CZ285996B6 - Způsob in vitro stimulace produkce nekeratinocytových epithelových buněk a růstový faktor keratinocytů pro léčbu chorob - Google Patents
Způsob in vitro stimulace produkce nekeratinocytových epithelových buněk a růstový faktor keratinocytů pro léčbu chorob Download PDFInfo
- Publication number
- CZ285996B6 CZ285996B6 CZ952482A CZ248295A CZ285996B6 CZ 285996 B6 CZ285996 B6 CZ 285996B6 CZ 952482 A CZ952482 A CZ 952482A CZ 248295 A CZ248295 A CZ 248295A CZ 285996 B6 CZ285996 B6 CZ 285996B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- kgf
- growth factor
- cells
- keratinocyte growth
- liver
- Prior art date
Links
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 title claims abstract description 178
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 title claims description 172
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 51
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 5
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000022605 chemotherapy-induced alopecia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 3
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000203 Hyaline Membrane Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032571 Infant acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028974 Neonatal respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 claims description 2
- 201000002652 newborn respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 206010063655 Erosive oesophagitis Diseases 0.000 claims 2
- 206010017865 Gastritis erosive Diseases 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 claims 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 claims 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 claims 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 claims 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 claims 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 claims 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 23
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 21
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 abstract description 20
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 abstract description 20
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 abstract description 18
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 abstract description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 42
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 27
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 23
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 16
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 15
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 15
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 13
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 12
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 12
- 210000002588 alveolar type II cell Anatomy 0.000 description 11
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 10
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 10
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 7
- 229950005499 carbon tetrachloride Drugs 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 7
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 240000007711 Peperomia pellucida Species 0.000 description 5
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 5
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 4
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 4
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 210000004378 sebocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 3
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 3
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 210000004043 pneumocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 206010068168 androgenetic alopecia Diseases 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 210000001100 crypt cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 238000012735 histological processing Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 108010029560 keratinocyte growth factor receptor Proteins 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 230000003843 mucus production Effects 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 238000012753 partial hepatectomy Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxomolybdenum Chemical compound O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.OP(O)(O)=O DHRLEVQXOMLTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 1
- 208000008964 Chemical and Drug Induced Liver Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057573 Chronic hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 208000016952 Ear injury Diseases 0.000 description 1
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100446512 Homo sapiens FGF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000898505 Homo sapiens Histatin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 208000021063 Respiratory fume inhalation disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007893 endotoxin activity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000037309 reepithelialization Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 210000003286 small intestinal goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- ZNVGYHOBTCWGTO-UHFFFAOYSA-N solutin Natural products Cc1cc(O)cc2OC(C)(O)C(=O)c12 ZNVGYHOBTCWGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu in vitro stimulace produkce nekeratinocytových epithelových buněk, jako jsou sebocyty, buňky vlasových folikulů, hepatocyty, pneumocyty typu II, pohárkovité buňky produkující mucin a jiné epithelové buňky a jejich progenitory obsažené v kůži, plicích, játrech a gastrointestinálním traktu, při němž se tyto buňky uvedou do styku s účinným množstvím růstového faktoru keratinocytů. Dále se řešení týká růstového faktoru keratinocytů pro léčbu dermálních poranění za účelem stimulace produkce buněk mazových žlaz a vlasových folikulů, například pro léčbu popálenin, epidermolysis bullosa,, alopecie indukované chemoterapií, plešatosti mužského typu, dále pro léčbu žaludečních vředů, dvanáctníkových vředů, erozí žaludku a jícnu, erosivní gastritis, oesophagitis nebo oesophageálního refluxu, zánětlivých chorob střev, pro léčbu nebo prevenci toxicity pro vnitřnosti vyvolané radiací nebo ozářením a chemoterapií, pro léčbu choroby hyalinní membrány, nekrosy respiračního epithelŕ
Description
Použití růstového faktoru keratinocytů pro výrobu léčiva
Oblast techniky
Vynález se týká použití růstového faktoru keratinocytů (KGF) pro výrobu léčiva pro léčení nebo prevenci choroby nebo stavu, vyžadujícího stimulaci nefibroblastových epitelových buněk pacienta. Toto použití je založeno na tom, že KGF stimuluje proliferaci růstu a deferenciace buněk jiných, než jsou keratinocyty. Takového léčiva je možno použít pro léčbu chorob u pacientů, u nichž je prospěšné dosáhnout regenerace poškozených a nemocných buněk a tkání.
Dosavadní stav techniky
Pokrok v biotechnologii v nedávných letech vedl k vývoj i a terapeutickému použití nových rekombinantních polypeptidů, jako je erythropoietin a faktor, stimulující granulocytovou kolonii, k užitku mnoha humánních pacientů. Od té doby byla objevena celá řada dalších polypeptidů, vykazujících biologickou účinnost in vitro. Pro identifikaci potenciálních terapeutických aplikací u člověka je však důležité zjištění biologických účinků těchto faktorů a charakterizace cílových buněk, na něž jsou tyto faktory zaměřeny.
KGF je známý mitogen, u něhož byla nedávno zjištěna specifická pro buňky epitelu, zejména keratinocyty (Rubin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 802-806 (1 989); Finch et al., Science, 245:752-755(1 989) a Merchese et al., J. Cell. Phys. 144:326 až 332 (1 990)). Exprese mediátorové RNA pro KGF byla zjištěna u několika buněčných linií stromálních fibroblastů, získaných z epitelových tkání embryonálního, neonatálního a adultního humánního původu a v RNA, extrahované z normálních adultních ledvin a gastrointestinálního traktu. Taková RNA nebyla zjištěna v gliálních buňkách, plicích, mozku, ani v různých buněčných linií epitelu, včetně kultur karcinomů šupinatých buněk, mamámích epitelových buněk, imortalizovaných bronchiálních epitelových buněk, imortalizovaných keratinocytů a primárních keratinocytů (Finch et al., Science, výše uvedená citace). KGF je však mitogenicky účinný u kontinuální linie myších buněk, BALB/MK (Weissman a Aaronson, Cell., 32: 599(1 983) a také PNAS a Science viz výše). Toto pozorování podporuje tvrzení, že KGF vykazuje v kůži parakrinní účinek, přičemž k produkci KGF dochází v dermis (ale nikoliv v epidermis) a že působí na keratinocyty.
Pomocí exprese genů pro keratin a filagrin bylo dále ukázáno, že KGF ovlivňuje diferenciaci a maturaci keratinocytů (viz J. Cell. Phys., výše uvedená citace).
Velká část výše popsaných výzkumů biologické aktivity KGF byla prováděna s rekombinantním KGF, což umožnilo rozšířit studii tohoto faktoru. Publikovaná patentová přihláška PCT WO 90/08 771 popisuje puriíikaci KGF z kondicionovaného média linie humánních embryonálních fibroblastů, částečné sekvenování izolovaného polypeptidu, klonování genu a expresi v bakteriálních buňkách (E. coli) za účelem produkce rekombinantního biologicky účinného KGF.
Zatímco úloha KGF, jakožto stimulačního činidla pro keratinocyty in vitro, již byla jasně identifikována, mnohé zůstává nezodpovězeno, pokud se týče úlohy KGF jako růstového faktoru, včetně identifikace dalších typů buněk, na něž může být KGF zacílen, a účinku KGF na takové buňky in vivo. Takové informace jsou velmi důležité pro pochopení celkového potenciálu KGF jako terapeutického činidla.
V EP 455 422 je popsán způsob zlepšování tělesného vzhledu člověka, při němž se na skalp aplikuje růstový faktor nebo růstové faktory fibroblastů (FGF) v množství, postačujícím pro léčení plešatosti mužského typu, například prostřednictvím stimulace implantovaných vlasových
- 1 CZ 285996 B6 štěpů. Z různých typů FGF jsou zde konkrétně zmíněny bFGF, int2, hst/KS3, FGF-6, KGF a popřípadě též aFGF.
V EP 455 422 není popisováno použití KGF pro léčení alopecie, indukované chemoterapií. Vzhledem ktomu, že etiologie ztráty vlasů při plešatosti mužského typuje odlišná od etiologie, vyvolané chemoterapií, nebylo možno předem předpokládat, že bude možno úspěšně použít KGF i ve druhém zvýše uvedených případů. Předložený vynález proto vykazuje potřebnou novost i vynálezeckou činnost vůči řešení, popsanému v EP 455 422.
Ve WO 92/14 480 je obecně popsáno, že KGF se ukázal být účinným EGF při stimulaci proliferace lidských keratinocytů. Dále se zde uvádí, že KGF je možno kombinovat s G-CSF a vzniklé směsi je možno používat pro urychlení hojení ran. Použití, která jsou předmětem předloženého vynálezu, nejsou v citované přihlášce uvedena ani navržena.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je použití růstového faktoru keratinocytů pro výrobu léčiva nebo prevenci choroby nebo stavu, vyžadujícího stimulaci nefíbroblastových epitelových buněk pacienta.
V krátkosti lze konstatovat, že vynález je založen na zjištění stimulačního účinku KGF na nekeratinocytové buňky epitelu. Konkrétněji se zjistilo, že KGF indikuje in vivo proliferaci a diferenciaci v normálních adnexálních strukturách, jako jsou sebocyty a buňky vlasových folikulů, v jatemích buňkách, jako jsou hepatocyty, a v buňkách mukozálního epitelu respiračního traktu, jako jsou pneumocyty typu II. Existuje též přesvědčivý důkaz, že KGF stimuluje proliferaci a růst buněk intestinální sliznice, například pohárkovitých buněk, produkujících mucin v žaludečních žlázách a v tenkém střevu, kryptických buněk v tračníku a jiných epitelových buněk ve vnitřnostech.
Tyto objevy mají významný dosah v tom, že umožňují aplikovat KGF na tkáně, v nichž existuje specifické poškození nebo nedostatečnost v buňkách těchto konkrétních typů. Následuje popis chorob a stavů, které lze léčit pomocí KGF v souladu s poznatky tohoto vynálezu.
Stimulace proliferace a diferenciace adnexálních struktur, jako jsou vlasové váčky, potní žlázy a mazové žlázy, má kritickou důležitost při regeneraci epidermis a dermis u pacientů, postižených popáleninami a jinými poškozeními v částečné nebo úplné tloušťce. Povrchové defekty se současné době hojí vytvořením jizvy a obnovením povrchově vrstvy keratinocytů, přičemž však úplné regenerace kůže dosud nelze dosáhnout. U kožních defektů, zasahujících celou tloušťku kůže, včetně popálenin, nedochází v současné době k repopulaci vlasových váčků, potních žláz a mazových žláz. Za použití KGF je takové repopulace možno dosáhnout.
Epidermolysis bullosa je defekt přilnavosti epidermis k podložní dermis, který má za následek časté otevřené a bolestivé puchýře, způsobující vážné onemocnění. Urychlená reepitelizace těchto lézí, například za použití KGF, by se projevila sníženým nebezpečím infekce, menší bolestivostí a sníženou potřebou péče o rány.
K alopecii, vyvolané chemoterapií, dochází u pacientů, léčených chemoterapeuticky za účelem potlačení maligních nádorových onemocnění. V současné době nejsou k dispozici žádná léčiva, která by účinně zabraňovala usmrcením buněk vlasových váčků, které způsobuje přechodnou ztrátu vlasů. KGF takový prostředek představuje.
Plešatost mužského typu je převládající typ plešatosti aje v podstatě neléčitelná. Progresivní ztráta vlasů u mužů a žen je vážným kosmetickým problémem. Tento stav by bylo možno léčit za použití KGF buď systemicky nebo topikálně, pokud by bylo léčivo možno aplikovat na skalp, kde
-2CZ 285996 B6 by docházelo kjeho absorpci, nebo pokud by bylo možno jej podávat sprejovými injekcemi do skalpu za použití vzduchové pistole nebo jiných technologií.
Žaludeční vředy je možno léčit antagonisty H2, ale přesto jsou významnou příčinou onemocnění, která se často opakují. Jejich hojení spočívá ve vytvoření jizvy v mukozální výstelce. Schopnost rychlejší regenerace glandulámí mukózy, například podáváním KGF, by představovala významné terapeutické zlepšení při léčbě žaludečních vředů.
Dvanáctníkové vředy jsou sice, podobně jako žaludeční vředy, léčitelné, ale vyvinutí terapeutických činidel, která by měla za následek úplnější a rychlejší regeneraci mikozální výstelky dvanáctníku, by představovala významný pokrok. Užitečná by přitom byla také skutečnost, že by pomocí tohoto terapeutického činidla došlo k regenerativnímu vyhojení vředů a snížení jejich četnosti jejich opakovaného výskytu. KGF takový potenciál má.
Inflamatomí choroby střev, jako je Crohnova choroba (která převážně postihuje tenké střevo) a ulcerativní kolitis (která převážně postihuje tlusté střevo), jsou chronické choroby neznámé etiologie, které se projevují destrukcí mukozálního povrchu, zánětem, zjizvením a srůsty, vznikajícími při hojení, a značnou morbiditou postižených pacientů. Současná terapie se orientuje na potlačení zánětu. Terapeutika, jako je KGF, stimulující obnovení mukozálního povrchu a urychlující hojení, by mohla být užitečná při potlačování postupu těchto chorob.
Střevní toxicita představuje hlavní omezující faktor pro léčebné režimy, zahrnující ozařování a chemoterapii. Předběžná léčba KGF by mohla mít cytoprotektivní účinek na sliznicí tenkého střeva, což by umožnilo zvýšit dávky při takových druzích léčby za současného snížení potenciálních fatálních vedlejších účinků střevní toxicity.
Léčba KGF má pozoruhodný účinek na produkci slizu v gastrointestinálním traktu. Tato vlastnost může být užitečná pro ochranu střevní sliznice před poškozením použitými škodlivými látkami nebo při omezování šíření poškození při chorobách, jako je zánětlivá choroba střev.
Choroba hyalinní membrány u předčasně narozených novorozenců má za následek absenci tvorby surfaktantu pneumocyty typu II v plicích, jejímž projevem je zhroucení alveol. Přestože je u plodů starých 28 týdnů a starších možno ve značném rozsahu urychlit maturaci a sekreci podáváním kortikosteroidů, neexistuje v současné době žádná léčba pro mladší plody, což má za následek významnou morbiditu a mortalitu u této populace. Terapeutické činidlo, jako KGF, které indukuje poliferaci a diferenciaci pneumocytů typu Π, je potenciálně velmi užitečné při léčbě této choroby.
Vdechování kouře je významnou příčinou morbidity a mortality v týdnu, který následuje po utrpění popálenin, a je způsobeno nekrózou bronchiolámího epitelu a alveol. Růstový faktor, jako KGF, který by mohl stimulovat proliferaci těchto struktur a indukovat jejich opravu a regeneraci, by byl užitečný při léčbě takových inhalačních poškození.
Emphysema je důsledkem progresivní ztráty alveol. Růstový faktor, jako KGF, který by mohl stimulovat nový růst, nebo který by byl cytoprotektivní vzhledem ke zbývajícím alveolám, by byl terapeuticky užitečný. V současné době neexistuje pro tuto chorobu žádná účinná léčba.
Cirhóza jater je vedle virové hepatitidy a chronického požívání alkoholu jednou z významných příčin morbidity a mortality. Cytoprotektivní účinek a účinek na proliferaci a diferenciaci hepatocytů, vyvolaný například KGF, by zvýšil funkci jater, což by se projevilo zpomalením nebo znemožněním vzniku cirhózy.
Fulminantní selhání jater je choroba ohrožující život, k níž dochází v posledním stadiu cirhózy. Činidlo, jako KGF, které by mohlo indukovat proliferaci zbývajících hepatocytů, by vykazovalo přímý užitečný vliv na tuto chorobu, která je v současné době léčitelná pouze transplantací jater.
-3CZ 285996 B6
Akutní virová hepatitida je často subklinická a má samoomezující průběh. U menší části pacientů může však dojít k vážnému poškození jater během několika týdnů. Cytoprotektivní činidlo, jako je KGF, by mohlo být užitečné při prevenci hepatocelulámí degenerace.
Toxické poškození jater, vyvolané acetaminofenem, halothanem, tetrachlormethanem a jinými toxiny, by bylo možno zlepšit pomocí růstového faktoru, jako je KGF, který vykazuje cytoprotektivní účinek vůči hepatocytům.
Předmětem vynálezu je KGF pro terapeutickou (nebo, kde je to též vhodné, také pro profylaktickou) léčbu výše uvedených chorob. Dalším předmětem vynálezu jsou farmaceutické prostředky, obsahující terapeuticky účinné množství KGF.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněna sekvence nukleotidů syntetické oligonukleotidové DNA, použité při konstrukci rekombinantního expresního systému pro KGF, kterého bylo použito při experimentech in vivo, uvedených v tomto popisu.
Na obr. 2 je znázorněno dermální poranění králičího ucha v částečné tloušťce, které je modifikováno tak, že rána proniká chrupavkou, za účelem lepší kvantifikace růstu nové tkáně.
Na obr. 3 je znázorněna reepitelizace rány, léčené KGF, a kontrolní rány za použití modifikovaného dermálního poranění v částečné tloušťce v králičím uchu, jako modelu. Celková plocha regenerujícího se epitelu po léčbě KGF je znázorněna nalevo, zatímco procentický podíl reepitelizace rány je uveden napravo.
Na obr. 4 je znázorněna proliferace bazálních a suprabazálních keratinocytů na okrajích rány do 5 dnů po ošetření KGF za použití poranění králičího ucha jako modelu.
Na obr. 5 je znázorněna histologická analýza vlasových váčků, léčených bromdeoxyuridinem (BrdU) zraň léčených KGF a kontrolních ran, jejímž účelem je ukázat proliferaci buněk u modifikovaného králičího modelu.
Na obr. 6 je ukázáno vybarvení mazových žláz olejovou červení u poranění léčeného KGF a kontrolního poranění v případě stejného králičího modelu.
Na obr. 7 a 8 je ukázán mikropapilámí nárůst alveolámích septálních epitelových buněk v plicích zdravých krys, kterým byl intratracheálně podán KGF.
Na obr. 9 a 10 je ukázán krychlovitý nárůst epitelových buněk v alveolách velkých segmentů plic po intratracheálním podání KGF stejným zdravým krysám.
Obr. 11 a 12 ukazují, hyperplastické alveolámí epitelové buňky, tvoří výstelku alveolámích sept takto léčených krys, obsahují lamelámí inkluze různé velikosti a tvaru.
Obr. 13A ukazuje hyperplastické účinky léčby KGF v bronchiálním epitelu po intratracheálním podání KGF zdravým krysám.
Obr. 13B ukazuje bronchiální epitel kontrolní skupiny (podán pouze excipient) zdravých krys, která odpovídá zkušební skupině z obr. 13 A.
Na obr. 14 jsou uvedeny výsledky zkoušky protekce receptoru KGF (KGFR) RNázou v plicích dospělých kiys.
-4CZ 285996 B6
Obr. 15 ukazuje zvýšení hmotnosti gastrointestinálního traktu a jater v závislosti na podané dávce po čtyřdenním podávání KGF.
Obr. 16 ukazuje zvýšení syntézy proteinu v krysích játrech v závislosti na podané dávce po čtyřdenním podávání KGF.
Obr. 17 ukazuje zvýšenou proliferaci hepatocytů v játrech zvířat, ošetřovaných jeden až sedm dnů KGF, stanovenou pomocí značení BrdU (a) nebo počtu mitóz (b).
Obr. 18 a 19 uvádějí množství získané jatemí hmoty po ošetření zčásti hepatektomizovaných krys KGF.
Obr. 20 uvádí snížení hladiny sérové glutamátoxaloacetát tranaminázy (SGOT) v krevním séru u krys, otrávených tetrachlormethanem, po léčbě KGF.
Obr. 21 ukazuje zvětšení délky gastrických žláz a množství vytvořeného slizu v žaludečních žlázách krys, ošetřovaných KGF po dobu 1 až 7 dnů.
Obr. 22 ukazuje prodloužení duodenálních krypt a tvorbu slizu v tenkém střevě krys, ošetřovaných KGF po dobu 1 až 7 dnů.
Obr. 23 ukazuje zvýšení hyperplastických krypt v tračníku krys, ošetřovaných KGF po dobu 1 až 7 dnů.
Obr. 24 ukazuje prohloubení krypt v tračníku krys, ošetřovaných KGF po dobu 1 až 7 dnů.
Popis specifických provedení tohoto vynálezu
Pro identifikaci specifických typů epitelových buněk, u nichž KGF poskytuje významný biologický účinek, který je indikativní pro jeho potenciální terapeutickou užitečnost, byla provedena rozsáhlá studie na živých zvířatech. Těmto zvířatům byl in vivo podáván KGF, přičemž byly sledovány a analyzovány dosažené výsledky. Ve všech následujících příkladech bylo použito rekombinantního KGF, vyrobeného následujícím způsobem:
Rekombinantní gen KGF se izoluje z RNA fibroblastu humánní předložky (AG1523) pomocí polymerázové reakce (PCR) a výsledná DNA se liguje do expresního vektoru pCFMl 156 mezi restrikční místa Ndel a BamHI. Plazmid pCFM1156se může získat z plazmidu pCFM836 způsobem, popsaným v US patentu č. 4 710 473 (celý obsah tohoto patentu je relevantní pro popis tohoto vynálezu) tak, že se zničí dvě endogenní restrikční místa Ndel vyplněním konce enzymem T4 polymerázou, načež se provede ligace tupého konce a nahrazení krátké sekvence DNA mezi jedinečnými restrikčními místy Clal a KpnI následujícím oligonukleotidovým duplexem, zahrnujícím sekvenci SEQ. ID NO.: 1 a sekvenci SEQ. ID NO.: 2
Clal KpnI ’CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3 ’ 3’ TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5’
Plazmid pCFM1156KGF se potom klonuje do hostitelských buněk FM5 (ATCC č. 53 911) standardním elektroporačním transformačním postupem (za použití zařízení BioRad Gene Pulser). Pro snížení pozorované interní translační iniciace se sekvence DNA v genu KGF mezi restrikčními místy KpnI a EcoRI nahradí syntetickou oligonukleotidovou DNA, která je zkonstruována tak, aby se snížilo využití vnitřního ribosomálního vazebného místa (obr. 1). Po ligaci a elektroporaci do buněk FM5 (ATCC č. 53 911) se selektuje klon, obsahující
-5CZ 285996 B6 pCFMl 156KGF-dsd. Potvrdí se sekvence DNA kódující gen KGF. Potom se buňky kultivují při 30 °C v lOlitrových fermentorech za použití standardního dávkování média, umožňujícího buňkám růst exponenciální rychlostí. Omezujícím faktorem je glukóza, aby se zabránilo akumulaci toxického vedlejšího produktu. Při dosažení poloexponenciální hustoty buněk se teplota na krátkou dobu zvýší na 42 °C za účelem indukce transkripce genu KGF. Potom se po zbytek KGF indukční fáze fermentace udržuje teplota přibližně na 42 °C. Oddělená buněčná pasta se skladuje ve zmrazeném stavu. Biologicky účinný KGF se získá purifíkací z mechanicky lyžované buněčné pasty standardními chromatografickými postupy, při kterých se využívá velmi vysokého izoelektrického bodu tohoto proteinu (S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia) a velikosti (Superdex 75, Pharmacia). Purifikovaný rekombinantní protein KGF se podrobí zkoušení na endotoxin a biologickou účinnost pomocí mitogenní zkoušky, popsané v publikaci Rubín et al., PNAS, viz výše.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Uvedené příklady mají výhradně ilustrativní charakter a vynález v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
KGF-stimulovaná proliferace a diferenciace adnexálních struktur při modelovém hojení rány in vivo.
V tomto příkladu se používá modifikovaného modelu dermálního poranění v částečné tloušťce v uchu králíka. Modelový dermální vřed v uchu králíka, popsaný v Mustoe et al., J. Clin. Invest. 87: 694 až 703 (1 991), se za použití 6mm trefinu modifikuje tak, že poranění pochází chrupavkou až k dermis na zadní straně ucha. V důsledku toho se rána hojí pučením elementů epitelu pod chrupavkou. Přitom se kontrakce nestává proměnnou veličinou v průběhu hojení, což umožňuje přesnou kvantifikaci nových tkání (viz obr. 2). Jako terapeutického činidla pro hojení rány se použije rekombinantního KGF, vyrobeného výše uvedeným způsobem.
Materiály a metody
KGF nebo samotné fosfátem pufrované vehikulum na bázi roztoku chloridu sodného se aplikuje jednou v den chirurgického zákroku a rány (0,25 cm2) se kryjí okluzivním obvazem Tegaderm (výrobek firmy 3M Company, St. Paul, MN, USA). Před usmrcením obdrží každé zvíře intravenózní injekci BrdU (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, USA) v množství 50 mg/kg tělesné hmotnosti. BrdU se používá pro zlepšení kvantifikace stupně proliferace bazálního keratinocytu a kinetiky migrace bazálních buněk k stratům spinosum a stratům comeum. Po usmrcení se poraněné místo rozřízne na dvě části, přičemž jedna část se zmrazí v médiu „Optimum Cooling Temperature Medium“ (OCT, Miles lne., Elkhart, IN, USA) a druhá část se fixuje v prostředku Omnifix (Al-Con, Genetics, lne. Melville, New York, USA) a zpracuje rutinními histologickými metodami. Vybarvení pomocí Masson Trichrome, červení Oil Red o a imunohistochemické vybarvení (IHC) se provádí na řezech poranění o tloušťce 3 pm.
Měření reepitelizace
U každého poranění se pomocí kalibrovaného objektivního mikrometru měří celková mezera a mezera v epitelu. Podíl reepitelizace v procentech u každého poranění se vypočítá jako rozdíl celkové mezery a mezery v epitelu, dělený celkovou mezerou v příslušném poranění. Data zjištěná ze dvou řezů každého poranění se zprůměrují. Rozdíly v naměřených hodnotách mezery
-6CZ 285996 B6 v epitelu a procentické podíly reepitelizace se analyzují nezdvojeným Studentovým t-testem s jednou větví.
U každé skupiny, která byla podána jedna dávka (léčivo nebo vehikulum), se vypočítá plocha vytvořeného epitelu. Pro každou dávku proti kontrolní skupině se provede jednosměrný test ANOVA a Dunnettův t-test.
Měření proliferace a diferenciace buněk epitelu
Řezy tkáně o tloušťce 3 pm, uložené v parafínu, se barví za použití anti-BrdU (Dako Corp. Carpinteria, CA, USA), komplexem avidin-biotin (Vector Laboratories lne., Burlingame, CA, USA) a diaminobenzidinovým substrátem (DAB, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Řezy se louží 0,1 % roztokem proteázy a potom se zpracují 2N kyselinou chlorovodíkovou. Endogenní peroxidáza se rozloží působením 3 % roztoku peroxidu vodíku. Preparáty se blokují 10% roztokem normálního koňského séra ve fosfátem pufrovaném roztoku chloridu sodného (PBS) a potom inkubují a anti-BrdU, zředěným v poměru 1:400 1 % roztokem hovězího sérového albuminu (BSA). Po promytí se řezy 20 minut inkubují s avidin-biotinovým komplexem s navázanou peroxidázou při zředění 1 : 100 v 1 % roztoku BSA. Potom se preparáty uvedou na 10 minut do styku se substrátem DAB (10 mg DAB, 20 ml PBS a 20 μΐ 30 % peroxidu vodíku). Nakonec se řezy dobarví hematoxylinem.
Histologická analýza vlasových váčků, ošetřovaných BrdU
Po zavedení BrdU a obarvení IHC se zjistí celkový počet váčků v lůžku poranění a zjištěný údaj se analyzuje za použití Kruskall-Wallisova několikanásobného srovnávacího testu. Další analýza zahrnuje zkoušku sChí-čtverci na procentický podíl poranění sfolikuly, obsahujícími 10 nebo více proliferačních buněk v každé skupině s jednou úrovní ošetření. Kromě toho se ve všech folikulech, obsahujících více než 5 proliferačních buněk, zjistí počet BrdU pozitivně vybarvených buněk.
Barvení mazových žláz barvivém Oil Red o
Barviva Oil Red o, které je specifické pro neutrální lipidy, se použije pro identifikaci sebocytů a mazových žláz. Barvení se provádí na zmrazených řezech způsobem, popsaných v F. L. Carson, Histotechnology“ A Self-Instructional Text; ASCP Press, Chicago (1 990), USA. Použitý postup lze v krátkosti popsat takto: 7pm zmrazené řezy se usuší na vzduchu a fixují v zinkovém formalinu po dobu 10 minut, potom se preparáty ponoří do roztoku Oil Red o (Sigma Chemical Co., St. Louis, WO, USA) o koncentraci 3 g/litr, dále se máčí po dobu 30 minut v 60 % izopropylalkoholu o teplotě místnosti, odbarví se v 60 % izopropylalkoholu a dobarví se Leamerovým hematoxylinem. Zjišťuje se velikost mazových žláz a počet buněk na žlázu.
Výsledky a diskuze
Urychlená reepitelizace a zvýšená tloušťka epitelu jsou pozorovány u poranění, ošetřených KGF, v množství 4 až 40 pg/cm2. Tato poranění vykazují 5. Den dodatečné léčby podstatně zvýšenou reepitelizaci ve srovnání s kontrolními poraněními (76,7 % versus 52,5 %, 1 μξ KGF). Vrstva nového epitelu se zvětšuje způsobem, závislým na dávce, 5. a 7. Den dodatečné léčby činí téměř dvojnásobek plochy epitelu v kontrolním poranění (při dávce 10 pg KGF na ránu, viz obr. 3). Histologická analýza ukazuje, že k regeneraci epitelu dochází převážně pučením z adnexálních elementů v dermis, tj. mazových žláz, potních žláz a vlasových folikulů.
Analýza proliferace bazálních keratinocytů a migrace bazálních buněk ukazuje, že po prvním dnu léčby KGF dochází ke zvýšení počtu proliferačních bazálních keratinocytů na okrajích poranění
-7CZ 285996 B6 (viz obr. 4). Druhý den léčby KGF se zvýší počet proliferačních keratinocytů v suprabazální vrstvě epidermis, což ukazuje urychlení tranzitu proliferačních buněk k stratům spinosum. Pátý den léčby vykazují poranění menší proliferaci v bazální vrstvě, což ukazuje na samoomezenou akceleraci opravy epitelu a diferenciaci (viz obr. 4). Zdá se, že keratinocyty při migraci vzhůru za vzniku stratům comeum podléhají normální maturaci.
Neočekávaně je také pozorována zvýšená proliferace sebocytů a jejich diferenciace, jakož i zvýšená proliferace vlasových folikulů. Jak vlasové folikuly, tak mazové žlázy se zdají být větší a četnější v poraněních, léčených KGF, ve srovnání s kontrolními (viz obr. 5 a 6). Histologické řezy, které byly obarveny Oil Red o za účelem selektivní identifikace mazových žláz, vykazují podstatně větší počet těchto žláz a také tyto žlázy jsou výrazně větší, což ukazuje, že dochází ke zvýšené proliferace a diferenciaci sebocytů na buňky, produkující maz. U poranění, léčených KGF, je také pozorováno zvýšení počtu (v závislosti na dávce) proliferačních buněk na vlasový váček.
Nedávno byl na modelu s králičím uchem studován epidermální růstový faktor (EGF) a bázický fibroblastový růstový faktor (GFG) (J. Clin. Invest., výše uvedená citace a Pierce et al., Amer. J. Pathol. 140: 1 375 - 1 388 (1 992)). Přesto že je známo, že oba tyto růstové faktory stimulují reepitelizaci, ani KGF, ani bazický FGF neovlivňuje proliferaci nebo diferenciaci adnexálních struktur, jako jsou mazové žlázy a vlasové folikuly. Schopnost KGF stimulovat proliferaci a následnou diferenciaci několika epitelových typů buněk v kůži spolu s její původní izolací od fibroblastů ukazuje, že KGF je silným parakrinním stimulátorem regeneračních pochodů v kůži.
Příklad 2
KGF-stimulovaná proliferace a diferenciace pneumocytů typu II in vivo
Tento příklad se provádí za účelem vyhodnocení účinku podávání KGF na epitelové buňky respiračního traktu zdravých krys.
Materiály a metody
Samcům Lewisovy krysy o hmotnosti 200 až 250 g se podá jedna intratracheální injekce s různou dávkou KGF, zředěnou v roztoku chloridu sodného nebo fosfátem pufrovaném roztoku chloridu sodného za použití protokolu, popsaného vUlich et al., Amer. J. Pathol. 138: 1 485 až 1 496(1991). KGF se injekčně podává v dávce 0,1, 5,0 a 10,0 mg/kg. Kontrolním krysám se podává intratracheální injekce excipientu. V časových bodech 6 hodin a 1,2, 3, 4, 5 a 6 dnů po injekci KGF se krysy usmrtí, jejich plíce se nafouknou prostřednictvím intratracheálního katetru Bouinovým fixativem, sagitální řezy plic se uloží do parafínu a histologické řezy se obarví hematoxylinem a eoxilinem.
Výsledky a diskuze
KGF v dávce 0,1 mg/kg nevyvolává histologicky rozeznatelnou hyperplazii buněk alveolámího epitelu. KGF v dávce 1,0 mg/kg vyvolává mírné, ale zjistitelné zvýšení počtu buněk alveolámího epitelu. Zvýšená hyperplazie buněk alveolámího epitelu se zjistí při úpravě dávky na hodnotu 5,0 a 10,0 mg/kg. KGF nevyvolává histologicky zjistitelné zvýšení počtu alveolámích epitelových buněk v době 6 hodin a jednoho dne po intratracheální injekci. V době 2 dnů se v plicích krys, ošetřených KGF, zjistí vyvýšený mikropapilámí nárůst alveolámích septálních epitelových buněk (viz obr. 7 a 8). V době 3 dnů se zjistí difúzní nízký krychlovitý až krychlovitý nárůst alveolámích epitelových buněk, který tvoří výstelku celých alveol ve velkých segmentech plic (obr. 9 a 10). Některé oblasti plic si však zachovají normální histologii. Histologický vzhled hyperplastického alveolámího epitelu u krys třetí den je v podstatě stejný jako vzhled hyperplazie pneumocytů
-8CZ 285996 B6 reaktivního typu II v lidských plicích. Hyperplastický alveolámí epitel je zjistitelný ve snižujícím se množství v plicích KGF-ošetřených krys v den 4 a 5 po intratracheální injekci. V den 6 nelze rozlišit plíce krys, léčených KGF, od plic kontrolních krys.
Plíce krys, ošetřovaných KGF, se ultrastriktumě vyšetřují 3 dny po intratracheální injekci. Výstelka hyperplastických alveolámích epitelových buněk v alveolámích septech téměř vždy obsahuje jednu nebo více lamelámích inkluzí proměnlivé velikosti a tvaru (obr. 11 a 12). Brochiální epitel krys ošetřovaných KGF je hyperplastický v den 3, ale tato hyperplazie není ihned tak nápadná, jako hyperplazie alveolámích buněk. Hyperplazie se hodnotí jako pseudostratifíkace epitelové výstelky menších distálních bronchů, které obsahují normálně jednu vrstvu epitelu jako výstelku, jako svazčitost nebo mikropapilámí nárůst bronchiálního epitelu a jako zvýšení mitotického čísla v bronchiálním epitelu (viz obr. 13A a 13B).
Intratracheálně podaný KGF vyvolává nápadnou hyperplazii alveolámích epitelových buněk. Přítomnost lamelámích cytoplazmických inkluzí v buňkách na ultrastruktumí úrovni je konzistentní s předpokladem, že hyperplastickými buňkami jsou pneumocyty typu II. Lamelámí inkluze se nezdají být tak četné nebo tak osmifílní. Jako inkluze ilustrované v některých případech experimentální hyperplazie pneumocytů typu II u krys a jsou velmi podobné lamelámím inkluzím, ilustrovaným v normálních krysích plicích. KGF vyvolává nejen hyperplazii alveolámích buněk, nýbrž i hyperplazii buněk bronchiálního epitelu. Je možné, že hyperplastický alveolámí epitel představuje podrost bronchiálního epitelu z terminálních bronciol do alveolámího parenchymu. Zdá se však pravděpodobnější, že KGF působí přímo na pneumocyty typu II, s ohledem na multifokální mikropapilámí pučení pneumocytů na alveolámích septech 2 dny po injekci KGF, což je typ nárůstu, který předchází konfluentní výstelce alveol krychlovitými buňkami v 3 den. Kromě toho se předpokládá, že pneumocyty typu II tvoří mitoticky responzivní populaci alveolámích epitelových buněk a je možno očekávat, že pravě buňky alveolámího typu budou responzivní vůči potenciálnímu endogennímu mediátoru růstu alveolámích buněk, jako je KGF. Konečně identifikace lamelámích inkluzí v hyperplastických buňkách potvrzuje nejen jejich diferenciaci na pneumocytů typu II.
Stimulační účinek KGF na pneumocyty typu II je v souladu s pozorováním, že množství KGF receptorové mediátorové RNA v plicích na ekvivalentní vzorek celkové RNA je dvakrát až třikrát vyšší než hladina, zjištěná v různých jiných orgánech mladé dospělé krysy. Při tomto pokusu se hladina KGF receptorové madiátorové RNA stavuje za použití modifikované zkoušky Ambion RNAse Protection Assay (RPA II, č. 1410).
Próba antimediátorové RNA, které se používá při této zkoušce, má následující sekvenci (SEQ. ID NO.: 3)
5’ GAAUACGAAUUCCUUGCUGUUUGGGCAGGACAGUGAGCCAGGCAGACUGGUUGGCCUGCCCUAUAUAAUUGGAGACCUUACAUAUAUAUUCCCCAGCAUCCAUCUCCGUCACAUUGAACAGAGCCAGCACUUCUGCAUUGGAGCUAUUUAUCCCCGAGUGGAUC 3’
Antimediátorová próba se vyrobí za použití soupravy Promega Riboprobe Gemini II kit (č. P2020) z linearizované teplátové DNA kódující odpovídající sekvenci DNA, popsanou výše. RNA próba se purifikuje na močovinopolyakrylamidovém gelu vyříznutím pásu o správné velikosti a elucí RNA próby pomocí roztoku Ambion Solutin F.
Mediátorová RNA (standard) kódující komplementární sekvenci RNA vzhledem k antimediátorové próbě má následující sekvenci (SEQ. ID NO.: 4)
-9CZ 285996 B6
5’ GGGAGACAAGCUUGCAUGCCUGCAGGUCGACUCUAGAGGAUCCACUCGGGGAUAAAUAGCUCCAAUGCAGAAGUGCUGGCUCUGUUCAAUGUGACGGAGAUGGAUGCUGGGGAAUAUAUAUGUAAGGUCUCCAAUUAUAUAGGGCAGGCCAACCAGUCUGCCUGGCUCACUGUCCUGCCCAAACAGCAAGG 3’
Mediátorový standard se připraví „chladný“ (bez radioaktivního značení) za použití soupravy Promega Riboprobe Gemini II kit (č. P2020) a purifikuje se na sloupci G50 Sephadex Quick Spin Column.
Podle standardního protokolu Ambion (RPA II č. 1 410) se 50 pg úplné RNA inkubuje s 105 cpm/próba, nejprve 4 minuty při 95 °C a potom 12 až 18 hodin při teplotě 45 °C. Rnáza (1: 500 Ambion roztok R) se inkubuje s hybridizačním roztokem 40 minut při 37 °C a potom se k ní přidá inaktivační/precipitační činidlo (roztok Dx).
RNáza-chráněné fragmenty se oddělí podle velikosti elektroforézou na močovinopolyakrylamidovém gelu a celý gel se exponuje na fosforimageru. Pásy se kvantifikují pomocí zařízení Molecular Dynamics Phosphorimager. Výstelky jsou uvedeny na obr. 14.
Identifikace KGF jako růstového faktoru pneumocytů typu II zvyšuje možnost, že KGF bude vykazovat podobný terapeutický potenciál, jako mají glukokortikoidy, jakožto stimulátory maturace fetálních plic. KGF by také mohl být klinicky užitečný při stimulaci bronchoalveolámí opravy po poranění plic u dospělých. Proliferační účinek KGF na pneumocytu typu II naznačuje, že KGF by mohl hrát důležitou úlohu při regulaci syntézy a sekreci surfaktantu.
Příklad 3
KGF-stimulovaná proliferace a diferenciace hepatocytů.
V tomto příkladu se vyhodnocují účinky systematicky podané KGF na epitelové tkáně jater dospělých krys.
Materiály a metody
Samci krysy, použití jako zkušební zvířata, dostávají vodu a potravu ad libidum. Všechna zvířata dostávají po dobu 1, 4 nebo 7 dnů jednou denně intraperitoneální injekci KGF nebo PBS. Při všech experimentech se používá alespoň pěti zvířat v každé skupině.
Krysy se usmrtí zadušením oxidem uhličitým a odebere se jim krev pro sérovou chemii srdeční punkcí okamžitě po usmrcení. Sérum se určuje ve zmrazeném stavu až do použití při zkoušce. U séra se provádí standardní chemická analýza na elektrolyty. Játra se zváží a jejich hmotnost se vyjádří v g/100 g tělesné hmotnosti, tj. jako procentický podíl tělesné hmotnosti. Vzorky tkáně se umístí do 10 % pufrovaného formalinu pro rutinní histologické zpracování.
Řezy z jater se obarví hematoxylinem a eosinem H a E). Jednu hodinu před usmrcením se krysám podá intraperitoneální injekcí 50 mg/kg BrdU. Provede se anti-BrdU imunohistochemie za účelem vizualízace inkorporace BrdU do DNA replikačních buněk.
Za použití kalibrované okulárové mřížky se stanoví index značení (Labeling Index - LI) jater. Spočítá se 10 políček na jedno zvíře a vypočítá průměr. Dále se vypočítá celkový počet jater a značených jater na jednotku plochy. Pro standardizaci políček, o nichž se předpokládá, že
-10CZ 285996 B6 představují podobné plochy jatemího parenchymu, se pro počítání používá políček sousedících s portálovou triádou.
Všechna data se analyzují za použití nezdvojeného Studentova t-testu se dvěma větvemi nebo jednosměrného testu ANOVA pro porovnání více skupin.
Výsledky a diskuze
Provede se studie závislosti odpovědi na dávce pro identifikaci účinné dávky KGF. KGF se podává injekčně každý den po dobu 4 dnů a vyjmou se orgány. Hmotnost jater vyjádřená v jednotkách % tělesné hmotnosti se podstatně odlišuje od hmotnosti kontrolních jatek pouze při nejvyšší dávce 5 mg/kg za den při porovnání testem ANOVA (viz obr. 15). Zajímavé je, že ve srovnání s kontrolními játry obsahují játra zvířat, kterým bylo podáváno KGF, sérové proteiny, cholesterol a triglyceridy, což jsou sloučeniny syntetizované v játrech, v podstatně větším množství, a to jak při dávce KGF 1 mg/kg, tak při dávce KGF 5 mg/kg (viz obr. 16).
Zvířata se analyzují po jednodenním, čtyřdenním nebo sedmidenním každodenním podávání KGF v dávce 5 mg/kg. Při zevrubné pitvě se zjistí, že játra jsou v době sedmého dne podstatně zvětšena. Hmotnost jater je podstatně vyšší ve všech studovaných časových bodech u krys ošetřených KGF (den 7., KGF 4,08 ± 0,08 % versus kontrolní 3,49 ± 0,06 %, p = 0,0003).
Kvantifikace BrdU pozitivních jader vykazuje troj- až čtyřnásobné zvýšení u krys ošetřených KGF ve srovnání s kontrolou při jednodenním ošetření (viz obr. 7). Mitotický index (číslo), vyjádřený jako počet mitóz na políčko ve srovnání s kontrolou, což je konzistentní s počtem BrdU.
Tyto výsledky ukazují silné mitogenní a diferenciační účinky KGF na játra. Rychlé zvýšení hmotnosti jater po jednodenním ošetření KGF spolu se zvýšeným mitotickým indexem a BrdUpozitivní frakcí ukazují, že KGF má rychlé a silné účinky na tuto převážně epitelovou tkáň. Přestože mitotické účinky KGF rychle mizí, hmotnost jater, vyjádřená jako procentický podíl tělesné hmotnosti, při studiích dále stoupá. Zvýšená hmotnost je převážně způsobena zvýšením počtu buněk, které byly histologicky pozorovatelné již při jednodenním ošetření a zůstaly zachovány i při čtyřdenní a sedmidenní ošetření. Jelikož se při regeneraci jater může hmotnost jater zvýšit více než dvojnásobně za méně než 2 týdny, není zjištění významných rozdílů, počínaje pro jednodenní ošetření, překvapující.
Zvýšená hladina albuminu není spojena s žádnou jinou známou chorobou, než je dehydratace. KGF pravděpodobně indukuje zvýšenou hladinu albuminu (a jiných proteinů) v séru díky zvýšenému počtu přítomných hepatocytů. Zvýšení syntézy proteinu, indukované KGF, by představovalo obrovský užitek pro pacienty s konečným stádiem jatemí choroby nebo cirhózy jater, který by jim mohl zachránit život.
Příklad 4
KGF-stimulovaná proliferace a regenerace jatemích buněk po částečné hepatektomii in vivo.
Při tomto pokusu se jako zkušebních subjektů používá samců krysy Spraque-Dawley o hmotnosti 300 až 340 g.
-11CZ 285996 B6
Materiály a metody
U všech krys se provede částečná hepatektomie (2/3) způsobem, popsaným v Higgins a Anderson, Archives of Pathology, sv. 12 str. 186 (1931). Počínaje 8 hodinami po chirurgickém zákroku a potom jednou denně se krysám subkutánně vstříkne buď PBS (kontrolní skupina) nebo KGF v dávce 1 mg/kg. Kontrolní i KGF-ošetřené krysy se zváží a usmrtí 4, 7, 10 nebo 14 dnů po chirurgickém zákroku. Zvířatům se odstraní zbytky jater, a ty se zváží.
Výsledky a diskuze
Zjistilo se, že ošetření částečně hepatektomizovaných krys KGF se projeví podstatným urychlením regenerace jatemí hmoty, a to jak absolutně, tak relativně (viz obr. 18 a 19). U skupiny léčené KGF se jatemí hmota vrátí na hodnotu před chirurgickým zákrokem do 7 dnů. Naproti tomu u kontrolní skupiny (která nebyla ošetřena KGF) se nedostane absolutní ani relativní regenerace jatemí hmoty ani po 14 dnech.
Příklad 5
Léčebné účinky KGF na chemicky indukovanou jatemí toxicitu.
Pro vyhodnocení terapeutického účinku KGF na játra po zavedení chemického toxinu se používá samců krysy Spraque-Dawley o hmotnosti 300 až 240 g.
Podávání
Skupinám po 12 samcích Spraque-Dawley se v den 0 podá tetrachlormethan v dávce 1 ml/kg nebo 2 ml/kg v kukuřičném oleji jako vehikulu. Každá skupina s jedním dávkováním se rozdělí do dvou podskupin po 6 krysách. Počínaje 3 hodinami po podání tetrachlormethanu a potom každý den se každé podskupině subkutánní injekcí podívá buď PBS nebo KGF v dávce 1 mg/kg/den. Po 22, 72 a 144 hodinách po podání tetrachlormethanu se každé kryse odebere krevní vzorek a stanoví se hladina glutamát-oxaloacetát tranaminázy (SGOT) v séru.
Výsledky a diskuze
Jak je zřejmé z obr. 20, subkutánní injekce KGF po orálním podání tetrachlormethanu podstatně snižuje hladinu enzymu SGOT, který je známým indikátorem poškození jater, v krevním séru. Tento účinek je obzvláště zřejmý při podání tetrachlormethanu v dávce 2 ml/kg první den po podání.
Příklad 6
KGF-stimulované proliferace a diferenciace epitelových buněk střevní sliznice.
Tento příklad ukazuje biologické účinky KGF na epitelové buňky střevní sliznice zdravých krys.
Materiály a metody
Samci krysy, použití jako zkušební zvířata, dostávají vodu a potravu od libutum. Všechna zvířata dostávají po dobu 1, 4 nebo 7 dnů jednu denně intraperitoneální injekci KGF nebo PBS. Při všech experimentech se používá alespoň pěti zvířat v každé skupině.
-12CZ 285996 B6
Krysy se usmrtí zadušením oxidem uhličitým. Hlavní orgány se zváží a jejich hmotnost se vyjádří v g/100 g tělesné hmotnosti (procenta tělesné hmotnosti). Vnitřnosti se rozdělí na neglandulámí homí část trávicí trubice, žaludeční žlázy, tenké střevo a tlusté střevo. Vzorky tkání se umístí do 10% pufrovaného formalinu pro rutinní histologické zpracování.
Řezy ze všech odebraných orgánů se obarví hematoxylinem a eosinem (H a E). Jednu hodinu před usmrcením se krysám podá intraperitoneální injekce 50 mg/kg BrdU. Standardními metodami se provede anti-BrdU imunhistochemie za účelem vizualizace inkorporace BrdU do DNA replikačních buněk. Zvolené tkáně se obarví kyselinou jodistou-schiff (PAS), alcionovou modří při pH 2,5 a Masson-Trichrome.
Pro měření výšky žaludeční sliznice a hloubky vybarvení PAS s žaludeční sliznicí se použije kalibrovaného okuláru. Podobně se změří délka klků a hloubka střevních krypt ve dvanáctníku a hloubka tračníkových krypt. Pro kvantifikaci změn produkce pohárkovitých buněk se zjistí počet PAS-pozitivních pohárkovitých buněk na délce 100 pm, počínaje u základny dvanáctníkového klku. Ve všech oblastech vnitřností se měření provádějí pouze na žlázách nebo klcích, které jsou kolmé k podkladové svalovině. Výsledky jsou uvedeny v pm, nebo v případě malých intestinálních pohárkovitých buněk je uveden průměrný počet na jednotku plochy. Kromě toho se stanoví počet tračníkových krypt a počet hyperplastických (dvojitě nebo trojitě rozvětvených) krypt, zaujímajících definovanou délku tračníku. U každého zvířete se provede 5 až 10 opakovaných měření a vypočítá se z nich průměr.
Všechna data se analyzují za použití nezdvojeného Studentova t-testu se dvěma větvemi nebo jednosměrného testu ANOVA pro porovnání více skupin (Statview II, Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA).
Výsledky a diskuze
Nejprve se provede studie závislosti odpovědi na dávce pro identifikaci účinné dávky KGF. KGF se podává injekčně každý den po dobu 4 dnů a vyjmou se orgány. Významná odpověď na dávku je pozorována u žaludečních žláz, tenkého střeva a tračníku (obr. 15).
Zvířata se analyzují po jednodenním, čtyřdenním nebo sedmidenním každodenním podávání KGF v dávce 5 mg/kg. Při zevrubné pitvě se zjistí, že po čtyřdenním a sedmidenním ošetření je homí část trávicí trubice značně ztluštěna záhyby sliznice. Homí část trávicího traktu, žaludeční žlázy, dvanáctník a tračník vykazuje podstatné zvýšení hmotnosti po čtyřdenním a sedmidenním podávání, ale nikoliv po jednodenním podávání. Hmotnost žaludečních žláz po sedmidenním ošetření je 0,65 ±0,01 g v případě zvířat ošetřených KGF a 0,48 ± 0,02 g v případě kontrolních zvířat (p = 0,001).
Neglandulámí homí část trávicí trubice vykazuje podstatně zvýšenou hmotnost po čtyřdenním a sedmidenním ošetření. Na základě histologického vyšetření se zjistí, že šupinatý epitel neglandulámí homí část trávicí trubice je mírně (po čtyřdenním ošetření) až výrazně (po sedmidenním ošetření) hyperplastický u zvířat, ošetřených KGF. Proliferační epitel se náhle mění u cardia z normálního šupinatého epitelu jícnu na proliferační epitel homí části trávicí trubice. Po jednodenním ošetření je glandulámí gastrická mukóza z histologického hlediska normální. Po čtyřdenním a sedmidenním ošetření se při histologickém vyšetření zjistí zvýšený počet pohárkovitých buněk, jakožto buňky s otevřenou cytoplazmou. Zvířata, ošetřovaná KGF po dobu 4 a 7 dnů, vykazují mírné zvýšení tloušťky sliznice (obr. 21). Po sedmidenním ošetření je slizotvomá adnexální vrstva mukozálních buněk rozšířena a přemístěna k serosálnímu povrchu. Vybarvení PAS po čtyřdenním a sedmidenním ošetření vykazuje nápadný nárůst počtu a velikosti PAS pozitivních (mucin produkujících pohárkovitých buněk). Pomocí řezů barvených BrdU je tato vrstva dále identifikována jako vrstva dělících se buněk v žaludečních žlázách, vykazující
-13ČŽ 285996 B6 nárůst proliferačních buněk během ošetření. Tloušťka PAS pozitivní vrstvy luminálního povrchu gastrické mukózy je také významně zvýšena po čtyřdenním a sedmidenním ošetření KGF (obr. 21).
Tenké střevo je ve všech časových bodech studie zhruba normální. Barvení PAS ukazuje zvýšený počet pohárkovitých buněk, produkujících mucus. Tento rozdíl je významný po čtyřdenním a sedmidenním ošetření (obr. 22). Výška klků se neliší v žádném okamžiku, ale hloubka krypt je podstatně větší po jednodenním a sedmidenním ošetření (obr. 22).
Po sedmidenním ošetření tvoří sliznice tračníku zvrásněné záhyby, které významně zvyšují celkovou povrchovou plochu. Indikátory hyperplazie, dvojnásobně a trojnásobně rozvětvené tračníkové krypty, jsou pozorovány ve všech skupinách, včetně kontrolních skupin, ale nejčetnější a nej nápadnější jsou u krátkodobě ošetřovaných skupin, tj. u skupin, ošetřovaných jeden a čtyři dny, přičemž počet hyperplastických kryp klesá s délkou ošetření (obr. 23). Tomu odpovídá hloubka krypt v tračníku, která se zvětšuje s délkou ošetření (obr. 24).
Barvení PAS a alcianovou modří ukazuje zvýšení pohárkovitých buněk, produkujících mucus v tračníku po ošetření KGF. Kromě toho počet pohárkovitých buněk, pozitivních na alcianovou modř na luminálním povrchu, je vyšší po sedmidenním ošetření u všech zkoušených zvířat. Zvířata, která byla ošetřována již jen 4 dny, vykazují významné zvýšení PAS pozitivních buněk v homí polovině a jedné třetině krypt tračníku.
Tyto výsledky ukazují, že KGF má silné mitogenní a diferenciační účinky na epitelové tkáně gastrointestinálního traktu. Ze značení BrdU je zřejmé, že KGF iniciuje proliferaci buněk ve slizotvomé adnexální vrstvě žaludeční sliznice. Tyto buňky tvoří progenitorové buňky žaludečních žláz. Po rozdělení migrují buňky z této vrstvy vzhůru směrem k průsvitu vnitřností a vytvářejí povrchové buňky, nebo dolů k serosálnímu povrchu, kde se stávají buňkami, které vytvářejí žaludeční žlázy (Toner et al., 1989, Gastrointestinal and Esophageal Pathology, Churchill Livingstone, New York, NY, USA, str. 1328). KGF kromě toho podporuje selektivní diferenciaci slizotvomých adnexálních buněk na buňky, které se pohybují směrem vzhůru a stávají se pohárkovitými buňkami. Celková tloušťka žaludeční sliznice je po čtyřdenním a sedmidenním ošetření zvýšena. Podobné účinky jsou pozorovány v tenkém a tlustém střevě. KGF podporuje zvýšené dělení buněk, které má za následek vznik protáhlých krypt, prostřednictvím stimulace prodenitorových buněk. KGF také indukuje diferenciaci dělících se buněk krypt, což je zřejmé ze zvýšené produkce slizu a vyššího počtu pohárkovitých buněk v klcích nebo kryptách.
Vynález byl popsán na specifických provedeních a příkladech, která však pro něj nepředstavují žádné omezení. Pro popsaná použití je například možno použít jakékoliv formy KGF, která má v podstatě shodné biologické vlastnosti jako přírodní KGF. Takové formy zahrnují samotný purifikovaný přírodní KGF, KGF syntetizovaný chemickými postupy a KGF získaný rekombinací za použití jiných expresních systémů než těch, které jsou uvedeny výše, jakož i jejich analogy, varianty, chiméry atd., založené na přírodní aminokyselinové sekvenci. Všech těchto forem je možno použít při provádění tohoto vynálezu.
Odborníkům v tomto oboru je také zřejmé, že pro expresi sekvence kódující protein KGF je možno použít různých systémů hostitel-vektor. Tyto systémy zahrnují systémy na bázi savčích buněk, infikovaných virem (například vacciniavirem, adenovirem atd.); systém na bázi hmyzích buněk, infikovaných virem (například baculovirem); mikroorganismy, jako jsou kvasinky, obsahující kvasinkové vektory, nebo jiné bakterie kromě E. coli, které jsou transformovány bakteriofágovou DNA, plazmidovou DNA nebo kozmidovou DNA. Na výše uvedený výčet systémů se vynález také neomezuje. Expresní elementy těchto vektorů se mohou lišit ve své síle a specifičnosti. V závislosti na použitém systému hostitel-vektor se může použít kteréhokoliv z řady vhodných transkripčních a translačních elementů.
-14CZ 285996 B6
Poté, co byl proteinový produkt KGF z exprese cDNA izolován, purifikován a poté, co byla u něho stanovena aktivita KGF za použití metod, opsaných v tomto textu, nebo za použití jiných postupů, známých odborníkům v tomto oboru, je možno ho zpracovat na různé farmaceutické prostředky. Tyto farmaceutické prostředky typicky obsahují vhodný, obvykle chemicky definovaný nosič nebo excipient pro toto terapeutické činidlo, tj. KGF a také jiné přísady, v závislosti na zamýšleném způsobu podávání. Prostředky mohou obsahovat vodné nosiče, nebo se může jednat o prostředky v tuhé fázi, v nichž je KGF zaveden do nevodných nosičů, jako jsou kolageny, kyselina hyaluronová a různé polymery. Takové prostředky je možno účelně zpracovávat na formy vhodné pro různé způsoby podávání, jako je injekční, orální, topické, intranasální a pulmonámí podávání.
Odborníkům v tomto oboru je také zřejmé, že množství dávkovaného KGF se bude měnit v závislosti na léčené chorobě a způsobu podávání. Jako orientační vodítko pro účinnou dávku je možno uvést například dávku v rozmezí od 0,01 do 500 mg/kg tělesné hmotnosti. Takovou dávku lze podávat jednorázově nebo opakovaně v závislosti na chorobě a stavu pacienta. Výše uvedené prostředkyje možno podávat v kombinaci s jinými druhy léčby, jako například spolu s podáváním jiných cytokinů a růstových faktorů nebo jiných farmaceutických prostředků, vhodných pro léčbu chorob kůže, plic, jater a gastrointestinálního traktu.
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Amgen lne.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Therapeutic Uses of Keratinocyte Grown Factor (Terapeutická použití růstového faktoru keratinocytů) (iii) POČET SEKVENCÍ: 4 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
| (A) ADRESÁT: | Amgen lne., |
| (B) ULICE: | Amgen Cente, 1840 DeHavilland Drive |
| (C) MĚSTO: | Thousand Oaks |
| (D) STÁT: (E) ZEMĚ: | Kalifornie USA |
| (F) PSČ: | 91320-1789 (ZIP) |
(v) STOJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Disketa, 3,5 inch, DS, 2,0 Mb (B) POČÍTAČ: IBM kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: MS-DOS (D) SOFTWARE: Microsoft Word Version 5.1a (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ: 26. 3. 1993 (C) ZATŘÍDĚNÍ:
-15CZ 285996 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 55 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC (3) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 49 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTAA GAATCAAAT 49 (4) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 164 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
GAAUACGAAUU UCCUUGCUGU UUGGGCAGGA CAGUGAGCCA GGCAGACUGG UUGGCCUGCC CUAUAUAAUU GGAGACCUUA CAUAUAUAUU CCCCAGCAUC CAUCUCCGUC ACAUUGAACA GAGCCAGCAC UUCUGCAUUG GAGCUAUUUA UCCCCGAGUG GAUČ 164 (5) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 191 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
-16CZ 285996 B6
GGGAGACAAG GAUAAAUAGC UGGAUGCUGG
CUUGCAUGCC UGCAGGUCGA CUCUAGAGGA UCCACUCGGG UCCAAUGCAG AAGUGCUGGC UCUGUUCAAU GUGACGGAGA GGAAUAUAUA UGUAAGGUCU CCAAUUAUAU AGGGCAGGCC
AACCAGUCUG CCUGGCUCAC UGUCCUGCCC AAACAGCAAGG
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití růstového faktoru keratinocytů pro výrobu léčiva pro léčení nebo prevenci choroby nebo stavu, vyžadujícího stimulaci nefibroblastových epitelových buněk pacienta.
- 2. Použití podle nároku 1, kde choroba nebo stav, vyžadující stimulaci nefibroblastových epitelových buněk, je zvolen ze souboru, zahrnujícíhoA) alopecii indukovanou chemoterapií;B) žaludeční vřed;C) dvanáctníkový vřed;D) erozi žaludku a jícnu, zejména erozivní gastritis, oesophagitis nebo oesophageální reflux;E) zánětlivé choroby střev;F) toxicitu pro vnitřnosti, vyvolanou ozářením nebo chemoterapií;G) chorobu hyalinní membrány;H) nekrózu respiračního epitelu, vyvolanou vdechováním kouře;I) emphysema;J) plicní zánět a fibrózu;K) cirhózu jater;L) fulminantní selhání jater;M) akutní virovou hepatitis; aN) toxické napadení jater.
- 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde růstovým faktorem keratinocytů je přírodní, chemicky syntetizovaný nebo rekombinantně produkovaný růstový faktor keratinocytů.
- 4. Použití podle některého z nároků 1 až 3, kde růstovým faktorem keratinocytů je rekombinantně produkovaný růstový faktor keratinocytů, obsahující aminokyselinovou sekvenci přírodního lidského růstového faktoru keratinocytů.
- 5. Použití podle některého z nároků 1 až 4, kde růstový faktor keratinocytů obsahuje aminokyselinovou sekvenci, znázorněnou na obr.l, nebo její analog, variantu nebo chiméru.
- 6. Použití podle některého z nároků 3 až 5, kde rekombinantní růstový faktor keratinocytů je produktem bakteriálních buněk, přednostně E. coli.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4074293A | 1993-03-26 | 1993-03-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ248295A3 CZ248295A3 (en) | 1996-12-11 |
| CZ285996B6 true CZ285996B6 (cs) | 1999-12-15 |
Family
ID=21912689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ952482A CZ285996B6 (cs) | 1993-03-26 | 1994-03-24 | Způsob in vitro stimulace produkce nekeratinocytových epithelových buněk a růstový faktor keratinocytů pro léčbu chorob |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0619370B1 (cs) |
| JP (1) | JP3578761B2 (cs) |
| KR (1) | KR100390340B1 (cs) |
| CN (1) | CN1064710C (cs) |
| AT (1) | ATE183233T1 (cs) |
| AU (1) | AU707340B2 (cs) |
| CA (1) | CA2159109C (cs) |
| CZ (1) | CZ285996B6 (cs) |
| DE (1) | DE69419958T2 (cs) |
| DK (1) | DK0619370T3 (cs) |
| ES (1) | ES2136673T3 (cs) |
| FI (1) | FI954541A (cs) |
| GR (1) | GR3031509T3 (cs) |
| HU (1) | HU220641B1 (cs) |
| IL (4) | IL137581A (cs) |
| NO (1) | NO953781L (cs) |
| NZ (1) | NZ263967A (cs) |
| RU (1) | RU2146148C1 (cs) |
| SG (1) | SG49841A1 (cs) |
| SI (1) | SI0619370T1 (cs) |
| SK (1) | SK281674B6 (cs) |
| UA (1) | UA46706C2 (cs) |
| WO (1) | WO1994023032A1 (cs) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPN271295A0 (en) * | 1995-05-02 | 1995-05-25 | Gropep Pty Ltd | Method of treatment |
| CA2202075C (en) * | 1994-10-13 | 2003-12-09 | Charles F. Morris | Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using |
| US6077692A (en) * | 1995-02-14 | 2000-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| US7232667B2 (en) | 1995-02-14 | 2007-06-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides |
| US6693077B1 (en) | 1995-02-14 | 2004-02-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| EP1323824A3 (en) * | 1995-02-14 | 2004-01-21 | Human Genome Sciences, Inc. | Use of human keratinocyte growth factor-2 for the preparation of pharmaceutical compositions |
| ES2293137T3 (es) * | 1995-10-11 | 2008-03-16 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Combinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para curacion de heridas. |
| GB9619660D0 (en) * | 1996-09-20 | 1996-11-06 | Scient Hospital Suppl Int Ltd | Prevention of gastrointestinal damage |
| ATE259651T1 (de) * | 1996-10-15 | 2004-03-15 | Amgen Inc | Verwendung von keratinocyten-wachstumsfaktor-2 |
| US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
| EP1452205B1 (en) * | 1996-10-15 | 2007-11-28 | Amgen Inc. | Uses of keratinocyte growth factor-2 |
| US20010006939A1 (en) * | 1997-10-03 | 2001-07-05 | Ralph W. Niven | Secretory leukocyte protease inhibitor dry powder pharmaceutical compositions |
| US6228839B1 (en) * | 1997-12-19 | 2001-05-08 | Emory University | Use of keratinocyte growth factor to improve oxidative status |
| US6869927B1 (en) | 1997-12-22 | 2005-03-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
| CA2316015A1 (en) | 1997-12-22 | 1999-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
| CA2320515A1 (en) | 1998-02-13 | 1999-08-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Therapeutic uses of keratinocyte growth factor-2 |
| US6335317B1 (en) | 1998-04-10 | 2002-01-01 | Emory University | Use of gut-trophic growth factors to improve oxidative status |
| ATE297751T1 (de) | 2000-03-20 | 2005-07-15 | Pfizer Prod Inc | Kombinationstherapie mit keratinozyten- wachstumfaktor und ein epidermis-wachstumfaktor inhibitor |
| CN1491231A (zh) * | 2001-02-06 | 2004-04-21 | Ĭ��ר������˾ | 免疫原性减弱的经修饰角质形成细胞生长因子(kgf) |
| US7202066B2 (en) | 2002-01-29 | 2007-04-10 | Carrington Laboratories, Inc. | Combination of a growth factor and a protease enzyme |
| JP2008512435A (ja) * | 2004-09-13 | 2008-04-24 | ユニバーシティ、オブ、サウサンプトン | 喘息の成長因子治療 |
| CN101822821B (zh) * | 2010-04-27 | 2013-01-23 | 复旦大学附属中山医院 | 角质细胞生长因子-2在制备防治肺损伤的药物中的应用 |
| CN104707164B (zh) * | 2015-03-31 | 2017-01-18 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种复合壳聚糖水凝胶敷料及其制备方法和应用 |
| CN106226511B (zh) * | 2016-07-28 | 2018-04-06 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 一种重组人角质细胞生长因子生物学活性检测方法 |
| CN107753932A (zh) * | 2016-08-22 | 2018-03-06 | 中国辐射防护研究院 | Kgf在制备治疗或预防放射性肠炎药物中的用途 |
| JP7135106B2 (ja) | 2018-11-27 | 2022-09-12 | 株式会社海月研究所 | 頭皮頭髪用組成物 |
| KR20210114646A (ko) * | 2020-03-11 | 2021-09-24 | (주)메디코스바이오텍 | 성장인자를 함유하는 탈모 치료 또는 모발 성장 촉진용 조성물 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0555205B1 (en) * | 1989-01-31 | 2000-11-29 | RUBIN, Jeffrey S | Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells |
| JPH04224522A (ja) * | 1990-04-27 | 1992-08-13 | Merck & Co Inc | 繊維芽細胞増殖因子含有組成物による禿頭症の治療又は予防方法 |
| AU1462392A (en) * | 1991-02-22 | 1992-09-15 | Amgen, Inc. | Use of gm-csf and g-csf to promote accelerated wound healing |
-
1994
- 1994-03-24 CN CN94192037A patent/CN1064710C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-24 SK SK1185-95A patent/SK281674B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 JP JP52218894A patent/JP3578761B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-24 WO PCT/US1994/003208 patent/WO1994023032A1/en active IP Right Grant
- 1994-03-24 NZ NZ263967A patent/NZ263967A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 KR KR1019950704154A patent/KR100390340B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 IL IL137581A patent/IL137581A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 RU RU95117959A patent/RU2146148C1/ru active
- 1994-03-24 IL IL10912294A patent/IL109122A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-24 HU HU9502800A patent/HU220641B1/hu unknown
- 1994-03-24 CA CA002159109A patent/CA2159109C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-24 AU AU65243/94A patent/AU707340B2/en not_active Expired
- 1994-03-24 UA UA95104698A patent/UA46706C2/uk unknown
- 1994-03-24 CZ CZ952482A patent/CZ285996B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-03-25 SI SI9430265T patent/SI0619370T1/xx unknown
- 1994-03-25 SG SG1996007376A patent/SG49841A1/en unknown
- 1994-03-25 AT AT94104804T patent/ATE183233T1/de active
- 1994-03-25 EP EP94104804A patent/EP0619370B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-25 DE DE69419958T patent/DE69419958T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-25 DK DK94104804T patent/DK0619370T3/da active
- 1994-03-25 ES ES94104804T patent/ES2136673T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-09-25 FI FI954541A patent/FI954541A/fi unknown
- 1995-09-25 NO NO953781A patent/NO953781L/no not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-10-13 GR GR990402604T patent/GR3031509T3/el unknown
-
2000
- 2000-07-30 IL IL13758100A patent/IL137581A0/xx unknown
-
2004
- 2004-04-22 IL IL16156804A patent/IL161568A0/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5965530A (en) | Therapeutic uses of keratinocyte growth factor | |
| CZ285996B6 (cs) | Způsob in vitro stimulace produkce nekeratinocytových epithelových buněk a růstový faktor keratinocytů pro léčbu chorob | |
| US7572452B2 (en) | Method for stimulating wound healing | |
| JPH0611709B2 (ja) | 角膜基質創傷の治療のための組成物 | |
| Pereira et al. | Liposomal gene transfer of keratinocyte growth factor improves wound healing by altering growth factor and collagen expression | |
| BRPI0708791A2 (pt) | medicamentos e proteÍnas | |
| CN111050785A (zh) | 局部皮肤营养不良状况的治疗 | |
| JP2005504515A (ja) | 毛嚢に存在する新規の第２ケラチノサイト成長因子類似体 | |
| EP3747440A1 (en) | Method for destroying cellular mechanical homeostasis and promoting regeneration and repair of tissues and organs, and use thereof | |
| KR20060052692A (ko) | 고콜레스테롤혈증 또는 당뇨병과 관련된 혈관형성 결함을치료하기 위한 섬유모세포 성장 인자를 코딩하는플라스미드 | |
| CN114432332B (zh) | circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物 | |
| AU6093794A (en) | Wound healing composition | |
| AU703793B2 (en) | Recombinant adenoviruses coding for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | |
| US20230220026A1 (en) | Nucleic acid carrier for producing the single-chain vegf fusion protein with high physiological stability and dimeric efficiency, preparation method thereof, and use thereof | |
| EP1603586A1 (en) | 14-3-3 protein for prevention and treatment of fibroproliferative disorders | |
| TW202328443A (zh) | 一種生產具高生理穩定性與高效能二聚體之單鏈ｖｅｇｆ融合蛋白的核酸載體及其製備方法和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20140324 |