cloning, sv. III, Practical Approach Series, IRL Press (ed. D. M. Glover), 1987, 59-88. Exprese proteinů v kvasinkách byla popsána vMethods in Enzymology, sv. 194, Academie Press 1991, ed. C. Guthrie a G. R. Fink.Large-scale purification of CPG2 from Pseudomonas RS-16 has been described by Sherwood et al. vEur. J. Biochem., 148, 447-453 (1985). The preparation of F (ab ') ₂ and IgG antibodies coupled to the CPG enzyme can be carried out by known methods and has been described, for example, in PCT WO 89/10140. CPG can be obtained from the Center for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. CPG2 can also be obtained by recombinant techniques. The nucleotide coding sequence for CPG2 was published by NP Minton et al. in Gene, 31 (1984), 31-38. Expression of the coding sequence was indicated in E. coli (SP Chambers et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1988), 29, 572-578) and in Saccharomyces cerevisiae (LE Clarke et al. J. Gen Microbiol, (1985), 131, 897-904). The overall gene synthesis was described by M Edwards in Am. Biotec. Lab (1987) 5: 38-44. Expression of heterologous proteins in E. coli has been described by FAO Marston-en in DNA Cloning, Vol. III, Practical Approach Series, IRL Press (ed. DM Glover), 1987, 59-88. Expression of proteins in yeast has been described in Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press 1991, ed. C. Guthrie and GR Fink.

Enzym CPG je dostupný u firmy Sigma Chemical Company, Fancy Road, Poole, Dorset, Velká Británie. CPG enzym byl popsán P. Goldman-em a C. C. Levy-m v PNAS USA, 58: 1299-1306 (1967) a C. C. Levy-m a P. Goldman-em vJ. Biol. Chem., 242: 2933-2938(1967). Enzym karboxypeptidáza G3 byl popsán N. Yasuda-em a kol. vBiosci. Biotech. Biochem., 56: 1536— 1540 (1992). Enzym karboxypeptidáza G2 byl popsán v evropském patentu 121 352.The CPG enzyme is available from Sigma Chemical Company, Fancy Road, Poole, Dorset, UK. The CPG enzyme has been described by P. Goldman and C. C. Levy in PNAS USA, 58: 1299-1306 (1967) and C. C. Levy and P. Goldman vJ. Biol. Chem., 242: 2933-2938 (1967). The carboxypeptidase G3 enzyme has been described by N. Yasuda et al. vBiosci. Biotech. Biochem., 56: 1536-1540 (1992). The carboxypeptidase G2 enzyme has been described in European patent 121 352.

Dodání cytotoxické léčivé látky do určitého místa se provádí tak, že se pacientovi nejdříve podá první složka, která obsahuje protilátku nebo fragment protilátky, které jsou schopné vázat se na daný antigen, přičemž tato protilátka nebo fragment protilátky jsou konjugovány k enzjmu CPG (výhodně ke karboxypeptidáze G2), který je schopen konvertovat sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl na cytotoxickou léčivou látku, načež se pacientovi podá druhý složka, která obsahuje sloučeninu obecného vzorce I nebo její fyziologicky přijatelnou sůl, které jsou konvertovatelné působením enzymu CPG (výhodně působením karboxypeptidázy G2) na cytotoxickou léčivou látku.The delivery of a cytotoxic drug to a particular site is accomplished by first administering to the patient a first component comprising an antibody or antibody fragment capable of binding to said antigen, said antibody or antibody fragment being conjugated to a CPG enzyme (preferably a carboxypeptidase) G2) which is capable of converting a compound of formula I or a physiologically acceptable salt thereof into a cytotoxic drug, then administering to the patient a second component comprising a compound of formula I or a physiologically acceptable salt thereof which are convertible by CPG (preferably carboxypeptidase) G2) to a cytotoxic drug substance.

Místem, na které má být cytotoxická léčivá látka dodána, jsou výhodně nádorové buňky, které budou obecně přítomny v savčím hostiteli nesoucím nádor, jakým je člověk.The site to which the cytotoxic drug substance is to be delivered is preferably tumor cells, which will generally be present in a mammalian host carrying a tumor, such as a human.

Když se uvedenému hostiteli nesoucímu nádor podá uvedená první složka, směruje protilátka nebo fragment protilátky tvořící součást konjugátu s enzymem tento konjugát na místo, ve kterém se nachází nádor a váže tento konjugát k nádorovým buňkám.When said first tumor component is administered to said tumor-bearing host, the antibody or antibody fragment forming part of the enzyme conjugate directs the conjugate to a tumor site and binds the conjugate to the tumor cells.

Když došlo k odstranění nevázaného konjugátu z léčeného hostitele, například spontánní likvidací v hostiteli po uplynutí určité vhodné doby nebo akcelerovanou likvidací, která je například popsána vBr. J. Cancer (1990), 61, 559-662, může být pacientovi podána druhá složka. Je velmi žádoucí odstranit podstatnou část nevázaného konjugátu z těla pacienta ještě před podáním uvedené druhé složky, neboť v opačném případě může být léčivá cytotoxická látka produkována také jinde v těle pacienta než v místě nádoru, což má za následek obecnou toxicitu produkované cytotoxické účinné látky, tj. toxicitu jak pro nádorové, tak také pro zdravé buňky, a tedy nikoliv požadovanou specifickou toxicitu pouze pro nádorové buňky.When the unbound conjugate has been removed from the host to be treated, for example, by spontaneous destruction in the host after a suitable period of time or by accelerated destruction, such as described in Br. J. Cancer (1990), 61, 559-662, the second component may be administered to the patient. It is highly desirable to remove a substantial portion of the unbound conjugate from the patient prior to administration of the second component, since otherwise the therapeutic cytotoxic agent may also be produced elsewhere in the patient than at the tumor site, resulting in general toxicity of the cytotoxic drug produced. toxicity to both tumor and healthy cells and thus not the specific tumor cell-specific toxicity desired.

-16CZ 287028 B6-16GB 287028 B6

Sloučeniny podle vynálezu mohou být použity ve formě kompozic, jakými jsou tablety, kapsle nebo elixíry pro perorální podání, čípky pro rektální podání, sterilní roztoky a suspenze pro parenterální nebo intramuskulámí podání a podobně.The compounds of the invention may be used in the form of compositions such as tablets, capsules or elixirs for oral administration, suppositories for rectal administration, sterile solutions and suspensions for parenteral or intramuscular administration, and the like.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být podávány pacientům (živočichům nebo lidem), kteří takové léčení potřebují, v dávkách, které zajistí optimální farmaceutickou účinnost. I když se dávky budou měnit od pacienta k pacientovi v závislosti na povaze a vážnosti léčené nemoci, pacientově hmotnosti, speciálních dietách, které je pacient nucen držet, dalších lécích, které jsou pacientovi podávány za účelem léčení jiných nemocí a dalších faktorech, budou se podávané dávky obecně pohybovat od asi 1 do asi 150 mg na kilogram pacientovy hmotnosti a den a tato množství mohou být podávána v jediné souhrnné denní dávce nebo v několika denních dílčích dávkách. Výhodně se podávaná dávka bude pohybovat od asi 10 do asi 75 mg na kilogram pacientovy hmotnosti a den. Výhodně se tyto dávky budou pohybovat od asi 10 do asi 40 mg na kilogram pacientovy hmotnosti a den.The compounds of the invention may be administered to patients (animals or humans) in need of such treatment at dosages that provide optimal pharmaceutical efficacy. Although doses will vary from patient to patient depending on the nature and severity of the illness being treated, the patient's weight, the special diets the patient is forced to maintain, other medicines administered to the patient to treat other diseases and other factors, they will be administered. doses generally range from about 1 to about 150 mg per kilogram of patient's weight per day, and these amounts may be administered in a single cumulative daily dose or in several daily sub-doses. Preferably, the dose administered will range from about 10 to about 75 mg per kilogram of patient weight per day. Preferably, these doses will range from about 10 to about 40 mg per kilogram of patient weight per day.

Tato dávková rozmezí mohou být přirozeně formulována v jednotkové dávkovači formě tak, aby bylo možné podávat denní dávku v několika dílčích dávkách a aby bylo možné podávat dávky přizpůsobené povaze a vážnosti léčené choroby, hmotnosti pacienta, speciálním dietám a ostatních faktorech, jak již to bylo uvedeno výše.These dosage ranges may, of course, be formulated in a unit dosage form such that the daily dose may be presented in several divided doses, and doses adapted to the nature and severity of the disease being treated, the weight of the patient, special diets and other factors may be administered. above.

Typicky budou tyto dávky formulovány do farmaceutických kompozic, které budou popsány v následujícím textu.Typically, such doses will be formulated into pharmaceutical compositions as described below.

Asi 50 až 500 mg sloučeniny nebo směsi sloučenin obecného vzorce I nebo jejich solí se smísí s fyziologicky přijatelným vehikulem, nosičem, excipientem, pojivém, konzervačním činidlem, stabilizátorem, chuťovou přísadou a podobně do jednotkové dávkové formy obvyklou odpovídající farmaceutickou metodou. V těchto kompozicích nebo přípravcích je obsaženo takové množství účinné látky, aby se dosáhlo vhodného dávkování v indikovaném rozmezí.About 50-500 mg of a compound or mixture of compounds of Formula I or salts thereof is mixed with a physiologically acceptable vehicle, carrier, excipient, binder, preservative, stabilizer, flavor, and the like into a unit dosage form by a conventional pharmaceutical method. Such compositions or preparations contain an amount of active ingredient such that an appropriate dosage is obtained within the indicated range.

Ilustrativními příklady přísad, které mohou být zabudovány do tablet, kapslí a podobných formulací, jsou: pojivo jako tragant, akácie, kukuřičný škrob nebo želatina, excipient jako mikrokrystalická celulóza, desintegrační činidlo jako kukuřičný škrob, preželatinační škrob, kyselina algová a podobně, mazivo jako stearát hořečnatý, sladidlo jako sacharóza, laktóza nebo sacharin, chuťová přísada jako máta pepmá a olej z libavky položené a třešňové aroma. Je-li jednotkovou dávkovači formou kapsle, potom tato kapsle může kromě obvyklých materiálů výše uvedeného typu obsahovat také kapalný nosič, jakým je mastný olej. Mohou být ale obsaženy i různé další materiály, například ve formě povlaků nebo látek jinak modifikujících fyzikální formu dávkové jednotky. Tak například tablety mohou být ovrstveny šelakem nebo/a cukrem. Sirup nebo elixír mohou obsahovat účinnou látku, sacharózu jako sladidlo, methyl- a propylparaben jako konzervační činidlo, barvivo a třešňové nebo pomerančové aroma jako chuťovou přísadu.Illustrative examples of ingredients that can be incorporated into tablets, capsules and the like are: a binder such as tragacanth, acacia, corn starch or gelatin, an excipient such as microcrystalline cellulose, a disintegrant such as corn starch, pregelatinized starch, alginic acid and the like, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint and wintergreen oil and cherry flavor. When the unit dosage form is a capsule, the capsule may contain, in addition to conventional materials of the above type, a liquid carrier such as a fatty oil. However, various other materials may also be present, for example in the form of coatings or substances otherwise modifying the physical form of the dosage unit. For example, tablets may be coated with shellac and / or sugar. A syrup or elixir may contain the active ingredient, sucrose as a sweetening agent, methyl and propylparaben as a preservative, a colorant and a cherry or orange flavor as a flavoring.

Jak již bylo uvedeno výše, mohou být sloučeniny obecného vzorce I a jejich fyziologicky přijatelné soli, jakož i výše uvedené konjugáty podávány za použití konvenčních způsobů podání, které neomezujícím způsobem zahrnují intravenózní podání, intraperitoneální podání, perorální podání, intralymfatické podání nebo podání přímo do nádoru. Výhodné je intravenózní podání, například intravenózní infuze.As mentioned above, the compounds of formula I and their physiologically acceptable salts, as well as the above conjugates, can be administered using conventional routes of administration, including, but not limited to, intravenous, intraperitoneal, oral, intralymphatic, or directly into the tumor. . Intravenous administration, for example intravenous infusion, is preferred.

Sterilní kompozice pro injekci nebo infuzi mohou být formulovány za použití konvenčního farmaceutického postupu rozpuštěním nebo suspendováním účinné látky ve vehikulu, jakým je voda pro injekci, přírodně se vyskytující olej, jako sezamový olej, kokosový olej, podzemnicový olej, olej z bavlníkových semen a podobně, nebo syntetické mastné vehikulum, jako ethyloleát nebo podobně. V případě potřeby mohou být zabudovány také pufry, konzervační prostředky, antioxidační přísady a podobně. Výhodnými sterilními kompozicemi pro injekci nebo infuziSterile injectable or infused compositions may be formulated using a conventional pharmaceutical procedure by dissolving or suspending the active ingredient in a vehicle such as water for injection, a naturally occurring oil such as sesame oil, coconut oil, peanut oil, cottonseed oil and the like, or a synthetic fatty vehicle such as ethyl oleate or the like. If desired, buffers, preservatives, antioxidants and the like can also be incorporated. Preferred sterile compositions for injection or infusion

-17CZ 287028 B6 formulovanými konvenčním farmaceutickým postupem zahrnují kompozice získané rozpouštěním prekurzoru léčivé látky ve vehikulu, jakým je voda, která případně obsahuje soli, cukr (zejména dextran), pufrovací činidla nebo/a korozpouštědla (zejména polyethylenglykol, propylenglykol nebo dimethylisosorbid).Formulated by a conventional pharmaceutical process include compositions obtained by dissolving a prodrug in a vehicle such as water, optionally containing salts, sugar (especially dextran), buffering agents and / or cosolvents (especially polyethylene glycol, propylene glycol or dimethylisosorbide).

V rámci jednoho provedení vynálezu je sloučenina obecného vzorce I použita ve formě volné kyseliny, která může být formulována do formy pro parenterální podání bezprostředně před podáním pacientovi. Takto může být například sloučenina obecného vzorce I ve formě volné kyseliny smíšena s pufrem, čímž se převede na fyziologicky přijatelnou sůl bezprostředně před podáním.In one embodiment of the invention, the compound of formula I is used in the form of the free acid, which can be formulated for parenteral administration immediately prior to administration to the patient. Thus, for example, the free acid compound of formula (I) may be mixed with a buffer to convert it to a physiologically acceptable salt immediately prior to administration.

Výhodnou jednotkovou dávkovou formou sloučeniny podle vynálezu je sloučenina obecného vzorce I nebo její farmaceuticky přijatelná sůl ve sterilní lyofilizované formě vampuli, připravené pro rekonstituci injikovatelného roztoku nebo roztoku podatelného infuzí. Taková ampule výhodně obsahuje 500 mg až 2 g (zejména 1 g) uvedené sloučeniny.A preferred unit dosage form of a compound of the invention is a compound of Formula I, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in sterile, lyophilized form in a vial, prepared for reconstitution of an injectable or infusible solution. Such an ampoule preferably contains 500 mg to 2 g (especially 1 g) of said compound.

V následujících příkladech provedení bude ilustrována příprava sloučenin obecného vzorce I a jejich zabudování do farmaceutických kompozic, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu. V těchto příkladech je použito, pokud není výslovně uvedeno jinak, následujících standardních technik:The following examples illustrate the preparation of the compounds of formula (I) and their incorporation into pharmaceutical compositions, and are not to be construed as limiting the scope of the invention. In these examples, the following standard techniques are used unless otherwise indicated:

i) všechna odpaření byla provedena v rotační odparce za vakua a zpracování rezultujících směsí byla provedena až po odstranění zbylého pevného podílu filtrací, ii) jednotlivé operace byly provedeny při okolní teplotě, tj. v rozmezí 18 až 25 °C, a pod atmosférou inertního plynu, jakým je argon, iii) sloupcová chromatografie (je použito mžikové chromatografie) byla provedena na silikagelu Měrek Kieselgel (Art. 9385), který je komerčně dostupný u firmy E. Měrek, Darmstadt, Spolková republika Německo, iv) výtěžky jsou uvedeny pouze pro ilustraci a tyto výtěžky nepředstavují maximálně dosažitelné výtěžky, kterých by se dosáhlo optimalizací preparativních postupů,(i) all evaporations were carried out in a rotary evaporator under vacuum and the resulting mixtures were treated after removal of the remaining solid by filtration; (ii) individual operations were carried out at ambient temperature, i.e. between 18 and 25 ° C and under inert gas atmosphere. (iii) column chromatography (flash chromatography) was performed on silica gel Kieselgel gauge (Art. 9385), which is commercially available from E. Měrek, Darmstadt, Federal Republic of Germany, (iv) yields are given only for the illustration and these yields do not represent the maximum achievable yields that would be achieved by optimizing the preparative procedures,

v) finální produkty mají uspokojivé výsledky elementární mikroanalýzy a jejich struktury jsou potvrzeny nukleární magnetickorezonanční spektroskopií a hmotovou spektroskopií, vi) získané meziprodukty nejsou obecně zcela charakterizovány a jejich čistota byla stanovena chromatografíí na tenké vrstvě, infračervenou spektroskopií nebo nukleární magnetickorezonanční spektroskopií, vii) teploty tání nejsou korigované a byly stanoveny za použití zařízení s olejovou lázní, přičemž teploty tání finálních produktů obecného vzorce I byly stanoveny po krystalizaci z vhodného organického rozpouštědla, jakým je ethanol, methanol, aceton nebo hexan, a to buď samotný, nebo ve směsi s ostatními rozpouštědly.(v) final products have satisfactory elemental microanalysis results and their structures are confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectroscopy; (vi) the intermediates obtained are generally not fully characterized and their purity determined by thin layer chromatography, infrared spectroscopy or nuclear magnetic resonance spectroscopy; are uncorrected and were determined using an oil bath apparatus, the melting points of the final products of formula (I) being determined after crystallization from a suitable organic solvent such as ethanol, methanol, acetone or hexane, either alone or mixed with other solvents .

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamováN- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid

-18CZ 287028 B6-18GB 287028 B6

Roztok dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamátu (viz 2 v reakčním schématu 1) (6 g) v ethylacetátu (100 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 30% paladia na uhlí (0,6 g) po dobu 2 hodin. Když se spotřebuje teoretické množství vodíku, hydrogenační katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se odpaří k suchu. Zbytek se vyjme horkým etherem (25 ml) a přidá se hexan až do zakalení. Po ochlazení se získá kyselina N-(4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová (viz 3 v reakčním schématu 1) ve formě bílého krystalického produktu.A solution of dibenzyl N- (4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenoxycarbonyl) -L-glutamate (see 2 in Reaction Scheme 1) (6 g) in ethyl acetate (100 mL) was hydrogenated in the presence of % palladium on carbon (0.6 g) for 2 hours. When the theoretical amount of hydrogen was consumed, the hydrogenation catalyst was removed by filtration and the filtrate was evaporated to dryness. The residue was taken up in hot ether (25 mL) and hexane was added until it became cloudy. After cooling, N- (4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid (see 3 in Reaction Scheme 1) is obtained as a white crystalline product.

Výtěžek: 3,4 g (79 %), teplota tání: 87 až 89 °C, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,0(d) 2H,Yield: 3.4 g (79%), melting point: 87-89 ° C, nuclear magnetic resonance spectrum: 7.0 (d) 2H,

6,6(d) 2H,6.6 (d) 2H,

6,2(d) 1H, 4,4(m) 1H, 3,5-3,7(m) 8H, 2,0-2,6(m) 4H), elementární analýza6.2 (d) 1H, 4.4 (m) 1H, 3.5-3.7 (m) 8H, 2.0-2.6 (m) 4H), elemental analysis

C(%) H(%) N(%) vypočteno 47,2 4,95 6,88 nalezeno 47,5 5,1 6,7.C (%) H (%) N (%) calculated 47.2 4.95 6.88 found 47.5 5.1 6.7.

Tato sloučenina může být rovněž připravena v odlišné polymorfní formě, která je nerozpustná v etheru a má teplotu tání 128 až 130 °C.This compound can also be prepared in a different polymorphic form which is insoluble in ether and has a melting point of 128-130 ° C.

Výchozí dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamát se připraví následujícím způsobem.The starting dibenzyl N- (4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl) -L-glutamate was prepared as follows.

Roztok 4-nitrofenylchlorformiátu (1,43 g) v chloroformu (15 ml) se přidá ke směsi 4—/bis(2— chlorethyl)amino/fenol-hydrochloridu (Biochem. Pharmacol 17 893 (1968)) (1,93 g), triethylaminu (2 ml) a chloroformu (20 ml). Po dvou hodinách při okolní teplotě se směs odpaří k suchu a zbytek se chromatografuje na silikagelu Měrek Art. 9385. Po eluci eluční soustavou tvořenou směsí hexanu a ethylacetátu a rekrystalizaci ze směsi benzenu a petroletheru v poměru 3:1 se získá 0-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl)-0'-(4-nitrofenyl)karbonát (viz 1 v reakčním schématu 1) ve formě nažloutlého pevného produktu.A solution of 4-nitrophenyl chloroformate (1.43 g) in chloroform (15 ml) was added to a mixture of 4- / bis (2-chloroethyl) amino / phenol hydrochloride (Biochem. Pharmacol 17 893 (1968)) (1.93 g) , triethylamine (2 mL) and chloroform (20 mL). After two hours at room temperature, the mixture was evaporated to dryness and the residue was chromatographed on silica gel. 9385. Elution with hexane / ethyl acetate and recrystallization from benzene / petroleum ether (3: 1) affords O- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenyl) -O '- ( 4-nitrophenyl) carbonate (see 1 in Reaction Scheme 1) as a yellowish solid.

Výtěžek: 1,4 g (50 %) teplota tání: 66 až 67 °C.Yield: 1.4 g (50%), m.p. 66-67 ° C.

K takto získanému produktu (5,5 g) v chloroformu (40 ml) se přidá triethylamin (3,8 ml a potom dibenzylestertosylát kyseliny L-glutamové (13,75 g). Získaná směs se míchá a zahřívá na teplotu 60 °C po dobu 4 hodin, načež se odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (Měrek Art. 9385), přičemž se eluce provádí 3% ethylacetátem v chloroformu. Z odpovídající frakce eluátu se získá požadovaný výchozí dibenzyl-2-(/bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)glutamát (viz 2 v reakčním schématu 1) ve formě bílého pevného produktu.To the product thus obtained (5.5 g) in chloroform (40 ml) was added triethylamine (3.8 ml and then L-glutamic acid dibenzyl ester tosylate (13.75 g). The resulting mixture was stirred and heated to 60 ° C for The residue is chromatographed on silica gel (Meter Art. 9385) eluting with 3% ethyl acetate in chloroform to give the desired starting dibenzyl-2 - (/ bis (2- chloroethyl) amino (phenoxycarbonyl) glutamate (see 2 in Reaction Scheme 1) as a white solid.

Výtěžek: 6,2 g (77 %), teplota tání: 85 až 87 °C.Yield: 6.2 g (77%), m.p. 85-87 ° C.

Příklad 2Example 2

Kyselina N-(4—/N,N-bis(2-chlorethyl)-amino/-3-methylfenoxykarbonyl)-L-glutamováN- (4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenoxycarbonyl) -L-glutamic acid

-19CZ 287028 B6-19GB 287028 B6

Způsob popsaný v příkladu 1 se opakuje za použití dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenoxykarbonyl)-L-glutamátu namísto dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamátu, přičemž se získá N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenoxykarbonyl)-L-glutamová kyselina ve formě bílého pevného produktu.The process described in Example 1 was repeated using dibenzyl N- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenoxycarbonyl) -L-glutamate instead of dibenzyl N- (4- / N, N -bis (2-chloroethyl) amino / phenoxycarbonyl) -L-glutamate to give N- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenoxycarbonyl) -L-glutamic acid as a white solid .

Teplota tání: 160 až 162 °C,Melting point: 160-162 ° C,

nukleární magnetickorezonanční spektrum: nuclear magnetic resonance spectrum: 7,3(d)2H, 6,7(d) 2H, 6,0(d) 1H), 4,2(m) 1H, 3,7(m) 8H, 2,3-2,0(m) 4H, 7.3 (d) 2H, 6.7 (d) 2H, 6.0 (d) 1H), 4.2 (m) 1H, 3.7 (m) 8H, 2.3-2.0 (m) 4H, elementární analýza: elementary analysis: C(%) C(%) H(%) N(%) H (%) Cl(%) Cl (%) vypočteno calculated 47,3 47.3 5,2 10,3 5,2 10,3 17,5 17.5 nalezeno found 46,8 46.8 5,2 10,3 5,2 10,3 18,0. 18.0.

Dibenzyl-N-(4-/N,N-(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenoxykarbonyl)-L-glutamát, použitý jako výchozí látka, se připraví způsobem, který je analogický se způsobem popsaným v příkladu 1 za použití 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenolu namísto 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenolu.The dibenzyl N- (4- [N, N- (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenoxycarbonyl) -L-glutamate used as starting material was prepared in a manner analogous to that described in Example 1 using 4 - [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] -3-methylphenol instead of 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenol.

4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenol se získá následujícím způsobem (viz reakční schéma 2).4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenol was obtained as follows (see Reaction Scheme 2).

a) Ethylenoxid (40 g) se zavede probubláváním do roztoku 4-amino-m-kresolu (12,3 g) ve směsi kyseliny octové a vody v poměru 1:1 (500 ml). Tato směs se potom ponechá při okolní teplotě po dobu 48 hodin, načež se odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu, přičemž se eluce provádí ethylacetátem. Zodpovídající frakce eluátu se získá 4-/N,N-bis(2hydroxyethyl)amino/-3-methylfenol ve formě oleje.a) Ethylene oxide (40 g) was bubbled into a solution of 4-amino-m-cresol (12.3 g) in a 1: 1 mixture of acetic acid and water (500 mL). The mixture is left at ambient temperature for 48 hours and then evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel, eluting with ethyl acetate. The corresponding eluate fraction gave 4- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] -3-methylphenol as an oil.

Výtěžek: 6,2 g), nukleární magnetickorezonanční spektrum: viz tabulku 2.Yield: 6.2 g), Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: see Table 2.

b) Benzylbromid (4,24 g) se přidá ke směsi takto získaného produktu (6 g), hydroxidu draselného (1,6 g) a ethanolu (40 ml). Tato směs se potom míchá a zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin, načež se ochladí a zahustí odpařením. Zbytek se nalije do vody (100 ml), dvakrát extrahuje ethylacetátem, vysuší a odpaří, přičemž se získá 2,2'-(4-benzyloxy2-toluidino)diethanolu ve formě pevného produktu.b) Benzyl bromide (4.24 g) was added to a mixture of the product so obtained (6 g), potassium hydroxide (1.6 g) and ethanol (40 ml). The mixture was stirred and heated to reflux for 2 hours, cooled and concentrated by evaporation. The residue was poured into water (100 mL), extracted twice with ethyl acetate, dried and evaporated to give 2,2 '- (4-benzyloxy-2-toluidino) diethanol as a solid.

Teplota tání: 70 až 72 °C, výtěžek: 7,2 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: viz tabulka 3.Melting point: 70-72 ° C, Yield: 7.2 g, Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: see Table 3.

c) K takto získanému produktu (7 g) v chloroformu (50 ml) se při teplotě 10 až 20 °C po částech přidá chlorid fosforečný (11,4 g). Směs se potom zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 90 minut, načež se ochladí a nalije do vody. Organická fáze se oddělí a promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu. Po eluci směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 2:1 se získá 4-benzyloxy-3-methylN,N-bis-(2-chlorethyl)anilin ve formě oleje.c) To the product thus obtained (7 g) in chloroform (50 ml) at 10 to 20 ° C was added portionwise phosphorus pentachloride (11.4 g). The mixture was then heated at reflux for 90 minutes, then cooled and poured into water. The organic phase was separated and washed with aqueous sodium bicarbonate solution, water and evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel. Elution with 2: 1 hexane: ethyl acetate gave 4-benzyloxy-3-methyl-N, N-bis- (2-chloroethyl) aniline as an oil.

-20CZ 287028 B6-20GB 287028 B6

Výtěžek: 2,2 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: viz tabulka 4.Yield: 2.2 g. Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: see Table 4.

Namísto bezprostředně výše uvedené reakce lze použít následující alternativní reakci. K roztoku produktu získaného v reakčním stupni b) (2,6 g) v pyridinu (8 ml) se při teplotě 0 až 5 °C přidá methansulfonylchlorid (2,5 ml). Získaná směs se potom zahřívá na teplotu 70 °C po dobu 15 minut, načež se ochladí a nalije do zředěného roztoku kyseliny citrónové (100 ml). Směs se potom dvakrát extrahuje ethylacetátem, vysuší a odpaří, přičemž se získá 4-benzyloxy-3methyl-N,N-bis(2-chlorethyl)anilin ve formě oleje.Instead of the immediately above reaction, the following alternative reaction may be used. To a solution of the product obtained in step b) (2.6 g) in pyridine (8 mL) at 0-5 ° C was added methanesulfonyl chloride (2.5 mL). The mixture was heated to 70 ° C for 15 minutes, cooled and poured into dilute citric acid solution (100 mL). The mixture was then extracted twice with ethyl acetate, dried and evaporated to give 4-benzyloxy-3-methyl-N, N-bis (2-chloroethyl) aniline as an oil.

Výtěžek: 2,6 g (84 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: viz tabulka 4.Yield: 2.6 g (84%), nuclear magnetic resonance spectrum: see Table 4.

d) K takto získanému produktu (2 g) v ethanolu (25 ml) se přidává ether nasycený chlorovodíkem až do okamžiku, kdy se získá roztok, tj. kdy dojde k rozpuštění veškerého pevného podílu. K roztoku se přidá 300 mg 30% paladia na uhlí ve funkci hydrogenačního katalyzátoru a získaná směs se míchá pod atmosférou dusíku až do okamžiku, kdy je spotřebováno příslušné množství vodíku. Hydrogenační katalyzátor se potom odstraní filtrací a filtrát se odpaří, přičemž se získá 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino-3-methylfenolhydrochlorid ve formě pevného produktu.d) To the product thus obtained (2 g) in ethanol (25 ml) was added ether saturated with hydrogen chloride until a solution was obtained, i.e. all solid was dissolved. To the solution was added 300 mg of 30% palladium on carbon as a hydrogenation catalyst, and the resulting mixture was stirred under nitrogen until the appropriate amount of hydrogen was consumed. The hydrogenation catalyst was then removed by filtration and the filtrate was evaporated to give 4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino-3-methylphenol hydrochloride as a solid.

Výtěžek: 950 mg, teplota tání: 164 až 167 °C.Yield: 950 mg, m.p. 164-167 ° C.

Příklad 3Example 3

Hydrochlorid kyseliny N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamovéN- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L-glutamic acid hydrochloride

Nasycený roztok chlorovodíku v etheru (120 ml) se přidá k roztoku diterc.butyl-N-(4-(N,Nbis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamátu (4,4 g) v ethylacetátu. Po jedné hodině při okolní teplotě se směs odpaří k suchu. Získaný pevný produkt se rozetře s etherem, přičemž se získá hydrochlorid kyseliny N-(4-7N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamové ve formě šedé pevné látky.A saturated solution of hydrogen chloride in ether (120 mL) was added to a solution of di-tert-butyl-N- (4- (N, Nbis (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L-glutamate (4.4 g) in ethyl acetate). The resulting solid was triturated with ether to give N- (4-7N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L-glutamic acid hydrochloride as a gray solid. substances.

Výtěžek: 3,5 g, teplota tání: 148 až 150 °C (viz reakční schéma 3), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,2(d) 2H,Yield: 3.5 g, m.p. 148-150 ° C (see Reaction Scheme 3), nuclear magnetic resonance spectrum: 7.2 (d) 2H,

6,7(d)2H) 4,2(n) 1H, 3,7(m) 8H, 2,4-l,8(m) 4H, elementární analýza:6.7 (d) 2H) 4.2 (n) 1H, 3.7 (m) 8H, 2.4-1.8 (m) 4H, elemental analysis:

C(%) H(%) N(%) vypočteno 46,7 6,8 7,0 nalezeno 47,1 6,5 7,5.C (%) H (%) N (%) calculated 46.7 6.8 7.0 found 47.1 6.5 7.5.

Výchozí ditercbutyl-N-(4-/N,N-bis-/(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamyl)-L-glutamát se získá následujícím způsobem.The starting di-tert-butyl N- (4- (N, N-bis - [(2-chloroethyl) amino) phenylcarbamyl) -L-glutamate was obtained as follows.

Směs p-fluomitrobenzenu (14,1 g) a diethanolaminu (30 ml) se míchá a zahřívá na teplotu 130 °C po dobu 2 hodin. Směs se potom ochladí na teplotu asi 60 °C, načež se nalije do 1 litruA mixture of p-fluorometrobenzene (14.1 g) and diethanolamine (30 mL) was stirred and heated to 130 ° C for 2 hours. The mixture was then cooled to about 60 ° C and then poured into 1 liter

-21CZ 287028 B6 vody obsahující 10 ml 48% louhu sodného. Po ochlazení na teplotu 15 °C se sraženina odfiltruje a vysuší, přičemž se získá 2,2'-(4-nitroanilmo)diethanol.Water containing 10 ml of 48% sodium hydroxide solution. After cooling to 15 ° C, the precipitate was filtered off and dried, yielding 2,2 '- (4-nitroanilino) diethanol.

Výtěžek: 20,7 g (92 %), teplota tání: 102 až 104 °C.Yield: 20.7 g (92%), m.p. 102-104 ° C.

Ke směsi takto získaného produktu (20 g), dichlormethanu (200 ml) a pyridinu (7 ml) se za chlazení přidá thionylchlorid (30 ml). Po ukončení přídavku se směs zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu jedné hodiny. Po ochlazení se směs zředí stejným objemem dichlormethanu, načež se pečlivě dvakrát promyje vodou, vysuší a odpaří, přičemž se získá /N,N-bis(2-chlorethyl)/-4-nitroanilin ve formě pevného produktu.To a mixture of the product so obtained (20 g), dichloromethane (200 ml) and pyridine (7 ml) was added thionyl chloride (30 ml) with cooling. After the addition was complete, the mixture was heated to reflux for one hour. After cooling, the mixture was diluted with an equal volume of dichloromethane and washed carefully twice with water, dried and evaporated to give [N, N-bis (2-chloroethyl)] - 4-nitroaniline as a solid.

Výtěžek: 21 g, teplota tání: 81 až 83 °C.Yield: 21 g, m.p. 81-83 ° C.

K roztoku takto získaného produktu (0,53 g) v redestilovaném tetrahydrofuranu (20 ml) se přidá 30% paladium na uhlí ve funkci hydrogenačního katalyzátoru (100 mg). Získaná směs se míchá pod atmosférou vodíku po dobu dvou hodin, načež se hydrogenační katalyzátor odstraní filtrací. Filtrát se odpaří k suchu a zbytek se opětovně rozpustí v ether (20 ml) a k roztoku se přidá mírný přebytek roztoku chlorovodíku v etheru. 4—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/aniliniumchlorid, získaný ve formě pevného produktu, se vysuší.To a solution of the product so obtained (0.53 g) in redistilled tetrahydrofuran (20 mL) was added 30% palladium on carbon as a hydrogenation catalyst (100 mg). The resulting mixture was stirred under a hydrogen atmosphere for two hours, after which the hydrogenation catalyst was removed by filtration. The filtrate was evaporated to dryness and the residue redissolved in ether (20 mL) and a slight excess of hydrogen chloride in ether was added. The 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) anilinium chloride obtained as a solid product is dried.

Výtěžek: 0,5 g, teplota tání: 238 až 240 °C (za rozkladu).Yield: 0.5 g, m.p. 238-240 ° C (dec.).

K roztoku trifosgenu (od firmy Aldrich, 200 mg) v chloroformu (10 ml) se přidá takto získaný produkt (539 mg) a potom ještě triethylamin (0,83 ml). Po 15 minutách při okolní teplotě se přidá roztok diterc.butylesteru kyseliny L-glutamové (0,31 g) v chloroformu (5 ml). Směs se ponechá stát při okolní teplotě po dobu 18 hodin, načež se promyje vodou, vysuší a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu Měrek za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 3:1, načež se zodpovídající frakce eluátu izoluje požadovaný výchozí diterc.butyl-4-/bis-2-(chlorethylamino)/fenylkarbamoyl-L-glutamát ve formě oleje (viz reakční schéma 3).To a solution of triphosgene (from Aldrich, 200 mg) in chloroform (10 mL) was added the product so obtained (539 mg) followed by triethylamine (0.83 mL). After 15 minutes at room temperature, a solution of di-tert-butyl L-glutamic acid ester (0.31 g) in chloroform (5 mL) was added. The mixture was allowed to stand at ambient temperature for 18 hours, then washed with water, dried and evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel using a 3: 1 hexane / ethyl acetate mixture as eluent, and the corresponding eluate fraction is isolated to give the desired starting di-tert-butyl-4- / bis-2- (chloroethylamino) / phenylcarbamoyl-L-glutamate starting material. in the form of an oil (see Reaction Scheme 3).

Výtěžek: 0,44 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,2(d) a 6,65(dd) 4H aromatikYield: 0.44 g, Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 7.2 (d) and 6.65 (dd) 4H aromatics

4,l(m) 1H,4.1 (m) 1H,

3,66(S) 8H, l,7-2,2(m) 4H, l,38(s) 9Ha l,42(s) 9H.3.66 (S) 8H, 1.7-2.2 (m) 4H, 1.38 (s) 9H, and 1.42 (s) 9H.

Příklad 4Example 4

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamováN- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L-glutamic acid

V tomto příkladu bude popsán alternativní způsob přípravy kyseliny N-(4—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamové. Tento způsob představuje alternativu ke způsobu popsanému v příkladu 3. Výchozí dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamát byl připraven způsobem, který je analogický s odpovídajícím stupněm v příkladu 5.In this example, an alternative method for preparing N- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenylcarbamoyl) -L-glutamic acid will be described. This method represents an alternative to the method described in Example 3. The starting dibenzyl N- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L-glutamate was prepared in a manner analogous to the corresponding step in the Example 5.

-22CZ 287028 B6-22EN 287028 B6

Roztok dibenzyl-N-(4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamátu (1,138 g) v dimethylformamidu (15 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 10% paladia na uhlí po dobu 16 hodin. Po filtraci a odpaření za vakua se zbytek rozpustí v chloroformu (20 ml). Po 18 hodinách se krystalická sraženina odfiltruje a vysuší za vakua, přičemž se získá kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamová.A solution of dibenzyl N- (4- / N, N-bis- (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L-glutamate (1.138 g) in dimethylformamide (15 ml) was hydrogenated in the presence of 10% palladium on carbon for 16 hours. hours. After filtration and evaporation in vacuo, the residue was dissolved in chloroform (20 mL). After 18 hours, the crystalline precipitate was filtered off and dried under vacuum to give N- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenylcarbamoyl) -L-glutamic acid.

Výtěžek: 730 mg (93 %).Yield: 730 mg (93%).

Po rekiystalizaci ze směsi acetonu acetonu a chloroformu se získá produkt tvořený mikroskopickými tyčinkami.After recrystallization from a mixture of acetone acetone and chloroform, a microscopic rod product is obtained.

Teplota tání: 116 až 118 °C, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,0(s) 1H,Melting point: 116-118 ° C, Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 8.0 (s) 1H,

7,2(d)2H,7.2 (d) 2H,

6,6(d) 2H,6.6 (d) 2H,

6,2(d) 2HNH, 4,4(m) 8H, 3,6(m) 8H, 2,5-l,9(m) 4H.6.2 (d) 2HNH, 4.4 (m) 8H, 3.6 (m) 8H, 2.5-1.9 (m) 4H.

Příklad 5Example 5

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)-amino/-3-fluorfenyl-karbamoyl)-L-glutamováN- (4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-fluorophenylcarbamoyl) -L-glutamic acid

K roztoku dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amin/-3-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamátu (0,4 g) v ethylacetátu (10 ml) se přidá 30% paladium na uhlí (50% vlhkost) (160 mg) a získaná směs se míchá pod vodíkovou atmosférou po dobu 1 hodiny. Po odfiltrování hydrogenačního katalyzátoru se filtrát odpaří k suchu. Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amin/-3-fluorfenylkarbamoyl-L-glutamová se získá po rozetření olejovitého zbytku ve směsi ethylacetátu a hexanu ve formě bílého prášku.To a solution of dibenzyl N- (4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amine) -3-fluorophenylcarbamoyl) -L-glutamate (0.4 g) in ethyl acetate (10 mL) was added 30% palladium on carbon (50% humidity) (160 mg) and the resulting mixture was stirred under a hydrogen atmosphere for 1 hour. After filtering off the hydrogenation catalyst, the filtrate was evaporated to dryness. N- (4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amine) -3-fluorophenylcarbamoyl-L-glutamic acid is obtained as a white powder after trituration of the oily residue in a mixture of ethyl acetate and hexane.

Výtěžek: 210 mg, teplota tání: 111 až 114 °C.Yield: 210 mg, m.p. 111-114 ° C.

Výchozí kyselina dibenzyl-N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-fluorfenylkarbamoyl)-Lglutamová se získá následujícím způsobem.The starting dibenzyl-N- (4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-fluorophenylcarbamoyl) -glutamic acid was obtained as follows.

Suspenze 4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/-3-fluoraniliniumoxalátu (3,5 g) v bezvodém ethylacetátu (200 ml) a uhličitanu draselném (5,5 g) se ochladí na teplotu 5 °C pod argonovou atmosférou. K této směsi se přidá roztok fosgenu v toluenu (1,9M, 5,5 ml). Po ukončení přídavku se směs míchá při okolní teplotě po dobu 10 minut, načež se zfiltruje a filtrát se vysuší nad síranem horečnatým. Vysušený filtrát se potom najednou přidá ke směsi dibenzylglutamát-ptoluensulfonátu (5 g), uhličitanu draselného (2 g) a ethylacetátu (100 ml). Přidá se triethylamin (2 ml) a získaná směs se míchá po dobu 20 minut při okolní teplotě. Směs se potom zfiltruje a filtrát se odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu, přičemž eluce se provádí eluční soustavou tvořenou směsí ethylacetátu a hexanu v poměru 1:2 a zodpovídající frakce eluátu se získá požadovaná výchozí látka ve formě oleje, který krystalizuje.A suspension of 4- [N, N-bis- (2-chloroethyl) amino] -3-fluoroaniline oxalate (3.5 g) in anhydrous ethyl acetate (200 mL) and potassium carbonate (5.5 g) was cooled to 5 ° C. under an argon atmosphere. To this mixture was added a solution of phosgene in toluene (1.9 M, 5.5 mL). After the addition was complete, the mixture was stirred at ambient temperature for 10 minutes, filtered, and the filtrate dried over magnesium sulfate. The dried filtrate was then added in one portion to a mixture of dibenzylglutamate-p-toluenesulfonate (5 g), potassium carbonate (2 g) and ethyl acetate (100 ml). Triethylamine (2 mL) was added and the resulting mixture was stirred for 20 minutes at room temperature. The mixture was then filtered and the filtrate was evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel, eluting with ethyl acetate / hexane (1: 2) to give the desired eluate fraction, as an oil which crystallizes.

Výtěžek: 5,5 g, teplota tání: 81 až 84 °C.Yield: 5.5 g, m.p. 81-84 ° C.

4-/N,N-bis(2-chlormethyl)amino/-3-fluoranililiniumoxalát se připraví postupem popsaným v příkladu 3 s výjimkou spočívající vtom, že se jako výchozí látka použije 3,44- (N, N-bis (2-chloromethyl) amino) -3-fluoroanililinium oxalate was prepared according to the procedure described in Example 3 except that 3,4

-23CZ 287028 B6 difluomitrobenzen namísto p-fluomitrobenzenu za vzniku 4-/N,N-bis-(2-hydroxyethyl)amino/fluomitrobenzenu.Difluomitrobenzene instead of p-fluorometrobenzene to give 4- [N, N-bis- (2-hydroxyethyl) amino] fluorometrobenzene.

Teplota tání: 99 až 101 °C.Melting point: 99-101 ° C.

Takto získaný produkt se uvede v reakci s thionylchloridem za podmínek uvedených v příkladu 3 za vzniku 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)-3-fluomitrobenzenu.The product thus obtained is reacted with thionyl chloride under the conditions of Example 3 to give 4- [N, N-bis (2-chloroethyl) -3-fluorometrobenzene].

Teplota tání: 66 až 68 °C.Melting point: 66-68 ° C.

Takto získaný produkt se hydrogenuje za podmínek uvedených v příkladu 3, přičemž se jako rozpouštědlo použije ethylacetát. Směs se zfiltruje a filtrát se odpaří na malý objem a opětovně rozpustí v etheru. Přidá se přebytek nasyceného roztoku kyseliny oxalové v etheru a izoluje se požadovaný 4-/N,N-bis(2-chlormethyl)amino/-3-fluoraniliniumoxalát.The product thus obtained is hydrogenated under the conditions of Example 3 using ethyl acetate as the solvent. The mixture was filtered and the filtrate was evaporated to a small volume and redissolved in ether. An excess of a saturated solution of oxalic acid in ether was added and the desired 4- [N, N-bis (2-chloromethyl) amino] -3-fluoroaniline oxalate was isolated.

Teplota tání: 146 až 148 °C.Melting point: 146-148 ° C.

Příklad 6Example 6

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-chlorfenylkarbamoyl)-L-glutamováN- (4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-chlorophenylcarbamoyl) -L-glutamic acid

Roztok dibenzyl-N-((4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/-3-chlorfenylkarbamoyl))-L-glutamátu (350 mg) v ethylacetátu (30 ml) obsahující 30% paladium na uhlí (70 mg, zvlhčený na 50 %) se míchá pod vodíkovou atmosférou po dobu jedné hodiny. Po filtraci hydrogenační směsi za účelem odstranění hydrogenačního katalyzátoru se filtrát odpaří k suchu a zbytek se rozetře se směsí etheru a ethylacetátu, přičemž se získá kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-chlorfenylkarbamoyl)-L-glutamová ve formě oleje.A solution of dibenzyl N - ((4- / N, N-bis- (2-chloroethyl) amino / -3-chlorophenylcarbamoyl)) - L-glutamate (350 mg) in ethyl acetate (30 mL) containing 30% palladium on carbon ( 70 mg (humidified to 50%) was stirred under a hydrogen atmosphere for one hour. After filtration of the hydrogenation mixture to remove the hydrogenation catalyst, the filtrate was evaporated to dryness and the residue triturated with ether / ethyl acetate to give N- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-chlorophenylcarbamoyl acid. -L-glutamic oil.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,7(s) 1H,Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 8.7 (s) 1H,

7,6(s) 1H,7.6 (s) 1 H,

7,l-7,4(m) 2H,7.1-7.4 (m) 2H,

6,5(d) 1H, 4,2(m) 1H, 3,3-3,6(m) 8H, l,7-2,4(m) 4H.6.5 (d) 1H, 4.2 (m) 1H, 3.3-3.6 (m) 8H, 1.7-2.4 (m) 4H.

Výchozí dibenzyl-4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino-3-chlorkarbamoyl)-L-glutamát se získá postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 3, s výjimkou spočívající vtom, že se jako výchozí látka použije 4-fluor-3-chlomitrobenzen namísto 4-fluomitrobenzenu za vzniku 4-/N,N-bis-(2-hydroxyethylamino)/-3-chlomitrobenzenu ve formě oranžového oleje.The starting dibenzyl 4- (N, N-bis- (2-chloroethyl) amino-3-chlorocarbamoyl) -L-glutamate is obtained by a method analogous to that described in Example 3, except that the starting the compound used 4-fluoro-3-chlorometrobenzene instead of 4-fluorometrobenzene to give 4- [N, N-bis- (2-hydroxyethylamino)] - 3-chlorometrobenzene as an orange oil.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,0-8,2(m) 2H,Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 8.0-8.2 (m) 2H,

7,3(1) 1H,7.3 (1) 1 H,

4,7(t)2H,4.7 (t) 2H,

3,5(m) 8H.3.5 (m) 8H.

Takto získaný produkt se uvede v reakci s thionylchloridem za podmínek popsaných v příkladu 3 za vzniku 4-/N,N-bis-(2-chlorethylamino)-3-chlomitrobenzenu ve formě oleje.The product thus obtained is reacted with thionyl chloride under the conditions described in Example 3 to give 4- [N, N-bis- (2-chloroethylamino) -3-chloronitrobenzene as an oil.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CHC1₃): 8,3(d) 1H,NMR (CHC1 _3): 8.3 (d) 1H;

8,l(q) 1H,8.1 (q) 1H,

7,25(d) 1H,7.25 (d) 1 H,

3,8(t)4H,3.8 (t) 4H,

-24CZ 287028 B6-24GB 287028 B6

3,6(t) 4H.3.6 (t) 4H.

Takto získaný produkt se hydrogenuje postupem popsaným v příkladu 3 za použití ethylacetátu jako rozpouštědla. Hydrogenační katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se odpaří na malý objem, zbytek se opětovně rozpustí v etheru a k získanému roztoku se přidá přebytek nasyceného roztoku kyseliny oxalové v etheru. Oxalátová sůl se oddělí filtrací.The product thus obtained was hydrogenated as described in Example 3 using ethyl acetate as solvent. The hydrogenation catalyst was removed by filtration and the filtrate was evaporated to a small volume, the residue was redissolved in ether and an excess of a saturated solution of oxalic acid in ether was added. The oxalate salt is separated by filtration.

Teplota tání: 118 až 121 °C.Melting point: 118-121 ° C.

Takto získaný produkt se převede na kyselinu dibenzyl-N-(4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/3-chlorfenylkarbamoyl)-L-glutamovou za podmínek popsaných v příkladu 5. Získá se produkt ve formě oleje.The product so obtained was converted to dibenzyl-N- (4- [N, N-bis- (2-chloroethyl) amino) -3-chlorophenylcarbamoyl) -L-glutamic acid under the conditions described in Example 5. The product was obtained as an oil.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,l-7,4(m) 13H,Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 7.1-1.4 (m) 13H,

5,l(s)2H,5.1 (s) 2H,

5,0(s) 2H,5.0 (s) 2H,

4,6(m) 1H,4.6 (m) 1H,

3,5(s) 8H, 2,0-2,6(m) 4H.3.5 (s) 8H, 2.0-2.6 (m) 4H.

Příklad 7Example 7

Typické farmaceutické kompozice obsahující sloučeninu podle vynálezuTypical pharmaceutical compositions comprising a compound of the invention

A) Suché plněné kapsle obsahující 100 mg prekurzoru léčivé látky v kapsliA) Dry filled capsules containing 100 mg of prodrug per capsule

Složka Množství obsažené v kapsli ___________________________________________________________(mg)__________________ Sloučenina100Component Amount contained in the capsule ___________________________________________________________ (mg) __________________ Compound100

Laktóza149Lactose149

Stearát hořečnatý1Magnesium stearate1

Kapsle (velikost č. 1)250Capsules (size 1) 250

Sloučenina může být desintegrována na prášek č. 60 a do takto získaného prášku se potom zavede skrze tkaninu č. 60 laktóza a stearát hořečnatý. Sloučené složky mohou být potom míšeny po dobu asi 10 minut, načež se naplní do suchých želatinových kapslí č. 1.The compound can be disintegrated into powder # 60 and lactose and magnesium stearate are then introduced into the powder thus obtained through fabric # 60. The combined components may then be mixed for about 10 minutes before being filled into No. 1 dry gelatin capsules.

B) TabletaB) Tablet

Typická tableta by měla obsahovat sloučeninu (100 mg), preželatinační škrob (82 mg), mikrokrystalickou celulózu (82 mg) a stearát hořečnatý (1 mg).A typical tablet should contain the compound (100 mg), pregelatinized starch (82 mg), microcrystalline cellulose (82 mg) and magnesium stearate (1 mg).

C) ČípekC) Suppository

Typická čípková formulace pro rektální podání může obsahovat sloučeninu (50 mg), dinatriumkalciumdetát (0,25-0,5 mg) a polyethylenglykol (775-1600 mg). V jiných čípkových formulacích může být dinatriumkalciumedetát nahrazen butylovaným hydroxytoluenem (0,04 až 0,08 mg) a polyethylenglykol může být nahrazen hydrogenovaným rostlinným olejem (675 až 1400 mg), jakým je Supocire L, Wecobee FS, Wecobee M, Witepsols a podobně.A typical suppository formulation for rectal administration may comprise the compound (50 mg), disodium calcium acetate (0.25-0.5 mg) and polyethylene glycol (775-1600 mg). In other suppository formulations, disodium calcium edetate may be replaced with butylated hydroxytoluene (0.04 to 0.08 mg) and polyethylene glycol may be replaced with hydrogenated vegetable oil (675 to 1400 mg) such as Supocire L, Wecobee FS, Wecobee M, Witepsols and the like.

-25CZ 287028 B6-25GB 287028 B6

D) InjekceD) Injection

Typická injikovatelná formulace bude obsahovat sloučeninu (500 mg), benzylalkohol (0,05 ml) a 0,15M hydrogenuhličitan pro injekci (5,0 ml).A typical injectable formulation will contain the compound (500 mg), benzyl alcohol (0.05 mL), and 0.15M bicarbonate for injection (5.0 mL).

Příklad 8 (viz reakční schéma 4)Example 8 (see Reaction Scheme 4)

Kyselina N-(4-/bí-(2-chlorethyl)-N-(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl}-L-glutamováN- (4- [1- (2-chloroethyl) -N- (2-mesyloxyethyl) amino] phenoxycarbonyl} -L-glutamic acid

N-(4-(/N-(2-Chlorethyl), N-(2-mesyloxyethyl)/amino)fenyloxykarbonyl)-L-glutamová kyselina ve formě di-terc.butylesteru (6, kde R’-C1 a R² = OSO2Me) (110 mg) se suspenduje v kyselině trifluoroctové (2,2 ml) a získaná suspenze se míchá po dobu 40 minut při okolní teplotě. Kyselina trifluoroctová se odežene za sníženého tlaku a zbylý olej se zředí ethylacetátem (1 ml) a odpaří, přičemž se získá kyselina N-(4-/N-(2-chlorethyl)-N-(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová ve formě solvátu s 1,02-kyselinou trifluoroctovou a 0,16-ethylacetátem (9, kde R¹ = Cl a R²=OSO2Me).N- (4 - (/ N- (2-Chloroethyl), N- (2-mesyloxyethyl) / amino) phenyloxycarbonyl) -L-glutamic acid in the form of di-tert-butyl ester (6, wherein R'-C1 and R ² = 110 mg) was suspended in trifluoroacetic acid (2.2 ml) and the resulting suspension was stirred at room temperature for 40 minutes. Trifluoroacetic acid was removed under reduced pressure and the residual oil was diluted with ethyl acetate (1 mL) and evaporated to give N- (4- / N- (2-chloroethyl) -N- (2-mesyloxyethyl) amino / phenoxycarbonyl) - L-glutamic acid as a solvate with 1.02-trifluoroacetic acid and 0.16 EtOAc (9, wherein ^R1 = Cl and ^R2 = OSO2).

Výtěžek: 90 mg (95 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum:Yield: 90 mg (95%), nuclear magnetic resonance spectrum:

-CH₂-CH₂-OSO₂Me/-CH₂-CH₂Cl-CH ₂ -CH ₂ -OSO ₂ Me / -CH ₂ -CH ₂ Cl další next 3,15(s)3H, 3,70(m) 6H, 4,30(t) 1H, 3.15 (s) 3H, 3.70 (m) 6H, 4.30 (t), 1H, aromatika aromatics 4,49(t) 1H, 6,75(d) 2H, 4.49 (t) 1 H, 6.75 (d) 2H, 6,92(d) 2H, l,8-2,3(m) 4H, 4,02(m) 1H, 7,90(d) 1H. 6.92 (d) 2H, 1.8-2.3 (m) 4H, 4.02 (m) 1H, 7.90 (d) 1H.

Výchozí di-terc.butylester kyseliny 4-(/N-(2-chlorethyl)-N-(2-mesyloxyethyl)/amino)fenyl— oxykarbonyl-L-glutamové se připraví následujícím způsobem.The starting 4- (N- (2-chloroethyl) -N- (2-mesyloxyethyl) amino) phenyl oxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester was prepared as follows.

Roztok hydrochloridu di-terc.butylesteru kyseliny L-glutamové (4,26 g) a triethylaminu (4 ml) v bezvodém chloroformu (30 ml) se míchá s chladným roztokem 4-nitrofenylchlorformiátu (2,92 g, dostupný u firmy Aldrich). Po 5 hodinách při okolní teplotě se rozpouštědlo odpaří a zbytek se rozpustí v ethylacetátu (70 ml), načež se roztok zfiltruje a filtrát se odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití elučního činidla tvořeného chloroformem, přičemž se zodpovídající frakce eluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-nitrofenyloxykarbonyl-L-glutamové (2) ve formě oleje.A solution of L-glutamic acid di-tert-butyl ester hydrochloride (4.26 g) and triethylamine (4 mL) in anhydrous chloroform (30 mL) was stirred with a cold solution of 4-nitrophenyl chloroformate (2.92 g, available from Aldrich). After 5 hours at room temperature, the solvent was evaporated and the residue was dissolved in ethyl acetate (70 ml), then the solution was filtered and the filtrate was evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel using chloroform, whereby the corresponding eluate fraction gives 4-nitrophenyloxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester (2) as an oil.

Výtěžek: 5,02 g (82 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,33(d) 2H,Yield: 5.02 g (82%), Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 7.33 (d) 2H,

8,24(d) 2H, l,46(s) 9H, l,50(s) 9H,8.24 (d) 2H, 1.46 (s) 9H, 1.50 (s) 9H,

2,0-2,4(m) 4H,2.0-2.4 (m) 4H,

4,32(m) 1H,4.32 (m), 1H,

5,90(d) 1H.5.90 (d) 1H.

-26CZ 287028 B6-26GB 287028 B6

Roztok takto získaného produktu (2) (5,01 g) v kyselině octové (30 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 10% paladia na uhlí po dobu tří dnů. Po zfiltrování se roztok ochladí a k takto ochlazenému roztoku se přidá ethylenoxid (5 ml) a směs se ponechá v klidu při okolní teplotě po dobu 22 hodin. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se rozdělí mezi ethylacetát a vodu. Organická fáze se oddělí, promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluění soustavy tvořené směsí ethylacetátu a chloroformu v poměru 2:1, načež se z odpovídající frakce eluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/bis(2-hydroxyethyl)amino/fenyloxykarbonyl-L-glutamové (4).A solution of the product so obtained (2) (5.01 g) in acetic acid (30 ml) was hydrogenated in the presence of 10% palladium on carbon for three days. After filtration, the solution was cooled and ethylene oxide (5 ml) was added to the cooled solution and the mixture was allowed to stand at ambient temperature for 22 hours. The solvent was evaporated and the residue was partitioned between ethyl acetate and water. The organic phase is separated, washed with water, dried over sodium sulphate and evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel, eluting with a 2: 1 mixture of ethyl acetate and chloroform, to give 4- (bis (2-hydroxyethyl) amino) phenyloxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester ( 4).

Výtěžek: 3,93 g (69 %), teplota tání: 91 až 93 °C.Yield: 3.93 g (69%), m.p. 91-93 ° C.

Roztok takto získaného produktu (4) (0,86 g) v pyridinu (3 ml) se míchá s methansulfonylchloridem (0,6 ml) při teplotě 2 °C po dobu 20 minut a potom ještě při teplotě 50 °C po dobu 10 minut. Reakční směs se potom rozdělí mezi ethylacetát a vodu. Organická fáze se oddělí, promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a dichlormethanu v poměru 1:9, načež se z odpovídající frakce eluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/(2-chlorethyl)-/2(mesyloxy)ethyl/aminofenyloxykarbonyl-L-glutamové (6) ve formě oleje.A solution of the product (4) thus obtained (0.86 g) in pyridine (3 ml) was stirred with methanesulfonyl chloride (0.6 ml) at 2 ° C for 20 minutes and then at 50 ° C for 10 minutes. . The reaction mixture was then partitioned between ethyl acetate and water. The organic phase is separated, washed with water, dried over sodium sulphate and evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel, eluting with ethyl acetate / dichloromethane (1: 9), to give 4 - [(2-chloroethyl) - [2- (mesyloxy) ethyl] aminophenyloxycarbonyl] di-tert-butyl ester from the corresponding eluate fraction. -L-glutamic (6) in the form of an oil.

Výtěžek: 0,44 g (43 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 3,15(s) 3H,Yield: 0.44 g (43%), nuclear magnetic resonance spectrum: 3.15 (s) 3H,

3,70(m) 6H,3.70 (m) 6H,

4,29(t) 2H,4.29 (t) 2H,

6,75(d) 2H,6.75 (d) 2H,

6,92(d) 2H, l,41(s) 9H, l,42(s)9H, l,8-2,3(m) 2H, 3,97(m) 1H, 7,92(d) 1H.6.92 (d) 2H, 1.41 (s) 9H, 1.42 (s) 9H, 1.8-2.3 (m) 2H, 3.97 (m) 1H, 7.92 (d) 1H.

Příklady 9 až 15Examples 9 to 15

Následující sloučeniny uvedené v tabulce 1 byly připraveny postupem popsaným v příkladu 2 za použití výchozích látek a meziproduktů uvedených v dále zařazených tabulkách 2 až 8.The following compounds listed in Table 1 were prepared as described in Example 2 using the starting materials and intermediates listed in Tables 2 to 8 below.

Tabulka 1Table 1

Př.č. Ex. _R5a-t> _R 5a-t> T.t. M.p. C1CH₂CH₂M-C1CH ₂ CH ₂ M- Aromatika Aromatics aCH aCH -CH₂CH₂--CH ₂ CH ₂ - 9 9 CH₃(R^áa)CH ₃ (R ^aa) 160ažl62 °C 160-162 ° C 3,34-3,54(m)8H 3.34-3.54 (m) 8H 6,9-7,22(m)3H; 6.9-7.22 (m) 3H; 4,l(m)lH 4.1 (m) 1H 2,0-2,5 (m)4H 2.0-2.5 (m) 4H 10 10 PrXR⁵’)PrXR ⁵ ') 156ažl58°C 156-158 ° C 3,32-3,55(m)8H 3.32-3.55 (m) 8H 6,95-7,28(m)3H; 6.95-7.28 (m) 3H; 4,l(m)lH 4.1 (m) 1H 2,0-2,49(m)4H 2.0-2.49 (m) 4H 11 11 CH₃(R^sb)CH ₃ (R ^sb ) 124ažl26 °C 124-126 ° C 3,7(m)8H 3.7 (m) 8H 6,5-6,9(m)3H 6.5-6.9 (m) 3H 4,l(m)lH 4.1 (m) 1H l,9-2,3(m)4H 1.9-2.3 (m) 4H 12 12 F(R^Sa)F (R ^Sa ) 3,6(m)8H 3.6 (m) 8H 6,8-7,2(tn)3H 6.8-7.2 (tn) 3H 4,l(m)lH 4.1 (m) 1H 2,0-2,49(m)4H 2.0-2.49 (m) 4H 13 13 -CH=CH-CH=CH- (_R5a-b)-CH = CH-CH = CH- ( _R 5a-b) 3,6(m)8H 3.6 (m) 8H 6,6-8,0(m)6H 6.6-8.0 (m) 6H 4,2(m)lH 4.2 (m) 1H 2,l-2,5(m)4H 2.1-2.5 (m) 4H 14 14 C1(R^51>)C1 (R ^51> ) 106ažl08 °C 106-108 ° C 3,6(m)8H 3.6 (m) 8H 6,7-7, l(m)3H 6.7-7.1 (m) 3H 4,l(m)lH 4.1 (m) 1H l,9-2,4(m)4H 1.9-2.4 (m) 4H 15 15 Dec CÍ(R^Sa)CI (R ^Sa ) 148ažl50 °C 148-150 ° C 3,4—3,54(m)8H 3.4-3.54 (m) 8H 7,0-7,4(m)3H 7.0-7.4 (m) 3H 4,l(m)lH 4.1 (m) 1H 1.9-2,36(m)4H 1.9-2.36 (m) 4H

Ostatní 2,27(s)3H CH₃ 3,7(m)lH CH l,14(d)2H(CH₃)₂ 2,l(s)3HCH₃ Other 2.27 (s) 3H CH ₃ 3.7 (m) 1H CH 1, 14 (d) 2H (CH ₃ ) ₂ 2.1 (s) 3HCH ₃

Sloučeniny z příkladů 9 až 15 byly tedy připraveny způsobem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 2. Sloučenina z příkladu 10 byla takto připravena náhradou 4-amino-3isopropylfenolu (Gilman H. a kol., J. Org. Chem. 19 (1954) 1067-78) za 4-amino-m-kresol použitý ve stupni a). Sloučenina z příkladu 11 byla připravena náhradou 4-amino-2methylfenolu (dostupný u firmy Aldrich) za 4-amino-m-kresol a sloučenina z příkladu 12 byla připravena náhradou 4-amino-3-fluorfenolu (připraveného podle Joumal of the Chemical Society (1964) str. 473) za 4-amino-m-kresol. Sloučenina z příkladu 13 byla připravena náhradou 4-aminonft-l-olu (Aldrich Chemical Co, Ltd.) za 4-amino-m-kresol a sloučenina z příkladu 14 byla připravena náhradou 4-amino-2-chlorfenolu (připraveného podle Joumal of the Američan Chemical Socienty 45, 2192 (1923)) za 4-amino-m-kresol. Sloučenina z příkladu 15 byla připravena náhradou 4-amino-3-chlorfenolu (Berichte, str. 2065 (1938) a Organic Synthesis, sv. 4, str. 148) za 4-amino-m-kresol.Thus, the compounds of Examples 9-15 were prepared in a manner analogous to that described in Example 2. The compound of Example 10 was thus prepared by substituting 4-amino-3-isopropylphenol (Gilman H. et al., J. Org. Chem. 19 ( 1954) 1067-78) for the 4-amino-m-cresol used in step a). Example 11 was prepared by replacing 4-amino-2-methylphenol (available from Aldrich) with 4-amino-m-cresol and Example 12 was prepared by substituting 4-amino-3-fluorophenol (prepared according to the Joumal of the Chemical Society ( 1964), p. 473) for 4-amino-m-cresol. Example 13 was prepared by substituting 4-amino-naphth-1-ol (Aldrich Chemical Co., Ltd.) for 4-amino-m-cresol and Example 14 was prepared by substituting 4-amino-2-chlorophenol (prepared according to Joumal of the American Chemical Societies 45, 2192 (1923)) for 4-amino-m-cresol. Example 15 was prepared by substituting 4-amino-3-chlorophenol (Berichte, p. 2065 (1938) and Organic Synthesis, vol. 4, p. 148) for 4-amino-m-cresol.

Použité výchozí látky a meziprodukty v příkladech 9 až 15 a jejich vlastnosti jsou uvedeny v dále zařazených tabulkách 2 až 8.The starting materials and intermediates used in Examples 9 to 15 and their properties are shown in Tables 2 to 8 below.

Tabulka 2Table 2

R5^a nebo^b R 5 ^a or ^b T.t. nebo NMR M.p. or NMR Odkaz Link Me (R5^a)Me (R 5 ^a) 176 až 179 °C M.p. 176-179 ° C Aldrich Aldrich Pr' (R5^a)Pr '(R 5 ^a) 172 až 175 °C Mp 172-175 ° C Cl (R5_a)Cl (5 _and) 6,5-6,7(m)3H aromatika 6.5-6.7 (m) 3H aromatics J. Chem. Soc. (1928), 2703 J. Chem. Soc. (1928) 2703 8,8(s)lHOH; 4,6(br s)2H NH₂; 159,5 °C8.8 (s) 1HOH; 4.6 (br s) 2H NH _2; 159.5 ° C Me (R5^b)Me (R5 ^b ) 174 až 176 °C Mp 174-176 ° C Aldrich Aldrich Cl (R5_b)Cl (R5 _b ) 146 až 148 °C Mp 146-148 ° C F (R5_a)F (R 5 _a) 6,6-6.9(m)3H aromatika 9,4(s)lHOH; 4,4(m)2HNH₂ 6.6-6.9 (m) 3H aromatics 9.4 (s) 1HOH; 4.4 (m) ₂ 2HNH

DiCH₃ (R5^a = R5^b = 260 až 262 °C (jako hydrochlorid od firmy Aldrich) (R5^a and R5^b 273 °C (jako hydrochlorid od firmy Aldrich) společně znamenají -CH=CH-CH=CH-)DiCH ₃ (R 5 ^a = R 5 ^b = 260 to 262 ° C (as hydrochloride from Aldrich) (R 5 ^a and R 5 ^b 273 ° C (as hydrochloride from Aldrich) together mean -CH = CH-CH = CH-)

-28CZ 287028 B6-28GB 287028 B6

Tabulka 3Table 3

HOHIM

R5^a-b HOCH2CH2N-Aromatika OstatníR5 ^ab HOCH2CH2N-Aromatics Other

Me (R5^a)Me (R 5 ^a) 2,8-3,3 (m) 8H 2.8-3.3 (m) 8H 6,4- 6,9 (m) 3H 6.4- 6.9 (m) 3H 2,03(s)3H CH₃ 2.03 (s) 3H, CH ₃ Pr¹ (R5^a)Pr ¹ (R 5 ^a) 3,0-3,4 (m) 8H 3.0-3.4 (m) 8H 6,6-7,1 (m)3H 6.6-7.1 (m) 3H 3,6(m)lH; l.l(d)6HPr‘ 3.6 (m) 1H; l.l (d) 6HPr ‘ Cl (R5^a)Cl (5 ^and) 3,15-3,54 (m) 8H 3.15-3.54 (m) 8H 6,7- 7,2 (m) 3H 6.7-7.2 (m) 3H CH₃ (R5^b)CH ₃ (R 5 ^b ) 3,3-3,5(m) 8H 3.3-3.5 (m) 8H 6,4- 6,6 (m) 3H 6.4-6.6 (m) 3H 2,06(s)3H CH₃ 2.06 (s) 3H, CH ₃ Cl (R5^b)Cl (R5 ^b ) 3,2-3,6 (m) 8H 3.2-3.6 (m) 8H 6,5-6,8 (m)3H 6.5-6.8 (m) 3H F (R5^a)F (R 5 ^a) 3,1-3,4 (m) 8H 3.1-3.4 (m) 8H 6,5- 6,9 (m) 3H 6.5-6.9 (m) 3H di CH₃ di CH ₃ 2,9-3,4 (m) 8H 2.9-3.4 (m) 8H 6,6- 7,0 (m) 3H 6.6- 7.0 (m) 3H 2,0(s)3H; 2,2(s)3H CH₃ 2.0 (s) 3 H; 2.2 (s) 3 H CH ₃ (R5^a = R5^b =CH₃)(R 5 ^a = R 5 ^b = CH ₃ ) (R5^a a R5^b (R5 ^a and R5 ^b 3,2-3,4 (m) 8H 3.2-3.4 (m) 8H 6,8-8,3 (m) 11H 6.8-8.3 (m) 11H společně znamenají together mean -CH=CH-CH=CH- -CH = CH-CH = CH-

Tabulka 4Table 4

10 R5^a~^b 10 R5 ^to ~ ^b HO HO HOCH₂CH₂N-HO HO HOCH ₂ CH ₂ R^5a R^5b // 4R ^5a R ^5b // 4 Ostatní Other Aromatika Aromatics -ch₂--ch ₂ - Me (R5^a)Me (R 5 ^a) 3,0-3,2 (m) 8H 3.0-3.2 (m) 8H 6,8-7,5 (m) 8H 6.8-7.5 (m) 8H 5,0(s) 2H 5.0 (s) 2H 2,2(s)3H; CH₃ 2.2 (s) 3H; CH ₃ Pr' (R5^a)Pr '(R 5 ^a) 2,9-3,3 (m) 8H 2.9-3.3 (m) 8H 6,8-7,5 (m) 8H 6.8-7.5 (m) 8H 5,0(s) 2H 5.0 (s) 2H 3,6(m)lH; l.l(d)6HPr* 3.6 (m) 1H; l.l (d) 6HPr * Cl (R5^a)Cl (5 ^and) 3,05-3,35 (m) 8H 3.05-3.35 (m) 8H 6,9-7,5 (m) 8H 6.9-7.5 (m) 8H 5,l(s) 2H 5.1 (s) 2H 2,2(s)3H CH₃ 2.2 (s) 3 H CH ₃ CH₃ (R5^b)CH ₃ (R 5 ^b ) 3,1-3,4 (m) 8H 3.1-3.4 (m) 8H 6,9-7,3 (m) 8H 6.9-7.3 (m) 8H 5,0(s) 2H 5.0 (s) 2H Cl (R5^b)Cl (R5 ^b ) 3,3-3,5 (m) 8H 3.3-3.5 (m) 8H 6,8-7,4 (m) 8H 6.8-7.4 (m) 8H 5,0(s) 2H 5.0 (s) 2H F (R5^a)F (R 5 ^a) 3,2-3,4 (m) 8H 3.2-3.4 (m) 8H 6,8-7,5 (m) 8H 6.8-7.5 (m) 8H 5,0(s) 2H 5.0 (s) 2H Di CH₃ Di CH ₃ 2,9-3,3 (m) 8H 2.9-3.3 (m) 8H 6,8-7,4 (m) 8H 6.8-7.4 (m) 8H 5,0(s) 2H 5.0 (s) 2H 2,2(s)3H; 2,l(s)3HCH₃ 2.2 (s) 3H; 2 L (s) 3HCH ₃ (R5^a=R5^b=CH₃)(R 5 ^a = R 5 ^b = CH ₃ ) (R5^a a R5^b (R5 ^a and R5 ^b 3,2-3,4 (m) 8H 3.2-3.4 (m) 8H 6,9-8,3 (m) 6H 6.9-8.3 (m) 6H 5,3(s) 2H 5.3 (s) 2H

společně znamenají -CH=CH-CH=CH~)together mean -CH = CH-CH = CH-)

-29CZ 287028 B6-29GB 287028 B6

Tabulka 5Table 5

0-Clí₂-PhO-Cl ₂ -Ph

R5³”¹¹ R5 ³ ” ¹¹ R¹ R ¹ R² R ² -ch₂ch₂n--ch ₂ ch ₂ n- -CHr- -CHr- Aromatika Aromatics Ostatní Other Me(R5^a)Me (R 5 ^a) Cl Cl Cl Cl 3,3-3,5 (m) 8H 3.3-3.5 (m) 8H 5,08(s) 2H 5.08 (s) 2H 6,8-7,4 (m) 8H 6.8-7.4 (m) 8H 2,3 (s) 3H Me 2.3 (s) 3H Me Pr'(R5^a)Pr '(R 5 ^a) Cl Cl Cl Cl 3,2-3,5 (m) 8H 3.2-3.5 (m) 8H 5,04(s) 2H 5.04 (s) 2H 6,8-7,4 (m) 8H 6.8-7.4 (m) 8H 3,7(m)lH; l,l(d)6H 3.7 (m) 1H; 1.1 (d) 6H Cl(R5^a)Cl (5 ^and) Cl Cl Cl Cl 3,4-3,6 (m) 8H 3.4-3.6 (m) 8H 5,l(s) 2H 5.1 (s) 2H 6,9-7,4 (m) 8H 6.9-7.4 (m) 8H CH₃(R5^b)CH ₃ (R 5 ^b ) Cl Cl Cl Cl 3,3-3,6 (m) 8H 3.3-3.6 (m) 8H 5,l(s) 2H 5.1 (s) 2H 6,9-7,4 (m) 8H 6.9-7.4 (m) 8H Cl(R5^b)Cl (R5 ^b ) Cl Cl Cl Cl 3,6(m) 8H 3.6 (m) 8H 5,l(s) 2H 5.1 (s) 2H 6,8-7,4 (m) 8H 6.8-7.4 (m) 8H F(R5^b)F (R5 ^b ) Cl Cl Cl Cl 3,4-3,6 (m) 8H 3.4-3.6 (m) 8H 5,06(s) 2H 5.06 (s) 2H 6,8-8,4 (m) 8H 6.8-8.4 (m) 8H Di CH₃ Di CH ₃ Cl Cl Cl Cl 3,2-3,5 (m) 8H 3.2-3.5 (m) 8H 5,06(s) 2H 5.06 (s) 2H 6,8-7,4 (m) 7H 6.8-7.4 (m) 7H 2,2(s)3H;2,l(s)3HCH 2.2 (s) 3H; 2.1 (s) 3HCH (R5^a=R5^b=CH₃ (R 5 ^and R 5 = CH ₃ ^B = (R5^a a R5^b (R5 ^a and R5 ^b Cl Cl Cl Cl 3,4-3,7 (m) 8H 3.4-3.7 (m) 8H 5,3(s) 2H 5.3 (s) 2H 7,1-8,3 (m) 11H 7.1-8.3 (m) 11H

společně znamenají -CH=CH-CH=CHTabulka 6together denote -CH = CH-CH = CHTable 6

____________________R5^a~^b ____________________R5 ^a ~ ^b

Pr' (R5^a)Pr '(R 5 ^a)

Me (R5^a)Me (R 5 ^a)

Me (R5^b)Me (R5 ^b )

Cl (R5^b)Cl (R5 ^b )

F (R5^a) (R5^a=R5^b=CH₃) di-CH₃ F (R 5 ^a) (R 5 ^and R 5 = ^b = CH ₃₎ of _di-CH3

R⁵ a R5^b společně znamenají -CH=CH-CH=CHC1 (R^5a)R ^{5 b} and R 5 together denote -CH = CH-CH = CHC1 (R ^5a)

T.t. HCl-soli (°C)M.p. HCl salts (° C)

124 až 127124 to 127

164 až 167164 to 167

122 až 124122 to 124

156 až 158156 to 158

123 až 125123 to 125

144 až 146144 to 146

180 až 184180 to 184

119 až 121119 to 121

-30CZ 287028 B6-30GB 287028 B6

Tabulka 7Table 7

Cl Cl 0 II 0 II z'”' Cl of'"' Cl

R_5a-^b R _5a - ^b -CICH2CH2N- -CICH2CH2N- Aromatika Aromatics Ostatní Other CH₃(R5^a)CH ₃ (R 5 ^a) 3,57(m)4H; 3,35(m)4H 3.57 (m) 4H; 3.35 (m) 4H 7,2-8,4(m)7H 7.2-8.4 (m) 7H 2,32(s)3HCH₃ 2.32 (s) ₃ 3HCH Pr'(R^5a)Pr '(R ^5a ) 3,5(m)4H; 3,34(m)4H 3.5 (m) 4H; 3.34 (m) 4H 7,2-8,4(m)7H 7.2-8.4 (m) 7H 3,7(m)lHCH; l,l(d)2H(CH₃)3.7 (m) 1HCH; l l (d), 2H (CH ₃₎ CH₃(R^5b)CH ₃ (R ^5b ) 3,7(m)4H; 3,32(m)4H 3.7 (m) 4H; 3.32 (m) 4H 6,7-8,4(m)7H 6.7-8.4 (m) 7H 2,2(s)3HCH₃ 2.2 (s) ₃ HCH ₃ 3F 3F 3,5-3,7(m)8H 3.5-3.7 (m) 8H 7,2-8, l(m)7H 7.2-8.1 (m) 7H 1,4-naftyl 1,4-naphthyl 3,5-3,5(m)8H 3.5-3.5 (m) 8H 7,2-8,4(m)10H 7.2-8.4 (m) 10H 2C1 2C1 3,75(m)8H 3.75 (m) 8H 6,7-8,4(m) 7H 6.7-8.4 (m) 7H

Tabulka 8Table 8

Cl _Rsa-b -C1ch₂CH₂N- Aromatika ArCH₂O «CH -CH₂CH₂- ostatníCl _{R a} -b-CH ₂ CH ₂ N- Aromatics ArCH ₂ O-CH-CH ₂ CH ₂ - others

CH₃(R^5a) Pr'(R^5b)CH ₃ (R ^5a ) Pr '(R ^5b ) 3,42(m)8H 3.42 (m) 8H 7,35-6,9(m)13H 7.35-6.9 (m) 13H 5,2(s)2H 5,l(s)2H 5.2 (s) 2H 5.1 (s) 2H 4,4(m)lH 4.4 (m) 1H 2,5-2, l(m)4H 2.5-2.1 (m) 4H 2,3(s)^3HCH₃ 2.3 (s) ^{3 H} CH ₃ 3,5(m) 3,3(m)8H 3.5 (m) 3.3 (m) 8H 7,35-6,7(m)13H 7.35-6.7 (m) 13H 5,2(s)2H 5.2 (s) 2H 4,3(m)lH 4.3 (m) 1H 2,5-2, l(m)4H 2.5-2.1 (m) 4H 3,6(m)lHCH 3.6 (m) 1HCH 5,l(s)2H 5.1 (s) 2H 1,1 (d6H 2xCH₃ 1.1 (d6H 2xCH3 ₎ CH₃(R^5b)CH ₃ (R ^5b ) 3,7(m) 3,3(m)8H 3.7 (m) 3.3 (m) 8H 6,6-7,4(m)13H 6.6-7.4 (m) 13H 5,14(s)2H 5.14 (s) 2H 4,2(m)lH 4.2 (m) 1H 2,5-2, l(m)4H 2.5-2.1 (m) 4H 2,l(s)3H 2.1 (s) 3H 5,09(s)2H 5.09 (s) 2H ch₃ ch ₃ 3F 3F 3,60(m)8H 3.60 (m) 8H 6,7-7,4(m)13H 6.7-7.4 (m) 13H 5,13(s)2H 5,08(s)2H 5.13 (s) 2H 5.08 (s) 2H 4,2(m)lH 4.2 (m) 1H 2,5-2, l(m)4H 2.5-2.1 (m) 4H 1,4-naftyl 1,4-naphthyl 7,l-8,4(m)16H 7.1-1.4 (m) 16H 5,l(s)2H 5,16(s)2H 5.1 (s) 2H 5.16 (s) 2H 4,2(m)lH 4.2 (m) 1H 2,5-2, l(m)4H 2.5-2.1 (m) 4H 2C1 2C1 3,7(m)8H 3.7 (m) 8H 6,7-7,4(m)13H 6.7-7.4 (m) 13H 5,09(s)2H 5,15(s)2H 5.09 (s) 2H 5.15 (s) 2H 4,2(m)lH 4.2 (m) 1H 2,5-2, l(m)4H 2.5-2.1 (m) 4H Cl(R5^a)Cl (5 ^and) 3,45-3,62(m)8H 3.45-3.62 (m) 8H 6,98-7,36(m)13H 6.98-7.36 (m) 13H 5,09(s)2H 5,16(s)2H 5.09 (s) 2H 5.16 (s) 2H 4,2(m)lH 4.2 (m) 1H 2,l-2,5(m)4H 2.1-2.5 (m) 4H

Příklad 16 gama-Anilid kyseliny N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamovéExample 16 N- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid gamma-anilide

-31CZ 287028 B6-31GB 287028 B6

Suspenze alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové kyseliny ve formě gama-anilidu (2,0 g) v ethylacetátu (50 ml) se hydrogenuje v přítomnosti paladia na uhlí (0,15 g) po dobu 4 hodin. Hydrogenační katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se odpaří k suchu za sníženého tlaku při teplotě 35 °C. gama-Anilid kyseliny 4-/N,N-bis(2chorethyl)amino/-fenoxykarbonyl-L-glutamové (1 v reakčním schématu 6) se získá ve formě bílé krystalické látky.A suspension of alpha-benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamic acid as gamma-anilide (2.0 g) in ethyl acetate (50 mL) is hydrogenated in the presence of palladium on carbon (0.15 g) for 4 hours. The hydrogenation catalyst was removed by filtration and the filtrate was evaporated to dryness under reduced pressure at 35 ° C. 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma-anilide (1 in Reaction Scheme 6) was obtained as a white crystalline solid.

Výtěžek: 1,4 g (83 %), teplota tání: 110 °C, elementární analýza: vypočteno nalezenoYield: 1.4 g (83%), melting point: 110 DEG C., elemental analysis: calculated

C(%) H(%) N(%)C (%) H (%) N (%)

54,8 5,22 8,7154.8 5.22 8.71

54,5 5,62 8,31.54.5 5.62 8.31.

Výchozí gama-anilid kyseliny alfa-benzyl-4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylL-glutamové se připraví následujícím způsobem.The alpha-benzyl-4- [N, N-bis- (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma-anilide was prepared as follows.

Ke směsi gama-anilidu kyseliny alfa-benzyl-p-tosyl-L-glutamové (2,8 g) a O-(4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenyl-O'-(4-nitrofenyl)karbonátu (2,0 g v dichlormethanu (30 ml) se přidá triethylamin (2 ml). Získaná směs se míchá při okolní teplotě po dobu 16 hodin, načež se rozpouštědla odstraní za vakua. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (Měrek Art. 9385) za použití eluční soustavy tvořené 10% ethylacetátem vdichlormethanu, načež se zodpovídající frakce eluátu získá gama-anilid kyseliny alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové ve formě bílé pevné látky.To a mixture of alpha-benzyl-p-tosyl-L-glutamic acid gamma-anilide (2.8 g) and O- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenyl-O '- (4-nitrophenyl) of carbonate (2.0 g in dichloromethane (30 mL) was added triethylamine (2 mL)), and the mixture was stirred at ambient temperature for 16 hours, then the solvents were removed in vacuo and the residue chromatographed on silica gel (Meter Art. using 10% ethyl acetate in dichloromethane, the corresponding eluate fraction gave the alpha-benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma-anilide as a white solid.

Výtěžek: 1,9 g (64 %).Yield: 1.9 g (64%).

Výchozí 0-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl-0'-(4-nitrofenyl)karbonát se připraví následujícím způsobem.The starting O- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenyl-O '- (4-nitrophenyl) carbonate was prepared as follows.

Ke směsi 4-nitrofenylchlorformiátu (7,25 g) a 4-(N,N-bis-(2-chlorethyl)amino)fenolhydrochloridu (10 g) v dichlormethanu (100 ml) se v průběhu dvou hodin přidá roztok triethylaminu (10 ml) v dichlormethanu (10 ml). Po 16 hodinovém míchání při okolní teplotě se rozpouštědla odeženou za sníženého tlaku a zbytek se chromatografuje na silikagelu (Měrek Art. 9385). Po eluci dichlormethanem a odpaření eluátu se získá produkt ve formě červeného oleje. Rozetřením tohoto oleje s hexanem se získá žlutý pevný produkt, který se rekrystalizuje ze směsi benzenu a hexanu, přičemž se získá O-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino)penol-O'-(4-nitrofenyl)karbonát ve formě oranžových krystalů.To a mixture of 4-nitrophenyl chloroformate (7.25 g) and 4- (N, N-bis- (2-chloroethyl) amino) phenol hydrochloride (10 g) in dichloromethane (100 mL) was added a solution of triethylamine (10 mL) over two hours. ) in dichloromethane (10 mL). After stirring at room temperature for 16 hours, the solvents were removed under reduced pressure and the residue was chromatographed on silica gel (Meter Art. 9385). Elution with dichloromethane and evaporation of the eluate gave the product as a red oil. Trituration of this oil with hexane gave a yellow solid which was recrystallized from benzene / hexane to give O- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) penol-O '- (4-nitrophenyl) ) carbonate in the form of orange crystals.

Výtěžek: 10,4 g(71 %), teplota tání: 68 °C.Yield: 10.4 g (71%), melting point: 68 ° C.

Výchozí gama-anilid kyseliny p-tosyl-alfa-benzyl-L-glutamové se připraví následujícím způsobem.The starting gamma-anilide of p-tosyl-alpha-benzyl-L-glutamic acid was prepared as follows.

alfa-Benzylester kyseliny N-t-BOC-L-glutamové (10 g) a dicyklohexylkarbodiimid (6,1 g) se rozpustí v dichlormethanu (120 ml) a získaný roztok se míchá při okolní teplotě po dobu 10 minut. Přidá se anilin (2,8 ml) a směs se míchá při okolní teplotě po dobu 16 hodin. Směs se zfiltruje a sraženina se promyje dichlormethanem (2x15 ml). Filtrát se postupně promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2x100 ml) a vodou (100 ml), načež se odpaří. Získaný pevný podíl se rekrystalizuje ze směsi ethylacetátu a hexanu, přičemž se získají bezbarvé destičky.N-t-BOC-L-glutamic acid alpha-benzyl ester (10 g) and dicyclohexylcarbodiimide (6.1 g) were dissolved in dichloromethane (120 mL) and the resulting solution was stirred at ambient temperature for 10 minutes. Aniline (2.8 mL) was added and the mixture was stirred at ambient temperature for 16 hours. The mixture was filtered and the precipitate was washed with dichloromethane (2 x 15 mL). The filtrate was washed successively with saturated sodium bicarbonate solution (2 x 100 mL) and water (100 mL), then evaporated. The solid obtained is recrystallized from ethyl acetate / hexane to give colorless plates.

Výtěžek: 8,2 g (67 %).Yield: 8.2 g (67%).

-32CZ 287028 B6 gama-Anilid (12,0 g) a kyselina p-toluensulfonová (5,4 g) v benzenu (300 ml) se zahřívají na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 40 minut, načež se ponechají přes noc vychladnout. Sraženina se odfiltruje, vysuší odsáváním a rekrystalizuje ze směsi ethylacetátu a methanolu, přičemž se získají bezbarvé destičky gama-anilidu kyseliny tosyl-alfabenzyl-L-glutamové.287028 B6 Gamma-Anilide (12.0 g) and p-toluenesulfonic acid (5.4 g) in benzene (300 mL) were heated at reflux for 40 minutes and allowed to cool overnight. The precipitate was filtered off, suction dried and recrystallized from a mixture of ethyl acetate and methanol to give colorless plates of tosyl-alphabenzyl-L-glutamic acid gamma-anilide.

Výtěžek: 8,2 g (58 %).Yield: 8.2 g (58%).

Příklad 17 gama-terc.Butylamid kyseliny N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamovéExample 17 N- (4- / N, N-Bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid gamma-tert-butylamide

Opakuje se postup popsaný v příkladu 16 za použití gama-terc.butylamidu kyseliny alfa-benzyl4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové namísto gama-anilidu kyseliny alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové za vzniku gamaterc.butylamidu kyseliny 4—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (2 v reakčním schématu 6), kteiý se rekiystalizuje ze směsi ethylacetátu a hexanu, přičemž se získají bezbarvé krystaly.The procedure described in Example 16 was repeated using alpha-benzyl-4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma-tert-butylamide instead of alpha-benzyl-4- / N gamma-anilide. N-bis (2-chloroethyl) amino / phenoxycarbonyl-L-glutamic acid to give 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma-tert-butylamide (2 in Reaction Scheme 6), This was recrystallized from ethyl acetate / hexane to give colorless crystals.

Teplota tání: 129 °C, elementární analýza: vypočteno nalezenoMelting point: 129 DEG C. Elemental analysis: Calculated Found

C(%) H(%) N(%)C (%) H (%) N (%)

51,9 6,32 9,0951.9 6.32 9.09

52,1 6,33 8,96.52.1 6.33 8.96.

gama-terc.Butylamid kyseliny alfa-benzyl—4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylL-glutamové se získá způsobem, který je analogický se způsobem popsaným v příkladu 16 pro gama-anilidový derivát.The alpha-benzyl-4- [N, N-bis- (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma-tert-butylamide was obtained in a manner analogous to that described in Example 16 for the gamma-anilide derivative.

Příklad 18Example 18

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl)-L-glutamováN- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenylcarbamoyl) -L-glutamic acid

Roztok di-terc.butyM-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl-L-glutamátu (0,6 g) v dichlormethanu (6 ml) se ochladí na teplotu 0 °C a k takto ochlazenému roztoku se přidá kyselina trifluoroctová (15 ml). Tento roztok se potom ponechá při teplotě 0 °C po dobu 3 dnů. Roztok se potom odpaří k suchu, přičemž se získá kyselina (4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl-L-glutamová ve formě oleje.A solution of di-tert-butyl N- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenylcarbamoyl L-glutamate (0.6 g) in dichloromethane (6 mL) was cooled to 0 ° C and cooled to 0 ° C. trifluoroacetic acid (15 mL) was added to the solution. This solution is then left at 0 ° C for 3 days. The solution was then evaporated to dryness to give (4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenylcarbamoyl-L-glutamic acid as an oil.

Výtěžek: 0,49 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: Yield: 0.49 g, nuclear magnetic resonance spectrum: 8,46(s) 1H, 7,15(m)3H, 6,4(d) 1H, 4,18(m) 1H, 3,55(m) 4H, 3,35(m) 4H, 2,3(m) 2H, 2,23(s) 3H, 2,0(m) 2H. 8.46 (s) 1H, 7.15 (m) 3H, 6.4 (d) 1H, 4.18 (m) 1H, 3.55 (m) 4H, 3.35 (m) 4H, 2, 3 (m) 2H, 2.23 (s) 3H, 2.0 (m) 2H.

Výchozí di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl-L-glutamát se připraví následujícím způsobem.The starting di-tert-butyl 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -3-methylphenylcarbamoyl-L-glutamate was prepared as follows.

-33CZ 287028 B6-33GB 287028 B6

K roztoku 3-methyl-4-nitroanilinu (joumal of Organic Chemistry 33, 3498 (1968) (7,6 g) v ethylacetátu (150 ml) se přidá uhličitan draselný (27,5 g), načež se ke směsi po kapkách přidá 1,9M roztok fosgenu v toluenu (27,5 ml), přičemž se udržuje teplota nižší než 30 °C. Směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu jedné hodiny. Ke směsi se přidá di-terc.butylester kyseliny L-glutamové (13 g) a směs se míchá přes noc při okolní teplotě. Roztok se potom zfiltruje, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří, přičemž se získá produkt ve formě oleje. Tento olej se potom chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 3:1, načež se z příslušné frakce eluátu získá terc.butyl(3-methyl-4-nitrofenylkarbamoyl-L-glutamát ve formě oleje.To a solution of 3-methyl-4-nitroaniline (joumal of Organic Chemistry 33, 3498 (1968) (7.6 g) in ethyl acetate (150 mL) was added potassium carbonate (27.5 g), followed by dropwise addition to the mixture. A 1.9 M solution of phosgene in toluene (27.5 mL) while maintaining the temperature below 30 ° C. The mixture is then stirred at ambient temperature for one hour, followed by the addition of L-glutamic acid di-tert-butyl ester ( The solution was then filtered, washed with water, and the organic layer was dried over magnesium sulfate and evaporated to give the product as an oil, which was then chromatographed on silica gel, eluting with a silica gel column. tert-butyl (3-methyl-4-nitrophenylcarbamoyl-L-glutamate) was obtained as an oil from the appropriate eluate fraction.

Výtěžek: 11,19 g (51 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 9,16(s) 1H,Yield: 11.19 g (51%), Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 9.16 (s) 1H,

8,0(d) 1H, 7,43(m) 2H, 6,70(d) 1H, 4,l(m) 1H, 2,5 l(d) 3H, 2,25(m) 2H, l,8(m) 2H, l,41(d) 8H.8.0 (d) 1H, 7.43 (m) 2H, 6.70 (d) 1H, 4.1 (m) 1H, 2.5 L (d) 3H, 2.25 (m) 2H, 1 .88 (m) 2H, 1.41 (d) 8H.

Roztok di-terc.butyl-3-methyl-4-nitrofenylkarbamoyl-L-glutamátu (4,7 g) v ethylacetátu (125 ml) se hydrogenuje v přítomnosti paladia na uhlí (0,5 g). Získaná směs se potom zfiltruje přes Celíte (přečištěná a kalcinovaná rozsivková zemina, velikost částic 20 až 45 pm, komerčně dostupná mezi jinými také u firmy Fluka Chemicals Ltd.) a filtrát se odpaří, přičemž se získá tmavý pevný produkt. Tento produkt se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a hexanu v poměru 1:1, načež se z eluátu získá di-terc.butyl-3methyl—4-aminofenylkarbamoyl-L-glutamát ve formě oleje.A solution of di-tert-butyl 3-methyl-4-nitrophenylcarbamoyl L-glutamate (4.7 g) in ethyl acetate (125 mL) was hydrogenated in the presence of palladium on carbon (0.5 g). The resulting mixture was then filtered through Celite (purified and calcined diatomaceous earth, particle size 20-45 µm, commercially available, among others, also from Fluka Chemicals Ltd.), and the filtrate was evaporated to give a dark solid product. The product is chromatographed on silica gel, eluting with ethyl acetate / hexane (1: 1), to give di-tert-butyl-3-methyl-4-aminophenylcarbamoyl-L-glutamate as an oil.

Výtěžek: 3,7 1 g (83 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 7,98(s) 1H,Yield: 3.7 g (83%), nuclear magnetic resonance spectrum: 7.98 (s) 1H,

6,9(m) 2H,6.9 (m) 2H,

6,52(d) 1H, 6,15(d) 1H, 4,53(s) 2H, 4,15(m) 1H, 2,25(m) 2H, 2,04(s) 3H, l,8(m) 2H, l,45(d)18H.6.52 (d) 1H, 6.15 (d) 1H, 4.53 (s) 2H, 4.15 (m) 1H, 2.25 (m) 2H, 2.04 (s) 3H, 1, Δ (m) 2H, 1.45 (d) 18H.

Do roztoku di-terc.butyl-3-methyl-4-aminofenylkarbamoyl-L-glutamátu (5 g) v ledové kyselině octové (25 ml) a vodě (25 ml) se zavede probubláním ethylenoxid (4,8 g). Roztok se potom míchá při okolní teplotě po dobu 24 hodin. Po odpaření k suchu se zbytek opětovně rozpustí v ethylacetátu, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří, přičemž se získá di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/-3methylfenylkarbamoyl-L-glutamát, který se použije bez dalšího čistění.To a solution of di-tert-butyl 3-methyl-4-aminophenylcarbamoyl-L-glutamate (5 g) in glacial acetic acid (25 mL) and water (25 mL) was bubbled ethylene oxide (4.8 g). The solution was then stirred at ambient temperature for 24 hours. After evaporation to dryness, the residue was redissolved in ethyl acetate, washed with water, and the organic layer was dried over magnesium sulfate and evaporated to give di-tert-butyl-4- (N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino) -3-methylphenylcarbamoyl -L-glutamate, which was used without further purification.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,35(s) 1H,Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 8.35 (s) 1H,

7,l(m)3H,7.1 (m) 3H,

6,35(d) 1H, 4,15(m) 1H, 3,3 5(m) 4H,6.35 (d) 1 H, 4.15 (m) 1 H, 3.3 5 (m) 4 H,

-34CZ 287028 B6-34GB 287028 B6

3,05(m) 4H, 2,25(m) 2H, 2,20(s) 3H, l,8(m) 2H, l,45(d) 18H. 3.05 (m) 4H, 2.25 (m) 2H, 2.20 (s) 3H, 1.8 (m) 2H, 1.45 (d) 18H.

K roztoku di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/-3-methylfenylkarbamoyl-L-glutamátu (4 g) v pyridinu (60 ml) se pod argonovou atmosférou a při udržování teploty pod 30 °C po kapkách přidá methansulfonylchlorid (3,8 ml). Po ukončení uvedeného přídavku se roztok míchá při teplotě 80 °C po dobu dvou hodin. Roztok se potom ochladí a nalije do 10% kyseliny citrónové (500 ml), extrahuje ethylacetátem, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a potom odpaří, přičemž se získá hnědý olej. Tento olej se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 5:1, přičemž se získá di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/3-methylfenylkarbamoyl-Lglutamát ve formě oleje.To a solution of di-tert-butyl-4- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] -3-methylphenylcarbamoyl-L-glutamate (4 g) in pyridine (60 mL) was added under argon atmosphere while maintaining the temperature below Methanesulfonyl chloride (3.8 mL) was added dropwise at 30 ° C. After the addition was complete, the solution was stirred at 80 ° C for two hours. The solution was then cooled and poured into 10% citric acid (500 mL), extracted with ethyl acetate, washed with water, and the organic layer was dried over magnesium sulfate and then evaporated to give a brown oil. This oil is chromatographed on silica gel, eluting with hexane / ethyl acetate (5: 1) to give di-tert-butyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] -3-methylphenylcarbamoyl-glutamate. in the form of oil.

Výtěžek: 7,23 g (28 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: Yield: 7.23 g (28%). nuclear magnetic resonance spectrum: 8,42(s) 1H, 7,l(m) 1H, 6,36(d) 1H, 4,13(m) 1H, 3,50(m) 4H, 3,3 l(m) 4H, 2,3(m) 2H, 2,23(s) 3H, l,9(m)2H, l,4(s)9H, l,35(s) 9H. 8.42 (s) 1H, 7.1 (m) 1H, 6.36 (d) 1H, 4.13 (m) 1H, 3.50 (m) 4H, 3.3 l (m) 4H, 2 3 (m) 2H, 2.23 (s) 3H, 1.9 (m) 2H, 1.4 (s) 9H, 1.35 (s) 9H.

Reakční sekvence pro tento příklad je uvedena v reakčním schématu 7.The reaction sequence for this example is shown in Reaction Scheme 7.

Příklad 19Example 19

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/benzylkarbonyl)-L-glutamováN- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino / benzylcarbonyl) -L-glutamic acid

Di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamát (0,5 g) se rozpustí v methylenchloridu (1,5 ml) a k získanému roztoku se přidá kyselina trifluoroctová (1,5 ml). Roztok se míchá při okolní teplotě po dobu dvou hodin. Roztok se potom odpaří, přičemž se získá požadovaná sloučenina ve formě oleje.Di-tert-butyl 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) benzylcarbonyl-L-glutamate (0.5 g) was dissolved in methylene chloride (1.5 mL) and trifluoroacetic acid ( 1.5 ml). The solution was stirred at ambient temperature for two hours. The solution was then evaporated to give the title compound as an oil.

Výtěžek: 0,8 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: Yield: 0.8 g, nuclear magnetic resonance spectrum: 8,22(d) 1H, 7,10(d) 2H, 6,66(d) 2H, 4,19(m) 1H, 3,69(s) 8H, 2,24(m) 2H, l,9(m) 2H, 3,32(s) 2H. 8.22 (d) 1H, 7.10 (d) 2H, 6.66 (d) 2H, 4.19 (m) 1H, 3.69 (s) 8H, 2.24 (m) 2H, 1, Δ (m) 2H, 3.32 (s) 2H.

Výchozí di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamát se připraví následujícím způsobem.The starting di-tert-butyl 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) benzylcarbonyl-L-glutamate was prepared as follows.

-35CZ 287028 B6-35GB 287028 B6

K roztoku kyseliny 4-nitrofenyloctové (5,4 g) v dimethylformamidu (75 ml) se přidá 1hydroxybenzotriazol (4,05 g). K získané směsi se přidá di-terc.butylester kyseliny L-glutamové (7,77 g) a potom dicyklohexylkarbodiimid (6,2 g). Směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu 18 hodin. Směs se zfiltruje a filtrát se promyje nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a 0,5M kyselinou chlorovodíkovou, načež se vysuší a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 2:1, načež se z eluátu získá di-terc.butyl-4-nitrobenzylkarbonyl-L-glutamát ve formě oleje.To a solution of 4-nitrophenylacetic acid (5.4 g) in dimethylformamide (75 mL) was added 1-hydroxybenzotriazole (4.05 g). L-Glutamic acid di-tert-butyl ester (7.77 g) was added followed by dicyclohexylcarbodiimide (6.2 g). The mixture was then stirred at ambient temperature for 18 hours. The mixture was filtered and the filtrate was washed with saturated sodium bicarbonate solution, water and 0.5M hydrochloric acid, then dried and evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel, eluting with hexane / ethyl acetate 2: 1, to give di-tert-butyl-4-nitrobenzylcarbonyl-L-glutamate as an oil.

Výtěžek: 9,7 g (77 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,2(d) 2H,Yield: 9.7 g (77%), nuclear magnetic resonance spectrum: 8.2 (d) 2H,

7,45(d)2H,7.45 (d) 2H,

6,45(d) 1H, 4,45(m) 1H, 3,15(s) 2H, l,4(d)9H, l,35(s) 9H.6.45 (d) 1H, 4.45 (m) 1H, 3.15 (s) 2H, 1.4 (d) 9H, 1.35 (s) 9H.

Roztok di-terc.butyl-4-nitrobenzylkarbonyl-L-glutamátu (9,7 g) v ethylacetátu (200 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 30% paladia na uhlí (900 mg). Směs se potom zfiltruje přes Celíte a filtrát se odpaří, přičemž se získá žlutý olej (di-terc.butyl-4-aminobenzylkarbonyl-L-glutamát), který se použije bez dalšího čistění.A solution of di-tert-butyl-4-nitrobenzylcarbonyl-L-glutamate (9.7 g) in ethyl acetate (200 mL) was hydrogenated in the presence of 30% palladium on carbon (900 mg). The mixture was then filtered through Celite and the filtrate was evaporated to give a yellow oil (di-tert-butyl-4-aminobenzylcarbonyl-L-glutamate) which was used without further purification.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,23(d) 1H, 6,92(d) 2H, 6,50(d) 2H, 4,86(s) 2H, 4,15(m) 1H, 3,24(s) 2H, 2,22(m) 2H, l,8(m) 2H, l,4(d) 18H, výtěžek: 8,2 g (90 %).Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 8.23 (d) 1H, 6.92 (d) 2H, 6.50 (d) 2H, 4.86 (s) 2H, 4.15 (m) 1H, 3.24 (s) 2H, 2.22 (m) 2H, 1.8 (m) 2H, 1.4 (d) 18H, Yield: 8.2 g (90%).

K roztoku di-terc.butyl-4-aminobenzylkarbonyl-L-glutamátu (8,2 g) v ledové kyselině octové (40 ml) a vodě (40 ml) se přidá ethylenoxid (7,1 g). Směs se potom míchá při okolní teplotě po dobu 24 hodin. Roztok se odpaří k suchu a zbytek se opětovně rozpustí v etheru, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a odpaří, přičemž se získá produkt ve formě oleje (di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamát, 6,3 g), který se použije bez dalšího čistění.To a solution of di-tert-butyl-4-aminobenzylcarbonyl-L-glutamate (8.2 g) in glacial acetic acid (40 mL) and water (40 mL) was added ethylene oxide (7.1 g). The mixture was then stirred at ambient temperature for 24 hours. The solution was evaporated to dryness and the residue redissolved in ether, washed with water, and the organic layer was dried over magnesium sulfate and evaporated to give the product as an oil (di-tert-butyl-4- / N, N-bis (2)). (hydroxyethyl) amino / benzylcarbonyl-L-glutamate, 6.3 g), which was used without further purification.

Výtěžek: 6,3 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 8,16(d) 1H,Yield: 6.3 g, Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 8.16 (d) 1H,

7,02(d) 2H, 6,85(d) 2H, 4,l(m) 1H, 3,4(m) 8H, 3,25(s) 2H, 2,25(m) 2H, l,8(m) 2H, l,4(s) 18H.7.02 (d) 2H, 6.85 (d) 2H, 4.1 (m) 1H, 3.4 (m) 8H, 3.25 (s) 2H, 2.25 (m) 2H, 1, Δ (m) 2H, 1.4 (s) 18H.

K roztoku di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamátu (2,88 g) v pyridinu (45 ml) se pod atmosférou argonu po kapkách přidá methansulfonylchloridTo a solution of di-tert-butyl-4- [N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino] benzylcarbonyl-L-glutamate (2.88 g) in pyridine (45 mL) was added dropwise methanesulfonyl chloride under argon.

-36CZ 287028 B6 (2,91 ml), přičemž se udržuje teplota nižší než 25 °C. Po ukončení přídavku se roztok míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 80 °C. Roztok se potom ochladí a nalije do 10% kyseliny citrónové (500 ml), extrahuje etherem, promyje vodou a organická vrstva se vysuší nad síranem hořečnatým a potom odpaří, přičemž se získá hnědý olej. Tento olej se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 2:1, přičemž se získá di-terc.butyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/benzylkarbonyl-L-glutamát ve formě oleje.287028 B6 (2.91 mL), maintaining the temperature below 25 ° C. After the addition was complete, the solution was stirred for one hour at 80 ° C. The solution was then cooled and poured into 10% citric acid (500 mL), extracted with ether, washed with water, and the organic layer was dried over magnesium sulfate and then evaporated to give a brown oil. This oil was chromatographed on silica gel, eluting with hexane / ethyl acetate (2: 1) to give di-tert-butyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] benzylcarbonyl-L-glutamate. in the form of oil.

Výtěžek: 1,3 g (42 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: Yield: 1.3 g (42%), nuclear magnetic resonance spectrum: 8,19(d) 1H, 7,10(d) 2H, 6,66(d) 2H, 4,10(m) 1H, 3,69(s) 8H, 3,32(s) 2H, 2,2 l(m) 2H, l,9(m) 2H, l,37(d) 18H, 8.19 (d) 1H, 7.10 (d) 2H, 6.66 (d) 2H, 4.10 (m) 1H, 3.69 (s) 8H, 3.32 (s) 2H, 2, 2 L (m) 2H, 1.9 (m) 2H, 1.37 (d) 18H,

výtěžek: 1,32 g (42 %).yield: 1.32 g (42%).

Reakční sekvence pro tento příklad je uvedena v reakčním schématu 8.The reaction sequence for this example is shown in Reaction Scheme 8.

Příklad 20Example 20

Kyselina N-(4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamováN- (4- / N, N-bis- (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L-glutamic acid

Roztok di-terc.butyl-4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl-L-glutamátu (připraven postupem popsaným v příkladu 3) (500 mg) v 98% kyselině mravenčí (10 ml) se ponechá stát při okolní teplotě po dobu 24 hodin. Roztok se potom odpaří k suchu a zbytek se chromatografuje na silikagelu Měrek Art. 9385 za použití eluční soustavy tvořené směsí dichlormethanu, ethylacetátu a kyseliny mravenčí v poměru 7:2:1, přičemž se získá požadovaná sloučenina ve formě oleje, který krystalizuje.A solution of di-tert-butyl-4- [N, N-bis- (2-chloroethyl) amino] phenylcarbamoyl L-glutamate (prepared as described in Example 3) (500 mg) in 98% formic acid (10 mL) was added allow to stand at ambient temperature for 24 hours. The solution is then evaporated to dryness and the residue is chromatographed on silica gel Merek Art. 9385, eluting with dichloromethane: ethyl acetate: formic acid (7: 2: 1) to give the title compound as an oil which crystallizes.

Teplota tání: 117 až 119 °C.Melting point: 117-119 ° C.

Příklad 21Example 21

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/-3-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamováN- (4- (N, N-bis (2-bromoethyl) amino) -3-fluorophenylcarbamoyl) -L-glutamic acid

Roztok dibenzyl-4/N,N-bis(2-bromethyl)amino-3-fluorfenylkarbamoyl-L-glutamátu (0,5 g) v ethylacetátu (10 ml) a 30% paladium na uhlí (100 mg) se míchá pod atmosférou vodíku po dobu 6 hodin. Katalyzátor se odfiltruje a filtrát se odpaří, přičemž se získá olej, tvořící požadovanou sloučeninu.A solution of dibenzyl 4 / N, N-bis (2-bromoethyl) amino-3-fluorophenylcarbamoyl L-glutamate (0.5 g) in ethyl acetate (10 mL) and 30% palladium on carbon (100 mg) was stirred under an atmosphere. hydrogen for 6 hours. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated to give an oil which forms the desired compound.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 8,6(s) 1H, 7,35(dd) 1H, 7,l-6,8(m) 2H, 6,5(d) 1H, 4,2(m) 1H, 3,7-3,2(m) 8H, 2,4-l,6(m) 4H. 8.6 (s) 1H, 7.35 (dd), 1H, 7.1-6.8 (m) 2H, 6.5 (d) 1 H, 4.2 (m) 1H, 3.7-3.2 (m) 8H, 2.4-1.6 (m) 4H.

Výchozí látka pro tuto reakci se připraví postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 5 s výjimkou spočívající v tom, že se použije thionylbromid namísto thionylchloridu.The starting material for this reaction was prepared in a manner analogous to that described in Example 5 except that thionyl bromide was used instead of thionyl chloride.

Tabulka 9Table 9

XX

CO-H i ² NH-CO-NH-CH-CH₂-CH₂-CO₂HCO-H ² NH-CO-NH-CH-CH ₂ -CH ₂ -CO ₂ H

Příklad č. Example # X X R R Teplota tání Melting point 22 22nd Cl Cl F F 111 až 114 °C Mp 111-114 ° C 23 23 Cl Cl Cl Cl olej oil 24 24 Cl Cl CN CN 105 až 107 °C 105-107 ° C

Nukleární magnetickorezonanční spektrum sloučeniny 23:Nuclear Magnetic Resonance Spectrum of Compound 23:

8,6(šir.) 1H, 7,6(m) 1H, 7,2(m) 2H, 4,25(m) 1H, 3,6-3,3(m) 8H, 2,4-l,7(m) 4H.8.6 (broad) 1H, 7.6 (m) 1H, 7.2 (m) 2H, 4.25 (m) 1H, 3.6-3.3 (m) 8H, 2.4-1 .7 (m) 4H.

Výchozí látky a meziprodukty použité při přípravě sloučenin podle příkladů 21 až 24 a jejich vlastnosti jsou uvedeny v následujících tabulkách 10 až 13.The starting materials and intermediates used in the preparation of the compounds of Examples 21 to 24 and their properties are shown in Tables 10 to 13 below.

Tabulka 10Table 10

R F Cl CNR F Cl CN

Teplota tání až 101 °C olej⁺⁾ Melting point up to 101 ° C oil ⁺⁾

151 až 154 °CMp 151-154 ° C

+) NMR(DMSOd₆: 8,15(d) 1H, 8,05(q) 1H, 7,3(d) 1H, 4,65(t)2H(OH), 3,5(m) 8H.+) NMR (DMSO-d _6: 8.15 (d) 1H, 8.05 (q) 1H; 7.3 (d) 1H, 4.65 (t), 2H (OH), 3.5 (m) 8H.

-38CZ 287028 B6-38GB 287028 B6

Tabulka 11Table 11

XX

ClCl

ClCl

ClCl

F Cl CNF Cl CN

Teplota tání až 68 °C Olej⁺⁾ Melting point up to 68 ° C Oil ⁺⁾

106 až 109 °C106-109 ° C

Br až 68 °CBr to 68 ° C

+)NMR(CDC1₃): 8,3(d) 1H, 8,l(q) 1H, 7,25(d) 1H, 3,75(t) 4H, 3,6(t) 4H.+) NMR (CDC1 _3): 8.3 (d) 1H, 8 (q) 1H; 7.25 (d) 1H, 3.75 (t) 4H; 3.6 (t) 4H.

Tabulka 12Table 12

X X R R Teplota tání (oxalátové soli) Melting point (oxalate salts) Cl Cl F F 146 až 148 °C Mp 146-148 ° C Cl Cl Cl Cl 118 až 121 °C Mp 118-121 ° C Cl Cl CN CN 112 až 116°C Mp 112-116 ° C Br Br F F 134 až 136 °C Mp 134-136 ° C

Tabulka 13Table 13

X Cl Cl Cl BrX Cl Cl Cl Br

R F Cl CNR F Cl CN

FF

Teplota tání až 84 °C olej⁺⁾ olej⁴“¹) olej^w>) Melting point up to 84 ° C oil ⁺⁾ oil ⁴ “ ¹ ) oil ^w>)

+) NMR(CDC1₃): 7,4(m) 1H, 7,3(m) 10H, 7,l(m) 2H, 5,2(s) 2H, 4,6(m), 1H, 3,5-3,4(m)+) NMR (CDC1 _3): 7.4 (m) 1H; 7.3 (m) 10H, 7 (m) 2H; 5.2 (s) 2H; 4.6 (m), 1H, 3 , 5-3.4 (m)

8H, 2,6-2,0(m) 4H8H, 2.6-2.0 (m) 4H

-39CZ 287028 B6-39GB 287028 B6

++) NMR(CDC1₃):++) NMR (CDC1 _3): 8,25(s) 1H, 7,6(m) 2H, 7,4-7,2(m) 10H, 7,l(d) 1H, 6,2(d)lH(NH), 5,2(s) 2H, 5,l(s) 2H, 5,l(s) 2H, 4,6(m) 1H, 3,7-3,5(m) 8H, 2,7-2,2(m) 4H 8.25 (s) 1H, 7.6 (m) 2H, 7.4-7.2 (m) 10H, 7.1 (d) 1H, 6.2 (d) 1H (NH), 5.2 (with) 2H, 5.1 (s) 2H, 5.1 (s) 2H, 4.6 (m) 1H, 3.7-3.5 (m) 8H, 2.7-2.2 (m) 4H +++) NMR: +++) NMR: 7,4-6,8(m) 13H, 5,7(d) 1H, 5,2(s) 2H, 5,l(s) 2H, 4,6(m) 1H, 3,7-3,3(m) 7.4-6.8 (m) 13H, 5.7 (d) 1H, 5.2 (s) 2H, 5.1 (s) 2H, 4.6 (m) 1H, 3.7-3, 3 (m) 5 5 8H, 2,6-1,9(m) 4H. 8H, 2.6-1.9 (m) 4H.

Příklady 25 až 32Examples 25 to 32

Způsobem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 1, avšak s výjimkami ío uvedenými dále, se připraví následující sloučeniny.The following compounds were prepared in a manner analogous to that described in Example 1, except as described below.

C0,H η I ² C0, H and I ²

O-C-NH-C-ZO-C-NH-C-Z

HH

Tabulka 14Table 14

Příklad č, ________________-ZExample no, ________________- Z

OO

II -ch₂-ch₂-c-nh₂ oII _-CH2-CH2 -C-NH ₂ of

IIII

H // ^N H // ^N

-ch₂-s—/ || \ ^.N-ch ₂ -s— / || \ ^ .N

N·^N · ^

HH

NH₂ NH ₂

-40CZ 287028 B6-40GB 287028 B6

Nukleární magnetickorezonanční spektra sloučenin z příkladů 25 až 32 jsou uvedena v následující tabulce 15.The nuclear magnetic resonance spectra of the compounds of Examples 25 to 32 are shown in Table 15 below.

Př. č. Ex. C. C1CH₂CH₂N-C1CH ₂ CH ₂ N- Aromatika Aromatics aCH aCH ch₂-xch ₂ -x Ostatní Other 25 25 3,69(m)8H 3.69 (m) 8H 6,7-6,9(m)4H 6.7-6.9 (m) 4H 3,97(m)lH 3.97 (m) 1H l,79-l,99(m)2H 1.79-1.99 (m) 2H 2,2(t)2H 6,7(bs)lH 7,27(bs)lH 7,89(bs)lH 2.2 (t) 2H 6.7 (bs) 1H 7.27 (bs) 1H 7.89 (bs) 1H 26 26 3,70(s)8H 3.70 (s) 8H 6,70-6,93(-)4H 6.70-6.93 (-) 4H 4,0(m)lH 4.0 (m) 1H l,85-2,2(m)2H 1.85-2.2 (m) 2H 2,42(m)2H 3,19(s)3H 7,90(d)lH 2.42 (m), 2H 3.19 (s) 3H 7.90 (d) 1H 27 27 Mar: 3,71(s)8H 3.71 (s) 8H 6,69-7,3 8(m)8H 6.69-7.3 δ (m) 8H 4,04(m)lH 4.04 (m) 1H l,9-2,l(m)2H 1.9-2.1 (m) 2H 2,45(m)2H 2,26(s)3H 7,89(d)lH 9,83(s)lH 2.45 (m) 2H 2.26 (s) 3H 7.89 (d) 1H 9.83 (s) 1H 28 28 3,73(s)8H 3.73 (s) 8H 6,7-6,9(m)4H 6.7-6.9 (m) 4H 4,08(m)lH 4.08 (m) 1H 2,l-2,27(m)2H 2.1-2.2 (m) 2H 3,03(t)2H 8,03(d)lH 12,79(bs)lH 3.03 (t) 2H 8.03 (d) 1H 12.79 (bs) 1H 29 29 3,69(s)8H 3.69 (s) 8H 6,72-6,93 (m)4H 6.72-6.93 (m) 4H 4,38(m)lH 4.38 (m) 1H 3,46-3,8(m)2H 3.46-3.8 (m) 2H 8,12(d)lH 8.12 (d) 1H 30 30 3,70(s)8H 3.70 (s) 8H 6,6-7,6(m)8H 6.6-7.6 (m) 8H 4,05(m)lH 4.05 (m) 1H l,8-2,3(m)2H 1.8-2.3 (m) 2H 2,45(m)2H 3,50(s)2H 7,0(d)lH 9,9(s)lH 12,5(šir. s) 2.45 (m) 2H 3.50 (s) 2H 7.0 (d) 1H 9.9 (s) 1H 12.5 (w) 31⁺⁾ 31 ⁺⁾ 3,67(s)8H 3.67 (s) 8H 6,5-8,5(m)8H 6.5-8.5 (m) 8H 4,10(m)lH 4.10 (m) 1H l,8-2,3(m)2H 1.8-2.3 (m) 2H 2,5(m)2H 2.5 (m) 2H 32 32 3,70(s)8H 3.70 (s) 8H 6,22-7,2 l(m) 6.22-7.2 l (m) 4,03(m)lH 4.03 (m) 1H l,8-2,2(m)2H 1.8-2.2 (m) 2H 2,50(m)2H 2.50 (m), 2H

7,79(d)lH7.79 (d) 1H

9,52(s)lH9.52 (s) 1H

+) NMR s přidaným CD₃CO₂D+) NMR with added CD ₃ CO ₂ D

Sloučenina z příkladu 25 se připraví postupem, který je popsán v příkladu 1 s výjimkou spočívající vtom, že se při hydrogenační reakci použije alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamin, jehož příprava je popsána dále. K ethylacetátu v hydrogenační směsi se přidá tetrahydrofuran za účelem podpoření rozpuštění výše uvedené alfa-benzylové sloučeniny.The compound of Example 25 was prepared according to the procedure described in Example 1, except that alpha-benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamine was used in the hydrogenation reaction. is described below. Tetrahydrofuran is added to the ethyl acetate in the hydrogenation mixture to promote dissolution of the above alpha-benzyl compound.

Sloučeniny z příkladů 26 a 27 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 hydrogenolýzou meziprodukčního alfa-benzyM—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-mesylglutaminu resp. alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-(3-methylfenyl)glutaminu.The compounds of Examples 26 and 27 were prepared as described in Example 1 by hydrogenolysis of the intermediate alpha-benzyl-N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-mesylglutamine, respectively. alpha-benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-L- (3-methylphenyl) glutamine.

Sloučenina z příkladu 28 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 hydrogenací benzyl/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-(5-tetrazolyl)-alfa-amino-L-butyrátu.The compound of Example 28 was prepared according to the procedure described in Example 1 by hydrogenation of benzyl [N, N-bis- (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-gamma- (5-tetrazolyl) -alpha-amino-L-butyrate.

Sloučenina z příkladu 28 se rovněž připraví druhou metodou, popsanou bezprostředně dále. Postupuje se stejně jako v příkladu 1 avšak za použití kyseliny (S)-2-amino-4-(lH-l,2,3,4tetrazol-5-yl)máselné (Z. Grzonka a kol. Tetrahedron, 33: 2299-2302, 1977) namísto dibenzylesteru kyseliny L-glutamové při reakci s O-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl)θ'-(4—nitrofenyl)karbonátem. Tato reakce se provádí v bezvodém dimethylformamidu s 2 ekvivalenty triethylaminu po dobu 20 hodin při teplotě 25 °C. Po odpaření k suchu se zbytek rozpustí v ethylacetátu, promyje zředěnou kyselinou citrónovou, vysuší a odpaří k suchu.The compound of Example 28 was also prepared by the second method described immediately below. The procedure was as in Example 1 but using (S) -2-amino-4- (1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl) butyric acid (Z. Grzonka et al. Tetrahedron, 33: 2299-). 2302, 1977) instead of L-glutamic acid dibenzyl ester in reaction with O- (4- / N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenyl) β '- (4-nitrophenyl) carbonate. This reaction is carried out in anhydrous dimethylformamide with 2 equivalents of triethylamine for 20 hours at 25 ° C. After evaporation to dryness, the residue is dissolved in ethyl acetate, washed with dilute citric acid, dried and evaporated to dryness.

-41CZ 287028 B6-41GB 287028 B6

Produkt pozvolna vykrystalizuje z ethylacetátu. Zbytek se rekrystalizuje z ethylacetátu, přičemž se získá sloučenina z příkladu 28.The product crystallizes slowly from ethyl acetate. The residue was recrystallized from ethyl acetate to give the compound of Example 28.

Teplota tání: 173 až 175 °C.Melting point: 173-175 ° C.

Sloučenina z příkladu 29 se připraví postupem, který je analogický s postupem podle příkladu 28 pro první přípravu produktu, přičemž se však použije l-/4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino/-l-benzyloxykarbonyl-2-(5-thiotetrazol)ethan namísto benzyl-4/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-(5-tetrazolyl)-alfa-amino-L-butyrátu. Obdobným zpracováním reakční směsi se získá gumovitý produkt, který se přečistí chromatografií na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 4% kyselinou mravenčí v ethylacetátu (objemově).The compound of Example 29 was prepared in a manner analogous to that of Example 28 for the first preparation of product, but using 1- [4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonylamino] -1-benzyloxycarbonyl- 2- (5-thiotetrazole) ethane instead of benzyl-4 (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-gamma- (5-tetrazolyl) -alpha-amino-L-butyrate. Similar treatment of the reaction mixture yielded a gum which was purified by chromatography on silica gel, eluting with 4% formic acid in ethyl acetate (v / v).

Sloučenina z příkladu 29 se také připraví druhou metodou, která je uvedena bezprostředně v následujícím textu.The compound of Example 29 was also prepared by the second method, which is shown immediately below.

l-Amino-l-karboxy-2-(5-thiotetrazol)ethan (600 mg, 2,89 mM) se suspenduje v bezvodém dimethylformamidu (48 ml) a k získané suspenzi se přidá triethylamin (0,806 ml, 578 mM), načež se suspenze míchá. V jediné dávce a v pevném stavu se potom přidá O-(4-/N,N-bis(2chIorethyl)amino/fenyl)-0^I-4-nitrofenyl)karbonát (1,10 g, 2,89 mM) a roztok se míchá při okolní teplotě po dobu 20 hodin. Dimethylformamid se odstraní za vakua. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu a zředěné kyselině citrónové. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou, vysuší nad síranem sodným, zfiltruje a odpaří. Získaný surový produkt se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 4% kyselinou mravenčí v ethylacetátu, přičemž se získá 4-/N,Nbis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino-l-karboxy-2-(5-thiotetrazol)ethan ve formě sklovitého pevného produktu.1-Amino-1-carboxy-2- (5-thiotetrazole) ethane (600 mg, 2.89 mM) was suspended in anhydrous dimethylformamide (48 mL) and triethylamine (0.806 mL, 578 mM) was added thereto, followed by stirring the suspension is stirred. In a single dose in the solid state is added O- (4- / N, N-bis (2chIorethyl) amino / phenyl) -0 ^I 4-nitrophenyl) carbonate (1.10 g, 2.89 mM) and sodium is stirred at ambient temperature for 20 hours. Dimethylformamide was removed in vacuo. The residue was dissolved in ethyl acetate and dilute citric acid. The ethyl acetate layer was washed with water, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated. The crude product obtained is chromatographed on silica gel, eluting with 4% formic acid in ethyl acetate, to give 4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonylamino-1-carboxy-2- (5-thiotetrazole) ethane in methanol. in the form of a glassy solid product.

Výtěžek: 0,963 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSOd₆): 3,46(dd, 1H),Yield: 0.963 g, NMR _(DMSOd6): 3.46 (dd, 1H)

3,69(s 8H), 3,8(dd, 1H), 4,38(m, 1H), 6,72(d,2H), 6,93(d, 2H), 8,12(d, 1H).3.69 (s 8H), 3.8 (dd, 1H), 4.38 (m, 1H), 6.72 (d, 2H), 6.93 (d, 2H), 8.12 (d, 1H).

Sloučeniny z příkladů 30 a 31 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 hydrogenací alfabenzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylmethyl)fenyl/-glutaminu a alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama//3-(5tetrazolyl)fenyl-L-glutaminu.The compounds of Examples 30 and 31 were prepared as described in Example 1 by hydrogenating alphabenzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-gamma- [3- (benzyloxycarbonylmethyl) phenyl] -glutamine and alpha-benzyl- 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-gamma / 3- (5-tetrazolyl) phenyl-L-glutamine.

Sloučenina z příkladu 32 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 hydrogenací alfa-benzyl4-/N,N-bis(2-chlorethyI)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylamino)fenyl/-Lglutaminu.The compound of Example 32 was prepared as described in Example 1 by hydrogenating alpha-benzyl-4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-gamma- [3- (benzyloxycarbonylamino) phenyl] -glutamine.

Meziprodukty pro použití při přípravě sloučenin z příkladů 25 až 32 alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyI-L-glutamin použitelný při přípravě sloučeniny z příkladu 25 se připraví postupem popsaným v příkladu 1 z O-(4-/N,Nbis-(2-chlorethyl)amino/fenyl)-O'-(4-nitrofenyl)karbonátu, přičemž se však alfa-benzyl-Lglutamin (L. Zervas a kol. J. Am. Chem. Soc. 87 (1), 99-104, 1965) použije namísto dibenzylestertosylátu kyseliny L-glutamové. Produkt se přečistí mžikovou chromatografií naIntermediates for use in the preparation of Examples 25-32 .alpha.-Benzyl-4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamine useful in the preparation of Example 25 were prepared as described in Example 1 from O- (4- / N, Nbis- (2-chloroethyl) amino / phenyl) -O '- (4-nitrophenyl) carbonate, but with alpha-benzyl-L-glutamine (L. Zervas et al. J. Am. Chem Soc., 87 (1), 99-104 (1965) uses L-glutamic acid instead of dibenzyl ester tosylate. The product was purified by flash chromatography on silica gel

-42CZ 287028 B6 silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí 80 % ethylacetátu a 20 % hexanu. Produkt se získá ve formě bílé pevné látky po rozetření s etherem.Silica gel, eluting with a mixture of 80% ethyl acetate and 20% hexane. The product is obtained as a white solid after trituration with ether.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-mesyl-L-glutamin použitelný pro přípravu sloučeniny z příkladu 26 se připraví následujícím způsobem.The alpha-benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-gamma-mesyl-L-glutamine useful for the preparation of the compound of Example 26 was prepared as follows.

K N-Boc-alfa-benzyl-L-glutamátu /E. Klieger a kol., Ann. 673, 196-207, 1964/ (10 mg) v 50 ml bezvodého dichlormethanu se přidá dimethylaminopyridin (DMAP, 3,9 g) a dicyklohexylkarbodiimid (6,73 g). Do reakční baňky se potom zavede methansulfonamid (3,04 g) a v reakci se pokračuje při teplotě 25 °C po dobu 20 hodin. Dichlormethan se odpaří a zbytek se opětovně rozpustí v ethylacetátu. Ethylacetátový roztok se potom promyje 0,25M kyselinou citrónovou a potom vodou, načež se vysuší nad síranem sodným (bezvodým). Po odpaření ethylacetátového extraktu se získá zbytek, který se přečistí na silikagelu mžikovou sloupcovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené nejdříve methylenchloridem, potom 5% methanolem v methylenchloridu a nakonec 10% methanolem v methylenchloridu, načež se z eluátu získá acylsulfonamid chráněný skupinou Boc:To N-Boc-alpha-benzyl-L-glutamate / E. Klieger et al., Ann. 673, 196-207, 1964] (10 mg) in 50 mL of anhydrous dichloromethane was added dimethylaminopyridine (DMAP, 3.9 g) and dicyclohexylcarbodiimide (6.73 g). Methanesulfonamide (3.04 g) was then introduced into the reaction flask and the reaction was continued at 25 ° C for 20 hours. The dichloromethane was evaporated and the residue was redissolved in ethyl acetate. The ethyl acetate solution was then washed with 0.25 M citric acid and then with water, and then dried over sodium sulfate (anhydrous). Evaporation of the ethyl acetate extract yielded a residue which was purified on silica gel by flash column chromatography, eluting first with methylene chloride, then with 5% methanol in methylene chloride and finally with 10% methanol in methylene chloride, and then obtaining the Boc-protected acylsulfonamide:

CO₂BzCO ₂ Bz

I tBoc-NH-CH-CH₂-CH₂-CO-NHSO₂Me (L)I tBoc-NH-CH-CH ₂ -CH ₂ -CO-NHSO ₂ Me (L)

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 1,98(s) 9H, l,98(m) 2H, 2,34(t) 2H, 5,1 l(d) 2H, 7,26(d) 1H, 7,36(s) 5H, 1 l,64(s) 1H.Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 1.98 (s) 9H, 1.98 (m) 2H, 2.34 (t) 2H, 5.1 L (d) 2H, 7.26 (d) 1H, 7.36 (s) 15H, 11.64 (s) 1H.

3,6 g Boc-chráněného acylsulfonamidu se suspenduje v 50 ml ethylacetátu, načež se k získané suspenzi přidá 8 ekvivalentů HC1 ve formě nasyceného roztoku v ethylacetátu (22,4 ml 3,1M roztoku). Výchozí sulfonamid přejde do roztoku a v reakci se pokračuje pod argonovou atmosférou při teplotě 25 °C po dobu 20 hodin. alfa-Benzyl-gama-mesyl-Lglutaminhydrochlorid vzorce:3.6 g of the Boc-protected acylsulfonamide are suspended in 50 ml of ethyl acetate, followed by the addition of 8 equivalents of HCl as a saturated solution in ethyl acetate (22.4 ml of a 3.1 M solution). The starting sulfonamide goes into solution and the reaction is continued under an argon atmosphere at 25 ° C for 20 hours. alpha-Benzyl-gamma-mesyl-L-glutamine hydrochloride of formula:

CO₂BzCO ₂ Bz

IAND

Cl.NH₃-CH-CH₂-CH₂-CO-NHSO₂Me se získá ve formě bílého pevného produktu, který se odfiltruje a promyje bezvodým etherem, načež se vysuší v exsikátoru.Cl.NH ₃ -CH-CH ₂ -CH ₂ -CO-NHSO ₂ Me is obtained as a white solid, which is filtered off and washed with anhydrous ether and then dried in a desiccator.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 2,08(m) 2H,Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 2.08 (m) 2H,

2,52(m) 2H,2.52 (m) 2H,

3,20(s) 3H, 4,09(t) 1H, 5,15-5,3 5(dd) 2H, 7,39-7,50(m) 5H, asi 9(šir.) 3H.3.20 (s) 3H, 4.09 (t) 1H, 5.15-5.3 5 (dd) 2H, 7.39-7.50 (m) 5H, about 9 (broad) 3H.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-mesylglutamin se připraví postupem popsaným v příkladu 1 z O-(4-N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl)-O'-(4nitrofenyl)-karbonátu, přičemž dibenzylestertosylát kyseliny L-glutamové se nahradí alfaalpha-Benzyl-4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-mesylglutamine was prepared as described in Example 1 from O- (4-N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenyl ) -O '- (4-nitrophenyl) carbonate, replacing L-glutamic acid dibenzyl ester tosylate with alpha

-43CZ 287028 B6 benzyl-gama-mesyl-L-glutamin-hydrochloridem. Produkt této reakce se přečistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 10% kyselinou mravenčí v ethylacetátu (objemově).Benzyl-gamma-mesyl-L-glutamine hydrochloride. The product of this reaction was purified by column chromatography on silica gel, eluting with 10% formic acid in ethyl acetate (v / v).

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-(3-methylfenyl)-L-glutamin použitelný při přípravě sloučeniny z příkladu 27 se připraví následujícím způsobem.The alpha-benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-gamma- (3-methylphenyl) -L-glutamine useful in the preparation of the compound of Example 27 was prepared as follows.

alfa-Benzyl—4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamát se připraví postupem popsaným v příkladu 1 z 0-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenyl}-O'-(4-nitrofenyl)-karbonátu, přičemž se však dibenzylester kyseliny L-glutamové nahradí alfa-benzyl-L-glutamátem (Ref. C. Coutsogeorgopoulos a kol. J. Am. Chem. Soc. 83, 1885, 1961). Navíc se reakce provádí v bezvodém dimethylformamidu při teplotě 25 °C po dobu dvou hodin. Získaný produkt se přečistí sloupcovou chromatografií na silikagelu (Měrek Art. 9385) za použití eluční soustavy tvořené nejdříve směsí ethylacetátu a hexanu v poměru 70:30 až postupně 100% ethylacetátem. Nukleární magnetickorezonanční spektrum tohoto produktu je uvedeno v tabulce 17.alpha-Benzyl-4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamate was prepared as described in Example 1 from O- (4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino)) phenyl} -O '- (4-nitrophenyl) carbonate, but replacing the L-glutamic acid dibenzyl ester with alpha-benzyl L-glutamate (Ref. C. Coutsogeorgopoulos et al. J. Am. Chem. Soc. 83, 1885) In addition, the reaction is carried out in anhydrous dimethylformamide at 25 DEG C. for two hours and the product obtained is purified by silica gel column chromatography (Meter Art. 9385), eluting first with an ethyl acetate / hexane mixture (70:30). The nuclear magnetic resonance spectrum of this product is shown in Table 17.

K alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamátu (300 mg) v bezvodém tetrahydrofuranu (5 ml) se přidá 1,1 ekvivalentu triethylaminu. K reakční směsi se pozvolna při teplotě -25 °C přidá Isobutylchlorformiát (0,08 ml, 1,1 ekv.) v bezvodém tetrahydrofuranu (10 ml). Po 15 minutách se přidá 1,1 ekvivalentu (0,08 ml) m-toluidinu v bezvodém tetrahydrofuranu (5 ml). Reakční směs se potom ponechá ohřát na teplotu 25 °C, načež se plynule míchá po dobu 18 hodin. Reakční směs se potom zfiltruje a filtrát se odpaří, přičemž se získaný zbytek přečisti mžikovou sloupcovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a hexanu. Po odpaření příslušných frakcí se získá alfa-benzyl-4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-(3-methylfenyl)-L-glutamin ve formě bílé krystalické pevné látky. Nukleární magnetickorezonanční spektrum tohoto produktu je uvedeno v tabulce 17.To alpha-Benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamate (300 mg) in anhydrous tetrahydrofuran (5 mL) was added 1.1 equivalents of triethylamine. Isobutyl chloroformate (0.08 mL, 1.1 eq.) In anhydrous tetrahydrofuran (10 mL) was added slowly to the reaction mixture at -25 ° C. After 15 minutes, 1.1 equivalents (0.08 mL) of m-toluidine in anhydrous tetrahydrofuran (5 mL) was added. The reaction mixture was then allowed to warm to 25 ° C and was stirred continuously for 18 hours. The reaction mixture is then filtered and the filtrate is evaporated, and the residue is purified by flash column chromatography using a mixture of ethyl acetate and hexane. Evaporation of the appropriate fractions gave alpha-benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-gamma- (3-methylphenyl) -L-glutamine as a white crystalline solid. The nuclear magnetic resonance spectrum of this product is shown in Table 17.

l-/4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino/-l-benzyloxykarbonyl-2-(5-thiotetrazol)ethan použitelný při přípravě sloučeniny z příkladu 29 se připraví následujícím způsobem.1- [4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonylamino] -1-benzyloxycarbonyl-2- (5-thiotetrazole) ethane useful in the preparation of the compound of Example 29 was prepared as follows.

l-Amino-l-karboxy-2-(5-thiotetrazol)ethan se připraví přidáním beta-chloranilinu (18,50 g, 115,6mmolu) (Sigma Chemical Co.) a 5-thiotetrazolu (11,79 g, 115,6mmolu, připraven postupem popsaným v evropské patentové zveřejněné přihlášce 33965) k 230 ml 2M roztoku hydroxidu sodného, přičemž se tento přídavek provádí za míchání. Reakční směs se potom zahřeje v průběhu 1,5 hodiny z okolní teploty na teplotu 90 °C. Reakční směs se potom ponechá vychladnout na okolní teplotu a potom se ochladí dále na lázni ledu a methanolu. Směs se okyselí na pH 4,0 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a míchá ještě po dobu 30 minut. Získaná sraženina se odfiltruje, promyje chladnou vodou a potom etherem a vysuší filtrací a odsáváním, přičemž se získá 6,9 g produktu. Změřením pH matečného louhu se zjistí, že došlo k jeho zvýšení na asi 5,5. Výše popsaný postup se opakuje, přičemž se získá další 2,3 g podíl produktu. Produkt se vysuší za hlubokého vakua.1-Amino-1-carboxy-2- (5-thiotetrazole) ethane is prepared by adding beta-chloroaniline (18.50 g, 115.6 mmol) (Sigma Chemical Co.) and 5-thiotetrazole (11.79 g, 115, 6mmol, prepared as described in European Patent Publication 33965) to 230 ml of a 2M sodium hydroxide solution with stirring. The reaction mixture was then warmed from ambient temperature to 90 ° C over 1.5 hours. The reaction mixture was then allowed to cool to ambient temperature and then cooled further in an ice-methanol bath. The mixture was acidified to pH 4.0 with concentrated hydrochloric acid and stirred for a further 30 minutes. The precipitate obtained is filtered off, washed with cold water and then with ether and dried by filtration and suction to give 6.9 g of product. Measurement of the pH of the mother liquor revealed an increase to about 5.5. The above procedure was repeated to give an additional 2.3 g of product. The product is dried under high vacuum.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 3,3O-3,5O(m) 2H,Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 3.3O-3.5O (m) 2H,

4,16-4,22(q) 1H,4.16-4.22 (q), 1H,

7,47(šir.) H₂O vyměň, s NH₂, elementární analýza:7.47 (broad) H ₂ O exchange, with NH ₂ , elemental analysis:

C(%) C(%) H(%) H (%) N(%) N (%) vypočteno calculated 23,2 23.2 4,4 4.4 33,8 (+lmol H₂O)33.8 (+ lmol H ₂ O) nalezeno found 23,1 23.1 4,4 4.4 33,7 (9,6% H₂O).33.7 (9.6% H ₂ O).

-44CZ 287028 B6 l-/4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonylamino/-l-benzyIoxykarbonyl-2-(5-thiotetrazol)ethan se připraví postupem popsaným v příkladu 1 z O-(4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-fenyl)-O'-(4-nitrofenyl)karbonátu, přičemž se však dibenzylester kyseliny Lglutamové nahradí kyselinou gama-(5-thiotetrazolyl)-alfa-benzyloxykarbonylamino-Lmáselnou (Ref. Z. Grzonka a kol., Tetrahedron Letters 33 2399-2302, 1977). Jako rozpouštědlo se použije bezvodý dimethylformamid a reakce se provede při teplotě 25 °C. Reakční směs se zpracuje po 2 hodinách a produkt se přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené 2% kyselinou mravenčí ve směsi ethylacetátu a methylenchloridu v objemovém poměru 3:1. Nukleární magnetickorezonanční spektrum tohoto produktu je uvedeno v tabulce 16.1-70- [4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonylamino) -1-benzyloxycarbonyl-2- (5-thiotetrazole) ethane was prepared as described in Example 1 from O- (4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -phenyl) -O '- (4-nitrophenyl) carbonate, but replacing the dibenzyl ester of Lglutamic acid with gamma- (5-thiotetrazolyl) -alpha-benzyloxycarbonylamino-butyric acid (Ref. Z. Grzonka et al., Tetrahedron Letters 33 2399-2302, 1977). Anhydrous dimethylformamide is used as solvent and the reaction is carried out at 25 ° C. The reaction mixture was worked up after 2 hours and the product was purified by flash column chromatography on silica gel, eluting with 2% formic acid in ethyl acetate / methylene chloride (3: 1 by volume). The nuclear magnetic resonance spectrum of this product is shown in Table 16.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylmethyl)fenyl/-L-glutamin použitelný pro přípravu produktu z příkladu 27 se připraví následujícím způsobem.The alpha-benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-gamma- [3- (benzyloxycarbonylmethyl) phenyl] -L-glutamine useful for the preparation of the product of Example 27 was prepared as follows.

Benzylester kyseliny 3-aminofenyloctové a kyseliny p-toluensulfonové se připraví přidáním kyseliny 3-aminofenyloctové (10 g) a monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové (13,2 g) k benzylalkoholu (27,2 ml) v toluenu (30 ml). Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a vytvořená voda se jímá v Dean-Starkově kolektoru. Když veškerá voda oddestilovala, směs se ponechá vychladnout na teplotu 25 °C, načež se zředí diethyletherem a uloží na dobu jedné hodiny na ledovou lázeň. Krystalický p-toluensulfonát se odfiltruje a vysuší v exsikátoru.3-Aminophenylacetic acid benzyl ester and p-toluenesulfonic acid was prepared by adding 3-aminophenylacetic acid (10 g) and p-toluenesulfonic acid monohydrate (13.2 g) to benzyl alcohol (27.2 mL) in toluene (30 mL). The mixture was heated to reflux and the water formed was collected in a Dean-Stark collector. When all the water had distilled off, the mixture was allowed to cool to 25 ° C, then diluted with diethyl ether and stored in an ice bath for one hour. The crystalline p-toluenesulfonate is filtered off and dried in a desiccator.

Výtěžek: 23,5 g, nukleární magnetickorezonanční spektrum: 2,31 (s) 3H,Yield: 23.5 g, Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 2.31 (s) 3H,

3,82(s) 3H,3.82 (s) 3H,

5,ll(s)2H, 7,ll(d)2H, 7,25-7,45(m) 8H, 7,52(d) 2H.5.1 (s) 2H, 7.1 (d) 2H, 7.25-7.45 (m) 8H, 7.52 (d) 2H.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylmethyl)fenyl/-L-glutamin se připraví postupem popsaným v příkladu 27, přičemž se však mtoluidin nahradí benzylesterem kyseliny 3-aminofenyloctové.alpha-Benzyl-4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-gamma- [3- (benzyloxycarbonylmethyl) phenyl] -L-glutamine was prepared as described in Example 27, but substituting the methyl toluidine for benzyl ester 3-aminophenylacetic acid.

alfa-BenzyM-/N,N-bis(2-chlorethyI)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(5-tetrazolyl)fenyl/-Lglutamin použitelný v příkladu 31 se připraví postupem popsaným v příkladu 27, přičemž se však m-toluidin nahradí 3-(tetrazol-5-yl)anilinem. Výchozí 3-(tetrazol-5-yl)anilin se připraví následujícím způsobem. K roztoku 5-(3-nitrofenyl)tetrazolu (Finnegan W. G., Henry R. A. a Lolquist R., J.A.C.S. 80:3908 (1958) (52 g) v ethanolu (2,5 1) se přidá 10% paladium na uhlí (5 g) a směs se míchá pod atmosférou vodíku po dobu 16 hodin. Katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se odpaří, přičemž se získá požadovaná výchozí látka.alpha-Benzyl-N- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-gamma- [3- (5-tetrazolyl) phenyl] -glutamine usable in Example 31 was prepared as described in Example 27, but m- replace toluidine with 3- (tetrazol-5-yl) aniline. The starting 3- (tetrazol-5-yl) aniline was prepared as follows. To a solution of 5- (3-nitrophenyl) tetrazole (Finnegan WG, Henry RA and Lolquist R., JACS 80: 3908 (1958) (52 g) in ethanol (2.5 L) was added 10% palladium on carbon (5 g). The mixture was stirred under a hydrogen atmosphere for 16 hours, the catalyst was removed by filtration and the filtrate was evaporated to give the desired starting material.

Výtěžek: 40,5 g, teplota tání: 188 až 189 °C.Yield: 40.5 g, m.p. 188-189 ° C.

alfa-Benzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-gama-/3-(benzyloxykarbonylamino)fenyl/-L-glutamin použitelný v příkladu 32 se připraví postupem popsaným v příkladu 27, přičemž se však m-toluidin nahradí 3-(benzoyloxykarbonylamino)anilinem.alpha-Benzyl-4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-gamma- [3- (benzyloxycarbonylamino) phenyl] -L-glutamine useful in Example 32 was prepared as described in Example 27, but m-toluidine is replaced by 3- (benzoyloxycarbonylamino) aniline.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum:Nuclear Magnetic Resonance Spectrum:

C1CH₂N: 3,68(m) 8H, aromatika: 6,68-7,74(m) 1H,ClCH ₂ N: 3.68 (m) 8H, aromatics: 6.68-7.74 (m) 1H,

-45CZ 287028 B6-45GB 287028 B6

ArCH₂O: 5,12(s) 2H, 5,14(s) 2H, alfa-CH: 4,18(m) 1H, ostatní: l,9-2,15(m) 2H, 2,45(m) 2H, 8,12(d) 1H, 9,7(s) 1H, 9,9(s) 1H.ArCH ₂ O: 5.12 (s) 2H, 5.14 (s) 2H, alpha-CH: 4.18 (m) 1H, others: 1.9-2.15 (m) 2H, 2.45 ( m) 2H, 8.12 (d) 1H, 9.7 (s) 1H, 9.9 (s) 1H.

3-(Benzyloxykarbonylamino)anilin, použitý při přípravě produktu z příkladu 32, se získá následujícím způsobem. K chladnému roztoku (0 °C) m-fenylendiaminu (10 g) v ethylacetátu (200 ml) se přidá vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (9 g ve 300 ml vody), přičemž tento přídavek se provádí za míchání. Potom se v průběhu deseti minut po kapkách přidá benzylchlorformiát (13,2 ml) v ethylacetátu (100 ml) a směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny, načež se okyselí (na pH2) přidáním 1M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Produkt se extrahuje ethylacetátem (250 ml), promyje solankou, vysuší nad síranem hořečnatým a zahustí za vakua, přičemž se získá olejovitý produkt. Tento olej se chromatografuje na silikagelu Měrek Art. 9385 za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v poměru 7:3, přičemž se získá 8 g meziproduktu ve formě nízkotajícího pevného produktu.The 3- (benzyloxycarbonylamino) aniline used in the preparation of the product of Example 32 was obtained as follows. To a cold solution (0 ° C) of m-phenylenediamine (10 g) in ethyl acetate (200 mL) was added aqueous sodium bicarbonate solution (9 g in 300 mL of water) with stirring. Benzyl chloroformate (13.2 mL) in ethyl acetate (100 mL) was then added dropwise over 10 minutes, and the mixture was stirred at 0 ° C for 1 hour, then acidified (to pH 2) by addition of 1M aqueous hydrochloric acid. The product was extracted with ethyl acetate (250 mL), washed with brine, dried over magnesium sulfate and concentrated in vacuo to give an oil. This oil is chromatographed on silica gel. 9385, eluting with hexane / ethyl acetate (7: 3) to give 8 g of the intermediate as a low melting solid.

Výtěžek: 36 %, nukleární magnetickorezonanční spektrum: Yield: 36% nuclear magnetic resonance spectrum: 9,32(s) 1H, 7,30(m) 5H, 6,80(t) 1H, 6,50(m) 1H, 6,12(m) 1H, 5,0(s) 2H, 4,88(s) 2H. 9.32 (s) 1 H, 7.30 (m) 5H, 6.80 (t) 1 H, 6.50 (m), 1H, 6.12 (m), 1H, 5.0 (s) 2H, 4.88 (s) 2H.

Tabulka 16Table 16

X X cich₂ch₂n-cich ₂ ch ₂ n- Aromatika Aromatics ArCH₂OArCH ₂ O ch₂co₂hch ₂ every ₂ h 3,63(m)8H 3.63 (m) 8H 6,62-7,31 (m)9H 6.62-7.31 (m) 9H 5,1 l(s)2H 5.1 L (s) 2H ch₂conh₂ ch ₂ con ₂ 3,71(m)8H 3.71 (m) 8H 6,7-7,3(m)9H 6.7-7.3 (m) 9H 5,15(s)2H 5.15 (s) 2H CH₂CONHSO₂MeCH ₂ CONHSO ₂ Me 3,71(m)8H 3.71 (m) 8H 6,7-7,37(m)9H 6.7-7.37 (m) 9H 5,15(s)2H 5.15 (s) 2H CH₂CONH-CH ₂ CONH- 3,71(m)8H 3.71 (m) 8H 6,69-7,42(m)13H 6.69-7.42 (m) 13H 5,18(s)lH 5.18 (s) 1H ch₂-ch ₂ - 3,71(m)8H 3.71 (m) 8H 6,7-7,37(m)9H 6.7-7.37 (m) 9H 5,17(s)2H 5.17 (s) 2H ch₂conh-ch ₂ conh- 3,70(m)8H 3.70 (m) 8H 6,6-7,6(m)18H 6.6-7.6 (m) 18H 5,10(s)2H 5,17(s)2H 5.10 (s) 2H 5.17 (s) 2H 3,70(s)8H 3.70 (s) 8H 6,6-8,5(m)13H 6.6-8.5 (m) 13H 5,15(s)2H 5.15 (s) 2H

ch₂conh-ch ₂ conh-

aCH aCH ch₂-xch ₂ -x Ostatní Other 4,14(m)IH 4.14 (m) 1H l,8-2,05(m)2H 1.8-2.05 (m) 2H 7,89(d)lH 2,35(m)2H 7.89 (d) 1H 2.35 (m), 2H 4,13(m)lH 4.13 (m) 1H l,8-2,03(m)2H 1.8-2.03 (m) 2H 2,23(t)2H 6,77(s)lH 7,28(s)lH 8,08(d)lH 2.23 (t), 2H 6.77 (s) 1H 7.28 (s) 1H 8.08 (d) 1H 4,15(m)lH 4.15 (m) 1H l,8-2,l(m)2H 1.8-2.1 (m) 2H 2,49(m)2H 3,19(s)3H 1 l,7(bs)lH 8,l(d)lH 2.49 (m) 2H 3.19 (s) 3H 11.7 (bs) 1H 8.1 (d) 1H 4,19(m)lH 4.19 (m) 1H l,9~2,2(m)2H 1.9-2.2 (m) 2H 2,49(m)2H 2,25(s)3H 8,1 l(d)lH 9,83(s)lH 2.49 (m) 2H 2.25 (s) 3H 8.1 l (d) 1H 9.83 (s) 1H 4,23(m)lH 4.23 (m) 1H 2,l-2,3(m)2H 2.1-2.3 (m) 2H 8,23(m)2H 3,03(t)2H 8.23 (m), 2H 3.03 (t) 2H 4,19(m)lH 4.19 (m) 1H l,9-2,3(m)2H 1.9-2.3 (m) 2H 2,45(m)2H 3,67(s)2H 8,13(d)lH 9,90(s)lH 2.45 (m), 2H 3.67 (s) 2H 8.13 (d) 1H 9.90 (s) 1H 4,2(m)lH 4.2 (m) 1H l,9-2,3(m)2H 1.9-2.3 (m) 2H 2,15(m)2H 8,15(d)lH 10,2(s)lH 2.15 (m) 2H 8.15 (d) 1H 10.2 (s) 1H

-46CZ 287028 B6-46GB 287028 B6

Příklad 33Example 33

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamováN- (4- / N, N-bis (2-iodoethyl) amino / phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid

Di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (188 mg) (viz reakční schéma 9 - sloučenina 14) se suspenduje v kyselině trifluoroctové (4 ml) a získaná suspenze se míchá po dobu 30 minut při okolní teplotě. Kyselina trifluoroctová se odežene za sníženého tlaku a zbylý olej se zředí ethylacetátem (3 ml) a odpaří, přičemž se získá kyselina 4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamová ve formě solvátu s 1,4 kyselinou trifluoroctovou a 0,8 ethylacetátem.4- (N, N-bis (2-iodoethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester (188 mg) (see Reaction Scheme 9 - Compound 14) was suspended in trifluoroacetic acid (4 mL) and the obtained the suspension is stirred for 30 minutes at ambient temperature. Trifluoroacetic acid was removed under reduced pressure and the residual oil was diluted with ethyl acetate (3 mL) and evaporated to give 4- (N, N-bis (2-iodoethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid as a solvate of 1, 4 with trifluoroacetic acid and 0.8 ethyl acetate.

Výtěžek: 162 mg (82 %),Yield: 162 mg (82%).

(sloučenina 15 z reakčního schématu 9), nukleární magnetickorezonanční spektrum: (Compound 15 of Reaction Scheme 9), nuclear magnetic resonance spectrum: 1,84-2,0 l(m) 1H, 2,36(m) 2H, 3,31(t)4H, 3,72(t)4H, 4,02(m) 1H, 6,66(d) 2H, 6,94(d) 2H, 7,92(d) 1H. 1.84-2.0 l (m) 1H, 2.36 (m) 2H, 3.31 (t) 4H, 3.72 (t) 4H, 4.02 (m) 1H, 6.66 (d) H, 6.94 (d) 2H, 7.92 (d) 1H.

Di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové, který je použit jako meziprodukt, se připraví následujícím způsobem.The intermediate 4- (N, N-bis (2-iodoethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester was prepared as follows.

a) Roztok di-terc.butylesteru kyseliny bis(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-Lglutamové (1,0 g) (viz reakční schéma 9 - sloučenina 11) v acetonitrilu (50 ml) se míchá s jodidem sodným (1,0 g) při teplotě 70 °C po dobu 20 hodin. Reakční směs se zfiltruje a filtrát se zahustí za vakua. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu vcyklohexanu v poměru 1:5, přičemž se zeluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (viz reakční schéma 9 sloučenina 14) ve formě oleje.a) A solution of bis (2-mesyloxyethyl) amino / phenoxycarbonyl-glutamic acid di-tert-butyl ester (1.0 g) (see Reaction Scheme 9 - Compound 11) in acetonitrile (50 mL) was stirred with sodium iodide (1.0). (g) at 70 ° C for 20 hours. The reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated in vacuo. The residue is chromatographed on silica gel, eluting with ethyl acetate / cyclohexane (1: 5) to give 4- (N, N-bis (2-iodoethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester ( see Reaction Scheme 9, compound 14) as an oil.

Výtěžek: 0,75 g (68 %), nukleární magnetickorezonanční spektrum: Yield: 0.75 g (68%), nuclear magnetic resonance spectrum: l,41(s)9H, l,43(s) 9H, l,91-l,95(m) 1H, 2,34(m) 2H, 3,31(t)4H, 3,72(t)4H, 4,00(m) 1H, 6,67(d) 2H, 6,93(d) 2H, 7,9 l(d) 1H. 1.41 (s) 9H, 1.43 (s) 9H, 1.91-1.95 (m) 1H, 2.34 (m) 2H, 3.31 (t) 4H, 3.72 (t) 4H, 4.00 (m), 1H, 6.67 (d) 2H, 6.93 (d) 2H, 7.9 L (d) 1H.

b) Di-terc.butylester kyseliny bis(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamovéb) Bis (2-mesyloxyethyl) amino / phenoxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester

Roztok di-terc.butylesteru kyseliny 4-/N,N-bis(2-hydroxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-Lglutamové (2,53 g) (získaný postupem v příkladu 8, viz také reakční schéma 4) v pyridinu (9 ml) se míchá s methansulfonylchloridem (1,8 ml) při teplotě 2 °C po dobu 20 minut a potom ještě při teplotě 80 °C po dobu 11 minut. Reakční směs se potom rozdělí mezi ethylacetát a 10% vodný roztok kyseliny mravenčí. Organická fáze se oddělí, promyje vodou, vysuší nad síranem sodným a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořenéA solution of 4- (N, N-bis (2-hydroxyethyl) amino) phenoxycarbonyl-glutamic acid di-tert-butyl ester (2.53 g) (obtained according to the procedure of Example 8, see also Reaction Scheme 4) in pyridine (9 mL) Stir with methanesulfonyl chloride (1.8 mL) at 2 ° C for 20 minutes and then at 80 ° C for 11 minutes. The reaction mixture was then partitioned between ethyl acetate and 10% aqueous formic acid. The organic phase is separated, washed with water, dried over sodium sulphate and evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel using the eluent system

-47CZ 287028 B6 směsí ethylacetátu a dichlormethanu v poměru 1:9, načež se zeluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (sloučenina 11 v reakčním schématu 9) ve formě oleje.287028 B6 with a 1: 9 mixture of ethyl acetate and dichloromethane, followed by 4- [N, N-bis (2-mesyloxyethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester (compound 11 in the reaction scheme) 9) in the form of oil.

Výtěžek: 0,95 g (28 %, nukleární magnetickorezonanční spektrum: Yield: 0.95 g (28%). nuclear magnetic resonance spectrum: l,41(s) 9H, l,43(s) 9H, l,8-l,99(m) 1H, 2,34(m) 2H, 3,16(s) 6H, 3,72(t) 4H, 3,9(m) 1H, 4,3 l(t) 1H, 4,31(t)4H, 6,78(d) 2H, 6,92(d) 2H, 7,9(d) 1H. 1.41 (s) 9H, 1.43 (s) 9H, 1.8-1.97 (m) 1H, 2.34 (m) 2H, 3.16 (s) 6H, 3.72 (t) 4H, 3.9 (m) 1H, 4.3 l (t) 1H, 4.31 (t) 4H, 6.78 (d) 2H, 6.92 (d) 2H, 7.9 (d) 1H.

Příklad 34Example 34

Kyselina N-(4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamováN- (4- / N, N-bis (2-bromoethyl) amino / phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid

Di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (133 mg) (viz reakční schéma 9 - sloučenina 12) se suspenduje v kyselině trifluoroctové a získaná suspenze se míchá po dobu 30 minut při okolní teplotě. Kyselina trifluoroctová se odežene za sníženého tlaku a zbylý olej se zředí ethylacetátem (3 ml), přičemž se získá kyselina 4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamová ve formě solvátu s 1,3 kyselinou trifluoroctovou a 0,9 ethylacetátem.4- (N, N-bis (2-bromoethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester (133 mg) (see Reaction Scheme 9 - Compound 12) was suspended in trifluoroacetic acid and the resulting suspension was stirred for for 30 minutes at ambient temperature. Trifluoroacetic acid was removed under reduced pressure and the residual oil was diluted with ethyl acetate (3 mL) to give 4- [N, N-bis (2-bromoethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamic acid as a 1.3 acid solvate. trifluoroacetic acid and 0.9 ethyl acetate.

Výtěžek: 126 mg (80 %)Yield: 126 mg (80%).

(viz reakční schéma 9 - sloučenina 13), nukleární magnetickorezonanční spektrum: (see Reaction Scheme 9 - Compound 13), nuclear magnetic resonance spectrum: l,83-2,01(m) 1H, 2,36(m) 2H, 3,58(t) 4H, 3,76(t) 4H, 4,03(m) 1H, 6,7 l(d) 2H, 6,94(d) 2H, 7,92(d) 1H. 1.83-2.01 (m) 1H, 2.36 (m) 2H, 3.58 (t) 4H, 3.76 (t) 4H, 4.03 (m) 1H, 6.7 l (d) H, 6.94 (d) 2H, 7.92 (d) 1H.

Di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2-bromethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové, použitý jako meziprodukt, se připraví následujícím způsobem.The intermediate 4- (N, N-bis (2-bromoethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester was prepared as follows.

Roztok di-terc.butylesteru kyseliny bis(2-mesyloxyethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (0,48 g) (sloučenina 11 v reakčním schématu 9, získaná postupem popsaným v příkladu 8; viz rovněž reakční schéma 4) v acetonitrilu (30 ml) se míchá s bromidem lithným (0,26 g) při teplotě 70 °C po dobu 22 hodin. Reakční směs se zfiltruje a filtrát se zahustí za vakua. Zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a dichlormethanu v poměru 1:5, načež se z eluátu získá di-terc.butylester kyseliny 4-/N,N-bis(2bromethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové (sloučenina 12 v reakčním schématu 9) ve formě oleje.A solution of bis (2-mesyloxyethyl) amino / phenoxycarbonyl-L-glutamic acid di-tert-butyl ester (0.48 g) (Compound 11 in Reaction Scheme 9, obtained as described in Example 8; see also Reaction Scheme 4) in acetonitrile ( 30 ml) was stirred with lithium bromide (0.26 g) at 70 ° C for 22 hours. The reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated in vacuo. The residue is chromatographed on silica gel, eluting with ethyl acetate / dichloromethane (1: 5) to give 4- (N, N-bis (2-bromoethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid, di-tert-butyl ester. Compound 12 in Reaction Scheme 9) as an oil.

Výtěžek: 0,37 g (83 %),Yield: 0.37 g (83%).

-48CZ 287028 B6 nukleární magnetickorezonanční spektrum:-48GB 287028 B6 Nuclear Magnetic Resonance Spectrum:

l,41(s)9H, l,43(s) 9H, l,8-l,98(m) 1H, 2,34(m) 2H, 3,58(t)4H, 3,76(t)4H, 3,97(m) 4H, 6,72(d) 2H, 6,93(d) 2H, 7,93(d) 1H.1.41 (s) 9H, 1.43 (s) 9H, 1.8-1.98 (m) 1H, 2.34 (m) 2H, 3.58 (t) 4H, 3.76 (t) 4H, 3.97 (m) 4H, 6.72 (d) 2H, 6.93 (d) 2H, 7.93 (d) 1H.

Příklad 35Example 35

N-(4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/-2-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamátN- (4- (N, N-bis- (2-chloroethyl) amino) -2-fluorophenylcarbamoyl) -L-glutamate

Požadovaná sloučenina mající následující nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO):The desired compound having the following nuclear magnetic resonance spectrum (DMSO):

se připraví z meziprodukčního karbamoyl-L-glutamátu, majícího (DMSO): prepared from an intermediate carbamoyl L-glutamate having (DMSO): 8,0(s), 1H, 7,65(t) 1H, 6,6(m) 3H, 4,2(m)3H, 3,7(s) 8H, 2,28(m) 2H, l,8(m) 2H, dibenzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/-2-fluorfenylnásledující nukleární magnetickorezonanční spektrum 7,62(t) 1H, 7,35(s) 10H, 6,8(d) 1H, 6,57(m) 2H, 5,l(d)4H, 4,33(m) 1H, 3,7(s) 8H, 2,43(m) 2H, 2,0(m) 2H, 8.0 (s), 1 H, 7.65 (t), 1H, 6.6 (m) 3H, 4.2 (m) 3H, 3.7 (s) 8H, 2.28 (m) 2H, 1.8 (m) 2H, dibenzyl-4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) -2-fluorophenylfollowing nuclear magnetic resonance spectrum 7.62 (t), 1H, 7.35 (s) 10H, 6.8 (d) 1 H, 6.57 (m) 2H, 5.1 (d) 4H, 4.33 (m), 1H, 3.7 (s) 8H, 2.43 (m) 2H, 2.0 (m) 2H,

způsobem, který je analogický s odpovídajícím stupněm příkladu 5.in a manner analogous to the corresponding step of Example 5.

Meziprodukt se připraví následujícím způsobem.The intermediate was prepared as follows.

Ethylenoxid (6,6 g) se přidá k 3-fluor-4-nitroanilinu (1,3 g) v ledové kyselině octové (30 ml), načež se získaná reakční směs udržuje v uzavřené baňce při okolní teplotě po dobu 72 hodin. Roztok se odpaří za sníženého tlaku na polovinu svého původního objemu, zbytek se zředí nasyceným vodným roztokem chloridu sodného a třikrát extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátové extrakty se sloučí, promyjí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a odpaří, načež se zbytek přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií na silikagelu. Po eluci hexanem obsahujícím 50 % (obj./obj.) ethylacetátu za účelem odstranění nezreagované výchozí látky a monosubstituovaného produktu poskytne eluce ethylacetátem 2',2'-(3-fluor-4-nitroanilino)diethanol.Ethylene oxide (6.6 g) was added to 3-fluoro-4-nitroaniline (1.3 g) in glacial acetic acid (30 ml) and the reaction mixture was kept in a sealed flask at ambient temperature for 72 hours. The solution was evaporated under reduced pressure to half its original volume, the residue was diluted with saturated aqueous sodium chloride solution and extracted three times with ethyl acetate. The ethyl acetate extracts were combined, washed with a saturated aqueous sodium bicarbonate solution and evaporated, then the residue was purified by flash column chromatography on silica gel. After eluting with hexane containing 50% (v / v) ethyl acetate to remove unreacted starting material and monosubstituted product, elution with ethyl acetate gave 2 ', 2' - (3-fluoro-4-nitroanilino) diethanol.

Teplota tání: 99 až 101 °C.Melting point: 99-101 ° C.

-49CZ 287028 B6-49GB 287028 B6

Takto získaný produkt (280 mg) se rozpustí v dichlormethanu (7,5 ml), načež se k roztoku přidá pyridin (0,1 ml) a roztok se ochladí na lázni ledu a vody. Potom se za míchání přidá po kapkách thionylchlorid (0,25 ml). Po ukončení tohoto přídavku se reakční směs zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny, načež se ponechá při okolní teplotě po dobu 20 hodin. Roztok se zředí dichlormethanem (10 ml) a třikrát promyje vodou, vysuší nad síranem sodným, odpaří a zbytek se rekiystalizuje z methanolu, přičemž se získá /N,N-bis(2-chlorethyl/-3-fluor4-nitroanilin.The product so obtained (280 mg) was dissolved in dichloromethane (7.5 ml), pyridine (0.1 ml) was added and the solution was cooled in an ice-water bath. Thionyl chloride (0.25 mL) was then added dropwise with stirring. Upon completion of the addition, the reaction mixture is heated at reflux for 1 hour and then left at ambient temperature for 20 hours. The solution was diluted with dichloromethane (10 mL) and washed three times with water, dried over sodium sulfate, evaporated and the residue recrystallized from methanol to give [N, N-bis (2-chloroethyl) -3-fluoro-4-nitroaniline.

Teplota tání: 97 až 98 °C.Melting point: 97-98 ° C.

Takto získaný produkt (200 mg) se míchá v tetrahydrofuranu (7,5 ml) po dobu 16 hodin pod vodíkovou atmosférou v přítomnosti paladia na uhlí (20 mg 5% paladia na uhlí (hmotnostně)). Po ukončení hydrogenace se hydrogenační katalyzátor odfiltruje a filtrát se odpaří. Rezultující zbytek se rozpustí v minimálním objemu methanolu a surový produkt se vysráží přidáním přebytku diethyletheru nasyceného chlorovodíkem. Po rekrystalizaci ze směsi methanolu a diethyletheru se získá 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino-2-fluoraniliniumchlorid.The product thus obtained (200 mg) was stirred in tetrahydrofuran (7.5 ml) for 16 hours under a hydrogen atmosphere in the presence of palladium on carbon (20 mg of 5% palladium on carbon (w / w)). After completion of the hydrogenation, the hydrogenation catalyst was filtered off and the filtrate was evaporated. The resulting residue was dissolved in a minimum volume of methanol and the crude product was precipitated by addition of an excess of diethyl ether saturated with hydrogen chloride. Recrystallization from a mixture of methanol and diethyl ether gave 4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino-2-fluoroanilinium chloride].

Teplota tání: 195 až 200 °C (za rozkladu).M.p .: 195-200 ° C (dec.).

Rezultující produkt se převede na požadovaný meziprodukt postupem, který je analogický s odpovídajícím stupněm v příkladu 5.The resulting product was converted to the desired intermediate by a procedure analogous to the corresponding step in Example 5.

Příklady 36 až 43Examples 36 to 43

Chemické struktury a elementární analýzy sloučenin z příkladů 36 až 43 jsou uvedeny v tabulce 17.The chemical structures and elemental analyzes of the compounds of Examples 36 to 43 are shown in Table 17.

Sloučeniny uvedené v tabulce 17 se připraví postupy popsanými v příkladu 16. Takto se sloučenina z příkladu 36 připraví náhradou benzyl^l-aminobenzoátu (Aldrich Chemical Co. Ltd.) za anilin v příkladu 16. Obdobně se připraví sloučeniny z příkladů 37 až 43 náhradou benzyl-4-aminobenzoátu, sek.butylaminu, n-propylaminu, iso-propylaminu, cyklohexylaminu, benzylaminu nebo p-benzyloxyanilinu za anilin v příkladu 16.The compounds of Table 17 were prepared according to the procedures described in Example 16. Thus, the compound of Example 36 was prepared by substituting benzyl 4-aminobenzoate (Aldrich Chemical Co. Ltd.) for the aniline of Example 16. Similarly, the compounds of Examples 37-43 were prepared by substituting benzyl-4-aminobenzoate, sec-butylamine, n-propylamine, iso-propylamine, cyclohexylamine, benzylamine or p-benzyloxyaniline under aniline in Example 16.

Tabulka 17Table 17

COOH cich₂ch₂ cich₂ch₂ 'COOH cich ₂ ch ₂ cich ₂ ch ₂ '

OCONHCH ch₂ch₂vOCONHCH ch ₂ ch ₂ v

Příklad č. W Vypočteno(%)Nalezeno(%)Example No. W Calculated (%) Found (%)

C C H H N N C C H H N N 36 36 -CO-NH-p-C₆H₅COOH-CO-NH-pC ₆ H ₅ COOH 51,5 51.5 5,26 5.26 7,83 7.83 51,7 51.7 5,10 5.10 7,50 7.50 37 37 -CO-NH-n-C₄H₉ -CO-NH-nC ₄ H ₉ 51,9 51.9 6,32 6.32 9,09 9.09 52,0 52.0 6,38 6.38 8,97 8.97 38 38 -CO-NH-sec-C₄H₉ -CO-NH-sec-C ₄ H ₉ 51,9 51.9 6,32 6.32 9,09 9.09 52,2 52.2 6,34 6.34 9,09 9.09 39 39 -CO-NH-n-C₃H₇ -CO-NH-nC ₃ H ₇ 50,9 50.9 6,07 6.07 9,37 9.37 50,6 50.6 6,35 6.35 8,95 8.95 40 40 -CO-NH-i-C₃H₇ -CO-NH-IC ₃ H ₇ 50,9 50.9 6,07 6.07 9,37 9.37 51,1 51.1 6,07 6.07 9,40 9.40 41 41 -CO-NH-C₆H_u -CO-NH-C ₆ H _u 54,1 54.1 6,40 6.40 8,60 8.60 54,3 54.3 6,73 6.73 8,72 8.72 42 42 -co-hn-ch₂c₆h₅ -co-hn-ch ₂ c ₆ h ₅ 55,6 55.6 5,48 5.48 8,46 8.46 56,0 56.0 5,52 5,52 8,21 8.21 43 43 -CO-NH-p-C₆H₅OH-CO-NH-pC ₆ H ₅ OH 53,0 53.0 5,06 5.06 8,43 8.43 53,0 53.0 5,24 5.24 7,90 7.90

-50CZ 287028 B6-50GB 287028 B6

Příklad 44Example 44

Kyselina 4-(4-N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L“glutamová4- (4-N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenylcarbamoyl) -L 'glutamic acid

Roztok meziprodukčního dibenzyl-4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl-L-glutamátu (1,138 g) v dimethylformamidu (15 ml) se hydrogenuje v přítomnosti 10% paladia na uhlí po dobu 16 hodin. Po filtraci a odpaření za vakua se zbytek rozpustí v chloroformu (20 ml). Po 18 hodinách se vyloučená sraženina odfiltruje a vysuší za vakua, přičemž se získá 4-/N,N-bis-(2chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl-L-glutamová. Po rekrystalizaci ze směsi acetonu a chloroformu se získá produkt ve formě mikroskopických tyčinek.A solution of the intermediate dibenzyl 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenylcarbamoyl L-glutamate (1.138 g) in dimethylformamide (15 ml) was hydrogenated in the presence of 10% palladium on carbon for 16 hours. After filtration and evaporation in vacuo, the residue was dissolved in chloroform (20 mL). After 18 hours, the precipitate formed is filtered off and dried under vacuum to give 4- [N, N-bis- (2-chloroethyl) amino] phenylcarbamoyl-L-glutamic acid. After recrystallization from a mixture of acetone and chloroform, the product is obtained in the form of microscopic bars.

Teplota tání: 116 až 118 °C, nukleární magnetickorezonanční spektrum (CD3COCD3): 8,0(s) 1H,Melting point: 116-118 ° C, Nuclear Magnetic Resonance Spectrum (CD3COCD3): 8.0 (s) 1H,

7,2(d)2H,7.2 (d) 2H,

6,6(d) 2HNH, 4,4(m) 1H, 3,6(m) 8H, 2,5-l,9(m) 4H.6.6 (d) 2HNH, 4.4 (m) 1H, 3.6 (m) 8H, 2.5-1.9 (m) 4H.

Dibenzylový meziprodukt se připraví následujícím způsobem (viz reakční schéma 10)The dibenzyl intermediate was prepared as follows (see Reaction Scheme 10).

Dibenzylglutamát-p-toluensulfonát (dostupný u firmy Bachem, Velká Británie, 0,25 g) se rozpustí vbezvodém methylenchloridu (10 ml) pod atmosférou argonu a roztok se ochladí na teplotu 0 °C. K roztoku se přidá pyridin (0,162 ml) a potom rychle fosgen v toluenu (1,93M, 0,311 ml). Roztok se míchá při teplotě 0 °C po dobu 2 hodin, načež se přidá pyridin (0,05 ml) a potom v jediné porci 4-/N,N-bis(chlorethyl)amino/aniliniumchlorid. Získaná směs se míchá po dobu 10 minut při teplotě 0 °C a potom po dobu 18 hodin při okolní teplotě. Reakční směs se potom zředí ethylacetátem a vodou. Organická vrstva se potom promyje zředěnou kyselinou citrónovou (dvakrát), vodou a nasycenou solankou, načež se vysuší a odpaří, přičemž se získá požadovaný dibenzylový meziprodukt ve formě pevné látky.Dibenzylglutamate-p-toluenesulfonate (available from Bachem, UK, 0.25 g) was dissolved in anhydrous methylene chloride (10 mL) under argon and cooled to 0 ° C. To the solution was added pyridine (0.162 mL) followed by rapid phosgene in toluene (1.93M, 0.311 mL). The solution was stirred at 0 ° C for 2 h before pyridine (0.05 mL) was added followed by 4- (N, N-bis (chloroethyl) amino) aniline chloride in a single portion. The resulting mixture was stirred for 10 minutes at 0 ° C and then for 18 hours at ambient temperature. The reaction mixture was then diluted with ethyl acetate and water. The organic layer was then washed with dilute citric acid (twice), water and saturated brine, then dried and evaporated to give the desired dibenzyl intermediate as a solid.

Uvedený dibenzylový meziprodukt může být alternativně připraven následujícím způsobem.Said dibenzyl intermediate may alternatively be prepared as follows.

K roztoku trifosgenu (1 g) v chloroformu (80 ml) se při teplotě 10 °C přidá 4-/N,N-bis-(2chlorethyl)amino/anilinium chlorid (2,7 g). Při udržování teploty 10°C se přidá triethylamin (4,15 ml) a získaná směs se míchá a ponechá ohřát na okolní teplotu po dobu 15 minut. Ktéto směsi se přidá v jedné porci dibenzylglutamáttosylát a triethylamin (1,7 ml). Po 1,5 hodině při okolní teplotě se směs zředí chloroformem (100 ml), dvakrát promyje vodou, vysuší a odpaří k suchu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu Měrek Art. 9385 za použití eluční soustavy tvořené směsí ethylacetátu a hexanu, přičemž se získá dibenzyl-4-/N,N-bis(2chlorethyl)amino/-fenylkarbamoyl-L-glutamát.To a solution of triphosgene (1 g) in chloroform (80 mL) at 10 ° C was added 4- (N, N-bis- (2-chloroethyl) amino) anilinium chloride (2.7 g). While maintaining the temperature at 10 ° C, triethylamine (4.15 ml) was added and the resulting mixture was stirred and allowed to warm to ambient temperature for 15 minutes. To this mixture was added dibenzylglutamate tosylate and triethylamine (1.7 mL) in one portion. After 1.5 h at room temperature, the mixture was diluted with chloroform (100 mL), washed twice with water, dried and evaporated to dryness. The residue is chromatographed on silica gel. 9385 eluting with a mixture of ethyl acetate and hexane to give dibenzyl 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenylcarbamoyl-L-glutamate.

Výtěžek: 2,5 g, teplota tání: 119 až 122 °C.Yield: 2.5 g, mp 119-122 ° C.

Příklad 45Example 45

4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl-gama-/N(3-karboxymethyl)anilino/-L-glutamát (sloučenina 7 v reakčním schématu 11)4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenylcarbamoyl-gamma- [N (3-carboxymethyl) anilino] -L-glutamate (Compound 7 in Reaction Scheme 11)

-51CZ 287028 B6-51EN 287028 B6

Tato sloučenina se připraví následujícím způsobem (viz reakční schéma 11). Roztok meziproduktu (sloučenina 6 v reakčním schématu 11, 1 g) ve 20 ml tetrahydrofuranu se hydrogenuje v přítomnosti 30% paladia na uhlí (100 mg) po dobu 4 hodin. Směs se potom zfiltruje přes Celíte a odpaří, přičemž se získá hnědý olej, který se potom přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií za použití 1% a 3% směsi kyseliny mravenčí a ethylacetátu jako eluční soustavy, načež se odpaření příslušných frakcí a působení etheru získá 300 mg požadované sloučeniny.This compound was prepared as follows (see Reaction Scheme 11). A solution of intermediate (compound 6 in Reaction Scheme 11, 1 g) in 20 mL of tetrahydrofuran was hydrogenated in the presence of 30% palladium on carbon (100 mg) for 4 hours. The mixture was then filtered through Celite and evaporated to give a brown oil which was then purified by flash column chromatography using 1% and 3% formic acid / ethyl acetate as eluent, then evaporation of the appropriate fractions and ether to give 300 mg of the desired product. compounds.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum:Nuclear Magnetic Resonance Spectrum:

C1CH₂CH₂N: 3,66(s) 8H, aromatika: 6,66-7,46(m) 8H, alfa-CH: 4,22(m) 1H, ostatní: l,66-2,06(m) 2H, 2,39(m) 2H, 3,49(s) 2H, 6,29(d) 1H, 8,33(s) 1H, 9,93(s) 1H, 12,5(šir.s) 2H.ClCH ₂ CH ₂ N: 3.66 (s) 8H, aromatics: 6.66-7.46 (m) 8H, alpha-CH: 4.22 (m) 1H, others: 1.66-2.06 ( m) 2H, 2.39 (m) 2H, 3.49 (s) 2H, 6.29 (d) 1H, 8.33 (s) 1H, 9.93 (s) 1H, 12.5 (broad); s) 2H.

Meziprodukt se připraví následujícím způsobem.The intermediate was prepared as follows.

a) Benzylester kyseliny 3-aminofenyloctové a kyseliny p-toluensulfonové se připraví přidáním kyseliny 3-aminofenyloctové (10 g) a monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové (13,2 g) k benzylalkoholu (27,2 ml) v toluenu (30 ml). Získaná směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem, přičemž se vytvořená voda jímá v Dean-Starkově kolektoru. Když byla oddestilována veškerá voda, směs se ponechá vychladnout na teplotu 25 °C, načež se zředí diethyletherem a uloží na ledovou lázeň po dobu 1 hodiny. Krystalický p-toluensulfonát se odfiltruje a produkt se vysuší v exsikátoru.a) Benzyl ester of 3-aminophenylacetic acid and p-toluenesulfonic acid was prepared by adding 3-aminophenylacetic acid (10 g) and p-toluenesulfonic acid monohydrate (13.2 g) to benzyl alcohol (27.2 ml) in toluene (30 ml). The resulting mixture was heated to reflux while the water formed was collected in a Dean-Stark collector. When all the water had been distilled off, the mixture was allowed to cool to 25 ° C, then diluted with diethyl ether and stored in an ice bath for 1 hour. The crystalline p-toluenesulfonate is filtered off and the product is dried in a desiccator.

Výtěžek: 23,5 g, nukleární magnetickorezonančn í spektrum: 2,31 (s) 3 H,Yield: 23.5 g, Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 2.31 (s) 3 H,

3,82(s) 2H, 5,ll(s)2H, 7,U(d)2H, 7,25-7,45(m) 8H, 7,52(d) 2H.3.82 (s) 2H, 5.1 (s) 2H, 7.7 (d) 2H, 7.25-7.45 (m) 8H, 7.52 (d) 2H.

b) N-Boc-alfa-benzyl-L-glutamát (5 g) ve 20 ml bezvodého dimethylformamidu o teplotě 5 °C se zahřívá s hydroxybenzothiazolem (HOBT, 1,1 ekv., 2,45 g) a reakční směs se míchá při této teplotě po dobu 10 minut. Potom se přidá Dicyklohexylkarbodiimid (DCCI, 1,1 ekv., 3,37 g) a reakční směs se míchá po dobu dalších 10 minut při teplotě 5 °C, načež se ponechá ohřát na teplotu 25 °C a míchá při této teplotě po dobu dalších 45 minut. Benzylester kyseliny 3-aminofenyloctové a p-toluensulfonové (produkt získaný v reakčním stupni a)) (1,1 ekv., 6 g) společně s 1,1 ekvivalentu triethylaminu (2,23 ml) v 10 ml bezvodého dimethylformamidu se přidají k reakční směsi a reakční směs se míchá při teplotě 25 °C po dobu dalších 20 hodin. Sraženina dicyklohexylmočoviny se potom odfiltruje a tetrahydrofuran se odežene odpařením. Zbytek se potom opětovně rozpustí v ethylacetátu. Ethylacetátový roztok se potom promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a potom solankou, načež se vysuší nad síranem sodným (bezvodým). Po odpaření ethylacetátového extraktu se získá zbytek, který se potom přečistí mžikovou sloupcovou chromatografií za použití eluční soustavy tvořené 30%, 40% a 50% ethylacetátem v hexanu. Po odpaření příslušných frakcí se získá 5 g produktu (sloučenina 4 v reakčním schématu 11).b) Heat N-Boc-alpha-benzyl-L-glutamate (5 g) in 20 mL of anhydrous dimethylformamide at 5 ° C with hydroxybenzothiazole (HOBT, 1.1 eq., 2.45 g) and stir the reaction mixture at this temperature for 10 minutes. Dicyclohexylcarbodiimide (DCCI, 1.1 eq., 3.37 g) was then added and the reaction stirred for an additional 10 minutes at 5 ° C, then allowed to warm to 25 ° C and stirred at this temperature for 5 minutes. another 45 minutes. 3-Aminophenylacetic acid and p-toluenesulfonic acid benzyl ester (product obtained in step a)) (1.1 eq, 6 g) together with 1.1 equivalents of triethylamine (2.23 mL) in 10 mL of anhydrous dimethylformamide were added to the reaction The reaction mixture was stirred at 25 ° C for a further 20 hours. The dicyclohexylurea precipitate is then filtered off and the tetrahydrofuran is stripped off by evaporation. The residue was then redissolved in ethyl acetate. The ethyl acetate solution was then washed with aqueous sodium bicarbonate solution and then brine, then dried over sodium sulfate (anhydrous). Evaporation of the ethyl acetate extract gave a residue which was then purified by flash column chromatography eluting with 30%, 40% and 50% ethyl acetate in hexane. Evaporation of the appropriate fractions gave 5 g of product (compound 4 in Reaction Scheme 11).

Nukleární magnetickorezonanční spektrum: 1,3 9(s) 9H, l,81-2,10(m) 2H,Nuclear Magnetic Resonance Spectrum: 1.3 9 (s) 9H, 1.81-2.10 (m) 2H,

2,3 8(m) 2H,2.3 (m) 2H,

3,69(s) 8H, 4,03(m) 1H,3.69 (s) 8H, 4.03 (m) 1H,

-52CZ 287028 B6-52EN 287028 B6

5,12(m)4H,5.12 (m) 4H,

6,92(d) 1H,6.92 (d) 1 H,

7.2 l(m) 1H,7.2 L (m) 1H,

7.3 5(m) 11H,7.3 (m) 11H,

7,42(d) 1H, 7,52(s) 1H, 9,89(s) 1H.7.42 (d) 1H, 7.52 (s) 1H, 9.89 (s) 1H.

Produkt získaný vreakčním stupni b) se suspenduje v 10 ml etheru a 5 ml dichlormethanu (posledně uvedené rozpouštědlo je přidáno jako solubilizační promotor) a k suspenzi se přidá 8 ekvivalentu chlorovodíku ve formě nasyceného roztoku chlorovodíku v etheru. Reakční směs se potom míchá po dobu 20 hodin při teplotě 25 °C. V tomto stádiu má produkt formu neutišitelného oleje. Ether se potom odpaří a zbytek se dvakrát azeotropně destiluje s toluenem, načež se přidá ether, který se potom odpaří, přičemž se získá 5 g produktu (sloučenina 5 v reakčním schématu 11) ve formě žluté pěny.The product obtained in reaction step b) is suspended in 10 ml of ether and 5 ml of dichloromethane (the latter solvent is added as a solubilization promoter) and 8 equivalents of hydrogen chloride are added as a saturated solution of hydrogen chloride in ether. The reaction mixture was then stirred for 20 hours at 25 ° C. At this stage, the product is in the form of a non-volatile oil. The ether was then evaporated and the residue was azeotroped twice with toluene followed by the addition of ether, which was then evaporated to give 5 g of the product (compound 5 in Scheme 11) as a yellow foam.

Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃): 2,35(m) 2H,Nmr (CDC1 _3): 2.35 (m) 2H;

2,65(m) 2H,2.65 (m) 2H,

3,50(s) 2H, 4,22(šir.s) 1H, 5,0 l(s) 2H, 6,8-7,6(m) 14H, 8,65(šir.s) 3H, 9,35(s) 1H.3.50 (s) 2H, 4.22 (broad s) 1H, 5.0 L (s) 2H, 6.8-7.6 (m) 14H, 8.65 (broad) 3H, 9 , 35 (s) 1 H.

d) K roztoku obsahujícímu 1 g 4-/N,N-bis-(2-chlorethyl)amino/aniliniumchloridu se při teplotě 5 °C přidá 1,1 ekvivalent (0,66 g) karbonyldiimidazolu ve 20 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Reakční směs se potom míchá při teplotě 5 °C po dobu 15 minut, načež se přidá 1 ekvivalent (1,84 g) produktu získaného vreakčním stupni c) s 1,1 ekvivalentem (0,56 ml) triethylaminu v 10 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Směs se míchá po dobu dalších dvou hodin při teplotě 25 °C. Triethylaminhydrochlorid se potom odstraní filtrací a tetrahydrofuranový filtrát se odpaří a zbytek se opětovně rozpustí v ethylacetátu. Ethylacetátový roztok se potom promyje vodou, dále 0,25M roztokem kyseliny citrónové a nakonec solankou, načež se vysuší nad síranem sodným (bezvodým). Po odpaření ethylacetátu se získá zbytek, který se přečistí mžikovou chromatografíí za použití eluční soustavy tvořené 30%, 40% a 50% roztokem ethylacetátu v hexanu. Po odpaření příslušných frakcí eluátu se získá požadovaný meziprodukt (sloučenina 6 v reakčním schématu 11).d) To a solution containing 1 g of 4- (N, N-bis- (2-chloroethyl) amino) anilinium chloride at 5 ° C was added 1.1 equivalents (0.66 g) of carbonyldiimidazole in 20 ml of anhydrous tetrahydrofuran. The reaction mixture was then stirred at 5 ° C for 15 minutes, after which 1 equivalent (1.84 g) of the product obtained in reaction step c) with 1.1 equivalents (0.56 ml) of triethylamine in 10 ml of anhydrous tetrahydrofuran was added. The mixture was stirred for an additional two hours at 25 ° C. The triethylamine hydrochloride was then removed by filtration and the tetrahydrofuran filtrate was evaporated and the residue was redissolved in ethyl acetate. The ethyl acetate solution was then washed with water, followed by a 0.25 M citric acid solution and finally brine, and then dried over sodium sulfate (anhydrous). Evaporation of ethyl acetate gave a residue which was purified by flash chromatography using a 30%, 40% and 50% ethyl acetate in hexane solution. Evaporation of the appropriate eluate fractions gave the desired intermediate (Compound 6 in Reaction Scheme 11).

Nukleární magnetickorezonanční spektrum:Nuclear Magnetic Resonance Spectrum:

C1CH₂CH₂N: 3,65(s) 8H, aromatika: 6,63-7,5(m) 18 H, ArCH₂O: 5,10(s) 2H, 5,12(s) 2H, alfa-CH: 4,32(m) 1H, ostatní: l,83-2,13(m) 2H, 2,4l(m) 2H, 6,42(d) 1H, 8,25(s) 1H, 9,9l(s) 1H.ClCH ₂ CH ₂ N: 3.65 (s) 8H, aromatics: 6.63-7.5 (m) 18 H, ArCH ₂ O: 5.10 (s) 2H, 5.12 (s) 2H, alpha -CH: 4.32 (m) 1H, others: 1.83-2.13 (m) 2H, 2.4l (m) 2H, 6.42 (d) 1H, 8.25 (s) 1H, 9 0.91 (s) 1H.

Příklad 46 gama-(3,5-Dikarboxy)anilid kyseliny 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-LglutamovéExample 46 4- (N, N-Bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma- (3,5-dicarboxy) anilide

Opakuje se postup popsaný v příkladu 16 za použití gama-(3,5-dikarboxybenzyl)anilidu kyseliny 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové namísto gama-anilidu kyseliny alfa-benzyl-4-(N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové, přičemž seThe procedure described in Example 16 was repeated using 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma- (3,5-dicarboxybenzyl) anilide instead of alpha-benzyl-4 gamma-anilide. - (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-L-glutamic acid,

-53CZ 287028 B6 získá gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny 4-/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-Lglutamové ve formě bezbarvých krystalů.-53C 287028 B6, 4- (N, N-bis (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonyl-glutamic acid gamma- (3,5-dicarboxy) anilide is obtained as colorless crystals.

Teplota tání: 167 až 170 °C, elementární analýza:Melting point: 167-170 ° C, elemental analysis:

C(%) H(%) N(%) vypočteno 49,6 4,87 6,68 nalezeno 49,7 4,9 6,7.C (%) H (%) N (%) calculated 49.6 4.87 6.68 found 49.7 4.9 6.7.

gama-(3,5-dikarboxybenzyl)anilid kyseliny alfa-benzyl-4-benzyM—/N,N-bis(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamové se získá postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 16 pro gama-anilino-derivát..alpha.-benzyl-4-benzyl-N, N-bis (2-chloroethyl) amino / phenoxycarbonyl-L-glutamic acid gamma- (3,5-dicarboxybenzyl) anilide is obtained in a manner analogous to that described in Example 16 for the gamma-anilino derivative.

Reakční schéma 1Reaction Scheme 1

-54CZ 287028 B6-54GB 287028 B6

Reakční schéma 2Reaction Scheme 2

OHOH

OHOH

OHOH

-55CZ 287028 B6-55GB 287028 B6

Reakční schéma 3Reaction Scheme 3

OHOH

-56CZ 287028 B6-56GB 287028 B6

Reakční schéma 4Reaction Scheme 4

Cl, Br, I, OSO₂MeCl, Br, I, OSO ₂ Me

-57CZ 287028 B6-57GB 287028 B6

Reakční schéma 5Reaction scheme 5

COWHAT

OO

OO

XX

ZOF

XX

OO

C4C4

O zO z

³ co ³ co

-58CZ 287028 B6-58GB 287028 B6

Reakční schéma 6Reaction scheme 6

CONHPhCONHPh

CO₂BzCO ₂ Bz

CONHPhCONHPh

CONHPhCONHPh

-59CZ 287028 B6-59GB 287028 B6

Reakční schéma 7Reaction Scheme 7

NHCONHNHCONH

-60CZ 287028 B6-60GB 287028 B6

Reakční schéma 8Reaction Scheme 8

-61CZ 287028 B6-61EN 287028 B6

Reakční schéma 9Reaction scheme 9

-62CZ 287028 B6-62EN 287028 B6

Reakční schéma 10Reaction Scheme 10

NI-ICONHNI-ICONH

-63CZ 287028 B6-63GB 287028 B6

Reakční schéma 11Reaction Scheme 11

-64CZ 287028 B6-64GB 287028 B6

Prekurzory jako substráty pro karboxypeptidázu G2Precursors as substrates for carboxypeptidase G2

ClCl

X-CO-GluX-CO-Glu

ClCl

X Km (μΜ)X Km (μΜ)

+) +) 3,4 3.4 0 0 1,9 1.9 NH NH 3 3 ch₂ ch ₂ 16 16

+) z WO 88/07378+) from WO 88/07378

Potence léčivých látek vytvořených z jejich prekurzorůPotency of active substances formed from their precursors

X-CO-GluX-CO-Glu

Účinnost po 1 h léči vé látky proti kolo rektálním nádorovým známá⁺⁾ nováEfficacy after 1 h of drug treatment against round rectal tumor known ⁺⁾ new

R¹ Cl Cl IR ¹ Cl Cl I

Cl Cl Cl ClCl Cl Cl Cl

Cl buňkám (LoVo)- IC50VCl cells (LoVo) - IC50V

R² R ² R³ R ³ X X μΜ μΜ Cl Cl H H - - vyšší, než 500 higher than 500 mesyl mesyl H H - - 86 86 I AND H H 0 0 0,26 0.26 Cl Cl Me Me 0 0 0,75 0.75 Cl Cl F F NH NH 2,38 2.38 Cl Cl H H 0 0 0,3-3 0,3-3 Cl Cl H H NH NH 0,3-3 0,3-3 Cl Cl H H ch₂ ch ₂ 40 40

+) z WO 88/07378+) from WO 88/07378

-65CZ 287028 B6-65GB 287028 B6

Srovnávací údaje týkající se poločasu léčivé látky v pufru a plazmě (z nahé myši)Comparative data on the half-life of the active substance in buffer and plasma (from nude mice)

RR

X-CO-GluX-CO-Glu

Prekurzor léčivé látkv Precursor of the active substance Poločas 11/2 (min) Half-time 11/2 (min) R R R² R ² X X Pufr Buffer Plazma Plasma známý⁰ known ⁰ Cl Cl mesyl mesyl - - 17 17 30 30 nový new Cl Cl Cl Cl 0 0 4,5 4,5 kratší ± než 5^{1 2)} less than 5 ^{1 2)} Cl Cl Cl Cl NH NH 2,8 2.8 kratší ± než 5²⁾ less than ± ^{2 2)} I AND I AND 0 0 0,3 0.3 — -

1) zW0 88/078781) WO 88/07878

2) nedetekována při 5 min (nejkratší měřitelný čas)2) undetected at 5 min (shortest measurable time)

Srovnávací údaje týkající se poločasu léčivé látkyComparative data on the half-life of the active substance

R² R ²

XX

Poločas 11/2 (min)Half-time 11/2 (min)

NaC10₄ myšiNaC10 ₄ mice

R¹ R ¹

známý⁰ known ⁰ Cl Cl Cl Cl - - 324 324 97 97 nový new Cl Cl Cl Cl O O 13 13 kratší ± než 5° less than ± 5 ° Cl Cl Cl Cl NH NH 8 8 kratší ± než 5²⁾ less than ± ^{2 2)}

1) z WO 88/078781) of WO 88/07878

2) nedetekována při 5 min (nejkratší měřitelný čas)2) undetected at 5 min (shortest measurable time)

Claims (17)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Deriváty dusíkatého yperitu, které jsou prekurzorovými substráty pro karboxypeptidázy G a které mají obecný vzorec I ve kterémNitrogen mustard derivatives which are precursor substrates for carboxypeptidase G and having the general formula I in which: R¹ a R² každý nezávisle znamená atom chloru, atom bromu, atom jodu, skupinu OSO₂Me nebo OSO₂fenyl, kde fenylový zbytek je případně substituován 1,2,3,4 nebo 5 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, skupinu -CN a skupinu -NO₂,R ¹ and R ² each independently represent chlorine, bromine, iodine, OSO ₂ Me or OSO ₂ phenyl, wherein the phenyl moiety is optionally substituted with 1,2,3,4 or 5 substituents independently selected from the group consisting of (C 1 -C 4) -alkyl, halogen, -CN, and -NO ₂ ; R^la a R^2a každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo halogenalkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,R ^1a and R ^{2a are} each independently hydrogen, C 1 -C 4 alkyl or C 1 -C 4 haloalkyl, R³ a R⁴ každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo halogenalkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy,R ³ and R ⁴ each independently represent a hydrogen atom, a (C 1 -C 4) alkyl group or a (C 1 -C 4) haloalkyl group, R^5a, R^5b, R^5c a R^5d každý nezávisle znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, která případně obsahuje jednu dvojnou vazbu nebo jednu trojnou vazbu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, kyanoskupinu, skupinu -NH2, skupinu -CONR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ mají níže uvedený význam, skupinu -NH-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -N-(alkyl)2, ve které každý alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a alkanoylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů, neboR ^5a , R ^5b , R ^5c and R ^5d each independently represent a hydrogen atom, a (C 1 -C 4) alkyl group optionally containing one double bond or one triple bond, a (C 1 -C 4) alkoxy group, a halogen atom, cyano, -NH 2, -CONR ⁷ R ⁸ in which R ⁷ and R ⁸ are as defined below, -NH-alkyl in which the alkyl radical contains 1 to 4 carbon atoms, -N- (alkyl) 2 wherein each alkyl radical contains 1 to 4 carbon atoms and an alkanoyl group containing 2 to 5 carbon atoms, or R^5a a R^5b společně znamenajíR ^5a and R ^5b together represent a) alkylenovou skupinu obsahující 4 uhlíkové atomy, která případně má jednu dvojnou vazbu,(a) an alkylene group containing 4 carbon atoms optionally having one double bond, b) alkylenovou skupinu obsahující 3 uhlíkové atomy nebo(b) an alkylene group containing 3 carbon atoms; or c) skupinu -CH=CH-CH=CH-, skupinu -CH=CH-CH₂- nebo skupinu -CH₂CH=CH-, přičemž každá z těchto skupin je případně substituována 1,2,3 nebo 4 substituenty, z nichž každý je nezávisle zvolen z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, atom halogenu, kyano-skupinu, nitro-skupinu, alkanoylovou skupinu obsahující 2 až 5 uhlíkových atomů a skupinu -CONR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ mají níže uvedené významy,c) -CH = CH-CH = CH-, -CH = CH-CH ₂ - or -CH ₂ CH = CH-, each of which is optionally substituted with 1,2,3 or 4 substituents; each of which is independently selected from the group consisting of C 1 -C 4 alkyl, C 1 -C 4 alkoxy, halogen, cyano, nitro, C 2 -C 5 alkanoyl, and -CONR ⁷ R ⁸ , wherein R ⁷ and R ⁸ are as defined below, X znamená atom kyslíku, skupinu NH nebo skupinu -CH₂-67CZ 287028 B6X represents an oxygen atom, an NH group or a group -CH ₂ -67EN 287028 B6 Y znamená atom kyslíku,Y is an oxygen atom, Z znamená skupinu -V-W, ve které V znamená skupinu CH₂-T-, ve které T znamená skupinu -CHr-, -O-, -S-, -(SO)- nebo -(SO₂)-, s výhradou spočívající v tom, že když V jako druhý atom obsahuje atom síry nebo atom kyslíku, potom W je jiný než -COOH, přičemž uvedená skupina V případně dále nese na uhlíku jeden nebo dva substituenty Q¹ nebo/a Q², přičemž Q¹ a Q² každý nezávisle znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo atom halogenu, nebo když Q¹ a Q² jsou vázány k přilehlým uhlíkovým atomům, potom mohou Q¹ a Q² dodatečně znamenat alkylenovou skupinu, obsahující 3 nebo 4 uhlíkové atomy, která je případně substituována 1, 2, 3 nebo 4 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z množiny zahrnující alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy a atom halogenu, aZ represents a group -VW where V is -CH ₂ -T- in which T represents a group -CH, -O-, -S-, - (SO) - or - (SO ₂₎ -, with the proviso wherein when V as the second atom contains a sulfur atom or an oxygen atom, then W is other than -COOH, wherein said group V optionally further carries on carbon one or two substituents Q ¹ and / or Q ² , wherein Q ¹ and Q ² each independently represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or a halogen atom, or when Q ¹ and Q ² are attached to adjacent carbon atoms, then Q ¹ and Q ^{2 may} additionally represent an alkylene group containing 3 or 4 carbon atoms which is optionally substituted with 1, 2, 3 or 4 substituents independently selected from the group consisting of C 1 -C 4 alkyl and halogen, and W znamenáW stands for A) skupinu COOH,(A) the COOH group, B) skupinu -(C=O)-O-R⁶, ve které R⁶ znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů nebo arylovou skupinu definovanou níže v C),B) - (C = O) -OR ⁶ , wherein R ⁶ is C 1 -C 6 alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl, or aryl as defined in C below, C) skupinu -(C=O)-NR⁷R⁸, ve které R⁷ a R⁸ každý nezávisle znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů, arylovou skupinu, heteroarylovou skupinu připojenou k dusíku přes uhlík nebo aralkylovou skupinu obsahující 7 až 9 uhlíkových atomů, přičemž arylová skupina znamená fenylovou skupinu, heteroarylová skupina znamená 5- nebo 6-člennou kruhovou skupinu obsahující 1 až 3 heteroatomy zvolené z množiny zahrnující atom dusíku a atom síry, samotný aiylový zbytek, heteroarylový zbytek a arylový zbytek aralkylové skupiny může být na uhlíku substituován 1 až 4 substituenty zvolenými z množiny zahrnující skupinu -COOH, skupinu -OH, skupinu NH₂, skupinu -CH₂-NH₂, skupinu -(CH₂)_M-COOH, tetrazol-5-ylovou skupinu a skupinu -SO₃H a alkylový zbytek může případně nést methylovou skupinu,C) - (C = O) -NR ⁷ R ⁸ , wherein R ⁷ and R ⁸ each independently represent hydrogen or C 1 -C 6 alkyl, C 3 -C 6 cycloalkyl, aryl, heteroaryl a group attached to nitrogen via carbon or an aralkyl group having 7 to 9 carbon atoms, wherein the aryl group is a phenyl group, the heteroaryl group is a 5- or 6-membered ring group having 1 to 3 heteroatoms selected from nitrogen and sulfur, alone the aryl, heteroaryl and aryl groups of the aralkyl group may be substituted on carbon by 1 to 4 substituents selected from the group consisting of -COOH, -OH, NH ₂ , -CH ₂ -NH ₂ , - (CH ₂ ) _M -COOH, tetrazol-5-yl and -SO ₃ H and the alkyl radical may optionally carry a methyl group, D) skupinu -SO₂NHR⁹, ve kterém R⁹ má význam uvedený pro R⁷ a navíc znamená skupinu -CF₃, skupinu -CH₂CF₃ nebo výše uvedenou arylovou skupinu,D) -SO ₂ NHR ⁹ in which R ⁹ is as defined for R ⁷ and in addition is -CF ₃ , -CH ₂ CF ₃ or the above-mentioned aryl group, E) skupinu SO₃R¹⁰, ve které R¹⁰ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů nebo cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 6 uhlíkových atomů,E) SO ₃ R ¹⁰ in which R ¹⁰ represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, F) skupinu PO₃R¹⁰R¹⁰, ve které symboly R¹⁰, které mohou být stejné nebo odlišné, mají výše uvedený význam,(F) PO ₃ R ¹⁰ R ¹⁰ , in which R ¹⁰ , which may be the same or different, have the same meaning as previously defined, G) tetrazol-5-ylovou skupinu,G) tetrazol-5-yl, H) skupinu -CONH-SO₂R^h, ve které R¹¹ znamenáH) -CONH-SO ₂ R ^h , wherein R ¹¹ is a) cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 7 uhlíkových atomů,a) cycloalkyl group containing 3 to 7 carbon atoms, b) alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, která je případně substituována substituenty zvolenými z množiny zahrnující níže definovanou arylovou skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu CF₃ nebo atom halogenu ab) an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms which is optionally substituted with substituents selected from the group consisting of an aryl group as defined below, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a CF ₃ group or a halogen atom; and c) perfluoralkylovou skupinu obsahující 1 až 6 uhlíkových atomů, přičemž arylová skupina znamená fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu mající 1 až 5 substituentů, které jsou zvoleny z množiny zahrnující atom halogenu, skupinu c) a perfluoroalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, wherein the aryl group is a phenyl group or a phenyl group having 1 to 5 substituents selected from the group consisting of a halogen atom, a -68CZ 287028 B6-68GB 287028 B6 -NO₂, skupinu -CF₃, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -NH₂, skupinu -NHCOCH3, skupinu -CONH₂, skupinu -OCH₂COOH, skupinu -NH-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -N-(alkyl)₂, ve které každý alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -NHCOOalkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, skupinu -OH, skupinu -COOH, skupinu -CN a skupinu -COO-alkyl, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a-NO ₂ , -CF ₃ , C 1 -C 4 alkyl, C 1 -C 4 alkoxy, -NH ₂ , -NHCOCH 3, -CONH ₂ , -OCH ₂ COOH, - NH-alkyl in which the alkyl radical contains 1 to 4 carbon atoms, the -N- (alkyl) ₂ group in which each alkyl radical contains 1 to 4 carbon atoms, the -NHCOOalkyl group in which the alkyl radical contains 1 to 4 carbon atoms , -OH, -COOH, -CN, and -COO-alkyl in which the alkyl moiety contains 1 to 4 carbon atoms, and I) skupinu -M-Het, ve které M znamená S, SO nebo SO₂ a Het znamená 5- nebo 6členný heterocyklický aromatický kruh, který je připojen k M přes uhlíkový atom aromatického kruhu, přičemž uvedený aromatický kruh obsahuje 1, 2, 3 nebo 4 heteroatomy zvolené z množiny zahrnující atom kyslíku, atom dusíku a atom síry a je případně substituován na uhlíkových atomech kruhu 1, 2, 3 nebo 4 substituenty zvolenými z množiny zahrnující skupinu -OH, -SH, -CN, -CF₃, NH₂ a atom halogenu, a soli uvedených sloučenin obecného vzorce I, s výhradou spočívající v tom, že do rozsahu sloučenin obecného vzorce I nespadají kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorpropyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,I) a -M-Het group in which M is S, SO or SO ₂ and Het is a 5- or 6-membered heterocyclic aromatic ring which is attached to M through the carbon atom of the aromatic ring, said aromatic ring comprising 1, 2, 3 or 4 heteroatoms selected from oxygen, nitrogen and sulfur and is optionally substituted on carbon ring atoms with 1, 2, 3 or 4 substituents selected from -OH, -SH, -CN, -CF ₃ , NH ₂ and a halogen atom, and salts of said compounds of formula I, with the proviso that 2- (2- / 4- / bis- (2-chloropropyl) amino / phenyl / acetylamino) is not included in the compounds of formula I pentanedium, 5-methylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové, kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,2- (2- / 4- / Bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino) pentanedioic acid 5-methyl ester, 2- (2- / 4- / Bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl) acetylamino acid ) pentanedium, 5-ethylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové a kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)-4-karbamoylmáselná.2- (2- / 4- / Bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino) pentanedioic acid 5-ethyl ester and 2- (2- / 4- / bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl) acetylamino acid ) -4-Carbamoylbutyric acid. 2. Deriváty dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém R¹ a R² nezávisle znamenají atom jodu, atom bromu, atom chloru, skupinu OSO₂Me a skupinu OSOr-fenyl, ve které je fenylový zbytek substituován v poloze 2 nebo/a 4 1 nebo 2 substituenty definovanými v nároku 1.The nitrogen mustard derivative according to claim 1, wherein R ¹ and R ² independently represent iodine, bromine, chlorine, OSO ₂ Me and OSOr-phenyl, wherein the phenyl moiety is substituted at the 2-position or and / or 4 1 or 2 substituents as defined in claim 1. 3. Deriváty dusíkatého yperitu podle nároku 1 nebo nároku 2 obecného vzorce I, ve kterém R¹ a R² nezávisle znamenají skupinu -CH₃ nebo atom vodíku.The nitrogen mustard derivative according to claim 1 or claim 2, wherein R ¹ and R ^{2 are} independently -CH ₃ or hydrogen. 4. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém R³ a R⁴ nezávisle znamenají atom vodíku, methylovou skupinu a skupinu CF₃.Nitrogen mustard derivatives according to any one of the preceding claims, wherein R ³ and R ⁴ independently represent a hydrogen atom, a methyl group and a CF ₃ group. 5. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém R^5a a R^5d nezávisle znamenají atom vodíku, atom fluoru, atom chloru, methylovou skupinu, skupinu -CONH₂ a skupinu CN.The nitrogen mustard derivative according to any one of the preceding claims wherein R ^5a and R ^{5d are} independently hydrogen, fluorine, chlorine, methyl, -CONH _2, and CN. 6. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém R^5a až R^5d nezávisle znamenají atom vodíku.Nitrogen mustard derivatives according to any one of the preceding claims wherein R ^5a to R ^{5d are} independently hydrogen. 7. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém X znamená atom kyslíku nebo skupinu NH.Nitrogen mustard derivatives according to any one of the preceding claims wherein X represents an oxygen atom or an NH group. -69CZ 287028 B6-69GB 287028 B6 8. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém V je zvolen z množiny zahrnující skupinu -CH2-CH2 a když W znamená tetrazol-5ylovou skupinu, potom také skupinu -CH₂-S-.A nitrogen mustard derivative according to any one of the preceding claims wherein V is selected from the group consisting of -CH 2 -CH 2 and, when W is tetrazol-5-yl, also -CH ₂ -S-. 9. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém W má významy uvedené v definicích A), B), C) G) a I).Nitrogen mustard derivatives according to any one of the preceding claims wherein W has the meanings given in definitions A), B), C) G) and I). 10. Deriváty dusíkatého yperitu podle některého z předcházejících nároků obecného vzorce I, ve kterém W znamená skupinu -COOH, tetrazol-5-ylovou skupinu nebo skupinu -CONH-aryl, ve které arylový zbytek má význam definovaný v definici C) nároku 1.Nitrogen mustard derivatives according to any one of the preceding claims wherein W is -COOH, tetrazol-5-yl or -CONH-aryl, in which the aryl radical is as defined in definition C) of claim 1. 11. Deriváty dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I z množiny zahrnující11. A compound according to claim 1, selected from the group consisting of: a) kyselinu (S)-2-(4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyIamino)-4-(lH-l,2,3,4-tetrazol5-yl)máselnou a její soli,(a) (S) -2- (4- / bis- (2-chloroethyl) amino) phenoxycarbonylamino) -4- (1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl) butyric acid and its salts; b) kyselinu N-(4-/bis-(2-chlorethyl)amino/-3-fluorfenylkarbamoyl)-L-glutamovou a její soli,(b) N- (4- [bis (2-chloroethyl) amino) -3-fluorophenylcarbamoyl) -L-glutamic acid and its salts; c) kyselinu N-(4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenylkarbamoyl)-L-glutamovou a její soli a(c) N- (4- / bis- (2-chloroethyl) amino) phenylcarbamoyl) -L-glutamic acid and its salts; and d) kyselinu N-(4-/bis-(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamovou a její soli.d) N- (4- [bis (2-iodoethyl) amino) phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid and its salts. 12. Derivát dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I, kterým je kyselina N-(4/bis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová a její soli.12. A compound according to claim 1, which is N- (4 / bis- (2-chloroethyl) amino / phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid and its salts. 13. Derivát dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I, kterým je kyselina N-(4/bis-(2-jodethyl)amino/fenoxykarbonyl)-L-glutamová a její soli.13. A compound according to claim 1, which is N- (4 / bis- (2-iodoethyl) amino) phenoxycarbonyl) -L-glutamic acid and its salts. 14. Derivát dusíkatého yperitu podle nároku 1 obecného vzorce I, kterým je kyselina 4-/N,Nbis-(2-chlorethyl)amino/fenoxykarbonyl-L-glutamová a její soli.14. A compound according to claim 1 which is 4- [N, N-bis (2-chloroethyl) amino] phenoxycarbonyl-L-glutamic acid and its salts. 15. Způsob přípravy derivátů dusíkatého yperitu obecného vzorce I podle nároku 1 a jejich solí, vyznačený tím, že seProcess for the preparation of the nitrogen mustard derivatives of the general formula I according to claim 1 and their salts, characterized in that a) odstraní ochranné skupiny ve sloučenině obecného vzorce Ia ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a, R^5b, R^5c, R^5d, X, Y a Q² mají výše uvedené významy a Z¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že když W znamená karboxylovou skupinu, potom je tato skupina přítomna v chráněné formě, která je označena jako Pr², a Pr' rovněž znamená karboxylovou skupinu v chráněné formě, která může být stejná jako Pr² nebo odlišná od Pr², načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl, nebo sea) deprotects a compound of formula Ia wherein R ¹ , R ² , R ^1a , R ^2a , R ³ , R ⁴ , R ^5a , R ^5b , R ^5c , R ^5d , X, Y and Q ² are as defined above and Z ¹ is Z as defined above, with the proviso that when W represents a carboxyl group, this group is present in a protected form, which is designated Pr ² , and Pr 'also represents a carboxyl group in a protected form. , which may be the same as Pr ² or different from Pr ² , whereupon the compound of formula I thus obtained is optionally converted into its salt, -70CZ 287028 B6-70GB 287028 B6 b) v případě přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterém W znamená následující výše definované skupiny: D), tj. skupinu -SO2NHR⁹, E), tj. skupinu -SO3R¹⁰ a F), tj. skupinu -PO3R¹⁰R¹⁰, uvede v reakci sloučenina obecného vzorce XVIIIab) for preparing compounds of formula I wherein W represents the following groups as hereinbefore defined: D), i.e. a group -SO 2 NHR ^9, E), i.e. a group -SO 3 R ^10, and F), i.e. the group R ¹⁰ -PO3R ¹⁰ , reacts with a compound of formula XVIIIa NH₂ NH ₂ IAND HOOC-CH-Z¹¹¹¹ (XVIIIa), ve kterém Z¹¹¹¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená následující výše definované skupiny: D), tj. -SO2NHR⁹, E), tj. -SO3R¹⁰ a F), tj. -PO3R¹⁰R¹⁰, se sloučeninou výše definovaného obecného vzorce II (II), ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a až R^5d, X a Y mají výše uvedené významy a L znamená odlučitelný atom nebo odlučitelnou skupinu, nebo se sloučeninou obecného vzorce V (V), ve kterém R¹, R², R^la, R^2a, R³, R⁴, R^5a až R^5d mají výše uvedené významy, za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém W znamená skupinu D), E) a F), načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl nebo seHOOC-CH-Z ¹¹¹¹ (XVIIIa), wherein Z ¹¹¹¹ is Z as defined above, with the proviso that W is as defined above: D), ie -SO2NHR ⁹ , E), ie -SO3R ¹⁰ and F), i.e. -PO ³ R ¹⁰ R ¹⁰ , with a compound of formula (II) above, wherein R ¹ , R ² , R ^1a , R ^2a , R ³ , R ⁴ , R ^5a to R ^5d , X and Y are as defined above and L is a separable atom or a separable group, or with a compound of formula V (V) wherein R ¹ , R ² , R ^1a , R ^2a , R ³ , R ⁴ , R ^5a through R 5 ^5d have the meanings given above to give a compound of formula I in which W is a group D), E) and F), whereupon the compound of formula I thus obtained is optionally converted into a salt thereof or c) v případě přípravy sloučenin obecného vzorce I, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, uvede v reakci sloučenina obecného vzorce XVIIIbc) reacting a compound of formula XVIIIb in the preparation of compounds of formula I in which W is a tetrazol-5-yl group NH₂ NH ₂ IAND HOOC-CH-Z¹¹¹¹ (XVIIIb), ve kterém Z¹¹¹¹ znamená výše definovaný obecný symbol Z s výhradou spočívající v tom, že W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, se sloučeninou výše definovaného obecného vzorce II za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém W znamená tetrazol-5-ylovou skupinu, načež se takto získaná sloučenina obecného vzorce I případně převede na její sůl, s výhradou spočívající v tom, že do rozsahu sloučenin obecného vzorce I nespadajíHOOC-CH-Z ¹¹¹¹ (XVIIIb), wherein Z ¹¹¹¹ is Z as defined above, with the proviso that W is tetrazol-5-yl, with a compound of formula II as defined above to form a compound of formula I, wherein W is tetrazol-5-yl, whereupon the compound of formula I thus obtained is optionally converted into a salt thereof, with the proviso that they do not fall within the scope of the compounds of formula I -71CZ 287028 B6 kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorpropyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,-71EN 287028 B6 2- (2- / 4- / Bis- (2-chloropropyl) amino / phenyl / acetylamino) pentanedioic acid, 5-methylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové,5-methyl 2- (2- / 4- / bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl) acetylamino) pentanedioic acid, 5 kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,5 2- (2- / 4- / bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino) pentanedioic acid, 5-ethylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové a kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)-4-karbamoylmáselná.2- (2- / 4- / Bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino) pentanedioic acid 5-ethyl ester and 2- (2- / 4- / bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl) acetylamino acid ) -4-Carbamoylbutyric acid. 16. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že jako prekurzor léčivé látky obsahuje alespoň jeden derivát dusíkatého yperitu obecného vzorce I podle nároku 10, 13 nebo 14 nebo fyziologicky přijatelnou sůl uvedeného derivátu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným16. A pharmaceutical composition comprising at least one nitrogen mustard derivative of the formula I as claimed in claim 10, 13 or 14 or a physiologically acceptable salt of said derivative in combination with a pharmaceutically acceptable 15 nosičem nebo ředidlem, s výhradou spočívající v tom, že do rozsahu sloučenin obecného vzorce I nespadají kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorpropyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,15 with a carrier or diluent, with the proviso that 2- (2- / 4- / bis- (2-chloropropyl) amino / phenyl) acetylamino) pentanedioic acid is not included in the compounds of formula I, 20 5-methylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové, kyselina 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiová,20 2- (2- / 4- / Bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino) pentanedioic acid 5-methyl ester, 2- (2- / 4- / bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl) acetylamino) pentanedioic acid, 5-ethylester kyseliny 2-(2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetylamino)pentandiové a kyselina 2-{2-/4-/bis-(2-chlorethyl)amino/fenyl/acetyIamino)-4—karbamoylmáselná.2- (2- / 4- / Bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino) pentanedioic acid 5-ethyl ester and 2- {2- / 4- / bis- (2-chloroethyl) amino / phenyl / acetylamino ) -4 — Carbamoylbutyric acid. 17. Dvojsložkový systém, ve kterém je jedna složka určena pro použití s druhou složkou, 30 vyznačený tím, že zahrnujeA two-component system in which one component is intended for use with the other component 30, characterized in that it comprises i) první složku, kterou je protilátka nebo její fragment, které jsou schopné vázat se s daným antigenem, přičemž tato protilátka nebo její fragment jsou konjugovány s enzymem karboxypeptidázou G, který je schopen převést sloučeninu obecného vzorce I nebo jejíi) a first component which is an antibody or fragment thereof capable of binding to said antigen, said antibody or fragment thereof being conjugated to an enzyme carboxypeptidase G capable of converting a compound of formula I or a compound thereof 35 fyziologicky přijatelnou sůl na cytotoxickou léčivou látku a ii) druhou složku, kterou je derivát dusíkatého yperitu obecného vzorce I podle nároku 10, 13 nebo 14 nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl, které jsou konvertovatelné působením enzymu karboxypeptidázy G na cytotoxickou léčivou látku.And ii) a second component which is a nitrogen mustard derivative of the formula I according to claim 10, 13 or 14, or a physiologically acceptable salt thereof, which is convertible by the action of the carboxypeptidase G enzyme on the cytotoxic drug substance.