CZ285649B6 - Čištěná molekula DNA, čištěná bílkovina a způsob její výroby, vektor, protilátka a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Podstatu vynálezu tvoří čištěná molekula DNA, obsahující kódový řewtězec nukleových kyselin pro zralý neurotrofní faktor, odvozený od mozkové tkáně, BDNF. Tento faktor, který rovněž tvoří součást řešení je možno získat tak, že se pěstuje hostitelská buňka, obsahující kódovou molekulu nukleové kyseliny nebo vektor, který tuto molekulu obsahuje, čímž dojde k expresi kódové molekuly pro uvedený faktor, který se pak po expresi izoluje. Součást řešení tvoří rovněž farmaceutický prostředek, obsahující BDNF spolu s farmaceutickým nosičem.ŕ

Description

Oblast techniky

1. Vynález se týká rekombinantní molekuly DNA, která obsahuje kódový řetězec nukleové kyseliny pro neurotrofní faktor z mozku (BDNF), vynález se rovněž týká v podstatě čistého BDNF, jeho peptidových fragmentů nebo jeho derivátů a protilátek proti BDNF, jeho peptidovým fragmentům nebo jeho derivátům. Mimoto se vynález týká genů, náležejících do nově definované skupiny genů BDNF/NGF a produktů těchto genů. Vynález se rovněž týká farmaceutických prostředků s obsahem účinného množství produktů genu pro BDNF nebo protilátek proti produktům genu pro BDNF a metod pro diagnózu a léčbu celé řady neurologických onemocnění a poruch včetně Alzheimerovy choroby a Parkinsonovy choroby. Produkty genu pro BDNF podle vynálezu mají zvláště velký význam pro diagnózu a léčbu poruch dopaminergních neuronů, jako je Parkinsonova choroba a poruch sensorických neuronů, jakož i degenerativních onemocnění sítnice.

Dosavadní stav techniky

2.1. Odumírání neuronů a úloha neurotrofhích faktorů při vývoji nervového systému.

V mnoha částech nervového systému obratlovců je přítomno v průběhu časného stadia vývoje mnohem více neuronů než je tomu u dospělého živočicha. Období časného vývoje je charakterizováno vlnami přirozeně se vyskytujícího uhynutí neuronů (Carr a Simpson, 1978, J. Comp. Neurol. 182: 727-740, Cowan a další, 1984, Science 225: 1258-1265). Použití, diferenciace a zrání vyvíjejících se neuronů může být řízeno spíše zevními nebo „epigenetickými“ faktory než přesným vnitřním genetickým programem. Například při experimentálních manipulacích s kuřecím embryem je možno prokázat, že při transplantaci nebo extirpaci periferních „cílových oblastí“, například oka v časném stadiu vývoje kuřete může dojít ktomu, že odpovídajícím způsobem stoupne nebo poklesne počet sensorických, sympatických, parasympatických nebo motorických neuronů v blízkosti zvětšeného nebo zmenšeného cílového pole (Hamburger, 1934, J. Exp. Zool. 68: 449, Hollyday a Hamburger, 1976, J. Comp. Neurol. 170: 311-321, Landmesses a Pilař, 1975, J. Cell. Biol. 68:357-374). Cílová oblast může podporovat jen omezený počet neuronů a běžnou částí vývojového procesu je omezení přebytečného počtu neuronů tak, aby odpovídal „neurotrofní“ kapacitě cílové tkáně. Objev a izolace bílkoviny NGF (nervový růstový faktor) vedl k molekulární hypotéze, že cílová tkáň může být schopna regulovat počet neuronů, které přežijí a inervují ji (Levi-Montalcini a další, 1968, Physiol. Rev. 48:524-569, Thoenen a Barde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284—1335).

Nyní je alespoň pro periferní nervový systém zřejmé, že cílová tkáň produkuje a uvolňuje omezené množství různých neurotrofních molekul, které jsou kritické pro přežití specifických typů neuronů (Korsching a Thoenen, 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:3513-3516, Heumann a další, 1984, EMBO J. 3:3183-3189, Shelton a Reichardt, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:7051-7955, Korsching a Thoenen, 1985, Neurosci Lett. 54:201-205).

2.2. Nervový růstový faktor (NGF)

Nervový růstový faktor (NGF) je až dosud nejúplněji charakterizovanou molekulou ze svrchu uvedené skupiny a in vivo a in vitro bylo prokázáno, že jde o látku, podstatnou pro přežití sympatických a sensorických neuronů v průběhu časného období vývoje embryí kuřete i krysy (Levi-Montalcini a Angeletti, 1963, Develop. Biol. 7:653-659, Levi-Montalcini a další, 1968, Physiol. Rev. 48:524-569). Injekce čištěného NGF do vyvíjejícího se kuřecího embrya způsobily

- 1 CZ 285649 B6 masivní hyperplasii a hypertrofíi spinálních sensorických neuronů a sympatických neuronů (Levi-Montalcini a Booker, 1960, Proč. Nati. Acad. Sci USA 46:373-384, Hamburger a další, 1981, J. Neurosci. 1: 60-71). Na druhé straně bylo možno odstraněním nebo vyčerpáním NGF podáváním protilátek novorozeným krysám denními injekcemi způsobit praktickou destrukci sympatického nervového systému (Leci-Montalcini a Booker, 1960, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 46:384-391, Levi-Montalcini a Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18:619-628). Vystavení účinku protilátek ještě dříve ve vývoji buď podáváním protilátek injekčně in utero, nebo pasivním transplacentámím přenosem mateřských protilátek mělo za následek podstatnou ztrátu sensorických neuronů, odvozených od nervové rýhy, jako spinálních a dorsomediálních sensorických neuronů trigeminu (Goedert a další, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 1580— 1584, Gorin a Johnson, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:5382—5386). Až dosud byly všechny studie, týkající se NGF zaměřeny na úlohu této látky v periferním nervovém systému, avšak nyní je zřejmé, že NGF také ovlivňuje udržení a vývoj specifických populací neuronů v centrálním nervovém systému (Thoenen a další, 1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109:145-178, Whittemore a Seiger, 1987. Brain Res. Rev. 12:439-464).

Objev většího množství NGF vpodčelistní žláze dospělých myších samců (Cohen, 1960, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 46: 302-311) a dřívější objev vysokého množství NGF vjedu hadů (Cohen a Levi-Montalcini, 1956, Proč. Nati. Acad. Sci USA 42: 571-574) poskytl dostatečné množství NGF pro studie íysiologie, chemie a v poslední době i molekulární biologie NGF (tj. molekulární klonování NGF a jeho receptoru). Funkce velkého množství NGF ve stinné žláze myších samců zůstává neznámá. Zdá se však, že tento bohatý zdroj NGF patrně nehraje žádnou úlohu při vývoji nebo udržování periferního nebo centrálního nervového systému. V cílových tkáních, inervovaných neurony, citlivými na NGF (neurony, které jsou na NGF závislé pokud jde o přežití a obsahují receptory s vysokou afinitou kNGF a také zajišťují retrográdní specifický transport NGF) bylo zjištěno velmi nízké stálé množství NGF, řádu pikogramu nebo nanogramu na gram tkáně ve srovnání s tisíckrát vyšším množstvím ve slinné žláze dospělých myších samců. NGF nebyl prokázán ve větším množství v séru a zřejmě není oběhovým růstovým faktorem nebo hormonem (Suda a další, 1978, Proč. Nati. Acad. Sci USA 75: 4042-4046).

Kromě důležitého objevu hlavního zdroje NGF ve slinné žláze myši měl vývoj citlivé, jednoduché a účinné metody pro biologický výzkum NGF velkou úlohu v osvětlení biologie a biochemie této látky. Ganglia dorsálních kořenů /DRG) vyvíjejícího se kuřecího embrya byly jednou z prvních neuronálních tkání, které odpovídaly in vitro na NGF. Kultury explantátů E8E12 DRG kuřete v plasmě a později disociované kultury DRG kuřete, obohacené o neurony byly velmi vhodné pro biologické zkoušky na účinnost NGF (např. při čištění) a pro studie biologie NGF in vitro Levi-Montalcini a další, 1954, Cancer Res. 4:49-57, Levi-Montalcini a Angeletti, 1963, Develop. Biol. 58:96 a 58: 106. Skutečnost, že je možno zjediného kuřecího embrya vyjmout více než 40 DRG vedla k širokému použití biologických zkoušek pro NGF v mnoha laboratořích.

Kromě dostupnosti velkého množství NGF a systému pro průkaz této látky byla třetím hlavním faktorem, přispívajícím k porozumění biologie NGF poměrná snadnost, s níž je možno získat protilátky proti NGF u morčete, králíka, ovce apod. Zejména myš tvoří velmi snadno protilátky proti NGF. Cohen (1960, Proč. Nati. Acad. Sci USA 46: 302-311) získal protilátky proti NGF, čištěnému z myší podčelistní žlázy a prokázal společně s Levim-Montalcinim a Bookerem (1960, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 46: 384-391) že tyto protilátky působí destrukci sympatických ganglií čili „imunologickou sympathektomii“ při denním podávání novorozeným kiysám (Levi-Montalcini a Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18:619—628).

Dostatečné množství NGF umožnilo stanovení primárního řetězce poměrně běžným postupem chemie bílkovin (Angeletti a Bradshaw, 1971, Proč. Nati. Acad. Sci USA 68:2417-2420). Nyní byl gen pro NGF klonován z řady druhů včetně myši (Scott a další, 1983, Nátuře 302: 538-540), člověka (Ullrich a další, 1983, Nátuře 303:821-825), krávy a kuřete (Meier a další, 1986, EMBO

-2CZ 285649 B6

J., 5:1489-1493) a krysy (Whittemore a další, 1988, J. Neurosci. Res. 20:402-4+0) při použití běžných metod molekulárních biologie v závislosti na dostupnosti řetězce aminokyselin pro NGF myši, takže bylo možno připravit oligonukleotidové sondy. Dostupnost větších množství NGF také podstatně usnadnila studie receptorů NGF, což vedlo k molekulárnímu klonování receptoru NGF u člověka a krysy (Johnson a další, 1986, Cell, 47:545-554, Radeke a další, 1987, Nátuře 325-593-597).

Nyní již je prokázáno, že NGF není všudypřítomný neurotrofní faktor. Pokud jde o periferní nervy, není NGF patrně faktorem, nezbytným pro přežití parasympatických neuronů, sensorických neuronů z přední části soustavy a enterických neuronů, jak bylo prokázáno in vitro i in vivo. Mimoto patrně není nutný pro přežití vyvíjejících se motorických neuronů (Oppenheim, 1982, J. Com. Neurol. 210:174-189), přestože u těchto neuronů dochází alespoň k expresi receptoru pro NGF s nízkou afinitou v průběhu vývoje (Raivich a další, 1985, EMBO J., 4:637-644). Nepřítomnost účinku NGF na tyto typy neuronů urychlila hledání dalších neurotrofních faktorů, které by podporovaly přežívání motorických neuronů míchy a/nebo parasympatických neuronů ganglion ciliare.

2.3. Další neurotrofní faktory

V posledním desetiletí byla podána řada zpráv o neurotrofní účinnosti v extraktech nejrůznějších tkání a v živném prostředí různých typů buněk. Avšak téměř ve všech případech byl pokrok v čištění a charakterizaci obsažených látek brzděn skutečností, že tyto látky jsou přítomny v nesmírně malých množstvích, obvykle řádu pikogramu nebo nanogramu na gram tkáně.

Mimoto byly sice navrženy vhodné biologické zkoušky pro periferní neurony, avšak zkoušky pro centrální nervový systém, které by byly specifické a poskytovaly reprodukovatelné výsledky narážejí na řadu problémů. Jednotlivé typy periferních neuronů je možno nalézt jako oddělená, snadno vyjmutelná ganglia, avšak neurony CNS jsou ve své distribuci vysoce heterogenní. Je nutno užít specifického značení kjejich identifikaci nebo k obohacení o určité typy neuronů CNS. Pokrok při tomto značení, například pomocí protilátek proti povrchu buněk nebo složkám buňky, nebo specifické histologické barvení je prozatím velmi omezený. Souhrnně je možno uvést že charakterizace neurotrofních faktorů, které i) se nevyskytují v takovém množství jako NGF, ii) obtížně se prokazují a iii) nejsou dostupné v dostatečném množství k vyvolání tvorby protilátek je postup nesmírně obtížný.

2.3.1 Srovnání růstového faktoru z mozku s nervovým růstovým faktorem

Neurotrofní účinnost, schopná udržet při životě neurony dorsálních kořenů ganglií kuřecího embrya in vitro byla identifikována v „upraveném prostředí“, v němž byly pěstovány buňky krysího gliomu C-6 (Barde a další, 1978, Nátuře 274:818). Tato účinnost nebyla neutralizována protilátkami proti myšímu NGF, což znamená pravděpodobnou přítomnost jiného neurotrofního faktoru v tomto prostředí. Podobný účinek, který nebylo možno blokovat protilátkami proti NGF byl prokázán také v kulturách astrogliálních buněk normálního mozku dospělých krys (Lindsay 1979, Nátuře 282: 80-82, Lindsay a další, 1982, Brain Res. 243:329-343) a v extraktech vyvíjejícího se a dospělého mozku krys (Barde a další, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 1199-1203) a vyvíjející se a dospělé kuřecí míchy (Lindsay a Peters 1984, Neurosci. 12: 45-51). Avšak v žádném případě nebyly účinné faktory izolovány ani identifikovány a zůstává pochybné, zda pozorovaná účinnost byla důsledkem přítomnosti jednoho nebo většího počtu různých faktorů.

Při použití mozku vepře jako výchozího materiálu podali Barde a další (1982, EMBO J., 1:549553) zprávu o faktoru, který se nyní nazývá mozkovým neurotrofhím faktorem (BNDF) a který podporuje přežití neuronů dorsálních kořenů ganglií u kuřecích embryí E10/E11. Neurotrofní účinnost byla prokázána pro vysoce bazickou bílkovinu (isoelektrický bod, pí 10,1), která

-3CZ 285649 B6 migrovala při elektroforéze na gelu s dodecylsíranem sodným (SDS) jako jednotný pás s molekulovou hmotností 12,3 k jednotky. Purifikační faktor byl 1,4 x 10⁶, avšak výtěžek byl velmi nízký, přibližně pouze 1 pg BDNF z 1,5 kg mozku vepře. Mimoto vzhledem ktomu, že posledním stupněm při čištění této látky byla preparativní elektroforéza na gelu, nebylo možno účinnost BDNF zcela renaturovat vzhledem k přítomnosti zbytků SDS (Barde a Thoenen, 1985, „Hormones and Cell Regulation“, sv. 9, Dumont a další, Elsevier Science Publishers, str. 385390). Bylo uvedeno, že vysoce bazická povaha a molekulová hmotnost BDNF byly velmi blízké monomeru NGF. Avšak BDNF má vlastnosti, které jsou odlišné od známých vlastností NGF v tom smyslu, že

a) při biologickém pokusu s dorsálními kořeny kuřecích ganglií není možno pozorovat zjevný účinek protilátek proti NGF na účinnost BDNF,

b) v tomtéž pokusu byl účinek BDNF a NGF aditivní a

c) na rozdíl od NGF nemá BDNF žádný účinek na přežití sympatických neuronů u kuřat E12.

Mimoto v průběhu studií s extrakty z mozku bylo pozorováno, že neurotrofní účinnost z těchto zdrojů patrně působí na sensorické neurony v pozdějším stadiu vývoje než v případě NGF. Při použití disociovaných kultur neuronů kuřecího embrya, pěstovaných na polykationtovém substrátu, jako polylysinu nebo polyomithinu, bylo prokázáno, že BDNF umožnil přežití více než 30 % El0-11 (embryonální den 10 nebo 11) neuronů dorsálních kořenových ganglií, avšak pravděpodobně měl jen malý vliv na přežití týchž neuronů v E6 (Barde a další, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 1199-1203). Za obdobných podmínek podporuje NGF přežití 30 až 40 % E6 neuronů DRG. Je zajímavé, že později bylo zjištěno, že při pěstování substrátu, povlečeného extracelulámí matricí glykoproteinu lamininu podporoval jak NGF, tak BDNF přežití přibližně 50 % neuronů DRG kuřecích embryí ve stáří E6 až E12 (Lindsay a další, 1985, Develop. Biol. 112, 319-328). V této publikaci se uvádí, že účinek NGF a BDNF je aditivní v případě, že obě tyto látky jsou přítomny v sytících koncentracích.

Časné studie podle publikace Levi-Montalcini, 1966, The Harvey Lectures 60, 217-259, týkající se specifičnosti NGF a účinků této látky na neurony uvádějí, že NGF patrně není všudypřítomným neurotrofním faktorem ani pro sensorické neurony vzhledem k tomu, že tato látka nemá žádný účinek na neurony v některých sensorických hlavových gangliích kuřete, zejména v ganglion nodosum desátého hlavového nervu. Při pozdějších studiích in vivo (Johnson a další, 1980, Science 210, 916-918; Pearson a další, 1983, Develop. Biol. 96, 32-36) bylo prokázáno, že deprivace NGF v průběhu embryogeneze neměla žádný vliv na přežití neuronů ve většině kraniálních sensorických gangliích krysy, zatímco totéž opatření vedlo k velké depleci počtu neuronů v sensorických gangliích, odvozených od neurální rýhy. Při podrobnějších studiích in vitro (Lindsay a Rohrer, 1985, Develop. Biol. 112, 30-48, Davies a Lindsay, 1985, Develop. Biol. 111, 62-72 a Lindsay a další, 1985, J. Cell Sci. Suppl. 3, 115-129) se jasně ukázalo, že NGF podporuje přežití většiny sensorických neuronů, odvozených od neurální rýhy avšak nemá žádný zjevný účinek na přežití kraniálních sensorických neuronů, odvozených od hlavové části zárodečného listu.

Prvním průkazem specifičnosti BDNF pro neurony, odlišné od NGF byla skutečnost, že in vitro bylo možno prokázat, že čištěný BDNF podporuje přežití 40 až 50 % sensorických neuronů, disociovaných od ganglion nodosum, odvozeného u kuřecího embrya od hlavové části zárodečného listu ve stadiu E6, E9 nebo E12 (Lindsay a další, 1985, J. Cell. Sci. Supp. 3, 115— 129). NGF neměl na tyto neurony žádný zjevný účinek ani sám o sobě ani ve spojení s BDNF. Jak bylo dále prokázáno při použití kultur explantátů, BDNF patrně podporuje přežití a růst neurinů z ostatních sensorických ganglií včetně ganglion petrosum, geniculatum a ventrolaterale trigeminu (Davies a další, 1986, J. Neurosci. 6, 1897-1904) žádné z uvedených ganglií nebylo

-4CZ 285649 B6 citlivé na NGF, Ve všech svrchu uvedených studiích neměly neutralizační protilátky proti NGF žádný vliv na pozorovaný účinek BDNF. Kromě pozorovaných účinků na neurony z periferních ganglií v kultuře bylo prokázáno, že BDNF také stimuluje přežití a diferenciaci neuronových buněk z neurální rýhy křepelky (Kalcheim a gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41, 79.86.

Až dosud brzdila nemožnost získat dostatečné množství BDNF pro imunizaci produkci protilátek proti BDNF pro srovnání s protilátkami proti NGF v jejich účinku na neurony a také nebylo možno provést pokusy se zkříženou neutralizací NGF a BDNF. Nyní však popisují dvě publikace, a to Kalcheim a další, 1987, Embo J., 6, 2871-2873 a Hofer a Barde, 1988, Nátuře 10 331, 261—262) fysiologickou úlohu BDNF u ptáků. V případě, že se uloží ve vejci mechanická překážka mezi dorsální kořenová ganglia ve dnech E3/E4 a jejich cíl v CNS v nervové trubici, je možno pozorovat, že řada neuronů těchto ganglií zahyne (Kalcheim a Le Douarin, 1986, Develop. Biol. 116, 451-466. Předpokládá se, že toto uhynutí neuronů by mohlo být způsobeno nedostatkem neurotrofního faktoru z CNS (nervové trubice). Bylo dále pozorováno, že BDNF ve 15 spojení s membránou, opatřenou povlakem lamininu může zabránit tomuto uhynutí buněk (Kalcheim a další, Embo J., 6, 2871-2873). Po vstřiknutí BDNF do vyvíjejících se křepelčích vajec potlačuje přirozené uhynutí v ganglion nodosum, což není možno prokázat pro NGF (Hofer a Barde, 1988, Nátuře 331, 261-262). Kromě účinku na periferní sensorické neurony v nervové rýze i v hlavové části podporuje BDNF přežívání vyvíjejících se neuronů CNS. Johnson a další 20 (1986, J. Neurosci. 6, 3031-3938) uveřejnili údaje, které prokazují, že BDNF podporuje přežití retinálních gangliových buněk z krysích embryí E17. Tím jsou rozšířeny dřívější poznatky, které prokazovaly, že některá upravená prostředí a extrakty z mozku, připravené z cílových oblastí retinálních gangliových buněk podporovaly přežívání těchto neuronů (McCaffery a další, 1982, Ex. Brain. Res. 48, 37-386, Sarthy a další, 1983, J. Neurosci. 3, 2532-2544, Turner a další, 25 1 983, Dev. Brain Res. 6, 77-83).

Kromě účinků na přežití vyvíjejících se neuronů v kultuře má BDNF účinky také na zralé neurony periferního i centrálního nervového systému v kultuře. Bylo prokázáno, že BDNF stejně jako NGF, stimuluje regeneraci axonů z neuronů DRG dospělých krys v kultuře (Lindsay, 1988, 30 J. Neurosci. 8, 2394-2405), přestože zralé sensorické neurony patrně nevyžadují ke svému přežití v kultuře in vitro na 3 nebo 4 týdny neurotrofní faktory. Mimoto v kultuře retinálních buněk dospělých krys bylo pozorováno, že BDNF podporuje jak přežití, tak prodlužování axonů z gangliových buněk retiny (Thanos a další, 1989, Eur. J. Neurosci. 1, 19-26). Srovnání biologických účinků NGF a BDNF je shrnuto v následující tabulce 1.

Tabulka I

Srovnání biologické účinnosti BDNF a NGF*

Přežití

Periferní nervový systém BDNF NGF

i) E6 DRG kuřete --H-

E10 DRG kuřete -++

E12 symp. kuřete (Barde a další, 1980 svrchu) -++ ii) E6-E12 DRG kuřete ++++

E6-E12 nodosum kuřete ++E12 symp. kuřete -++

E12 ciliámí g. kuřete (Lindsay a další, 1985 svrchu) --5CZ 285649 B6

Tabulka I - pokračování

Přežití iii) E3-E14 kuřete: jugulare DM-trigemini petrosum geniculatum VL-trigemini vestibulare mesencephalicum (Davies a další, 1986 svrchu, Barde a další, 1987, Prog., Brain Res., 71:185-198)

Centrální nervový systém

i) El7 gangliové buňky sítnice krysy (Johnson a další, 1986,

J. Neurosci. 6:3031-3038) +/++++ +/++++ +/++ +/++ ++++++

Poznámky k tabulce:

\ chronologickém pořadí podle data zveřejnění, účinky byly zkoumány in vitro '“žádné přežití (-). malý počet přežití (+), dobré přežití (++).

2.3.2. Cílové neurony pro neurotrofní faktory, odvozené od mozku

Sensorické neurony periferních nervových ganglií pocházejí z některé ze dvou od sebe odlišitelných přechodných embryonálních struktur, z nichž jednou je nervová rýha a druhou z těchto struktur je zvětšená kraniální část této rýhy ve formě destiček. Nervová rýha dává vznik jak neuronům, tak satelitním buňkám autonomních ganglií a spinálním sensorickým gangliím, tj. DRG. Příspěvek obou uvedených struktur na tvorbu sensorických ganglií kraniálních nervů byl studován při použití stransplantačního chimémího systému křepelka/kuře podle publikace Le Douarin, 1973, Develop. Biol. 20:217-222, Noden, 1978, Develop. Biol. 67:313-329, Narayan a Narayan, 1980, Anat. Rec. 196:71-82, Ayer-Le Lievre a Le Dourain, 1982, Develop. Biol. 94:291-310, D'Amico-Martel a Noden, 1983, Am. J. Anat. Rec. 196:445-468). Ve shrnující publikaci Lindsay a další, 1985, J. Cell. Sci. Supp. 3:115-129 se uvádí, že alespoň u ptáků pocházejí neurony distálních ganglií kraniálních nervů VII, IX a X (ganglium geniculatum, petrosum a nodosum) a neurony vestibulámě-akustického komplexu VIII kraniálního nervu výlučně z hlavové části. Trigeminální ganglion V. kraniálního nervu obsahuje neurony z obou uvedených struktur, přičemž neurony z hlavové části je možno nalézt převážně ve ventrolaterální části maxillomandibulámího laloku, zatímco satelitní buňky všech kraniálních ganglií mají svůj původ patrně výlučně v nervové rýze.

Z pokusů in vitro, při nichž byly užity jak explantáty, tak disociované, neurony obohacené kultury sensorických neuronů míchy a mozku je zřejmé, že sensorické neurony z nervové rýhy odpovídají na působení NGF. Na rozdíl od toho odpovídají neurony, jejichž původ je v hlavové části včetně neuronů ventrolaterální části ganglia trigeminu a celé populace neuronů z ganglion vestibulare, geniculatum, petrosum a nodosum v podstatě neodpovídají na působení NGF v průběhu svého embryonálního vývoje. Přes rozdíly v požadavcích a v odpovědi na NGF, jak je zřejmé z tabulky 1, jsou oba typy neuronů citlivé na účinek BDNF, a to jak pokud jde o přežití, tak pokud jde o vliv na tvorbu neuritů (Lindsay a další, 1985, J. Cell. Sci. Supp. 3:115-129,

-6CZ 285649 B6

Lindsay a další, 1985, Develop. Biol. 112:319-328, Kalcheim a Gendreau, 1988, Develop. Brain Res. 41:79-86). Tebar a Barde (1988, J. Neurosci. 8: 3337-3342) studovali vazné parametry radioaktivně značeného BDNF na neuronech ganglií dorsálních kořenů u kuřete. Jejich výsledky jsou v souladu s výsledky, které prokazují existenci dvou skupin receptorů BDNF, z nichž jedna má vysokou afinitu pro BDNF a druhá afinitu nízkou. V případě sympatických nervů nebyly pozorovány žádné receptory s vysokou afinitou.

Známé neuronové cíle pro BDNF byly shrnuty v publikaci Barde a další, 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189. Před existencí tohoto vynálezu nebylo možné provádět identifikaci buněk, syntetizujících BDNF vzhledem k tomu, že nebyly k disposici sondy typu kyselin nukleových nebo protilátek, specifických proti BDNF. Pokusy o přípravu polyklonálních nebo monoklonálních protilátek proti BDNF byly neúspěšné. Tento neúspěch zbrzdil molekulární klonování BDNF, stanovení fysiologického účinku nedostatku BDNF in vivo na vyvíjející se neurony, kvantitativního stanovení BDNF ve tkáních pomocí imunologických zkoušek a lokalizaci BDNF při použití imunocytochemie.

V následující tabulce II jsou uvedeny neurony podle své odpovědi na BDNF.

Tabulka II

Neurony, odpovídající a neodpovídající na BDNF*

A. Odpovídající neurony

I. Sensorické neurony kuřete z nervové rýhy v

a) gangliích dorsálních kořenů

b) ganglion jugulare

c) dorsomediálního ganglia trigeminu

d) mesencephalického jádra trigeminu**

II. Sensorické neurony kuřete z ektodermální destičky

a) ganglion nodosum

b) ganglion vestibulare

c) ganglion petrosum

d) ganglion geniculatum

e) ventrolaterální ganglion trigeminu

ΠΙ. Gangliové buňky retiny kiys

IV. Gangliové buňky retiny kuřete***

A. Neodpovídající neurony

I. Neurony sympatiku kuřete a krysy

Π. Parasympatické ciliámí neurony kuřete * Barde a další, 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189 **Davies a další, 1986, Nátuře 319: 497-499 ^Rodriguez-Tebar a další, 1989, Dev. Biol. 136:296-303

-7CZ 285649 B6

3.Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří čištěná molekula DNA, obsahující kódový řetězec nukleových kyselin pro zralý neurotrofní faktor, odvozený od mozkové tkáně, BDNF s následujícím řetězcem aminokyselin

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp

Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr

Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg nebo subsekvence řetězce, která je kódem pro polypeptid s účinností BDNF.

BDNF ve formě bílkoviny je podle vynálezu možno získat tak, že se pěstuje hostitelská eukaryotická nebo prokaryotická buňka, obsahující svrchu uvedenou molekulu nukleové kyseliny nebo vektor, který ji obsahuje, čímž dojde k expresi kódové molekuly DNA pro uvedený faktor a BDNF ve formě bílkoviny se po expresi izoluje. Jako prokaryotická hostitelská buňka se s výhodou užije bakterie.

Předmětem vynálezu jsou řetězce nukleových kyselin, které jsou kódem pro neurotrofní faktor, odvozený od mozkové tkáně (BDNF), vynález se rovněž týká čistého faktoru BDNF, jeho peptidových fragmentů a jeho derivátů a protilátek proti BDNF, jeho peptidovým fragmentům a jeho derivátům. Vynález poprvé umožňuje získání dostatečného množství BDNF pro výrobu protilátek proti BDNF a pro diagnostické a léčebné použití této látky.

V různých provedeních vynálezu je možno využít nukleových kyselin pro BDNF, samotného BDNF, jeho peptidových fragmentů, jeho derivátů nebo protilátek proti BDNF k diagnóze a léčení různých neurologických onemocnění a poruch, zejména k diagnóze a léčení poruch sensorických neuronů a při degeneraci sítnice. Mimoto je ve specifických provedeních možno využít nukleové kyseliny pro BDNF a genové BDNF produkty pro diagnózu a léčení neuroblastomu, Parkinsonovy choroby a Alzheimerovy choroby. Produkty genu pro BDNF je také možno využít k usnadnění příjmu implantátů do nervové tkáně nebo k vyvolání regenerace nervů po poranění, infarktu, infekci nebo po operacích.

Vynález se rovněž týká farmaceutických prostředků, které jako svou účinnou složku obsahují produkty genu pro BDNF, nebo také protilátky proti BDNF, prostředky je možno využít k diagnóze nebo k léčení různých neurologických onemocnění a poruch.

Mimoto je možno objasněním celého nukleotidového řetězce pro BDNF uskutečnit srovnání genů pro BDNF a NGF, identifikovat homologní oblasti a definovat skupinu genů BDNF/NGF. Vynález se proto týká také způsobu identifikace dalších členů skupiny genů BDNF/NGF ve specifickém provedení je možno způsob podle vynálezu využít pro identifikaci nových členů skupiny genů BDNF/NGF. Ve specifickém provedení je možno způsob podle vynálezu užít k identifikaci nových členů skupiny, odlišných od genu pro NGF i pro BDNF. Vynález tedy poskytuje další členy skupiny genů BDNF/NGF, které lze identifikovat svrchu uvedeným způsobem a také produkty těchto genů.

-8CZ 285649 B6

3.1. Zkratky a definice pojmů

BDNF neurotrofhí faktor, odvozený od mozkové tkáně hBDNF lidský BDNF

CAT cholinacetyltransferáza

CNS centrální nervový systém

DRG ganglia dorsálních kořenů (ganglion)

EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová

NGF nervový růstový faktor

PBS fysiologický roztok NaCl s fosfátovým pufrem

PCR vazba řetězců, vyvolaná pomocí polymerázy PNS periferní nervový systém

SDS dodecylsíran sodný tris tris(hydroxymethyl)aminomethan

4. Popis výkresů

Na obr. 1 je znázorněn nukleotidový řetězec a odvozený řetězec aminokyselin pro cDNA prepro BDNF vepře. Je znázorněn úplný řetězec dvou překrývajících se klonů cDNA. Peptidový řetězec, zjištěný analýzou mikrovzorku (tabulka III) je podtržen. Jediný společný řetězec pro Nglykosylaci je podtržen dvakrát. Začátek úplného řetězce BDNF je označen tím, že kromě nukleotidového řetězce je uveden i odpovídající řetězec aminokyselin.

Na obr. 2 je znázorněno srovnání řetězců NGF a BDNF. Jsou označeny oblasti s více než dvěma zbytky aminokyselin na identických místech. Řetězce začínají prvními aminokyselinami úplných bílkovin a končí posledními před stop-kodony. BDNF a různým NGF je společných 51 aminokyselin (Schwarz a další, 1989, J. Neurochem. 52:1203-1209) včetně šesti cysteinových zbytků.

Na obr. 3 je znázorněn autoradiogram zkoušky Southem blot pro DNA genomu člověka, opice, krysy, myši, psa, krávy, králíka, kuřete a kvasinek po rozštěpení enzymem EcoRI a po hybridizaci na ³²P-značené sondy NGF a BDNF.

Na obr. 4 je znázorněna analýza Northem blot. Z každé tkáně bylo do dráhy naneseno 20 pg celkové RNA a pak byla provedena hybridizace na ³²P-značenou myší cRNA jako sondu pro BDNF. Je možno pozorovat silný signál při 1,45 kb v případě mozkové tkáně, avšak pak již v případě žádné ze sedmi dalších analyzovaných tkání.

Na obr. 5 je znázorněn řetězec cDNA pro BDNF člověka a odvozený řetězec aminokyselin a také srovnání řetězců DNA vepře, krysy a člověka.

Na obr. 6 je znázorněn plasmid PCMVl-pBDNF pro expresi BDNF.

Na obr. 7 a) je znázorněn výsledek stanovení ELISA pro vazbu antiséra na peptid B5 při použití sériového ředění antiséra. Na obr. 7 b) je znázorněno kvantitativní stanovení vazby různých antisér v ředění 1 : 500 na 10 ng BDNF.

Na obr. 8 jsou znázorněny výsledky imunohistochemického barvení pro tyrosinhydroxylázu v kulturách ventrálního mesencephala po působení BDNF (šrafované sloupce) a u kontrol (prázdné sloupce).

-9CZ 285649 B6

Na obr. 9 je znázorněn příjem dopaminu kulturami ventrálního mesencephala. Kultury, doplněné BDNF jsou označeny šrafovanými sloupci, kontrolní kultury prázdnými sloupci.

Na obr. 10 a) je znázorněn účinek BDNF na počet CAT-pozitivních buněk v kulturách cholinergních neuronů předního mozku. Na obr. 10b) je znázorněna kultura cholinergních neuronů předního mozku při hustotě 260 000 buněk na jedno vyhloubení (bílý sloupec) nebo 150 000 buněk na vyhloubení (šrafovaný sloupec) po působení 150ng/ml NGF. Počet CTAimunopozitivních buněk v buňkách po působení NGF a bez tohoto působení je navzájem srovnán.

Na obr. 11 jsou znázorněny změny v účinnosti enzymu CAT v pikomolech v katalyzovaném substrátu za minutu jako funkce koncentrace BDNF v kulturách cholinergních neuronů předního mozku.

Na obr. 12 je znázorněn případ, kdy byly kultury astrogliálních buněk ve stadiu, v němž na 60 % souvisle pokrývaly dno nádoby zpracovávány působením buď a) epidermálního růstového faktoru, nebo b) BDNF po dobu 42 hodin, načež byly inkubovány s 1³H | -methylthymidinem. Množství inkorporovaného ³H bylo měřeno relativně ke koncentraci EGF a BDNF.

Na obr. 13 je znázorněn Southem blot pro sondu R1B/2C kuřete po štěpení EcoRl, hybridizovanou na BDNF/NGF. Polohy fragmentů genomu pro BDNF a NGF po štěpení enzymem EcoRl jsou znázorněny písmeny B a N.

Na obr. 14 je znázorněno srovnání NGF a BDNF s novým členem skupiny BDNF/NGF, který byl 25 identifikován pomocí PCR z DNA myši při použití primerů sestavy 3/sestavy 4: Nový gen, označený jako M3/4 a známý rovněž jako Neurotrofin-3 nebo NT-3 je znázorněn pouze svým kódovým řetězcem a odvozeným řetězcem aminokyselin ve srovnání s úplným NGF myši a úplným BDNF vepře, krysy, myši nebo člověka. Pomlčky znázorňují polohy, v nichž je vynechán v NGF kodon, aby bylo možno řetězec lépe srovnat s řetězcem BDNF a M3/4. 30 Kursivou jsou označena místa s odpovídajícími aminokyselinami a/nebo konservativní substituce aminokyselin.

Na obr. 15 je znázorněn Northem blot RNA z různých lidských buněčných linií, odvozených od nádorových tkání, hybridizovaných na lidský BDNF, užitý jako sonda.

Na obr. 16 je znázorněn vliv depolarizace na úroveň mRNA pro BDNF v neuronech hippocampu.

a) Průběh exprese mRNA pro BDNF v čase v primární kultuře hippocampálních neuronů za 40 přítomnosti 50 mM KC1. Celková buněčná RNA byla extrahována z 0,5 x 10⁶ buněk, glyoxylována a analyzována elektroforézou na 1,3% agarozovém gelu (Biziere K. a Coyle T., Neurosci., 1978, Lett. 8:303; McGeer a další, 1978, Brain Res. 139-381.). RNA byla přenesena na filtry Hybond N a hybridizována s ³²P-značenou cRNA-sondou (specifická účinnost 10’ impulsů za minutu/pg), specifickou pro myši BDNF a získanou transkripcí in vitro. Dva horní 45 pásy (4 a 1,5 kb) odpovídají mRNA BDNF. Dva pásy BDNF (4 kb a 1,5 kb) odpovídají mRNA BDNF. Dva pásy BDNF (4 kb a 1,5 kb) jsou odolné proti Rnáze A a representují dva různé transkripty, které jsou však patrně řízeny podobným způsobem, a spodní pás (700 bp) odpovídá 10 pg krátkého standardu mRNA BDNF, který byl ke vzorkům přidán před extrakcí RNA.

b) Závislost na vápníku. Neurony byly inkubovány 3 hodiny v normálním živném prostředí (CM), v modifikovaném prostředí bez vápníku (-Ca) nebo v živném prostředí s 10μΜ nifedipinu (NIF). Tam, kde je to označeno, bylo přidáno 50 mM KC1 (+K).

- 10CZ 285649 B6

Na obr. 17 je znázorněn vzestup mRNA pro NGF v neuronech hippocampu působením draslíku a kyseliny kainové. Neurony byly inkubovány 3 hodiny v kontrolním prostředí (C) nebo v přítomnosti 50 mM KC1 (+K) nebo v přítomnosti 25 μΜ kyseliny kainové (KA). RNA byla extrahována a hladina mRNA pro NGF byla stanovena kvantitativní PCR (11). Hodnoty jsou průměrem (n=6) ± standardní odchylka.

Na obr. 18 je znázorněn vztah mezi dávkou a účinkem pro působení kyseliny kainové. RNA byla extrahována a analyzována způsobem, popsaným v obr. 16. Hodnoty jsou průměrem ze tří pokusů ± směrodatná odchylka. Hippocampální neurony byly inkubovány 3 hodiny při různých koncentracích kyseliny kainové.

Na obr. 19 je znázorněn časový průběh vzestupu mRNA pro NGF a pro BDNF působením kyseliny kainové. Byla extrahována celková buněčná RNA a analyzována způsobem, popsaným u obr. 16 z hippocampu (a) nebo z mozkové kůry (b) v označeném čase (v hodinách) po intraperitoneální injekci kyseliny kainové v množství 12 mg/kg. 90 minut po kyselině kainové byla podána jediná dávka diazepamu (10 mg/kg) (dva pásy pro BDNF, 4 a 1,5 kb jsou odolné proti působení Rnázy A a znamenají dav odlišné transkripty, které jsou však pravděpodobně řízeny podobným způsobem). Hodnoty, odpovídající 1,5 kb mRNA-BDNF (o) a 1,3 kb mRNANGF (o) jsou rovněž znázorněny. Podobný vzestup byl pozorován pro 4 kb mRNA-BDNF. Uvedené hodnoty jsou průměrem ze tří až čtyř stanovení ± směrodatná odchylka (SEM).

Na obr. 20 je znázorněn vliv protikřečových látek na expresi mRNA-BDNF, vyvolanou kyselinou kainovou. Krysám byl podán intraperitoneálně diazepam (10 mg/kg) (DZ); MK-801 (1 mg/kg) (MK) nebo ketamin (20 mg/kg) (KET) 15 minut před injekcí kyseliny kainové (12 mg/kg) (+KA) nebo íysiologického roztoku chloridu sodného (kontrola). Po třech hodinách byla tkáň hippocampu k přípravě celkové RNA způsobem, který byl popsán u obr. 16. Hodnoty znamenají průměr ze tří pokusů ± SEM.

Na obr. 21 jsou znázorněny buněčné kultury septa. A-F. Jde o mikrofotografie ve fázovém kontrastu, zaznamenán je průběh buněčného růstu kultury v čase. Buňky byly naneseny v hustotě 1,3 x 10⁵ buněk/cm² a udržovány v 5 HS/NS tak, jak je popsáno v textu. Záznam byl prováděn v časových intervalech 1 (A,B), 2(C,D) a 4 (E,F) dnech. Bylo užito specifických značících prostředků pro identifikaci populací buněk, neuronů, histochemicky zbarvených Ache (G,H) a neuronů, imunopozitivních na receptor NGF (I). Cejchovací tyčinka = 25 pm.

Na obr. 22 je uvedeno srovnání odpovědi disociovaných buněk septa na působení BDNF nebo NGF na bázi počtu AChE buněk.

A) Srovnání odpovědi na BDNF (25 ng/ml), NGF (20 ng/ml) nebo kombinace obou těchto látek při různé hustotě buněk.

B) Srovnání odpovědi cholinergních neuronů na různé koncentrace BDNF nebo NGF (0 až 50 ng/ml). Pro oba typy pokusů byly buňky pěstovány 11 až 12 dnů v prostředí s obsahem séra. Údaje jsou průměrem z 6 až 9 stanovení ± SEM.

Na obr. 23 je znázorněn graf, který uvádí vliv opožděného přidání BDNF nebo NGF na disociované kultury septa. BDNF (50 ng/ml) nebo NGF (50 ng/ml) byly přidány k disociovaným buněčným kulturám se zpožděním 5 až 6 hodin (+12), 5 dnů (-5/+7) nebo 7 (-7/+5) dnů. Kultury byly pěstovány 12 dnů. Pak byly buňky vyhodnoceny na bázi pozitivního histochemického zbarvení AChE. Výsledky jsou průměrem ze 4 až 5 stanovení ± SEM.

Na obr. 24 je znázorněn graf pro schopnost BDNF a NGF řídit počet receptorů pro NGF v imunopozitivních buňkách.

- 11 CZ 285649 B6

Zkouška na počet receptorů pro NGF byla prováděna při soužití monoklonální protilátky 192-IgG v ředění 1 : 1000. Disociované buňky septa byly naneseny na plotny s hustotou 1,3 x 10⁵ buněk/cm a buňky byly zpracovávány kontinuálně po dobu 12 dnů. Bylo provedeno srovnání mezi vyskytující dávkou NGF a řadou dávek BDNF v rozmezí 0 až 100ng/ml. Znázorněné výsledky jsou průměrem ze čtyř stanovení ± SEM.

Na obr. 25 je znázorněna křivka závislosti účinku na dávce pro indukci účinnosti CAT pro BDNF (A) a NGF (B).

Kultury byly naneseny do vyhloubení o průměru 6 mm, povlečených polyomithinem a lamininem a byly udržovány 12 dnů v prostředí 5 HS/N3. Buňky byly vystaveny působení BDNF nebo NGF po dobu 5 až 6 hodin před nanesením na plotny. Faktory byly měněny každé 3 dny současně s výměnou živného prostředí. Získané výsledky jsou průměrem z 5 až 6 stanovení ± SEM.

Na obr. 26 je znázorněna závislost dávky a účinku v případě enzymatické účinnosti EChE pro BDNF a NGF.

Cholinergní neurony krysího septa byly pěstovány 12 dnů v živném prostředí s obsahem séra s doplňkem hormonů. Pak byly buňky podrobeny působení BDNF (prázdné čtverečky) a NGF (plné čtverečky) tak, jak bylo popsáno u výkresu 25. Výsledky jsou průměrem ze 6 až 9 stanovení ± SEM. Účinnost EChE v neošetřených kulturách byla 16,4 ± 2 nmol/h/vyhloubení.

Na obr. 27 je znázorněn časový průběh účinnosti enzymu CAT, indukované BDNF ve srovnání sNGF.

Časové požadavky pro stimulaci účinnosti CAT byly sledovány na buňkách v hustotě 2,3 x 10⁵ buněk/cm², pěstovaných po různou dobu v prostředí s obsahem séra s doplňkem hormonů a exogenních faktorů. Buňky byly z počátku vystaveny působení BDNF (prázdné čtverečky) nebo NGF (plné čtverečky) 5 až 6 hodin po nanesení na plotny. Výsledky jsou uvedeny v % účinnosti stanovené na ošetřených kulturách ve srovnání s kulturami neošetřenými (n=6, BDNF 12 dnů n=3).

Na obr. 28 je znázorněno srovnání účinku gliálních buněk na schopnost BDNF indukovat enzymatickou účinnost CAT. Septální buňky byly pastovány na plotnách při hustotě 2,3 x 10⁵ buněk/cm². Po době 5 až 6 hodin bylo prostředí nahrazeno buď prostředím prostým séra, nebo prostředím s obsahem séra, obě prostředí byla doplněna 1 % N3, jak je podrobně vysvětleno v textu. Na 24 hodin byl přidán cytosinarabinosid (1 μΜ) k dalšímu snížení počtu astrocytů. Pak byly kultury pěstovány 12 dnů. Výsledky představují průměr ze 4 stanovení ± SEM.

Na obr. 29 je znázorněn graf, který uvádí vliv BDNF nebo NGF na úroveň příjmu cholinu. Příjem cholinu byl sledován na buňkách, pěstovaných 11 dnů při hustotě 1,3 x 10⁵ buněk/cm². Po celou dobu pěstování byly buňky vystaveny účinku BDNF (50 ng/ml) nebo NGF (50 ng/ml). Údaje jsou průměrem z 5 stanovení ± SEM pro BDNF a z 10 stanovení ± SEM pro NGF.

Na obr. 30 je znázorněno dělení ³⁵S-značených reakčních produktů enzymatického štěpení lidského BDNF trypsinem a endoproteinázou Arg-C na SDS-Page.

Na obr. 31 je znázorněna biologická zkouška na DRG, srovnávající nezpracovaný CHO-hBDNF s CHO-hBDNF, rozštěpeným endoproteinázou. Růst neuronů se hodnotí stupnicí 0 až 5, přičemž hodnocení 5 znamená maximální biologickou účinnost.

- 12CZ 285649 B6

Na obr. 32 jsou znázorněny ve fázovém kontrastu (A) a v osvětleném poli (B, C) mikrofotografie disociovaných kultur E14 buněk ventrálního krysího mesencephala, barvené po 9 dnech pěstování v kultuře pomocí monoklonálních protilátek proti tyrosinhydroxyláze (TH).

A a B. Fázový kontrast a mikrofotografie téhož pole v plném osvětlení ukazují malé množství TH-neuronů v těchto kulturách. Je možno pozorovat pouze jediný TH+ - neuron (šipky) v poli, které obsahuje celou řadu jasných neuronů s dlouhými vlákny. Je možno pozorovat také několik buněk, odlišných od neuronů, a to pomocí morfologické analýzy nebo barvením na GFAP (neznázoměno).

C. Fotografie v osvětleném poli znázorňuje dva TH+ -neurony (malé šipky) v poli, obsahujícím přibližně 98 jasných buněk s morfologickými znaky neuronů. Cejchovací tyčinka = 100 1M.

Na obr. 33 je ve velkém zvětšení uvedena mikrofotografie 6 dnů starých kultur E14 buněk 15 ventrálních mesencephalických buněk krysy se změněnou morfologií TH+ -neuronů, některé z nich mají velký růst vláken a velmi vyjádřené růstové kónusy (A, B). Kultury byly založeny a barveny stejným způsobem jako v případě výkresu 32. Velikost cejchovací tyčinky = 25 μΜ.

Na obr. 34 je znázorněn pozitivní účinek BDNF na přežití TH+ -neuronů, dopaminergních 20 neuronů mesencephala v kultuře při závislosti účinku na velikosti dávky, účinek je možno pozorovat po době delší než 3 dny.

A) Srovnání počtu TH+ -neuronů v kulturách E14 ventrálních mesencephalických buněk krysy, které byly udržovány bez přítomnosti BDNF (prázdné sloupky) nebo v přítomnosti BDNF (plné 25 sloupky). V ošetřených kulturách byl BDNF přidáván jednou denně v dávce 50 ng/ml ve druhém dni pěstování kultury. V den 3 nebylo možno pozorovat žádný rozdíl mezi kontrolními a ošetřenými kulturami, avšak počet TH+ - neuronů v kulturách, k nimž byl přidán BDNF byl l,8krát vyšší než v kontrolních kulturách ve dni 8. Hodnoty jsou průměrem ze dvou stanovení.

B) Účinek BDNF na vyšší přežívání TH+ - neuronů je závislý na jeho dávce.

Počet TH+ -neuronů byl stanoven ve dvojím opakování po 8 dnech pěstování v kultuře v nepřítomnosti BDNF nebo v prostředí, obsahujícím zvyšující se koncentrace BDNF, který byl přidán vždy ve dni 2.

C) NGF nemá žádný účinek na přežití TH+ - neuronů.

Aby bylo možno prokázat specifičnost působení BDNF, byly kultury pěstovány také za přítomnosti nebo v nepřítomnosti NGF v dávce 50 ng/ml po dobu 8 dnů a pak byly analyzovány 40 na přítomnost TH+ - neuronů. NGF, přidaný ve dni 2 nezvýšil přežívání TH+ - neuronů v kulturách, které byly zkoumány ve dnech 6 nebo 8. Výsledky jsou průměrem ze dvojího opakování.

Na obr. 35 je znázorněn vliv BDNF na další zvýšení přežívání TH+ - neuronů, srovnání bylo 45 provedeno s opakovanými dávkami BDNF a jedinou dávkou ve dni 2.

Kultury byly připraveny stejně jako je popsáno v textu. Rekombinantní lidský BDNF byl čištěn ze supematantu buněk COS M5. Kultury byly ošetřeny buď jediným přidáním (SA, tečkované sloupky) BDNF (50 ng/ml) v den 2, nebo opakovanými dávkami BDNF (50 ng/ml) ve dnech 1, 50 2, 4, 6 a 8 (MA- mnohočetné přidání, plné sloupky), nebo byly pěstovány bez přidání BDNF (kontroly, prázdné sloupky). V uvedené době byly kultury fixovány a barveny na ΊΉimunoreaktivitu. Doplňováním BDNF jeho opakovaným přidáváním bylo možno dosáhnout 2,7krát vyššího počtu TH+ - neuronů ve dni 11 ve srovnání s kontrolními kulturami, zatímco při

- 13CZ 285649 B6 jediném podání BDNF byl maximální vzestup počtu po 11 dnech o málo více než dvojnásobný. Výsledky jsou uvedeny pro dvojí opakováno zkoušek jako jejich průměr.

Na obr. 36 je graficky znázorněna skutečnost, že při opožděném přidání BDNF nedochází ktak velkému zvýšení počtu TH+- neuronů jako při jeho přidání ve dni 2.

Kultury byly připraveny způsobem, uvedeným v textu až na dobu přidání exogenního BDNF. Všechny kultury byly pěstovány ode dne 2 v prostředí, prostém séra a BDNF byl přidán v jediné dávce 50 ng/ml (BDNF z mozku vepře) ve dni 2, 5 nebo 7 (CD2, CD5, CD7). Ve dnech 6, 8 a 10 byl stanoven počet TH+ - neuronů ve dvojím opakování. Při tomto pokusu došlo po přidání BDNF ve dni 2 k trojnásobnému zvýšení počtu TH+ - neuronů ve dni 10. V případě, že byl BDNF přidán později, ve dni 5, bylo možno také pozorovat zvýšení počtu TH+ - neuronů ve srovnání s kontrolami ve dni 10, avšak toto zvýšení bylo méně než dvojnásobné a rozdíl mezi počtem TH+ - neuronů mezi ošetřenou kulturou a kulturou kontrolní se již v průběhu času nezvyšoval. Výsledky kontrolních pokusů jsou vyjádřeny prázdnými sloupky. Přidání BDNF ve dni 2 = tečkované sloupky. Přidání BDNF ve dni 7 - plné sloupky. Přidání BDNF ve dni 7 je vyjádřeno diagonálně šrafovanými sloupky.

Na obr. 37 je znázorněna závislost odpovědi na dávce BDNF na příjem GABA v kultuře hippocampálních neuronů. BDNF, částečně čištěný ze supematantu buněk COS M5 byl přidán ke kulturám v různém ředění. Bylo prokázáno, že BDNF v ředění 1 x 10² měl maximální účinek na vývoj neuritů u ES kuřecího ganglia dorsálních kořenů. Příjem ³H-GABA byl měřen 8 následujících dnů po podání BDNF in vitro.

Na obr. 38 je znázorněna skutečnost, že BDNF je schopen chránit dopaminergní neurony substantia nigra před neurotoxickými účinky MPP+. Kultuiy byly získány z krysích embryí způsobem podle obr. 1. Po 24 hodinách in vitro bylo živné prostředí nahrazeno prostředím prostým séra. Po třech dnech byly kultury rozděleny n čtyři části a uloženy do šesti misek o průměru 35 mm. Jedna skupina buněk byla kontrolní, k dalším skupinám byl přidán i) růstový faktor z bazických fibroblastů, 10 ng/ml, (bFGF z hovězího mozku, Boehringer-Mannheim), nebo ii) myší NGF, 50 ng/ml nebo ii) BDNF, 50 ng/ml. Kultury byly udržovány dalších 24 hodin a pak byly 3 misky z každé skupiny vystaveny působení 1 μΜ MPP+ (Research Biochemicals, lne., Natick, MA) na dobu 48 hodin. Na konci pokusu, který trval celkem 6 dnů byly všechny vzorky zkoumány na TH-imunoreaktivitu a v každé skupině buněk byl stanoven počet TH+ buněk. Udané údaje jsou počet TH+ - neuronů po působení MPP+, vyjádřený v procentech počtu TH+ - neuronů v podobných kulturách, nevystavených působení MPP+. Všechny hodnoty jsou průměr ± SEM pro trojí opakování.

5. Podrobný popis vynálezu

Vynález se týká řetězců nukleových kyselin, které jsou kódem pro neurotrofní faktor, odvozený od mozkové tkáně (BDNF) a také BDNF, jeho peptidových fragmentů a jeho derivátů, získaných ve větším množství při použití uvedených řetězců nukleových kyselin. Mimoto se vynález týká farmaceutických prostředků a léčebného použití BDNF a poprvé poskytuje prostředky pro získání dostatečného množství v podstatě čistého BDNF pro klinické použití. Vynález se rovněž týká protilátek proti BDNF nebo jeho fragmentům a poskytuje postup pro získání dostatečného množství imunogenu. Mimoto umožňuje vynález srovnání řetězců nukleových kyselin pro BDNF a pro NGF a tím i možnost identifikace homologních oblastí řetězců nukleových kyselin pro BDNF a NGF, čímž je definována také skupiny genů BDNF/NGF. Vynález poskytuje postup pro identifikaci a izolaci dalších členů uvedené skupiny genů.

- 14CZ 285649 B6

Pro jasnost popisu vynálezu, avšak nikoliv kjeho omezení bude nyní vynález popsán v následujících odstavcích:

i) čištění BDNF ii) biologické zkoušky na přítomnost BDNF iii) stanovení řetězce BDNF mikrometodami iv) klonování kódové DNA pro BDNF

v) exprese BDNF vi) geny pro BDNF a vlastní BDNF vii) tvorba protilátek proti BDNF viii) identifikace dalších členů skupiny genů BDNF/NGF ix) využití vynálezu

x) farmaceutické prostředky

5.1. Čištění faktoru, odvozeného od mozkové tkáně (BDNF)

Aby bylo možno identifikovat nukleovou kyselinu, která je kódem pro BDNF, je možno získat z tkáně mikrogramová množství této látky, aby bylo možno stanovit řetězec aminokyselin, který je pak možno užít ke konstrukci oligonukleotidových sond. Výjimečná vzácnost bílkoviny BDNF prakticky omezuje množství řetězců aminokyselin, které může být stanoveno. BDNF je možno získat z mozku vepře postupy, které byly popsány v publikaci Barde a další, 1982, EMBO J., 1: 549-553 nebo v publikaci Hofer a Barde, 1988, Nátuře 331: 261-262.

S výhodou je možno BDNF připravit následujícím způsobem, který bude popsán jako příklad, avšak nikoliv pro omezení různých modifikací, které může provést každý odborník. Vzhledem k malému množství přirozeně se vyskytujícího se BDNF je nutno užít s výhodou přibližně 6 kg mozkové tkáně pro čisticí postup. Mozková tkáň může být homogenizována vpufru s fosforečnanem sodným v koncentraci přibližně 0,2 M fosforečnanu sodného o pH přibližně 6 s obsahem 1 mM EDTA a 1 mM čerstvě přidaného fenylmethansulfonylchloridu tak aby poměr mozkové tkáně a kapaliny byl přibližně 1 kg tkáně na 2 litry pufru. Pak je možno užít kyselinu chlorovodíkovou k úpravě pH směsi na hodnotu přibližně 4 a směs se pak míchá 2 hodiny pří teplotě 4 °C. Pak je možno směs odstředit 25 minut při 20 000 g. Po odstředění se supematant oddělí, jeho pH se upraví na hodnotu přibližně 6,0 při použití hydroxidu sodného, načež se supematant míchá s 1 litrem předem nabobtnané karboxymethylcelulózy (na 6 kg mozkové tkáně) v rovnovážném stavu s 0,1 M fosforečnanem sodným o pH 6. Po několikanásobném promytí celkovým množstvím 20 litrů 0,1 M fosforečnanu sodného o pH 6 je možno suspenzi nalít do sloupce a sloupec promýt týmž pufrem s obsahem 0,13 M chloridu sodného, nejlépe přes noc. Účinné frakce, identifikované biologickou zkouškou na BDNF (je uvedena dále v odstavci 5,2) je pak možno vymýt fosfátovým pufrem s obsahem 0,5 M chloridu sodného a pak dialyzovat proti několikrát vyměněným přibližně 5 litrům 5 mM fosforečnanu draselného o pH 6,8. Dialyzované frakce se pak nanesou na sloupec s obsahem hydroxyapatitu s objemem vrstvy 20 ml na každý kg zpracovávané mozkové tkáně. Hydroxyapatitový sloupec má být předem uveden do rovnovážného stavu v 5 mM fosforečnanu draselném při pH 6,8 před nanesením vzorku. Pak se sloupec vymývá při použití lineárního gradientu, který je tvořen 500 ml 5 mM fosforečnanu draselného a 500 ml 700 mM fosforečnanu draselného, vždy o pH 6,8. BDNF se

- 15CZ 285649 B6 vymývá při koncentraci fosforečnanu draselného 500 mM. Účinné frakce se spojí, jejich molarita se upraví na 700 mM fosforečnanu draselného a pak se materiál nanese na sloupec s obsahem fenyl-sepharosy s objemem přibližně 5 ml na každých 6 kg zpracovávané mozkové tkáně, sloupec je v rovnovážném stavu v 700 mM roztoku fosforečnanu draselného o pH 6,8. Po 5 promytí přibližně 40 ml téhož pufru je možno BDNF vymývat 0,1 M fosforečnanem draselným o pH 6,8 a pak je možno materiál dialyzovat proti destilované vodě a pak lyofilizovat. Lyofilizovaný materiál se pak rozpustí v pufru pro provádění elektroforézy na SDS-gelu s obsahem 0,1 % SDS, avšak s výhodou bez obsahu merkaptoethanolu a pak se vzorek nanese na SDS-gel s lineárním gradientem 10 až 25 % akrylamidu. Po ukončeném elektroforetickém dělení 10 je možno gel barvit přibližně 10 minut coomassieovou modří a pak 20 minut odbarvovat. Pás, který migruje na úrovni značení, provedeného cytochromem C je možno vyříznout a vymýt z gelu elektroforeticky. SDS je možno do značné míry odstranit podle Webera a Kutera (1971, J. Biol. Chem. 246:4504-4509). Je nutno uvést, že odstranění SDS obvykle není úplné. Čisticí postup pro stanovení řetězce BDNF byl modifikován podle Hofera a Bardeho (1988, Nátuře 15 331:261-262) a neužívá se při něm v posledním stupni čištění elektroforézy na gelu.

5.2. Biologické zkoušky BDNF

Podle vynálezu je ke zkouškám možno užít jakýkoliv systém, kterým je možno kvalitativně nebo 20 kvantitativně prokázat účinnost BDNF. Tímto způsobem lze identifikovat BDNF a/nebo měřit účinnost přírodního nebo rekombinantního BDNF.

Je možno použít jakékoliv známé biologické zkoušky na BDNF. Je například možno užít neuronů ganglií dorsálních kořenů kuřecích embryí (DRG), jak bylo popsáno v publikaci Barde a 25 další, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:1199-1203.

Při této zkoušce se například ganglia dorsálních kořenů 6 až 14 dnů starých kuřecích embryí, s výhodou ve stáří 10 až 12 dnů odeberou známým způsobem a okamžitě se uloží do malého objemu prostředí F14 (vyrobeného z práškového materiálu GIBCO F-12 podle Vogel a další, 30 1 972, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:3180-3184), toto prostředí se pak nahradí PBS, tj.

fysiologickým roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem, prostým vápenatých a hořečnatých iontů, s obsahem 0,1 % trypsinu. Po přibližně 20 minutách inkubace při teplotě 37 °C se ganglia odstředí a dvakrát se promyjí prostředím F14 s obsahem přibližně 10% objemových koňského séra, inaktivovaného teplem. Pak je možno ganglia od sebe oddělit 35 jemným rozetřením (přibližně 10 až 15 zdvihů při použití silikonizované Pasteurovy pipety s průměrem přibližně 1 mm. Zbývající shluky tkáně je pak možno odstranit s výhodou průchodem tkáně pře silonovou siť s otvory přibližně s průměrem 40 pm. Pak je možno suspenzi buněk předběžně pěstovat 210 minut ve tkáňové misce z plastické hmoty, v průběhu této doby přilnou buňky odlišné od neuronů k povrchu plastické hmoty a v suspenzi zůstanou buňky, 40 obohacené o neurony. Pak je možno buňky zředit na koncentraci přibližně 5 x 10³ buněk v 1 ml prostředí, s výhodou prostředí F14, doplněném 10 % objemovými koňského séra, inaktivovaného teplem a doplněného antibiotiky, načež se materiál uloží do misek pro tkáňové kultury, povlečených polyomithinem nebo s výhodou polyomithinem a lamininem.

V některých případech může být výhodnější použít systémy, které jsou citlivé na BDNF, avšak relativně necitlivé na NGF (svrchu uvedený systém DRG může být za určitých podmínek citlivý jak na BDNF, tak na NGF). Těmito poměrně specifickými systémy pro BDNF jsou retinální ganglia a kultury neuronů, odvozených od přední části nervového systému.

Perinatální retinální buňky je možno pěstovat způsobem, popsaným v publikaci Jahnson a další 1986, J. Neurosci. 6:3031-3038). Je například možno vyjmout sítnice z perinatálních živočichů (u krysy se pod pojmem „perinatální“ rozumí embrya po embryonálním dnu 17 až krysy do 48 hodin po vrhu), sítnice se promyjí ve fysiologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým

- 16CZ 285649 B6 pufrem (PBS), prostém vápenatých a horečnatých iontů a pak se inkubují v PBS s obsahem přibližně 0,05 až 0,1 % trypsinu přibližně 15 minut při teplotě 37 °C. Po proteolytickém štěpení je možno sítnice promýt v živném prostředí F14 s obsahem přibližně 10% objemových koňského séra, inaktivovaného teplem (F14-HS). Pak se sítnice opatrně rozruší pipetou v malém objemu (přibližně 1 až 10 ml (čerstvého F14-HS. Nedisociovaná tkáň se nechá usadit a zbývající buňky a živné prostředí se odpipetuje pro další pěstování.

K biologickým zkouškám na BDNF je možno užít také buňky z přední části nervového systému. Je například možno pěstovat explantáty embryonálních kraniálních nervů, například ventrolaterální části ganglia trojklanného nervu nebo ganglion vestibulare, geniculatum, petrosum nebo nodosum na kolagenovém gelu, převrstveném živným prostředím podle publikace Davies a další, 1986, J. Neurosci. 6:1897.1904 nebo v disociovaném stavu podle publikace Barde a další, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci USA 77: 1199-1203).

Vzhledem ktomu, že bylo pozorováno, že odpověď na BDNF je možno desetkrát zvýšit výměnou růstového substrátu z polyomithinu na směs lamininu a polyomithinu (Barde a další, 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189), provádějí se zkoušky na BDNF s výhodou na substrátech, obsahujících laminin. Povrchy pro pěstování je možno připravit například tak, že se

i) překryje povrch prostředí 8 až 10 hodin sterilním roztokem polyomithinu, ii) prostředí se několikrát omyje sterilní vodou, načež se iii) povrch prostředí na dvě hodiny převrství lamininem v koncentraci 25 pg/ml v PBS (Johnson a další, 1986, J. Neurosci. 6:3031-3038).

V jakémkoliv biologickém systému podle vynálezu je možno známým způsobem získat křivky závislosti účinku BDNF na jeho dávce. Při použití zkoušek na disociovaném sensorickém gangliu kuřete bylo možno pozorovat hodnotu, rovnou polovině maximálního přežití při koncentraci přibližně 5 ng/ml čištěného BDNF a maximální přežití bylo možno pozorovat při koncentraci 10 až 20 ng/ml čištěného BDNF (Barde a další, 1987, Prog. Brain Res. 71:185-189).

5.3. Stanovení řetězce BDNF ve formě bílkoviny

Řetězec bílkoviny BDNF, připravené z mozkové tkáně je možno analyzovat, je však nutno zdůraznit, že výjimečná vzácnost této bílkoviny způsobuje, že je velmi nesnadné skutečně zjistit složení podstatné části řetězce této bílkoviny. Řetězec je možno analyzovat přímo neboje možno jej na počátku rozštěpit jakoukoliv známou proteázou včetně trypsinu ze Staphylococcus aureus a bromkyanu. Řetězec peptidů je možno analyzovat automaticky Edmanovou degradací v plynné fázi způsobem podle publikace Hewick a další, 1981, J. Biol. Chem. 256:7990-7997 a Hunkapillar a další, 1983, Methods Enzymol. 91:227-236. Detekci aminokyselin s použitím fenylthiohydantoinu je pak možno provést způsobem podle publikace Lottspeich, 1985, Chromatography 236:321-327. Je možno prokázat překrývající se řetězce aminokyselin a použít k dedukci delších řetězců.

5.4. Klonování kódové DNA pro BDNF

Vzhledem ke vzácnosti výskytu BDNF není možno použít pro klonování genu pro tuto látku standardních postupů. Například v případě, že se užije dostupný řetězec bílkoviny ke konstrukci komplementární značené oligonukleotidové sondy a tato sonda se použije k vyšetření sestav cDNA ze tkání, o nichž se předpokládá, že v nich dochází k syntéze BDNF, bude počet pozitivních klonů patrně mizivě malý. Vynález však umožňuje klonování genu pro BDNF kombinací postupů, které zahrnují čištění vhodných množství BDNF, stanovení řetězce této

- 17CZ 285649 B6 látky, konstrukci oligonukleotidové sondy, konstrukci sestavy cDNA, amplifikaci na bázi odvozeného řetězce aminokyselin BDNF a konečně selekci genu BDNF. Při provádění tohoto postupu se jako výhodného postupu pro amplifikaci užívá amplifíkace nukleových kyselin z tkání pomocí PCR (Saiki a další, 1985, Science 230:+350-1354, aby bylo možno získat dostatečné množství molekul BDNF pro klonování. Dále bude způsob podle vynálezu podrobněji popsán.

Nejprve je možno užít řetězec aminokyselin, odvozený od čištěné bílkoviny BDNF k odvození oligonukleotidových primerů pro použití při PCR. Vzhledem k degeneraci genetického kódu, při níž mohou různé triplety nukleových kyselin být kódem pro tutéž aminokyselinu je nutno synthetizovat celou řadu oligonukleotidů pro daný řetězec aminokyselin aby bylo možno získat řadu potenciálních kombinací oligonukleotidových řetězců. Výsledné oligonukleotidy se označují jako degenerované primery.

Při provádění PCR je nutno použít jak mediátorové, tak nemediátorové primery. Degenerovaný oligonukleotidový primer, odpovídající řetězci aminokyselin BDNF je možno užít jako primer pro jeden řetězec DNA a druhý primer, homologní s běžně se vyskytujícím řetězcem DNA, například vznikající při reversní transkripci polyadenosinového zakončení mRNA je možno užít jako primer pro druhý řetězec DNA. Tyto primery se pak použijí pro PCR spolu stemplátem nukleové kyseliny, o němž se předpokládá, že obsahuje kódový řetězec pro BDNF, například DNA genomu nebo s výhodou cDNA, připravenou z mRNA ze tkáně, pravděpodobně syntetizující BDNF. Produkty této reakce se pak analyzují elektroforézou, aby bylo možno stanovit, zda reakční produkt má rozměr, odpovídající předpokládanému rozměru genu pro BDNF a s výhodou se provádí analýza řetězce.

Vzhledem k použití dvou degenerovaných primerů se však při provádění PCR zvyšuje pravděpodobnost amplifíkace řetězců nukleových kyselin, které nejsou kódem pro BDNF, takže výhodný je postup, při němž se užívá pouze jednoho degenerovaného primerů a druhý primer odpovídá přesně řetězci BDNF. Aby bylo možno přesně identifikovat řetězec BDNF, je možno užít řetězec aminokyselin, který byl zjištěn při použití čištěného BDNF ke konstrukci degenerovaného mediátorového i nemediátorového primerů. Produkt reakce při použití těchto primerů při PCR a při použití nukleové kyseliny, která je kódem pro BDNF jako templátu by měl být fragment nukleové kyseliny, který je kódem pro aminokyseliny, užité při konstrukci primerů a měl by mít předpokládaný rozměr v párech bází. Analýzou řetězce tohoto reakčního produktu a srovnáním zjištěného řetězce aminokyselin je možno potvrdit, že amplifikovaný řetězec nukleové kyseliny je ve skutečnosti kódem pro peptidový fragment BDNF. Přestože je možno k analýze řetězce nukleových kyselin použít jakýkoliv známý postup, je výhodné užít postup s využitím terminačního postupu dideoxynukleotidového řetězce (Sanger a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci USA 72: 3918-3921). Analýzu řetězce je možno provést při použití reakčního produktu, čištěného na gelu nebo s výhodou klonovaného reakčního produktu. Řetězec reakčního produktu je pak možno použít ke konstrukci oligonukleotidového primerů, který odpovídá přesnému řetězci, který je kódem pro BDNF. Tento primer je pak možno použít spolu s druhým primerem, který může být degenerovaný, aby bylo možno zvýšit množství nukleotidů v řetězci pro BDNF nad nukleotidy, representované fragmentem řetězce, kteiý byl přesně stanoven na počátku postupu. Mediátorový primer může například přesně odpovídat nukleotidovému řetězci pro BDNF, zatímco nemediátorovým řetězcem může být degenerovaný primer, homologní k oblasti řetězce, která pravděpodobně je uložena směrem k polyadenosinovému zakončení mRNA, k jejíž reversní transkripci dochází do cDNA. Pak může být nutné použít podobného postupu ke zjištění řetězce na druhé straně od prokázaného fragmentu. Například může nemediátorový primer přesně odpovídat nukleotidovému řetězci pro BDNF a mediátorový primer může být degenerovaný primer, homologní k oblasti řetězce BDNF směrem k 5'-polyadenosinovému zakončení, přidanému na 5'-zakončení cDNA při použití terminální deoxynukleotidtransferázy. Obdobným způsobem je možno sestavit celý řetězec genu nebo mRNA pro BDNF.

-18CZ 285649 B6

Reakční produkty DNA je možno klonovat jakýmkoliv známým způsobem. Je možno použít celou řadu systémů vektor-hostitel. Vhodnými vektory jsou například kosmidy, plasmidy nebo modifikované viry, avšak je zapotřebí, aby vektorový systém byl kompatibilní s užitou hostitelskou buňkou. Tyto vektory zahrnují například bakteriofágy jako deriváty bakteriofágu lambda nebo plasmidy jako pBR322, pUC nebo plasmid Bluescript (Stratagene). Rekombinantní molekuly je možno do hostitelské buňky uložit transformací, transfekcí, infekcí, otevřením pórů působením elektrického proudu a podobně.

Gen pro BDNF se uloží do vektoru pro klonování, který je možno užít k transformaci, transfekci nebo infekci příslušných hostitelských buněk tak, aby vzniklo velké množství kopií řetězce genu. Toho je možno dosáhnout tak, že se fragment DNA uloží do vektoru pro klonování s komplementárními kobesivními zakončeními. Avšak v případě, že nejsou k dispozici komplementární štěpná místa pro restrikční enzymy, užitá k fragmentaci DNA ve vektoru pro klonování, je možno zakončení DNA chemicky modifikovat. Může být výhodné uložit místa působení restrikčních enzymů do oligonukleotidových primerů, užitých při reakci PCR k usnadnění uložení do vektoru. Je také možno zkonstruovat na zakončeních DNA jakékoliv štěpné místo navázáním vazných nukleotidových řetězců. Tyto řetězce mohou být tvořeny specifickými chemicky synthetizovanými oligonukleotidy, které jsou kódem pro řetězce s obsahem štěpných míst, rozpoznávaných určitými endonukleázami. Rozštěpený vektor a gen pro BDNF je také možno modifikovat konstrukcí homopolymemích zakončení.

Ve specifických provedeních může umožnit transformace hostitelských buněk rekombinantní molekulovou DNA, s obsahem izolovaného genu pro BDNF, cDNA nebo synthetizovaný řetězec DNA tvorbu mnohočetných kopií tohoto genu. V tomto případě je pak možno získat gen ve velkém množství pěstováním transformantů s následnou izolací rekombinantních molekul DNA z těchto transformantů, načež je popřípadě možno opět vyjmout uložený gen z izolované rekombinantní DNA.

Podle výhodného provedení vynálezu je možno postupovat tak, že jakmile dojde k získání klonu, odvozeného od cDNA a kódujícího BDNF, je možno izolovat klon genomu, který je kódem pro BDNF při použití standardních postupů, které jsou v oboru známy. Je například možno odvodit od BDNF značenou sondu nukleové kyseliny a tuto, od uvedeného klonu odvozenou nukleovou kyselinu použít k vyšetření sestav DNA genomu hybridizací nukleových kyselin například způsobem, popsaným v publikaci Benton a Davies, 1977, Science 196:180 pro případ sestav bakteriofágu a podle publikace Grunstein a Hogness, 1975, Proč. Nati. Acad. Sci USA 72: 3961— 3965 pro sestavy plasmidu. Izolované klony je pak možno analyzovat zjištěním štěpných míst pro restrikční enzymy a analýzou řetězce. Tyto analýzy je možno provést standardními postupy.

Mimoto je také možno ze sestavy cDNA identifikovat další klony cDNA při použití řetězců, získaných způsobem podle vynálezu.

5.5. Exprese genu, který je kódem pro neurotrofní faktor, odvozený od mozkové tkáně

Řetězec nukleotidů, který je kódem pro BDNF nebo jeho část je možno uložit do vhodného vektoru pro expresi, tj. pro thymidinkinázu viru herpesu (Wagner a další, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci USA 78: 1444-1445), řídicí řetězec metallothioninového genu (Brinster a další, 1982, Nátuře 296: 39—42), prokaryotické vektory pro expresi, například promotor beta-laktamázy (VillaKomaroff a další, 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) nebo tac-promotor (DeBoer a další, 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25), souhrn je možno nalézt například v publikaci „Useful proteins from rekombinant bacteria“, Scientific Američan, 1980: 242: 7494. Dále je možno užít vektoru pro expresi v rostlinách s obsahem promotoru pro nopalinsynthetázu (Herrera-Estrella a další, Nátuře 303: 209-213) nebo promotor RNA 35S viru mosaiky květáku (Gardner a další, 1981, Nucl. Acids, Res. 9: 2871) a promotor pro

- 19CZ 285649 B6 fotosynthetický enzym ribulozobifosfátkarboxylátu (Hererra-Estrella a další, 1984, Nátuře 310: 115-120), promotorové prvky z kvasinek nebo jiných hub jako promotor Gal 4, ADC promotor (pro alkoholdehydrogenázu) pro motor PGK (pro fosfoglycerolkinázu), promotor pro alkalickou fosfatázu a následující živočišné oblasti pro řízení transkripce, které jsou specifické pro určité tkáně a byly užity v případě transgenních živočichů: řídicí oblast genu pro elastázu I, která je účinná v pankreatických buňkách (Swift a další, 1984, Cell 38:639-646, Omitz a další, 1986, Cold Spring Haarbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409, MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425515), dále řídicí oblast genu pro insulin, která je účinná v pankreatických beta-buňkách (Hanahan, 1985, Nátuře 315:115-122) řídicí oblast genu pro imunoglobulin, která je účinná v lymfoidních buňkách (Grosschedl a další, 1984, Cell 38:647-658, Adames a další, 1985, Nátuře 318-533-538, Alexander a další, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-14444), řídící oblast viru nádoru mléčné žlázy u myší, která je účinná u buněk varlat, mléčné žlázy, lymfoidních a tukových buňkách (Leder a další, 1986, Cell 45:485-495), řídicí oblast genu pro albumin, která je účinná v jatemích buňkách (Pinkert a další, 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), řídicí oblast genu pro alfa-fetoprotein, který je účinný v játrech (Krumlauf a další, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648), Hammer a další, 1987, Science 235:53-58), řídicí oblast genu pro 1-antitrypsin, která je účinná v játrech (Kelsey a další, 1987, Genes and Devel. 1:161-171), řídicí oblast genu pro beta-globin, která je účinná v myeloidních buňkách (Mogram a další, 1985, Nátuře 315:338— 340, Kollias a další, 1986, Cell 46:89-94), řídicí oblast pro gen základní bílkoviny myoglobinu, která je účinná v oligodendrocytech (Readhead a další, 1987, Cell 48:703-712) řídicí oblast pro lehký řetězec 2 myosinu, která je účinná v kosterním svalu (Sani, 1985, Nátuře 314:283-286) a řídicí oblast genu pro uvolňování gonadotropinu, která je účinná v hypothalamu (Mason a další, 1986, Science 234:1372-1378).

Vektoiy pro expresi, které obsahují včleněný gen pro BDNF je možno identifikovat třemi zásadními postupy:

a) hybridizaci DNA-DNA,

b) přítomnost nebo nepřítomností „značícího“ genu a

c) podle exprese včleněných funkcí.

Při prvním z těchto postupů je možno zjistit přítomnost cizorodého genu, včleněného do vektoru pro expresi hybridizaci DNA-DNA při použití sond, které obsahují řetězce, homologní s včleněným genem BDNF. Při druhém z těchto postupů se identifikuje a podrobí selekci systém rekombinantního vektoru a hostitele na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti určitého „značícího“ genu a jeho funkcí (například může jít o účinnost thymidinkinázy, odolnost proti antibiotikům, transformaci fenotypu, tvorbu oklusních tělísek u baculoviru apod.). Tyto funkce jsou způsobeny včleněním cizorodého genu do vektoru. Například v případě, že se gen pro BDNF uloží do značícího genu ve vektoru, je možno rekombinanty, které jej obsahují identifikovat podle ztráty funkce, odpovídající funkci značícího genu. Při třetím postupu je možno identifikovat rekombinantní vektory pro expresi podle exprese cizorodého genu v rekombinantní buňce. Tyto postupy mohou být založeny například na fysikálních nebo funkčních vlastnostech produktu genu BDNF v systému pro biologické zkoušky.

Jakmile je určitá rekombinantní molekula DNA identifikována a izolována, je možno k její propagaci užít několika postupů. Jakmile dojde ke stabilizaci systému hostitele a růstových podmínek, je možno připravit rekombinantní vektoiy ve větším množství. Jak již bylo vysvětleno, je možno jako vektory užít například následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo jiné živočišné viry jako jsou virus vaccinia nebo adenovirus, viry hmyzu, například baculovirus, vektory z kvasinek, z bakteriofágů (například lambda) a DNA plasmidů a kosmidů, a podobně.

-20CZ 285649 B6

Mimoto je možno volit kmen hostitelských buněk, který mění expresi uloženého řetězce nebo modifikuje a zpracovává produkt genu specifickým způsobem. Expresi některých promotorů je možno zvýšit za přítomnosti některých induktorů. Tímto způsobem je možno řídit expresi geneticky pozměněného NT-3. Mimoto byly charakterizovány různé hostitelské buňky a 5 specifické mechanismy pro translační a posttranslační zpracování a modifikaci, například jako jsou glykosylace a odštěpení bílkovin. Je možno volit příslušné buněčné linie nebo systémy hostitelů k zajištění požadované modifikace a zpracování cizorodé bílkoviny. Je například možno použít exprese v bakteriálním systému k získání neglykosylovaného bílkovinného produktu. Exprese v kvasinkách poskytne glykosylovaný produkt. Expresi v buňkách savců je možno 10 využít k zajištění „nativní“ glykosylace heterologního BDNF. Mimoto je možno zajistit vhodnou volbou různých vektorů a hostitelů pro expresi zpracování výsledného produktu, například proteolytické štěpení v různém rozsahu.

Ve specifickém provedení je možno klonovat DNA, která je kódem pro prepro BDNF v plasmidu 15 pCMV, amplifikovat a pak použít ktransfekci buněk COS při použití fosforečnanu vápenatého (Chen a Okayama 1987, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752), BDNF je pak možno izolovat z živného prostředí, jak je popsáno v příslušných odstavcích oddílu 10.

5.5.1. Identifikace a čištění produktu genu po jeho expresi

Jakmile dojde u rekombinanty k identifikaci exprese genu pro BDNF, je možno produkt genu analyzovat. Toho je možno dosáhnout zkouškami, založenými na fysikálních nebo na funkčních vlastnostech produktu.

Jakmile došlo k identifikaci BDNF ve formě bílkoviny, je možno tuto bílkovinu izolovat a čistit obvyklými způsoby včetně chromatografie (například na iontoměniči, afinitní chromatografie, chromatografie pro dělení molekul podle jejich velikosti apod.), odstředěním, diferenciální rozpustností nebo jakýmkoliv jiným známým způsobem pro čištění bílkovin. Funkční vlastnosti je možno vyhodnotit jakoukoliv známou zkouškou na BDNF včetně použití ganglií dorsálních 30 kořenů kuřecího embrya, retinálních buněk krysy v perinatálním období nebo neuronů, odvozených od přední části nervové soustavy.

Postupy, užité k získání BDNF z mozkové tkáně, zahrnují jako konečný stupeň preparativní chromatografii na gelu a z tohoto důvodu poskytují BDNF, který není zcela účinný vzhledem 35 k tomu, že obsahuje residuální SDS (Barde a Thoenen, 1985, „Hormones and Cell Regulation“,

Sv. 9, Dumont a další, Elsevier Science Publishers, str. 385-390). Naproti tomu dovoluje vynález izolaci BDNF, který je získán z rekombinantních molekul nukleových kyselin, je prostý SDS a je proto plně účinný. Je například možno užít protilátek podle vynálezu proti BDNF (například protilátky proti fragmentu aminokyselin B5-33 z BDNF vepře, tak jak jsou popsány 40 v odstavci 11) k izolaci BDNF pomocí imunoprecipitace nebo pomocí afinitní chromatografie za získání plně účinného BDNF, prostého smáčedla.

V dalším provedení vynálezu je možno převést preproBDNF enzymaticky na účinný úplný BDNF, například při použití endoproteinázy Arg-C (odstavec 17).

5.6. Geny pro neurotrofní faktor, odvozené od mozkové tkáně a odvozené bílkoviny

Při použití svrchu uvedených postupů a postupů, uvedených v příkladech v odstavcích 6 a 9 bylo možno stanovit dále uvedené řetězce nukleových kyselin a od nich odvozené řetězce 50 aminokyselin. Řetězec cDNA pro BDNF vepře je znázorněn na obr. 1. Byla také stanovena cDNA lidského genomu, která je znázorněna na obr. 5, kde jsou také znázorněny řetězce DNA pro faktor vepře, krysy a kuřete. Každý z těchto řetězců nebo jeho funkční ekvivalenty je možno použít ve smyslu vynálezu. Mimoto se vynález týká rovněž genů a odpovídajících bílkovinných faktorů BDNF z dalších zdrojů, například vepře, skotu, koček, ptáků, koní nebo psů a také

-21 CZ 285649 B6 primátů a jakýchkoliv dalších živočišných druhů, u nichž existují faktory s účinností BDNF. Vynález se týká také úseků řetězců nukleových kyselin pro BDNF, které obsahují alespoň 10 nukleotidů a současně obsahují hybridizovatelné úseky řetězce BDNF, které je možno užít například při hybridizaci nukleových kyselin, při analýze Southem blot a Nothem blot a podobně. Vynález rovněž poskytuje bílkovinu BDNF a její fragmenty a deriváty, odpovídající řetězci aminokyselin z obr. 1 a 5 nebo jejich funkční ekvivalenty. Vynález rovněž poskytuje fragmenty nebo deriváty bílkovin BDNF s antigenními determinantami nebo s funkční aktivitou. Funkční aktivita znamená pozitivní výsledek při zkouškách na funkci BDNF, například při zkouškách s DRG kuřecího embrya.

Řetězec nukleových kyselin, znázorněný na obr. 1 a 5 je možno pozměnit substitucí, přidáním nebo vypuštěním některých nukleotidů za vzniku funkčně ekvivalentních molekul. Vzhledem k degeneraci kódových nukleotidových řetězců, které jsou kódem pro týž řetězec aminokyselin, jaký je znázorněn na obr. 1 a 5 je možno tyto řetězce v praxi užít. Jde například o řetězce nukleotidů, které obsahují celý řetězec nebo část řetězce z obr. 1 a 5, tento řetězec je však pozměněn substitucí různých kodonů tak, že tyto odlišné kodony jsou kódem pro funkčně ekvivalentní aminokyseliny v řetězci, takže běží o tichou změnu. Odpovídajícím způsobem spadají do pojmu BDNF, jeho fragmentů nebo jeho derivátů řetězce s obsahem řetězce aminokyselin z obr. 1 a 5 nebo jeho fragmentu, přičemž některé zbytky aminokyselin mohou být nahrazeny funkčně ekvivalentními zbytky aminokyselin, takže opět vzniká tichá změna. Je například možno vyměnit jednu nebo větší počet aminokyselin v řetězci za jinou aminokyselinu s podobnou polaritou, která působí jako funkční ekvivalent. Zbytky aminokyselin, užité k náhradě určitého zbytku aminokyselin se vždy volí z dalších členů skupiny aminokyselin, do níž příslušná aminokyselina náleží. Nepolárními (hydrofobními) aminokyselinami jsou například alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Polární neutrální aminokyseliny zahrnují glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Aminokyseliny s pozitivním nábojem (bazické) jsou arginin, lysin a histidin. Negativně nabité (kyselé) aminokyseliny jsou kyselina asparagová a glutamová. Vynález zahrnuje také bílkoviny typu BDNF, jejich fragmenty a jejich deriváty, které jsou různě modifikovány v průběhu translace nebo po ní, například glykosylací, štěpením bílkoviny proteolytickými enzymy, vazbou na molekulu protilátky nebo jiný buněčný ligand apod.

Mimoto může být daný typ BDNF podroben mutacím in vitro nebo in vivo tak, aby vznikly a/nebo byly odstraněny řetězce pro translaci, iniciaci a terminaci nebo aby vznikly změny v kódové oblasti a/nebo ke vzniku nových míst působení restrikčních endonukleáz nebo ke zrušení míst existujících, aby bylo možno usnadnit modifikaci in vitro. Je možno užít jakýkoliv typ cílené mutagenese in vitro (Hutchinson a další, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), použití vazných řetězců TAB (Pharmacia) apod.

5.7. Tvorba protilátek proti neurotrofhímu faktoru, odvozenému od mozkové tkáně (BDNF)

Podle vynálezu je možno užít BDNF ve formě bílkoviny, jejích derivátů nebo jejích fragmentů jako imunogenní sloučeninu, která vyvolává tvorbu protilátek proti BDNF. Dříve prováděné pokusy vyvolat imunologickou odpověď proti BDNF byly neúspěšné, pravděpodobně proto, že bylo dosažitelné jen velmi malé množství čištěného BDNF. Jakmile je k dispozici poměrně značné množství bílkoviny BDNF při použití rekombinantní techniky pro syntézu bílkovin (na základě řetězce nukleových kyselin pro BDNF podle vynálezu) je uvedený problém, spojený s nedostatkem BDNF překonán.

Aby bylo možno zvýšit pravděpodobnost tvorby imunologické odpovědi na podání BDNF, je možno analyzovat řetězec aminokyselin této látky k identifikaci částí molekuly, které mohou být spojeny se zvýšenou imunogenitou. Je například možno podrobit řetězec aminokyselin analýze na počítači k identifikaci povrchových epitopů způsobem podle publikaci Hopp a Woods, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78:3824-3828, tento postup byl úspěšně použit k identifikaci

-22CZ 285649 B6 antigenních peptidů povrchového antigenu viru hepatitidy B. Je také možno srovnávat dedukované řetězce aminokyselin pro BDNF z různých druhů a identifikovat relativně nehomologní oblasti, tyto oblasti totiž budou pravděpodobně imunogenní u různých druhů.

Pro přípravu monoklonálních protilátek proti BDNF je možno užít jakýkoliv postup pro produkci protilátek kontinuální buněčnou linií v kultuře. Může být užita například technika s použitím hybridomu, původně publikovaná v Kohler a Milstein, 1975, Nátuře 256: 495-497 nebo technika triomu, lidského hybridomu buněk B (Kozbor a další, 1983, Immunology Today 4: 72) a technika s použitím EBV-hybridomu k tvorbě lidských monoklonálních protilátek (Cole a další, 1985, „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy“, Alan R. Liss, lne., str. 77-96) a další postupy, které rovněž spadají do oboru vynálezu.

Monoklonální protilátky pro léčebné použití mohou být lidské monoklonální protilátky nebo chimémí protilátky člověk-myš (nebo jiný druh). Lidské monoklonální protilátky je možno získat řadou způsobů, které jsou v oboru známy (Teng a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:7308-7312, Kozbor a další, Immunology Today 4: 72-79, Olsson a další, 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Chimémí molekuly protilátek je možno připravit tak, aby obsahovaly myší antigen, vázaný na lidskou konstantní oblast (Morrison a další, 1984, proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851, Takeda a další, 1985, Nátuře 314:452).

Pro tvorbu monoklonálních protilátek proti epitopům BDNF je možno užít různých postupů. Ke tvorbě protilátky je možno imunizovat různé živočichy injekční BDNF, může jít například o králíky, myši, krysy apod. Je také možno užít různých pomocných látek ke zvýšení imunologické odpovědi v závislosti na živočišném druhu, může jít například o Freundovo úplné nebo neúplné pomocné činidlo, o minerální gely, jako hydroxid hlinitý, smáčedla jako lysolecithin, polyoly typu pluronic, polyanionty, peptidy, olejové emulse, hemocyaniny, dinitrofenol a potenciálně účinné pomocné látky lidského původu jako BCG (Bacillus Calmette-Guérin) a Corynebacterium parvum.

Molekulární klon protilátky proti BDNF-epitopu je možno připravit známým způsobem. Je možno užít postupů s využitím rekombinantní DNA (Maniatis a další, 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) ke konstrukci řetězců nukleových kyselin, které jsou kódem pro molekulu monoklonální protilátky nebo pro její oblast pro vazbu antigenu.

Molekuly protilátek je možno čistit známými postupy, jako imunoabsorpcí nebo imunoafinitní chromatografíí, dalšími chromatografíckými postupy jako je vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) nebo kombinace těchto postupů apod.

Fragmenty protilátek, které obsahují idiotyp molekuly je možno také získat známými postupy. Těmito fragmenty jsou například: fragment F(ab')₂, který je možno získat štěpením molekuly protilátky působením pepsinu, fragmenty Fab', které je možno vytvořit redukcí disulfídových můstků ve fragmentu F(ab')₂ a fragmenty 2 Fab nebo Fab, které je možno získat tak, že se na molekulu protilátky působí papainem a redukčním činidlem.

V odstavci 11 se popisuje příprava polyklonálních antisér proti fragmentu B5-33 bílkoviny BDNF.

5.8. Identifikace dalších členů skupiny genů BDNF/NGF

Analýza kódového řetězce genu pro BDNF a odvození jeho řetězce aminokyselin prokázalo, že tato bílkovina je strukturně velmi příbuzná NGF (Obr. 2). Podle řetězce úplného BDNF a podle jeho obecné struktury a pravděpodobného způsobu zpracování z prekursorové bílkoviny je

-23CZ 285649 B6 možno mít za to, že geny pro NGF a BDNF se vyvíjely ze společného původního genu. V případě, že se zavedou do řetězce NGF pouze tři přerušení k usnadnění srovnání obou řetězců je zřejmé, že celkem 51 aminokyselin je společných dříve známým NGF z řady druhů a BDNF člověka a vepře. Tyto totožné aminokyseliny zahrnují všech šest cysteinových zbytků, což napovídá, že NGF a BDNF mají velmi podobnou sekundární strukturu. Mimoto je možno prokázat čtyři úseky s obsahem šesti nebo většího počtu aminokyselinových zbytků, v nichž jsou NGF z uvedených zdrojů a BDNF vepře buď totožné, nebo se liší pouze jednou konservativní substitucí zbytku aminokyseliny. Z těchto pozorování je možno uzavřít, že NGF a BDNF jsou blízce příbuznými členy téže skupiny genů.

Vyhledávání dalších členů skupiny genů BDNF/NGF je možno provést tak, že se využije nepředpokládané existence konservovaných segmentů se silnou homologii mezi NGF a BDNF. Je například možno identifikovat další členy skupiny genů BDNF selekcí, z různých řetězců nukleových kyselin, které jsou homologní NGF a BDNF, další sloučeniny je možno identifikovat z řetězců, které nejsou homologní NGF ani BDNF. Pod pojmem „nehomologní“ se rozumí oblasti, které obsahují alespoň 6 po sobě jdoucích nukleotidů, z nichž alespoň dva nukleotidy jsou odlišné od řetězce NGF a BDNF.

Ve výhodném provedení vynálezu je možno synthetizovat jako sondy skupiny degenerovaných oligonukleotidů s obsahem alespoň 18 nukleotidů, které odpovídají čtyřem konservovaným segmentům, „boxům“ tak, jak jsou dále uvedeny v tabulce ΙΠ. Tyto oligonukleotidy representují všechny možné kódové řetězce pro aminokyseliny, které se nacházejí v šesti po sobě následujících kodónech NGF nebo BDNF. V případě, že se počítá od aminoterminálního zakončení úplného polypeptidu (takže Hisl34 preproBDNF je Hisl úplné bílkoviny), je možno charakterizovat uvedené čtyři boxy následujícím způsobem (počítáno vzhledem k úplné bílkovině lidského původu, DNA podle obr. 1):

Tabulka III

Řetězec DNA

Box 1:	NGF BDNF	Gly 10- Ser 19 Gly8-Serl7	587-616
Box 2:	NGF	Lys50-Cys58
	BDNF	Lys50 - Cys58	713-739
Box 3:	NGF	Gly67-Asp72
	BDNF	Gly67-Asp72	764-781
Box 4:	NGF	Trp99-Cysll0
	BDNF	TrplOO-Cyslll	863-898

Synthetické oligonukleotidy, odvozené od párů řetězců, uvedených v boxech v tabulce ΠΙ je možno využít jako primery k amplifikaci PCR řetězců ze zdroje potenciálního zájmu (RNA nebo DNA). Může jít o mRNA nebo cDNA nebo o DNA genomu z jakéhokoliv eukaryotického druhu organismu, u nějž může dojít k expresi polypeptidu, blízce příbuznému BDNF nebo NGF. Provedením pouze šesti PCR reakcí (a to: při použití primeru z boxu 1 s primerem z boxu 2, primeru z boxu 1 s primerem z boxu 3, primeru z boxu 1 s primerem z boxu 4, primeru z boxu 2 s primerem z boxu 3, primeru z boxu 2 s primerem z boxu 4 a primeru z boxu 3 s primerem z boxu 4) je možno prokázat gen nebo produkt genu, jemuž jsou společně kterékoliv dva ze svrchu uvedených čtyř konservovaných úseků mezi NGF a BDNF. V případě, že se synthetizuje několik různých degenerovaných primerů pro každý box, může být stále ještě možné provést úplný průzkum při poměrně malém počtu PCR-reakcí. Je také možno měnit přísnost

-24CZ 285649 B6 hybridizačních podmínek a tím zajistit průkaz většího nebo menšího stupně podobnosti nukleotidového řetězce mezi neznámým genem a NGF nebo BDNF. V případě, že dojde k úspěšné amplifíkaci segmentu předem neznámé látky ze skupiny NGF/BDNF, je možno tento segment podrobit molekulárnímu klonování a stanovení řetězce a využít jej jako sondu k izolaci úplné cDNA nebo klonu genomu. To opět umožní stanovení úplného řetězce nukleotidů v neznámém genu, analýzu jeho exprese a produkci jeho bílkovinného produktu pro funkční analýzu.

Svrchu uvedený přístup byl použit k identifikaci nového genu, příbuzného jak NGF, tak BDNF, tak, jak bude dále popsáno v odstavci 13.

Mimoto umožňuje vynález na základě homologií řetězce NGF a BDNF konstrukci nových rekombinantních molekul, které náleží do skupiny genů NGF/BDNF, avšak nemusí se přirozeně vyskytovat. Je například možno zkonstruovat rekombinantní molekulu podle vynálezu, obsahující části genů NGF i BDNF. Taková molekula by mohla mít vlastnosti, odpovídající NGF i BDNF a měla by tedy zcela nový profil biologické účinnosti, a to pokud jde o látky s obdobným účinkem i pokud jde o antagonisty. Primární řetězec BDNF a NGF je rovněž možno užít k předpovědi terciární struktury molekuly při použití simulace počítačem (Hopp a Woods, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78 : 3824—3828). Chimémo rekonbinantní geny BDNF/NGF by mohly být konstruovány podle korelace mezi terciární strukturou a biologickou funkcí. Je také možno konstruovat chimémí geny s obsahem částí jakéhokoliv počtu členů skupiny genů NGF/BDNF včetně nových členů skupiny, které budou dále popsány v odstavci 13.

5.9. Využití vynálezu

Vynález se týká řetězce nukleových kyselin pro BDNF, v podstatě čistého BDNF ve formě bílkoviny, peptidových fragmentů nebo derivátů z nich odvozených. Poprvé je tak možno získat BDNF v množstvích, dostatečných pro diagnostické a léčebné použití. Rovněž je poprvé možno získat protilátky proti BDNF, nukleové kyseliny jako sondy pro BDNF, které je možno využít pro diagnostické a léčebné účely. Pro většinu účelů je výhodné použít geny pro BDNF nebo produkty genu téhož druhu jak k diagnostickým, tak k léčebným účelům, přestože je ve specifických provedením může být užitečné i použití BDNF z jiného druhu.

5.9.1. Diagnostické použití

Vynález, týkající se nukleových kyselin, které jsou kódem pro BDNF, čistého BDNF ve formě bílkoviny, jejích peptidových fragmentů a jejích derivátů a také protilátek proti BDNF, jeho peptidovým fragmentům a jeho derivátům je možno využít k diagnóze onemocnění a poruch nervového systému, které mohou být spojeny s poruchami exprese této látky.

V různých provedeních vynálezu je možno užít BDNF, geny pro BDNF a příbuzné řetězce nukleových kyselin i části těchto řetězců a příbuzné řetězce včetně řetězců komplementárních k diagnostickým hybridizačním zkouškám. Řetězce nukleových kyselin pro BDNF nebo části těchto řetězců s obsahem přibližně 15 nukleotidů je možno užít jako hybridizační sondy. Hybridizační zkoušky je možno použít ke zjištění, prognóze, diagnóze, zjištění stavu, poruchy nebo pokročilosti onemocnění, spojeného se změnami v expresi BDNF včetně například stavů, které jsou výsledkem poškození sensorických neuronů. Tyto nemoci a stavy zahrnují například poškození CNS, infarkt, infekce, degenerativní nervová onemocnění, zhoubná onemocnění, postoperativní změny, Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu nebo Huntingtonovu chorobu. Je například možno zkoumat vzorek úplné RNA ve vzorku tkáně nemocného na přítomnost mRNA pro BDNF, přičemž zjištěná změna v množství mRNA pro BDNF je ukazatelem degenerace neuronů.

-25CZ 285649 B6

V dalších různých provedeních vynálezu je možno užít protilátky proti BDNF, jeho peptidovým fragmentům, nebo jeho derivátům k diagnóze onemocnění a poruch nervového systému, včetně sensorických poruch a degenerativních chorob sítnice, stejně jako k diagnóze svrchu uvedených onemocnění. Protilátky podle vynálezu je možno například užít při hybridizačních postupech in šitu při použití vzorků tkání z nemocného, u nějž je toto vyšetření nutno provést. Dalším příkladem je možné použití protilátek podle vynálezu při zkoušce ELISA k detekci a/nebo kvantitativnímu stanovení množství BDNF ve tkáních nebo vzorcích tělesných tekutin. Podobně je možno protilátky podle vynálezu využít při zkoušce Western blot k detekci a/nebo kvantitativnímu stanovení BDNF ve tkáních nebo ve vzorcích tekutiny.

V dalších provedeních vynálezu je možno použít BDNF jeho peptidové fragmenty nebo deriváty k diagnóze onemocnění a poruch nervového systému. Ve zvláštním provedení je možno použít BDNF nebo jeho peptidové fragmenty k identifikaci tkání nebo buněk, u nichž dochází k expresi receptoru BDNF, aby bylo možno identifikovat aberance v expresi tohoto receptoru a v důsledku toho i potenciální abnormality tkáňové nebo buněčné odpovědi na BDNF.

5.9.2 Léčebné použití

Vynález, který se týká nukleových kyselin, které jsou kódem pro BDNF, jeho peptidových fragmentů nebo jeho derivátů a také protilátek proti BDNF, jeho peptidovým fragmentům nebo jeho derivátům je možno využít k léčbě onemocnění a poruch nervového systému, spojených s poruchami exprese BDNF, nebo které by bylo možno příznivě ovlivnit přívodem BDNF nebo protilátek proti BDNF.

V různých provedeních vynálezu je možno podávat BDNF jeho peptidové fragmenty nebo jeho deriváty nemocným, jejichž nervový systém byl porušen úrazem, chirurgickým zákrokem, ischemií, metabolickou chorobou, nedostatky ve výživě, zhoubným onemocněním nebo toxickými látkami. V různých specifických provedeních je možno BDNF podávat místně na sensorické neurony, které jsou porušeny, jde například o neurony dorsálních ganglií míšních kořenů nebo o jakoukoliv z následujících tkání: ganglion geniculatum, petrosum nebo nodosum, vestibuloakustický komplex VIII hlavového nervu, ventrolaterální pól maxillo-mandibulámího laloku ganglia trojklanného nervu, mesenoephalické jádro pro trigeminus a ganglia sympatiku. Může být žádoucí podat BDNF nebo příbuzné peptidy vstřebáním z membrány, na niž jsou adsorbovány, může jít například o silastickou membránu, kterou je možno implantovat do blízkosti poškozeného nervu. Vynález je možno užít i k urychlení rekonvalescence nemocných s diabetickými neuropatiemi, jakoje mononeuropatie multiplex a diabetická periferní neuropatie.

V dalším provedení vynálezu je možno užít BDNF ve formě bílkoviny, peptidových fragmentů nebo derivátů k léčbě kongenitálních stavů nebo neurodegenerativních poruch včetně například Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby, syndromu Parkinson-Plus, při němž symptomy Parkinsonovy choroby jsou vyvolány degenerací dopaminergních neuronů, jak je progresivní supranukleámí syndrom (syndrom Steele-Richardson-Olszewski), olivopontocerebelámí atrofie (OPCA), Shy-Dragerův syndrom (mnohočetná systémová atrofir) a komplex demence Guamanian-Parkinson a Huntingtonova chorea. Zejména je vynález možno využít k léčbě kongenitálních nebo neurodegenerativních poruch spojených s dysfunkcí sensorických neuronů a degenerativním onemocněním sítnice. Například je možno použít BDNF ve formě bílkoviny, peptidových fragmentů nebo derivátů podle vynálezu k léčbě hereditámí spastické paraplegie sretinální degenerací (syndromy Kjellinův a Bamard-Scholz), dále při retinitis pigmentosa, Stargardtově onemocnění, Usherově syndromu (retinitis pigmentosa s kongenitální ztrátou sluchu) a také při Refsumově syndromu (retinitis pigmentosa, hereditámí ztráta sluchu a polyneuropathie). Jde však jen o některé syndromy, u nichž lze BDNF použít. Je možné, že poruchy při syntéze BDNF nebo poruchy v odpovědi na BDNF mohou být původní příčinou řady syndromů, které jsou charakterizovány kombinací degenerace sítnice a další sensotické dysfunkce.

-26CZ 285649 B6

Ve specifickém provedení vynálezu je možno podávat BDNF ve formě bílkoviny, peptidového fragmentu nebo derivátu ve spojení s chirurgickou implantací tkáně při léčení Alzheimerovy choroby a/nebo Parkinsonovy choroby. Jak bude dále uvedeno v odstavcích 12 a 18, je možno BDNF použít také k podpoře přežití neuronů dopaminergní substantia nigra, které je závislé na použité dávce, jak je zřejmé z obr. 34, a také k léčbě poruch dopaminergních neuronů CNS, včetně Parkinsonovy choroby v zásadě ve světle údajů, které budou dále uvedeny v odstavci 21, kde se prokazuje, že BDNF je možno použít k prevenci neurotoxicity, způsobené MPP, což je toxin, spojený s indukcí onemocnění, podobného Parkinsonově chorobě. Mimoto bylo pozorováno, že BDNF podporuje přežití cholinergních neuronů CNS, jak bude dále popsáno v odstavcích 12 a 16, zejména cholinergních neuronů bazální části předního mozku, což ukazuje na to, že BDNF by bylo patrně možno použít k léčbě poruch, zahrnujících cholinergní neurony, včetně například Alzheimerovy choroby. Bylo prokázáno, že přibližně 35 % nemocných s Parkinsonovým onemocněním trpí také demencí Alzheimerova typu. V těchto případech by mohlo podávání BDNF být užitečné jako komplexní léčba tohoto syndromu. Podobně je možno užít BDNF, získaný způsobem podle vynálezu k léčbě Alzheimerova onemocnění, spojeného s Downovým syndromem. BDNF, získaný způsobem podle vynálezu je možno použít při léčbě celé řady demencí a také při kongenitálních poruchách poznávání. Bylo také zjištěno, že BDNF patrně potlačuje proliferaci astrogliálních buněk, což podporuje používání BDNF při zajištění tvorby co nej menších jizev v CNS (například po chirurgických zákrocích, po úrazech nebo po krvácení nebo thromboze v mozku) a také k léčbě nádorů, odvozených od astrogliálních buněk.

V dalším provedení vynálezu je možno užít BDNF k regulaci exprese receptoru NGF. Je tedy možno podat tuto látku s výhodou před podáním NGF nebo současně s podáním NGF nemocným.

Jak bude dále uvedeno v odstavci 15, může být užito podávání kyseliny kainové k indukci zvýšení exprese BDNF (a v menším rozsahu také k indukci exprese NGF) v neuronech, včetně hippokampálních neuronů a neuronů v mozkové kůře. Bylo pozorováno (jak bude dále uvedeno v odstavci 15), že inhibice non-NMDA-receptorů blokuje toto zvýšení exprese BDNF, vyvolané podáním kyseliny kainové. Je tedy zřejmé, že je možno indukovat expresi peptidů, příbuzných NGF a BDNF in vitro nebo in vivo podáním kyseliny kainové nebo příbuzných látek nebo podáním karbacholu, histaminu nebo bradykininu a příbuzných látek, které mají in vitro nebo in vivo podobný účinek, nebo agonisty ne-NMDA glutamátových receptorů nebo jiných látek, které zvyšují nebo napodobují působení acetylcholinu, histaminu nebo bradykininu. Indukce exprese NGF je rovněž možno dosáhnout podáním kyseliny kainové nebo příbuzných molekul nebo agonistů ne-NMDA receptorů.

V dalším provedení vynálezu je možno užít BDNF, a to bílkovinu, její fragmenty nebo její deriváty ve spojení s dalšími cytokiny k dosažení požadovaného neurotrofního účinku. Například je podle vynálezu možno BDNF použít spolu s NGF nebo spolu s extraktem z kosterního svalu k dosažení synergního stimulačního účinku na růst sensorických neuronů, což znamená, že synergním účinkem je účinek kombinace BDNF jako bílkoviny, peptidu nebo derivátu a druhého prostředku, což vede k dosažení většího účinku, než by bylo možno dosáhnout při použití jakékoliv z užitých látek samostatně. Je patrně možno předpokládat synergní účinek BDNF s dalšími peptidovými faktory, odvozenými od CNS, které ještě nejsou zcela charakterizovány, a to jak na růst, tak na vývoj a přežívání široké škály subpopulací neuronů v centrálním nervovém systému.

Je dále možno předpokládat, že na základě plné charakterizace molekuly BDNF bude možno vyvinout nové peptidové fragmenty, deriváty nebo mutanty BDNF, které budou antagonisty pro některé nebo všechny funkce BDNF. Takové antagonisty BDNF by pak patrně bylo možno použít pro selektivní ablaci sensorických neuronů, například při léčbě chronických bolestických syndromů.

-27CZ 285649 B6

V dalším provedení vynálezu je možno podávat protilátky proti BDNF ve formě bílkoviny, peptidových fragmentů nebo derivátů nemocným, trpícím různými neurologickými poruchami a onemocněními. Jde například o nemocné, kteří trpí příliš vysokou produkcí BDNF. Protilátky proti BDNF je možno použít při prevenci aberantní regenerace sensorických neuronů, např. po operacích, nebo jak již bylo svrchu uvedeno při léčbě chronických bolestivých syndromů. Vzhledem k tomu, že ve tkáni neuroblastomu bylo prokázáno velké množství mRNA pro BDNF je možné, že BDNF slouží i jako látka, podporující růst neuroblastomu a bylo by proto pravděpodobně možné podávat protilátky proti BDNF léčebně k dosažení regrese nádoru ve specifickém provedení vynálezu.

5.10 Farmaceutické prostředky

Prostředky podle vynálezu, které mohou obsahovat celý produkt genu pro BDNF nebo jeho část včetně bílkoviny, peptidového fragmentu nebo derivátu nebo také protilátky nebo jejich fragmenty proti BDNF ve formě bílkoviny, peptidového fragmentu nebo deriváty nebo kombinaci BDNF a druhé účinné látky, například NGF nebo extraktu kosterního svaluje možno podávat v jakémkoliv sterilním biologicky kompatibilním nosiči včetně fysiologického roztoku chloridu sodného, popřípadě s obsahem pufru, dextrosy, nebo ve vodě.

BDNF ve formě bílkoviny, peptidového fragmentu nebo jeho derivátu může obsahovat řetězec aminokyselin nebo jeho prekursor tak, jak je znázorněn na obr. 1 nebo 5. Může být výhodné použít BDNF ve formě bílkoviny, zejména s obsahem řetězce aminokyselin v rozsahu aminokyseliny 134 až 252 z obr. 1 nebo funkční ekvivalent uvedeného řetězce, který patrně tvoří funkční část molekuly BDNF. BDNF je možno odvodit od řetězců, odpovídajících genům pro BDNF pro vhodné druhy, například člověka, vepře, krysu, kuře, krávu, psa, ovci, kozu, kočku králíka a podobně.

Množství BDNF ve formě bílkoviny peptidového fragmentu nebo derivátu nebo množství protilátky proti BDNF, účinné v případě určité poruchy nebo určitého stavu bude záviset na povaze této poruchy nebo tohoto stavu a je možno je stanovit běžnými klinickými postupy. Tam, kde to je možné, je žádoucí stanovit křivku závislosti účinku na dávce a vhodné složení farmaceutického prostředku nejprve in vitro, např. na svrchu uvedeném systému pro průkaz biologické účinnosti BDNF a pak na vhodném živočišném systému před klinickými testy. Na základě údajů, získaných in vitro je možno ve specifickém provedení vynálezu získat farmaceutický prostředek, který může při podpoře přežívání sensorických neuronů zajistit místní koncentraci BDNF v rozmezí 5 až 25 ng/ml a s výhodou 10 až 20 ng/ml. V dalším specifickém provedení vynálezu je při podání farmaceutického prostředku pro vyvolání růstu a pro přežití dopaminergních nebo cholinergních neuronů možno dosáhnout místní koncentrace BDNF v rozmezí 10 až 100 ng/ml.

Způsoby podání zahrnují podání intradermální, intramuskulámí, intraperitoneální, nitrožilní, podkožní, perorální a intranasální. Mimoto může být žádoucí podat farmaceutický prostředek podle vynálezu přímo do centrálního nervového systému jakoukoliv vhodnou cestou včetně intraventrikulámí a intrahektální injekce. Intraventrikulámí injekci je možno usnadnit použitím intraventrikulámího kathetru, například připojeného na zásobník, jako Ommayův zásobník.

Mimoto může být vhodné podávat farmaceutický prostředek podle vynálezu místně do oblasti, kde je zapotřebí dosáhnout požadovaného účinku. Toho je možno dosáhnout například místní infusí v průběhu chirurgického zákroku, injekcí, například pomocí kathetru nebo pomocí implantátu, kterým může být porézní, neporézní nebo želatinovitý materiál včetně membrán, například sialastické membrány nebo může jít o vlákna.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž farmaceutické prostředky s obsahem bílkoviny BDNF, jejího peptidového fragmentu nebo derivátu, podávaného pomocí liposomů, mikročástic, nebo

-28CZ 285649 B6 mikrokapslí. V různých provedeních vynálezu může být vhodné užít takové prostředky, které mohou zajistit zpomalené uvolňování BDNF nebo příbuzných produktů.

Je pravděpodobné, že v budoucnosti bude možno přivádět do oblastí, do nichž to bude třeba buňky aktivně produkující BDNF, příbuzné látky, antagonisty nebo protilátky proti BDNF tam, kde bude zapotřebí zvýšit nebo snížit koncentraci této látky.

6. Příklad: Molekulární klonování a charakterizace cDNA pro neurotrofní faktor, odvozené z mozku vepře.

Nesmírně malé množství BDNF ve tkáních vylučovalo použití běžných způsobů klonování pro gen této látky. Bylo postupováno tak, že omezené údaje o řetězci bílkoviny byly postupně doplňovány použitím amplifíkace DNA následujícím způsobem:

(i) Z kilogramových množství mozku vepře byla vyčištěna mikrogramová množství BDNF (ii) Čištěný BDNF byl analyzován při použití nepatrného množství materiálu a byl stanoven souvislý řetězec s obsahem 36 aminokyselin.

(iii) Na základě takto zjištěného řetězce aminokyselin byly synthetizovány oligonukleotidy, které pak byly užity jako primery pro PCR-reakci při použití cDNA z colliculus superior vepře jako templátu kamplifikaci kódové DNA pro definovaný fragment řetězce aminokyselin.

(iv) Řetězec reakčního produktu ze stupně iii) byl dále analyzován.

(v) Byly synthetizovány odpovídající oligonukleotidové primery a využity při PCR-reakci s cDNA colliculus superior vepře za vzniku překrývajících se fragmentů DNA, představujících mRNA pro BDNF oběma směry od původního fragmentu s obsahem 36 aminokyselin. Tímto způsobem byly molekulárně klonována kódová oblast pro BDNF vepře ve formě dvou překrývajících se fragmentů.

Dále budou uvedeny podrobnosti jednotlivých svrchu uvedených stupňů a také další charakterizace genu pro BDNF.

6.1. Materiály a metody.

6.1.1. Čištění BDNF z mozku vepře.

Čištění BDNF z mozku vepře bylo prováděno v podstatě způsobem podle publikace Hofer a Barde, 1988, Nátuře, 331: 261-262.

kg mozku vepře bylo homogenizováno v homogenizačním zařízení Ultra-Turrax v 0,2 M fosforečnanu sodném jako pufru o pH 6,0 s obsahem 1 mM EDTA a 1 mM čerstvě přidaného fenylmethansulfonylfluoridu, bylo užito poměru 1 kg mozku na 2 litry pufru. Pak bylo upraveno pH supematantu na hodnotu 4,0 přidáním 1 N HC1 a směs byla míchána 2 hodiny při teplotě 4 °C. Po odstředění 25 minut při 20 000 g byly supematanty (upravené na pH 6,0 přidáním 1 N NaOH) odpovídající množství 3 kg mozkové tkáně spojeny, míchány 2 hodiny s 1 litrem předem nabobtnané karboxymethylcelulózy, uvedené do rovnovážného stavu v 0,1 M fosforečnanu sodném o pH 6,0. Po dvojím promytí celkovým množství 20 litrů 0,1 M fosforečnanu sodného o pH 6,0 byla suspenze vlita do sloupce a promývána přes noc tímtéž pufrem s obsahem 0,13 M chloridu sodného. Aktivní frakce pak byly vymyty fosfátovým pufrem s obsahem 0,5 M chloridu sodného a pak dialyzovány proti 2x 5 litrům 5 mM fosforečnanu sodného o pH 6,8. Dialyzované frakce, které byly získány zpracováním 2 x 3 kg výchozího materiálu byly naneseny na sloupec

-29CZ 285649 B6 s obsahem 130 ml hydroxyapatitu, předem uvedený do rovnovážného stavu s 5 mM fosforečnanu draselného o pH 6,8. Pak byl sloupec vymýván při použití lineárního gradientu 500 ml 5 mM a 500 ml 700 mM fosforečnanu draselného vždy o pH 6,8. Určité množství BDNF bylo vymyto při použití 500 mM fosforečnanu draselného, jak bylo také uvedeno v publikaci Barde a další, EMBO J., 1982, 1: 549-553. Přidáním 1,0 M fosforečnanu draselného byly spojené aktivní frakce upraveny na konečnou molámí koncentraci 700 mM fosforečnanu draselného a materiál byl nanesen na sloupec s obsahem 5 ml fenylsepharosy v rovnovážném stavu se 700 mM fosforečnanem draselným o pH 6,8. Po promytí sloupce 40 ml téhož pufru byl BDNF vymýván 0,1 M fosforečnanem draselným o pH 6,8, dialyzován proti destilované vodě a pak lyofilizován. Lyofilizovaný materiál byl rozpuštěn v pufru pro nanášení vzorku na SDS-gel pro elektroforézu s obsahem 0,1 SDS bez merkaptoethanolu, pufr byl popsán v publikaci Barde a další, EMBO J., 1:549-553 a pak byl vzorek nanesen na SDS-gel s lineárním (nikoliv exponenciálním) gradientem 10 až 25 % akrylamidu. Po ukončení elektroforetického dělení byl gel krátce barven (10 minut) Coomassieovou modří, pak byl odbarvován 20 minut a byl vyříznut pás putující na úrovni cytochromu c, tento pás pak byl z gelu elektroforeticky vymyt. SDS byl odstraněn způsobem podle publikace Barde a další, EMBO J., 1: 549-553. Další čištění, které pak vedlo ke stanovení řetězce BDNF bylo modifikováno podle publikace Hofer a Brde, 1988, Nátuře 331:261-262, takže v posledním stupni čištění nebylo užito elektroforézy na gelu.

6.1.2. stanovení řetězce bílkoviny

Řetězec BDNF byl stanoven jednak přímo (55 pmolu podle stanovení analýzou aminokyselin, s počátečním výtěžkem 40 pmolu pro aminoterminální histidin), jednak byl rozštěpen následujícím způsobem: 5 až 10 mikrogramů BDNF (z 5 různých přípravků) se rozštěpí následujícím způsobem: 1 mikrogram Staphylococcus aureus V8 (Miles) se přidá k 5 pg BDNF v 0,2 M uhličitanu amonném o pH 8 s obsahem 10 % acetonitrilu (celkový objem 50 mikrolitrů) a materiál se inkubuje přes noc při teplotě místnosti. Trypsin: 1 pg trypsinu, zpracovaného TPCK (pankreas skotu, Sigma Typ XIII) se přidá k 8 pg BDNF v Tris-HCl (0,1 M, pH 8,0) s obsahem 10 mM chloridu vápenatého (celkový objem 40 pl) a směs se inkubuje přes noc při teplotě 37 °C. Bromkyan (CNBr): 10 pg BDNF se inkubuje 3 hodiny při teplotě místnosti (celkový objem 60 pl) s 10% CnBr v 70% kyselině mravenčí (konečná koncentrace). Po přidání 500 pl vody na konci reakce se vzorek zahustí na objem 50 pl v odpařovacím zařízení. Pak se přidá 50 pl TrisHCl (1,0 M, pH 8,0) spolu s 5 pl β-merkaptoethanolu a vzorek se inkubuje přes noc při teplotě 37 °C. Přidá se ještě 5 pl jodmethanu a vzorek se odpaří dosucha na odpařovacím zařízení. Bylo zjištěno, že po rozštěpení působením CNBr je nutno provést redukci a alkylaci BDNF. Bez redukce nebylo možno získat žádné fragmenty, jak bylo možno prokázat HPLC a SwankMunkreasovou elektroforézou na SDS-gelu podle publikace Swank a Mukres, 1971 Anal. Biochem. 39: 462-477. To prokazuje, že v BDNF jsou obsaženy disulfídové můstky a jsou uspořádány takovým způsobem, že žádným štěpením není možno získat volné peptidy. Po všech štěpeních byly usušené vzorky znovu uvedeny do suspenze v 0,1% kyselině trifluoroctové TFA a naneseny na sloupec C8 microbore HPLC v reversní fázi (Applied Biosystems) a pak byly peptidy vymývány rychlostí 0,1 ml/min. při použití 60 min. lineárního gradientu 0 až 60% ycetonitrilu v 0,1% TFA. Detekce byla prováděna při 214 nm při použití UV detektoru Waters 441. Řetězec peptidů byl analyzován při použití Edmanovy automatické degradace v plynné fázi (model 470 A, Applied Biosystems). Analýza byla prováděna způsobem podle publikace Hewick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 7990-7997 a Hunkapillar, 1983, Methods Enzymol. 91:227236. Detekce ΡΊΉ aminokyselin byla popsána v publikaci Lottspeich, 1985, J. Chromatograph. 326:321-327.

6.1.3. Příprava DNA templátů.

DNA genomu vepře byla izolována způsobem podle publikace Herrmann a Frischauf, 1987, Methods Enzymol. 152:180-183.

-30CZ 285649 B6

Pro přípravu cDNA byla získána celková RNA ze vzorku s hmotností 6 g z colliculus superior mozku vepře. Byl odebrán vzorek tkáně, který byl zmrazen v kapalném dusíku na místních jatkách. K extrakci RNA byly užity obvyklé postupy, například podle publikace Okayama a další, 1987, Methods Enzymol. 154: 3-28. 80 mikrogramů celkové RNA bylo užito k transkripci pomocí reversní transkriptázy při použití viru myší leukemie Moloney (BRL, podle údajů výrobce až na to, že bylo přidáno 1 μΐ Rnázy a byl vynechán actinomycin D), byla užita směs primeru CGGATCCGAATTCTGCAGTTTTTTTTTTTT s A, C nebo G jako terminálním 3'nukleotidem (oligo3, konstruovaný tak, aby odpovídal 3'-poly-A-prodloužení a aby obsahoval místo štěpení enzymy BamHI, EcoRI a Pstl).

6.1.4. PCR-reakce

Polymerázová reakce (PCR) byla provedena způsobem, popsaným v publikaci Saiki a další, 1985, Science 230: 1350 - 1354.

6.2. Výsledky a diskuse

6.2.1. Výsledky stanovení řetězce bílkoviny

Výsledky, získané stanovením řetězce bílkoviny při použití nepatrných množství této bílkoviny jsou shrnuty v následující tabulce IV.

Tabulka IV

Experimentálně stanovený řetězec peptidu BDNF

N-terminální část

V8

V8

CNBr

CNBr

Trypsin

Trypsin

HSDPARRGELSV XVTAADKKTAVD KVPVSKGQLKQYFYE XGGTVTVLEKVP (V) (S) GYTKEGXRGIXRGI (T)AVDMSGGTVTVLEK. ALTMDSK

V kombinovaném řetězci

VTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGOLKQYFYE znamenají podtržené aminokyseliny řetězce, pro něž jsou kódem oligonukleotidové primery, užité při PCR, jak bylo uvedeno v odstavci 6.1.2.

Při použití Edmanovy degradace byly zjištěny čtyři řetězce aminokyselin, které pak bylo možno použít k dedukci řetězce 36 aminokyselin, které představují přibližně třetinu celého řetězce aminokyselin.

6.2.1. Syntéza oligonukleotidů a použití PCR k získání kódové DNA pro fragment aminokyselin

Dva plně degenerované oligonukleotidové primery (17-mery) byly chemicky synthetizovány na základě kódového řetězce pro úseky šesti aminokyselin v blízkosti aminoterminálního a karboxyterminálního zakončení fragmentu s obsahem 36 aminokyselin tak, jak byl svrchu popsán v odstavci 6.2.1. Zejména pak byly synthetizovány dvě oddělené směsi oligonukleotidů

-31 CZ 285649 B6 (17-merů) odpovídajících všem kodonům a označené oligol a oligo2, na základě řetězce AADKKT (antikódující řetězec) a KQYFYE (kódující řetězec), tyto řetězce jsou v tabulce III podtrženy. Pak bylo 150pmolu každého primeru přidáno k 1 pg DNA genomu vepře jako templátu. Pak bylo provedeno 35 amplifikačních cyklů při použití PCR-reakce podle instrukcí výrobce (GeneAmp™, Perkin-Elmer Cetus). Denaturace byla prováděna jednu minutu při teplotě 94 °C, vazba primeru 2 minuty při teplotě 45 °C a extenze primeru 2 minuty při teplotě 72 °C. Pás DNA s předpokládanou délkou 101 bp byl vyříznut z 3% agarozového gelu (zbarveného ethidiumbromidem) a asymetricky amplifikován způsobem podle publikace Innis a další, 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 9436-9440 při použití lOOnásobného přebytku buď oligol nebo oligo2.

6.2.3. Oligonukleotidový řetězec fragmentu cDNA

Výsledné antikódující a kódující fragmenty DNA byly analyzovány metodou s použitím dideoxynukleotidů podle publikace Sanger a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72:3918— 3921, jako primery byly užity oligonukleotidy 1 a 2, značené na koncích pomocí ³²P. Získaný řetězec nukleotidů obsahuje pouze jeden otevřený čtecí rámec, nepřerušený terminačním kodonem. Odvožený řetězec aminokyselin pro tento otevřený čtecí řetězec byl zcela v souladu se skutečným řetězcem aminokyselin, který byl pro tuto oblast stanoven v BDNF vepře.

6.2.4. Klonování celé cDNA pro BDNF vepře

Úplná kódová oblast pro BDNF vepře byla molekulárně klonována ve formě dvou překrývajících se segmentů. Aby bylo možno získat 3'-oblast (relativně k antikódujícímu řetězci) pro cDNA pro BDNF, byl synthetizován oligonukleotidový primer (30-mer), obsahující 21 bází předního antikódujícího řetězce BDNF ze svrchu popsané oblasti, tento řetězec sloužil jako „antikódující primer“. Nukleotidový řetězec tohoto primeru byl oligo 4, (5')AAACTAGTCGACGGCAGTGGACATGTCGGG(3') (podtržené báze odpovídají řetězci který je antikódujícím řetězcem pro BDNF od polohy 643 do 663 na obr. 1 a je kódem pro řetězec aminokyselin Thr-Ala-Val-Asp-Met-Ser-Gly /první dvě baze pro kodon Gly/). Dalších 9 nukleotidů na 5'-zakončení tohoto primeru bylo zahrnuto proto, aby bylo snadno možno provést restrikci pomocí endonukleáz Spěl a Sall při molekulárním klonování. Byl také sestaven degenerovaný oligonukleotidový primer (31-mer) tak, aby byl komplementární k řetězci, prodlouženému pomocí Poly-A a předcházenému jakýmkoliv nukleotidem (T, G nebo C) antikódujícího řetězce cDNA, současně tento řetězec obsahoval místa štěpení restrikčních endonukleáz BamHI, EcoRl a Pstl. Řetězec tohoto „antikódujícího primeru“ (oligo3) byl (5')cggatggcaattgtgcagttttttttttttX(3'), kde X = A, C nebo G. Synthetické oligonukleotidové primery byly využity k amplifikaci řetězců z colliculus superior vepře, a to z cDNA pomocí PCR. Specificky byl získán řetězec 3'amplifikované cDNA při použití 10 μΐ prostředku s obsahem reversní transkriptázy, 150pmolu antikódujícího primeru (oligo4) a 150 pmolu oligo3 jako kódujícího primeru při reakci PCR. Analýza Southem blot byla provedena na amplifikovaných produktech DNA a pás, poskytující hybridizační signál s oligonukleotidem AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG (oligo5, užitý jako kódující primer při 5-reakci, popsané svrchu a obsahující místa štěpení enzymů BamHI a Pstl) byl vyříznut, extrahován při použití postupu glassmilk (genclean™, rozštěpený EcoRl a Sall, klonovaný v plasmidu Bluescript SK⁺ /Stratagene/ s následným klonováním).

Aby bylo možno získat zbytek kódového řetězce pro BDNF (směrem vzhůru od 5'-oblasti), byla připravena cDNA obdobným způsobem jako svrchu a na 5'-zakončení byla navázána Poly-Azakončení při použití terminální deoxynukleotidtransferázy. Tatáž směs tří oligonukleotidů (31merů), z nichž každý obsahoval 12 po sobě následujících zbytků T, popsaných svrchu, byl užita

-32CZ 285649 B6 ke konstrukci primeru, komplementárního k navázaným poly-A řetězcům. Byl synthetizován také oligonukleotidový primer (30-mer), obsahující 17 bází, odpovídajících komplementárnímu řetězci kódového řetězce pro BDNF a obsahující místa štěpení restrikčními endonukleázami BamHI a Pstl. Tento primer je možno vyjádřit následujícím řetězcem:

í'5^,')AAGGATCCTGCAGTTGGCCTTTCGAGACGG(3'')

Jde o svrchu uvedený oligo5, podtržené báze označují oblast, komplementární k antikódujícímu řetězci pro BDNF od polohy 709 do polohy 693 na obr. 1. Řetězec odpovídá řetězci, který je kódem pro řetězec aminokyselin Pro (poslední dvě baze kodonu)-Val-Ser-Lys-Gly-Gln. Primery byly přidány k cDNS s navázanými poly-A-řetězci a pak byla provedena amplifikace svrchu uvedeným způsobem. Reakční produkty byly rozštěpeny Pstl a klonovány ve vektoru Bluescript, nukleotidový řetězec byl stanoven terminační metodou při použití dideoxynukleotidů.

6.2.5. Nukleotidový řetězec cDNA pro BDNF vepře.

Na obr. 1 je uveden nukleotidový řetězec pro překrývající se části klonů cDNA pro BDNF vepře. Řetězec obsahuje otevřený čtecí rámec pro polypeptid o 252 aminokyselinách Identifikace iniciačního kodonu Met (ATG) je založena na přítomnosti dvou kodonů pro ukončení řetězce (TAG-TGA) v tomtéž čtecím rámci po 36 párech bází ve směru odečítání. Aminoterminální zakončení BDNF vepře, stanovené přímou analýzou řetězce na čištěné bílkovině odpovídá zbytku His 134 tohoto polypeptidu. Zbytku His 134 bezprostředně předchází řetězec Arg-ValArg-Arg. Takové řetězce, v nichž je jeden zbytek bazické aminokyseliny následován neutrální aminokyselinou a pak následují ještě dva zbytky bazické kyseliny se považují za cílová místa pro proteolytické zpracování prekursorových polypeptídů. Odvozený řetězec aminokyselin pro úplný BDNF předpovídá bílkovinu s obsahem 119 aminokyselin (molekulová hmotnost 13 511 s bazickým nábojem (pí = 9,99) a s vlastnostmi, které jsou v souladu s dřívější charakterizací BDNF a jeho vyhodnocením jako biologicky účinného faktoru po frakcionaci dvojrozměrnou elektroforézou na gelu. Řetězec aminokyselin pro části BDNF, stanovený analýzou řetězce mikrovzorků (celkem 64 zbytků aminokyselin) je v naprostém souladu s řetězcem aminokyselin, odvozeným od nukleotidového řetězce klonů cDNA tak, jak je podtržen na obr. 1. Řetězec prekursorového polypeptidu je v souladu se zpracováním BDNF alespoň ve dvou stupních: nejprve dochází k odštěpení přibližně 18 zbytků signálního peptidu na aminoterminálním zakončení a pak dojde ke štěpení mezi Arg 133 a His 134 k uvolnění úplného polypeptidu. V případě, že tento model je správný, měl by být prekursor označován například názvem preproBDNF.

7. Příklad: Gen pro BDNF je odlišný od genu pro NGF u různých druhů obratlovců

7.1. Materiály a methody

7.1.1. Příprava sond DNA pro NGF a BDNF

Od British Biotechnologies Limited byl získán plasmid, obsahující synthetický gen, který je kódem pro úplný lidský NGF a obsahuje normální kód pro lidský NGF s několika málo konservačními substitucemi kodonů tak, aby byla zavedena vhodná místa štěpení restrikčními endonukleázami. Byl rovněž synthetizován pár oligonukleotidových primerů (18-merů) k umožnění amplifikace segmentu tohoto genu o 270 párech bází, odpovídajícího kódové oblasti pro zbytky aminokyselin 9 až 111, pomocí PCR. Aby bylo možno získat značenou sondu DNA, bylo provedeno 10 cyklů reakce PCR při použití ³²P-dCTP. Sonda pro BDNF byla získána podobným způsobem s tím rozdílem, že amplifikace byla prováděna při použití DNA genomu vepře jako originálního templátu a amplifikovaný úsek odpovídal kódové oblasti pro aminokyseliny 28 až 111 úplného řetězce BDNF. Byl také synthetizován komplementární (tj.

-33CZ 285649 B6 „kódující“) primer, odpovídající oblasti aminokyselin 106 až 111, s řetězcem bází (5')ACATACACAGGAAGTGTC(3').

Antikódující oligonukleotidový primer byl připraven pro oblast zbytků aminokyselin 28 až 33 a lze jej vyjádřit řetězcem /(5')GCAGTGGACATGTCGGGT(3').

Hybridizace Southem blot (Southem, 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517) při použití těchto dvou sond byla prováděna za omezujících podmínek ve 2 x SSC při teplotě 68 °C.

7.1.2. Stanovení řetězce genů pro BDNF z různých druhů

Tytéž dva oligonukleotidy (18-mery), vymezující kódovou oblast pro aminokyseliny 28 až 111 úplného BDNF vepře, tak jak byly svrchu popsány, byly užity jako primery pro amplifikaci (za standardních podmínek pro PCR) segmentu o 252 párech bází genomu DNA vepře, krysy, kuřete a člověka a výsledné produkty PCR-reakce byly analyzovány terminační metodou při použití dideoxynukleotidů podle publikace Sanger a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72:3918— 3921. V některých případech byl pás pro amplifikovanou DNA vyříznut a extrahován po elektroforéze na agarozovém gelu a pak reamplifikován před analýzou řetězce. V jiných případech nebyla reamplifikace podstatná.

7.2. Výsledky a diskuse

Před navržením způsobu podle vynálezu byl čištěn BDNF ve formě bílkoviny pouze z vepře. Bylo velmi důležité jednoznačně prokázat, že BDNF není pouze podjednotkou faktoru, podporujícího růst nervové tkáně u vepře (podjednotka beta, nebo beta-NGF nebo také jen NGF), a to podjednotkou, která až dosud nebyl čištěna a podrobena molekulárnímu klonování. Tato situace byla zvláště kritická z toho důvodu, že dříve uváděné fysikální vlastnosti BDNF vepře byly v podstatě shodné s vlastnostmi β-NGF-monomeru různých druhů živočichů.

Skutečnost, že nebyly k disposici neutralizační protilátky proti BDNF a současně nebyly k disposici informace o řetězci aminokyselin nebo nukleotidů v BDNF vepře činila nemožným také stanovení skutečného vztahu mezi BDNF a NGF. Zdálo se přijatelné, že by pozorované rozdíly v biologické účinnosti mezi BDNF a NGF mohly prostě odrážet rozdíly mezi NGF vepře a některých dalších živočišných druhů (například myši), nebo by mohly být důsledkem různé modifikace molekuly NGF v různých tkáních (například by mohlo jít o rozdíl mezi modifikací v mozku vepře a ve slinné žláze myši), nebo důsledkem modifikace, způsobené v bílkovině nechtěně v některém ze stupňů čištění z mozku vepře.

V případě, že by bylo zjištěno, že BDNF je zřetelně odlišný od NGF, bylo velmi důležité zjistit, zde je gen pro BDNF přítomen také v dalších živočišných druzích, zejména u člověka. Před navržením způsobu podle vynálezu nebyla o tomto problému k disposici žádná informace vzhledem ktomu, že BDNF byl vyčištěn pouze z jediného živočišného druhu. Přítomnost neurotrofní účinnosti, zřetelně odlišné od účinnosti NGF v celé řadě surových extraktů a prostředí nebyla ještě průkazem existence látky, totožné nebo ekvivalentní BDNF vepře.

Srovnání předpověděného řetězce aminokyselin BDNF vepře se známým řetězcem aminokyselin NGF z celé řady druhů (člověk, skot, morče, myš, kuře a hadi) ukázalo, že BDNF je statisticky významně méně příbuzný jakémukoliv NGF obratlovců než jednotlivé typy NGF mezi sebou, jak je zřejmé z obr. 2. Významným znakem primární struktury úplného BDNF je skutečnost, že tato struktura je velmi podobná struktuře NGF. V případě, že se vypustí tři úseky řetězce NGF pro lepší srovnání, je možno prokázat 51 totožných aminokyselin pro různé typy NGF (od člověka až

-34CZ 285649 B6 po hady) a pro BDNF, jak je znázorněno na obr. 2. Je důležité, že identické úseky zahrnují všech 6 cysteinových zbytků. Přestože přesné uspořádání disulfidových můstků v BDNF není dosud známo je zřejmé, že BDNF tyto můstky obsahuje (legenda k Tabulce III). Tři tryptophanové a 2 fenylalaninové zbytky, které se nacházejí v BDNF je možno v identických polohách nalézt také v NGF. Je také nutno uvést, že 6 zbytků kyseliny asparagové (ze 7, přítomných v BDNF) a 7 valinových zbytků (z 9 přítomných) se nachází na identických místech v NGF a BDNF savců. Těchto pět aminokyselin tvoří přibližně polovinu totožných zbytků aminokyselin mezi oběma uvedenými bílkovinami. Na druhé straně existují nápadné rozdíly mezi strukturou NGF a BDNF. Kromě tří již uvedených chybějících úseků řetězce existuje také 21 poloh, v nichž jsou zbytky aminokyselin totožné pro všechny typy NGF, avšak jsou různé v BDNF.

Většina řetězců prekursoru BDNF je nepříbuzná řetězci prekursoru pro NGF s dvěma výjimkami: sekretorický signální řetězec BDNF má 5 totožných aminokyselin (z 18 obsažených) a celkovou nápadnou podobnost se signálním řetězcem NGF myši, což bylo prokázáno štěpením za alaninovým zbytkem v poloze 18 po methioninovém zbytku pro počátek translace (Edvards a další, 1988, Mol. Cell Biol. 8:2456-2464). Je pravděpodobné, že alanin, který se v BDNF rovněž nachází v poloze 18 je potenciálním místem štěpení pro odstranění signálního řetězce BDNF. Další podobnost s řetězcem pro NGF začíná na jediném shodném N-glykosylačním místě (na obr. 1 je dvojitě podtrženo), které odpovídá asparaginovému zbytku v poloze 126. Tento asparaginový zbytek je uložen 8 zbytků aminokyselin před místem štěpení pro odštěpení úplného BDNF. Totéž uspořádání je možno nalézt u několika typů NGF, stejně jako řetězec Arg-Xbazická aminokyselina-Arg jako řetězec posledních 4 aminokyselin prekursoru (Schwarz a další, 1989, J. Neurochem. 52:1203-1209.

Důkaz, že kódy pro NGF a BDNF jsou odlišné geny u různých druhů obratlovců byl získán tak, že byly připraveny sondy DNA z molekulárně klonovaného lidského NGF a z BDNF vepře a pak byla prováděna hybridizace Southem blot při použití DNA genomu, rozštěpené restrikční endonukleázou EcoRI. DNA genomu byla analyzována z následujících zdrojů: člověk, opice, krysa, myš, pes, skot, králík, kuře a kvasinky. DNA byla rozštěpena působením enzymu EcoRI a analyzována hybridizací Southem blot ve dvojím provedení při použití ³²P-značené lidské sondy pro NGF a sondy pro BDNF vepře. Pro každou sondu bylo možno pozorovat ve všech testovaných organismech jeden pás, s výjimkou kvasinek. Ve většině případů měly pásy, hybridizující se sondami pro NGF a BDNF v kterémkoliv organismu různou elektroforetickou pohyblivost, přestože v některých případech, například u myší DNA měly fragmenty po štěpení enzymem EcoRI, hybridizující se sondami pro NGF a BDNF přibližně stejný rozměr a nebylo možno je od sebe oddělit za použitých podmínek pro elektroforézu (obr. 1).

Část kódového řetězce pro úplný BDNF byla amplifikována pomocí PCR z DNA genomu morčete, krysy, kuřete a člověka a byly stanoveny nukleotidové řetězce. Analýza řetězce DNA z amplifikované oblasti DNA genomu vepře přesně potvrdila výsledky analýzy řetězce, které byly získány při použití molekulárních klonů cDNA z mozku vepře. Byly rovněž stanoveny řetězce genomu krysy, kuřete a člověka pro segment BDNF o 252 párech bází (obr. 5). Je pozoruhodné, že u krysy a u člověka byl odvozený řetězec aminokyselin pro oblast alespoň aminokyselin 28 až 111 totožný s řetězcem pro BDNF vepře, přestože bylo možno pozorovat u různých druhů celou řadu rozdílů v nukleotidech (například konservativní změny ve třetí poloze kodonu). U kuřete bylo možno pozorovat v této oblasti jedinou substituci aminokyseliny. U kuřete je zbytkem 61 v úplné bílkovině lysin, zatímco u savců se v této poloze BDNF nachází zbytek methioninu. Údaje, získané při analýze řetězce spolu s výsledky hybridizace Southem blot, tak jak byly svrchu popsány, poskytují jednoznačný průkaz skutečnosti, že kódem pro BDNF je vysoce konservovaný gen, který je odlišný od genu, který je kódem pro NGF.

8. Příklad: Exprese RNA pro BDNF v neuronových a neneuronových tkáních

8.1. Materiály a metody

-35CZ 285649 B6

8.1.1. Příprava RNA

Celková DNA byla extrahována ze tkání dospělých myších samic způsobem podle publikace Okayama a další, 1987, Methods Enzymol. 154:3-28. Zmrazená tkáň byla homogenizována v 5,5 M guanidiniumthiokyanátu, rozrušená tkáň byla odstředěna k odstranění buněčné drti a supematant byl navrstven na vrstvu trifluoracetátu česného, upraveného na hustotu 0,51 g/ml. Po odstředění 24 hodin při 125 000 x g v rotoru SW 27 (Beckman) a RNA byla znovu uvedena do suspenze a pak srážena ethanolem a 8 M acetátem amonným a pak skladována při teplotě -70 °C. Elektroforéza byla prováděna podle publikace Lehrach a další, 1977, Biochemistry 16:47434751) na 1,3% agarozoformaldehydovém gelu. RNA byla přenesena na nylonové membrány (Hybond-N, Amersham) a hybridizována přes noc při teplotě 62 °C v 1 ml 2 x SSC s obsahem 50 % formamidu s ³²P-cRNA jako sondy pro BDNF myši (10⁷ impulsů za minutu, jak bude dále uvedeno). Promývání bylo prováděno 60 minut při teplotě 65 °C v 0,1 x SSC. Po promytí byl materiál inkubován 60 minut při teplotě místnosti s 0,1 pg/ml RNázy A (Pharmacia) a film byl exponován při teplotě -70 °C při použití zesilující clony po dobu 48 hodin.

8.1.2: Příprava sondy cRNA

Banka cDNA z mozku myši byla vyšetřována pomocí dvou nezávislých oligonukleotidů BDNF. Byly izolovány dvojité pozitivní klony, které byly subklonovány v místě štěpení enzymu EcoRI plasmidu Bluescript SK⁺ (Stratagene). Byl stanoven nukleotidový řetězec, odpovídající nukleotidům 350 až 829 řetězce vepře (obr. 1). V tomto řetězci bylo možno prokázat pouze 4 odlišné aminokyseliny pro řetězec BDNF myši a vepře, což znamená velký stupeň konservace v této oblasti mezi BDNF myši a vepře. Byla připravena sonda RNA s jednoduchým řetězcem při použití tohoto templátu a T3-polymerázy (Promega). Specifická účinnost této sondy byla 10⁸ impulsů za minutu/ pg.

8.2. Výsledky a diskuse

Analýza Northem blot byla užita k vyhodnocení exprese mRNA pro BDNF v neuronové i neneuronové tkáni. Analýza Northem blot byla provedena při použití myších tkání, které dovolují rychlejší zpracování k získání RNA než tkáně vepře. Sonda ³²P-cRNA prokázala signál o velikosti přibližně 1,45 kb v mozku (Obr. 4) a v míše (údaje nejsou znázorněny). Je významné, že nebylo možno zjistit žádný signál pro jiné tkáně včetně ledvin, střeva, plíce, jater, sleziny, srdce a svalu (Obr. 4). Vzhledem k tomu, že velikost mRNA vepře je podobná velikosti téže látky u myši je zřejmé, že řetězec DNA, znázorněný na obr. 2 představuje více než 80 % úplného řetězce mRNA.

Významným pozorováním při výzkumu fysiologie BDNF byla skutečnost, že mRNA, která je kódem pro tuto látku je možno nalézt pouze v centrálním nervovém systému a nikoliv v sedmi tkáních, odlišných od centrálního nervového systému, kódovou mRNA pro BDNF bylo možno nalézt nejen v celém mozku (Obr. 4), nýbrž i v míše a v colliculus superior (řetězec, znázorněný na obr. 1 je zcela odvozen od cDNA colliculus superior jako templátu). Tyto údaje podporují myšlenku, že BDNF je neurotrofní faktor, odvozený od cílové tkáně a že neurony, odpovídající na BDNF jsou buď vnitřní neurony CNS, nebo jde o neurony, které jsou se strukturami CNS přímo spojeny. Skutečně také všechny neurony, o nichž je známo, že odpovídají na BDNF buď vybíhají do CNS, jako například dorsální kořeny kraniálních sensorických ganglií (Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112:319-328, Davies a další, 1986, J. Neurosci. 6: 1897-1904), nebo jde o neurony CNS, například gangliové buňky sítnice (Johnson a další, J. Neurosci. 6: 3031-3038). Je zřejmé, že je zapotřebí provést podrobné studie k prozkoumání přesné distribuce míst syntézy BDNF v CNS, je však již zřejmé, že distribuce mRNA pro BDNF je velmi odlišná od distribuce mRNA pro NGF, kterou je možno nalézt v celé řadě neneuronových tkáních (Heumann a další,

-36CZ 285649 B6

1984, EMBO J„ 3:3183-3189, Shelton a další, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 79517955).

9. Příklad: Molekulární klonování a charakterizace genů pro BDNF člověka a krysy

9.1. Materiály a metody

9.1.1. DNA genomu a banky cDNA

Byla získána banka cDNA lidské sítnice v lambda-ΖΑΡΠ (Stratagene). Dále byla získána banka DNA genomu lidské placenty v EMBL3/SP6/76 (Clontech). Pak byly získány banky cDNA lidského fetálního mozku v lambdagtl 1 (Clontech a banka DNA genomu krysy v EMBL3/SP6/T7 (Clontech). Obě banky genomu byly připraveny partiálním štěpením DNA genomu restrikční endonukleázou Sau 3A s následnou vazbou do místa štěpení BamHI vektoru. Pak byla získána ještě banka cDNA krysího mozku v lambda—ZAPII (Stratagene).

9.1.2. Příprava sond DNA ³²P-značené DNA-sondy pro BDNF byly připraveny při použití týchž oligonukleotidových primerů, které byly popsány v odstavci 7.1.1. svrchu při popisu PCR-reakce sDNA lidského genomu tak, aby bylo možno dosáhnout amplifikace kódové oblasti pro zbytky 28 až 111 lidského BDNF. Souběžně byla získána ³²P-značená sonda, specifická pro krysí BDNF při použití DNA genomu krysy jako templátu pro PCR.

9.1.3. Analýza knihoven

Knihovny fágu lambda byly analyzovány podle standardních postupů (Benton and Davis, 1977, Science 196:180-182, Maniatis a další, 1978, Cell 15: 687-701), hybridizací v 50% formaldehydu za přítomnosti dextransulfátu a Denhardtova roztoku při teplotě 42 °C. Filtry byly předem hybridizovány při teplotě 42 °C v 50% formamidu, 5 x SSCPE, 10% Denhardtův roztok, 0,5 mg/ml DNA ze spermatu lososa, 0,1% SDS a 10% dextransulfát. Hybridizace byla prováděna v tomtéž pufru s tím rozdílem, že Denhardtův roztok byl 2%, bylo užito DNA ze spermatu lososa v množství 0,1 mg/ml a SDS a dextransulfát byly vynechány. Po hybridizace byly filtry promyty při teplotě 68 °C. Pro analýzu DNA lidského genomu a knihovny cDNA ze sítnice byla užita sonda pro lidský BDNF. Krysí sonda pro BDNF byla užita pro analýzu DNA krysího genomu a knihovny cDNA z mozku. Knihovny byly rovněž analyzovány při použití lidských a krysích sond pro NGF, připravených podle odstavce 7.1.1. svrchu.

9.2. Výsledky a diskuse

Bylo analyzováno alespoň 670 000 plaků z každé knihovny. Z lidských klonů byly považovány za pozitivní takové klony, které hybridizovaly s lidskou sondou pro BDNF, avšak nikoliv s lidskou sondou pro NGF, tak jak bylo svrchu popsáno. Klony genomu pro BDNF byly získány z lidských i krysích knihoven s častostí výskytu, která odpovídá častosti výskytu genu pro BDNF v jedné kopii na haploidní genom. Jak v případě krysích, tak v případě lidských knihoven byl analyzován přibližně jeden milion plaků. Tři pozitivní klony byly získány z knihovny krysího genomu a jeden z knihovny lidského genomu. Pozitivní klony z knihovny lidské sítnice a z cDNA mozku krysy byly rovněž získány s častostí výskytu, která odpovídala genu, k jehož expresi dochází na velmi nízké úrovni. V cDNA krysího mozku byly identifikovány dva pozitivní klony ze 670 000, v knihovně lidské sítnice byl identifikován jeden klon z množství 670 000 vyšetřovaných klonů. Ani jeden pozitivní klon nebyl identifikován za 670 000 klonů z běžně dodávané knihovny cDNA, připravené z lidského fetálního mozku. Stanovení řetězce bylo provedeno na cDNA pro BDNF lidského původu a na klonech genomu při použití synthetických oligonukleotidových primerů, representujících přesný řetězec, odpovídající

-37CZ 285649 B6 kódovému řetězci pro BDNF člověka a krysy, jak bylo popsáno svrchu v odstavci 7.1.2. Nejdelší lidský klon cDNA, získaný tímto způsobem, měl vloženou část o velikosti 1,6 až 1,8 Kbp, jak bylo možno očekávat, obsahoval přesný řetězec pro část lidského BDNF, jak bylo stanoveno po přímé amplifikaci z DNA lidského genomu, jak bylo popsáno svrchu v odstavci 7.2. Podrobná analýza řetězce této cDNA (Obr. 5) klonu prokázala otevřený čtecí rámec, který je kódem pro polypeptid o 247 aminokyselinách, podobný, avšak nikoliv totožný s plnou délkou prekursoru pro BDNF vepře. V oblasti, odpovídající úplnému polypeptidu BDNF (například od kodonu pro His 134 do terminačního kodonu) nebylo možno prokázat žádné rozdíly v odvozeném řetězci aminokyselin. Všechny rozdíly v nukleotidech mezi řetězcem člověka a vepře byly konservativní, pokud jde o specifičnost kódu. Ve zbytku polypeptidu, který je prekursorem pro BDNF bylo možno pozorovat malé rozdíly v řetězci aminokyselin člověka a vepře, jde zejména o dva po sobě následující kodony pro Ser 5 a 6 u vepře, které nejsou přítomny u člověka, což má za následek poněkud kratší polypeptid (247 místo 252 aminokyselin).

Knihovny, připravené ve vektoru EMBL3 obsahovaly vložené části cizorodé DNA o velikosti 10 až 23 kbp. Přesná velikost vložené části pro klon BDNF lidského genomu nebyla přesně stanovena. Klon však obsahoval jediné místo štěpení pro EcoRI o délce přibližně 4 kbp, které hybridizovalo se značenou sondou pro BDNF, která byla užita k analýze knihovny. Tento fragment má očekávanou délku podle výsledků hybridizace Southem blot DNA lidského genomu se sondou pro BDNF vepře, jak bylo svrchu popsáno. Analýza řetězce byla prováděna na lidském klonu při použití synthetických oligonukleotidů, representujících řetězec cDNA, které byly užity jako primery při syntéze DNA z DNA bakteriofágu jako templátu. Bylo prokázáno, že kódový řetězec pro prekursor BDNF lidského původu je totožný s řetězcem v klonu lidské cDNA s tím rozdílem, že obsahuje jednu substituci nukleotidu v prepro oblasti, což odpovídá náhradě valinu (GTG) methioninem (ATG), na nukleotidu 785 na obr. 5. Tato změna může odrážet polymorfii v lidském genomu. Stejně jako v případě lidského genu pro NGF nebylo možno zjistit řetězce, intervenující s kódovým řetězcem pro lidský preproBDNF. Údaje o řetězci cDNA krysy jsou rovněž znázorněny na obr. 5.

10. Příklad: Exprese rekombinantního BDNF

10.1. Materiály a metody.

10.1.1. Příprava vektoru pro expresi BDNF

Byl získán řetězec, odpovídající řetězci pro preproBDNF vepře při použití vždy 150 pmolů oligonukleotidových primerů

ATAATCTAGATGACCATCCTTTTCCTT (mediátorový)

ATAATCTAGACTATCTTCCCCTCTTAAT (antimediátorový) při PCR-reakci s použitím 1 pg templátu genomu vepře (každý primer obsahuje místo štěpení Xbal). Amplifikační reakce byla prováděna svrchu uvedeným způsobem až na to, že teplota při spojení byla 50 °C. Po rozštěpení Xbal byla amplifikovaná DNA navázána v místě štěpení Xbal do plasmidu pCMV¹ za vzniku pCMV’-pBDNF^_1 (-1 znamená orientaci na obr. 6 a odpovídá COS+ v tabulce V) a plasmid byl užit k transformaci bakterií XL-1 otevřením póru pomocí elektrického proudu.

10.1.2. Exprese BDNF v buňkách COS

DNA plasmidu pCMVl-pBDNF z pozitivních klonů (podle kontroly hybridizací při použití oligo5 z obr. 2) byla rozštěpena enzymy Xbal a Pstl. Velikost získaných produktů umožnila stanovit orientaci vložených řetězců a oba plasmidy byly užity ktransfekci buněk COS při

-38CZ 285649 B6 použití fosforečnanu vápenatého (Chen a další, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752) a živné prostředí bylo po 24 hodinách odděleno. Účinnost BDNF byla zkoušena na kuřecím embryu (ganglia dorsálních kořenů) tak, jak bylo podrobně uvedeno svrchu.

10.2. Výsledky a diskuse

E8 spinální sensorické neurony kuřete byly naneseny na plotny (6 000 na vyhloubení), inkubovány 24 hodin a pak počítány po 24 hodinách (Lindsay a další, 1985, Develop. Biol. 112: 319-328). Uvedené hodnoty jsou průměrem ze tří stanovení ± standardní odchylka, BDNF a 10 NGF byly užity v množství 1 ng/ml, což je maximální koncentrace, při které je možno pozorovat maximální přežívání neuronů. Buňky COS+ jsou buňky po transfekci plasmidem s obsahem vloženého kódu pro BDNF ve správné orientaci, COS— jsou buňky pro transfekci plasmidem s obsahem vloženého kódu pro BDNF v obrácené orientaci. COS jsou buňky, u nichž nebyla transfekce provedena. Při ředění vyšším než 1 : 20 nebylo možno pozorovat vyšší přežívání ve 15 srovnání s kontrolami u prostředí s obsahem buněk COS nebo COS-. Ve všech pokusech bez

NGF bylo použito monoklonální protilátky proti NGF (Korsching a další, 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 3513-3516) v množství 1 pg/ml.

Jak je zřejmé z tabulky V, pouze v prostředí, které obsahovalo buňky COS, nesoucí plasmid 20 pCMVl-pBDNF ve správné orientaci bylo možno pozorovat vyšší přežívání sensorických neuronů kuřete oproti kontrolám. Je tedy zřejmé, že rekombinantní BDNF má biologickou účinnost. Mimoto při přidání BDNF, izolovaného z mozku vepře nebylo možno dále zvýšit statisticky významně přežívání sensorických neuronů nad úroveň, které bylo možno dosáhnout při použití samotného rekombinantního BDNF, což znamená, že rekombinantní BDNF je 25 schopen nasytit receptory pro BDNF. Bylo také možno pozorovat, že rekombinantní BDNF má aditivní nebo synergní účinek na přežívání sensorických neuronů kuřete při současném použití s NGF.

Tabulka V

Přežívání sensorických neuronů kuřete v kultuře

Prostředí COS (konečné ředění)	1 :20	1 : 50	1 :200
COS+		2 510 ±263	2 833 ± 171
COS-	211± 16
COS	250 ±87
BDNF + COS		2 516 ±209
NGF + COS		5 770 ± 72
samotný BDNF		2 718 ±424

11. Příklad: Produkce protilátek proti BDNF

11.1. Materiály a metody

Polyklonální antisérum, specifické pro BDNF označené jako sérem 4 bylo získáno u bílých 40 králíku NZ imunizací pomocí synthetického peptidu.

11.1.1. Syntéza peptidů a vazba na nosič

Peptid, tvořený 34 zbytky aminokyselin a označený B5 byl synthetizován obvyklým způsobem. 45 Obsahoval následující řetězec zbytků aminokyselin, který odpovídá 33 zbytků úplného BDNF (zbytky 153 až 185 úplného řetězce preproBDNF, jak je znázorněno na obr. 1) a další cysteinový

-39CZ 285649 B6 zbytek na aminoterminálním zakončení k umožnění vazby na nosnou bílkovinu při použití Nhydroxysukcinimidu kyseliny m-maleimidobenzoové (MBS) v případě potřeby:

Cys-Val-Thr-Ala-Ala-Asp-Lys-Lys-Thr-Ala-Val-Asp-Met-SerGly-Gly-Thr-Val-Thr-Val-Leu-Glu-Lys-Val-Pro-Val-Ser-LysGly-Gln-Leu-Lys-Gln—Tyr

Peptid B5 byl navázán na sérový albumin skotu (BSA) při použití bis-diazobenzidinu (BDB). Čerstvý BDB byl připraven rozpuštěním 46 mg hydrochloridu benzidinu (p-diaminofenylhydrochlorid, Sigma), v 9,0 ml 0,2 N kyseliny chlorovodíkové. 35 mg NaNO₂ bylo rozpuštěno v 1,0 ml vody a přidáno k roztoku benzidinu a směs byla hodinu míchána při 4 °C. 21 mg BSA bylo rozpuštěno ve 3,0 ml 0,16 M boritanu, 0,13 M NaCl o pH 9,0. Přibližně 15 mg peptidu B5 bylo rozpuštěno v 1,5 ml pufru s boritanem a NaCl o pH 9,0. Peptidový roztok byl přidán k roztoku BSA a uložen do ledu. 1,0 ml BDB bylo přidáno k roztoku BSA-peptidu a reakční směs byla inkubována za míchání 2 hodiny při °C, pak bylo pH upraveno na 9,0 přidáváním malých množství 0,5 M NaOH v případě potřeby. Reakce byla ukončena přidáním 0,2 ml 1% roztoku fenolu s obsahem pufru. Přebytečná reakční činidla byla odstraněna dialyzou proti fysiologickému roztoku chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru (PBS).

11.1.2 imunizace

Celkem šest králíků bylo imunizována podle následujícího schématu:

Králíci 1 a 4 — peptid B5, vázaný na svém C-terminálním zakončení na BSA při použití BDB.

Králíci 2 a 3 - peptid B5, vázaný na svém N-terminálním zakončení na BSA při použití MBS.

Králíci 5 a 6 — peptid B5, smísený s práškovou nitrocelulózou.

Ve všech případech bylo k první imunizaci užito 1 mg imunogenu (100 pg B5/500 pg nitrocelulózy pro králíky 5 a 6) v 0,5 ml PBS plus 0,5 ml úplného Freundova pomocného činidla. Tato směs byla podána podkožně na řadu míst na hřbetu. Druhá imunizace byla provedena po třech týdnech a byla totožná s první imunizací až na to, že byl užit neúplný Freundův pomocný prostředek. Další imunizace byly prováděny v intervalech 4 až 6 týdnů. Králíkům byla odebrána krev 1 týden po imunizaci a antiséra byla obvyklým způsobem zkoušena na vazbu čistého peptidu B5 zkouškou ELISA při použití imunoadsorpce s vázaným enzymem.

11.1.3. Detekce vazby protilátky na BDNF

100 pg antigenu (peptid B5) ve vodě bylo přidáno do vyhloubení mikrotitrační plotny a po usušení přes noc byl materiál krátce promyt vodou a blokován 100 pg 1% želatiny po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Pak byla vyhloubení třikrát promyta destilovanou vodou, bylo předáno 100 pg antiséra a směs byla inkubována přes noc při teplotě 4 °C. Pak byla vyhloubení třikrát promyta PBS/0,05% Triton-X-100 a pak bylo přidáno 100 pg peroxidázou značeného antiséra proti králíkům (ředění 1/1000) a směs byla inkubována tři hodiny při teplotě místnosti. Pak byla vyhloubení dvakrát promyta, bylo přidáno 100 pg roztoku ABTS (10 mg ABTS (Sigma), rozpuštěného v 10 ml 0,1 M citrátu sodného o pH 4,0 s 10 pg H₂O₂) a směs byla inkubována 5 minut (do vzniku zabarvení). Reakce byla zastavena přidáním 10 pg 1% NaNj. Vzorky byly zředěny 1:5 vodou, optická hustota byla měřena při 415 nm.

11.2. Výsledky a diskuse

-40CZ 285649 B6

Antisérum z králíka 4 (sérum 4) mělo nejvyšší titr (obr. 7a) a bylo použito v následujících pokusech. Protilátky proti séru 4 byly částečně čištěny srážením síranem amonným. K podílu antiséra byl přidán stejný podíl nasyceného vodného roztoku síranu amonného, pomalu a za stálého míchání a roztok byl pak dále míchán ještě 15 minut, pak byl odstředěn při 2000 g. Usazenina byla dvakrát promyta 50% nasyceným roztokem síranu amonného, pak byla znovu rozpuštěna v PBS v objemu, který odpovídal původnímu objemu séra. Pak byl síran amonný odstraněn dialýzou proti PBS, který byl několikrát vyměněn. Dialyzovaný roztok byl rozdělen na podíly po 1,0 ml a pak byl lyofilizován (speed-vac). Vzorek protilátky proti séru 4 byl znovu uveden do suspenze v 0,5 ml vody a zkoušen na reaktivitu s peptidem B5 zkouškou ELISA, bylo prokázáno, že reaguje do zředění 1 : 4 000.

Polyklonální protilátky proti synthetickému peptidu B5, odpovídajícímu fragmentu 33 zbytků aminokyselin BDNF vepře byly získány imunizací králíků svrchu uvedeným způsobem. Sérum 4, které mělo nejvyšší titr proti synthetickému peptidu bylo reaktivní s čištěným BDNF z mozku vepře při zkoušce ELISA (obr. 7b). Slabou reaktivitu bylo možno prokázat také při imunoblotové zkoušce (údaje nejsou uvedeny). Antisérum však nebylo schopno blokovat účinnost BDNF při biologické zkoušce na sensorických neuronech dorsálních ganglií kuřecího embrya.

12. Příklad: Nové biologické účinky BDNF

Následující pozorování prokazují že BDNF je patrně schopen následujících funkcí:

i) udržet přežívání a indukovat plně diferenciovaný stav dopaminergních neuronů v CNS, ii) udržovat přežívání cholinergních neuronů CNS a iii) Potlačovat proliferaci astrogliálních buněk.

Uvedená biologická funkce BDNF dosud nebyly popsány. Vzhledem k tomu, že dopaminergní neurony, cholinergní neurony a astrogliální buňky mohou být spojeny se vznikem neurologických onemocnění nebo poruch, mohl by BDNF patrně být použit k léčbě neuropathologických stavů, spojených s těmito populacemi buněk.

12.1. Materiály a metody.

12.1.1. Metody pro pěstování dopaminergních neuronů ze substantia nigra

Z mozku krysích embryí ve stáří embryonálního dne 13 až 15 bylo odebráno ventrální mesencephalon. V typických případech byly užity dva litry tohoto materiálu v každém pokusu. Roztok, užitý při vyjímání měl následující složení:

136,8 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8,0 mM Na2HPO₄.7 H₂O, 1,5 mM KH2/PO4, 6 mg/ml glukózy a 0,1 mg/ml BSA, pH 7,4. Tento roztok byl připraven a pak sterilizován filtrací přes filtr s velikostí pórů 0,2 pm. Vyjímání bylo prováděno za nesterilních podmínek. Jakmile byla tkáň vyjmuta ze všech mozků, byly všechny další postupy prováděny za sterilních podmínek. Fragmenty tkáně byly uloženy do kultivačních misek s průměrem 35 mm a rozděleny na malé částice jemnými nůžkami. Pak byly přidány 2 ml živného prostředí F-12 s obsahem 0,125 % trypsinu a materiál byl inkubován při teplotě 37 °C. Na konci inkubace byla k suspenzi přidána DNAáza I do konečné koncentrace 80 ng/ml. Pak byl proveden ještě jeden identický postup pro získání téhož materiálu a tkáňová suspenze byla pak přidána k 8,0 ml živného prostředí, které bylo tvořeno minimálním základním prostředím (MEM), doplněným 2 mM glutaminu, 6 mg/ml glukózy, 5 jednotkami/ml penicilinu, 5 mg/ml streptomycinu a 7,5 % fetálního telecího séra (FCS). Vzorek byl odstředěn na stolní odstředivce při teplotě místnosti a 500 otáčkách/min. po dobu 5 minut.

-41 CZ 285649 B6

Prostředí bylo odsáto a k usazenině buněk byly přidány 2 ml živného prostředí. Pak byly buňky rozetřeny celkem osmkrát při použití vyžíhané pipety s otvorem 1 mm. Zbývající tkáňové fragmenty byly usazeny pomocí gravitace a byl odebrán malý podíl supematantu k odečtení počtu buněk pomocí hemocytometru. Po stanovení hustoty buněk byly buňky naneseny na kultivační plotny při použití 50 000 buněk/ml.

Kultivační plotny byly připraveny den před vynětím tkáně. Tkáňové plotny (24 vyhloubení, 2 ml/vyhloubení) byly předem opatřeny povlakem polyomithinu (molekulová hmotnost 30 000 až 70 000 g/mol) v množství 0,5 mg/ml při teplotě místnosti po dobu 3 hodiny. Plotny byly důkladně promyty vodou a pak na ně bylo naneseno 5 pg/ml myšího lamininu při teplotě místnosti na tři hodiny. Pak byly plotny omyty vodou stejně jako svrchu a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C ve vlhké atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého, 95 % vzduchu za přítomnosti živného prostředí. Následujícího dne bylo živné prostředí nahrazeno čerstvým živným prostředím.

Jakmile byly buňky naneseny na kultivační plotny, byly buňky uloženy do inkubátoru, jehož teplota byla nastavena na 37 °C při použití atmosféry s obsahem 5 % CO₂ a 95 % vzduchu na 24 hodin. Růstové prostředí bylo nahrazeno prostředím, prostým séra (SFM) následujícího složení: směs 1 : 1 Basálního Eaglova prostředí (BEM) a živného prostředí F—12 s glukózou (33 mM), glutaminem (2 mM), NaHCO3 (15 mM), HEPES (10 mM), prostředí bylo doplněno insulinem (25 pg/ml), transferrinem (100 pg/ml), putrescinem (60 μΜ), progesteronem (20 mM), selenitem sodným (30 nM), Penicillinem (5 jednotek(ml), streptomycinem (5 mg/ml) a T₃ (30 nM). V některých pokusech byl čištěný BDNF přidán ke kultuře po výměně prostředí na prostředí SFM druhého dne kultivace.

Roztok, užitý pro kultivaci dopaminergních neuronů byl připraven při použití vody ze systému Mílii—Q. Živná prostředí byla získána z Gobco Laboratories (Santa Clara, Ca), stejně jako fetální telecí sérum (šarže 43N1086) a myší laminin. Všechny další složky prostředí byly získány od Sigma Chemical (St. Louis, MO) s čistotou, vhodnou pro kultivaci kultur. Polyomithin a DNAáza byly rovněž získány od Sigma. Trypsin byl získán od fy Worthington (Freehold, NJ), šarže 3667. Obchodně dodávané chemické látky byly analyticky čisté a byly získány od Baker Chemical (Phillipsburg, NJ). BDNF, použitý při těchto pokusech byl čištěn z mozku vepře podle publikace Barde a další, 1982, svrchu.

12.1.2. Způsoby immunocytochemického barvení kultur ventrálního mesencephala

Pro každý pokus byly použity čerstvé fixační roztoky. Pro barvení tyrosinhydroxylázy (TH) byl fixačním prostředkem 4,0% paraformaldehyd v Sorensenově fosfátovém pufru. Tento pufr byl připraven přidáním 0,2 M roztoku dihydrogenfosforečnanu draselného k zásobnímu roztoku 0,2 M hydrogenfosforečnanu sodného až do dosažení pH 7,3. Paraformaldehyd byl pak k roztoku přidán a roztok byl slabě zahřát kjeho rozpuštění a pak zchlazen na teplotu místnosti před použitím.

K zahájení postupu bylo prostředí z kultivačních misek odstraněno opatrným odsátím a do misky byl přidán příslušný fixační roztok. Pak byl materiál 20 minut inkubován při teplotě místnosti. Pak byly misky třikrát promyty sorensenovým fosfátovým pufrem, vždy po pěti minutách za opatrného otáčení miskou. Pak byly buňky inkubovány s roztokem pro zastavení reakce 30 minut při teplotě místnosti, opět za opatrného otáčení. Roztok k zastavení reakce pro materiály, které měly být barveny na TH obsahoval Sorensenův fosfátový pufr s obsahem 2 % normálního koňského séra. Pak byly kultury inkubovány v permeabilizačním pufru 30 minut při teplotě místnosti, opět za opatrného míchání otáčením. Tento roztok obsahoval 0,2 % saponinu a 1,5 % normálního koňského séra pro kultury, které měly být barveny na TH. Po permeabilizačním stupni byly kultury inkubovány za přítomnosti primární protilátky přes noc při teplotě 4 °C.

-42CZ 285649 B6

Protilátkou proti krysímu TH byla myší monoklonální protilátka isotypu IgG2a. Byla užita v koncentraci 40 pg/ml v roztoku 10 mM fosforečnanu sodného, 50 mM NaCl, 0,2% saponinu při pH 7,5. Po primární inkubaci protilátky byly kultury 5x15 minut promývány příslušným permeabilizačním pufrem. Pak byly kultury inkubovány se sekundární protilátkou, vázanou na biotin, tj. na biotynylovanou koňskou protilátku proti myšímu IgG. Tato inkubace byla prováděna při teplotě místnosti. Dvě hodiny za opatrného míchání rotací. Pak byla kultura opět promývána stejně jako svrchu a pak byla inkubována za přítomnosti předem vytvořeného komplexu avidinbiotinylované peroxidáza z křenu (reakční činidlo ABC, Vector Laboratories, Burlingame, CA) podle návodu výrobce. Po inkubaci 30 minut za opatrného míchání otáčením byly kultury opět promyty stejně jako svrchu. Pak byly kultury inkubovány s 55 mM Tris-HCl o pH 7,3 s obsahem 0,5 mg/ml dieminobenzidinu a 0,01 % peroxidu vodíku. Reakční produkt vznikal 2 až 5 minut, pak byl roztok opět odstraněn a kultury byly několikrát promyty ledově chladným PBS. Pak byl stanoven počet pozitivních buněk v 1 ml.

Paraformaldehyd a glutaraldehy byly získány od Fluka Chemical. Balíčky Vectastain, které obsahují normální sérum (užité jako blokující činidlo), biotynylovaný antiimunoglobulin, čištěný afínitní chromatografíí, avidin DH a biotinylovaný HRP-H byly získány od Vector Laboratories. Diaminobenzidin byl získán od BRL (Gaithesberg, MD).

12.1.3. Metody, užité při měření příjmu ³H-dopaminu v kulturách ventrálního mesencephala

Příjem ³H-dopaminu (³H-DA) byl sledován způsobem podle publikace Dal Toso a další, 1988, J. Neurosci. 8:733-745 s malými modifikacemi. Pufr pro tuto zkoušku měl následující složení: NaCl 136,8 mM, KC1 2,7 mM, Na₂HPO₄ . 7 H₂O 8,0 mM, KH₂PO₄1,5 mM, glukóza 5,0 mM, chlorid vápenatý 1,0 mM, síran hořečnatý 1,0 mM, kyselina askorbová 0,1 mM, pargylin 0,1 mM, pH 7,4. V případě potřeby byl k tomuto prostředí přidán benztropinmesylát v množství 5,0 μΜ (BZT).

Buňky byly jednou promyty uvedeným pufrem, předehřátým na 37 °C, pak bylo do každého vyhloubení přidáno 0,4 ml tohoto pufru na 2 ml vyhloubení. Pak byly kultury předběžně inkubovány 5 minut při teplotě 37 °C. Na konci této předběžné inkubace bylo přidáno 0,1 ml ³HDA v pufru pro provedení zkoušky (250 nM, 40 Ci/mM) tak, aby konečná koncentrace ³H-DA v pufru byla 50 nM. Kultury byly inkubovány 15 minut při teplotě 37 °C, pak byly kultury čtyřikrát promyty při teplotě 4 °C, vždy při použití pufru pro provedení zkoušky. Pak byly buňky promyty ještě dvakrát ledově chladným PBS (10 mM NaPO₄, 150mM NaCl, pH 7,6). Po posledním promytí bylo k buňkám přidáno 0,2 ml 0,5 N NaOH do 2 ml vyhloubení a buňky byly ponechány dvě hodiny při teplotě místnosti. Pak byl extrakt v NaOH odebrán a radioaktivita byla měřena na scintilačním počítači (Packard, LS 500TD) při použití 10 ml scintilační kapaliny („Ultimagold“). Specifický příjem byl definován jako příjem, který vymizel za přítomnosti 5 μΜ BZT. Typicky tento podíl představoval 70 až 90 % celkového pozorovaného příjmu.

³H-DA byl získán od NEN (Boston, MA). Askorbát, Pargylin, BZT a glukóza byly získány od Sigma (St. Louis, MO). Scintilační kapalina Ultimagold byla získána od fy Packard (Sterling, VA).

12.1.4. Metody pro získání kultur cholinergních neuronů bazální části předního mozku

Primární kultury cholinergních buněk bazální části předního mozku byly získány z krys embryonálního dne 17. Cholinergní neurony, použité při těchto zkouškách byly specificky získány ze středního septálního jádra a zjádra pro diagonální Brocův pás. Tato populace neuronů primárně odpovídá hippocampu. Disociované smíšené kultury Neurony a glie byly získány následujícím způsobem:

-43 CZ 285649 B6

Septální oblast byla zbavena okolní tkáně a vyjmuta zfetálního mozku. Úseky tkáně byly rozrušeny nůžkami a pak uloženy do 12,5% trypsinu na 20 minut při 37 °C. Trypsin byl inaktivován zředěním v živném prostředí (Dulbeccova modifikace Eaglova prostředí DMEM) s obsahem 1 % penicillinu a streptomycinu, 5 % koňského séra a 1 % N3 jako hormonální doplněk). Suspenze jednotlivých buněk byla získána rozetřením tkáňových fragmentů pomocí vyžíhané pasteurovy pipety. Disociované buňky byly počítány v hemocytometru a pak byly naneseny na plotny při zvolené hustotě v živném prostředí pro kultivaci. Pět až šest hodin po nanesení na plotny byly k buňkám přidány vazné látky a pak byly buňky pěstovány deset dnů in vitro při výměně prostředí každé tři dny.

12.1.5. Zkoušky na cholinacetyltransferázu

Po svrchu uvedeném zpracování byly buňky buď užity pro zkoušky na enzym cholinacetyltransferázu (CAT), nebo byly dále zpracovávány pro imunohistochemické barvení na CAT následujícím způsobem: Monoklonální protilátka proti CAT byla získána od Boehringer Mannheim Biochemical Co. Na konci pokusného období byly buňky dvakrát propláchnuty DMEM. Pak byly buňky fixovány v průběhu dvoustupňového postupu: 50 μΐ 4% paraformaldehydu bylo přidáno k 50 μΐ DMEM na 10 minut. Pak byl tento roztok odstraněn a nahrazen 100 μΐ 4% paraformaldehydu a inkubace byla prováděna ještě 30 minut při teplotě místnosti. Po fixaci byly buňky třikrát propláchnuty roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS) a pak permeabilizovány inkubací 30 minut se saponinem (0,5 mg/ml). Smáčedlo bylo odstraněno trojím promytím PBS a pak byl přidán na 30 minut blokující roztok s obsahem 5 % normálního králičího séra. Primární protilátka byla přidána v ředění 1:3 v 1% normálním králičím séru po odstranění blokujícího roztoku a pak byly kultury inkubovány přes noc při teplotě 4 °C. Roztok s obsahem primární protilátky byl odstraněn vymytím pomocí PBS. Vázaný imunoglobulin byl prokázán při použití Vectastainu metodou „ABC“. Jako substrát pro peroxidázovou reakci byl užit diaminobenzidentetrahydrochlorid /DAB/, reakce byla prováděna obvykle 1 až 5 minut. Pak byla reakce zastavena tak, že kultury byly dvakrát promyty 0,1 M tris-HCI o pH 7,2. Kultury byly skladovány v 50 mM tris o pH 7,6 s obsahem 0,15 M NaCl, 42% glycerolu a 0,15% Zephiranu (Pierce Chemical Co., Rockville, IL) při teplotě 4 °C.

12.1.6. Způsob získávání čistých kultur astrogliálních buněk

Čištěné gliální kultury byly připraveny v podstatě způsobem podle publikace McCarthy K.D. a DeVellis J., 1980, J. Cell Biol. 85:890-902 zhippocampu krys postnatálního dne 1 až 2. Hippocampy byly odebrány od pěti mláďat a byly rozrušeny nůžkami. Částice tkáně byly natráveny 2 ml 0,125% trypsinu 20 minut při teplotě 37 °C. Proteáza byla inaktivována zředěním pomocí kultivačního prostředí (10% fetální sérum skotu Gibco, DMEM, 0,5 % penicillinu (5000 pg/ml) a 0,5 % glutaminu). Pak byla připravena suspenze jednotlivých buněk průchodem tkáňových fragmentů zúženou pasteurovou pipetou. Buňky pak byly odstředěny pět minut při 900 otáčkách za minutu, pak byly znovu uvedeny do suspenze v kultivačním prostředí a pak počítány v hemocytometru. Suspenze jednotlivých buněk byla rozdělena do tří lahví pro pěstování tkáňových kultur s objemem 75 ml a buňky byly pěstovány tak dlouho, až vytvořily vrstvu, spojitou na 80 %. Pak byly buňky opět podrobeny působení trypsinu a znovu kultivovány v podstatě svrchu uvedeným způsobem. Gliální buňky byly počítány a pak naneseny na plotny s hustotou 10 000 buněk/0,9 ml.

12.2. Výsledky

12.2.1. Vliv BDNF na hydroxylázu, přítomnou v kulturách buněk ventrálního mesencephala

Imunochemické barvení, provedené podle odstavce 12.1.2 bylo užito k měření účinku BDNF na řadu buněk, pozitivních na hydroxylásu (TH, obr. 8). Maximální vzestup o více než 200 % ve

-44CZ 285649 B6 srovnání s kontrolou bylo možno pozorovat ve dni 8 u kultur buněk ventrálního mesencephala po stimulaci BDNF. Velmi malý vzestup bylo možno pozorovat u kultur, stimulovaných BDNF již třetího dne.

12.2.2. Účinek BDNF na příjem dopaminu kulturami buněk ventrálního mesencephala

Příjem ³H-dopaminu (³H-DA) byl měřen způsobem podle publikace Dal Taso a další, 1988, J. Neurosci. 8:733-745 s malými modifikacemi tak, jak bylo popsáno svrchu v odstavci 12.1.3. Malý vzestup příjmu dopaminu bylo možno pozorovat u BDNF-stimulovaných kultur ventrálního mesencephala již v osmém dni pěstování kultuiy (obr. 9).

12.2.3. Účinek BDNF na expresi cholinacetyltransferázy v cholinergních neuronech předního mozku

Na obr. 10(a) je znázorněn účinek BDNF na počet CAT-pozitivních buněk po růstovém období 12 dnů in vitro. 5,9-násobný vzestup počtu CAT-buněk bylo možno pozorovat po přidání 100 ng/ml BDNF, EC₅₀ byla v tomto případě 10 ng/ml. Jako pozitivní kontrola byly užity kultury s hustotou buněk 260 000 (černý sloupec) nebo 150 000 (šrafovaný sloupec) buněk na jedno vyhloubení, buňky byly obdobným způsobem zpracovány působením NGF (obr. 10 b). Hustota buněk 260 000/vyhloubení odpovídá hustotě, užité při sledování účinku BDNF. Tento vzestup počtu CAT-imunopozitivních buněk je podobný dříve uváděnému vzestupu. Potenciál BDNF při účinku na cholinergní neurony byl rovněž sledován měřením CAT-enzymatické účinnosti podle publikace F. Fonnum, J. Neurochemistry 1975, 24:407—409. Na obr. 11 jsou znázorněny změny CAT, vyvolané působením BDNF. V tomto případě bylo dosaženo l,8násobného zvýšení při použití BDNF v množství 100 ng/ml, hodnota EC50 byla 61 ng/ml.

12.2.4. Účinky BDNF nebo EGF na kultury astrogliálních buněk

Bylo prokázáno, že astrocyty mají receptory s vysokou afinitou pro celou řadu nervových přenašečů a neuropeptidů. Z tohoto důvodu jsou astrocyty schopny odpovídat na signály, odvozené od neuronů. Z tohoto důvodu a také proto, že astrocyty typu II představují jednu z buněčných složek v primárních kulturách byl sledován případný přímý účinek BDNF na gliální buňky. Buňky byly pěstovány in vitro čtyři dny před přidáním růstových faktorů tak, aby byla vytvořena vrstva, souvislá přibližně na 60 %, pak byly buňky podrobeny na 42 hodin působení EGF nebo BDNF. V průběhu posledních 18 hodin inkubace byl v živném prostředí přítomen (³H)methylthymidin. Účinek EGF je znázorněn na obr. 12a. Jak již bylo dříve uvedeno, bylo prokázáno, že EGF má na astrocyty mitogenní účinek. Maximální odpověď bylo možno pozorovat po přidání EGF v množství 10 ng/ml, čímž bylo dosaženo 5,2-násobného vzestupu příjmu (³H)-methylthymidinu. Na obr. 12 b je znázorněn účinek BDNF na příjem (³H)~ methylthymidinu. Odpověď na působení BDNF je dvoufázová: velmi nízké dávky (0,1 ng/ml) vyvolávají malý vzestup příjmu derivátu thymidinu. Dávky vyšší než 1 ng/ml BDNF působí inhibici příjmu uvedené sloučeniny. BDNF v dávce 5 ng/ml způsobil 24% inhibici příjmu, což patrně vede ke snížení rychlosti proliferace gliálních buněk v průběhu působení této látky.

12.3. Diskuse

Tyto pokusy in vitro jasně ukazují, že BDNF podporuje přežívání nebo indukuje plně diferencovaný stav dopaminergních neuronů ve vyvíjející se substantia nigra krysy, jak bylo prokázáno barvením na tyrosinhydroxylázu a také příjmem dopaminu v kulturách těchto neuronů, odvozených od mesencephala embryonální krysy. Vzhledem k tomu, že běží o neurony, k jejichž degeneraci dochází při Parkinsonově onemocnění, je velmi pravděpodobné, že by bylo možno BDNF použít k léčebným účelům u této choroby, čímž by bylo možno buď snížit ztráty neuronů, nebo zvýšit hladinu tyrosinhydroxylázy (enzym, omezující syntézu dopaminu) nebo obojí.

-45CZ 285649 B6

Mimoto, stejně jako NGF, má BDNF účinek na přežívání cholinergních neuronů bazální části předního mozku krysy, jak je možno prokázat zvýšeným barvením na cholinacetyltransferázu (CAT), zvýšenou aktivitou CAT a zvýšeným barvením na acetylcholinesterázu v kulturách mediálního septálního jádra krysího embrya a jádra diagonálního svazku (Broca). Je tedy zřejmé, že by BDNF jako takový nebo ve spojení sNGF mohl být vhodnou látkou pro léčení onemocnění nebo poruch, které ovlivňují cholinergní neurony bazální části předního mozku, například včetně Alzheimerova onemocnění.

13. Příklad: Identifikace nového genu ze skupiny genů BDNF/NGF

Identifikace nových genů ze skupiny genů NGF/BDNF využitím PCR za použití degenerovaných oligonukleotidů, na základě konservace úseků aminokyselin mezi NGF a BDNF (boxy 1 - 4, odstavec 5,8) byla poprvé zkoušena při stanovení, zda páry takových primerů by bylo možno využít k amplifikaci řetězců genu pro NGF i BDNF z DNA genomu několika živočišných druhů. Tato metoda pak byla použita k identifikaci nového genu, který má homologii, společnou pro NGF a BDNF ve všech čtyřech boxech, v nichž byla homologie prokázána.

13.1. Materiály a metody

13.1.1. PCR-reakce

PCR byla prováděná v podstatě způsobem podle svrchu uvedeného odstavce 6.

13.2. Výsledky

13.2.1. Amplifikace řetězců pro NGF a BDNG z DNA genomu

Degenerované synthetické oligonukleotidy byly jako primery synthetizovány tak, aby odpovídaly částem boxu 1 a boxu 2 konservace řetězců aminokyselin mezi NGF a BDNF (odstavec 5,8 svrchu) a pak byly využity pro PCR-reakci při použití DNA krysího genomu jako templátu. Přesné řetězce primerů jsou dále uvedeny (místo degenerace se směsí dvou nebo většího počtu bází při synthéze oligonukleotidu je uvedeno v závorce, podtrženy jsou konečné úseky s obsahem většího počtu míst působení restrikčních endonukleáz k usnadnění vazby na vektor při následujícím klonování. A= adenin, G= guanin, C= cytosin, T= thymin, N = směs A, G, C a T):

Box 1 (antikódující), primer 1B: 5^,-GACTCGAGTCGACTCGGTGTGfC.T)GACAG(C.T)(A.G)T(C.T,A)AG-3'

Box 2 (kódující), primer 2C: 5'-CCAAGCTTCTAGAATTCCA(C,T)TT(N)GT(C,T)TC(A,G)(A,T)A(A,G)AA (A,G)TA(C,T)TG-3'

300 ng každé směsi degenerovaných primerů bylo přidáno k 500 ng DNA genomu krysy ve 100 mikrolitrech standardní reakční směsi pro provedení PCR. Bylo provedeno 35 cyklů, z nichž každý spočíval v inkubaci 1 minutu při 94 °C, 2 minuty při 43 °C a 2 minuty při 72 °C. Předpokládaná velikost produktu amplifikace PCR v případě genu pro NGF nebo BDNF při použití uvedených primerů by byla 175 párů bází včetně zakončení o délce 17 bází (v primerech jsou podtržena), která byla do primerů zařazena pro usnadnění následného klonování. Elektroforézou reakční směsi na 8% polyakrylamidovém gelu s 5 % glycerolu bylo možno pozorovat hlavní pás amplifikované DNA s předpokládanou velikostí 175 bp.

-46CZ 285649 B6

13.2.2. Detekce řetězců, komplementárních k sondám BDNF/NGF v DNA genomu různých živočišných druhů

Pás s materiálem o 175 bp byl z akrylamidového gelu odstraněn elektroelucí a pak amplifikován ve druhé PCR-reakci při použití sedmi cyklů za totožných reakčních podmínek až na to, že koncentrace dGTP, dATP a TTP byla snížena ve všech případech na 50 μΜ a že byl užit alfa³²P-dCTP k označení místo neznačeného dCTP. Radioaktivně značené DNA jako produkt byla od ostatních reakčních složek oddělena chromatografií na sloupci, dělícím sloučeniny podle molekulové hmotnosti. Tato sonda, označená „R1B/2C“ (pro DNA krysy amplifikovaná zprimerů IB a 2C) pak byla užita k detekci komplementárních řetězců v DNA různých druhů obratlovců (krysa, myš, kuře jsou znázorněny na obr. 13) po rozštěpení enzymem EcoRI a blotové reakci s nitrocelulózovou hybridizací Southem blot pro DNA genomu, rozštěpené pomoci EcoRI (Obr. 13).

Velikost fragmentů DNA genomu po rozštěpení enzymem EcoRI (šlo o DNA s obsahem kódových řetězců pro NGF a BDNF) byla stanovena v kontrolních a paralelních blotových reakcích při použití radioaktivně značených sond pro lidský NGF a BDNF, připravených pomocí PCR z klonovaných genů. Polohy fragmentů NGF a BDNF genomu po rozštěpení EcoRI jsou na obr. 13 označeny N a B. Výsledky podobné analýzy již byly znázorněny na obr. 3 a ekvivalentní výsledky byly získány při použití sondy pro lidský BDNF se sondou, připravenou z BDNF vepře (obr. 3). Jak již bylo svrchu uvedeno, sondy pro NGF a BDNF hybridizují na určité fragmenty EcoRI v různých DNA genomu obratlovců. Například v případě DNA krysy prokázala sonda pro BDNF pás o velikosti přibližně 8,8 kb, zatímco sonda pro NGF prokázala pás o velikosti přibližně 10,4 kb.

Jak je zřejmé z obr. 13, u každého zkoumaného druhu (údaje jsou uvedeny pro kuře, myš a krysu) sonda R1B/2C hybridizuje na pás DNA, který je neodlišitelný od pásu, identifikovaného sondou pro NGF a také na pás, který je neodlišitelný od pásu, identifikovaného sondou pro BDNF (u myši mají fragmenty genomu po štěpení enzymem EcoRI tutéž elektroforetickou motilitu, odpovídající velikosti přibližně 11,5 až 12,0 kb). To dokazuje, že degenerované oligonukleotidové primery IB a 2C je možno využít kamplifikaci řetězců genů pro NGF i pro BDNF. V některých případech byly pozorovány přídatné pásy, které při hybridizaci Southem blot z genomu rovněž hybridizovaly na sondu R1B/2C. Například v DNA genomu myši po rozštěpení enzymem EcoRI bylo možno zjistit alespoň dva další pásy (označené Xl a X2, o přibližně 19,0 kb a 1,5 kb) které neodpovídaly ani NGF ani BDNF. Podobně bylo možno pozorovat při hybridizaci na DNA krysy alespoň dva další pásy (Xl a X2 o velikosti 7,3 a 1,2 kb) a alespoň jeden takový pás bylo možno prokázat i u kuřete (X, přibližně 2,6 kb). Další pásy, které nejsou výslovně označeny na tomto obrázku, byly v některých případech rovněž pozorovány. Přítomnost pásů, které neodpovídají ani NGF ani BDNF napovídají možnost existence dalších genů z této skupiny genů. Podobně byly i při použití jiných sestav párů primerů a templátů DNA genomu nalezeny pásy, které zcela zřejmě neodpovídají pásům, které jsou známy pro geny BDNF a NGF (údaje nejsou uvedeny).

13.2.3. Identifikace nového genu, příbuzného genům pro BDNF a NGF

Specifický test na podporu hypotézy, že by bylo možno identifikovat nové geny, příbuzné genům pro NGF a BDNF pomocí PCR při použití degenerovaných oligonukleotidových primerů byl proveden při použití primerů pro box 3 a box 4 (odstavec 5,8 svrchu) a při použití DNA genomu myši jako templátů. Byly synthetizovány degenerované primery s následujícími řetězci:

Box (antikódující): 5'-GGGGATCCGCGGITG(T,C)(C,A)GIGGIAT(T,C,A)GA-3'

-47CZ 285649 B6

Box 4 (kódující) 5'-TCGAATTCTAGATIC(T,G)IAT(AG)AAIC(T,G)ICCA—3' (G= guanin, A= adenin, C= cytosin, T= thymin, 1= inosin; směsi více než jedné báze v jedné poloze jsou v závorkách). Inosin byl využit v některých polohách, které odpovídají třetí bázi kodonu, tak aby došlo k degeneraci genetického kódu. Je také možno využít směs čtyř obvyklých baží DNA místo inosinu, s takovými primery bylo dosaženo přibližně stejných výsledků.

Při použití degenerovaného páru primerů Box 3/Box 4 je možno předpokládat, že PCR řetězců pro NGF a BDNF z DNA genomu myši poskytne amplifikovaný řetězec o přibližně 90 bp. Při použití svrchu uvedených primerů byla PCR prováděna ve čtyřech cyklech při teplotě zahřívání při vazbě 45 °C, pak následovalo 31 cyklů při teplotě 49 °C. Produkty byly analyzována elektroforézou na gelu a bylo možno prokázat hlavní pás s očekávaným rozměrem. U myši obsahuje gen pro NGF místo působení restrikční endonukleázy HindlII v oblasti mezi boxem 3 a boxem 4, zatímco gen pro BDNF obsahuje v této oblasti místo štěpení enzymem Apal. Z tohoto důvodu bylo možno očekávat, že při štěpení produktu amplifikace PCR enzymy Apal a HindlII dojde k odstranění řetězců pro BDNF a NGF z produktu v hlavním pásu. Avšak v případě, že byl produkt PCR rozštěpen těmito dvěma enzymy zřejmě úplně, bylo možno prokázat pás, který byl proti štěpení těmito enzymy odolný a který byl tvořen amplifikovanou DNA. Je tedy možno předpokládat, že kromě NGF a BDNF došlo ještě k amplifikaci alespoň jednoho nového genu.

13.2.4. Charakterizace nového genu ze skupiny BDNF/NGF

Produkt PCR, který byl odolný proti rozštěpení byl z gelu vymyt a byl užit jako templát při asymetrických PCR-reakcích, v nichž byl jeden z původních degenerovaných primerů užit ve stonásobném molámím přebytku vzhledem k množství druhého primerů. Tato asymetrická amplifikace dovoluje tvorbu templátů DNA s jednoduchým řetězcem, které jsou vhodné pro analýzu řetězce metodou s ukončením řetězce. Analýza řetězce nového genu (označeného jako „M3/4“, avšak uváděného také jako neurotrofin-3) byla dále upřesněna PCR-amplifíkací řetězců mezi primerem, uloženým mezi boxy 3 a 4 a polyA-řetězcem, nacházejícím se na 3'-zakončení transkriptu genu při použití metody „rychlé amplifikace zakončení cDNA“ (RAGE) podle publikace M. A. Frohman, Μ. K. Dush a G. R. Martin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:89989002 (1988). Výsledky analýzy řetězce DNA potvrdily, že nový gen byl skutečně amplifikován a že obsahuje otevřený čtecí rámec, který je kódem pro polypeptid, odlišný jak od NGF, tak od BDNF, avšak blízce příbuzný oběma těmto látkám svým řetězcem aminokyselin (obr. 14).

Předběžný důkaz skutečnosti, že nový gen je kódem pro neurotrofní faktor byl získán stanovením exprese tohoto genu v různých tkáních krysy pomocí hybridizace Northem blot. Tato analýza prokázala, že k expresi nového genu dochází nejvíce v mozkové tkáni ve srovnání se všemi ostatními sledovanými tkáněmi.

13.3. Diskuse

Jak bylo svrchu znázorněno na obr. 3, hybridizovala sonda DNA, získaná amplifikaci PCR při použití primerů pro boxy 1 a 2 s DNA krysího genomu jako templátů (R1B/2C) na nové pásy kromě známých pásů, které obsahovaly geny pro NGF a BDNF v DNA, rozštěpené enzymem EcoRI u různých sledovaných druhů. Podobná analýza byla provedena při použití radioaktivně značené sondy pro nový gen, který byl amplifikován při použití primerů boxu 3 a 4 a DNA myšího genomu (M3/4). V každém případě hybridizovala sonda M3/4 na jediný hlavní pás DNA genomu, rozštěpené enzymem EcoRI, který byl odlišný od pásů, o nichž bylo známo, že obsahují řetězce NGF a BDNF. Je nutno uvést, že fragmenty genomu myši, krysy a kuřete po rozštěpení EcoRI při hybridizaci se sondou M3/4 jsou v každém případě v souladu s jedním z nových pásů, které byly získány hybridizaci se sondou R1B/2C. Jde o fragment DNA myši o 19,0 kb po

-48CZ 285649 B6 štěpení EcoRI (XI na obr. 14), fragment krysí DNA o 7,3 kb (XI na obr. 14), a fragment DNA kuřete o 2,6 kb (X na obr. 14). Je možno se domnívat, že části téhož genu byly amplifikovány z DNA krysy při použití páru primerů 1B/2C a z DNA myši při použití páru primerů 3/4. Je tedy zřejmé, že alespoň jeden gen má společnou homologii s geny NGF a BDNF ve všech čtyřech boxech homologie, tak jak byly uvedeny svrchu.

Koncepce homologie boxů mezi NGF, BDNF a dalšími členy této skupiny genů (například M3/4, známý také jako NT-3) byla primárně vyjádřena ve formě primárního řetězce aminokyselin přičemž bylo užito metod pro identifikaci nových genů z určité skupiny. Je však důležité uvést, že patrně existují sekundární a terciární struktury těchto neurotrofních faktorů, jejich interakce se specifickými receptory a tím i pravděpodobnost konstrukce nových molekul, které by bylo možno využít k léčebným účelům.

Například v NGF existuje 6 zbytků Cys, z nichž se všechny účastní disulfidových vazeb. Při číslování těchto zbytků od C-terminálního zakončení jako Cysl až Cys6 je známo, že disulfídové vazby jsou tvořeny Cysl-Cys4, Cys2-Cys5 a Cys3-Cys6. Poloha všech šesti zbytků Cys je v NGF a BDNF konservována a polohy 3 zbytků Cys v části genu M3/4 přesně odpovídají zbytkům Cys4, Cys5 a Cys6 v NGF a BDNF. To napovídá, že sekundární struktura všech členů této skupiny genů je patrně blízce příbuzná a do značné míry je určována konservovanými zbytky Cys. Je nutno uvést, že boxy homologie, tak jak byly uvedeny pro BDNF a NGF zahrnují 5 ze 6 zbytků Cys (Cysl v boxu 1, Cys2 v boxu 2, Cys3 v boxu 3 a Cys5 a Cys6 v boxu 4). Toto uspořádání podporuje názor, že tyto zbytky Cys a jejich bezprostředně sousedící zbytky hrají důležitou úlohu v určování obecné struktury těchto neurotrofních faktorů. Strukturní determinanty pro specifické interakce s receptory s vysokou afinitou pro každý z neurotrofních faktorů jsou patrně uloženy v předem určené části každé molekuly.

Je tedy zřejmé, že je možné konstruovat nové chimémí geny rekombinací mezi členy uvedené skupiny genů (například rekombinací in vitro nebo přímou syntézou genu) v místě kteréhokoliv boxu homologie, tak jak byly svrchu popsány nebo i jinde v molekule. Takové chimémí bílkoviny budou pravděpodobně mít podobnou sekundární strukturu vzhledem ke konservaci zbytků Cys a zbytků jiných aminokyselin, mohou však mít nové biologické vlastnosti. Například chimémí bílkovina NGF/BDNF může být bifunkční, pokud jde o interakci s receptory jak pro NGF, tak pro BDNF. Chimémí bílkoviny se také mohou lišit od výchozích molekul například dimerizací a jinými fysikálně-chemickými vlastnostmi. Chimémí bílkovina může také působit jako antagonista vzhledem k účinku výchozí molekuly.

Aktivní fragmenty BDNF/NGF je možno užít pro konstrukci dalších členů uvedené skupiny genů v závislosti na poznání kritických oblastí a také na základě informací, které oblasti jsou nezbytné pro specifickou reakci s příslušnými receptory.

Srovnání nových členů skupiny genů (například M3/4) se známými členy je možno použít k průkazu nových boxů homologie, což může napomoci vyhledávání nových členů uvedené skupiny genů. Například při srovnání M3/4 a BDNF budou objeveny určité boxy homologie. Zvláštní zájem vzbuzuje například čtvrtý konservovaný zbytek Cys, jediný, který není zahrnut do svrchu uvedených boxů 1 až 4. Mezi BDNF a M3/4 však existuje poměrně dlouhý segment totožných nebo konservovaných zbytků aminokyselin, v němž je uvedený zbytek Cys zahrnut. Jde o následující řetězec:

His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys-(Arg nebo Lys)-Thr-(Thr nebo Ser)-Gln-(Ser nebo Thr)-Tyr-

V al-Arg-Ala-Leu-Thr.

V této oblasti by mělo být možné nalézt alespoň dva boxy homologie pro syntézu použitelných degenerovaných oligonukleotidových primerů (například His-Trp-Asn-Ser-Gln-Cys vyžaduje

-49CZ 285649 B6 pouze 96násobnou degeneraci pro primer o 18 bázích nebo 48násobnou degeneraci pro primer o 17 bázích; Tyr-Val-Arg-Ala-Leu-Thr by rovněž mohl být použitelný box).

14. Příklad: Zvýšená exprese BDNF v buňkách neuroblastomu

14.1. Materiály a metody.

14.1.1. Buněčné linie

CHP100, CHP126, CHP134, CHP234, LANI, LAN5, NB9, SY5Y, Y79, F01, BU2, H01, HL60 a COL320 jsou buněčné linie, které jsou udržovány v laboratoři Dr. Fred Alt, který dodal rovněž RNA pro analýzu Northem blot, použitou v obr. 15. Všechny buněčné linie jsou buněčné linie, odvozené od lidských nádorových buněk. CHP100 je linie neuroepitheliomových buněk, CHP126, CHP134, CHP234, Lani, Lan5, NB9 a SY5Y jsou buněčné linie neuroblastomových buněk, Y79 je linie buněk retinoblastomu, F01, BU2, H01 jsou buněčné linie melanomových buněk, HL60 je linie buněk promyelocytických a COL320 je buněčná linie neuroendokrinního karcinomu tlustého střeva.

14.1.2. Příprava RNA

RNA byla připravena a analýza Northem blot byla provedena v podstatě podle odstavce 8.1.1. svrchu při použití lidské cDNA s plnou délkou jako sondy. 10 pg celkové RNA bylo použito v každé dráze gelu k analýze Northem blot podle obr. 15 až na to, že RNA v dráze 1 byla užita v nižším množství a pro buňky SY5Y byl užit 1 pg poly(A)⁺RNA.

14.2. Výsledky

Na obr. 15 jsou znázorněny výsledky analýzy northem blot při použití sondy BDNF, hybridizované na celou řadu vzorků RNA z různých druhů lidských buněčných linií. Velký podíl RNA, hybridizující na sondu BDNF byl prokázán v buněčných liniích CHP234 a LAN5, nižší množství bylo prokázáno v CHP1 a CHP134. Všechny pozitivní linie byly odvozeny od buněk lidského neuroblastomu.

15. Příklad: Řízení mRNA pro BDNF a NGF, závislé na účinnosti, vhippocampu krysy, zprostředkované ne-NMDA-glutamátovými receptory

15.1. Materiály a metody.

15.1.1. Působení kyseliny kainové na krysy

Krysám byl podán diazepam (Valium) 90 minut před intraperitoneální injekcí kyseliny kainové v dávce 12 mg/kg k potlačení příliš vysoké inhibiční účinnosti. Jak je zřejmé z obr. 19, neinterferuje Valium, podané po kyselině kainové s dalším vzestupem úrovně mRNA pro BDNF a NGF. Krysy, jimž nebylo podáno Valium, vykazovaly podobný vzestup úrovně mRNA pro NGF a BDNF v hippocampu 3 hodiny po podání kyseliny kainové ve srovnání se zvířaty, jimž byla podána kyselina kainová a pak bylo podáno Valium.

15.1.2. Příprava hippocampálních kultur

Hippocampy byly připraveny z krysích embryí ve stáří El7, materiál byl vyjmut a inkubován 20 minut při teplotě 37 °C ve fysiologickém roztoku chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru (PBS) bez vápenatých nebo hořečnatých iontů, avšak s obsahem lOmM glukózy, 1 mg/ml albuminu, 6 pg/ml DNA-ázy a 1 mg/ml papainu, hippocampální buňky byly pečlivě od sebe

-50CZ 285649 B6 odděleny pomocí vyžíhané pasteurovy pipety. Pak byly buňky odděleny odstředěním při malé rychlosti, znovu uvedeny do suspenze vDMEM, doplněny 10% fetálním telecím sérem a naneseny na kultivační plotny z plastické hmoty (0,5 x 10⁶ buněk na plotnu s průměrem 35 mm), plotny byly předem opatřeny povlakem poly-DL-omithinu (0,5 mg/ml) a lamininu (5 pg/ml). Po třech hodinách od nanesení na plotny bylo prostředí nahrazeno prostředím, prostým séra, které obsahovalo doplňky podle publikace Brewer a Cotman, Brain Res. 497: 65, 1989, avšak bez glutamátu. Životnost neuronů přetrvávala až tři týdny v této kultuře a neurony byly obvykle použity k pokusům 7 dní po nanesení na plotny.

15.1.3. Amplifikace RNA

Celková buněčná RNA byla extrahována způsobem podle publikace Chomcynski a Sacci, Anal. Biochem 1987, 162:156-159 z 0,5 x 10⁶ buněk po přidání zkrácené mRNA jako standardu pro NGF (30 fg). mRNA a cRNA pro NGF byly společně amplifíkovány v téže zkumavce v reakční směsi pro současné provedení reversní transkripce a PCR-reakce (RT/PCR) s obsahem:

1/5 extrahované RNA, 1 x RT/PCR pufr (10 mM tris-HCI o pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCh, 0,1 mg/ml želatiny a 0,1 % Tritonu X-100), 0,25 mM dNTP, 0,1 μΜ primerů 5' a 3', 5 jednotek Rnasin (Promega), 3,2 jednotek AMV-reversní transkriptázy (Life Science) a 2 jednotky Taq Polymerázy (Genofit) v celkovém objemu 25 μΐ. Směs byla převrstvena minerálním olejem, inkubována 30 minut při teplotě 41 °C, zahřáta na 92 °C na dobu 60 sekund, pak byl navázán primer 60 sekund při teplotě 55 °C a extence primeru byla provedena 60 sekund při teplotě 72 °C. Produkty amplifikace (203 bp pro mRNA NGF a 153 bp pro standard) byly odděleny na 3% NuSieve/Agarosový gel (3:1) (FMC Bioproducts), pak byla provedena blotová reakce působením báze na Hybond N - membránu (Amersham) a byla provedena hybridizace způsobem podle publikací Heumann R. a Thoenen H., 1986, J. Biol. Chem. 261, 9246, Lindhold a další, 1988, J. Biol. Chem. 263: 16348. Pro absolutní kvantifikaci byla provedena současná amplifikace mRNA pro NGF po transkripci in vitro a standardu v paralelní reakci. V současné době byla popsána podobná metoda Wangem a dalšími (PNAS 86:9717-9721, 1989).

15.2. Výsledky a diskuse

BDNF a NGF jsou členy skupiny genů, které obsahují přibližně 50 % totožných zbytků aminokyselin (leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149). Molekuly obsahují přísně konservované oblasti. V těchto oblastech je obsaženo 6 cysteinových zbytků, které se pravděpodobně účastní stabilizace trojrozměrné struktury těchto molekul, která je nutná pro jejich biologickou účinnost. Avšak NGF a BDNF obsahují také variabilní oblasti, které určují jejich specifičnost pro různé typy neuronů (Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112:319, Johnson a další, 1986, J. Neurosci. 6:3031, Hofer M. a Barde Y. 1988, Nátuře 331:261, Rodriguez-Tebar a další, 1989, Dev. Biol. 136:296). Mimoto je rozdíl mezi těmito dvěma neurotrofními molekulami prokazován také místem jejich syntézy. K expresi NGF dochází jak na periferii (Korsching S. a Thoenen H. 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:3513, Ebendal a další, 1983, Exp. Cell Res. 148: 311, Heumann a další, 1984, EMBO J. 3:3183, Dhelton D. L. a Reichardt L. F. 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:7951), tak v centrálním nervovém systému (Korsching a další, 1985, EMBO J. 4: 1489, Shelton D. L. a Reichardt L. F. 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 2714, Whittemore a další, 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 817, Large a další, 1986, Science 234:352). Hustota inervavce Neuronů které odpovídají na NGF odráží úroveň NGF v odpovídající cílové tkáni (Korsching S. a Thoenen H., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 3513, Ebendal a další, 1983, Exp. Cell Res. 148:311, Heumann a další, 1984, EMBO J., 3:3183, Dhelton D. L. a Reichardt L. F„ 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:7951, Korsching a další, 1985, EMBO J., 4:1389, Shelton D. L. a Reichardt L. F. 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:2714, Whittemore a další, 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:817, Large a další, 1986, Science 234:352). Na rozdíl od NGF dochází k expresi BDNF převážně v neuronech CNS a úroveň mRNA pro BDNF je

-51 CZ 285649 B6 podstatně vyšší než mRNA pro NGF, například 50krát v hippocampu. V periferním nervovém systému je NGF synthetizován různými buněčnými typy, odlišnými od neuronů (Bandtlow a další, 1987, EMBO J. 6:891), zatímco v mozku je syntéza lokalizována převážně v neuronech, jak je možno prokázat hybridizací in šitu (Rennert P. D. a Heinrich G., 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 138: 813, Ayer-LeLievre a další, 1988, Science 240:1339, Whittemore a další, 1988, J. Neurosci. Res. 20:403). Bylo však prokázáno, že v kultuře také astrocyty typu 1 produkují značná množství NGF (Lindsay R. M., 1979, Nátuře 282:80, Forokawa a další, 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 142:395). Relativní příspěvek neuronů a astrocytů k množství NGF, které je synthetizováno v mozku není dosud znám.

S ohledem na převážnou expresi mRNA pro BDNF i NGF v neuronech centrálního nervového systému byl soustředěn výzkum na zjištění, zda je úroveň těchto dvou typů RNA ovlivněna aktivitou neuronů a v případě, že tomu tak je, který přenašeč by se mohl účastnit v řízení. V první sérii pokusů byly připraveny kultury neuronů z hippocampu embryonálních krys (El7). Jak je zřejmé z obr. 16a, depolarizace hippocampálních neuronů velkým množstvím (50 mM) draslíku měla za následek zvýšení mRNA pro BDNF. Maximálních hodnot bylo dosaženo mezi 3 a 6 hodinami po zvýšení koncentrace draslíku. Zvýšení mRNA pro BDNF, vyvolané draslíkem bylo možno omezit vyloučením iontů vápníku z prostředí a také inhibicí vstupu vápníku použitím blokátoru vápníku nifedipinu (obr. 16b).

Vzhledem k tomu, že použité hippocampální kultury byly tvořeny smíšenou populací neuronů s různou úrovní exprese přenašeče a receptoru, bylo dále sledováno, jaký účinek mají různé fysiologické a synthetické látky, působící agonisticky s receptorem na expresi mRNA pro BDNF a NGF. Výsledky, které jsou shrnuty v tabulce VI ukazují, že ze všech zkoumaných látek kyselina kainová, agonista glutamátových receptorů (Monaghan a další, 1989, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 365) vyvolává daleko nejvyšší vzestup mRNA pro BDNF v hippocampálních neuronech. Na druhé straně jiné molekuly, například karbachol (agonista muskarinových receptorů) a do menší míry histamin a bradykinin působí slabé zvýšení avšak statisticky významné zvýšení mRNA pro BDNF (Tabulka VI). Vzhledem ktomu, že úroveň mRNA pro NGF v hippocampálních neuronech byla velmi nízká, bylo užito kvantitativní PCR, vhodné pro stanovení změn v množství mRNA pro NGF. Při použití této metody bylo prokázáno že stejně jako v případě mRNA pro BDNF, i úroveň mRNA pro NGF se zvyšuje působením draslíku a kyseliny kainové v hippocampálních neuronech (obr. 17).

Jak je znázorněno na obr. 18, maximální vzestup mRNA pro BDNF v hippocampálních neuronech byl vyvolán při použití přibližně 25 μΜ kyseliny kainové. Další zvýšení koncentrace kyseliny kainové mělo za následek snížení úrovně mRNA pro BDNF, což patrně odráží toxické působení vysoké koncentrace kyseliny kainové na hippocampální neurony (obr. 18). Neurotoxicita, zprostředkovaná glutamátovými receptory již byla dříve popsána (Choi a další, 1987, J. Neurosci. 7:357, Rothman S. M. a Olney J. W., 1987, Trends Neurosci. 10:299, Choi D. W., 1988, Neuron 1:623) pro různé centrální neurony po aplikaci analogů aminokyseliny glutamátu, která má excitační účinek. Je však možno zřetelně od sebe odlišit koncentrace kyseliny kainové, potřebné k podpoře exprese mRNA pro BDNF a NGF v neuronech hippocampu a koncentrace, které vedou k neurotoxicitě.

Aby bylo možno zkoumat účinky kyseliny kainové podrobněji, bylo sledováno, zda je možno zvýšení mRNA pro BDNF blokovat kterýmkoliv ze známých antagonistů glutamátových receptorů (Monaghan a další, Ann. Rev. Pharmacol Toxicol. 29: 365). Kynurenová kyselina, antagonista glutamátových receptorů se širokým spektrem, stejně jako CNQX, kompetitivní inhibitor ne-NMDA-receptorů (Monaghan a další, 1989, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365) úplně blokují vzestup mRNA v neuronech hippocampu, který byl vyvolán působením kyseliny kainové, jak je znázorněno v tabulce VII. Na druhé straně MK 801, který specificky blokuje receptory NMDA byl neúčinný při pokusu blokovat zvýšení úrovně mRNA pro BDNF

-52CZ 285649 B6 v těchto neuronech. Navíc NMDA jako taková nemění nijak úroveň mRNA pro BDNF, jak je zřejmé z tabulky VI. To prokazuje, že kyselina kainová působí přímo přes své receptory a že její účinek není způsoben uvolněním endogenního glutamátu (který také působí na receptory NMDA). Je tedy možno uzavřít, že kyselina kainová in vitro zvyšuje úroveň mRNA pro BDNF přes ne-NMDA-glutamátové receptory.

Tabulka VI

Účinek různých agonistů receptorů na expresi mRNA pro BDNF v kulturách neuronů

Přidaná látka (μΜ) % kontroly

O	100 ±5
karbachol (50)	220 ± 25
karbachol (50) + atropin (10)	85 ±15
nikotin (100)	110 ± 7
histamin (50)	150 ± 12
serotonin (100)	95 ±6
dopamin (100)	115 ± 7
norepinefrin (25)	75 ± 10
látka P(l)	85 ±9
somatostatin (1)	110 ± 8
bradykinin (1)	155 ± 15
kyselina kainová (25)	1365 ± 70
NMDA (25)	105 ± 10

Tabulka VII

Účinek antagonistů různých glutamátových receptorů na expresi mRNA pro BDNF, indukovanou kyselinou kainovou

Přidaná látka (μΜ) % kontroly

O	100 ±60
kyselina kainová (25)	1250 ±60
kyselina kynurenová (1)	70±6
kyselina kynurenová (1) + kyselina
kainová (25)	84±7
CNQX(10)	109 ±6
CNQX (10) + kyselina kainová (25)	105 ±7
MK-801 (5)	96±5
MK-801 (5) + kyselina kainová (25)	1130 ±80

Aby bylo možno vyhodnotit fysiologický význam pozorování, provedených in vitro, byly provedeny další studie se snahou zjistit, zda uvedené mechanismy jsou v činnosti také in vivo. Dospělým krysám kmene Wistar obojího pohlaví s hmotností 180 až 300 g bylo podání 12 mg/kg kyseliny kainové. Po různé době byly stanoveny změny mRNA pro BDNF a NGF v hippocampu a v mozkové kůře analýzou northem blot. Na obr. 19 je znázorněno, že kyselina kainová vyvolala v obou oblastech mozku vzestup úrovně mRNA proBDNF i pro NGF. Vzestup mRNA pro BDNF byl podstatně vyšší než vzestup mRNA pro NGF. Mimoto zůstala úroveň mRNA vyšší 24 hodin po podání kyseliny kainové. Časový průběh změn mRNA pro BDNF a pro NGF ukázal, že maximálního vzestupu v hippocampu bylo dosaženo přibližně 3 hodiny po podání kyseliny

-53CZ 285649 B6 kainové (obr. 19). Je zajímavé, že vzestup mRNA pro NGF a pro BDNF vhippocampu předcházelo zvýšení c-fos-mRNA. Oba fenomény mohou být tedy spolu příčinně spojeny, jak bylo v poslední době prokázáno pro n. ischiadicus po jeho poškození (Hengerer a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3899). Mimoto dochází ke vzestupu mRNA pro BDNF i pro NGF v mozkové kůře později než ke vzestupu týchž látek v hippocampu, což ukazuje na skutečnost, že signály, které vedou ke zvýšení exprese NGF a BDNF se rozšiřují z hippocampu do dalších oblastí mozku. Toto pozorování je v souladu s dřívějšími zprávami (Morgan a další, 1987, Science 237:192), které uváděly, že vzestup c-fos, vyvolaný metrazolem, působícím křeče se projevil nejprve v hippocampu a teprve potom v mozkové kůře.

Předchozí studie potvrdily, že receptory NMDA se účastní řízení mRNA v hippocampu, například NGFI-A (Cole a další, 1989, Nátuře 340: 474), byly proto provedeny další studie s cílem prokázat, zda antagonisté receptorů NMDA, MK 801 a ketamin blokují vzestup mRNA pro BDNF a NGF in vivo. Avšak při pokusech in vitro nepůsobil MK 801 inhibici vzestupu mRNA pro BDNF v hippocampu, vyvolaný kyselinou kainovou, přestože spolehlivě působil inhibici jevů, vyvolaných aktivací receptorů NMDA (obr. 20). Pravděpodobně má tato aktivace receptorů NMDA příčinu v endogenním glutamátu, který je uvolněn kyselinou kainovou (Biziere K. a Coyle T. Neurosci. 1978, Lett. 8:303. McGeer a další, 1978, Brain Res. 139:381). Na druhé straně nebyl vzestup mRNA pro NGF v hippocampu po podání kyseliny kainové brzděn ani MK801 ani ketaminem. V dřívějších studiích (Gall C. M. a Isackson P. J. 1989, Science 245:758) bylo prokázáno, že elektrolytické poškození limbu má rovněž za následek zvýšení úrovně mRNA pro NGF vhippocampu. Současné výsledky, získané při podání MK801 a kyseliny kainové však prokazují jasný rozdíl mezi uvedeným jevem a zvýšením exprese BDNF a NGF. V případě, že byl podán diazepam (Valium) krysám před injekcí kyseliny kainové, došlo k úplnému blokování vzestupu mRNA pro BDNF a NGF v hippocampu (obr. 20). Blokující účinek diazepamu na zvýšení úrovně mRNA pro BDNF a NGF je patrně výsledkem potlačení aktivity neuronů přes inhibiční GABA-ergní systém. Avšak 90 minut po podání kyseliny kainové (tj. přibližně 30 minut po začátku křečí) nebylo již možno diazepamém blokovat vzestup mRNA pro BDNF a NGF, což znamená, že poměrně krátké období zvýšené aktivity může být dostatečné k tomu, aby byl spuštěn mechanismus, který vede ke zvýšení exprese mRNA pro oba uvedené neurotrofní faktory.

Současná sledování prokázala, že ne-NMDA-receptory se mohou účastnit řízení mRNA pro BDNF a NGF v hippocampu, čímž je možno tento mechanismus odlišit od mechanismu, který byl již dříve popsán v publikaci Cole a další, 1989, Nátuře 340:474, kde se uvádí, že různé typy mRNA v hippocampu, které jsou kódem pro časně se vyskytující geny jsou patrně řízeny přes NMDA-podtypy glutamátových receptorů. Bylo uváděno, že některé účinky kyseliny kainové na neurony mohou rovněž být zprostředkovány quisqualátovým typem glutamátových receptorů (Monaghan a další, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365).

Je tedy možno uzavřít, že současné studie prokázaly, že aktivita neuronů řídí úroveň mRNA, která je kódem pro neurotrofní faktory BDNF a NGF v hippocampu a mozkové kůře krysy. Ze všech zkoumaných látek zvyšovala kyselina kainová, působící přes ne-NMDA-glutamátové receptory, úroveň mRNA pro BDNF a NGF jak in vitro, v kulturách hippocampálních neuronů, tak in vivo. Na rozdíl od toho na periferii, není možno prokázat, že syntéza NGF v neneuronových buňkách je řízena běžnými přenašeči nebo neuropeptidy, uvolněnými inervujícími (na NGF citlivými) neurony (Barth a další, 1984, J. Cell Biol. 99: 839, Hellweg a další, 1988, Exp. Cell. Res. 179:18). K expresi BDNF dochází převážně v CNS, kde se alespoň částečně překrývají centrální dráhy, užívající glutamátu jako nervového přenašeče a oblasti, poměrně bohaté na mRNA pro BDNF a NGF (Hofer a další, EMBO J., v tisku, Monaghan a další, 1989, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365). Zejména je možno pozorovat překvapující podobnost mezi distribucí in šitu (Hofer a další, EMBO J., v tisku) a receptory kyseliny kainové, tak jak byly prokázány autoradiografícky v hippocampu, mozkové kůře a v mozečku (Monaghan a další, 1989, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:365). Pozorování jsou kompatibilní

-54CZ 285649 B6 s interpretací, podle níž glutamát představuje fysiologický přenašeč, kteiý řídí mRNA pro BDNF aNGFvCNS.

16. Příklad: Neurotrofní faktor, odvozený od mozkové tkáně (BDNF) zvyšuje přežívání a diferenciaci kultur cholinergních neuronů krysího septa v kultuře

16.1. Materiály a metody

16.1.1. Příprava disociovaných buněk a podmínky při pěstování kultur

Z krys kmene Sprague-Dawley po 17 dnů gestace byla vyjmuta septální oblast a byla zbavena okolní tkáně. Fragmenty tkáně byly třikrát promyty prostředím F-10 (Ham) a pak přeneseny do kultivační misky s průměrem 35 mm a rozdrceny. Suspenze jednotlivých buněk byla připravena inkubací tkáně s 0,25% trypsinem 20 minut při 37 °C. Po inaktivaci trypsinu pětiminutovou inkubací při teplotě místnosti v růstovém prostředí s obsahem 50 pg/ml deoxyribonukleázy typu 1 (Sigma), buňky byly od sebe odděleny tak, že fragmenty byly opakovaně protlačeny zúženým koncem Pasteurovy pipety. Pak byly oddělené buňky odstředěny při 500 x g celkem 45 sekund. Supematant byl oddělen a znovu odstředěn. Usazenina volných buněk byla znovu uvedena do suspenze a bylo přidáno růstové prostředí a hustota buněk byla stanovena hemocytometrem. Nakonec byly buňky naneseny na vyhloubení s průměrem 6 mm, předem povlečená polyomithinem (10 pg/ml) a lamininem (10pg/ml). Byla ověřena životnost buněk po 24 hodinách v kultuře na základě schopnosti buněk vylučovat trypanovou modř.

Obvyklé živné prostředí 5HS/N3 pro kultury, tvořené neurony a buňkami glie obsahovalo: 5 % objemových koňského séra (Gibco), 1% objemových přísady N3 (Romijn a další, 1982, Dev. Brain. Res. 2:583-589), 0,5 % objemových glutaminu (200 mM, Gibco) a 0,25 % objemových směsi penicillinu a streptomycinu (10 000 jednotek/ml a 10000 mikrogramů/ml, Gibco) v Dulbeccově modifikaci Eaglova prostředí (DMEM). Kultury, obohacené neuronyné neurony byly připraveny tak, že živné prostředí bylo pět až šest hodin po kultivaci nahrazeno prostředím DMEM s obsahem 1 % přísady N3, 0,5 % glutaminu a 0,25 % směsi penicillinu a streptomycinu. V obou případech bylo užito cytosinarabinosidu (1 μΜ na 24 hodin) jako látky, omezující proliferaci gliálních buněk.

16. 1.2. Zkouška na účinnost cholinacetyltransferázy

Z kultur bylo odstraněno růstové prostředí dvojím promytím buněk vždy 100 μΐ PBS. Pak byly buňky rozrušeny zmrazením a opětným rozmražením a 15-minutovou inkubací při teplotě 37 °C v 50 mM KH₂PO₄ o pH 6,7 s obsahem 200 mM NaCl a 0,25 % objemových Tritonu X-100. Pak byly 2 mikrolitry materiálu analyzovány na účinnost CAT podle publikace Fonnum F., 1975, J. Neurochem. 24: 407—409. Složení konečného substrátu: 0,2 mM ¹⁴C-acetyl-CoA (NEN, 54,4 mCi/mmol), 300 mM NaCl, 8 mM cholinbromidu, 20 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové a 0,1 mM neostigminu v 50 mM NaH₂PO₄ o pH 7,4 jako pufru. Při této koncentraci enzymu a substrátu byla enzymatické reakce lineární 90 až 120 minut. Specifičnost indukce cholinacetyltransferázy byla zkoušena přidáním specifického inhibitoru účinnosti CAT, kterým je N-hydroxyethyl-4-(l-naftylvinyl)pyridium (HNP) v průběhu pokusu (White H. L., a Cavallito C. J„ 1970, J. Neurochem. 17: 1579-1989).

16.1.3. Zkouška na účinnost acetylcholinesterázy (AChE)

Množství AChE v rozrušených buňkách bylo měřeno podle publikace Potter L. T., 1967, J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 156:500-506 a Johnson C. D. a Russell R. L., 1975, Anal. Biochem. 64:229-238 s několika modifikacemi. Lysáty, připravené v 50 mM KH₂PO₄ o pH 6,7 jako pufru s obsahem 200 mM NaCl a 0,25 % objemových Tritonu X-100

-55CZ 285649 B6 byly smíseny s ³H-acetylcholinjodidem (NEN, NET-113, 73,7 mCi/mmol), ethopropazinem (0,1 mM) v 50 mM KH2PO4 o pH 7,0. Po 15 minutách inkubace při teplotě 37 °C byla reakce ukončena P5ID8N9M L00 μΐ pufru k zastavení reakce, který obsahoval 1M kyselinu chloroctovou, 0,5 M hydroxid sodný a 2,0 M chloridu sodného. Specifická účinnost AChE byla měřena za přítomnosti 1,0 (10^-6) neostigminu.

16.1.4. Měření příjmu cholinu mechanismem s vysokou afinitou

Příjem cholinu vysoce afinitním, na Na⁺ závislým mechanismem byl měřen způsobem podle publikace Vaca K. a Pilař G., 1979, J. Gen. Physiol. 73:605-628. Buňky byly jednou promyty 100 μΐ prostředí F-10 (Ham) a pak 100 μΐ Tyrodova roztoku. Po 10-minutové depolarizaci, indukované Tyrodovým roztokem s obsahem 25 mM draslíku byly buňky inkubovány 20 minut při teplotě místnosti s ³H-cholinem (NEN, NET-109, 0,11 μΜ, 86,7 Ci/mmol) v normálním Tyrodově roztoku s obsahem Na⁺ nebo Li⁺. Příjem byl zastaven dvojím promytím buněk pomocí PBS. Nahromaděný cholin byl extrahován tak, že kultura byla alespoň 20 minut inkubována se 100 μΐ chladného IN acetonového roztoku kyseliny mravenčí. Rozpustná frakce pak byla oddělena a výsledek byl změřen. Specifický příjem cholinu je rozdíl mezi celkovým a na Na⁺ nezávislým příjmem cholinu.

16.1.5. Histochemické barvení na acetylcholinesterázu

Cholinergní buňky byly identifikovány histochemickým barvením na acetylcholinesterázu při použití modifikace barvení podle publikace Geneser-Jensen a Blackstadt, 1971, Z. Zellforsch. 114:460-481. Po fixaci kultury ve 4% paraformaldehydu byly buňky inkubovány 5 až 6 dnů při 4 °C za přítomnosti roztoku s obsahem substrátu pro AChE s následujícím složením: 4 mM acetylthiocholinjodidu, 2 mM síranu měďnatého, lOmM glycinu a 10 pg/ml želatiny v 50 mM acetátového pufru o pH 5,0. Visualizace produktu byla uskutečněna podle publikace Hartikka J. a Hefti F., 1988, J. Neurosci. 8:2967-2985.

16.1.6. Histochemické barvení receptorů NGF

Kultury byly dvakrát promyty DMEM a pak byly fixovány 4% paraformaldehydem. Pak byly buňky zpracovávány 3 až 4 hodiny pufrem s fosforečnanem sodným o pH 7,4 s obsahem 5 % sérového albuminu skotu, 0,02 % Tritonu X-100 a 5 % sacharózy (Hartikka J. a Hefti F., 1988, J. Neurosci 8: 2967-2985). Receptory NGF byly prokázány při použití monoklonální protilátky 192-IgG (Taniuchi M. a Johnson E., 1985, J. Cell Biol. 101: 1100-1106, Chandler a další, 1984, J. Biol. Chem. 259: 6882-6889) a v ředění 1:1000 v pufru s obsahem 5% koňského séra. Kultury byly inkubovány se zředěnou protilátkou 15 až 18 hodin při teplotě 4 °C. Vázaný imunoglobulin myši byl detekován při použití biotinylovaného koňského IgG proti myším (1:200 Vector). Imunoreaktivní buňky byly identifikovány při použití 3', 3'-diaminobenzidinu jako substrátu pro vázaný enzym peroxidázu.

16.1.7. Čištění BDNF a NGF

Čištění BDNF bylo prováděno z mozku vepře, čištění NGF ze submaxillámí žlázy myších samců způsobem podle publikací Barde a další, 1982, EMBO J., 1:549-553, Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112:319-328. Rekombinantní BDNF, užitý pro část těchto studií již byl drive charakterizován (Maisonpierre a další, 1990, Science 247:1446-141).

16.2. Výsledky

Kultury septálních buněk byly pěstovány ve vyhloubeních, opatřených povlakem polyomithinlamininu. Bylo možno pozorovat růst neuritů, po 24 hodinách vytvářely buňky útvary

-56CZ 285649 B6 charakteristické pro neurony, které bylo možno pozorovat ve fázovém kontrastu (Obr. 21A a 21B). Při dalším růstu neuritů postupně docházelo k častějšímu vzájemnému styku mezi jednotlivými buňkami ve dnech 2 až 4 in vitro, jak je zřejmé z obr. 21C, D, E a F. I po 4 dnech bylo možno v kulturách pozorovat velmi malé množství buněk, odlišných od neuronů, což se projevuje nepřítomností plochých buněk, které jsou ve fázovém kontrastu tmavé. Aby bylo možno zjistit účinek BDNF na přežívání cholinergních neuronů septa v kultuře, bylo použito histochemického barviva pro AChE a pro receptor NGF. Typickou morfologii neuronů pozitivních na AChE je možno pozorovat na obr. 21 G a H. Několik neuronů s pozitivní reakcí na receptory NGF je možno vidět na obr. 21 I.

BDNF vyvolal 2,4-násobný vzestup počtu buněk, pozitivních na AChE v kulturách s nízkou hustotou (hustota buněk v rozmezí 66,700 až 133 300/cm²) v kulturách septálních buněk krysího embrya, jak je zřejmé z obr. 22A. Při téže hustotě buněk byl účinek NGF poněkud slabší (l,9násobek). Zjištění, že BDNF i NGF mohou zvýšit počet neuronů, pozitivních na AChE v kultuře septálních buněk urychlilo rozhodnutí zjistit, zda oba tyto faktory působí na podobné nebo odlišné populace neuronů. Jak je zřejmé z třetího pole obr. 22A, současné přidání BDNF a NGF až do nasycení nevedlo k většímu zvýšení počtu neuronů, pozitivních na AChE ve srovnání s jednotlivých působením obou faktorů. Pokud jde o přežívání neuronů, tyto výsledky ukazují, že v případě cholinergních neuronů krysího septa v kultuře musí jít v případě pozitivní odpovědi na NGF nebo na BDNF o překrývající se populace.

Účinek BDNF na přežívání neuronů, pozitivních na AChE byl závislý na hustotě, při níž byly buňky pěstovány, jak je zřejmé z obr. 22A. Při vysoké hustotě buněk /200 000 až 266 000 buněk/cm²/již ani samotný BDNF ani v kombinaci s NGF již nezpůsobí zvýšení počtu neuronů, u nichž dochází k expresi AChE. Tento jev může být způsobem zvýšenou endogenní hladinou neurotrofního účinku nebo také tím, že zvýšené přežívání je podporováno také zvýšeným stykem mezi buňkami.

Při nízké hustotě buněk se zvyšuje počet AChE-pozitivních buněk jako funkce koncentrace BDNF, maximální odpověď je možno pozorovat v dávce lOng/ml, při níž dochází ke zvýšení počtu AChE-pozitivních buněk/vyhloubení z kontrolních hodnot 169 ±12,9 na 388 ±26,2 (2,5násobný vzestup) v kulturách, k nimž byl BDNF přidán. Pro srovnání je možno uvést, že maximální odpověď na NGF bylo možno pozorovat při koncentraci této látky 50 ng/ml, tato koncentrace vyvolala zvýšení počtu AChE-pozitivních buněk/vyhloubení z původní hodnoty 121 ± 7,6 na 231 ± 12,9, to znamená l,9násobné zvýšení. Fáze, při níž křivka po určitou dobu nestoupá (plateau) je stálá na křivkách pro BDNF i pro NGF v tom smyslu, že nedošlo ke snížení AChE-pozitivních neuronů až do dávek 100 ng/ml.

Je zřejmé, že v případě kultur s nízkou hustotou buněk mohou BDNF i NGF zvýšit počet buněk, které je možno prokázat histochemicky pomocí AChE. Je možné, že tento vzestup může být způsoben záchranou cholinergních buněk, které by v kultuře zahynuly bez růstového faktoru, nebo může jít o zvýšení počtu prekursorových buněk nebo o indukci cholinergního značení, AChE. Aby bylo možno tyto možnosti od sebe odlišit, byly provedeny další pokusy, při nichž byly uvedené látky přidány později (obr. 23) v sériích kultur, které byly pěstovány celkem 12 dnů. K jedné skupině kultur byly látky přidány 5 až 6 hodin po nanesení na plotny a kultura pak byla pěstována až do 12. dne v přítomnosti BDNF nebo NGF. Druhá skupina kultur byla pěstována bez růstového faktoru 5 dnů a pak byl na dalších 7 dnů přidán NGF nebo BDNF (-5/+7). Při srovnání těchto dvou skupin kultur byla odpověď na BDNF nebo NGF, přidané až po pěti dnech pěstování v podstatě stejná jako v případě, že byly buňky kontinuálně pěstovány v přítomnosti těchto faktorů (jak je zřejmé ze srovnání plných a šrafovaných sloupců na obr. 23). Avšak výsledky byly zcela rozdílné ve třetí skupině kultur, v nichž byl NGF nebo BDNF přítomen pouze posledních pět dnů (-7/+5). Za těchto podmínek již nedošlo v přítomnosti BDNF ani v přítomnosti NGF ke zvýšení počtu buněk, pozitivních na AChE. V dalších pokusech bylo prokázáno, že vystavení septálních neuronů jen na 3—4 dny vlivu NGF nebo BDNF je dostatečné

-57CZ 285649 B6 k velkému zvýšení počtu buněk s aktivitou AChE, kterou je možno prokázat příslušným barvením. To znamená, že skutečnost, že u kultur ,,-7/+5“ nedošlo ke zvýšení počtu AChEpozitivních neuronů nebyla způsobena tím, že by růstový faktor nebyl v době exposice schopen vyvolat zvýšení počtu těchto buněk.

In vivo bylo prokázáno (Montero C. a Hefti F., 1988, J. Neurosci. 8:2986-2999, Higgins a další, 1989, Neuron. 3: 247-256), že NGF je schopen řídit úroveň svých vlastních receptorů, jak je možno prokázat měřením úrovně mRNA. Stejnou schopnost bylo možno prokázat i in vitro. Vzhledem k tomu, že BDNF má podobné účinky jako NGF při indukci cholinergního fenotypu a při přežívání septálních buněk v kultuře, byla zkoumána možnost, zda BDNF neřídí úroveň receptorů pro NGF. K tomuto účelu byl zjištěn počet IgG-pozitivních buněk. Při koncentraci BDNF 10 ng/ml došlo ke trojnásobnému zvýšení počtu imunopozitivních buněk s receptory pro NGF, jak je zřejmé z obr. 24. Je zajímavé, že při vyšších koncentracích (25 až 100 ng/ml) byl účinek BDNF postupně stále méně vyznačen. Z křivky závislosti účinku na dávce tedy byl zřejmý velký rozdíl ve srovnání s účinkem BDNF na jiné parametry těchto kultur, například na počet AChE-pozitivních buněk. Jako pozitivní kontrola byly užity buňky, pěstované v přítomnosti NGF v koncentraci 50 ng/ml, tato koncentrace vyvolávala trojnásobný vzestup počtu pozitivních buněk. Na bázi barvení IgG-192 bylo tedy možno prokázat, že BDNF má přibližně stejný účinek jako NGF při řízení exprese receptorů pro NGF.

Kromě účinků na přežívání buněk byla zkoumána také možnost, že by BDNF mohl vyvolávat vznik cholinergního fenotypu. U kultur septálních buněk, pěstovaných za přítomnosti zvyšující se koncentrace BDNF až do 50 ng/ml bylo možno pozorovat lineární vzestup aktivity CAT, nejvyšší odpověď byla l,8násobné zvýšení oproti kontrole, jak je zřejmé z obr. 25. Při indukci účinnosti CAT v paralelních kulturách s přidáním NGF bylo dosaženo olateau při koncentraci 25 ng/ml, což znamená zvýšení 3,4krát ve srovnání s kontrolními hodnotami. Odpověď na BDNF ani NGF nevykazovala podstatné snížení při koncentraci třikrát vyšší než odpovídá nasycení. Indukce aktivity CAT v přítomnosti NGF ani BDNF neovlivnila hladinu transferázy, nezávislé na /N-hydroxyethyl—4-( l-naftylvinyl)pyridium/HNP.

Vzhledem ke zjištění, že BDNF i NGF vyvolává zvýšení účinnosti CAT v buňkách septa, byla studována odpověď na současné působení obou těchto faktorů, výsledky jsou uvedeny v tabulce VIII. V těchto pokusech bylo užito dvou koncentrací BDNF, 5 a 25 ng/ml, došlo ke zvýšení účinnosti CAT 1,4 a 2,6krát. V případě, že byl účinek NGF v dávce 50 ng/ml, která sama zvyšuje účinnost enzymu 2,8krát kombinován s účinkem BDNF, byl účinek na aktivitu CAT alespoň aditivní, jak je z tabulky VII rovněž zřejmé. V použité koncentraci BDNF by čistě aditivní účinek vedl spolu s použitím NGF ke zvýšení 4,2 a 5,4krát ve srovnání s kontrolní hodnotou. Pozorované hodnoty tedy byly o něco vyšší než aditivní.

Tabulka VIII

Vliv současného přidání NGF a BDNF na aktivitu CAT

Koncentrace ng/ml	účinnost CAT pmol/h/vx	% kontroly
Kontrola	561,3 ±34,8
NGF (50)	1546,3 ± 89,7	280
BDNF (5)	768,0 ± 25,5	140
BDNF (25)	1470,1 ± 66,2	260
NGF (50) + BDNF (5)	2767,6 ± 177,2	490
NGF (50) + BDNF (25)	3742,0 ± 669,3	670

^x v = vyhloubení

-58CZ 285649 B6

Buňky septa byly pěstovány po dobu 12 dnů v prostředí 5HS/N3 za přítomnosti uvedených koncentrací trofíckých faktorů. Aktivita CAT byla změřena a popsána. Uvedené hodnoty jsou průměr ± průměrná standardní odchylka ze 4 až 5 stanovení.

Byla zkoumána také možnost, že biologická odpověď, pozorovaná při podání BDNF by mohla být důsledkem uvolňování endogenního NGF v závislosti na BDNF. Aby bylo možno tento vztah studovat, byla užita monoklonální protilátka proti NGF (protilátka 27/21, Korsching a Thoenen, 1983) k blokování jakékoliv odpovědi, spojené sNGF. Jak je znázorněno v tabulce IX, byl účinek NGF na účinnost CAT podstatně snížen protilátkou proti NGF, zatímco odpověď, vyvolaná podáním BDNF byla v podstatě nezměněna. Je však nutno uvést, že bazální úroveň účinnosti CAT byla přibližně o 20 % snížena u kultur, jimž byla podávána pouze protilátka proti NGF, ve srovnání s kontrolními kulturami bez ošetření. Avšak pozorovaný vzestup účinnosti CAT u kultur septálních buněk po podání BDNF je patrně přímým účinkem a nikoliv účinkem, kteiý by byl zprostředkován zvýšením koncentrace endogenního NGF.

Tabulka IX

Účinek protilátek proti NGF na schopnost NGF a BDNF indukovat aktivitu enzymu CAT

Účinnost enzymu CAT

koncentrace ng/ml	(pmol/h/vyhloubení)	% kontroly
kontrola	517,53 ±3,2
BDNF (25)	1021,6 ± 106,1	197
NGF (50)	1139,0 ±99,1	220
kontrola + protilátka
proti NGF	418,7 ±27,0	81
BDNF + protilátka
proti NGF	819,2 ±68,8	158
NGF ± protilátka
proti NGF	551,0 ±27,0	107

Po dvanáctidenním růstu v prostředí 5HS/N3 za přítomnosti uvedených koncentrací trofíckých faktorů byly spetální buňky (nanesené v hustotě 2,3 (10⁵) buněk/cm²) odděleny. Účinnost CAT byla stanovena způsobem, popsaným v metodické stati. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± střední odchylka od průměru ze 6 stanovení.

Byla rovněž sledována možnost, že AChE je koordinovaně řízena spolu s účinností CAT působením BDNF nebo NGF (obr. 26). Na rozdíl od účinnosti CAT nebyla závislost účinku na dávce pro AChE při působení BDNF nebo NGF byla při srovnání obou trofíckých faktorů podobná v tom smyslu, že účinnost enzymu se zvyšovala lineárně až do koncentrace 50 ng/ml. Při této koncentraci zvyšovaly NGF a BDNF účinnost CAT o 274 a 234 % ve srovnání s kontrolními hodnotami, získanými v nepřítomnosti těchto faktorů.

Byla zkoumána také doba, po které dochází k indukci zvýšení účinnosti CAT (obr. 27). Účinnost CAT v kulturách, knimž bylo přidáno 50 ng/ml BDNF se zvýšila na 170% kontrolní hodnoty v průběhu 3 dnů. Tento vzestup pokračoval až do dne 6, kdy se začalo vytvářet plateau na hodnotě, rovné 2,5násobku kontrolní hodnoty a hodnota se již v průběhu pokusu nezvyšovala. Oproti tomu při sledování odpovědi CAT na NGF v koncentraci 50 ng/ml bylo zjištěno, že třetího dne již bylo dosaženo 2,5násobku kontrolní hodnoty. Pak vzestup pokračoval lineárně, až po 12 dnech dosáhl 3,2násobku kontrolních hodnot.

-59CZ 285649 B6

Bylo prokázáno, že astrocyty, pěstované v kultuře po určitou dobu synthetizují celou řadu neurotrofních látek kromě NGF (Lindsay, R. M., 1979, Nátuře 282: 80-82, Lindsay a další, 1982, Brain Res. 243: 329-343, Alderson a další, 1989, Dev. Brain Res. 48: 229-241). Přestože byla připuštěna možnost, že současná pozorování účinku BDNF jsou zprostředkována přes vzestup koncentrace NGF je možné, že BDNF může působit nepřímo tak, že mění expresi jiných neurotrofních faktorů, zejména v buňkách glie. Aby bylo možné odhadnout možnost, že buňky, odlišné od neuronů by mohly ovlivnit vliv BDNF na účinnost CAT v septálních kulturách, byla srovnávána odpověď cholinergních neuronů na BDNF v kulturách směsí gliálních buněk a neuronů a v kulturách, obohacených neurony (obr. 28). V kulturách, obohacených neurony měla křivka závislosti účinku CAT na BDNF tvar zvonu, maximálního vzestupu bylo dosaženo při dávce 5 ng/ml BDNF a při koncentraci 25 ng/ml již bylo možno pozorovat podstatný pokles enzymatické účinnosti (p 0,001, ve srovnání s 15 až 25 ng/ml BDNF). Obdobně, jako je tomu u výsledků, znázorněných na obr. 25, odpověď CAT na BDNF za přítomnosti souvislé vrstvy gliálních buněk byla lineární, v tomto případě až do 25 ng/ml BDNF, což byla nejvyšší zkoumaná dávka. Za přítomnosti buněk, odlišných od neuronů je tedy zapotřebí vyšší koncentrace BDNF k vyvolání ekvivalentního vzestupu účinnosti CAT, jakého je možno dosáhnout v kulturách, obohacených neurony. Nezávisle na této skutečnosti byla schopnost maximálně stimulovat aktivitu CAT u cholinergních neuronů septa v podstatě stejná za přítomnosti i v nepřítomnosti gliálních buněk.

Na bázi účinnosti CAT a AChE je zjevné, že BDNF může mít v podstatě stejný účinek, pokud jde o podporu fenotypového značení cholinergních buněk. Aby bylo možno tuto skutečnost podrobněji studovat, byl srovnáván účinek BDNF na příjem cholinu, závislý na sodíkových iontech, s účinkem NGF (Obr. 29). Buňky, které byly 12 dnů pěstovány za přítomnosti 50 ng/ml BDNF akumulovaly cholin 3,8násobně ve srovnání s neošetřenými kontrolami. V paralelních kulturách byl NGF v dávce 25 ng/ml schopen vyvolat 2,3násobný vzestup akumulace cholinu.

16.3. Diskuse

Ve srovnání s prokázanými účinky na periferní neurony (Barde a další, 1982, EMBO J., 1:549— 553, Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112:319-328, Davies a další, 1986, J. Neurosci. 6: 1897— 1904, Hofer M. a Barde Y., 1988, Nátuře 331:262-262) je specifičnost působení BDNF v oblasti centrálního nervového systému méně dobře charakterizována. Až dosud je možno považovat za jediné buňky CNS, které na tento faktor odpovídají, malou subpopulaci Thy-l-pozitivních buněk sítnicových ganglií, které byly poprvé identifikovány v sítnici krysích embryí El7 (Johnson a další, 1986, J. Neurosci. 6:3031-3038). Další sledování prokázalo rovněž účinek BDNF na sítnicová ganglia dospělých krys v explantátech (Thanos a další, 1989, Eur. J. Neuro. 1:19-26. V současných pokusech bylo prokázáno, že BDNF zvyšuje přežívání cholinergních neuronů z embryonálního septa krys v kultuře, jak bylo prokázáno histochemickým barvením AChE a zvyšuje expresi různých fenotypických cholinergních značení, tj. enzymatickou účinnost AChE a CAT a vysoký příjem cholinu. Mimoto bylo prokázáno, že BDNF zvyšuje expresi receptoru pro NGF v kultuře septálních buněk.

V počátečních pokusech bylo prokázáno, že BDNF zvyšuje počet neuronů, pozitivních na acetylcholinesterázu AChE v kulturách septálních buněk embryí E17 přibližně na dvojnásobek. Stejně, jako tomu je v případě NGF (Hartikka J. a Hefti F., 1988, J. Neurosci. 8: 2967-2985) byl tento účinek nejzřejmější při nízkých hustotách buněk. Je zajímavé, že současné přidání NGF a BDNF nemělo žádný účinek, pokud jde o další vzestup AChE-pozitivních buněk nad úroveň, pozorovanou v přítomnosti kteréhokoliv a růstových faktorů jednotlivě. Toto pozorování podporuje teorii, že BDNF a NGF patrně působí na tutéž populaci cholinergních neuronů septa.

Jak již bylo uváděno pro NGF (Hefti a další, 1985, Neuroscience 1:55-68), BDNF nepodporuje přežívání cholinergních neuronů v kulturách při poměrně vysoké hustotě buněk. V poměru

-60CZ 285649 B6 k pěstovaným buňkám bylo přežívání cholinergních neuronů vyšší při vyšší než při nižší hustotě buněk i v nepřítomnosti jakéhokoliv neurotrofního faktoru. Je několik možných vysvětlení působení tohoto buněčného vzájemného styku, možnost příznivého účinku většího počtu buněk, odlišných od neuronů nebo vyšší než proporcionální vzestup endogenního neurotrofního účinku. Pokud jde o poslední možnost, nebylo možno prokázat žádnou známku toho, že by bylo podstatněji zvýšeno množství endogenního NGF vzhledem k tomu, že přidání přebytku protilátky proti NGF u neošetřených buněk s vyšší hustotou snížilo bazální aktivitu CAT pouze o 20 %.

V těchto kulturách zvyšoval exogenní NGF účinnost CAT až 3,4krát.

Jak bylo možno pozorovat jak na úrovni bílkovin, tak na úrovni mRNA, existuje nyní mnoho zpráv, které se týkají možnosti, že NGF může sám zpětně řídit expresi svého vlastního receptoru na pěstovaných neuronech i in vivo. V současných pokusech bylo užito monoklonální protilátky IgG-192 k detekci receptoru pro NGF. Tato monoklonální protilátka byla charakterizována jak na sensorických neuronech krysy, tak na krysím mozku (Taniuchi M. a Johnson E., 1985, J. Cell. Biol. 101:1100-1106). Bylo potvrzeno zjištění Hartikky a Heftiho, že NGF může regulovat množství svého receptoru v kulturách septa, jak bylo možno prokázat zvýšením počtu IgG-192imunopozitivních neuronů, a mimoto bylo prokázáno, že BDNF zvyšuje počet IgG-192imunopozitivních buněk až třikrát. Odpověď na BDNF je dvoufázová v tom smyslu, že vysoké koncentrace v rozmezí 25-100 ng/ml již nevyvolávají tak vysoký vzestup pozitivních buněk, jaký je možno pozorovat při koncentraci 10 ng/ml. Je zajímavé, že tento typ závislosti odpovědi na dávce je zcela rozdílný od typu odpovědi, kterou je možno pozorovat pro vzestup počtu AChEpozitivních neuronů po podání BDNF. Při tomto typu odpovědi nebylo možno pozorovat snížení maximálního účinku BDNF při vyšších koncentracích. Je nutno uvést, že receptor pro NGF s nízkou afinitou je rovněž schopen vázat BDNF s obdobnou afinitou, jak bylo v poslední době prokázáno, což vede k domněnce, že by receptory s nízkou afinitou mohly být identické pro BDNF i NGF (Rodriguez-Tebat a další, 1990, Binding of Barin-derived Neurotrophic Factor to the Nerve Growth Factor Receptor Neuron. 4, 487-492).

Na možnou podobnost mechanismu účinku BDNF a NGF bylo usuzováno na základě zjištění, že BDNF je v případě indukce aktivity AChE stejně účinný jako NGF. Přestože bylo prokázáno, že BDNF podporuje přežívání cholinergních neuronů v podobné míře jako NGF, účinek BDNF na enzymatickou účinnost CAT nebyl tak vysoký jako účinek NGF. Při provádění řady pokusů bylo dosaženo maximální indukce CAT 1,8 až 2,6krát, zatímco v případě NGF je možno běžně dosáhnout trojnásobného zvýšení. Je tedy patrné, že přestože existuje určitá podobnost mezi mechanismem účinku BDN F a NGF, je přesto pravděpodobné, že existují rovněž určité rozdíly v expresi a řízení odpovídajících receptorů a vazby těchto receptorů na cesty, jimiž dochází k indukci účinnosti CAT.

Předpoklad, že rozdíl v úrovni indukce účinnosti CAT, vyvolaný BDNF nebo NGF by mohl být důsledkem různých cest řízení byl dále podporován výsledky pokusů, sledujících účinky těchto látek v průběhu času. Septální neurony, pěstované v kultuře odpovídaly na přítomnost BDNF vzestupem účinnosti CAT až do dne 6, kdy se odpověď zastavila na určité úrovni. Na rozdíl od tohoto pozorování v přítomnosti NGF dochází k indukci účinnosti CAT pomaleji v rozmezí dnů 3 až 12. Zastavení vzestupu indukce účinnosti CAT ve dni 6 za přítomnosti BDNF může být ukazatelem vývojové změny v expresi receptorů pro BDNF nebo složky, nezbytné při vyvolávání odpovědi. S ohledem na to, že počet cholinergních neuronů (AChE-pozitivních neuronů) v kulturách s vysokou hustotou buněk po 12 dnech je zřejmě nezávislý na exogenním přívodu BDNF nebo NGF, je nepravděpodobné, že by diferencované uhynutí neuronů mohlo být příčinou časových rozdílů, pozorovaných při indukci účinnosti CAT u těchto dvou růstových faktorů.

V počátečních pokusech, při nichž bylo sledováno působení BDNF na cholinergní buňky bazální části předního mozku nebyl proveden žádný předpoklad, pokud jde o primární typ buněk, neuronový nebo gliální, který by mohl odpovídat na tento neurotrofhí faktor. Přestože pokusy, provedené na vysoce obohacených kulturách periferních neuronů silně napovídaly, že BDNF

-61 CZ 285649 B6 působí přímo na neurony (Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112:319-328, Lindsay, 1988, J. Neurosci. 7:2394-2405), je také možno připustit, že účinek BDNF na neurony, pozorovaný při současných pokusech by mohl být způsoben přes primární účinek BDNF na astrologii nebo jiné buňky neneuronové povahy. Bylo však také prokázáno, že BDNF je stejně účinný při vyvolávání 5 indukce účinnosti CAT za přítomnosti souvislé vrstvy převážně astrogliálních buněk nebo v kulturách, které byly do značné míry zbaveny gliálních buněk působením inhibitorů mitózy, cytosinarabinosidu. Zajímavým pozorováním při těchto pokusech byla skutečnost, že tvar křivky závislosti odpovědi na dávce pro BDNF měl v obou případech zjevnou odlišnost. V přítomnosti souvislé vrstvy gliálních buněk byla odpověď na BDNF lineární při zvyšující se koncentraci ío BDNF. V kulturách, obohacených neurony bylo možno pozorovat posun křivky závislosti odpovědi na dávce doleva. Možným vysvětlením pro tyto výsledky je, že i u gliálních buněk jako takových může docházet k expresi receptoru pro BDNF, čímž se současně sníží účinná koncentrace ligandu, dostupná pro receptor, uložený na neuronu. Je také možné, že supresivní účinek astrocytů je nepřímý a není spojen s účinkem na koncentraci ligandu nebo na expresi 15 receptoru a je zprostředkován například vysoce zvýšenou regradací BDNF. Podobná pozorování uvedli také Hartikka a Hefti, 1988, J. Neurosci. 8:2967-2985 a Honegger a Lenoir, 1982, Dev. Brain. Res., 3:229-238. Bylo prokázáno, že gliální buňky z různých oblastí mozku mohou do značné míry ovlivnit morfologii neuronů, které jsou s nimi spojeny (Prochiantz a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:5387-5391, Prochiantz a další, 1981, Nátuře 293:570-572). 20 Septální glie tedy může mít vnitřní působení buď na membrány, nebo na sekreční struktuiy a tímto způsobem může potlačit expresi cholinergního fenotypu. V poslední době jsou zkoumány řídicí vlastnosti astrocytů, odvozených od hippocampu za podobných pokusných podmínek.

Na základě zjištěných skutečností je zřejmé, že jak BDNF, tak NGF mohou zvýšit cholinergní 25 funkce neuronů septa. Je zajímavé pokusit se o zhodnocení fysiologického působení těchto dvou vysoce homologních neurotrofních faktorů, které zjevně působí na tutéž populaci neuronů. Je pravděpodobné, že působení BDNF a NGF se může na počátku překrývat v průběhu časného vývoje periferních neuronů, zvláště u subpopulací ganglií dorsálních kořenů nebo u prekursorů těchto neuronů, a pak později může dojít k rozlišení tak, že oba faktory působí na odlišné 30 populace (Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112: 319-328, Ersberger U. a Rohrer H, 1988, Dev,

Biol. 126:420-432, Barde Y. A., 1989, Neuron. 2:1525-1534). Tyto skutečnosti však prozatím nebyly prokázány při použití příslušného značení, tak aby bylo možno definovat subpopulace sensorických neuronů. Vzhledem ktomu, že současné studie byly zaměřena na embryonální septální neurony v kultuře v určitém časovém období E17 je možné, v septu může docházet i 35 v jiných časových obdobích, zejména v pozdějších vývojových stadiích k podobným segregativním fenoménům. Může se ukázat, že existují zajímavé časové a prostorové rozdíly v odpovědi septálních cholinergních neuronů na NGF a BDNF.

Bude také zajímavé prozkoumat účinky BDNF na cholinergní neurony bazální části předního 40 mozku in vivo, v této části mozku bylo prozatím prokázáno, že NGF, odvozený od hippocampu se patrně účastní normálního vývoje a udržování cholinergních neuronů bazální části předního mozku in vivo. Bude zajímavé zjistit, zda BDNF má nebo nemá podobnou úlohu in vivo. Současné zjištění, že mRNA pro BDNF se nachází v hippocampu ve zvláště vysokém množství podporuje tuto možnost.

17. Příklad: Enzymatická přeměna prepro BDNF na účinný, úplný BDNF

17.1. Materiály a metody.

Běžně dodávaná endoproteináza Arg-C (čištěná ze submaxilámích žláz myši) byla užita k enzymatické přeměně velké prekursorové formy hBDNF (preproBDNF) na biologicky účinnou bílkovinu. Toto enzymatické štěpení bylo provedeno in vitro. Substrátem pro enzymatickou reakci byl preproBDNF, synthetizovaný v buňkách CHO-DG44, látka byla vylučována do živného prostředí, odkud byla izolována. Jako živné prostředí bylo užito prostředí Hamovo, F12

-62CZ 285649 B6 (prosté nukleosidů) s přídavkem 1% fetálního séra skotu (FBS) a 1% penicillinu i streptomycinu. Reakce byla prováděna 5 minut při teplotě 37 °C při použití 5 jednotek enzymu a 50 μΐ supematantu buněk CHO-DG44 s obsahem prepro hBDNF. Za těchto podmínek proběhlo úplně rozštěpení preprohBDNF na hBDNF.

17.2. Výsledky a diskuse

Prepro-forma rekombinantního hBDNF s molekulovou hmotností přibližně 31 000 byla úplně zpracována na biologicky účinnou formu hBDNF s molekulovou hmotností přibližně 12 000 in vitro při použití endoproteinázy Arg-C. Rekombinantní hBDNF byl úspěšně získán produkcí v savčích buňkách CHO-DG44. Gen pro hBDNF byl stabilně integrován do genomu buněk CHO a byl amplifíkován při použití methotrexatu. Rekombinantní hBDNF byl vylučován do živného prostředí a bylo prokázáno, že je biologicky účinný. Metabolické značení s následnou elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu prokázalo, že většina synthetizovaného, ³⁵S-značeného hBDNF, vyloučeného do živného prostředí migrovala v prepro-formě ze zjevnou molekulovou hmotností 31 000, jak je zřejmé z dráhy 2 na obr. 30. ³⁵S-značené bílkoviny, produkované divokým typem buněk CHO-DG44 jsou znázorněny ve dráze 1 na obr. 30. Aby bylo možno získat převážně zralou formu hBDNF se zjevnou molekulovou hmotností 12 000, bylo užito postupu in vitro k enzymatickému rozštěpení prepro-formy BDNF.

Produkty štěpení trypsinem jsou znázorněny ve drahách 3 až 6 na obr. 30. Trypsin ze slinivky skotu, prostý chymotrypsinu (Worthington) byl rozpuštěn ve fysiologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem a enzym byl přidán k jednotlivým podílům 50 μΐ ²⁵S-značeného hBDNF z buněk CHO. Bylo užito koncentrací trypsinu 25, 50, 75 a 100pg/ml. ³⁵S-značené reakční produkty jsou znázorněny ve drahách 3 až 6. Enzymatické štěpení bylo prováděno při teplotě 37 °C celkem 5 minut. Bylo možno pozorovat postupný pokles intensity značení preproformy s molekulovou hmotností 31 000 a odpovídající vzestup značení produktu s molekulovou hmotností 18 500. Za těchto podmínek nebylo možno dosáhnout vzniku zralé účinné formy s molekulovou hmotností 12 000. V dráze 7 na obr. 30 jsou znázorněny reakční produkty, značené ³⁵S po provedení enzymatického štěpení hBDNF z buněk CHO působením endoproteinázy Arg-C, izolované ze submaxillámí žlázy myši (Boehringer Mannheim Biochemicals, lne.). 100 jednotek tohoto enzymu bylo rekonstituováno z lyofilizovaného prostředku při použití 100 μΐ vody Milli—Q a roztok byl skladován při teplotě -20 °C. Pro enzymatické rozštěpení hBDNF z buněk CHO bylo užito 5 jednotek (5 μΐ) enzymu a 50 μΐ ³⁵Sznačené bílkoviny ze supematantu buněk CHO s obsahem preprohBDNF (dráha 2 na obr. 30). Jak je z obr. 30 zřejmé, 5 jednotek endoproteinázy Arg-C bylo schopno převést prepro-formu hBDNF s molekulovou hmotností 31 000 ne zralou formu hBDNF s molekulovou hmotností 12 000 v průběhu 5 minut při teplotě 37 °C.

Enzymatické zpracování supematantů buněk CHO, u nichž dochází k expresi hBDNF endoproteinázou Arg-C vede ke zvýšení úrovně biologické účinnosti BDNF ve srovnání se supematanty, které tímto způsobem zpracovány nebyly. Supematanty buněk CHO-DG44, u nichž dochází k expresi hBDNF byly 5 minut zpracovávány endoproteinázou Arg-C při teplotě 37 °C. Ke 200 μΐ supematantu bylo přidáno 20 jednotek enzymu a jak zpracovaný, tak nezpracovaný hBDNF byl zkoumán na biologickou účinnost při použití explantátů E8 kuřecích ganglií z dorsálních kořenů. 24 hodin po přidání hBDNF byl kvalitativně hodnocen růst neuritů. Vždy bylo možno pozorovat, že vzorky, zpracované endoproteinázou byly významně biologicky aktivnější než kontrolní nezpracované vzorky. Křivka závislosti na koncentraci pro tyto hodnoty je uvedena na obr. 31.

Je tedy možno uzavřít, že čištěnou endoproteinázu Arg-C je možno užít při enzymatické reakci in vitro k získání zralé, biologicky účinné formy rekombinantního hBDNF z neúplně zpracovaných prekursorů BDNF. Tento nový postup umožní získávat ve velkém množství

-63 CZ 285649 B6 biologicky aktivní hBDNF z kultur savčích buněk. Mělo by například být možné imobilizovat endoproteinázu Arg-C na pevnou matrici a tímto způsobem získat možnost účinného chromatografíckého zpracování.

18. Příklad: BDNF podporuje přežívání a zrání dopaminergních neuronů ventrálního mesencephala krysy

18.1. Materiály a metody

18.1.1. Buněčné kultury

Disociované kultury byly připraveny enzymatickým a mechanickým dělením tkáně ventrálního mesencephala, které bylo vyjmuto z E14 - El5 krysích embryí. Postup byl obvykle prováděn tak, že dva až tři litry směsi uvedené tkáně z krysích embryí, narozených z krys, jejichž páření bylo načasováno, byly zpracovány působením trypsinu (0,125%, Worthington) v prostředí F12 (Gobco) 20 minut při teplotě 37 °C. Po promytí růstovým prostředím (MEM s následujícími doplňky: Glutamin 2 mM, Glukóza 6 mg/ml, penicillin G 0,5 jednotek/ml, streptomycin 5 pg/ml, fetální telecí sérum 7,5 %) byla tkáň krátce odstředěna nízkou rychlostí celkem 5 minut a peleta byla rozetřena. Po usazení shluků v době 1 až 2 minut byla suspenze jednotlivých buněk nanesena na plotny s průměrem 35 mm (předem opatřené povlakem polyomithinu a lamininu podle publikace Lindsay a další, 1985, Dev. Biol 112: 319) s obsahem růstového prostředí, bylo užito hustoty 5 x 10⁴ buněk na cm². Po inkubaci přes noc v růstovém prostředí k dosažení spojení buněk byly buňky pěstovány za přítomnosti nebo v nepřítomnosti BDNF v definovaném prostředí, prostém séra (Bottenstein a Sáto, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:514) stím rozdílem, že byl přidán insulin v dávce 20 ng/ml. Aby bylo možno zviditelnit dopaminergní buňky, byly kultury fixovány 4% paraformaldehydem, důkladně promyty, zpracovány 0,02% Sapninem v Sorensenově pufru s 1,5 koňského séra a pak barveny myší monoklonální protilátkou proti TH krysy (Boehringer Mannheim). Primární vazba protilátky byla visualizována při použití zkušebního balíčku Vectastain ABC kit (Vector Labs).

18.1.2. Měření příjmu dopaminu

Kultury byly připraveny způsobem, popsaným v odstavci 18.1.1 a byly pěstovány po uvedený počet dnů buď za přítomnosti, nebo v nepřítomnosti BDNF vepře v množství 50 ng/ml. Příjem dopaminu byl měřen vždy v trojím opakování v uvedených časových bodech. Buňky byly předběžně promyty pufrem pro sledování příjmu s následujícím složením: 136,8 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8 mM Na₂HPO₄.7 H₂O, 1,5 mM KH₂PO₄, 5 mM glukózy, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgSO₄, 0,1 mM askorbátu a 0,1 mM pargylinu při pH 7,4. Vzorky, na nichž měl být měřen příjem ³H-dopaminu neneuronálními buňkami obsahovaly benztropin v koncentraci 5 μΜ. Po promytí byly buňky předehřátý na teplotu 37 °C po dobu 5 minut v čerstvém pufru pro sledování příjmu a pak byl přidán ³H-dopamin (NEN, 40 Ci(mmol) do konečné koncentrace 50 nM. Kultury byly inkubovány 15 minut při 37 °C, pak byl roztok odstraněn a buňky byly uloženy do ledu a čtyřikrát promyty ledově chladným pufrem pro příjem. Pak byly buňky odděleny přidáním 0,5 N NaOH do ploten a v NaOH extraktu byla stanovena radioaktivita při použití scintilačního počítače (Beckman) se scintilační kapalinou v množství 15 ml (Ultima Gold, Packard Instruments). Specifický příjem dopaminu neurony je definován jako to množství (v impulsech za minutu), které je možno pozorovat v přítomnosti BZT minus množství, pozorované za přítomnosti BZT. Obvykle bylo možno dosáhnout inhibice 70 až 90 % celkového příjmu působením BZT. V opakovaných zkouškách bylo v kulturách v každém časovém období stanoveno množství neuronů TH+ imunocytochemickým barvením a výsledky representují příjem, normalizovaný na bázi TH+.

-64CZ 285649 B6

18.1.3. Přechodná exprese BDNF

Buňky COS M5 byly podrobeny transfekci vektorem CDM8, obsahujícím kódový řetězec pro lidský BDNF. 72 hodin po transfekci bylo odebráno 50 ml supematantu kultury a dialyzováno proti 6M močovině. Dialyzovaný supematant pak byl smísen na 4,5 hodin s ampholiny (pH 3,5 až 10, BioRad). Byly odebírány frakce, které byly dialyzovány proti 5M Na₂PO₄ o pH 7,6 při použití dialyzační trubice, která byla předem promyta BSA (0,5 mg/ml), aby nedošlo k nespecifické absorpci. Frakce byly zkoušeny na schopnost podporovat růst neuritů v kulturách explantátů ganglií dorsálních kořenů kuřete. Účinné frakce byly spojeny a analýzovány na SDS PAGE s následným barvením stříbrem (Wray a další, 1981, Anal. Biochem. 118:197), na 8.18% gelu bylo možno pozorovat slabý pás s molekulovou hmotností 68 000, odpovídající BSA a pás při přibližně molekulové hmotnosti 12 000, odpovídající dříve pozorovanému pásu pro BDNF vepře (Barde a další, 1982, EMBO J., 1:549). Ve srovnávacích studiích, které byly provedeny na explantátech ganglií dorsálních kořenů, ganglion nodosum a na sympatických gangliích kuřete byla specifická účinnost a specifičnost pro neurony v případě rekombinantního lidského BDNF podobná vlastnostem čištěného BDNF vepře.

18.1.4. Příprava hBDNF z buněk CHO po transfekci

Buňky CHO-DG44 byly získány jako dar od Dr. L. Chasina (Columbia University, NY). Těmto buňkám chybí dihydrofolátreduktáza (dhfr-) (Urlaub and Chasin, 1980, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220). Buňky CHO-DG44 byly udržovány na Hamově prostředí F12 s 10% fetálního séra skotu, 1 % penicillinu a streptomycinu a 2 mM glutaminu. Buňky byly přeočkovávány dvakrát týdně a byly obvyklým způsobem zkoumány na kontaminaci mycoplasmaty. Veškerá plasmidová DNA byla čištěna před transfekci při použití chloridu česného. Gen pro hBDNF byl subklonován ve vektoru pro expresi savčího původu pCDM8 ža vzniku plasmidu pC8hB, jak již bylo popsáno (Maisonpierre a další, 1990, Science 247: 14461451). Zeslabený gen pro dihydrofolátreduktázu, p410, byl získán jako dar od Dr. L. Chasina. Tyto dvě konstrukce byly společně užity k transfekci buněk CHO-DG44 otevřením pórů působením elektrického proudu (souhrnný článek Shikegawa a Dower, 1988, BioTehcniques 6:742-751). Transfekci bylo podrobeno přibližně 1 x 10⁶ buněk při použití 20 pg pC8hB a 0,2 pg p410. 48 hodin po transfekci byly buňky CHO-DG44 rozděleny do selekčních prostředí, bylo užito nukleosidů prosté Hamovo prostředí F12 (bez thymidinu a hypoxanthinu; -HT) s 10 % dialyzovaného fetálního séra skotu a 1 % penicillinu a streptomycinu. Jednotlivé kolonie byly izolovány přibližně 10 dnů po uložení buněk do selekčního prostředí, prostého nukleosidů. Jednotlivé kolonie, odolné proti Hamovu prostředí F12 bez nukleosidů (-HT) pak byly podrobeny působení 0,02, 0,05 nebo 0,1 pM methotrexatu (MTX) k indukci amplifikace genu (Alt a další, 1989, J. Biol. Chem. 253:1357-1370). MTX-resistentní kolonie byly pěstovány ve směsi a byly dále amplifikovány při použití 1,5, 2,0 nebo 2,5 pM MTX. Byla izolována jediná kolonie, odolná proti 2,5 pM MTX a tato kolonie byla podrobena selekci na produkci hBDNF a účinnost v kultuře. Při analýze Southem blot tohoto klonu (DGZ1000-B-3-2,5) bylo možno prokázat amplifikaci genu pro BDNF ve srovnání s divokým typem buněk CHO-DG44 přibližně 50x. Při biologických zkouškách na explantátech embryonálních (E8) kuřecích gangliích dorsálních kořenů (DRG) bylo možno prokázat, že tento klon produkoval přibližně 9,5 pg hBDNF/ml. Rekombinantní hBDNF byl produkován ve velkém měřítku pěstováním buněk DGZ1000-B-3-2,5 v lahvích s objemem 480 ml. Prostředí bylo izolováno přibližně čtyři dny poté, kdy buňky vytvořily souvislou vrstvu. Čištění hBDNF ze supematantu kultury bylo provedeno stejným způsobem jako svrchu čištění supematantu buněk COS.

18.2. Výsledky a diskuse

Charakterizace molekulárních signálů, které řídí přežívání neuronů a specifičnost cílové inervace má základní důležitost nejen vzhledem ktomu, že může osvětlit stavbu nervového systému, ale

-65CZ 285649 B6 také proto, že může vést k lepšímu pochopení mechanismu, který se účastní udržování a regenerace zralých neuronů v příslušných synaptických konfiguracích. I když je v současné době široce uznáváno, že přežití a regenerace neuronů závisí na specifických, od cílových buněk odvozených neurotrofních faktorech, (Levi-Montalcini a Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Thoenen a Barde, 1980, Physiol. Rev. 60: 1284, Purves D., 1988, in Body and Brain, Harvard University Press, Cambridge, MA, Barde Y.A., 1989, Neuron 2:1525, Lindsay R. M., 1988, The Making of the Nervous Systém, Oxford University Press, Oxford, str. 148) až dosud bylo jen velmi málo takových molekul plně charakterizováno. Až dosud bylo prokázáno pouze pro dva neurotrofní faktory, a to pro růstový faktor nervů (NGF) a mozkový neurotrofní faktor (BDNF), že tyto faktory selektivně podporují přežití určitých populací neuronů in vivo (Levi-Montalcini a Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48: 534, Barde Y. A., 1989, Neuron 2:1525, Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149).

Buněčné kultury neuronů jsou široce používány pro biologické zkoušky k identifikaci neurotrofní účinnosti v extraktech tkání a buněk (Levi-Montalcini a Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Thoenen a Barde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284, Lindsay R. M., 1988, The Making of the Nervous Systém, Oxford University Press, Oxford, str. 148, Varon and Adler, 1981, Adv. Cell. Neurobiol. 2:118) a ke stanovení specifičnosti čištěných neurotrofních faktorů pro neurony (Ebendal T., 1989, Nerve Growth Factors, John Wiley, London, str. 81, Barbin a další, 1984, J. Neurochem. 43:1468, Barde a další, 1982, EMBO. J., 1:549, Davies a další, 1986, J. Neurosci. 6:1897, Lindsay a další, 1985, Dev. Biol. 112:319). Až dosud se většina výzkumů soustředila na neurotrofní požadavky různých skupin neuronů periferního nervového systému ONS). Dostupnost NGF byla příčinou skutečnosti, že tato látka je až dosud nejlépe charakterizovaným neurotrofním faktorem. Jak bylo prokázáno in vitro i in vivo, je NGF podstatný pro přežití a udržování subpopulací neuronů jak v PNS, tak v CNS (Levi-Montalcini a Angeletti, 1968, Physiol. Rev. 48:534, Thoenen a Barde, 1980, Physiol. Rev. 60:1284, Whittemore a Seiger,

1987, Brain Res. Rev. 12:439, Snider and Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26:489, Hefti a další, 1989, Neurobiology of Aging 10:515, Martinez a další, 1987, Brain Res. 412:295, Takei a další,

1988, J. Neurochem. 51:1118, Hartikka a Hefti, 1988, J. Neurosci. 8: 2967). Brzdicím faktorem pro identifikaci neurotrofních růstových faktorů pro specifické neurony CNS byla omezená dostupnost čištěných preparátů neurotrofních faktorů s výjimkou NGF a obtížné připravování homogenních preparátů specifických populací neuronů. Dvě současná sledování urychlila studium účinků BDNF na přežití dopaminergních neuronů v substantia nigra. Především je zřejmé, že k expresi genu pro BDNF dochází v CNS, a to ve srovnatelných nebo vyšších množstvích než k expresi genu pro NGF (Leibrock a další, 1989, Nátuře 341:149). Za druhé se prokázalo, že bílkovina, částečně čištěná z corpus striatum skotu (cílová tkáň dopaminergních neuronů substantia nigra) sivlastnostmi, zjevně podobnými vlastnostem BDNF může zvýšit in vitro přežívání dopaminergních neuronů, připravených z mesecephala (Dal Toso a další, 1988, J. Neurosci 8-733).

Na obr. 32A je znázorněn typický vzhled disociovaných ventrálních mesencephalických buněk po devíti dnech ve tkáňové kultuře. V téměř všech buňkách je možno pozorovat jasnou perikaryotickou oblast a dlouhé výběžky. Je obsaženo také několik buněk s morfologií fibroblastů, avšak žádné astrogliální buňky v případě, že kultury byly barveny pomocí protilátek na označení astrologie, tj. bílkovinu kyselé povahy zfibril glie (GFAP; Bignami a další, 1972, Brain Res. 43:429). Aby bylo možno visualizovat dopaminergní neurony v této kultuře, bylo provedeno imunocytochemické barvení při použití monoklonálních protilátek proti TH. Jak bylo možno očekávat, počet TH+ neuronů byl malý (šipky na obr. 32B a 32C) a měnil se v závislosti na době pěstování kultury v rozmezí 0,1 až 0,5 % z pěstovaných buněk. Mezi buňkami TH+ bylo možno pozorovat různou morfologii neuronů, jak je zřejmé z obr. 33.

Ve všech kulturách bez rozdílu bylo možno pozorovat postupný pokles počtu TH+ buněk, jak je zřejmé z obr. 34A a 35, po prvních 3 až 4 dnech in vitro. Po 8 dnech kultury tvořil například počet TH+ buněk v kontrolních kulturách pouze 25 % počtu těchto buněk v obdobných kulturách

-66CZ 285649 B6 ve dni 2, jak je zřejmé z obr. 35. Avšak v kulturách, ošetřených BDNF byla ztráta buněk TH+ podstatně nižší než v kontrolních kulturách. Ve všech časových intervalech po dni 8 in vitro byl počet buněk TH+ v kulturách, ošetřených přidáním BDNF in vitro vyšší než v neošetřených kontrolách, například l,8krát vyšší po jediném přidání BDNF (obr. 34A) a 5krát vyšší po opakovaném podání (obr. 35). I když byl BDNF přidán pouze jedenkrát do kultur, udržovaných po dobu 8 dnů, bylo možno prokázat, že účinek BDNF je závislý na dávce (obr. 34A). V souladu s předchozími zprávami (Dal Toso a další, 1988, J. Neurosci 8:733, Knusel a další, 1990, J. Neurosci. 10: 558) neměl NGF v dávce 50 ng/ml žádný vliv na počet buněk TH+ (obr. 34C).

Jako další způsob pro zjištění účinku BDNF na dopaminergní neurony v těchto kulturách byla studována schopnost buněk TH+ přijímat ³H-dopamin. Jak je zřejmé z tabulky X, schopnost přijímat dopamin (propočítaná najeden neuron TH+) se význačně zvyšovala v průběhu prvních 8 dnů pěstování v kultuře, avšak pak klesala. Bylo však prokázáno, že BDNF nijak nemění schopnost buněk TH+ přijímat dopamin vzhledem k tomu, že v průběhu téhož časového období bylo možno pozorovat obdobné hodnoty v přítomnosti i za nepřítomnosti BDNF (tabulka X). Z tohoto výsledku je možno usoudit, že BDNF pravděpodobně působí přímo na přežívání dopaminergních neuronů v kultuře mesencephalické tkáně na rozdíl od indukce exprese dopaminergního fenotypu v neuronech, které nevyžadují nezbytně ke svému přežití BDNF. Aby bylo možno tento jev dále sledovat, byly provedeny pokusy, v nichž byl v kultuře stanoven počet neuronů TH+ a současně bylo přidáni BDNF odloženo o několik dnů. Bylo prokázáno, že v případě, že bylo přidání BDNF odloženo až do dne 5 a počet buněk TH+ byl stanoven ve dnech 6, 8 nebo 10, bylo možno pozorovat v těchto kulturách menší počet dopaminergních buněk ve srovnání s paralelními kulturami, v nichž byl BDNF přítomen ode dne 2 (obr. 36). Přestože opožděné přidání BDNF zřejmě zvýšilo počet neuronů TH+ ve srovnání s kontrolními kulturami při odečítání výsledků v ekvivalentních časových údobích, při opožděném přidání této látky již nedochází k přežití tolika neuronů TH+jako v případě, že se BDNF ke kultuře přidá již ve dni 2.

Je tedy zřejmé, že uvedené výsledky svědčí proti možnosti, že by BDNF působil pouze zvýšením exprese genu pro TH při fixovaném počtu buněk, je naopak pravděpodobné, že BDNF účinkuje zvýšením přežívání dopaminergních neuronů, které by jinak byly ztraceny v případě, že by tento neurotrofní faktor nebyl ke kultuře přidán v časném stadiu.

Několik zpráv dokumentuje stimulaci zrání a zlepšení přežívání dopaminergních mesencephalických neuronů in vitro po přidání extraktu z cílové tkáně různých růstových faktorů (Dal Toso a další, 1988, J. Neurosci. 8:733, Knusel a další, 1990. J. Neurosci 10:558, Prochiantz a další, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:5387, DiPorzio a další, 1980, Nátuře 288:370, Prochiantz a další, 1981, Nátuře 293:570, Denis-Donini a další, 1983, J. Neurosci. 3:2292). Až dosud však nebyla podána zpráva o žádné plně čištěné molekule, která by přímo a selektivně podporovala přežívání neuronů TH+ v úplné nepřítomnosti gliálních buněk nebo by podporovala dělení buněk (jak bylo pozorováno například v případě IGF-1 nebo FGF, Dal Toso a další, 1988, J. Neurosci 8:733). V souladu s předchozími zprávami s použití, časné embryonální tkáně myší (Dal Toso a další, 1988, J. Neurosci 8:733) bylo prokázáno, že buňky ventrálního mesencaphala krysy El4, pěstované v definovaném prostředí, prostém séra byly v podstatě prosté astrocytů nebo fibroblastů. Poměrně malá hustota buněk 50 000 buněk/cm² při těchto pokusech snižovala účinek jakéhokoliv endogenního neurotrofního faktoru a dovolovala přesnější počítání buněk. Vzhledem k uváděným výsledkům je zřejmé, že neurotrofní faktor, částečně čištěný z corpus striatum skotu (Dal Toso a další, 1988, J. Neurosci 8:733) je patrně BDNF. Je pravděpodobné, že BDNF je produkován v corpus striatum a přijímán zakončeními dopaminergních neuronů, vycházejícími ze substantia nigra. Až dosud však nebylo možno prokázat mRNA pro BDNF (nebo mRNA pro jakýkoliv jiný faktor ze skupiny neurotrofních faktorů) ve větším množství ve tkáni corpus striatum pomocí analýzy Northem blot.

Je zřejmé, že přidání BDNF, i v případě opakovaného přidání, nemá za následek přežití všech dopaminergních neuronů substantia nigra v průběhu analyzovaných období pěstování v kultuře.

-67CZ 285649 B6

Tento fenomen již byl pozorován za pokusných podmínek, velmi podobných současně použitým podmínkám (Dal Toso a další, 1988, J. Neurosci 8:733), při nichž se ukázalo, že tato ztráta buněk může být v souvislosti s použitou hustotou buněk. Při vyšších hustotách (až 4krát vyšších než byly použity v současné době) je možno pozorovat vyšší počet katecholaminfluorescenčních buněk a spontánní vymizení těchto buněk bylo sníženo. Je možné, že k dlouhodobému přežití těchto buněk je zapotřebí styku mezi buňkami.

Bude ještě zapotřebí provést další studie, zvláště zaměřené na zjištění účinků BDNF na vývoj a udržování dopaminergních neuronů ventrálního mesencephala in vivo, tak aby bylo možno stanovit fysiologický význam účinků BDNF, který byl nyní popsán. Vzhledem ke specifickým ztrátám dopaminergních neuronů v substantia nigra u Parkinsonovy choroby je zvláště žádoucí nalézt neurotrofní faktor, který by tyto buňky selektivně ovlivňoval. Současná zjištění, že BDNF podporuje přežívání těchto neuronů, to znamená buněk, které jsou refraktemí vzhledem k působení NGF opodstatňují provedení pokusů na zvířatech za účelem zjištění, zda BDNF může chránit dopaminergní neurony před neurotoxickými účinky 6-hydroxydopaminu nebo MPTP (1methyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridinu). Tyto výzkumy by mohly vést k novému therapeutickému přístupu k Parkinsonově chorobě.

Tabulka X

BDNF přímo nezvyšuje příjem dopaminu v buňkách ventrálního mesencephala příjem ³H - dopaminu (impulsy za minutu/TH/(+)neuron/15 min.)

dny v kultuře	kontroly	po podání BDNF
3	0,51 ±0,1	0,95 ± 0,2
6	4,5 ± 0,3	3,1 ±0,6
8	18,5 ±5,3	27,3 ± 1,2
10	3,37 ±0,24	2,21 ±0,18

19. Příklad: BDNF vyvolává v závislosti na dávce inhibici příjmu kyseliny gammaaminomáselné

19.1. Materiál a metody

19.1.1. Kultury hippokampálních buněk

Hippocampy byly vyjmuty z krysích embryí El 8-19 kmene Sprague-Dawley a byly uloženy do prostředí F10. Tkáň byla rozdrcena, dvakrát propláchnuta prostředím F10 (Gibco) a pak byla zpracována působením 0,25 % trypsinu (Gibco) po dobu 20 minut při teplotě 37 °C. Trypsin byl inaktivován přidáním prostředí s obsahem séra, které bylo tvořeno minimálním základním prostředím (MEM), doplněným 10% fetálního telecího séra (FSC). 2 mM glutaminu, 25 jednotek/ml penicillinu a 25 pg na 1 ml streptomycinu. Disociované buňky, získané opatrným rozetřením byly odděleny a odstředěny při nízké rychlosti 500 otáček za minutu po dobu 30 sekund. Odstředění bylo dvakrát opakováno a pelety buněk pak byly uvedeny do suspenze v prostředí s obsahem séra. Pak byly buňky naneseny na plotny s vyhloubeními o průměru 6 mm nebo na plotny s průměrem 35 mm, povlečené polyomithinem (lOpg/ml) a lamininem (10 pg/ml). Ve většině pokusů byly buňky naneseny na plotny s nízkou hustotou přibližně 71 000 buněk/cm². 5 až 6 hodin po nanesení buněk na plotny bylo prostředí vyměněno za prostředí, prosté séra, obsahující 1 % N3 a 25 jednotek penicillinu v ml a 25 pg streptomycinu v 1 ml, v této době byl přidán BDNF. Prostředí bylo měněno každé 3 nebo 4 dny a současně byl vždy přidán také neurotrofní faktor.

-68CZ 285649 B6

19.1.2. Měření příjmu kyseliny gamma-aminomáselné (GABA) s vysokou afinitou

Měření bylo prováděno při použití modifikovaného postupu podle publikace Tomozawa a Appel, 1986, Brain Res. 399:111-124. Buňky byly promyty pufrem pro příjem GABA s obsahem 140 mM NaCl, 2,6 mM KC1, 1 mM KH2PO4, 1 mM Na2HPC>4, 6 mg/ml glukózy, 1 mM MgCh, 1 mM CaCl₂, 0,1 % BSA. Po promytí byly buňky inkubovány v pufru pro příjem GABA 5 minut při teplotě 37 °C. Pak byla přidána ³H-GABA (NEN, NET-191X, 111,4 Ci/mmol) do konečné koncentrace 12 nM a inkubace byla dále prováděna 10 minut při teplotě 37 °C. Pak byly buňky uloženy do ledu a třikrát promyty pufrem pro příjem. Pak byly buňky inkubovány 2 hodiny s 0,14 N NaOH při teplotě místnosti, načež bylo odečteno množství GABA v extraktu. Bylo prokázáno, že příjem ³H-GABA je lineární po dobu alespoň 30 minut. Příjem GABA do neneuronálních buněk byl brzděn přidáním 2 mM B-alaninu, zatímco příjem, specifický pro neurony byl ověřen inhibici kyselinou nipekotovou v koncentraci 1 mM.

19.2. Výsledky a diskuse

V poslední době bylo prokázáno výjimečně velké množství mRNA pro BDNF v kulturách buněk hippocampu, obohacených o neurony, avšak nikoliv v astrocytech hippocampu. Tyto údaje silně napovídají, že BDNF je lokalizován v neuronech hippocampu. Aby bylo možno sledovat účinek BDNF na hippocampální neurony v kultuře, byly buňky podrobeny působení různých koncentrací BDNF (čištěného ze supematantu buněk COS). Na konci osmidenního období působení byl měřen příjem GABA neurony s vysokou afinitou. Jak je zřejmé z obr. 37, BDNF působí v závislosti na dávce inhibici příjmu GABA. BDNF tedy může ovlivnit přežívání a/nebo expresi fenotypu GABAergních neuronů. BDNF však neměl žádný vliv na neurony, obsahující glutamát (jak bylo měřeno příjmem glutaminu) ani na množství bílkovin v nervových vláknech. Účinek BDNF na kultury hippocampálních buněk je tedy zřejmě specifický účinek na GABAergní neurony.

20. Příklad: BDNF má ochranný účinek proti toxickému účinku MPP+

20.1. Materiály a metody

20.1.1. Měření účinků neurotrofních faktorů na buňky SH-SY5Y při působení MPP+

Buňky SH-SY5Y byly naneseny na plotny s 24 vyhloubeními v hustotě 1 x 10⁵ buněk najedno vyhloubení. Po 24 hodinách byl přidán neurotrofní faktor. Po 24 hodinách po přidání neurotrofního faktoru bylo k buňkám přidáno 10 μΜ MPP+. Po 48 hodinách po přidání MPP+ byly spočítány životaschopné buňky po barvení trypanovou modří. Použitým neurotrofním faktorem byl mNGF-COD v ředění 1:5, hBDNF-COS (ředění 1:5), čištěný rCNTF zE. coli (25 ng/ml), čištěný bFGF z mozku skotu (25 ng/ml), rNT3-COS (ředění 1:5) a čištěný hEGF (25 ng/ml).

20.1.2. Měření účinku neurotrofních faktorů na kultury buněk ventrálního mesencephala po působení MPP+

Kultury disociovaných neuronů ventrálního mesencephala byly získány z krysích embryí El4, jak bylo svrchu popsáno v odstavci 18. Po 48 hodinách po založení kultur byl přidán příslušný neurotrofní faktor, a to hBDNF (čištěný z buněk COS v množství <50 ng/ml), čištěný mNGF (50 ng/ml), rNT-3 (Supematant buněk COS v ředění 1:50), čištěný bFGF z mozku skotu (10 ng/ml) nebo čištěný rCNTF (25 ng/ml zE. coli). Po 24 hodinách po přidání neurotrofního faktoru byl ke kulturám přidán 1 μΜ MPP+. Po 48 hodinách po přidání této látky byly identifikovány TH+-neurony imunohistochemicky a byly stanoveny kvantitativně. Údaje znamenají průměr ze tří nezávislých pokusů, přičemž v každém pokusu byly užity tři vzorky.

-69CZ 285649 B6

Počet TH+ neuronů po působení MPP+ je vyznačen šrafovanými sloupky. Prázdné sloupky znamenají počet TH-pozitivních neuronů bez působení MPP+.

20.2. Výsledky a diskuse

V případě, že byly faktory BDNF, NGF, NT-3, bFGF a EGF odděleně na svou schopnost chránit buňky SH-SY5Y před toxickým působením l-methyl-4-fenylpyridiniového iontu (MPP+), jak bylo měřeno pomocí barvení trypanovou modří, pouze BDNF a NGF měly statisticky významný ochranný účinek proti tomuto toxickému působení, jak je zřejmé z následujících tabulek XI a ΧΠ.

Tabulka XI

Ochrana buněk SH-SY5Y proti toxicitě MPP+ působením BDNF a NGF

Ošetření kultur: Počet životaschopných buněk (%) simulovaná transfekce COS (1:5) 0,4 x 10⁴ (5 %)

BDNF-COS (1:5) 1,2 xlO⁵ (67%)

NGF-COS(1:5) 1,7 xlO⁵ (84%)

CNTF 0,6 xlO⁴ (14%)

NT-3 0,7x 10⁴ (20%) bFGF 0,4x10⁴ (11%)

EGF 0,1 x 10⁴ (3 %)

Tabulka XII

Závislost koncentrace BDNF a NGF na jejich účinku při pokusech na inhibici toxicity MPP+

Ošetření

COS-MOCK* (1:2) (1:5) (1:10) (1:20) (1:50) (1:100)

COS-BDNF (1:2) (1:5) (1:10) (1:20) (1:50) (1:100)

COS-NGF (1:2) (1:5) (1:10) (1:20) (1:50) (1:100) *MOCK = simulovaná transfekce % životaschopných buněk

-70CZ 285649 B6

V kulturách buněk ventrálního mesencephala údaje prokazují, že BDNF má statisticky významný ochranný účinek proti toxicitě MPP+, zatímco bFGF má menší účinek, jak je zřejmé z obr. 38. Bylo prokázáno, že působením MPP+ dojde ke snížení počtu neuronů, pozitivních na tyrosinhydroxylázu o 85 % v kontrolních kulturách, zatímco v kulturách, které byly zpracovány působením BDNF před působením MPP+ došlo ke snížení pouze o 40 %. MPP+ je předpokládaný účinný metabolit toxinu MPTP, u něhož bylo prokázáno, že in vivo může způsobit vznik syndromu, obdobného projevů, Parkinsonovy choroby, takže jde o uznávaný modelový systém pro Parkinsonovu chorobu. Ochranný účinek BDNF a NGF tedy ukazuje, že by tyto sloučeniny mohly být účinné při léčení Parkinsonovy choroby nebo při prevenci neurologického poškození po vystavení účinku toxických látek.

21. Uložení mikroorganismů.

Dne 30. srpna 1989 byly ve veřejné sbírce Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 uloženy : rekombinantní bakteriofág a rekombinantní plasmidová DNA pod následujícími čísly:

Označení phBDNF-C-1 lambdahBDNF-G-1

ATCC číslo

40648

40649

Vynález byl popsán v souvislosti s několika specifickými provedeními, je však zřejmé že existuje ještě řada modifikací, rovněž spadajících do oboru vynálezu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (28)

1. Čištěná molekula DNA obsahující kódový řetězec nukleových kyselin pro zralý neurotrofní faktor odvozený od mozkové tkáně BDNF s následujícím řetězcem aminokyselin

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp

Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val ThF

Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr

Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp

Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala

Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe

Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile

Lys Arg Gly Arg nebo subsekvence řetězce, která je kódem pro polypeptid s účinností BDNF.

2. Čištěná molekula DNA podle nároku 1, tak, jak je znázorněna na obr. 5 nukleotidy 1 až 1615 lidského řetězce nebo subsekvence této molekuly, která je kódem pro polypeptid s účinností BDNF.

-71 CZ 285649 B6

3. Čištěná molekula nukleové kyseliny, homologní s molekulou DNA podle nároků 1 nebo 2 nebo komplementární této molekule nebo subsekvence této molekuly, která je kódem pro polypeptid s účinností BDNF.

4. Čištěná molekula DNA podle nároku 2, se sekvencí obsahující nukleotidy 974 až 1330 z obr. 5, pro zralý BDNF člověka.

5. Čištěná molekula DNA podle nároku 2, obsažená v plazmidu phBDNF-C-1, uloženém ve sbírce ATCC pod číslem 40648, nebo obsažená v lambdaBDNF-G-1, uloženém ve sbírce ATCC pod číslem 40649.

6. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, nebo čištěná molekula DNA podle některého z nároků 1, 2, 4 a 5, schopná exprese BDNF nebo jeho peptidového fragmentu v hostitelské buňce pod řízením řídícího řetězce DNA.

7. Vektor ze skupiny phBDNF-C-1, uložený ve sbírce ATCC pod číslem 40648 a lambdaBDNF-G-1, uložený ve sbírce ATCC pod číslem 40649.

8. Způsob výroby BDNF ve formě bílkoviny, vyznačující se tím, že se pěstuje hostitelská eukaryotická nebo prokaryotická buňka, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároků 1 až 6 nebo vektor podle nároku 7, přičemž dochází k expresi kódové molekuly DNA pro uvedený faktor a BDNF ve formě bílkoviny se po expresi izoluje.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující setím, že se jako prokaryotická buňka užije bakterie.

10. Čištěná bílkovina ve formě izolované a nedenaturované bílkoviny s neurotrofním účinkem a s následujícím řetězcem aminokyselin

Met His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp

Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr

Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr

Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp

Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala

Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe

Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile

Lys Arg Gly Arg nebo s částí tohoto řetězce s účinností BDNF.

11. Čištěná bílkovina ve formě izolované a nedenaturované bílkoviny podle nároku 10 s neurotrofním účinkem a s následujícím řetězcem aminokyselin

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp

Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr

Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr

Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe

-72CZ 285649 B6

Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile

Lys Arg Gly Arg nebo s částí tohoto řetězce s účinností BDNF.

12. Čištěná bílkovina ve formě izolované a nedenaturované bílkoviny podle nároku 10 s neurotrofním účinkem a s následujícím řetězcem aminokyselin

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser

Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp

Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr

Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin Leu Lys

Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr

Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp

Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala

Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe

Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile

Lys Arg Gly nebo s částí tohoto řetězce s účinností BDNF.

13. Způsob výroby čištěné bílkoviny v izolované a nedenaturované formě podle nároku 11, vyznačující se tím, že se uskuteční exprese kódové nukleové kyseliny pro tuto bílkovinu v ovariálních buňkách čínského křečka a vytvořená bílkovina se izoluje.

14. Způsob výroby čištěné bílkoviny v izolované a nedenaturované formě podle nároku 10, vyznačující se tím, že se uskuteční exprese kódové nukleové kyseliny pro tuto bílkovinu v bakteriálních buňkách a vytvořená bílkovina se izoluje.

15. Farmaceutický prostředek pro léčení chorob nervového systému, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje čištěný, izolovaný a nedenaturovaný BDNF ve formě bílkoviny s účinností BDNF podle nároků 10 až 12 a mimoto obsahuje farmaceutický nosič.

16. Farmaceutický prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje nosič pro pomalé uvolnění účinné látky.

17. Protilátka, specificky rozpoznávající bílkovinu BDNF podle některého z nároků 10 až 12 nebo její fragment nebo derivát.

18. Molekula protilátky podle nároku 17, s rozpoznatelným značením pro použití při diagnostických postupech k průkazu onemocnění nebo poruch nervového systému.

19. BDNF ve formě bílkoviny s účinností DBNF podle některého z nároků 10 až 12 pro použití k léčení onemocnění nebo poruch nervového systému nebo při diagnostice těchto onemocnění nebo poruch.

20. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 19, pro použití k léčení poruch nebo onemocnění senzorických neuronů.

21. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 20 pro použití k léčení diabetické neuropathie jako poruchy sensorických neuronů.

-73CZ 285649 B6

22. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 19 pro použití k léčení poruch nebo onemocnění cholinergních neuronů.

23. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 22 pro léčení poruch nebo onemocnění cholinergních neuronů v bazální části předního mozku nebo v septu.

24. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 19 pro léčení Alzheimerovy choroby, Huntingtonovy choroby, onemocnění sítnice, Parkinsonovy choroby, Parkinsonova plussyndromu nebo diabetické neuropathie.

25. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 19 pro léčení poruch nebo onemocnění dopaminergních neuronů.

26. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 25 pro léčení Parkinsonovy choroby.

27. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 19 pro léčení stavů poškození nervového systému.

28. BDNF ve formě bílkoviny podle nároku 27 k léčení poruch nebo poškození ze skupiny úrazů, chirurgických zákroků, infarktů, infekcí, zhoubných nádorů, působení toxických látek, nedostatku živin nebo při diabetické neuropathii.