CZ285096A3 - Enzymatic antimicrobial preparation, dna, vector and use of vanadiumhaloperoxidase - Google Patents

Abstract

An antimicrobial composition is provided, comprising a Vanadium haloperoxidase, a source of halide and hydrogen peroxide or a source of hydrogen peroxide. Preferably, the Vanadium haloperoxidase is a chloroperoxidase obtainable from Curvularia inaequalis.

Description

Vynález se týká enzymatického antimikrobiálního prostředku, který obsahuje vanadiumhalogenperoxidázu, zdroj peroxidu vodíku a zdroj halogenidu. Uvedený enzym je možno získat genetickým inženýrstvím.The invention relates to an enzymatic antimicrobial composition comprising a vanadium haloperoxidase, a hydrogen peroxide source and a halide source. The enzyme can be obtained by genetic engineering.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Je známa celá řada enzymatických antimikrobiálních prostředků. Například W0-A-94/04217 popisuje stabilizovaný prostředek pro čištění zubů, při jahož použití je zajištěna antimikrobiálně účinná koncentrace hypothiokyanitových iontů, OSCN . Prostředek obsahuje oxidoreduktázu k získání peroxidu vodíku a peroxidázu, schopnou oxidovat thiokyanátové ionty, běžně přítomné ve slinách na svrchu uvedené ionty s antimikrobiálním účinkem. Vhodnými peroxidázami pro toto použití jsou laktoperoxídáza, myeloperoxidáza, peroxidáza ze slin a chlorperoxidáza.A variety of enzymatic antimicrobial agents are known. For example, WO-A-94/04217 discloses a stabilized dentifrice composition wherein an antimicrobially effective concentration of hypothiocyanite ions, OSCN, is provided. The composition comprises an oxidoreductase to obtain hydrogen peroxide and a peroxidase capable of oxidizing the thiocyanate ions commonly present in the saliva of the above-mentioned antimicrobial ions. Suitable peroxidases for this use are lactoperoxidase, myeloperoxidase, saliva peroxidase and chloroperoxidase.

Enzymatické antimikrobiální prostředky, obsahující halogenperoxidázu jsou popsány také v EP-A-500 387 (Exoxemis). Bylo popsáno, že halogenperoxidázy jsou schopny se selektivně vázat a způsobit* inhibici růstu cílových mikroorganismů v přítomnosti peroxidu a halogenidu. V EP-A-500 387 se jako vhodná halogenperoxidáza uvádí myeloperoxidáza MPO, oxidáza z eosinofilů, EPO, laktoperoxídáza, LPO, a chlorperoxidáza, CPH. Uvádí se, že poměr halogenidu k peroxidu vodíku je kritickým faktorem pro stálost a funkčnost halogenperoxidázy. Při velmi nízkých poměrech může peroxid vodíku způsobit inhibici funkce enzymu, kdežto při velmi vysokých poměrech může halogenid blokovat enzymatickou reakci. Uvedený poměr se může měnit v širokém rozmezí, s výhodou je však vyšší než 50.Enzymatic antimicrobial agents containing haloperoxidase are also described in EP-A-500 387 (Exoxemis). Halogen peroxidases have been reported to be capable of selectively binding and to inhibit growth of target microorganisms in the presence of peroxide and halide. In EP-A-500 387, myeloperoxidase MPO, eosinophil oxidase, EPO, lactoperoxidase, LPO, and chloroperoxidase, CPH are mentioned as suitable haloperoxidase. The ratio of halide to hydrogen peroxide is said to be a critical factor for the stability and functionality of the haloperoxidase. At very low ratios, hydrogen peroxide may inhibit the function of the enzyme, while at very high ratios the halide may block the enzymatic reaction. Said ratio may vary within wide limits, but is preferably greater than 50.

Vzhledem k tomu, že peroxid vodíku může způsobit nežádoucí vedlejší reakce, měla by být jeho koncentrace v antimikrobiálním prostředku udržována na pokud možno nižší úrovni. Nyní však bylo zjištěno, že je žádoucí použít vyšší výchozí koncentrace peroxidu vodíku v prostředku v případě jeho kombinace s vhodným množstvím halogenidu.Since hydrogen peroxide can cause undesirable side reactions, its concentration in the antimicrobial should be kept as low as possible. However, it has now been found desirable to use higher starting concentrations of hydrogen peroxide in the composition when combined with an appropriate amount of halide.

Dále by bylo zapotřebí mít k dispozici enzymatické antimikrobiální prostředky s odlišným spektrem účinnosti, než jaké mají známé prostředky. Zejména by měly být k dispozici prostředky, účinné proti mikroorganismůn, jejichž růst se potlačuje jen obtížně, jako je například Streptococcus faecalis. V některých případech může být žádoucí potlačit i nepathogenní organismy vzhledem k tomu, že mohou znehodnocovat potraviny.Further, it would be desirable to have enzymatic antimicrobial compositions with a different spectrum of activity than the known compositions. In particular, agents effective against microorganisms whose growth is difficult to inhibit, such as Streptococcus faecalis, should be provided. In some cases, it may be desirable to suppress non-pathogenic organisms as well, as they may degrade food.

Vynález si klade za úkol navrhnout enzymatický antimikrobiální prostředek, prostý svrchu uvedených nevýhod.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide an enzymatic antimicrobial composition devoid of the above disadvantages.

V literatuře je popsána celá řada halogenperoxidáz, vhodných pro použití v antimikrobiálních prostředcích, až dosud však nebyla věnována pozornost skupině enzymů, označovaných jako vanadiumhalogenperoxidázy.A number of haloperoxidases suitable for use in antimicrobial agents have been described in the literature, but so far no attention has been paid to the group of enzymes referred to as vanadium haloperoxidases.

>>

Uvedené enzymy se liší od ostatních halogenperoxidáz tím, že jejich prosthetická skupina má vlastnosti, podobné vanadičnanu (pětimocnému vanadu), kdežto ostatní halogenperoxidázy jsou hem peroxidázy.Said enzymes differ from other haloperoxidases in that their prosthetic group has properties similar to vanadate (pentavalent vanadium), while the other haloperoxidases are haem peroxidase.

Vynález si rovněž klade za úkol navrhnout způsob klonování genu pro uvedené peroxidázy a stanovit sekvenci tohoto genu, tak, aby bylo možno dosáhnout jeho exprese v mikroorganismech, které se snadno pěstují a tak získat velké množství enzymů při použití rekombinantní DNA.It is also an object of the present invention to provide a method for cloning a gene for said peroxidases and to determine the sequence of said peroxidase so that it can be expressed in microorganisms that are easy to grow and thus obtain large amounts of enzymes using recombinant DNA.

Některé enzymy uvedeného typu je možno v přírodě nalézt na povrchu některých mořských řas (Wever a další, 1991). V neporušené řase v mořské vodě může uvedený enzym po přidání peroxidu vodíku uvolnit HOBr. Úloha tohoto enzymu dosud není objasněna, je však pravděpodobná, že tvorba vysoce oxidačního HOBr v mořské vodě je částí obranného systému uvedených rostlin před napadením mikroorganismy nebo houbami.Some enzymes of this type can be found naturally on the surface of some seaweed (Wever et al., 1991). In intact seaweed in seawater, said enzyme may release HOBr upon addition of hydrogen peroxide. The role of this enzyme has not been elucidated yet, but it is likely that the formation of highly oxidizing HOBr in seawater is part of the defense system of these plants against attack by microorganisms or fungi.

Po objevu vanadiumbromperoxidázy z mořské řasy Ascophyllum nodosum, odlišné od běžných peroxidáz bylo prokázáno, že velké množství dalších řas rovněž obsahuje tyto enzymy. Zvláště byla studována bromperoxidáza z A. nodosum a byly podrobně stanoveny její vlastnosti, které byly popsány podrobněji zejména v dále uvedených literárních citacích 2 a 3. Prosthetická skupina těchto enzymů má strukturu, podobnou vanadičnanu. V katalytickém mechanismu, odvozeném od tohoto enzymu reaguje peroxid vodíku s enzymem za vzniku komplexu peroxidu vodíku a enzymu a pak dochází k reakci bromidu a protonu s tímto komplexem za vzniku komplexu enzymu a HOBr. Bylo prokázáno (De Boer a další, 1988), že tento komplex se rozkládá za vzniku enzymu a HOBr. V téže publikaci se prokazuje, že uvedené enzymy jsou velmi stálé ve vodném i organickém prostředí. Uvedené enzymy byly nai příklad stálé po dobu 3 týdnu a bylo možno je skladovat více než měsíc v organických rozpouštědlech, jako acetonu, methanolu, ethanolu (až do 60 % objemových) a 1-propanolu bez ztráty účinnosti. Uvedené enzymy však mají tu nevýhodu, že vyžadují přítomnost bromidu nebo jeho přidání a mimoto pokusy klonovat tyto geny z mořských řas a stanovit sekvenci jejich aminokyselin nebyly úspěšné.After the discovery of vanadium bromoperoxidase from the seaweed Ascophyllum nodosum, different from conventional peroxidases, it has been shown that a large number of other algae also contain these enzymes. In particular, A. nodosum bromoperoxidase has been studied and its properties have been determined in detail, which have been described in more detail in particular in references 2 and 3 below. The prosthetic group of these enzymes has a vanadate-like structure. In the catalytic mechanism derived from this enzyme, hydrogen peroxide reacts with the enzyme to form a hydrogen peroxide-enzyme complex and then reacts the bromide and proton with the complex to form an enzyme-HOBr complex. It has been shown (De Boer et al., 1988) that this complex decomposes to form the enzyme and HOBr. The same publication demonstrates that said enzymes are very stable in both aqueous and organic media. For example, the enzymes were stable for 3 weeks and could be stored for more than a month in organic solvents such as acetone, methanol, ethanol (up to 60% by volume) and 1-propanol without loss of potency. However, these enzymes have the disadvantage of requiring the presence or addition of bromide and, moreover, attempts to clone these marine algae genes and determine their amino acid sequence have not been successful.

Známé existující chlorperoxidázy, obsahující hem z Caldariomyces fumago jsou méně vhodné pro přípravu enzymatických antimikrobiálních prostředků vzhledem ke své nestálosti a nízkém optimálním pH 2,75 (J. R. Kanofsky, 1984), což závažně omezuje možnost jejich použití. Podobné důvody brání použití enzymu myeloperoxidázy MPO z lidských bílých krvinek, tato peroxidáza rovněž může tvořit H0C1 (A.R.J. Bakkenist a další, 1980).Known existing chloroperoxidases containing heme from Caldariomyces fumago are less suitable for the preparation of enzymatic antimicrobial agents due to their instability and low optimal pH of 2.75 (J. R. Kanofsky, 1984), which severely limits their use. Similar reasons prevent the use of the enzyme myeloperoxidase MPO from human white blood cells, this peroxidase may also form HOCl (A.R.J. Bakkenist et al., 1980).

V dále uvedených literárních citacích 8 a 9 jsou uvedeny zprávy o halogenperoxidázách s vysokou stálostí z hub hyphomyctes. Zvláště jde o houbu Curvularia inaequalis, která vylučuje vanadiumchlorperoxídázu (J.W.P.M. Van Schjindel a další, 1993), která má vysokou afinitu pro chloridy a její optimální pH pro chlorační reakci je přibližně 5,5. Stejně jako v případě bromperoxidázy z mořských řas má prostetická skupina těchto enzymů strukturní vlastnosti, podobné vanadiěnanu, to znamená pětimocnému vanadu. V dalších podrobnějších studiích týchž autorů, 1994, se prokazuje, že kinetika těchto enzymů při oxidaci chloridů peroxidem vodíku je obdobná jako kinetika vanadiumbromperoxidáz z mořské řady A. nodosum. Mimoto bylo třemi různými postupy dokázáno, že enzym produkuje oxidovanou skupinu H0C1 jako reakční produkt a sám je proti působení tohoto produktu odolný. Enzym je stálý až do teploty 90 °C a je velmi stálý také v organických rozpouštědlech, například ve 40% methanolu, ethanolu a propanolu. , _h References 8 and 9 below disclose reports of halper peroxidases with high stability from fungal hyphomyctes. In particular, it is a fungus Curvularia inaequalis which secretes vanadium chloroperoxidase (JWPM Van Schjindel et al., 1993) which has a high affinity for chlorides and has an optimum pH for the chlorination reaction of about 5.5. As with seaweed bromoperoxidase, the prosthetic group of these enzymes has structural properties similar to vanadienate, i.e., pentavalent vanadium. In further detailed studies by the same authors, 1994, it was shown that the kinetics of these enzymes in the oxidation of chlorides by hydrogen peroxide is similar to the kinetics of vanadium bromoperoxidases from the A. nodosum marine series. In addition, it has been shown by three different processes that the enzyme produces an oxidized group of HCl as a reaction product and is itself resistant to the action of this product. The enzyme is stable up to 90 ° C and is also very stable in organic solvents, for example 40% methanol, ethanol and propanol. , _h

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Podstatu vynálezu tvoří enzymatický antimikrobiální prostředek, který obsahuje vanadiumhalogenperoxidázu, zdroj halogenidu a peroxid vodíku nebo zdroj peroxidu vodíku.The present invention provides an enzymatic antimicrobial composition comprising a vanadium haloperoxidase, a halide source and hydrogen peroxide or a source of hydrogen peroxide.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby vanadiumhalogenperoxidázy, při němž se transformuje vhodný hostitel vektorem pro expresi, který obsahuje počátek replikace, řídící řetězce pro transkripci a ukončení transkripce a alespoň část kódového řetězce DNA pro vanadiumhalogenperoxidázu, transformovaný hostitel se pěstuje za podmínek, při nichž může dojít k expresi strukturního genu a výsledný enzym se izoluje.The present invention also provides a method for producing vanadium haloperoxidase by transforming a suitable host with an expression vector comprising an origin of replication, transcriptional and transcriptional termination control chains, and at least a portion of the vanadium haloperoxidase DNA coding sequence, the transformed host being grown under conditions under which to express the structural gene and the resulting enzyme is isolated.

Dále budou podrobněji popsány jednotlivé složky antimikrobiálního prostředku podle vynálezu.The individual components of the antimicrobial composition of the present invention will be described in more detail below.

a) Vanadiumhalogenperoxidáza(a) Vanadium haloperoxidase

Enzymatický antimikrobiální prostředek obsahuje jako svou základní složku enzym vanadiumhalogenperoxidázu, kterou je možno volit z různých známých enzymů tohoto typu.The enzyme antimicrobial composition contains as its essential component the enzyme vanadium haloperoxidase, which may be selected from various known enzymes of this type.

Je například možno použít halogenperoxidázu, neobsahující hem, produkovanou Curvularia inaequalis podle US-A-4 707 466 Je také možno izolovat a čistit chlorperoxidázu z Curvularia inaequalis, CBS 102.42 způsobem podle J.W.P.M. Van Schijndel a další, 1993.For example, it is possible to use heme-free haloperoxidase produced by Curvularia inaequalis according to US-A-4 707 466. It is also possible to isolate and purify chloroperoxidase from Curvularia inaequalis, CBS 102.42 according to the method of J.W.P.M. Van Schijndel et al., 1993.

Jako další zdroje vanadiumhalogenperoxidáz je možno uvést Drechslera biseptata, CBS 371.72, Drechslera fugax,Other sources of vanadium haloperoxidases include Drechslera biseptata, CBS 371.72, Drechslera fugax,

CBS 509.77, Drechslera nicotiae, CBS 655.74, Drechslera subpapendorfii, 656.74, Embelisia hyacinthi, 416.71, Embelisia didymospora, CBS 7Θ679, Ulocladium chartarum, 200.67 a Ulocladium botrytis, 452.72.CBS 509.77, Drechslera nicotiae, CBS 655.74, Drechslera subpapendorfii, 656.74, Embelisia hyacinthi, 416.71, Embelisia didymospora, CBS 7679, Ulocladium chartarum, 200.67 and Ulocladium botrytis, 452.72.

Vanadiumhalogenperoxidázu je možno získat také genetickým inženýrstvím způsobem, který byl svrchu uveden a který bude podrobněji popsán v příkladvé části přihlášky.Vanadium haloperoxidase can also be obtained by genetic engineering as described above, which will be described in more detail in the Examples section of the application.

b) Zdroj halogenidových iontůb) Halide ion source

Druhou složkou prostředku podle vynálezu je zdroj halogenidových iontů. Může jít o jakékoliv halogenidové ionty, avšak zvláště výhodný je zdroj jodidových nebo chloridových iontů vzhledem k tomu, že tyto ionty jsou nejúčinnější. Chlorid sodný je nejvýhodnějším zdrojem halogenidových iontů. Halogenid je možno přidávat k prostředku podle vynálezu nebo je možno použít halogenid, běžně přítomný ve vodě z vodovodu v množství obvykle 2 až 5 mM.A second component of the composition of the invention is a source of halide ions. These may be any halide ions, but the source of iodide or chloride ions is particularly preferred, since these ions are most effective. Sodium chloride is the most preferred source of halide ions. The halide may be added to the composition of the invention or a halide conventionally present in tap water in an amount of usually 2 to 5 mM may be used.

c) Zdroj peroxidu vodíku(c) Source of hydrogen peroxide

Antimikrobiální prostředky podle vynálezu dále obsahují zdroj peroxidu vodíku nebo systém, vytvářející peroxid vodíku. Příkladem takového systému mohou být perboritany nebo peruhličitany, například peruhličitan sodný nebo perboritan sodný.The antimicrobial compositions of the invention further comprise a hydrogen peroxide source or hydrogen peroxide generating system. Examples of such a system are perborates or percarbonates, for example sodium percarbonate or sodium perborate.

Peroxid vodíku může být tvořen také systémy, vytvářející tuto látku. Tento systém je možno volit z různých systémů, které již byly popsány. Je například možno užít aminooxidázu a amin, oxidázu aminokyselin a aminokyselinu, laktatátoxidázu a laktát, cholesteroloxidázu a cholesterol, oxidázu kyseliny močové a kyselinu močovou nebo xanthinoxidázu a xanthin. Zvláště výhodná je kombinace glukosooxidázy a glukosy.Hydrogen peroxide may also be formed by the systems forming this substance. This system can be selected from the various systems already described. For example, amino oxidase and amine, amino acid oxidase and amino acid, lactate oxidase and lactate, cholesterol oxidase and cholesterol, uric acid and uric acid oxidase or xanthine oxidase and xanthine may be used. Particularly preferred is a combination of glucose oxidase and glucose.

Množství enzymu, například glukosooxidázy bude záviset na specifické účinnosti enzymu a účinnosti jakékoliv zbývající katalázy, která může být přítomna, obecně je možno uvést, že prostředek podle vynálezu bude obsahovat 10 až 1000, s výhodou 20 až 500 jednotek glukosooxidázy na g nebo 1 ml prostředku, přičemž jednotka účinnosti enzymu je definována jako to množství enzymu, jehož je zapotřebí k přeměně 1 mikromol substrátu za minutu za standardních podmínek.The amount of enzyme, e.g. glucose oxidase, will depend on the specific activity of the enzyme and the activity of any remaining catalase that may be present, generally, the composition of the invention will contain 10 to 1000, preferably 20 to 500 glucose oxidase units per g or 1 ml of the composition. wherein the enzyme activity unit is defined as the amount of enzyme required to convert 1 micromole of substrate per minute under standard conditions.

d) Další složkyd) Other components

Enzymatický antimikrobiální prostředek podle vynálezu může obecně obsahovat 0,01 až 50, s výhodou 0,1 až 5,0 % hmotnostních alespoň jednoho smáčedla. Vhodným smáčedlem je například mýdlo nebo jiné aniontové, neiontové, kationtové, amfoterní nebo obojetné iontové sloučeniny. Systém smáčedel obvykle tvoří alespoň jedno aniontové -smáčedlo a alespoň jedno neiontové smáčedlo. Mimoto může systém obsahovat amfoterní látky nebo látky s obojetnými ionty, to však není běžné vzhledem k poměrně vysokým nákladům na tyto látky.The enzymatic antimicrobial composition of the invention may generally contain 0.01 to 50, preferably 0.1 to 5.0% by weight of at least one wetting agent. A suitable wetting agent is, for example, soap or other anionic, nonionic, cationic, amphoteric or zwitterionic ionic compounds. The surfactant system typically comprises at least one anionic surfactant and at least one nonionic surfactant. In addition, the system may contain amphoteric or zwitterionic substances, but this is not common due to the relatively high cost of these substances.

Obvykle je možno volit neiontová a aniontová smáčedla z látek, uvedených v publikaci Surface Active Agents, sv. 1, Schwartz a Perry, Interscience 1949, sv. 2, Schwartz, Perry a Berch, Interscience 1958, v současném vydání McCutcheon s Emulsifiers and Detergents, Manufacturing Confectioners Company nebo v Tenside-Taschenbuch, H. Stache, 2-, vydání, Carl Hauser Verlag, 1981.Typically, nonionic and anionic surfactants may be selected from Surface Active Agents, Vol. 1, Schwartz and Perry, Interscience 1949, Vol. 2, Schwartz, Perry and Berch, Interscience 1958, in the current edition of McCutcheon with Emulsifiers and Detergents, Manufacturing Confectioners Company or in Tenside-Taschenbuch, H. Stache, 2-, edition, Carl Hauser Verlag, 1981.

Vhodnými neiontovými sloučeninami, které je možno k uvedenému účelu použit jsou například reakční produkty sloučenin s hydrofobní skupinou a reaktivního atomu vodíku, jako alifatických alkoholů, kyselin, amidů nebo alkylfenolů s alkylenoxidy, zvláště s ethylenoxidem jako takovým nebo ve směsi s propylenoxidem. Specifickými neiontovými smáčedly jsou kondenzáty alkylfenolů s alkylovou částí o 6 až 22 atomech uhlíku s ethylenoxidem, obsahující obvykle 2 až 25 jednotek ethylenoxidu v molekule a kondenzační produkty alifatických primárních nebo sekundárních alkoholů s přímým nebo rozvětveným řetězcem o 8 až 18 atomech uhlíku s ethylenoxidem, obvykle 5 až 40 jednotek ethylenoxidu (EO) v molekule.Suitable nonionic compounds which can be used for this purpose are, for example, the reaction products of compounds with a hydrophobic group and a reactive hydrogen atom, such as aliphatic alcohols, acids, amides or alkylphenols with alkylene oxides, in particular ethylene oxide per se or in admixture with propylene oxide. Specific nonionic surfactants are condensates of alkylphenols having an alkyl moiety of 6 to 22 carbon atoms with ethylene oxide, usually containing from 2 to 25 units of ethylene oxide per molecule, and condensation products of straight or branched aliphatic alcohols of 8 to 18 carbon atoms with ethylene oxide, usually 5 to 40 units of ethylene oxide (EO) per molecule.

Vhodnými aniontovými smáčedly, která je k tomuto účelu možno použít jsou ve vodě obvykle rozpustné soli alkalických kovů s organickými sulfáty a sulfonáty s alkylovými zbytky o 8 až 22 atomech uhlíku, přičemž pod pojmem alkyl se rozumí alkylová část vyšších acylových zbytků.Suitable anionic surfactants which can be used for this purpose are the water-soluble alkali metal salts of organic sulfates and sulfonates having alkyl radicals of 8 to 22 carbon atoms, the alkyl moiety being the alkyl portion of the higher acyl radicals.

Jako příklad vhodných syntetických aniontových smáčedel je možno užít alkylsulfát sodný nebo draselný, jde zejména o produkty sulfatace vyšších alkoholů o 8 až 18 atomech uhlíku, získaných například z loje nebo z kokosového oleje, o alkylbenzensulfonáty sodné nebo draselné s alkylovou částí o 9 až 20 atomech uhlíku, zvláště o lineární sekundární alkylbenzensulfonáty sodné o 10 až 15 atomech uhlíku a o alkylglycerylethersulfáty sodíku, zvláště ethery vyšších alkoholů, odvozené od loje nebo kokosového oleje, zvláště vhodné jsou také syntetické alkoholy, odvozené od nafty. Výhodnými aniontovými smáčedly jsou alkylbenzensulfonáty sočné o 11 až 15 atomech uhlíku v álkylové části a alkylsulfáty sodné o 12 až 18 atomech uhlíku v álkylové části.Examples of suitable synthetic anionic surfactants are sodium or potassium alkyl sulphate, in particular the products of sulphation of higher alcohols having from 8 to 18 carbon atoms, obtained, for example, from tallow or coconut oil, sodium or potassium alkylbenzene sulphonates having an alkyl moiety of 9 to 20 atoms. The fatty alcohols, especially the linear secondary alkylbenzene sulphonates of 10 to 15 carbon atoms and the sodium alkyl glyceryl ether sulphates, in particular the higher alcohol ethers, derived from tallow or coconut oil, are also suitable synthetic alcohols derived from naphtha. Preferred anionic surfactants are alkylbenzene sulfonates having 11 to 15 carbon atoms in the alkyl moiety and sodium alkyl sulfates having 12 to 18 carbon atoms in the alkyl moiety.

Použít je možno také smáčedla, popsaná v EP-A-328 177 (Unilever), která jsou odolná proti vlivu solí a alkylpolyglykosidová smáčedla, pcop^aná v EP-A-070 074 a mimoto také alkylmonoglykosidy.Wetting agents described in EP-A-328 177 (Unilever) which are resistant to salts and the alkyl polyglycoside surfactants described in EP-A-070 074 and also alkyl monoglycosides can also be used.

Výhodným systémem smáčedel jsou směsi aniontových a neiontových smáčedel, zvláště jde o skupiny těchto látek, popsané v EP-A-346 995 (Unilever). Zvláště výhodný je systém smáčedel, tvořený směsí solí alkalických kovů s primárními alkoholsulfáty o 16 až 18 atomech uhlíku a ethoxyláty primárních alkoholů o 12 až 15 atomech uhlíku s 3 až 7 EO.Preferred surfactant systems are mixtures of anionic and nonionic surfactants, especially the groups described in EP-A-346 995 (Unilever). Particularly preferred is a wetting system consisting of a mixture of alkali metal salts of primary alcohol sulfates of 16 to 18 carbon atoms and ethoxylates of primary alcohols of 12 to 15 carbon atoms of 3 to 7 EO.

Neiontové smáčedlo je s výhodou přítomno v množství vyšším než 10, například 25 až 90 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost systému smáčedel. Aniontová smáčedla mohou být přítomna například v množství 5 až 40 % hmotnostních, vztaženo na hmotnost systému smáčedel.The nonionic surfactant is preferably present in an amount of greater than 10, for example 25 to 90% by weight based on the weight of the surfactant system. For example, anionic surfactants may be present in an amount of 5 to 40% by weight based on the weight of the surfactant system.

Enzymatický prostředek podle vynálezu může obsahovat ještě další složky, obvykle přítomné v antimikrobiálních prostředcích, například zahušťovadla. Zvláště vhodné jsou v tomto ohledu kombinace smáčedel, uvedené v EP-A-314 232 (Unilever), která vytvářejí zahušťovací gelovité látky po svém rozpuštění ve vodě.The enzymatic composition of the invention may contain still other components usually present in antimicrobial agents, for example thickeners. Particularly suitable in this regard are the surfactant combinations disclosed in EP-A-314 232 (Unilever) which form thickening gel-like substances upon dissolution in water.

Antimikrobiální prostředky podle vynálezu je možno použít k čištění tvrdých povrchů a praní látek, avšak také pro průmyslové použití, v nemocnicích a pro čištění a desinfekci lékařských nástrojů. Další možnou oblastí použití je v mlékárenství. Antimikrobiální prostředky mohou být s úspěchem použity také jako deodorační prostředky vzhledem k potlačení růstu bakterií, způsobujících vznik pachu.The antimicrobial compositions of the present invention can be used to clean hard surfaces and wash fabrics, but also for industrial use, in hospitals, and to clean and disinfect medical instruments. Another possible field of application is in dairy. The antimicrobial agents can also be successfully used as deodorants in order to suppress the growth of odorous bacteria.

Antimikrobiální prostředky podle vynálezu mohou mít formu prášků, určených k rozpuštění ve vodě před použitím, avšak mohou být také přímo zpracovány na kapalné produkty nebo gely. V těchto produktech je důležité, aby ke tvorbě hypohalitu nedošlo dříve než před použitím prostředku. Toho je možno dosáhnout fyzikálním oddělením enzymu od jeho substrátu, například zapouzdřením enzymu známým způsobem.The antimicrobial compositions of the invention may take the form of powders intended to be dissolved in water prior to use, but may also be directly formulated into liquid products or gels. In these products, it is important that hypohalite formation does not occur earlier than before use of the composition. This can be achieved by physically separating the enzyme from its substrate, for example by encapsulating the enzyme in a known manner.

Při použití se prostředek podle vynálezu ředí 5 až lOOx vodou na prostředek s antimikrobiálním účinkem. Pak se zředěný prostředek uvádí do styku s povrchem, který má být desinfikován.In use, the composition of the invention is diluted 5-10x with water to form an antimicrobial agent. The diluted composition is then contacted with the surface to be disinfected.

Seznam literárních údajůList of literary data

1. R. Wever, M.G.M. Tromp. 3.Ξ. Krann A.Marjani and M. van Tol. Brominating activity of the seawead Ascoohvllum nodosum : Impact on the biospnera. Envir. Sc. Techn. 25 (1991), 446-449.1. R. Wever, M.G.M. Tromp. 3.Ξ. Krann A. Marjani and M. van Tol. Brominating activity of the seawead Ascoohvllum nodosum: Impact on the biospner. Envir. Sc. Techn. 25 (1991) 446-449.

2. R. Wever and K. Kustin. Vanadium : a biologicaliy relavant element. Adv. Inorg. Chem. 35 (1990), 31-115.2. R. Wever and K. Kustin. Vanadium: a biologicaliy relavant element. Adv. Inorg. Chem. 35 (1990) 31-115.

3. D. Rehder. The bioinorganic chemistry of vanadium.3. D. Rehder. The bioinorganic chemistry of vanadium.

Ang. Chem. Ed. Engl. 30 (1991) 148-167.Ang. Chem. Ed. Engl. 30 (1991) 148-167.

4. Ξ. de Boer and R. Wever. The raacticn mechanism cť the novel vanadium bromoperoxidase, a staadv-stata kinetic analysis. J. Biol. Chem. 263 (1988), 12325-12332.4. Ξ. de Boer and R. Wever. The raactic mechanism honors the novel vanadium bromoperoxidase, and staadv-stata kinetic analysis. J. Biol. Chem. 263 (1988), 12325-12332.

5. E. da Boer, H. Plat, M.G.M. Tromp, M.C.R. Franssen, H.C. van der Plas, E.M. Meljer and H.E. Schoemaker. Vanadium-containing bromoperoxidase : an axample of an oxidoraductase with high operational stability in aqueous and organic media. Biotechn Bioeng. 30 (1987), 607-610.5. E. da Boer, H. Plat, M.G.M. Tromp, M.C.R. Franssen, H.C. van der Plas, E.M. Meljer and H.E. Schoemaker. Vanadium-containing bromoperoxidase: an axample of an oxidoraductase with high operational stability in aqueous and organic media. Biotechn Bioeng. 30 (1987) 607-610.

6. J.R. Kanofsky. Singlet oxygen producion by chicroperoxidase-hvdrogen peroxide -haliče systems. J.6. J.R. Kanofsky. Singlet oxygen producion by chicroperoxidase-hydrogen peroxide-heater systems. J.

Biol. Chem. 259 (1984), 5596-5600.Biol. Chem. 259 (1984) 5596-5600.

7. A.R.J. Bakkenist, J.E.G. de Boer, H. Plac and R.7. A.R.J. Bakkenist, J.E.G. de Boer, H. Plac and R.

Wever. The haliče complexes of myeloperoxidasa and the mechanism of the halogenation reacuions. Biochim. Biophys. Acta 613 (1980), 337-343.Wever. The halic complexes of myeloperoxidase and the mechanism of halogenation reactions. Biochim. Biophys. Acta. 613 (1980), 337-343.

8. J.C. Hunter-Cavera and L. Sotos. Screening for a new enzyme in nátuře: hailoperoxidasa productlon by Death Vallev dematiacaous hyphoraycetes. Microb. Ecol. 12 (1986) 121-127.8. J.C. Hunter-Cavera and L. Sotos. Screening for a new enzyme in nature: hailoperoxidase productlon by Death Vallev dematiacaous hyphoraycetes. Microb. Ecol. 12 (1986) 121-127.

9. Τ-Μ.Ξ. Liu, T. M'Timkulu, J. Geigert, 3. Wolf, S.L. Neidleman, D. Silva and J.C. Hunter-Cavera. Isolation and characterization of a novel non-heme chioroperoxidase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 (1937), 329-333.9. Τ-Μ.Ξ. Liu, T. M'Timkulu, J. Geigert, 3. Wolf, S.L. Neidleman, D. Silva and J.C. Hunter-Cavera. Isolation and characterization of novel non-heme chioroperoxidase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142 (1937) 329-333.

IQ. J.W.P.M. Van Schijndel, E.G.M. Vollenbroek and R.IQ. J.W.P.M. Van Schijndel, E.G.M. Vollenbroek and R.

Wever. The chioroperoxidase from the fungus Curvularia inaecualis; a novel vanadium enzyme. Biochim. Biophys. ActaWever. Chioroperoxidase from the fungus Curvularia inaecualis; and a novel vanadium enzyme. Biochim. Biophys. Acta

1151 (1993), 249-256.1151 (1993) 249-256.

11. Van Schijndel, J.W.P.M., Barnett, Roelse, J.,11. Van Schijndel, J.W.P.M., Barnett, Roels, J.,

Vollenbraek, E.G.M. and Wever, R. Vanadium chioroperoxidase from the fungus Curvularia inaequalis; stability and steady-stata kinetics (1994) Eur.J.Biochem. 225, 151-157.Vollenbraek, E.G.M. and Wever, R. Vanadium chioroperoxidase from the fungus Curvularia inaequalis; stability and steady-state kinetics (1994) Eur. J. Biochem. 225, 151-157.

12. H. Schagger and G. Van Jagow (1937) Anal.Biochem. 156, 363-379.12. H. Schagger and G. Van Jagow (1937) Anal. Biochem. 156: 363-379.

13. P. Matsudaira (1937) J.Siol.Chem. 252, 10035-10033.13. P. Matsudair (1937) J.Siol.Chem. 252, 10035-10033.

14. Sambrook, J. , Fritch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MY.).14. Sambrook, J., Fritch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MY.).

15. R. Wever, H. Plat and Ξ. de 3oer (1985), Biochem. Biophys. Aera 330, 131-136.15. R. Wever, H. Plat and Ξ. de 3oer (1985) Biochem. Biophys. Aera 330: 131-136.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.The following examples are intended to illustrate the invention.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

Minimální inhibiční koncentrace MIC hypochlorituMinimum inhibitory concentration of MIC hypochlorite

Materiály:Materials:

Bakteriální kmeny, použité v tomto příkladu byly Escherichia coli NCTC^COC, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 13565, Streptococcus faecalis NCTC 1092 a Listeria innocua ATCC 33090, seretyp 6B. Bakterie byly pěstovány 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C v bujónu s vývarem z mozku a srdce, BHI. Po této době byly bakterie dvakrát promyty citrátovým pufrem o pH 5,5 (20 mM citronanu sodného a NaOH + 10 mM NaCl). Suspenze bakterií pak byla odstředěna v Eppendorfově odstředivce 5 minut při 14 000 ot/min, supernatanty se odstraní a usazenina bakterií se znovu uvede do suspenze v citrátovém pufru.The bacterial strains used in this example were Escherichia coli NCTC-COC, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 13565, Streptococcus faecalis NCTC 1092, and Listeria innocua ATCC 33090, seretype 6B. Bacteria were grown for 15-18 hours at 30 ° C in a broth with brain and heart broth, BHI. After this time, the bacteria were washed twice with citrate buffer pH 5.5 (20 mM sodium citrate and NaOH + 10 mM NaCl). The bacterial suspension was then centrifuged in an Eppendorf centrifuge for 5 minutes at 14,000 rpm, the supernatants were removed and the bacterial pellet resuspended in citrate buffer.

Toto promytí se ještě jednou opakuje v případě každé suspenze bakterií. Dvakrát promyté bakteriální suspenze se pak zředí citrátovým pufrem o pH 5,5 na suspenzi, obsahující přibližně 10 bakterií/ml. V průběhu promývání se buněčný materiál uchovává v ledu. Pufry a roztok BSA (1% roztok v citrátovém pufru o pH 5,5) se sterilizují filtrací a uchovávají při 4 °C. Roztoky hypochloritu se připraví ze zásobního roztoku o 107 000 ppm zředěním sterilní demineralizovanou vodou.This wash is repeated once again for each bacterial suspension. The twice washed bacterial suspension is then diluted with citrate buffer pH 5.5 to a suspension containing approximately 10 bacteria / ml. During washing, the cell material is stored on ice. Buffers and BSA solution (1% citrate buffer pH 5.5) are filter sterilized and stored at 4 ° C. Hypochlorite solutions are prepared from a stock solution of 107,000 ppm by dilution with sterile demineralized water.

Metoda:Method:

Za sterilních podmínek se vytvoří suspenze s obsahem 7 přibližně 10 bakterií/ml citrátového pufru o pH 5,5. Z této suspenze se přidají podíly 1,9 ml do sterilních zkumavek. Pak se do zkumavek přidá 0,1 ml chladného roztoku hypochloritu s různou koncentrací za vzniku zřeďovací řady hypochloritu. Obsah zkumavek se trvale míchá magnetickým míchadlem. Užijí se také kontroly, k nimž se přidá místo roztoku hypochloritu pouze sterilní pufr. Vzorky se inkubují přesně 5 minut při teplotě 30 °C, pak se odebere 1 ml reakční směsi, přidá se k 9 ml chladného 1% roztoku BSA a směs se okamžitě uloží do ledu k zastavení reakce hypochloritu s mikroorganismy. Pak se stanoví přežívání bakterií tak, že se určí zbývající počet jedpotek pro tvorbu kolonií, CFU/ml zře-1 -5 děním vzorku v rozmezí 10 az 10 a naneseni vzorku 100 mikrolitrů různých ředění na značené BHI-agarové plotny. Plotny se inkubují 15 až 18 hodin při 30 °C. V případě, že se po této době nezjistí žádné CFU, inkubují se plotny ještě 24 hodin při teplotě 30 °C.Under sterile conditions, a suspension is formed containing 7 approximately 10 bacteria / ml citrate buffer pH 5.5. From this suspension 1.9 ml aliquots were added to sterile tubes. 0.1 ml of cold hypochlorite solution of varying concentration is then added to the tubes to form a dilution series of hypochlorite. The contents of the tubes are constantly stirred with a magnetic stirrer. Controls to which only sterile buffer is added instead of hypochlorite solution are also used. The samples are incubated for exactly 5 minutes at 30 ° C, then 1 ml of the reaction mixture is withdrawn, added to 9 ml of cold 1% BSA solution and immediately placed on ice to stop hypochlorite reaction with microorganisms. Bacterial survival is then determined by determining the remaining number of colony forming units, CFU / ml by diluting the sample between 10 and 10, and loading a sample of 100 microliters of various dilutions on labeled BHI-agar plates. The plates are incubated at 30 ° C for 15-18 hours. If no CFU is detected after this time, the plates are incubated at 30 ° C for 24 hours.

Minimální inhibiční koncentrace, hodnota MIC je definována jako ta koncentrace hypochloritu, která za daných podmínek vede alespoň k log 6-snížení jednotek pro tvorbu kolonií v případě zkoumaného mikroorganismu.The minimum inhibitory concentration, the MIC value, is defined as that concentration of hypochlorite which, under given conditions, results in at least a log 6-reduction of colony-forming units in the case of the microorganism under investigation.

Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce I Zjištěné hodnoty odpovídaly hodnotám, uváděným v literatuře.The results obtained are summarized in Table I below. The values obtained correspond to those reported in the literature.

Tabulka ITable I

Hodnoty MIC pro různé mikroorganismyMIC values for various microorganisms

Mikroorganismus MIC v ppmMicroorganism MIC in ppm

Escherichia coli 2-3Escherichia coli 2-3

Staphylococcus aureus 2-3Staphylococcus aureus 2-3

Listeria innocua 2-3Listeria innocua 2-3

Pseudomonas aeruginosa 2-3Pseudomonas aeruginosa 2-3

Streptococcus faecalis 2-3Streptococcus faecalis 2-3

Příklad 2Example 2

Minimální inhibiční koncentrace hypochloritu ve srovnání s hypochloritem, vytvořeným enzymaticky vanadiumchlorperoxidázou V-CPO z Curvularia inaequalis.Minimum inhibitory concentration of hypochlorite as compared to hypochlorite produced enzymatically by vanadium chloroperoxidase V-CPO from Curvularia inaequalis.

V tomto příkladu ap srovnává účinek hypochloritu s účinkem hypochloritu, vytvořeného enzymaticky vanadiumchlorperoxidázou V-CPO z Curvularia inaequalis. Aby bylo možno uskutečnit srovnání, bylo použito mikročerpadla. Bylo totiž zapotřebí zajistit v průběhu pokusu stejný profil koncentrace i pro hypochlorit, vytvořený enzymem. Účinnost V-CPO byla v průběhu pokusu velmi pečlivě stanovena, aby bylo známo množství hypochloritu v každém okamžiku pokusu.In this example, ap compares the effect of hypochlorite with that produced enzymatically by vanadium chloroperoxidase V-CPO from Curvularia inaequalis. A micro pump was used to make the comparison. Indeed, it was necessary to ensure the same concentration profile during the experiment for the hypochlorite produced by the enzyme. The efficacy of V-CPO was determined very carefully during the experiment to know the amount of hypochlorite at each time of the experiment.

Materiály:Materials:

V tomto příkladu byly použity bakteriální kmeny Escherichia coli NCTC 900, Pseudomonas aeruginova ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 13565, Streptococcus faecalis NCTC 1092 a Listeria innocua ATCC 33090, serotyp 6B. Bakterie byly pěstovány 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C v bujónu s vývarem z mozku a srdce BHI. Po této době byly bakteriální kmeny dvakrát promyty citrátovým pufrem o pH 5,5 (20 mM citrátu sodného a NaOH + 10 mM NaCl). Suspenze bakterií pak byla odstředěna 5 minut v Eppendorfově odstředivce při 14 000 ot/min, supernatant byl odstraněn a usazenina bakterií byla znovu uvedena do suspenze v citrátovém pufru. Toto promytí bylo jště jednou opakováno. Promyta suspenze bakterií pak byla zředěna citrátovým pufrem o pH 5,5 na suspenzi, obsahující přibližně 10 bakterií/ml. Při provádění těchto stupňů byl buněčný materiál uložen v ledu.In this example, bacterial strains of Escherichia coli NCTC 900, Pseudomonas aeruginova ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC 13565, Streptococcus faecalis NCTC 1092 and Listeria innocua ATCC 33090, serotype 6B were used. The bacteria were cultured for 15-18 hours at 30 ° C in a broth containing BHI broth and heart. After this time, the bacterial strains were washed twice with citrate buffer pH 5.5 (20 mM sodium citrate and NaOH + 10 mM NaCl). The bacterial suspension was then centrifuged for 5 minutes in an Eppendorf centrifuge at 14,000 rpm, the supernatant was removed, and the bacterial pellet was resuspended in citrate buffer. This wash was repeated once more. The washed bacterial suspension was then diluted with citrate buffer pH 5.5 to a suspension containing approximately 10 bacteria / ml. In these steps, the cell material was stored on ice.

Pufry a 1% roztok BSA v citrátovém pufru o pH 5,5 byly sterilizovány filtrací a uloženy při teplotě 4 °C. Roztoky hypochloritu byly připraveny ze zásobního roztoku s obsahem 107 000 ppm této látky ředěním sterilní demineralizovanou vodou.Buffers and 1% BSA in citrate buffer pH 5.5 were filter sterilized and stored at 4 ° C. Hypochlorite solutions were prepared from a stock solution containing 107,000 ppm by dilution with sterile demineralized water.

Roztoky peroxidu vodíku byly připraveny z 30% zásobního roztoku ředění sterilní demineralizovanou vodou. Casitone byl získán od Difco. Chloperoxidáza z Curvularia inaequalis byla čištěna podle publikace Schijndel a další, 1993. Účinnost chlorperoxidázy při přeměně chloru na H0C1 byla stanovena spektrofotometricky ve 20 mM pufru s citrátem sodným o pH 5,5 s obsahem 10 mM NaCl, 100 mikroM peroxidu vodíku a 50 mikroM monochlordimedonu při 30 °C, sleduje se přeměna monochlordimedonu (e 290 nm = 20,2 mM~¹.cm~ ) na dichlordimedon (e 290 nm = 0,2 mM \cm ^) . Jedna jednotka chlorperoxidázy je to množství enzymu, které přeměňují jeden mikromol monochlordimedonu (Sigma) za minutu.Hydrogen peroxide solutions were prepared from a 30% stock dilution solution with sterile demineralized water. Casitone was obtained from Difco. Curvularia inaequalis chloroperoxidase was purified according to Schijndel et al., 1993. The efficacy of chloroperoxidase in converting chlorine to HCl was determined spectrophotometrically in 20 mM sodium citrate buffer pH 5.5 containing 10 mM NaCl, 100 microM hydrogen peroxide and 50 microM monochlordimedone. at 30 ° C, follows the conversion of monochlorodimedone (e 290nm = 20.2 mM ^-1 .cm ~) to dichlorodimedone (e 290 nm = 0.2 mM \ cm ^). One unit of chloroperoxidase is the amount of enzyme that converts one micromole of monochlorodisone (Sigma) per minute.

Metoda:Method:

Při použití sterilních podmínek se vytvoří suspenze 7 s obsahem přibližně 10 bakterií/ml citrátového pufru o pH 5,5. Z této suspenze se přidají podíly 1,8 ml do sterilní reakční nádoby, v níž se obsah za sterilních podmínek míchá magnetickým míchadlem v průběhu celého pokusu. Pak se přidá 0,2 ml roztoku V-CPO s různou koncentrací (výpočet je dále uveden) tak, aby se vytvořila zřeďovací řada této látky. Mimoto byla zařazena kontrolní zkouška, k níž bylo přidáno 0,2 ml sterilního pufru místo 0,2 ml roztoku V-CPO. Vzorky byly inkubovány při teplotě 30 °C a pak bylo přidáno 0,5 ml zásobního roztoku peroxidu vodíku k zahájení reakce. Použitá koncentrace peroxidu vodíku závisela na koncentraci hypochloritu a byla volena tak, aby konečná koncentrace peroxidu vodíku byla pětinásobkem molárního přebytku, vztaženo na konečnou koncentraci hypochloritu. Vzorky byly inkubovány přesně 5 minut při teplotě 30 °C. Po této době inkubace byl odebrán 1 ml reakční směsi a byl přidán k 9 ml chladného 1% roztoku BSA, vzorek byl okamžitě uložen do ledu k zastavení reakce hypochloritu s mikroorganismem. Přežití mikroorganismů, vyjádřené jako počet jednotek pro tvor bu kolonií, CFU/ml bylo stanoveno tak, že vzorky byly zředě -1 —5 ny v rozmezí 10 až 10 a vzorky 100 mikrolitrů různého ředění byly naneseny na značené BHI-agarové plotny. Plotny pak byly inkubovány 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C. V pří pádě, že po této době nebylo možno prokázat přítomnost CFU, byly plotny inkubovány jeste 24 hodin pri teplote 30 C.Using sterile conditions, a suspension 7 is formed containing approximately 10 bacteria / ml citrate buffer pH 5.5. From this suspension, 1.8 ml aliquots are added to a sterile reaction vessel in which the contents are stirred under sterile conditions with a magnetic stirrer throughout the experiment. 0.2 ml of a V-CPO solution of varying concentration (calculated below) is then added to form a dilution series. In addition, a control assay was included to which 0.2 ml of sterile buffer was added instead of 0.2 ml of V-CPO solution. The samples were incubated at 30 ° C and then 0.5 ml of hydrogen peroxide stock solution was added to initiate the reaction. The hydrogen peroxide concentration used depended on the hypochlorite concentration and was chosen such that the final hydrogen peroxide concentration was five times the molar excess based on the final hypochlorite concentration. The samples were incubated for exactly 5 minutes at 30 ° C. After this incubation period, 1 ml of the reaction mixture was collected and added to 9 ml of cold 1% BSA solution, the sample was immediately placed on ice to stop the hypochlorite reaction with the microorganism. The survival of the microorganisms, expressed as the number of colony forming units, CFU / ml was determined by diluting the samples for 1 to 5 in the range of 10 to 10, and samples of 100 microliters of various dilutions were plated on labeled BHI-agar plates. The plates were then incubated at 30 ° C for 15-18 hours. In the event that CFU was not detectable after this time, the plates were incubated for 24 hours at 30 ° C.

Hodnoty MIC byly srovnávány s hodnotami, které byly získány při přidání týchž množství hypochloritu při použití mikročerpadla. Postup byl prováděn následujícím způsobemMIC values were compared to those obtained by adding the same amounts of hypochlorite using a micro pump. The procedure was carried out as follows

Za sterilních podmínek byla připravena suspenze při7 bližně 10 bakterií/ml citrátového pufru o pH 5,5. Z této suspenze byly podíly po 1,8 ml uloženy do sterilní reakční nádoby, která se v průběhu pokusu za sterilních podmínek míchá magnetickým míchadlem. Směs se inkubuje při teplotě 30 °C a přidá se 0,2 ml zásobního roztoku peroxidu vodíku, jehož koncentrace se volí v závislosti na koncentraci hypochloritu tak, aby konečná koncentrace peroxidu vodíku byla pětinásobkem molárního množství hypochloritu. Pak se v průběhu 5 minut rychlostí 0,1 ml/min při teplotě 30 °C přidá 0,5 ml roztoku hypochloritu známé koncentrace. Provádí se řada pokusů, v každém z nich se užije roztok hypochloritu odlišné koncentrace tak, aby vznikla řada stoupajících koncentrací hapochloritu (výpočet je dále uveden). Směs se inkubuje 5 minut a pak se odebere 1 ml reakční směsi a přidá se do 9 ml chladného 1% roztoku BSA, načež se vzorky okamžitě uloží do ledu k zastavení reakce hypochloritu s mikroorganismy. Přežití mikroorganismů ve formě jednotek pro tvorbu kolonií, CFU/ml se stanoví tak, že se vzorek zředí v rozmezí 10 až 10 a vždy 100 mikrolitrů různých ředění se nanese na značené BHI agarové plotny, které se pak inkubují 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C. V případě, že po této době není možno prokázat přítomnost CFU, inkubují se plotny dalších 24 hodin při teplotě 30 °C.Under sterile conditions, a suspension was prepared at about 10 bacteria / ml citrate buffer pH 5.5. From this suspension, 1.8 ml aliquots were placed in a sterile reaction vessel which was stirred under sterile conditions with a magnetic stirrer during the experiment. The mixture is incubated at 30 ° C and 0.2 ml of hydrogen peroxide stock solution is added, the concentration of which is chosen depending on the concentration of hypochlorite, so that the final concentration of hydrogen peroxide is five times the molar amount of hypochlorite. 0.5 ml of a hypochlorite solution of known concentration is then added at a rate of 0.1 ml / min at 30 ° C over 5 minutes. A number of experiments are carried out, each using a hypochlorite solution of different concentration to produce a series of increasing concentrations of hapochlorite (calculation below). The mixture is incubated for 5 minutes and then 1 ml of the reaction mixture is withdrawn and added to 9 ml of cold 1% BSA solution, then the samples are immediately placed on ice to stop the hypochlorite reaction with the microorganisms. Survival of microorganisms in the form of colony forming units, CFU / ml, is determined by diluting the sample between 10 and 10 and each 100 microliters of various dilutions is applied to labeled BHI agar plates, which are then incubated for 15-18 hours at 30 ° C. Deň: 32 ° C. If CFU is not detectable after this time, the plates are incubated for an additional 24 hours at 30 ° C.

Podobnost profilu účinku hypochloritu, uvolněného působením V-CPO a hypochloritu ze zásobního roztoku byla potvrzena stejným provedením pokusů pří použití spektrofotometru, v němž byla koncentrace hypochloritu v průběhu času sledována při 290 nm na bázi přeměny monochlordimedo— 1 —1 nu (e 290 nm = 20,2 mM .cm )na dichlordimedon (e 290 nm= = 0,2 mM^-1.cm^-1) .The similarity of the V-CPO-released hypochlorite effect profile and the hypochlorite from the stock solution was confirmed by the same experiments using a spectrophotometer in which the hypochlorite concentration was monitored over time at 290 nm on the basis of monochlordimedo-1-nu (e 290 nm = 20.2 mM cm-1) to dichlorodimedone (e 290 nm = 0.2 mM ^-1 cm- ¹ ).

Výpočet:Calculation:

Konečná koncentrace hypochloritu, vytvořeného působením V-CPO se vypočítá následujícím způsobem:The final concentration of hypochlorite formed by V-CPO is calculated as follows:

Při použití 0,01 jednotky V-CPO/ml se vytvoří za minutu 0,01 mikromol hypochloritu v 1 ml roztoku, což je ekvivalentní 0,05 mikromol/ml v průběhu 5 minut vzhledem ke zřeďovacímu účinku 0,5 ml roztoku, který se přidá k 2,0 ml počátečního objemu, takže konečná koncentrace po 5 minutách je (2,0/2,5).0,05 mikromol/ml = 0,04 mikromol hypochloritu/ml po 5 minutách. Tuto koncentraci je možno vyjádřit jako 0,04.52,5 ppm hypochloritu, to znamená 20,10 ppm hypochloritu. Další konečné koncentrace hypochloritu byly připraveny zvýšením nebo snížením koncentrace V-CPO. Konečná koncentrace hypochloritu byla vypočítána následujícím způsobem: vzhledem k tomu, že se k reakčnímu objemu 2,0 ml přidá ještě 0,5 ml roztoku, je konečný objem 2,5 ml, což odpovídá pětinásobnému ředění. Aby bylo možno připravit roztok hypochloritu s výslednou koncentrací 2,10 ppm, je nutno použít 10,50 ppm hypochloritu v zásobním roztoku. Další koncentrace je možno připravit zvýšením nebo snížením obsahu hypochloritu v zásobním roztoku.Using 0.01 units of V-CPO / ml, 0.01 micromoles of hypochlorite is produced per minute in 1 ml of solution, which is equivalent to 0.05 micromoles / ml over 5 minutes due to the dilution effect of 0.5 ml of solution add to 2.0 ml of initial volume so that the final concentration after 5 minutes is (2.0 / 2.5) .0.05 micromol / ml = 0.04 micromol of hypochlorite / ml after 5 minutes. This concentration can be expressed as 0.04.52.5 ppm hypochlorite, i.e. 20.10 ppm hypochlorite. Additional final hypochlorite concentrations were prepared by increasing or decreasing the V-CPO concentration. The final hypochlorite concentration was calculated as follows: since 0.5 ml of the solution was added to the 2.0 ml reaction volume, the final volume was 2.5 ml corresponding to a 5-fold dilution. In order to prepare a hypochlorite solution with a final concentration of 2.10 ppm, it is necessary to use 10.50 ppm of hypochlorite in the stock solution. Additional concentrations may be prepared by increasing or decreasing the hypochlorite content of the stock solution.

Minimální inhibiční koncentrace MIC je definována jako ta koncentrace hypochloritu, která vede za podmínek pokusu k nejméně log 6-snížení počtu jednotek pro tvorbu kolonií zkoumaného mikroorganismu.The minimum inhibitory concentration of MIC is defined as that concentration of hypochlorite that results in at least a log 6-colony count reduction of the microorganism of interest under the test conditions.

Výsledky uvedených pokusů jsou shrnuty v tabulce II, v níž jsou srovnávány výsledky působení konečných koncentrací hypochloritu, přodďkováného V-CPO nebo přidaného ze zásobníého roztoku. Jak je zřejmé z tabulky II, způsobuje enzymaticky uvolněný hypochlorit po působení V-CPO úplnou inhibici růstu již při nízké koncentraci 0,4 ppm u všech organismů s výjimkou Staphylococcus aureus, u nějž je zapotřebí použít 2 ppm hypochloritu pro úplnou inhibici.The results of these experiments are summarized in Table II, which compares the results of the effects of the final concentrations of hypochlorite, supplemented V-CPO or added from the stock solution. As shown in Table II, enzymatically released hypochlorite after V-CPO treatment completely inhibits growth at a low concentration of 0.4 ppm in all organisms except Staphylococcus aureus, which requires 2 ppm of hypochlorite for complete inhibition.

Z toho je zřejmé, že vanadiumhalogenperoxidáza je daleko účinnější složkou prostředku, než by bylo možno očekávat pouze na základě její schopnosti vytvořit hypochlorit. Je rovněž zřejmé, že při použití uvedeného enzymu je možno vyhubit všechny mikroorganismy, pathogenní i nepathogenní, kdežto v případě halogenperoxidáz, obsahujících hem se podle EP-A-500 387 popisuje pouze schopnost potlačit růst pathogenních bakterií.Thus, vanadium haloperoxidase is a far more potent component of the composition than would be expected only by its ability to form hypochlorite. It is also evident that all microorganisms, both pathogenic and non-pathogenic, can be exterminated using the enzyme, whereas in the case of heme-containing haloperoxidases, only the ability to suppress the growth of pathogenic bacteria is described in EP-A-500 387.

Tabulka IITable II

Hodnoty MIC pro různé mikroorganismyMIC values for various microorganisms

MikroorganismusMicroorganism

MIC pro hypo- MIC pro chlorit ppm V-CPO ppmMIC for hypo- MIC for chlorite ppm V-CPO ppm

Escherichia coliEscherichia coli

Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus

Listeria innocuaListeria innocua

Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

Streptococcus faecalisStreptococcus faecalis

2-32-3

0,40.4

1,61.6

0,40.4

0,40.4

0,40.4

Příklad 3Example 3

Účinnost přidaného hypOjChlpritu a hypochloritu, vytvořeného působením V-CPO v přítomnosti hydrolyzátu bílkovinEfficacy of added hypochlorite and hypochlorite produced by V-CPO in the presence of protein hydrolyzate

Je známo, že k dosažení požadovaného účinku je obvykle zapotřebí použít vyšší dávky hypochloritu vzhledem k tomu, že tato reaktivní látka reaguje nejen s mikroorganismy, nýbrž také s různými sloučeninami. Z tohoto důvodu bylo zkoumáno chování vanadiumhalogenperoxidázy v přítomnosti hydrolyzátu bílkovin.It is known that higher doses of hypochlorite are usually required to achieve the desired effect since this reactive agent reacts not only with microorganisms but also with various compounds. For this reason, the behavior of vanadium haloperoxidase in the presence of protein hydrolyzate was investigated.

Materiály:Materials:

Použitým bakteriálním kmenem byla Escherichia coli NCTC 900. Bakterie byly pěstovány 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C v bujónu BHI s vývarem ze srdce a mozku. Po vypěstování byly bakterie dvakrát promyty citrátovým pufrem o pH 5,5 (20 mM citrátu sodného s NaOH + 10 mM NaCl). Suspenze bakterií pak byla 5 minut odstředěna v Eppendorfově odstředivce při 14 000 ot/min, supernatanty byly odstraněny a usazenina bakterií byla znovu uvedena do suspenze v citrátovém pufru. Toto promývání bylo ještě jednou opakováno pro každou bakteriální suspenzi. Dvakrát promyté suspenze bakterií pak byly zředěny citrátovým pufrem o pH 5,5 na susg penzi s obsahem bakterií přibližně 10 /ml. V průběhu promývání byl buněčný materiál uložen v ledu. Pufry a 1% roztok BSA v citrátovém pufru o pH 5,5 byly sterilizovány filtrací a uloženy při teplotě 4 °C. Roztoky hypochloritu byly připravovány ze zásobního roztoku s obsahem 107 000 ppm zředěním sterilními roztoky. Roztoky peroxidu vodíku byly připraveny ze 30% zásobního roztoku zředěním sterilní demineralizovanou vodou. Casitone byl získán od Difco. Chlorperoxidáza byla izolována z Curvularia inaequalis a čištěna podle publikace Van Schijndel a další, 1993.The bacterial strain used was Escherichia coli NCTC 900. The bacteria were grown for 15-18 hours at 30 ° C in a BHI broth with broth from the heart and brain. After cultivation, the bacteria were washed twice with citrate buffer pH 5.5 (20 mM sodium citrate with NaOH + 10 mM NaCl). The bacterial suspension was then centrifuged for 5 minutes in an Eppendorf centrifuge at 14,000 rpm, the supernatants were removed, and the bacterial pellet was resuspended in citrate buffer. This wash was repeated once for each bacterial suspension. The twice washed bacterial suspensions were then diluted with citrate buffer pH 5.5 to a susg retention with a bacterial content of approximately 10 / ml. During washing, the cell material was stored on ice. Buffers and 1% BSA in citrate buffer pH 5.5 were filter sterilized and stored at 4 ° C. Hypochlorite solutions were prepared from a stock solution containing 107,000 ppm by dilution with sterile solutions. Hydrogen peroxide solutions were prepared from a 30% stock solution by dilution with sterile demineralized water. Casitone was obtained from Difco. Chloroperoxidase was isolated from Curvularia inaequalis and purified according to Van Schijndel et al., 1993.

Metoda:Method:

Za sterilních podmínek byla připravena suspenze bakterií přibližně 10⁸/ml v citrátovém pufru o pH 5,5. Podíly 1,3 ml této suspenze byly uloženy do sterilní reakčni nádoby, jejíž obsah byl v průběhu pokusů kontinuálně míchán magnetickým míchadlem. Pak bylo přidáno 0,5 ml roztoku casitonu s obsahem této látky 0,5 mg/ml v citrátovém pufru o pH 5,5, kontrolní roztok obsahoval pouze 0,5 ml citrátového pufru o pH 5,5. Pak bylo přidáno 0,2 ml roztoku V-CPO s různou koncentrací (výpočty jsou uvedeny v příkladu 2), tak, aby bylo dosaženo konečné koncentrace 3,2 ppm nebo 6,5 ppm hypochloritu. Do kontrolních roztoků bylo přidáno 0,2 ml sterilního pufru místo 0,2 ml roztoku V-CPO. Vzorky byly inkubovány při teplotě 30 °C a pak bylo přidáno 0,5 ml roztoku peroxidu vodíku tak, aby bylo dosaženo pětinásobného molárního přebytku peroxidu vodíku na konci přidávání, čímž dojde k reakci V-CPO. Vzorky se inkubují přesně 5 minut při teplotě 30 °C. Po této době se odebere 1 ml reakční směsi a přidá se k 9 ml chladného 1% roztoku BSA, načež se vzorky okamžitě uloží do ledu k zastavení reakce hypochloritu s mikroorganismy. Přežívání bakterií se stanoví na základě počtu jednotek pro tvorbu kolonií, CFU, tyto jednotky se stanoví zředěním vzorků v rozmezí 10 až 10^_ a nanesením 100 mikrolitrů vzorku s různým ředěním na značené BHI-agarové plotny. Plotny se pak inkubují 15 až 18 hodin při 30 °C. V případě, že po této době není možno prokázat přítomnost CFU, inkubují se plotny dalších 24 hodin při teplotě 30 °C.Under sterile conditions, a suspension of bacteria of about 10 ⁸ / ml in citrate buffer pH 5.5 was prepared. Aliquots of 1.3 ml of this suspension were placed in a sterile reaction vessel whose contents were continuously stirred with a magnetic stirrer during the experiments. Then 0.5 ml of a casitone solution containing 0.5 mg / ml in citrate buffer pH 5.5 was added, the control solution contained only 0.5 ml citrate buffer pH 5.5. Then 0.2 ml of a different concentration of V-CPO solution (calculations are given in Example 2) was added to achieve a final concentration of 3.2 ppm or 6.5 ppm hypochlorite. 0.2 ml of sterile buffer was added to the control solutions instead of 0.2 ml of V-CPO solution. The samples were incubated at 30 ° C, and then 0.5 ml of hydrogen peroxide solution was added to give a 5-fold molar excess of hydrogen peroxide at the end of the addition to effect the V-CPO reaction. The samples are incubated for exactly 5 minutes at 30 ° C. After this time, 1 ml of the reaction mixture was withdrawn and added to 9 ml of cold 1% BSA solution, whereupon the samples were immediately placed on ice to stop the hypochlorite reaction with the microorganisms. Survival of bacteria is determined based on the number of colony forming units, CFU, of these units is determined by diluting the sample in the range 10 to 10 ^_ and plating 100 l samples with various dilutions on labeled BHI-agar plates. The plates are then incubated at 30 ° C for 15-18 hours. If CFU is not detectable after this time, the plates are incubated for an additional 24 hours at 30 ° C.

Účinnost, dosažená tímto způsobem byla srovnávána s účinností přidaného hypochloritu v různém množství při použití mikročerpadla následujcím způsobem:The efficacy achieved in this way was compared with the efficacy of the added hypochlorite in varying amounts when using a micro pump as follows:

Za sterilních podmínek se připraví suspenze bakteriíBacterial suspensions are prepared under sterile conditions

Q přibližně 10 /ml v citrátovém pufru o pH 5,5. Z této suspenze se přidají podí|y po 1,3 ml do sterilní reakční nádoby, jejíž obsah se v průběhu pokusu kontinuálně míchá magnetickým míchadlem. Pak se přidá roztok 0,5 ml casitonu s obsahem 0,5 mg této látky v 1 ml citrátového pufru o pH 5,5, jako kontrolní roztok se přidá 0,5 ml citrátového pufru o pH 5,5. Pak se přidá ještě 0,2 ml sterilního citrátového pufru o pH 5,5. Obsah reakčních nádob se inkubuje při teplotě 30 °C a pak se přidá 0,5 ml roztoku hypochloritu k dosažení konečné koncentrace 3,2 ppm nebo 6,5 ppm hypo21 chloritu (pro výpočet koncentrace byly podmínky uvedeny v příkladu 2) v průběhu 5 minut rychlostí 0,1 ml/min při teplotě 30 °C. Po inkubační době 5 minut byl odebrán 1 ml reakční směsi a přidán k 9 ml 1% chladného roztoku BSA, načež byly vzorky okamžitě uloženy do ledu k zastavení reakce hypochloritu s mikroorganismy. Přežívání bakterií bylo stanoveno v jednotkách pro tvorbu kolonií, CFU, zředěním vzorku v rozmezí 10 až 10 s nanesením vzorků s objemem 100 mikrolitrů v různém ředění na značené BHI-agarové plotny, které pak byly inkubovány 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C.Q approximately 10 / ml in citrate buffer pH 5.5. 1.3 ml aliquots of this suspension were added to a sterile reaction vessel whose contents were continuously stirred with a magnetic stirrer during the experiment. Then a solution of 0.5 ml of casitone containing 0.5 mg of this substance in 1 ml of citrate buffer pH 5.5 is added, as a control solution 0.5 ml of citrate buffer pH 5.5 is added. 0.2 ml of sterile citrate buffer pH 5.5 is then added. The contents of the reaction vessels are incubated at 30 ° C and then 0.5 ml of hypochlorite solution is added to achieve a final concentration of 3.2 ppm or 6.5 ppm of hypo21 chlorite (for the calculation of the concentration, the conditions are given in Example 2) over 5 minutes. at a rate of 0.1 ml / min at 30 ° C. After an incubation period of 5 minutes, 1 ml of the reaction mixture was removed and added to 9 ml of a 1% cold BSA solution, and the samples were immediately placed on ice to stop the hypochlorite reaction with the microorganisms. Bacterial survival was determined in colony forming units, CFU, by diluting the sample in the range of 10-10 with 100 microliter samples at various dilutions on labeled BHI-agar plates, which were then incubated for 15-18 hours at 30 ° C.

V případě, že po této době nebylo možmo prokázat přítomnost CFU, byly plotny inkubovány dalších 24 hodin při teplotě 30 °C. Výsledky jsou shrnuty v tabulce III.If CFU was not detectable after this time, the plates were incubated for an additional 24 hours at 30 ° C. The results are summarized in Table III.

Tabulka IIITable III

Vliv casitonu na účinnost HC10, vytvořený V-CPOEffect of casitone on HC10 efficacy generated by V-CPO

casiton mg/ml casitone mg / ml log snížení s 3,2 ppm HC10 z V-CPO log reduction with 3.2 ppm HC10 from V-CPO log snížení s 3,2 ppm HC10 log reduction with 3.2 ppm HC10 log snížení s 6,5 ppm HC10 z V-CPO log reduction with 6.5 ppm HC10 from V-CPO log snížení s 6,5 ppm HC10 log reduction with 6.5 ppm HC10 0,0 0.0 8,0 8.0 8,2 8.2 8,0 8.0 8,2 8.2 (úplné vyhubení) (complete eradication) (úplné vyhubení) (complete eradication) (úplné vyhubení) (complete eradication) (úplné vyhubení) (complete eradication) 0,1 0.1 5,0 5.0 0,5 0.5 8,0 8.0 1,0 1.0

(úplné ) > vyhubení)(complete)> extermination)

Příklad 4Example 4

Srovnání účinnosti vanadiumhalogenperoxidázy a halogenperoxidázy, obsahující hemComparison of the efficacy of vanadium haloperoxidase and heme-containing haloperoxidase

Materiály:Materials:

K pokusu byly užity bakteriální kmeny Escherichia coli NCTC 900, Streptococcus faecalis NCTC 1092 a Listeria innocua ATCC 33090, serotyp 6B. Bakterie byly pěstovány 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C v bujónu BHI. Po této době byly kmeny dvakrát promyty citrátovým pufrem o pH 5,5 (20 mM citrátu sodného s NaOH + 10 mM NaCl). Pak byly suepenze bakterií odstředěny 5 minut v Eppendorfově odstředivce při 14 000 ot/min, supernatanty byly odstraněny a usazeniny bakterií byly znovu uvedeny do suspenze v citrátovém pufru. Toto promytí bylo v každém případě ještě jednou opakováno. Dvakrát promyté bakteriální suspenze pak byly zředěny citrátovým pufrem o pH 5,5 na suspenze s obsahem bak7 o „ ~ z terií přibližně 10 /ml. B průběhů promývání byl bunecny materiál uložen v ledu. Pufry a 1% roztok BSA v citrátovém pufru o pH 5,5 byly sterilizovány filtrací a uloženy při teplotě 4 °C. Chloperoxidáza z Curvularia inaequalis byla čištěna podle publikace Van Schindel a další, 1993. Chlorperoxidáza, obsahující hem byla získána od Sigma (z Caldotiomyces fumago). Účinnost chlorperoxidázy při přeměně chloru na H0C1 byla stanovena spektrofotometrlcky ve 20 mM citrátovém pufru o pH 5,5 s 10 mM NaCl, 100 mikroM peroxidu vodíku a 50 mikroM monochlordimedonu při teplotě 30 °C sledováním přeměny monochloridimedonu (e 290 nm = 20,2 mM .cm^-1) na chlordimedon (e 290 nm = 0,2 mM^-1.cm ). Jedna jednotka chlorperoxidázy je definována jako to množství enzymu, ktere premeni 1 mikromol monochlordimedonu za minutu. Pro oba enzymy byla užita tatáž zkouška, aby bylo možno zajistit stejnou účinnou dávku pro obě látky.The bacterial strains Escherichia coli NCTC 900, Streptococcus faecalis NCTC 1092 and Listeria innocua ATCC 33090, serotype 6B were used for the experiment. The bacteria were grown for 15-18 hours at 30 ° C in BHI broth. After this time, the strains were washed twice with citrate buffer pH 5.5 (20 mM sodium citrate with NaOH + 10 mM NaCl). Then the bacterial suepens were centrifuged for 5 minutes in an Eppendorf centrifuge at 14,000 rpm, the supernatants were discarded and the bacterial sediments were resuspended in citrate buffer. This wash was in each case repeated once more. The twice washed bacterial suspensions were then diluted with citrate buffer pH 5.5 to a suspension containing bac7 of approximately 10 / ml. During the wash steps, the cell material was stored in ice. Buffers and 1% BSA in citrate buffer pH 5.5 were filter sterilized and stored at 4 ° C. Curvularia inaequalis chloroperoxidase was purified according to Van Schindel et al., 1993. Heme-containing chloroperoxidase was obtained from Sigma (from Caldotiomyces fumago). The efficacy of chloroperoxidase in the conversion of chlorine to HCl was determined spectrophotometrically in 20 mM citrate buffer pH 5.5 with 10 mM NaCl, 100 microM hydrogen peroxide and 50 microM monochlordimedone at 30 ° C by monitoring the conversion of monochloridimedone (e 290 nm = 20.2 mM cm ^-1 ) to chlordimedone (e 290 nm = 0.2 mM ^-1 .cm). One unit of chloroperoxidase is defined as that amount of enzyme that converts 1 micromole of monochlorodisone per minute. The same assay was used for both enzymes to ensure the same effective dose for both.

Metoda:Method:

Za sterilních podmínek se připraví suspenze bakterií s obsahem bakterií přibližně 10 /ml ve 20 mM pufru s citrátem sodným o pH 5,5 s 10 mM NaCI. Z této suspenze se podíly po 1,9 ml vloží do sterilních zkumavek. Pak se do zkumavek přidá 0,1 ml zásobního roztoku vanadiumchlorperoxidázy nebo chlorperoxidázy, obsahující hem tak, aby byla získána zřeďovací řada pro oba enzymy. Kontrolní zkumavky obsahovaly pouze sterilní pufr bez přidání zásobního roztoku enzymů. Pak se přidá 0,5 ml zásobního roztoku 25 mM peroxidu vodíku. Vzorky se inkubují přesně 5 minut při teplotě 30 °C. Po této době inkubace se odebere 1 ml reakční směsi a přidá se do 9 ml chladného 1% roztoku BSA a pak se vzorky okamžitě uloží do ledu. Přežívání bakterií se stanoví podle počtu jednotek pro tvorbu kolonií, CFU/ml, tato hodnota se , -1 - -5 stanoví tak, že se vzorek zředí v rozmezí 10 az 10 a 100 mikrolitrů vzorku v různém ředění se nanese na značené BHI-agarové plotny. Tyto plotny se pak inkubují 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C. V případě, že po této době nelze prokázat přítomnost CFU, inkubují se plotny dalších 24 hodin při teplotě 30 °C.Under sterile conditions, a suspension of bacteria having a bacterial content of approximately 10 / ml is prepared in 20 mM sodium citrate buffer pH 5.5 with 10 mM NaCl. From this suspension, aliquots of 1.9 ml are placed in sterile tubes. Thereafter, 0.1 ml of a stock solution of vanadium chloroperoxidase or chloroperoxidase containing heme was added to the tubes to obtain a dilution series for both enzymes. Control tubes contained only sterile buffer without the addition of enzyme stock. 0.5 ml of a 25 mM hydrogen peroxide stock solution is then added. The samples are incubated for exactly 5 minutes at 30 ° C. After this incubation period, 1 ml of the reaction mixture is withdrawn and added to 9 ml of cold 1% BSA solution, and the samples are immediately placed on ice. Bacterial survival is determined by the number of colony forming units, CFU / ml, this value, -1-5, is determined by diluting the sample between 10 and 10 and 100 microliters of sample at various dilutions applied to labeled BHI-agar plates. These plates are then incubated at 30 ° C for 15-18 hours. If CFU cannot be detected after this time, the plates are incubated for an additional 24 hours at 30 ° C.

Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce IV.The results are summarized in Table IV below.

Je zřejmé, že vanadiumchlorperoxidáza představuje daleko účinnější systém než chlorperoxidáza, obsahující hem v případě, že oba enzymy jsou užity v téže dávce, i »Obviously, vanadium chloroperoxidase is a far more potent system than chloroperoxidase containing haem when both enzymes are used at the same dose, i »

Tabulka IVTable IV

10 mM Naci 10 mM Naci vanadium chloro- peraxidaza jednotky/ml vanadium chloro- peraxidaza units / ml hem< chloro- peroxidaza jednotky/ml hem < chloro- peroxidase units / ml log snížení log reduction E coli E coli 0.000 0.000 0.0 0.0 0.00156 0.00156 4.0 4.0 0.0030 0.0030 5.0 5.0 0.0060 0.0060 7.0 ^x 7.0 ^x 0.012 0.012 7.0 ^x 7.0 ^x 0.025 0.025 7.0 ^x 7.0 ^x 0.050 0.050 7.0 ^x 7.0 ^x 0.10 0.10 7.0 ^x 7.0 ^x 0.000 0.000 0.0 0.0 0.00156 0.00156 0.1 0.1 0.0030 0.0030 0.1 0.1 0.0060 0.0060 0.1 0.1 0.012 0.012 0.2 0.2 0.025 0.025 1.0 1.0 0.050 0.050 1.2 1.2 0.10 0.10 1.2 1.2

χ = úplné vyhubení uχ = complete extermination at

L. innocua L. innocua 0.000 0.000 0.0 0.0 0.00156 0.00156 7.0^x 7.0 ^x 0.0030 0.0030 7.0^x '7.0 ^x ' 0.0060 0.0060 7.0^x 7.0 ^x 0.012 0.012 7.0^x 7.0 ^x 0.025 0.025 7.0^x 7.0 ^x 0.050 0.050 •7.0^x • 7.0 ^x 0.10 0.10 7.0^x 7.0 ^x 0.00 0.00 0.0 0.0 0.00156 0.00156 0.0 0.0 0.0030 0.0030 0.0 0.0 0.0060 0.0060 0.0 0.0 0.012 0.012 0.0 0.0 0.025 0.025 0.0 0.0 0.050 0.050 0.0 0.0 0.10 0.10 0.0 0.0 S.faecalis S.faecalis 0.00 0.00 0.0 0.0 0.00156 0.00156 5.0 5.0 0.0030 0.0030 5.0 5.0 0.0060 0.0060 7.0^X 7.0 ^X 0.012 0.012 7.0^X 7.0 ^X 0.025 0.025 _ X _ X 7.0 7.0 0.050 0.050 7.0^X 7.0 ^X 0.10 0.10 7.0^X 7.0 ^X 0.00 0.00 0.0 0.0 0.00156 0.00156 0.0 0.0 1 1 0.0030 0.0030 0.1 0.1 0.0060 0.0060 0.1 0.1 0-012 0-012 0.1 0.1 0.025 0.025 0.1 0.1 0.050 0.050 0.1 0.1 0.10 0.10 0.9 0.9

x = úplné vyhubeníx = complete eradication

Příklad 5Example 5

Vliv různých zdrojů peroxidu vodíku na inhibiční účinnost V-CPOEffect of various hydrogen peroxide sources on V-CPO inhibitory activity

V předchozích příkladech byl peroxid vodíku, který je jedním ze substrátů v reakci V-CPO, přidáván ve formě zásobního roztoku. V tomto příkladu byl pozorován vliv jiných zdrojů peroxidu vodíku. Oxidázy byly podrobeny zkouškám při teplotě 30 °C v zařízení pro sledování spotřeby kyslíku, Biological Oxygen Monitor YSI Model 5300 (Oxygen chamber model 5301) při použití citrátového pufru o pH 5,5 (20 mM citrátu sodného s NaOH + 10 mM NaCl). Pufr byl nasycen vzduchem při 30 °C. Jako substrát pro glukosooxydázu byla užita glukosa v konečné koncentraci 15 g/litr. Byl užit bakteriální kmen Escherichia coli NCTC 900. Bakterie byly pěstovány 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C v bujónu BHI. Po uvedené době byly kmeny dvakrát promyty citrátovým pufrem o pH 5,5 (20 mM citrátu sodného s NaOH + 10 mM NaCl) Suspenze bakterií byly odstředěny 5 minut v Eppendorfově odstředivce při 14 000 ot/min, supernatant byl odstraněn a usazenina bakterií byla znovu uvedena do suspenze v citrátovém pufru. Toto promývání bylo ještě jednou opakováno pro každou suspenzi bakterií. Dvakrát promyté suspenze bakterií pak byly zředěny citrátovým pufrem o pH 5,5 za vzniku suspenze bakterií přibližně 10 /ml. V průběhu promývání byl buněčný materiál uložen do ledu. Pufry a 1% roztok BSA v t citrátovém pufru o pH 5,5 byly sterilizovány filtrací a pak uloženy při teplotě 4 °C. Roztoky hypochloritu byly připraveny ze zásobního roztoku této látky s obsahem 107 000 ppm ředěním sterilní demineralizovanou vodou. Roztoky peroxidu vodíku byly připraveny ze 30% zásobního roztoku rovněž ředě ním sterilní demineralizovanou vodou. Hydrolyzát kaseinu Casitone byl získán od Difco. Chlorperoxidáza z Curvularia inaequalis byla izolována a čištěna způsobem podle publikace Van Schijndel a další, 1993. Glukosa oxidáza z Aspergillus niger byla získána od Sigma.In the previous examples, hydrogen peroxide, which is one of the substrates in the V-CPO reaction, was added as a stock solution. In this example, the effect of other hydrogen peroxide sources was observed. The oxidases were tested at 30 ° C in an Oxygen Consumption Monitor, Biological Oxygen Monitor YSI Model 5300 (Oxygen chamber model 5301) using a pH 5.5 citrate buffer (20 mM sodium citrate with NaOH + 10 mM NaCl). The buffer was air saturated at 30 ° C. Glucose at a final concentration of 15 g / liter was used as a substrate for the glucosoxyxyase. The bacterial strain Escherichia coli NCTC 900 was used. The bacteria were grown for 15-18 hours at 30 ° C in BHI broth. After this time, the strains were washed twice with citrate buffer pH 5.5 (20 mM sodium citrate with NaOH + 10 mM NaCl). The bacterial suspensions were centrifuged for 5 minutes in an Eppendorf centrifuge at 14,000 rpm, the supernatant was removed and the bacteria settled again. suspended in citrate buffer. This wash was repeated once for each bacterial suspension. The twice washed bacterial suspensions were then diluted with citrate buffer pH 5.5 to give a bacterial suspension of approximately 10 / ml. During washing, the cell material was placed on ice. Buffers and a 1% solution of BSA in pH 5.5 t citrate buffer were sterilized by filtration and then stored at 4 ° C. Hypochlorite solutions were prepared from a stock solution of 107,000 ppm by dilution with sterile demineralized water. Hydrogen peroxide solutions were prepared from a 30% stock solution also by dilution with sterile demineralized water. Casein hydrolyzate Casitone was obtained from Difco. Chloroperoxidase from Curvularia inaequalis was isolated and purified according to the method of Van Schijndel et al., 1993. Glucose oxidase from Aspergillus niger was obtained from Sigma.

Metoda:Method:

Za sterilních podmínek se připraví suspenze bykterií přibližně 10 /ml citrátového pufru o pH 5,5. Z této suspenze se přidají podíly po 1,3 ml do sterilní reakční nádoby, jejíž obsah se v průběhu pokusu kontinuálně míchá magnetickým míchadlem. Pak se přidá 0,5 ml roztoku s obsahem 0,5 mg/ml casitonu v citrátovém pufru o pH 5,5. Pak se přidá ještě 0,2 ml roztoku V-CPO k dosažení konečné koncentrace 6,5 ppm hypochloritu. Zařadí se rovněž slepé kontrolní zkoušky, do nichž se přidá 0,2 ml sterilního pufru místo 0,2 ml roztoku V-CPO. Reakční nádoby se inkubují při teplotě 30 °C. Pak se přidá 0,5 ml jednoho z následujících tří systémů, obsahujících peroxid vodíku:Under sterile conditions, a suspension of bycteries of approximately 10 / ml citrate buffer pH 5.5 is prepared. 1.3 ml aliquots of this suspension were added to a sterile reaction vessel whose contents were continuously stirred with a magnetic stirrer during the experiment. 0.5 ml of a solution containing 0.5 mg / ml casitone in citrate buffer pH 5.5 is then added. 0.2 ml of V-CPO solution is then added to reach a final concentration of 6.5 ppm hypochlorite. Blank controls are also included in which 0.2 ml of sterile buffer is added instead of 0.2 ml of V-CPO solution. The reaction vessels were incubated at 30 ° C. Then 0.5 ml of one of the following three hydrogen peroxide containing systems is added:

1. peroxid vodíku z 3 mM zásobního roztoku,1. hydrogen peroxide from a 3 mM stock solution;

2. peruhličitan sodný z 3 mM zásobního roztoku,2. Sodium percarbonate from a 3 mM stock solution;

3. směs 0,39 jednotek/ml glukosooxidázy ve směsi s mg/ml glukosy.3. a mixture of 0.39 units / ml glucose oxidase mixed with mg / ml glucose.

Vzorky se inkubují přesně 5 minut při teplotě 30 °C. Po této době inkubace se 1 ml reakční směsi odebere a přidá se k 9 ml chladného 1% rcztoku BSA a pak se vzorky okamžitě uloží do ledu k zastavení reakce hypochloritu s mikroorganismy. Přežívání mikroorganismů se sleduje na bázi jednotek pro tvorbu kolonií, CFU/ml, tato hodnota se stanoví tak, θThe samples are incubated for exactly 5 minutes at 30 ° C. After this incubation period, 1 ml of the reaction mixture is withdrawn and added to 9 ml of cold 1% BSA solution and then the samples are immediately placed on ice to stop the hypochlorite reaction with the microorganisms. Survival of micro-organisms is monitored on the basis of colony-forming units, CFU / ml, determined by θ

že se vzorky zředí v rozmezí 10 až 10 a pak se vzorky 100 mikrolitrů těchto roztoků v různém ředění nanesou na značené BHI-agarové plotny. Tyto plotny se pak inkubují až 18 hodin při teplotě 30 °C. V případě, že po této době inkubace není možno prokázat CFU, inkubují se plotny dal ších 24 hodin při teplotě 30 °C. Získané hodnoty se srovnávají s hodnotami MIC v případě, že bylo totéž množství hypochloritu přímo přidáno při použití mikročerpadla následujícím způsobem:2. The method according to claim 1, wherein the samples are diluted between 10 and 10, and then 100 microliters of these solutions are applied at different dilutions to labeled BHI-agar plates. These plates are then incubated for up to 18 hours at 30 ° C. If CFU is not detectable after this incubation period, the plates are incubated for an additional 24 hours at 30 ° C. The values obtained are compared with the MIC values when the same amount of hypochlorite was directly added using a micro pump as follows:

Za sterilních podmínek se připraví suspenze bakterií 8 s obsahem přibližně 10 /ml v citrátovém pufru o pH 5,5. Z této suspenze se přidají podíly po 1,3 ml do sterilní reakč ní nádoby, jejíž obsah se v průběhu pokusu kontinuálně míchá magnetickým míchadlem. Pak se přidá 0,5 ml roztoku casitonu s obsahem 0,5 mg/ml této látky v citrátovém pufru o pH 5,5. Pak se přidá ještě 0,2 ml sterilního citrátového pufru o pH 5,5 . Reakční nádoby se inkubují při teplotě 30 °C. Pak se v průběhu 5 minut přidá 0,5 ml roztoku hypochloritu s koncentrací 32,5 ppm rychlostí 0,1 ml/min při teplotě 30 °C. Po inkubační době 5 minut se odebere 1 ml reakční směsi a přidá se k 9 ml chladného 1% roztoku BSA a vzorky se oakmžitě uloží do ledu k zastavení reakce hypochloritu s mikroorganismy. Přežívání mikroorganismů se stanoví na bázi jednotek pro tvorbu kolonií, CFU/ml a stanoví se tak, že se vzorek zředí v rozmezí 10 až 10 a vzorky 100 mikrolitrů různého ředění se nanesou na značené BHI-agarové plotny. Tyto plotny se pak inkubují 15 až 18 hodin při teplotě 30 °C. V případě, že po této době není možno prokázat pří tomnost. CFU, inkubují se plotny ještě dalších 24 hodin při teplotě 30 °C. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce V.Under sterile conditions, a suspension of bacteria 8 containing approximately 10 / ml in citrate buffer pH 5.5 is prepared. From this suspension, 1.3 ml aliquots were added to a sterile reaction vessel whose contents were continuously stirred with a magnetic stirrer during the experiment. Then 0.5 ml of a casitone solution containing 0.5 mg / ml of this substance in citrate buffer pH 5.5 is added. 0.2 ml of sterile citrate buffer pH 5.5 is then added. The reaction vessels were incubated at 30 ° C. Then, 0.5 ml of a 32.5 ppm hypochlorite solution was added over 5 minutes at a rate of 0.1 ml / min at 30 ° C. After an incubation period of 5 minutes, 1 ml of the reaction mixture is removed and added to 9 ml of cold 1% BSA solution and immediately placed on ice to stop the hypochlorite reaction with the microorganisms. The survival of the microorganisms was determined on the basis of colony forming units, CFU / ml, and was determined by diluting the sample in the range of 10 to 10 and loading 100 microliters of various dilutions on labeled BHI-agar plates. These plates are then incubated at 30 ° C for 15-18 hours. In the event that the presence cannot be established after this period. CFU, the plates are incubated for an additional 24 hours at 30 ° C. The results obtained are summarized in Table V below.

Tabulka VTable V

Reakce V-CPO s různými zdroji peroxidu vodíku zdroj peroxidu vodíku koncentrace casitonu mg/ml log snížení při 6,5 ppm hypochloritu log snížení při 6,5 ppm hypochloritu z V-CPOV-CPO reaction with different hydrogen peroxide sources hydrogen peroxide source casitone concentration mg / ml log reduction at 6.5 ppm hypochlorite log reduction at 6.5 ppm hypochlorite from V-CPO

zásobní roz- stock distribution 0,0 0.0 8,2 8.2 8,0 8.0 tok h₂o₂ flow h ₂ o ₂ (úplné vyhubení) (complete eradication) (úplné vyhubení) (complete eradication) peruhličitan percarbonate 0,0 0.0 8,0 (úplné vyhubení) 8.0 (complete eradication) 8,2 (úplné vyhubení) 8.2 (complete eradication) glukoso- glucoso- 0,0 0.0 6,4 6.4 6,4 6.4 oxidáza oxidase (úplné vyhubení) (complete eradication) (úplné vyhubení) (complete eradication) zásobní roz- stock distribution tok H₂O₂ H ₂ O ₂ flow 0,1 0.1 1,0 1.0 8,0 (úplné vyhubení) 8.0 (complete extermination) peruhličitan percarbonate 0,1 0.1 0,8 0.8 8,2 (úplné vyhubení) 8.2 (complete eradication) glukoso- glucoso- 0,1 0.1 1,0 1.0 6,4 6.4 oxidáza oxidase (úplné vyhubení) (complete eradication)

Příklad 6Example 6

Stanovení kódové sekvence genu (cDNA) pro chlorpeoxidázu a genu z Curvularia inaequalis (Centraal Bureau voor Schimmelcuktures, the Netherlands, kmen č. 102.42) a použitelné systémy pro expresiDetermination of Chlorpeoxidase (Curvularia inaequalis) cDNA (cDNA) and Curvularia inaequalis gene (Centraal Bureau voor Schimmelcuktures, the Netherlands, strain No. 102.42) and applicable expression systems

Chlorperoxidáza byla izolována a čištěna z kultur C. indaequalis v kapalném živném prostředí podle publikace Van Schijndel a další, 1993 s tím rozdílem, že po DEAE-chromatografii byly prováděny ještě dva další stupně čištění při použití systému FPLC (Pharmacia LKB). Nejprve byl použit sloupec hydrofobní fenylsepharosy C1-4B k vazbě enzymu v přítomnosti 2M NaCl v 50 mM tris-HCl o pH 8,3, pak byla uskutečněna eluce sestupným gradientem 2M NaCl v 50 mM tris-HCl o pH 8,3. Konečné čištění bylo provedeno tak, že pro vazbu enzymu byl použit sloupec iontoměniče MonoQ HR 5,5 aniontoměničové pryskyřice (Pharmacia LKB), eluce byla prováděna při použití gradientu 0 až 0,5 M NaCl ve 20 mM piperazin-HCl o pH 5,4. Následující koncentrování enzymu bylo uskutečněno na rotačním odpařovači s následnou dialýzou proti pufru 50 mM tris-SO^ o pH 8. Čištěná chlorperoxidáza byla enzymaticky štěpena působením proteáz ze Staphylococcus V8 a působením trypsinu běžnými postupy nebo byla štěpena chemicky působením CNBr podle Gross E., 1967, Methods Enzymology, 11, 238 - 255. Výsledné peptidy byly děleny při použití SDS-PAGE podle publikace Laemmli, U.K., 1970, Natďre 227, 680 - 685 nebo na tricinovém gelu podle publikace Schagger a Von Jagow, 1987, načež byly přeneseny na membrány PVDF (Immobilon-P, Millipore) při použití pufru CAPS pro přenos s obsahem 10 mM kyseliny 3-/cyklohexylamino/-l-pnopansulfonové a 10 % methanolu o pH 11 podle publikace Matsudaina, 1987. Po elektrofonetické eluci byla membrána 5 minut pnoplachována deionizovanou vodou, pak byla 5 minut barvena 0,1% modří CoomassieChloroperoxidase was isolated and purified from C. indaequalis cultures in a liquid culture medium according to Van Schijndel et al., 1993, except that two additional purification steps were performed after DEAE chromatography using the FPLC system (Pharmacia LKB). First, a C1-4B hydrophobic phenylsepharose column was used to bind the enzyme in the presence of 2M NaCl in 50 mM tris-HCl pH 8.3, then eluting with a descending gradient of 2M NaCl in 50 mM tris-HCl pH 8.3. Final purification was performed by using an MonoQ HR 5.5 anion exchange resin column (Pharmacia LKB) to bind the enzyme, eluting with a gradient of 0 to 0.5 M NaCl in 20 mM piperazine-HCl pH 5.4 . Subsequent enzyme concentration was performed on a rotary evaporator followed by dialysis against 50 mM tris-SO4 buffer pH 8. Purified chloroperoxidase was enzymatically digested with proteases from Staphylococcus V8 and trypsin by conventional procedures or chemically digested with CNBr according to Gross E., 1967 Methods Enzymology, 11, 238-255. The resulting peptides were resolved using SDS-PAGE according to Laemmli, UK, 1970, Natre 227, 680-685, or on a Tricine gel according to Schagger and Von Jagow, 1987, and then transferred to PVDF membranes (Immobilon-P, Millipore) using CAPS transfer buffer containing 10 mM 3- (cyclohexylamino) -1-pnopanesulfonic acid and 10% methanol at pH 11 according to Matsudaina, 1987. After electrophoretic elution, the membrane was rinsed for 5 minutes deionized water, then stained with 0.1% Coomassie Blue for 5 minutes

R-250 v 50% methanolu, barvivo bylo odstraněno 50% methanolem s 10 % kyseliny octové 10 minut při teplotě místnosti, pak byla membrána usušena na vzduchu. Pásy pro peptidy byly podrobeny automatické Edmannově analýze sekvence na zařízení Porton LF 3000 (Beckman Instruments, lne., USA). Výsledky stanovení sekvence aminokyselin jsou uvedeny na obr. 1.R-250 in 50% methanol, dye was removed with 50% methanol with 10% acetic acid for 10 minutes at room temperature, then the membrane was air dried. Peptide bands were subjected to automatic Edmann sequence analysis on a Porton LF 3000 (Beckman Instruments, Inc., USA). The results of the amino acid sequence determination are shown in Figure 1.

V závislosti na sekvenci aminokyselin v peptidech byly zkonstruovány plně degenerované oligonukleotidy (tabulka VII). Tyto degenerované primery byly použity pro PCR-reakci při použití prvního řetězce cDNA jako matrice. První řetězec cDNA byl připraven následujícím způsobem.Depending on the amino acid sequence of the peptides, fully degenerate oligonucleotides were constructed (Table VII). These degenerate primers were used for the PCR reaction using the first strand cDNA as a template. The first strand cDNA was prepared as follows.

Pro izolaci RNA byly spory C. inaequalis naočkovány do fermentačního prostředí s obsahem 4 g extraktu z kvasnic a 2 ml roztoku mikroprvků na 1 litr podle Van Schijndel a další, 1993. Po několika dnech pěstování bylo mycelium odděleno filtrací a lyofilizováno. Lyofilizované mycelium C. inaequalis bylo umleto v kapalném dusíku. RNA byla extrahována pufrem pro extrakci RNA s obsahem 42 mM citrátu sodného o pH 7, 0,83 % N-laurysarkosinu, 50 mM beta-merkaptoethanolu, 1 % tritonu X-100 a 4 M guanidinisothiokyanátu, načež se směs inkubuje 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak se ke směsi přidá 0,1 objemu 2M octanu sodného o pH 4 a jeden objem směsi fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 25 : 24 : 1 a směs se uloží na 15 minut do ledu. Pak se směs 10 minut odstředí při teplotě 4 °C při 10 000 g, vodná fáze se oddělí, přidá se 1 objem absolutního alkoholu a směs se *1 hodinu inkubuje při teplotě -20 °C, načež se znovu krátce odstředí při 10 000 g. Usazenina se znovu uvede do suspenze v příslušném objemu pufru pro extrakci RNA a podrobí se frakcionaci v ultraodstředivce při použití gradientu chloridu česného (Sambrook a další, 1989). Usazenina se pečlivě promyje a skladuje se v 75% ethanolu při teplotě -70 °C. Pro izolaci mRNA se RNA vysráží a znovu uvede do suspenze ve vodě, prosté ribonukleázy, načež se mRNA extrahuje při použití balíčku pro izolaci mRNA, polyAtract (Promega Corporation, USA). Syntéza prvního řetězce cDNA se provádí s použitím mRNA, izolované z C. inaequalis při použití balíčku pro syntézu prvního řetězce cDNA (Pharmacia Biotech). V závislosti na sekvenci aminokyselin v peptidech chlorperoxidázy byly zkonstruovány čtyři degenerované oligonukleotidy s 20 nukleotidy (tabulka VII) a byly použity jako primery při PCR spolu s prvním řetězcem cDNA z C. inaequalis jako matricí. Reakce PCR byla provedena při použití zařízení pro tvorbu tepelných cyklů (Eppendorf mastercycler 5330) a Taq-polymerázy (Promega Corporation). Pro optimální amplifikaci kodové cDNA pro chlorperoxidázu při použití degenerovaných primeru byla PCR-reakce prováděna při teplotě 46 °C (ve vazném stupni) po 30 cyklů. Dva výsledné specifické fragmenty byly navázány na vektor pUC18, klonovány a byly analyzovány sekvence v obou řetězcích. V závislosti na sekvenci DNA pak byly zkonstruovány následující dva specifické primery:For RNA isolation, C. inaequalis spores were inoculated into a fermentation broth containing 4 g yeast extract and 2 ml microelement solution per liter according to Van Schijndel et al., 1993. After several days of cultivation, the mycelium was separated by filtration and lyophilized. The lyophilized C. inaequalis mycelium was ground in liquid nitrogen. RNA was extracted with RNA extraction buffer containing 42 mM sodium citrate, pH 7, 0.83% N-laurysarcosine, 50 mM beta-mercaptoethanol, 1% tritone X-100 and 4 M guanidinium isothiocyanate, followed by incubation at room temperature for 1 hour. rooms. Then, 0.1 volume of 2M sodium acetate pH 4 and one volume of 25: 24: 1 phenol / chloroform / isoamyl alcohol were added to the mixture and stored on ice for 15 minutes. The mixture is centrifuged for 10 minutes at 4 ° C at 10,000 g, the aqueous phase is separated, 1 volume of absolute alcohol is added and the mixture is incubated at -20 ° C for 1 hour, then centrifuged briefly again at 10,000 g. The pellet is resuspended in an appropriate volume of RNA extraction buffer and fractionated in an ultra centrifuge using a cesium chloride gradient (Sambrook et al., 1989). The pellet was washed thoroughly and stored in 75% ethanol at -70 ° C. For mRNA isolation, RNA is precipitated and resuspended in ribonuclease-free water, whereupon the mRNA is extracted using a mRNA isolation package, polyAtract (Promega Corporation, USA). First strand cDNA synthesis is performed using mRNA isolated from C. inaequalis using a first strand cDNA synthesis kit (Pharmacia Biotech). Depending on the amino acid sequence of the chloroperoxidase peptides, four degenerate 20 nucleotide oligonucleotides were constructed (Table VII) and were used as primers in PCR together with the first C. inaequalis cDNA strand as a matrix. The PCR reaction was performed using a thermal cycling apparatus (Eppendorf mastercycler 5330) and Taq polymerase (Promega Corporation). For optimal amplification of the chloroperoxidase cDNA codon using degenerate primers, the PCR reaction was performed at 46 ° C (in the binding step) for 30 cycles. The two resulting specific fragments were ligated to the pUC18 vector, cloned, and the sequences in both strands analyzed. Depending on the DNA sequence, the following two specific primers were constructed:

5'- CATAGCGATAGCGACGCGGA-3' a5'- CATAGCGATAGCGACGCGGA-3 'a

5'- CTAACCCCGGCGCCAACATC-3'.5'- CTAACCCCGGCGCCAACATC-3 '.

Tyto dva primery byly použity při PCR-reakcích spolu s prvním řetězcem cDNA jako matricí. Tímto způsobem byl získán fragment DNA, specifický pro gen spojením dvou známých řetězců DNA.Tento· fragment byl klonován ve vektoru pUC18 a byla analyzována jeho sekvence. K získání 5'-oblasti kódové mRNA pro chlorperoxidázu byl použit balíček 5'-Amplifinder RACE (Clonetech Corporation). Gen pro chlorperoxidázu z genomu C. inaequalis byl izolován následujícím způsobem:These two primers were used in the PCR reactions together with the first strand cDNA as a template. In this way, a gene-specific DNA fragment was obtained by joining two known DNA strands. This fragment was cloned in the pUC18 vector and its sequence analyzed. A 5'-Amplifinder RACE package (Clonetech Corporation) was used to obtain the 5'-region of the chloroperoxidase encoding mRNA. The chloroperoxidase gene from the C. inaequalis genome was isolated as follows:

DNA genomu C. inaequalis se izoluje z lyofilizovaného mycelia, umletého v kapalném dusíku a extrahovaného příslušným množstvím extrakčního pufru, obsahujícího 200 mM tris-HCl o pH 8,5, 25 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1 % SDS a 0,2 mg/ml proteinázy K. Směs se inkubuje přes noc při teplotě místnosti, pak se přidá 0,7 objemů fenolu a 0,3 objemu chloroformu a směs se energicky promíchá. Pak se obsah zkumavek odstředí při 10 000 g a vodná vrstva se přenese do čisté zkumavky. DNA genomu se pak vysráží přidáním 2 objemů absolutního ethanolu. Po odstředění 5 minut při 5 000 g se usazenina znovu uvede do suspenze ve 2 ml 10 mM tris-HCl o pH 8,0 a 1 mM EDTA a přidá se ribonukleáza (Boehringer Mannheim) podle návodu výrobce. Roztok s obsahem DNA genomu se extrahuje směsí fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 25 : 24 : 1 a po vysrážení ethanolem se materiál rozpustí v příslušném objemu 10 mM tris-HC1 o pH 8 s 1 mM EDTA. Pro provádění Southernovy analýzy se DNA rozštěpí několika kombinacemi restrikčních enzymů a po elektroforéze na agarosovém gelu se materiál přenese na nitrocelulosovou membránu (Sambrook a další, 1989).C. inaequalis genome DNA is isolated from lyophilized mycelium, ground in liquid nitrogen and extracted with an appropriate amount of extraction buffer containing 200 mM tris-HCl pH 8.5, 25 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1% SDS and 0.2 mg. / ml proteinase K. Incubate overnight at room temperature, then add 0.7 volumes of phenol and 0.3 volumes of chloroform and mix vigorously. Then centrifuge the contents of the tubes at 10,000 g and transfer the aqueous layer to a clean tube. The genome DNA is then precipitated by adding 2 volumes of absolute ethanol. After centrifugation for 5 minutes at 5,000 g, the pellet is resuspended in 2 ml of 10 mM tris-HCl pH 8.0 and 1 mM EDTA and ribonuclease (Boehringer Mannheim) is added according to the manufacturer's instructions. The genomic DNA solution was extracted with 25: 24: 1 phenol / chloroform / isoamyl alcohol and, after ethanol precipitation, the material was dissolved in an appropriate volume of 10 mM tris-HCl pH 8 with 1 mM EDTA. To perform Southern analysis, DNA was digested with several combinations of restriction enzymes and after agarose gel electrophoresis, the material was transferred to a nitrocellulose membrane (Sambrook et al., 1989).

Hybridizace se provádí při použití radioaktivně značeného specifického fragmentu genu (amplifikovaného pomocí dvou svrchu popsaných specifických primerů), získaného při použití alfa- P-značeného dATP (Sambrook a další, 1989).Hybridization is performed using a radiolabeled specific fragment of the gene (amplified using the two specific primers described above) obtained using alpha-β-labeled dATP (Sambrook et al., 1989).

Na bázi získaných výsledků byla připravena minibanka při použití DNA genomu, rozštěpené enzymem Pst I, získaný materiál byl uložen do vektoru pUC18. Banka byla sériové vyšetřena toutéž sondou, jaká byla popsána pro Southern blot. Byl izolován positivní klon, u nějž byla také z části analyzována sekvence obou řetězců, tak aby bylo možno potvrdit výsledky analýzy cDNA. Gen pro chlorperoxídázu C. inaequalis a příslušný produkt tohoto genu jsou uvedeny dále na obr. 2.Based on the obtained results, a minibank was prepared using the Pst I digested DNA genome, and the material was inserted into the pUC18 vector. The flask was screened with the same probe as described for the Southern blot. A positive clone was isolated, which also partially analyzed the sequence of both strands to confirm the results of the cDNA analysis. The C. inaequalis chloroperoxidase gene and its respective gene product are shown in Figure 2 below.

Systém pro produkci chlorperoxidázy v Saccharomyces cerevisiae byl připraven následujícím způsobem:A system for producing chloroperoxidase in Saccharomyces cerevisiae was prepared as follows:

Dobře známý indukovatelný promotor kvasinek GAL1 byl získán jako fragment po štěpení enzymy EcoRI a BamHI z divokého typu genu GAL1 ze S. cerevisiae (Molecular and Cellular Biology, 10, 4757 - 4769, 1990) a byl klonován v místě působení týchž enzymů v plasmidech YCplac33 a YEplac95 (Gietz a Sugino, 1988, Gene, 74, 527 - 534). Získané plasmidy byly označeny TNT1 a TNT2. Místo působení restrikčního enzymu BamHI bylo vytvořeno na 5'-zakončení genu pro chlorperoxidázu C. inaec.ualis při použití PCR, při němž byl jako matrice použit fragment genu pro chlorperoxidázu C. inaequalis z oblasti 5^- po štěpení enzymy Pstl a EcoRI, tento fragment byl subklonován v plasmidu pUC18 při použití primeru M13/pUC (22-mer s reverzní sekvencí) a následujícího primeruThe well-known inducible GAL1 yeast promoter was obtained as a fragment after digestion with EcoRI and BamHI from the wild-type GAL1 gene of S. cerevisiae (Molecular and Cellular Biology, 10, 4757-4769, 1990) and was cloned at the same enzymatic site in plasmids YCplac33 and YEplac95 (Gietz and Sugino, 1988, Gene, 74, 527-534). The plasmids obtained were designated TNT1 and TNT2. A BamHI restriction enzyme site was created at the 5'-end of the C. inaec.ualis chloroperoxidase gene by PCR using a fragment of the C. inaequalis chlorperoxidase gene from region 5 ^- digested with PstI and EcoRI, as a template was subcloned in plasmid pUC18 using primer M13 / pUC (22-mer with reverse sequence) and the following primer

5'-GAG AGA GGA TCC ACT CAC TAC TTA CAA TCA CAC 3'5 '-GAG AGA GGA TCC ACT CAC TAC CAA TCA CAC 3'

Amplifikovaný fragment byl rozštěpen enzymy BamHI a EcoRI. Fragment genu z C. inaequalis pro chlorperoxidázu po štěpení enzymy EcoRI a PvuII, obsahující 3 -část tohoto genu, byl subklonován v rozštěpeném plasmidu pUC18 po jeho rozštěpení enzymy EcoRI a Smál. Z tohoto klonu byl izolován a čištěn po rozštelení enzymy EcoRI a Xbal fragment, obsahující 3-část genu ρφο qblorperoxidázu z C. inaequalis.The amplified fragment was digested with BamHI and EcoRI. A fragment of the C. inaequalis gene for chloroperoxidase after digestion with EcoRI and PvuII containing the 3-part of this gene was subcloned in the digested plasmid pUC18 after digestion with EcoRI and SmaI. This clone was isolated and purified after digestion with EcoRI and an XbaI fragment containing the 3-part of the ρφο qbloroperoxidase gene from C. inaequalis.

Pak byla provedena vazba tří složek, a to TNT1 nebo TNT2 vždy po rozštěpení BamHI a Xbal, 5 -fragmentu po štěpení BamHI a EcoRI a 3 -fragmentu po štěpení EcoRI a Xbal.Three components were then bound, namely TNT1 or TNT2, respectively, after digestion with BamHI and XbaI, the 5-fragment after digestion with BamHI and EcoRI, and the 3-fragment after digestion with EcoRI and XbaI.

Po navázání a klonování získaných plasmidů byla ověřována totožnost těchto látek. Vzniklé pasmidy byly označeny TNT3 (odvozený od TNT1) a TNT4 (odvozený od TNT2).After binding and cloning of the plasmids obtained, their identity was verified. The resulting pasmids were designated TNT3 (derived from TNT1) and TNT4 (derived from TNT2).

Kmen kvasinek BJ1991 se transformuje plasmidem TNT3 nebo TNT4 známým způsobem a podrobí se selekci na transformanty ura+. Tyto transformanty se podrobí replikaci na YP-plotnách s obsahem 2 % glukosy nebo 2 % galaktosy. Jakmile kvasinky vyrostou, odebere se část buněk z ploten a uvede se do suspenze ve 200 mikrolitrech 20 mM tris-HCl o pH 8,1. Po inkubaci 5 minut se odebere 10 mikrolitrů materiálu a nanese jako skvrna na nitrocelulosový filtr. Nitrocelulosové filtry se inkubují v pufru se 100 mM octanu sodného o pH 5,5 s obsahem 1 mM orthodianisidinu, 100 mM KBr a 2 mM peroxidu vodíku. Barevná skvrna se objeví na všech místech, které byly odebrány z ploten s galaktosou, kdežto u kvasinek z ploten s glukosou se nevytvoří žádné zbarvení. To prokazuje, že v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae byl zkonstruován produkční systém pro gen pro chlorperoxidázu, indukovatelný galaktosou. Při podobné zkoušce při použití pufru se 100 mM fosfátem draselným o pH 6,5, 100 mM KBr, mM peroxidu vodíku a 40 mikroM fenolové červeni BDH je možno pozorovat tvorbu modravěpurpurového zbarvení při použití kvasinek z prostředí s galaktosou, u kvasinek z prostředí s glukosou nedojde k žádnému zbarvení. Aby bylo dále možno potvrdit tvorbu systému pro expresi heterologního genu pro chlorperoxidázu C. inaequalis s týmiž funkčními vlastnostmi, byl rekombinantní enzym čištěn z kvasinkových kmenů, transformovaných plasmidem TNT3 nebo TNT4 po indukci galaktosou. Po pěstování v prostředí s obsahem galaktosy byly kvasinky odděleny a znovu uvedeny do suspenze ve 20 mM tris-HCl o pH 8,^J1. 'Pak byly přidány sterilní skleněné kuličky a suspenze byla energicky protřepána. Po odstředění 15 minut při 10 000 g byl supernatant oddělen a nanesen na sloupec DEAE a rekombinantní enzym byl čištěn v podstatě stejným způsobem, jaký byl popsán svrchu pro divoký enzym z C. inaequalis. Po čištění byla získána rekombinantní chlorperoxidáza se specifickou účinností 22 jednotek/mg bílkoviny při stanovení ve 10C mM pufru s octanem sodným o pH 5,0 s obsahem 1 mM peroxidu vodíku, 5 mM chloridu draselného a 50 mikroM MCD, podle publikace Van Schijndel a další, 1993. Toto zjištění je ve velmi dobrém souladu se specifickou účinností přibližně 20 jednotek/mg bílkoviny, tak jak byla svrchu prokázána pro čištěnou chlorperoxidázu z C. inaequalis. Účinnost v závislosti na pH je pro divoký typ chlorperoxidázy a pro rekombinantní enzym z kvasinek znázorněna na obr. 3. Tato účinnost je dalším důkazem, že rekombinantní enzym, získaný z kvasinek má stejné funkční vlastnosti jako enzym divokého typu.The yeast strain BJ1991 is transformed with plasmid TNT3 or TNT4 in a known manner and selected for ura + transformants. These transformants were replicated on YP-plates containing 2% glucose or 2% galactose. Once the yeast has grown, part of the cells are removed from the plates and suspended in 200 µl of 20 mM Tris-HCl, pH 8.1. After incubation for 5 minutes, 10 microliters of material was removed and stained on a nitrocellulose filter. The nitrocellulose filters are incubated in a buffer of 100 mM sodium acetate pH 5.5 containing 1 mM orthodianisidine, 100 mM KBr and 2 mM hydrogen peroxide. A color spot appears at all sites taken from the galactose plates, whereas no color develops from the yeast from the glucose plates. This demonstrates that a production system for the galactose-inducible chloroperoxidase gene was constructed in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In a similar test using 100 mM potassium phosphate buffer pH 6.5, 100 mM KBr, mM hydrogen peroxide and 40 microM BDH phenol red, blue-purple color formation was observed using yeast from galactose media, yeast from glucose media. there is no discoloration. In order to further confirm the production of a system for the expression of a heterologous C. inaequalis chloroperoxidase gene with the same functional properties, the recombinant enzyme was purified from yeast strains transformed with plasmid TNT3 or TNT4 after galactose induction. After cultivation in a medium containing galactose, yeast collected and resuspended in 20 mM Tris-HCl, pH 8, the first ^J 'were then added with sterile glass beads, and the suspension was shaken vigorously. After centrifugation for 15 minutes at 10,000 g, the supernatant was collected and loaded onto a DEAE column, and the recombinant enzyme was purified in essentially the same manner as described above for the wild-type C. inaequalis enzyme. After purification, recombinant chloroperoxidase with a specific efficiency of 22 units / mg protein was obtained in a 10C mM sodium acetate buffer pH 5.0 containing 1 mM hydrogen peroxide, 5 mM potassium chloride and 50 microM MCD, according to Van Schijndel et al. , 1993. This finding is in very good agreement with the specific efficacy of approximately 20 units / mg protein as demonstrated above for purified C. inaequalis chloroperoxidase. The pH-dependent activity is shown in Figure 3 for the wild-type chloroperoxidase and for the recombinant yeast enzyme. This efficiency is further evidence that the recombinant yeast-derived enzyme has the same functional properties as the wild-type enzyme.

Příklad 7Example 7

Sledování halogenperoxidáz v dalších mikroorganismechMonitoring of haloperoxidases in other microorganisms

Dalšími sledovanými mikroorganismy byly organismy Curvularia inaequalis CBS 102.42, Drechslera biseptat CBS 371.72, Drechslera fugax CBS 509.77, Drechslera nicotiae CBS 655.74, Drechslera subpapendorfii 656.74, Embelisia hyacinthi 416.71, Embelisia didymospora CBS 766.79,Other microorganisms studied were Curvularia inaequalis CBS 102.42, Drechslera biseptat CBS 371.72, Drechslera fugax CBS 509.77, Drechslera nicotiae CBS 655.74, Drechslera subpapendorfii 656.74, Embelisia hyacinthi 416.71.79, Embelis 416.71, Embelis, Csp.

Ulocladium chartarum 200.67 a Ulocladium botrytis 452.72. Houby byly pěstovány na agarových plotnách. Po ukončení růstu byly extracelulární bílkoviny přeneseny ve dvojím opakování na nitrocelulosové filtry, předem zvlhčené 50 mM tris-HCl-pufrem o pH 8,3. Po 15 minutách inkubace na agarových plotnách byly filtry podrobeny zkouškám na účinnost halogenperoxidázy tak, že filtr byl ponořen do 100 mM octanu sodného o pH 5,5 nebo do fosforečnanu draselného o pH 6,5 a 7,5 a 1 mM orthodianisidinu a 2 mM peroxidu vodíku v přítomnosti nebo nepřítomnosti 0,1 M bromidu draselného. Tímto způsobem je možno prokázat tvorbu bromperoxidázy a/nebo chlorperoxidázy. Ke zjištění, zda produkovaná halogenperoxidáza je vanadiumhalogenperoxidáza, byl pokus opakován v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10 a 100 mikroM vanadičnanu sodného. V případě, že jde o vanadiumhalogenperoxidázu, bylo možno pozorovat po přidání vanadičnanu zesílení signálu. Aby bylo možno zjistit, zda identifikovaná chlorperoxidáza je skutečně obdobná vanadiumhalogenperoxidáze z C. inaequalis, byla malá množství chlorperoxidáz čištěna podle publikace Van Schijndel a další, 1993, šlo o enzymy z Ulocladium chartarum, Embelisia didymospora a Drechslera subpapendorfii. Optimální pH pro tyto enzymy bylo v rozmezí 4,5 až 5,5. Chlorační účinnost těchto enzymů stoupla po přidání vanadičnanu, což jasně prokazuje, že jde o vanadiumhalogenperoxidázy. Aby bylo možno dále prokázat podobnost enzymů s enzymem z C. inaequalis, byla jedna z identifikovaných halogenperoxidáz dále analyzována. Šlo o enzym z houby Drecgslera biseptata CBS 371.72. Vlastnosti tohoto enzymu jsou podobné vlastnostem chlorperoxidázy z Curvularia inaequalis, která má vysokou tepelnou stálost a vysokou afinitu pro své substráty. Bylo rovněž zaznamenáno EPR-spektrum čištěného enzymu. Jako v případě ostatních vanadiumhalogenperoxidáz podle publikace de Boer a další, 1988 a Wever a další, 1988, se oxidovaný enzym při provádění tohoto spektra neprojevuje, avšak po redukci dithionitem sodným se objeví typické spektrum pro vanadylovou skupinu (údaje nejsou znázorněny). Isotropní EPR-parametry, g_Q - 1,969 a A_Q - 9,0 mT jsou téměř totožné s parametry pro enzym z C. inaequalis podle Wever a další, 1985. Mimoto byl čištěný enzym rozštěpen na peptidy působením proteáz a bromkyanidu⁾. Peptidové mapy jsou pro oba enzymy totožné, takže tyto enzymy mají pravděpodobně velkou homologii svých sekvencí. Byla proto analyzována sekvence dvou peptidů, jednoho peptidu z každého enzymu po štěpení proteázou a po čištění. Získané sekvence prokazovaly velkou homologii a je tedy možno uzavřít, že oba enzymy jsou si velmi podobné.Ulocladium chartarum 200.67 and Ulocladium botrytis 452.72. Mushrooms were grown on agar plates. After growth, extracellular proteins were transferred in duplicate to nitrocellulose filters pre-wetted with 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.3. After 15 minutes incubation on agar plates, the filters were tested for haloperoxidase activity by immersing the filter in 100 mM sodium acetate pH 5.5 or potassium phosphate pH 6.5 and 7.5 and 1 mM orthodianisidine and 2 mM. hydrogen peroxide in the presence or absence of 0.1 M potassium bromide. In this way, the formation of bromoperoxidase and / or chloroperoxidase can be detected. To determine if the haloperoxidase produced was vanadium haloperoxidase, the experiment was repeated in the presence or absence of 10 and 100 microM sodium vanadate. In the case of vanadium haloperoxidase, signal amplification was observed after the addition of vanadate. To determine whether the identified chloroperoxidase was truly similar to vanadium haloperoxidase from C. inaequalis, small amounts of chloroperoxidase were purified according to Van Schijndel et al., 1993, enzymes from Ulocladium chartarum, Embelisia didymospora and Drechslera subpapendorfii. The optimum pH for these enzymes was in the range of 4.5 to 5.5. The chlorination activity of these enzymes increased after the addition of vanadate, clearly demonstrating that they are vanadium haloperoxidases. In order to further demonstrate the similarity of the enzymes to the C. inaequalis enzyme, one of the identified halogen peroxidases was further analyzed. It was an enzyme from the fungus Drecgslera biseptata CBS 371.72. The properties of this enzyme are similar to those of Curvularia inaequalis chloroperoxidase, which has high thermal stability and high affinity for its substrates. The EPR spectrum of the purified enzyme was also recorded. As with other vanadium haloperoxidases according to de Boer et al., 1988 and Wever et al., 1988, the oxidized enzyme does not show up in this spectrum, but after reduction with sodium dithionite, a typical spectrum for the vanadyl group appears (data not shown). The isotropic EPR parameters, g _Q - 1.969 and _{Q Q} - 9.0 mT, are almost identical to those for the enzyme from C. inaequalis (Wever et al., 1985 ⁾ . The peptide maps are identical for both enzymes, so these enzymes are likely to have great homology to their sequences. Therefore, the sequence of two peptides, one peptide from each enzyme after protease digestion and purification, was analyzed. The obtained sequences showed great homology and it can be concluded that both enzymes are very similar.

Peptid z C. inaequalis má následující sekvenci aminokyselin:The peptide from C. inaequalis has the following amino acid sequence:

(Asp)-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-trh-ala-pro-ile-glu-asp-gln-pro-gly-ile-val-arg-thrPodobný peptid z D. biseptata má následující sekvenc aminokyselin:The (Asp) -leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-market-ala-pro-ile-glu-asp-gln-pro-gly-ile-val-arg-thr Similar peptide from D. biseptata has the following amino acid sequence:

Asp-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-thr-ala-pro-ile-glu-glu-gln-pro-gly-ile-val-arg-thrVanadiumhalogenperoxidázy je tedy možno identifikovat při použití techniky, při níž se prokazuje vzestup účin nosti po přidání vanadičnanu, nebo je také možno enzym částečně čistit a až pak sledovat vzestup účinnosti po přidání vanadičnanu.Thus, asp-leu-arg-gln-pro-tyr-asp-pro-thr-ala-pro-ile-glu-glu-glu-gln-pro-gly-ile-val-arg-thrVanadium haloperoxidase can be identified using the technique of which shows an increase in potency after the addition of vanadate, or it is also possible to partially purify the enzyme before monitoring the increase in potency after the addition of vanadate.

Příklad 8Example 8

Zkoušky s chlorperoxidázami dalšícm mikroorganismů při použití protilátekTests with chloroperoxidases of other microorganisms using antibodies

Použité kmeny byly Curvularia inaequalis CBS 102.42, Drechslera biseptata CBS 371.72, Drechslera subpapendorfii CBS 656.74, Embellissia didymospora CBS 766.79 a Ulocladium chartarum CBS 200 .»67.The strains used were Curvularia inaequalis CBS 102.42, Drechslera biseptata CBS 371.72, Drechslera subpapendorfii CBS 656.74, Embellissia didymospora CBS 766.79 and Ulocladium chartarum CBS 200.

Mikroorganismy byly pěstovány ve dvou fázích. Nejprve bylo 50 ml sterilního prostředí podle publikace Van Schijndel a další, 1993 naočkováno sporami mikroorganismu. Kultura byla pěstována tři dny za stálého protřepávání při teplotě 23 °C a pak byla přenesena do Erlenmeyerovy baňky s objemem 3 litry a obsahem 1 litr fermentačního prostředí, které obsahovalo 5 g hydrolyzátu kaseinu (Gibco BRL), 3 g extraktu z kvasnic a 1 g fruktosy na 1 litr deionizované vody. Prostředí bylo za stálého protřepávání udržováno na teplotě 23 °C celkem 14 až 17 dnů, pak bylo zfiltrováno a chlorperoxidážy byly čištěny způsobem podle publikace Van Schijndel a další, 1994. U králíků byla vyvolána tvorba polyklonálních protilátek proti tímto způsobem čištěné chlorperoxidáze z Curvularia inaequalis. Byly použity králičí samice ve stáří 2 měsíce, v první injekci byl podán úplný Freundův pomocný prostředek a při opakovaném podání byl podáván neúplný Freundův pomocný prostředek. Po posled ní injekci byla králíkům po 6 dnech odebrána krev, sérum bylo 30 minut zahříváno na 56 °C k inaktivaci komplementu a pak bylo sérum odstředěno. Supernatant Pyl odebrán a zpracován na zřeďovací řadu. Zřeďovací řada byla rovněž připravena pro bromperoxidázu z Ascophylum nodosum, čištěnou podle Wever a další, 1985. Výchozím materiálem bylo 50 mikrolitrů každé bílkoviny s obsahem přibližně 0,1 mg této bílkoviny na ml roztoku a každý vzorek byl postupně vždy dvojnásobně ředěn. Tato ředění pak byla nanesena na nitrocelulosový filtr pomocí přístroje pro dot-blot (bio-Rad) a po promytí filtrů 2% BSA byly filtry postupně inkubovány s králičím antisérem proti chlorperoxidáze v ředění 1 : 800, s biotinylovanou kozí protilátkou proti králičím tkáním v ředění 1 : 3000, s alkalickou fosfatázou, konjugovanou se streptavidinem v ředění 1 : 2000 a s činidlem pro vznik barevné reakce, tvořený 5-brom-4-chlor)Microorganisms were grown in two phases. First, 50 ml of sterile medium according to Van Schijndel et al., 1993 were inoculated with spores of the microorganism. The culture was grown for three days with constant shaking at 23 ° C and then transferred to a 3 liter Erlenmeyer flask containing 1 liter fermentation broth containing 5 g casein hydrolyzate (Gibco BRL), 3 g yeast extract and 1 g fructose per liter of deionized water. The medium was maintained at 23 [deg.] C. for 14 to 17 days with constant shaking, then filtered and the chloroperoxidases were purified according to Van Schijndel et al., 1994. Rabbits were induced to produce polyclonal antibodies against this purified Curvularia inaequalis chloroperoxidase. Two month old female rabbits were used, the first injection received complete Freund's adjuvant and repeated administration with incomplete Freund's adjuvant. After the last injection, the rabbits were bled 6 days later, the serum was heated at 56 ° C for 30 minutes to inactivate complement, and then the serum was centrifuged. The pollen supernatant was collected and processed into a dilution series. The dilution series was also prepared for bromoperoxidase from Ascophylum nodosum, purified according to Wever et al., 1985. The starting material was 50 microliters of each protein containing approximately 0.1 mg of this protein per ml of solution, and each sample was diluted twice in succession. These dilutions were then applied to a nitrocellulose filter using a dot-blot (bio-Rad), and after washing with 2% BSA filters, the filters were incubated sequentially with a 1: 800 dilution of anti-chloroperoxidase rabbit antisera with a biotinylated goat anti-rabbit tissue antibody at dilution. 1: 3000, with alkaline phosphatase conjugated to streptavidin at a dilution of 1: 2000 and a color reaction reagent consisting of 5-bromo-4-chloro)

-3-indolylfosfátem a chloridem tetrazoliové 4-nitromodři (Boehringer Mannheim). Všechny stupně byly provedeny standardním způsobem. Výsledky těchto zkoušek jsou shrnuty v následující tabulce VI.3-indolylphosphate and tetrazolium chloride 4-nitromodor (Boehringer Mannheim). All steps were performed in a standard manner. The results of these tests are summarized in Table VI below.

Tabulka VITable VI

Halogenperoxidáza z zkřížená reaktivita s polyklonálními protilátkami proti proti chlorperoxidáze z C. inaequalisCross-reactivity haloperoxidase with polyclonal antibodies against C. inaequalis chloroperoxidase

c. C. inaequalis inaequalis ano Yes D. D. biseptata biseptata ano Yes D . D. subpapendorfii subpapendorfii ano Yes E. E. didymospora didymospora ano Yes U. AT. chartarum chartarum ano Yes

bromperoxidáza zbromoperoxidase from

A. nodosum neA. nodosum no

Z výsledků, uvedených v tabulce VI je možno uzavřít, že imunologické zkoušky s protilátkami proti chlorperoxidáze z C. inaequalis jsou vhodné pro identifikaci dalších halogenperoxidáz s obsahem vanadu. Tyto halogenperoxidázy mohou být v surové formě nebo mohou být částečně nebo úplně čištěny. Čištění je možno uskutečnit jakýmikoliv známými postupy, jako jsou filtrace na gelu, chromatografie na iontoměniči, chromatograf ie s hydrpfob.ní interakcí, srážení, filtrace, ultrafiltrace, afinitni chromatografie, elektroforéza na gelu a podobné postupy.From the results shown in Table VI, it can be concluded that immunoassays with antibodies against C. inaequalis chloroperoxidase are useful for identifying other vanadium-containing haloperoxidases. These haloperoxidases may be in crude form or may be partially or completely purified. Purification can be accomplished by any of the known methods, such as gel filtration, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, precipitation, filtration, ultrafiltration, affinity chromatography, gel electrophoresis, and the like.

Příklad 9Example 9

Vyhledávání chlorperoxidáz z dalších mikroorganismůSearch for chloroperoxidases from other microorganisms

V tomto příkladu se popisuje možnost použití radioaktivně značené sondy, odvozené z genu pro chlorperoxidázu z Curvularia inaequalis pro detekci homologních genů u dalších mikroorganismů. Postup byl prováděn následujícím způsobem: Chromosomální DNA z mikroorganismů C. inaequalis CBS 102.42, Embellissia didymospora CBS 766.79 a Drechslera biseptata CBS 371.72 byly čištěny tak, jak bylo popsáno v příkladu 6 pro chromosomální DNA z C. inaequalis. Pro Southernovu analýzu DNA genomu byla DNA rozštěpena několika kombinacemi restrikčních enzymů a po elektroforéze na agarosovém gelu byly frakce naneseny jako skvrny na nitroselulosovou membránu (Sambrook a další, 1989).Hybridizace byla uskutečněna při použití radioaktivně značeného specifického fragmentu genu při použití alfa- P-značeného dATP (Sambrook a další, 1989). Použitý specifický fragment genu byl před radioaktivním značením amplifikován pomocí PCR při použicí prvního řetězce cDNA jako matrice stejně jako v příkladu 6 při použití následujících primerů:This example describes the possibility of using a radiolabeled probe derived from the chloroperoxidase gene from Curvularia inaequalis to detect homologous genes in other microorganisms. The procedure was performed as follows: Chromosomal DNA from C. inaequalis CBS 102.42, Embellissia didymospora CBS 766.79 and Drechslera biseptata CBS 371.72 were purified as described in Example 6 for C. inaequalis chromosomal DNA. For Southern DNA genome analysis, the DNA was digested with several combinations of restriction enzymes and, after agarose gel electrophoresis, the fractions were stained on a nitrosellulose membrane (Sambrook et al., 1989). labeled dATP (Sambrook et al., 1989). The specific gene fragment used was PCR amplified prior to radiolabeling using the first strand cDNA as template as in Example 6 using the following primers:

5'-CACGATGGGGTCCGTTACAC a5'-CACGATGGGGTCCGTTACAC a

5'-GTACCGCTATCGCTGCGCCTG5'-GTACCGCTATCGCTGCGCCTG

Hybridizace byla prováděna následujícím způsobem:Hybridization was performed as follows:

Při předběžné hybridizaci a hybridizaci byla použita směs 6 x SSPE, 5 x Denhards, 0,5% SDS s 10 mg DNA ze spermatu lososa jako prostředí? Předběžná hybridizace byla prováděna 1 hodinu při teplotě 55 °C, pak byla radioaktivní sonda 1 minutu vařena a pak byla přímo použita. Hybridizace byla prováděna přes noc. Autoradiograf, získaný při použití DNA z Curvularia inaequalis a Drechslera biseptata je znázorněn na obr. 4, kde jednotlivé útvary mají tento význam: dráha 1: lambda DNA, dráha 2: nerozštěpená DNA genomu C. inaequalis, dráha 3: tentýž materiál, rozštěpený EcoRI, dráha 4: totéž po rozštěpení BamHI, dráha 5: totéž po rozštěpení EcoRI a BamHI, dráha 6: totéž po rozštěpení Xbal, dráha 7: totéž po rozštěpení Pstl, dráha 8: totéž po rozštěpení Xbal a Pstl, dráhy 9 až 14: štěpení materiálu z D. biseptata týmiž enzymy ve stejném pořadí. Jak je z výkresu zřejmo, byl positivní signál získán z chromosomové DNA z Drechslera biseptata, což prokazuje vysokou podobnost obou genů. Podobné výsledky byly získány také při použití DNA. Podobné výsledky byly získány při použití DNA z Embellissia didymospora. Je proto možno uzavřít, že je možno použít gen pro chlorperoxídázu, části tohoto genu nebo sondy, připravené na bázi sekvence genu pro chlorperoxídázu z C. inaequalis pro detekci dalších podobných vanadiumhalogenperoxidáz z jiných mikroorganismů.For pre-hybridization and hybridization, a mixture of 6 x SSPE, 5 x Denhards, 0.5% SDS with 10 mg salmon sperm DNA was used as the medium? Pre-hybridization was carried out for 1 hour at 55 ° C, then the radioactive probe was boiled for 1 minute and then used directly. Hybridization was performed overnight. The autoradiograph obtained using DNA from Curvularia inaequalis and Drechslera biseptata is shown in Figure 4, where the individual features have the following meaning: lane 1: lambda DNA, lane 2: uncleaved DNA of the C. inaequalis genome, lane 3: same material digested with EcoRI , lane 4: same after digestion with BamHI, lane 5: same after digestion with EcoRI and BamHI, lane 6: same after digestion with XbaI, lane 7: same after digestion with PstI, lane 8: same after digestion with XbaI and Pstl, lanes 9-14: cleavage of the D. biseptata material by the same enzymes in the same order. As can be seen from the drawing, a positive signal was obtained from chromosomal DNA from Drechsler biseptata, demonstrating the high similarity of the two genes. Similar results were also obtained using DNA. Similar results were obtained using DNA from Embellissia didymospora. Thus, it can be concluded that a chloroperoxidase gene, a portion of the gene or a probe prepared based on the C. inaequalis chloroperoxidase gene sequence can be used to detect other similar vanadium haloperoxidases from other microorganisms.

Tabulka VIITable VII

Oligonukleotidové primery (20-mery), připravené na bázi sekvence aminokyselin vanadiumchlorperoxidázy z Curvularia inaequalisOligonucleotide primers (20-mers), prepared based on the amino acid sequence of vanadium chloroperoxidase from Curvularia inaequalis

Oligonukleotid 1:Oligonucleotide 1:

¹ -T A C/T A T G A A A/G CCZGTIGA A/G C A -3 ' ¹ -TAC / TATGAAA / G CCZGTIGA A / GCA -3 '

Oligonukleotid 2:Oligonucleotide 2:

5'-A G/A T/C T G I G, C G/A Τ A I G C G/A Τ T G/A T C-3 '5'-A G / A T / C T G I G, C G / A Τ A G G / A Τ T G / A T C-3 '

Oligonukleotid 3:Oligonucleotide 3:

5'-G A C/T G A A/G ACIGGZGA A/G T A C/T G A-35'-G AC / G AC / G ACIGGZGA AC / G AC / G AC-3

Oligonuikleotid 4:Oligonuikleotid 4:

S'-A G/A TGC T/C TGIGCZCC G/A/T/C C C C A T-3 'S'-A G / A TGC T / C TGIGCZCC G / A / T / C

Vysvětlivky k tabulce VII:Explanatory notes to Table VII:

I = inosinI = inosine

A/G: v této poloze byla použita směs A a G se stejným množstvím obou složek.A / G: A mixture of A and G with the same amount of both components was used in this position.

C/T: v této poloze byla použita směs C a T se stejným množstvím obou složek.C / T: at this position, a mixture of C and T with the same amount of both components was used.

G/A/T/C: v této poloze byla použita směs G, A, C a T se stejným množstvím všech složek.G / A / T / C: a mixture of G, A, C and T with the same amount of all components was used in this position.

Claims (13)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Enzymatický antimikrobiální prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje vanadiumhalogenperoxidázu, zdroj halogenidu a peroxid vodíku nebo zdroj peroxidu vodíku.An enzymatic antimicrobial composition comprising vanadium haloperoxidase, a halide source and hydrogen peroxide or a source of hydrogen peroxide. 2. Enzymatický antimikrobiální prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že jako vanadiumhalogenperoxidázu obsahuje chlorperoxidázu.Enzymatic antimicrobial composition according to claim 1, characterized in that it contains chloroperoxidase as vanadium haloperoxidase. 3. Enzymatický antimikrobiální prostředek podle nároku 1 nebo 2,vyznačující se tím, že jako vanadiumhalogenperoxidázu obsahuje chlorperoxidázu z Curvularia inaequalis.Enzymatic antimicrobial composition according to claim 1 or 2, characterized in that it contains chloroperoxidase from Curvularia inaequalis as vanadium haloperoxidase. 4. Enzymatický antimikrobiální prostředek podle některého z nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že jako vanadiumhalogenperoxidázu obsahuje chlorperoxidázu se zkříženou imunologickou reaktivitou s chlorperoxidázou z Curvularia inaequalis CBS 102.42.Enzymatic antimicrobial composition according to any one of claims 1 to 3, characterized in that it contains chloroperoxidase with cross-immunological reactivity with chloroperoxidase from Curvularia inaequalis CBS 102.42 as vanadium haloperoxidase. 5. Enzymatický antimikrobiální prostředek podle některého z nároků 1 až 4,vyznačuj ící se tím, že jako zdroj peroxidu vodíku obsahuje enzymatický systém, vytvářející peroxid vqdíkyi.Enzymatic antimicrobial composition according to one of Claims 1 to 4, characterized in that it contains, as a source of hydrogen peroxide, an oxygen peroxide-forming enzyme system. 6. Enzymatický antimikrobiální prostředek podle nároku 5,vyznačující se tím, že jako enzymatický systém, vytvářející peroxid vodíku obsahuje glukosu a glukosooxidázu nebo laktát a laktátoxidázu.The enzymatic antimicrobial composition according to claim 5, characterized in that it contains glucose and glucose oxidase or lactate and lactate oxidase as the hydrogen peroxide generating enzyme system. 7. Enzymatický antimikrobiální prostředek podle některého z nároků 1 až 6,vyznačující se tím, že je v podstatě prostý účinnosti katalázy.Enzymatic antimicrobial composition according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it is substantially free of catalase activity. 8. Způsob inhibice růstu mikrorganismů, vyznačující se t í m , že se na povrch, na němž má být růst mikroorganismů potlačen nanese enzymatický antimikrobiálni prostředek podle některého z nároků 1 až ý.8. A method of inhibiting the growth of microorganisms, characterized in that an enzymatic antimicrobial composition according to any one of claims 1 to 6 is applied to the surface on which the growth of microorganisms is to be suppressed. 9. Použití vanadiumhalogenperoxidáz jako prostředků pro potlačení mikroorganismů.Use of vanadium haloperoxidases as agents for suppressing microorganisms. 10. DNA, obsahující strukturní kódový gen pro vanadiumchlorperoxidázu z Curvularia inaequalis CBS 102.42.DNA containing the structural code for vanadium chloroperoxidase from Curvularia inaequalis CBS 102.42. 11. DNA, obsahující strukturní kódový gen pro vanadiumchlorperoxidázu z Curvularia inaequalis CBS 102.42, znázorněný na obr. 2.11. DNA containing the structural code for vanadium chloroperoxidase from Curvularia inaequalis CBS 102.42, shown in FIG. 2. 12. Vektor pro expresi, obsahující počátek replikace řídící sekvence pro transkripci a ukončení transkripce a alespoň část sekvence DNA z nároků 10 nebo 11.An expression vector, comprising an origin of replication of a transcription termination sequence and at least a portion of a DNA sequence of claims 10 or 11. 13. Způsob výroby vanadiumhalogenperoxidázy, vyznačující se tím, že se hostitel transformuje vektorem pro expresi podle nároku 12, hostitel se pěstuje za podmínek, při nichž může dojít k expresi strukturního genu a vanadiumhalogeAper-oxidáza se izoluje.13. A process for the production of vanadium haloperoxidase, characterized in that the host is transformed with an expression vector according to claim 12, the host is grown under conditions in which the structural gene can be expressed and vanadium halopereAper oxidase is isolated.