CZ233997A3

CZ233997A3 - MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST VARIOUS EPITOPES OF HUMAN pg39 AND METHODS OF THEIR USE IN DIAGNOSIS AND THERAPY

Info

Publication number: CZ233997A3
Application number: CZ972339A
Authority: CZ
Inventors: Anthony W Siadak; Diane Hollenbaugh; Lisa K Gilliland; Marcia L Gordon; Jurgen Bajorath; Alejandro A Aruffo; Linda J Harris
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 1997-11-12
Also published as: FI973120A; JPH10513348A; NO973447L; WO1996023071A2; CA2210419A1; EP1728864A1; AU4966996A; FI973120A0; NO973447D0; MX9705610A; IL116882A0; PL182868B1; EP1728864B1; EP0807175A2; US5876950A; HUP9802401A3; ES2391101T3; WO1996023071A3; NZ303375A; HUP9802401A2

Description

Oblast techniky

Úspěšná imunitní odpověď vyžaduje koordinovanou interakci mnoha typů buněk. Interakce mezi pomocnými T buňkami (Th) a antigen presentujícími buňkami (APC) jako jsou B buňky, monocyty a dendritické buňky vede ke komplexní komunikaci uplatňující signály zprostředkované solubilními cytokiny nabo membránovými vazebnými proteiny, stejně tak jako adhezivními interakcemi. Mnoho z těchto signálů je nespecifických pro cílenou imunitní odpověď a protein jsou široce distribuovány.

Dosavadní stav techniky

Bylo identifikováno množství významných povrchových proteinů T buněk účastnících se mezibuněčných interakcí včetně CD2, CD4, CD8, CD28, LFA-1, CTLA-4 a gp39. Tyto proteiny se účastní na mezibuněčném kontaktu vazbou na jejich receptory na APC a poskytují významné kostimulační signály pro T buňky, které modulují signály obdržené antigením receptorem T-buněk. Tyto kostimulační signály jsou nezbytné pro to, aby se T buňka stala plně zapojenou a exprivovala jak na membránu vázané, tak solubilní faktory nutné pro vlastní aktivaci na T buňkách závislých efektorových buněk (B buněk, buněk přirozených zabíječů, monocytů, neutrofilů atd.). Pár gp39/CD40 T buněčný ligand/receptor B buněk hrají zásadní roli v protilátkové imunitní odpovědi. In vitro studie ukázaly, že tento pár receptor/ligand je nutný pro proliferaci B buněk, produkci cytokinů a protilátek a pro přežívání buněk. Studie in vivo, jak prostřednictvím blokující monoklonální protilátky, tak prostřednictvím pozorování genetických defektů gp39, potvrdily in vitro výsledky a rozšířily je o nutnost funkčního gp39 pro tvorbu germinálních center v průběhu imunitní odpovědi na antigen.

CD 40 je 50 kDa membránový glykoprotein typu I exprivovaný B buňkami, makrofágy, folikulárními dendritickými buňkami, normálním bazálním epitelem, některými buněčnými liniemi odvozenými od karcinomů a melanomu (Clark and Ledbetter 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA; Paerlie et al., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 20: 23; Ledbetter et al., 1987, J. Immunol. 138: 788; Young et al., Int. J. Cancer 43: 786; Galy and Spitz 1992 J. Immunol. 149: 775; Alderson et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 669) a nedávno bylo popsáno, že je exprivován na T buňkách (Armitage et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 2326). Bylo ukázáno, že je významnou signální molekulou s rozsahem následných účinků v mnoha systémech. Dřívější studie ukázaly, že CD40 je vyžadován pro aktivaci B buněk. Zkřížená vazba mezi CD40 a anti-CD40 monoklonální protilátkou indukuje agregaci B buněk cestou LFA-1 (Gordon et al., 1988, J. Immunol. 140: 1425, Barret et al., 1991, J. Immunol. 146: 1722), zvyšuje Ser/Tyr (Gordon et al., výše) a Tyr (Uckun et al., J. Biol. Chem. 266: 17478) fosforylaci a množství intracelulárních substrátů a poskytuje kompetenční signál, který umožňuje B buňkám proliferovat a podléhat přesmyku tříd, pokud jsou stimulovány vhodným druhým signálem, například, ari£i--CD40 monoklonální protilátka může synergizovat s PMA (Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17:

1535) nebo anti-CD20 monoklonální protilátka (Clark and Ledbetter 1986, výše) indukci proliferace B buněk, s IL-4 za indukce proliferace B buněk (Gordon et al. 1987, výše; Rousett et al., 1991, J. Exp. Med. 172: 705) a IgE sekrece (Jabara et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 1861; Gascan et al.,

1991, J. Immunol. 147: 8; Rousset et al., 1991, výše; Zhang et al., 1991, J. Immunol. 146: 1836; Shapira et al., 1992,

J. Exp. Med. 175: 289) a s IL-10 a TGF-β za indukce sekrece IgA slgD B buňkami (De France et al., 1992, J. Exp. Med.

175: 671).

Izolace cDNA klonu kódujícího lidský CD40 (Stamenkovic et al., 1989, EMBO J. 8: 1403) ukazuje, že CD40 má signifikantní homologii rodinou receptoru nervového růstového faktoru. Za použití solubilní formy CD40, CD40 imunoflobulin fůsního proteinu (CD40-Ig) (Armitage et al.,1992, Nátuře 357: 80; Lané et al.,1992, Eur. J. Immunol. 22: 2573; Noelle et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6550) bylo zjištěno, že CD40 ligand (gp39, CD40-L), protein o přibližně 39 kDa, byl exprivován aktivovanými lidskými a myšími T buňkami. Kromě toho, studie blokování s CD40-Ig (Fanslow et al., 1992, J. Immunol. 149: 655; Noelle et al., 1992, výše) nebo s anti myší gp39 monoklonální protilátkou (MR1) (Noelle et al., 1992, výše) ukázaly, že zabránění gp39-VD40 vazby vedlo k inhibici biologické odpovědi B buněk.

Komplementární DNA kódující jak myší (Armitage et al.,

1992, Nátuře 357: 80) tak lidský (Hollenbaught et al., 1992, EMBO J. 11: 4313; Spriggs et al., 1992, J. Exp. Med. 176:

1543) gp39 nebo solubilní rekombinantní formu gp39 a IL-4 nebo gp39 a IL-10 mohou řídit lidské B buňky tak, aby secernovaly IgE a IgA, nebo IgM a IgG, v příslušném pořadí (Aruffo et al., 1993, Cell, 72: 291). Dohromady tyto výsledky naznačují, že gp39 může být vypínač odpovědný za některé aspekty diferenciace a přesmyku izotypů B buněk (Noelle et al., 1992, Immunol. Today 13: 431).

Nové byl mapován gen kódující gp39 na Xq26, region X chromosomu, kde byly již dříve mapovány geny odpovědné za hyper IgM syndrom (HIM) (Aruffo et al., 1993, CE11 72: 291). gp39 molekuly u HIM byly shledány jako abnormálně funkční. U aktivovaných T buněk byla nalezena produkce normálních hladin mRNA, ale kódovaný gp39 je defektní (Aruffo et al., 1993, výše; DiSanto et al., 1993, Nátuře 361: 541).

Hyper IgM syndrom je jednou z alespoň sedmi vrozených imunodeficiencí mapovaných na X chromosom (Kinnon a Levinsky 1992. J. Inherit. Metab. Dis. 15: 674). Choroba je chrakterizována nízkými nebo žádnými hladinami IgG, IgA a IgE, normální nebo zvýšenou hladinou IgM, normálním počtem recirkulujících B buněk, vnímavosti k bakteriálním a oportuním infekcím (včetně Pneumocystis carinii), žádnými germinálními centry, autoimunitou, neutropenií, X-vázanou a autosomální formou, a defektem genu gp39 ligandu v X-vázané formě choroby. Společná variabilní imunodeficience (CVI) je jinou skupinou imunodeficitnich onemocnění charakterizovaných abnormální protilátkovou odpovědí a rekurentními bakteriálními infekcemi. Klinické presentace CVI jsou různé a choroby popsané tímto termínem zahrnují širokou škálu dosud necharakterizovaných defektů. Chorobný stav popsaný jako CVI obyčejně vykazuje snížení nebo chybění sérových IgG a IgA, zatímco hladina IgM může být normální nebo snížená. Ačkoliv většina pacientů má normální počet a odpověď T buněk, někteří mají snížený počet, abnormální poměr CD4/CD8 buněk a abnormální funkci T buněk. Je zde také zvýšená pravděpodobnost autoimunitních protilátek u těchto pacientů.

Mutace v genu kódujícím gp39 edou k delecím vedoucím k posunu rámečku a nezralým stop kodonům, nebo vedou k bodovým mutacím vedoucím k substitucím aminokyselin (Allen et al., 1993, Science 259: 990; DiSanto et al., 1993, výše;

Fuleichan et al., 1993, výše; Korthauer et al., 1993, výše; Aruffo et al., 1993, výše; Collard et al., 1993, Immunol. Today 14: 559). Účinek těchto mutací na expresi gp39 aktivovanými T buňkami byl vyšetřován za použití solubilního CD40-Ig, polyklonální protilátky namířené proti gp39 bakteriálnímu fusnímu proteinu (anti-TRAP) (Graf et al.,

1992, Eur. J. Immunol. 22:3191; Korthauer et al., 1993, Nátuře 361: 539) a gp39 specifické monoklonální protilátky 5c8 (Lederman et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 1091). Při barvení solubilním CD40-Ig nebyla exprese gp39 nalezena, zatímco exprese anti-TRAP byla normální na T buňkách od jednoho ze tří testovaných pacientů, což bylo potvrzeno použitím monoklonální protilátky. Tyto výsledky ukazují, že exprese gp39 je variabilní u HIM pacientů a bylo naznačeno, že jesou nezbytné další práce pro určení, zda variace v povrchové expresi mutantní formy gp39 koreluje s vážností HIM onemocnění. Za absence rodině anamnézy X-HIM e obtížné tuto chorobu odlišit od CVI. Nyní používaná metoda pro identifikaci defektů v gp39 jako kausálního agens v X-HIM zahrnuje sekvencování nukleotidů obsahujících gp39 gen z cDNA vytvořené z mRNA izolované z in vitro aktivovaných lymfocytů, které nevážou CD40, ale obsahují mRNA kódující gp39. Toto metoda bylapoužita k ukázání toho, že jeden pacient, u kterého byla diagnostikována CVI trpí hyper IgM syndromem. Nicméně, tato metoda je pracná a její všeobecné použití by bylo velmi nákladné.

To, co je v oboru potřeba, jsou další monoklonální protilátky reaktivní s různými epitopy gp39, které mohou být snadno použity pro testování mutantních forem gp39 a pro jiné účely v diagnostice pro rozlišení mezi běžnou variabilní imunodeficienci a X-vázaným hyper IgM, a terapeutické metody pro modulování choroby ovlivňující interakce mezi CD40 a jeho ligandem gp39.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje monoklonální protilátky schopné vazby na alespoň dvanáct oddělených epitopů lidského gp39. Vynález dále poskytuje antigen vážící fragmenty a rekombinantní vazebné proteiny, odvozené pd monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu, které také váží gp39. Také jsou poskytnuty specifické hybridomy, které secernují monoklonální protilátky, které se váží na dvanáct popsaných epitopů gp39.

V jenom provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 a divoký typ gp39 se stejnou aviditou, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem, a také má slabou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a tyrosinu 135 nebo lysinu 143 nebo alaninem; a dále nereaguje s gp39 ve Western blotu. Specifickými příklady monoklonálních protilátek majících tyto charakteristiky jsou ty, které jsou secernovány hybridomy jako je 39-1.3 označený ATCC HB 11822, 39-1.122 označený ATCC HB 11816 nebo 39-1.138 označený ATCC HB 11821.

V druhém provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 s o něco menší aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem, a dále má slabou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a threoninu 135 nebo lysinu 143 nebo alaninem; a dále nereaguje s gp39 ve Western blotu. Specifickým příkladem monoklonální protilátky majících tyto charakteristiky je ta, která je secernována hybridomem jako je 39-1.59 označený ATCC HB 11815.

Ve třetím provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 s o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem. Protilátka je dále charakterizována tím, že má slabou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení glutamové kyseliny 129 nebo lysinu 145 alaninem. Dále, protilátka nereaguje s gp39 ve Western blotu. Specifickými příklady monoklonálních protilátek majících tyto charakteristiky jsou ty, které jsou secernovány hybridomy jako je 39-1.37 označený ATCC HB 11813 nebo 39-1.132 označený ATCC HB 11809.

V jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 s o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem; a dále má slabou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení glutamové kyseliny 129 nebo lysinu 143 alaninem. Protilátka této skupiny také reaguje s gp39 ve Western blotu. Specifickými příklady monoklonálních protilátek majících tyto charakteristiky jsou ty, které jsou secernovány hybridomy jako je 39-1.124 označený ATCC HB 11819 nebo 39-1.156 označený ATCC HB 11817.

V jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 s o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem; a dále má slabou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 obsahujícího lysin 143 nahrazený alaninem ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39. Protilátka je dále charakterizována tím, že není schopná vázat gp39 ve Western blotu.

Specifickými příklady monoklonálních protilátek majících tyto charakteristiky jsou ty, které jsou secernovány hybridomy jako je 39-1.7 označený ATCC HB 11812, 39-1.128 označený ATCC HB 11818 nebo 39-1.26 označený ATCC HB 11820.

V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 a divoký typ gp39 se stejnou aviditou, pokud mutant obsahuje nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo asparaginu 180 alaninem. Protilátka je dále charakterizována tím, že má slabou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní forma nahrazení fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem; a má o něco redukovanou vazebnou aviditou k mutantnimu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní gp39 nahrazení lysinu 143 alaninem. Monoklonální protilátka také váže gp39 ve Western blotu. Specifickými příklady monoklonálních protilátek majících tyto charakteristiky jsou ty, které jsou secernovány hybridomy jako je 39-1.77 označený ATCC HB 11814, 39-1.106 označený ATCC HB 11811 a 39-1.134 označený ATCC HB 11810.

V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 a divoký typ gp39 se stejnou aviditou, pokud mutantní gp39 obsahuje nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo asparaginu 180 alaninem a má slabou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní forma gp39 nahrazení fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem. Protilátka je dále charakterizována svou schopností vázat gp39 ve Western blotu. Specifickým příkladem monoklonální protilátky majících tyto charakteristiky je ta, která je secernována hybridomem jako je 39-1.29 označený ATCC HB 11808.

V jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 a divoký typ gp39 se stejnou vazebnou aviditou, pokud mutantní gp39 obsahuje nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo asparaginu 180 alaninem. Protilátka je dále charakterizována tím, že má o něco redukovanou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutant nahrazení lysinu 143 alaninem a také neváže gp39 ve Western blotu. Specifickým příkladem monoklonální protilátky majících tyto charakteristiky je ta, která je secernována hybridomem 39-7.3E12 označeným HB 11823.

V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 a divoký typ gp39 se stejnou vazebnou aviditou, pokud mutantní gp39 obsahuje nahrazení glutamové kyseliny 129 alaninem. Protilátka je dále charakterizována tím, že má o něco redukovanou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutant nahrazení šeřinu 131 a threoninu 135, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem a má slabou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutantní forma gp39 nahrazení lysinu 143 nebo tyrosinu 145 alaninem. Protilátka také není schopna vázat gp39 ve Western blotu. Specifickým příkladem monoklonální protilátky majících tyto charakteristiky je monoklonální protilátka 39-5.6E9 označená ATCC HB_.

V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 a divoký typ gp39 s o něco redukovanou nebo stejnou vazebnou aviditou, pokud mutantní forma obsahuje nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a threoninu 135, lysinu 143, tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem Protilátka je také charakterizována vazbou gp39 ve Western blotu. Specifickým příkladem monoklonální protilátky majících tyto charakteristiky monoklonální protilátka secernovaná hybridomem 39-9.246 označeným ATCC HB_.

V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, její antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 a divoký typ gp39 se stejnou vazebnou aviditou, pokud mutantní gp39 obsahuje nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem. Protilátka, antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein je dále charakterizována tím, že má o něco redukovanou vazebnou aviditu k mutantní formě gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k divokému typu gp39, pokud obsahuje mutant nahrazení lysinu 143 alaninem a má slabou vazebnou aviditu, pokud mutantní forma obsahuje nahrazení asparaginu 180 alaninem. Protilátka je dále charakterizována tím, že neváže gp39 ve Western blotu. Specifickým příkladem monoklonální protilátky majících tyto charakteristiky je monoklonální protilátka secernovaná hybridomem 39-9.11 označeným ATCC HB_.

V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována svou vazbou na mutantní formu lidského gp39 a divoký typ gp39 se stejnou vazebnou aviditou, pokud mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení glutamové kyseliny 129, šeřinu 131 a threoninu 135, lysinu 143, tyrosinu 145, nebo fenylalaninu 201 a glutamové kyseliny 202 alaninem Protilátka je také charakterizována schopností vázat gp39 ve Western blotu. Specifickým příkladem monoklonální protilátky majících tyto charakteristiky monoklonální protilátka secernovaná hybridomem 39-9.274 označeným ATCC HB_.

V ještě jiném provedení předkládaného vynálezu je monoklonální protilátka, antigen vážící fragment nebo rekombinantní vazebný protein charakterizována tím, že není vysoce reaktivní s mutantní formou lidského gp39 kde mutant obsahuje nahrazení glutamové kyseliny v pozici 129, šeřinu v pozici 131 a threoninu v pozici 135, tyrosinu v pozici 145, nebo fenylalaninu v pozici 201 a glutamové kyseliny v pozici 202 alaninem. Nebo, monoklonální protilátka je charakterizována tím, že není podobně reaktivní s mutantním lidským gp39, pokud mutant obsahuje náhradu asparaginu v pozici 180 a lysinu v pozici 143 alaninem. Tyto protilátky také mohou být charakterizovány svou vazbou nebo chyběním vazby na gp39 Westren blotem.

Každá skupina monoklonálních protilátek rozpoznává epitopy gp39 a může být manipulována buď chemicky nebo rekombinantními metodami, které generují buď antigen vazebné fragmenty nebo rekombinantní vazebné proteiny. Příkladem antigen vazebných fragmentů jsou Fab, (Fab')₂ nebo Fv vytvořené enzymovým trávením celé protilátky. Rekombinantní vazebné proteiny podle vynálezu zahrnují jakoukoliv molekulu, která si uchovává specifitu pro antigen původní protilátky a byla rekombinována s jinou sekvencí aminokyselinových zbytků. Příklady zahrnují chimérické protilátky, sFvs, humanizované protilátky a fusní molekuly.

V ještě jiném provedení vynálezu mohou být monoklonální protilátky nebo rekombinantní vazebné proteiny konjugovány s detekovatelným markérem nebo terapeutickým agens. Příklady detekovatelných markérů zahrnují fluorofory, radioaktivní izotopy, enzymy nebo chromofory. Terapeutická agens uvažovaná v předkládaném vynálezu mohou zahrnovat radioizotopy, toxiny nebo chemoterapeutická agens, jako jsou cytostatika. Kromě konjugačních technik mohou být rekombinantní vazebné proteiny podle předkládaného vynálezu konstruovány ve formě fusních proteinů, které obsahují variabilní region odvozený od monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu a enzymu, proteinového toxinu nebo proteinového terapeutického agens.

V ještě dalším provedení vynálezu je popsána metoda pro detekci X-vázaného hyper IgM syndromu. Metoda obsahuje kroky izolování lymfocytů periferní krve od pacienta, u kterého je podezření, že má příznaky asociované se syndromem, aktivování lymfocytů periferní krve, fixování a permeabilizování izolovaných a aktivovaných lymfocytů periferní krve, smísení popsané monoklonální protilátky s aktivovanými, fixovanými a permeabilizovanými lymfocyty periferní krve, a detekování protilátky navázané na buňky. Protilátka může být značena detekovatelným markérem, nebo může být neznačena. Pokud e použita neznačená protilátka je dalším krokem přidání sekundární protilátky (která je značená) specifické pro první protilátku, což je provedeno před krokem detekce. Detekovatelný markér může být, například, fluorofor, radioaktivní izotop, enzym nebo chromofor.

Dále, předkládaný vynález poskytuje hybridomy, které secernují specifické protilátky reaktivní s každým epitopem popsaným předkládaným vynálezem. Každý z těchto hybridomů byl uskladněn v American Type Culture Colection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 v 20.1.1995, za podmínek Budapešúské smlouvy.

V ještě dalším provedení předkládaného vynálezu jsou popsány izolované a purifikované sekvence nukleových kyselin, které kódují aminokyselinové sekvence pro lehké a těžké řetězce imunoglobulinových molekul, které rozpoznávají epitopy lidského gp39. Zejmena, sekvence nukleové kyseliny kódující variabilní region lehkého řetězce imunoglobulinu znázorněná v SEQ ID NO:12 a v SEQ ID NO:16. Také jsou zde popsány specifické nukleotidové sekvence, které kódují tyto aminokyselinové sekvence. Ty jsou znázorněny v Sekvenci ID#11 a 15. Také sou poskytnuty sekvence nukleové kyseliny kódující variabilní regiony těžkého řetězce imunoglobulinu mající sekvenci aminokyselinových zbytků znázorněnou v SEQ ID NO:14 a v SEQ ID NO:18. Jednotlivé nukleotidové sekvence, které kódují tyto aminokyselinové sekvence jsou poskytnuty v SEQ ID NO:15 a a SEQ ID NO: 17.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutické kompozice obsahující monoklonální protilátky, jejich antigen vazebné fragmenty nebbo rekombinantní vazebné proteiny, které jsou zde popsány v kombinaci s farmaceuticky akceptovatelným nosičem. Tyto kompozice mohou zahrnovat monoklonální protilátku, jejich antigen vazebný fragment nebbo rekombinantní vazebný protein konjugovaný s detekovatelným markérem nebo terapeutickým agens.

Jsou také poskytnuty metody pro použití těchto farmaceutických kompozic pro inhibici protilátkové odpovědi na antigen dependentní na T buňkách u savců prostřednictvím podání účinného množství kompozic popsaných výše. Zvířata poskytnutá s kompozicí mohou zahrnovat opice a lidi. Inhibice protilátkové odpovědi na antigen dependentní na T buňkách může zabránit autoimunitní odpovědi, rejekci transplantovaného orgánu, reakci štěpu proti hostiteli, alergické odpovědi nebo zánětlivé odpovědi. Autoimunitním onemocněním, kterému lze zabránit pomocí této metody může zahrnovat psoriasu, revmatoidní artritidu, systémový lupus erytematodes nebo diabetes mellitus, mimo jiné.

Dle, předkládaný vynález poskytuje metody pro znázornění buněk exprivujících gp39 na svém povrchu u pacienta, kde tato metoda obsahuje podání farmaceutické kompozice obsahující monoklonální protilátku popsanou výše konjugovanou na detekovatelný markér pacientovi, za podmínek umožňujících tvorbu komplexu antigen/protilátka na povrchu buněk exprivujících gp39 a detekování přítomnosti komplexu antigen /protilátka, jak je znázorněno přítomností detekovatelných markérů.

Popis obráyků na připojených výkresech

Obrázky 1A až ID ukazují vazbu myších anti-lidský gp39 monoklonálních protilátek 7 (39-1.7) a 106 (39.1-106) na aktivované T buňky člověka a makaka. E rosety pozitivních T buněk byly izolovány z mononukleárních buněk periferní krve, aktivovány PMA a ionomycinem po šest hodin a potom inkubovány s anti-lidský gp39 monoklonálními protilátkami 7, 106 nebo negativní kontrolní protilátkou. Buňky byly potom inkubovány s FITC kozím anti-myším IgG polyklonálním antiserem, po čemž následovala fykoerythrinem značená anti-lidský CD4 monoklonální protilátka. Buňky byly tříděny na CD4+ buňky a následně analyzovány na anti--gp39 barvení za použití FACSan. Obrázky 1A a 1B jsou lidské T buňky. Obrázky 1C a ID jsou T buňky makaka.

Obrázky 2A až 2C ukazují inhibici lidské CD40-Ig vazby na aktivované lidské a makačí T buňky myší anti-lidský gp39 monoklonální protilátkou 7 a 106. E rosety pozitivních T buněk byly izolovány z mononukleárních buněk periferní krve, aktivovány PMA a ionomycinem po šest hodin. Aktivované T buňky byly inkubovány s myší anti-lidský gp39 monoklonálními protilátkami 7 (39-1.7) nebo 106 (39-1.106) v koncentraci 5 /xg/ml, po čemž následovala lidská CD40-Ig (20 /zg/ml) . Po inkubaci byly buňky barveny fykoerythrinem značeným anti-lidský CD4 IgG a nanalyzovány na FACSan.

Obrázek 2A - lidské T buňky a monoklonální protilátka 7. Obrázek 2B - lidské T buňky a monoklonální protilátka 106 Obrázek 2C - buňky makaka a monoklonální protilátka 7. Obrázek 2D - buňky makaka a monoklonální protilátka 106.

Obrázek 3 ukazuje schopnost myších anti-lidský gp39 monoklonálních protilátek 7 a 106 inhibovat produkci IgG a IgM B buňkami makaka stimulovanými aktivovanými T buňkami makaka.

Obrázky 4A a 4B ukazují schopnost gp39 vazebných proteinů suprivovat imunitní odpověď na ovčí červené krvinky u makaka. Sérum bylo odebíráno týdně a (Obr. 4A) titry anti-SRBC IgM a (obr. 4B) titry anti-SRBC IgG byly hodnoceny ELISA. Hodnoty representují průměr + SEM pro 4 opice na skupinu. Šipky ukazuí dobu sekundární imunizace. Popsaná hodnota je titr, jak je určen ředěním séra dávajícím hodnoty absorbance pětinásobné proti hodnotě pozadí, kde pozadí je určeno měřením absorbance za absence séra.

Obrázek 5 ukazuje schopnost makaků ošetřených gp39 vazebnými proteiny generovat IgG odpověď na KLH. Výsledky j sou průměrem od všech opic v každé skupině. Popsaná hodnota je titr, jak je určen ředěním séra dávajícím hodnoty absorbance pětinásobné proti hodnotě pozadí, kde pozadí je určeno měřením absorbance za absence séra.

Obrázek 6 poskytuje nukleotidovou sekvenci pro 106 VL (SEQ ID č. 11) a odvozenou sekvenci aminokyselin (SEQ ID č. 12). Obrázek IB poskytuje nukleotidovou sekvenci pro 106 VH (SEQ ID č. 13) a odvozenou sekvenci aminokyselin (SEQ ID č. 14). Leader sekvence jsou zakroužkovány a komplementaritu určující regiony jsou orámečkovány. VL je členem myší kappa V podrodiny a V gen segment je přestavěn s Jkappa 5 (obrázek 6A, podtrženo). VH je členem myší III(D) podskupiny. V gen těžkého řetězce je přestavěn s JH2 (Obrázek 6B, podtrženo).

Obrázek 7 poskytuje nukleotidovou sekvenci pro 7 VL (SEQ ID č. 15) a odvozenou sekvenci aminokyselin (SEQ ID č. 16).

Obrázek 2B poskytuje nukleotidovou sekvenci pro 7 VH (SEQ ID č. 17) a odvozenou sekvenci aminokyselin (SEQ ID č. 18). Leader sekvence jsou zakroužkovány a komplementaritu určující regiony jsou orámečkovány. VL je členem myší kappa II podrodiny a V gen segment je přestavěn s Jkappa 4 (obrázek A, podtrženo). VH je členem myší II(A) podskupiny. V gen těžkého řetězce je přestavěn s JH2 (Obrázek 7B, podtrženo).

Obrázky 8A a 8B ukazují titraci 106 sFv-Ig a 7 sFv-Ig transfekčních supernatantů COS buněk navázaných na imobilizovaný lidský gp39. 96 jamkové plotnu s mělkým dnem potažené anti-myší Lt-2a a Lyt-2a-gp39 fusní proteiny byly použity pro vyšetřování supernatantů COS buněk na funkční anti-gp39 106 a 7 sFv-Ig. Je ukázáno dvojnásobné ředění representativních klonů pro každý sFv-Ig. Zatímco kontrolní transfekční supernatant (bez přidání DNA ke COS buňkám) nevykazoval žádnou aktivitu, 106-sFv-Ig a 7-sFv-Ig vázaly imobilizovaný gp39 v ředěních přesahujících 1:100 (pro 106 sFv-Ig byla vazba detekována pod ředěním transfekčního supernatantů 1:1000. Ve srovnání, anti-myší gp39 sFv (MR1 sFv-Ig) nevázal lidský gp39, ačkoliv se dobře vázal na plotny potažené anti-myší Lt-2a a Lyt-2a myší-gp39 fusními proteiny. 106-sFv-Ig a 7-sFv-Ig vykazovaly malou nebo žádnou reaktivitu na plotnách potažených anti-myší Lt-2a a Lyt-2a myší-gp39 fusními proteiny.

Obrázky 9A a 9B ukazují komparativní vazbu bivalentní 106 monoklonální protilátky a 106 sFv-Ig na Jurkat buňky konstitutivně exprivující gp39. Jodinovaná bivalentní 106 mAb bya srovnávána s jodinovaným sFv-Ig na vazbu k gp39 exprivovaném na BMS-10 Jurkat buňkách. Kalkulované afinity byly Kd=4 x 10^-1° + 6 x 10^-11 pro bivalentní 106 mAb (obrázek 9A) a Kd=l,9 x 10^-9 + 3,3 x 10^_1°pro 106 sFv-Ig (obrázek 9B) . Scatchard transformace ukázala, že ak bivalentní 106 mAb, tak 106 sFv-Ig se váží na přibližně 10000 míst na buňku (obrázky 9A a 9B).

Obrázek 10 ukazuje 106 VL humanizační templát. Původní myší sekvence je ukázána ve čtyřech řadách (ml06, SEQ ID č.

27) s myší sekvencí germinální linie pod ní. Vybraná lidská tempátová sekvence je ukázána ve druhé řadě (lidský templát, SEQ ID č. 29) s lidskou konsensuální sekevencí nad ní. Humanizovaná sekvence 106 VL (hl06, SEQ ID č. 28) e ukázána mezi lidskou templátovou a myší 106 VL sekvencí. Skládá se v podstatě ze zbytků lidského pracovního rámečku a myších hypervariabilních residuí. Hypervariabilní regiony jak je definuje Kabat et al., (Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 4. vydání, U.S. Health and Human Services, Washington D.C. (1987)) jsou ukázány podtržené dvojitou linkou. Ll, L2 a L3 smyčky jsou podtrženy ednoduchou linkou a strukturální determinanty definované Chothiou jsou označeny hvězdičkou (Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol.

196: 901). Lidská nebo myší residua lišící se od humanizované 106 VL jsou dvojitě podtržena. Lidský J kappa byl vybrán na základě homologie k 106 J kappa.

Obrázek 11 ukazuje 106 VH humanizační templát. Původní myší sekvence je ukázána ve čtyřech řadách (ml06, SEQ ID č. 30) s nejbližší myší sekvencí pod ní (vhodná germinální sekvence mající pouze tři residua v H2 smyčce nebyla dostupná; místo ní byla vybrána přeskupená sekvence mající vysokou celkovou homologii ke 106 VH a také mající tři residua v H2 smyčce).

Vybraná lidská tempátová sekvence je ukázána ve druhé řadě (lidský templát, SEQ ID č. 32) s lidskou konsensuální sekevencí nad ní (lidský VHIII(JH4 konsensus). Humanizovaná sekvence 106 VH (hl06, SEQ ID č. 31) je ukázána mezi lidskou templářovou a myší 106 VH sekvencí. Skládá se v podstatě ze zbytků lidského pracovního rámečku a myších hypervariabilních residuí (podtrženo dvojitě). Hl, H2 a H3 smyčky jsou podtrženy jednoduchou linkou a strukturální determinanty definované Chothiou jsou označeny hvězdičkou. Lidská nebo myší residua lišící se od humanizované 106 VH jsou dvojitě podtržena. Lidský JH byl vybrán na základě homologie k 106 JH.

Obrázek 12 zobrazuje souhrn osmi humanizovaných 106 VH.

Dva DNA fragmenty byly amplifikovány PCR prvních 149 baží myšího 106 VH za použití sense primerů které kódovaly Hind III místo ihned před 106 VH sekvencí obsahující změny tří (106-vh T-5¹) nebo čtyř (106 vhA-5') myších residuí na lidská residua, a antisense primerů, které kódovaly jedinečná restrikční místa (Nhel, EcoRI, Pstl a Xbal). Tyto fragmenty byly tráveny HindlII a Xbal a byly ligovány do pUC19 za vytvoření dvou vektorů 106 vhA-NEP a 106 vhT-NEP. Tři páry syntetizovaných oligonukleotidů kódovaly změny v jedné nebo ve dvou pozicích (106 vh SY, 106 vh DY, 106 vh SS) zatímco 106 vh DS si uchoval původní myší sekvenci ve zbytcích 55 a 56. Všechny čtyři páry také kódovaly další humanizovaná residua Ile 57, Ala 60, Lys 64 a Lys 75, což pro zjednodušení není ilustrováno. Kromě toho, byly zpracovány s Nhel a Pstl přesahujícími úseky (0/H) a jedinečným Xhol místem pro diagnostické trávení. DNA fragmenty generované těmito oligonukleotidy byly ligovány do 106 vhA-NEP a 106 vhT-NEP vektorů v Nhel a Pstl místech. Konečný PCR fragment byl generován za použití 106 vh Pst5 sense primeru a 106 vh Xba3 antisense primeru za použití myší 106 VH jako templátu. Tyto dva oligonukleotidy kódovaly čtyři další změny z myší na lidskou sekvenci. DNA fragment byl klonován do dříve konstruovaného vektoru za použití Pstl a Xbal restrikčních míst.

Obrázek 13 demonstruje inhibici exprese E selektinu na endoteliálních buňkách. Černé sloupce ukazují hladiny exprese E selektinu. Zatímco myší 106 sFv-Ig vykazuje silnou inhibici, L6 sFv-Ig negativní kontrola nevykazuje žádnou inhibici. HuVL/106 vhA-DY (ADY), huVL/106 vhA-SY (ASY) a huVL/106 vhT-DS (TDS) inhibují expresi E selektinu, ačkoliv ne tak účinně jako myší 106 aFv-Ig. Supernatanty od huVL/106 vhT-SY (TSY; žádný protein) a huVL/106 vhT-SS (TSS; aberantní protein) transfekci nevykazují žádnou aktivitu.

Obrázek 14 ukazuje Biacre™ analýzu humanizovaných 106 sFv-Ig proteinů vážících lidský gp39. Lidský gp39 byl potažen na plátky a byly testovány různé humanizované 106 sFv-Ig supernatanty transfekci na vazbu. Původní myší 106 sFv-Ig se vázal velmi silně (nepozorovanán žádný výstup, jak je ukázáno horizontální linií). Proteiny z huVL/106 vhA-DY (ADY12.3), huVL/106 vhA-SY (ASY21.7) a huVL/106 vhT-DS (TDS46.17) transfekčních supernatantů se také vázaly silně s žádným detekovatelným poměru. Supernatanty z huVL/l06vhT-SY (TSY26.9; žádný protein) a huVL/106vhT-SS (TSS36.13; aberantní protein) transfekci se navázaly na gp39 potažené plátky.

Obrázek 15 poskytuje zobrazení kompletního hl06 lehkého řetězce expresního plasmidu pD16-hK8.Ll.

Obrázek 16 popisuje sekvence nukleové kyseliny (SEQ ID NO: 76) a aminokyselinových residuí (SEQ ID NO: 77) pro insert hl06 imunoglobulinového lehkého řetězce, který kóduje hl06 signální peptid, variabilní region a asociované sousední regiony.

Obrázek 17 poskytuje zobrazení kompletního hl06 těžkého řetězce expresního plasmidu pD17-hKl.Hl.

Obrázek 18 popisuje sekvence nukleové kyseliny (SEQ ID NO: 78) a aminokyselinových residuí (SEQ ID NO: 79) pro insert hl06 imunoglobulinového těžkého řetězce, který kóduje hl06 signální peptid, variabilní region a asociované sousední regiony.

Obrázek 19 poskytuje data pro inhibici proliferace B buněk sgp39 za přítomnosti anti-myšího IgM. Klidové tonsilární B buňky byly kultivovány za přítomnosti sgp39, králičích anti-lidských IgM imunokorálků a ukázaného množství monoklonální protilátky po 72 hodin. Plotny byly potom pulsovány (³H)-thymidinem a inkubovány po dalších 16 hodin.

Po inkubaci byly buňky sklízeny a byla určena inkorporace (³H)-thymidinu. Všechny testy byly provedeny třikrát.

Výsledky jsou vyjádřeny v procentech inhibice ve srovnání s kulturami, které obsahovaly pouze medium.

Obrázek 20 srovnává schopnost různých proteinů humanizované 106 protilátky inhibovat produkci protilátek lidskými B buňkami stimulovanými aktivovanými T buňkami. Lidské mononukleární buňky periferní krve byly depletovány od monocytů a přirozených zabiječů a potom separovány na E rosety pozitivní (T buňky) a E rozety negativní (B buňky).

T buňky byly následně ošetřeny mitomycinem C a kokultivovány s B buňkami v anti-CD3 monoklonální protilátkou potažených jamkách 96 jamkové plotny za přítomnosti ukázaného množství monoklonální protilátky. Všechny testy proběhly třikrát. Výsledky jsou vyjádřeny v procentech inhibice ve srovnání s kulturami, které obsahovaly pouze medium (žádnou anti-gp39 monoklonální protilátku).

Obrázek 21 srovnává schopnost různých proteinů humanizované 106 protilátky inhibovat indukci exprese E selektinu na endoteliálních buňkách gp39~ linií T buněk. Endoteliální buňky lidské umbilikální vény kultivovány s BMS-2 buňkami, Jurkat linií, o které je známo, že exprivuje gp39, za přítomnosti ukázaného množství protilátky. Po čtyřech hodinách byla hladina exprese E-selektinu měřena ELISA. Sloupce chyb jsou menší než symboly grafu.

Podrobný popis vynálezu

Aby byl vynález lépe pochopitelný je dán následující popis.

Předkládaný vynález je zaměřen na skupinu monoklonálních protilátek, které rozpoznávají specifické epitopy glykoproteinu gp39 na membráně T buněk, a na hybridomy, které produkují a secernují tyto monoklonální protilátky.

Předkládaným vynálezem jsou také zahrnuty jiné monoklonální protilátky, které mohou být vyrobeny, které kompetitivně inhibují vazbu specificky popsaných monoklonálních protilátek na jejich epitopy. Fragmenty monoklonálních protilátek a rekombinantních proteinů majících variabilní region popsaných monoklonálních protilátek jsou také zahrnuty v předkládaném vynálezu, stejně jako metody pro použití monoklonálních protilátek, fragmentů a rekombinantních vazebných proteinů v diagnostice hyper IgM syndromu, v jiných testech buněčné adhese a testech T buněk a v metodách modulace imunitní odpovědi u hostitele.

Příprava monoklonálních protilátek může být provedena imortalizací buněčné linie produkující protilátku specifickou pro epitop na gp39. Typicky může být monoklonální protilátka podle předkládaného vynálezu produkována za pomoci dobře ustanovené hybridomní techniky prvně popsané Kohlerem a Milsteinem. Viz Kohler and Milstein, 1975, Nátuře 256: 495. Viz také Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539; Yeh et al., 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 297; Hellstrom et al., 1990, Cancer Research 50: 2183.

Tyto techniky vyžadují injikování imunogenu (např. buněk nebo buněčného extraktu obsahujícího gp39 antigen nebo purifikovaného gp39, bud' jako nativního proteinu, fragmentu obsahujícího epitopové místo nebo fusního proteinu) do zvířete tak, aby se vyvolala požadovaná imunitní odpověď u zvířete. Běžně používaná zvířata zahrnují mnoho savců,, např. myš, krysu, hovězí dobytek, kozu, ovci, králíka atd..Imunogen je obvykle presentován zvířeti s adjuvans, např. kompletním Freundovým adjuvans, gelem hydroxidu hlinitého a podobně.

Zvířeti potom může být odebrána krev a krev může být využita pro izolaci polyklonálních protilátek. Alternativně, periferní lymfocyty, lymfocyty sleziny (B-buňky) nebo lymfocyty lymfatických uzlin mohou být využity pro fúsi s vhodnými myelomovými buňkami pro imortalizaci genů kódujících monoklonální protilátky specifické pro gp39.

V předkládaném vynálezu jsou monoklonální protilátky zejména charakterizovány svou vazbou na serie mutantů gp39. Vazebná avidita (síla vazby) protilátek na na mutantní gp39 byla srovnávána s vazebnou aviditou protilátky na divoký typ gp39. Vazebná avidita byla charakterizována jako chudá, pokud srovnání vazebné avidity pro určitý mutant bylo menší než 25 - 30% vazebné avidity k divokému typu gp39; slabá nebo méně silná redukce reaktivity byla získána, pokud vazebná avidita k mutantu byla 25 - 30% až 50 -55% vazebné avidity k divokému typu gp39; a o něco redukovaná reaktivita byla získána, pokud vazebná avidita k mutantu byla 50 - 55% až 75 - 80% vazebné avidity k divokému typu gp39; a podobná nebo ekvivalentní reaktivita byla získána, pokud vazebná avidita k mutantu byla 75 - 80% nebo větší než vazebná avidita k mutantu. Protilátky podle předkládaného vynálezu byly také charakterizovány svým izotypem, vazbou gp39 ve Western blotu, schopností suprivovat proliferaci B buněk a schopností suprivovat produkci imunoglobulinů.

Ačkoliv je vynález popsán prostřednictvím příkladů používajících myší monoklonální protilátky, není ria ně omezen a obsahuje použití, například, lidských hybridomů (Cote et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci, USA 80: 2026) nebo transformujících lidských B buněk (např. virem Epsteina

Barrové (EBV) in vitro) (Cote et al., 1985, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 - 96).

Monoklonální protilátky mohou být jakékoliv třídy nebo podtřídy imunoglobulinů jako je IgM, IgD, IgA, igE nebo podtříd IgG známé pro jednotlivý druh zvířete. Obecně, monoklonální protilátky mohou být použity intaktní, nebo jako epitopové vazebné fragmenty, jako je Fv, Fab nebo F(ab)₂.

Buněčné linie podle předkládaného vynálezu mohou být použity jinak než pro přímou produkci monoklonálních protilátek. Buněčné linie mohou být fušovány s jinými buňkami (jako jsou vhodné lékem-značené lidské myelomové, myší myelomové nebo lidské lymfoblastoidní buňky, pro produkci hybridomů a tak poskytují přenos genů koduících monoklonální protilátky. Alternativně může být buněčná linie použita jako zdroj chromosomů nebo genů, kódujících imunoglobuliny, zejména ty regiony genů kódujících variabilní epitop vazebné regiony imunoglobulinu, které mohou být izolovány a přeneseny do buněk technikami jinými než fúsními. Toto může být provedeno přípravou cDNA knihoven (z mRNA) kódujících imunoglobulin a prostých intronů a potom izolování a umístěním DNA do vhodného prokaryotního nebo eukaryotního expresního vektoru. Metody pro expresní vektory mohou potom být použity pro transformaci hostitele pro produkci imunoglobulinu nebo epitop vazebného fragmentu. Víz obecně U.S. č. 4172124, 4350683; 4363799; 4381292; a 4423147. Viz také Kennet et al., 1980, Monoclonal Antibodies, Plenům Pree, New York, a odkazy zde citované.

Podrobněji, podle technologie hybridní DNA, imunoglobulin nebo epitop vazebný fragment podle předkládaného vynálezu může být produkován v bakteriích (Viz, Boss et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 3791 a Wood et al., 1985, Nátuře 314:

446). Například, essengerová RNA transkribovaná z genů koduících těžké a lehké řetězce monoklonální protilátky produkovaná buněčnou linií podle předkládaného vynálezu může být izolována různou cDNA hybridizaci za použití degenerovaných cDNA prob odvozených od DNA sekvencí známých jako obvyklé pro zralé imunoglobulinové molekuly původního typu buněk. mRNA, která nehybridizuje, bude bohatá na sekvence kódující požadované imunoglobulinové řetězce. Pokud to je nezbytné, může být tento proces opakován pro další zvýšení hladin požadované mRNA. Odečtená mRNA kompozice může potom být reversně transkribována za poskytnutí cDNA směsi obohacené o požadované sekvence. RNA může být hydrolyzována vhodnou RNasou a ssDNA dvoj řetězcová může být vyrobena DNA polymerasou I a náhodnými primery, např. náhodně fragmentovanou telecí thymovou DNA. Vzniklá dsDNA může potom být klonována insercí do vhodného vektoru, např. virového vektoru, jako je lambda vektor nebo plasmidový vektor (jako je pBR322, pACYC 184, atd.) Při vývoji prob založeném na známých sekvencích pro konstantní regiony lehkých a těžkých řetězců mohou být tyto cDNA klony mající gen kódující pro požadované lehké a těžké řetězce identifikovány hybridizaci. Potom mohou být geny excidovány z plasmidů, manipulovány pro odstranění nadbytečné DNA a potom zavedeny do vhodného vektoru pro transformaci hostitele a konečnou expresi genu. Mohou být použity jiné, v oboru dobře známé metody, pro izolování genových sekvencí, které kódují imunoglobulinové molekuly.

V předkládaném vynálezu byla RNA izolována a cDNA byla generována za použití PCR technik s imunoglobulinovými konstantními regiony jako primery. PCR amplifikované VH a VL fragmenty byly vybrány, klonovány a použity pro určení nukleotidových sekvencí pro variabilní regiony.

Běžně byly využity savčí hostitelé (např. myší buňky) pro zpracování imunoglobulinových řetězců (např. spojení těžkých a lehkých řetězců) pro produkci intaktních imunoglobulinů; a navíc, sekreci imunoglobulinu prostého od jakékoliv leader sekvence, pokud je to žádoucí. Alternativně je možné použít jednobuněčný mikroorganismus pro produkci dvou řetězců, kde může být žádoucí další manipulace pro odstranění DNA sekvencí kódujících sekreční leader a zpracovatelské signály, zatímco poskytuje iniciační kodon na 5' konci sekvence kódující těžký řetězec. Tímto způsobem může být připraven a zpracován imunoglobulin tak, aby byl shromažďován a glykosylován v jiných buňkách než savčích.

Pokud je to žádoucí může být každý řetězec zkrácen tak, aby obsahoval alespoň jeden variabilní region, který potom může být manipulován tak, aby poskytnul jiné rekombinantní vazebné proteiny specifické pro gp39 epitop rozpoznávaný původní protilátkou.

Jedním takovým rekombinantním vazebným proteinem je chimérická protilátka, ve které jsou variabilní regiony původní protilátky rekombinovány s konstantními regiony protilátky odvozené od jiného druhu (např. myší variabilní regiony rekombinované s lidskými konstantními regiony). Typicky, variabilní region monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu bude připojen na konstantní region lidské protilátky. Chimérické protilátky, které jsou obvykle lidské, jsou· významně méně imunogenní, než myší protilátky.

Jiným rekombinantním vazebným proteinem je protilátka o jednom řetězci. V takovém konstruktu, někdy nazývaném sFv, je jeden variabilní region z jak těžkého, tak z lehkého řetězce původní protilátky kovalentně navázány prostřednictvím peptidového linkeru tak, že je vytvořen epitop vazebný region. Multivalentní jednořetězcové protilátky obsahující variabilní regiony lehkého a těžkého řetězce specifické pro jeden nebo více epitopů gp39 mohou také být konstruovány. Viz EP 0610046 a WO 94/13806 pro návod pro pronstrukci takových rekombinantních vazebných proteinů.

Ještě jiným typem rekombinantního vazebného proteinu je humanizovaná protilátka, ve které byly kodony uvnitř regionu pracovního rámečku non-lidské monoklonální protilátky změněny různými metodami bodové mutagenese tak, aby kódovali aminokyselinové zbytky pro -vytvoření myšího pracovního rámečku podobnějšího lidskému regionu pracovního rámečku. Viz EP 0578515, EP 0592106, Jones et al., 1986, Nátuře 321: 522; Riechmann et al., 1988, Nátuře 332: 323. Mohou být vytvořeny také změny v komplementaritu určujících regionech (CDR) pro vytvoření celého variabilního regionu podobnějšího povrchovému charakteru lidské protilátky. Význam tvorby různých rekombinantních vazebných proteinů je změna buď imunogenicity protilátky, nebo další aktivita týkající se konstantního regionu nebo jiné aktivní skupiny rekombinované s epitop vazebným regionem a uchování gp39 epitop vazebné specifity původní protilátky.

Vynález dále poskytuje kompozice monoklonálních protilátek a rekombinantních vazebných proteinů podle předkládaného vynálezu. Kompozice mohou obsahovat monoklonální protilátky a rekombinantní vazebné proteiny podle předkládaného vynálezu značené detekovatelným markérem, například radioaktivním izotopem, enzymem, fluoroforem, chromoforem atd. Jiné kompozice mohou obsahovat monoklonální protilátky a rekombinantní vazebné proteiny podle předkládaného vynálezu konjugované nebo navázané na terapeutické agens, jako je radioizotop, toxin (t.j. Pseudomonas exotoxin) nebo chemoterapeutické agens.

Konjugace nebo vazba protilátky nebo rekombinantního vazebného proteinu podle předkládaného vynálezu na detekovatelný markér nebo terapeutické agens může být prostřednictvím kovelentní nebo jiné chemické vazby. Prostředky chemické vazby mohou zahrnovat, například, glutaraldehyd, heterobifunkční a homobifunkční vazebná agens. Heterobifukční vazebná agens mohou zahrnovat, například, SMPT (sukcimidyl oxykarbonyl-a-methyl-Q! (2-pyridyldition)-tolume, SPDP (N-sukcimydil3-(2-pyridylilithio)propionát a SMCC (sukcimidyl-4-(N-male-imidomethyl)cyclohexan-1-karboxylat. Homobifukční vazebná agens mohou zahrnovat, například, DMP (dimethyl pimelymidat), DMA (dimethyl suberinidat) a DTBP (dimethyl 3,3'-dithio-bispropionimidat).

Jisté proteinové detekovatelné markéry a terapeutická agens mohou být rekombinantně kombinována s variabilními regiony monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu za vytvoření kompozic, které jsou fusními proteiny, kde si variabilní regiony monoklonální protilátky uchovávají svou vazebnou specificitu a detekovatelný markér nebo terapeutické agens si uchovávají svou reaktivitu. Rekombinantní metody pro konstrukci těchto fusních proteinů jsou v oboru dobře známé.

Farmaceutické kompozice obsahující monoklonální protilátku nebo rekombinantní vazebné proteiny, bud' konjugované nebo nekonjugované, jsou zahrnuty předkládaným vynálezem. Farmaceutické kompozice mohou obsahovat monoklonální protilátku a farmaceuticky akceptovatelný nosič. Pro účely předkládaného vynálezu může být farmaceuticky akceptovatelný nosič jakýmkoliv běžným standartním nosičem známým v oboru. Například, vhodné nosiče mohou zahrnovat fosfátem pufrované salinické roztoky, emulse jako je olej/voda emulze a různé typy zvlhčovačích agens. Jiné nosiče mohou také zahrnovat sterilní roztoky, tablety, potažené tablety a kapsle.

Typicky může takový nosič obsahovat excipient jako je škrob, mléko, cukr, typy hlíny, želatinu, stearovou kyselinu, jejich sole, stearát vápenatý nebo hořečnatý, talek, rostlinné tuky nebo oleje, gumy, glyceroly nebo jiné známé excipienty. Takové nosiče mohou také obsahovat ochucovací nebo barvící přísady, preservativy nebo jiné přísady. Kompozice obsahující takové nosiče jsou formulovány dobře známými běžnými prostředky. Viz Remington’s Pharmaceuticel Science, 15 vydání, Much Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

Monoklonální protilátky a rekombinantní vazebné proteiny podle předkládaného vynálezu nacházejí mnoho in vitro a in vivo použití. Například, kompozice podle předkládaného vynálezu mohou najít použití in vitro pro izolaci solubilního lidského gp39 a proteinů majících mutace v lidském gp39 asociované s lidskými chorobami, jako je X-vázaný hyper IgM syndrom. Kompozice mohou také nacházet uplatnění v diagnostických metodách pro rozlišení mezi X-vázaným hyper IgM a CVI.

Pro diagnostické účely mohou být monoklonální protilátky a rekombinantní vazebné proteiny bud' značené, nebo neznačené. Typicky diagnostický test vyžaduje detekci tvorby komplexů mezi monoklonální protilátkou nebo rekombinantním vazebným proteinem a lidským gp39 bud' na povrchu buňky, nebo v aktivované T buňce. Pokud jsou neznačeny, potom nacházejí protilátky a rekombinantní vazebné proteiny uplatnění v aglutinačních testech. Kromě toho, neznačené protilátky mohou být použity v kombinaci s jinými značenými protilátkami (sekundárními protilátkami), které jsou specificky reaktivní s monoklonální protilátkou nebo rekombinantním vazebným proteinem, jako jsou protilátky specifické pro imunoglobulin. Alternativně mohou být monoklonální protilátky a rekombinantní vazebné proteiny přímo značeny. Může být využita široká škála značících látek, jako jsou radionuklidy, fluorescery, enzymy, substráty enzymů, kofaktory enzymů, inhibitory enzymů, ligandy (zejména hapteny) atd. V oboru je dobře známý velký počet imunotestů.

Obyčejně jsou monoklonální protilátky a rekombinantní vazebné proteiny podle předkládaného vynálezu použity v testu fluorescence, kde je protilátka nebo rekombinantní vazebný protein konjugována na fluorescentní molekulu, jako je fluorescein isothiokyanat (FITC). Jelikož mnoho mutantních forem lidského gp39 není transportováno na povrch buněk jsou t buňky izolovány od subjektu, aktivovány a potom jsou buňky permeabilizovány tak, aby umožnili značené protilátce nebo rekombinantnímu vazebnému proteinu penetrovat do buňky a vázat se na mutantní gp39, pokud je přítomen v buňkách. Vazba monoklonálních protilátek na intracelulární gp39 a neschopnost vázat se na solubilní formu CD40 na povrchu buněk demonstruje přítomnost jistých bodových mutací v lidském gp39, které zabránily lokalizaci gp39 molekuly na buněčný povrch. Toto může být asociováno s lidským onemocněním, jako je X-vázaný hyper IgM. Přítomnost navázané protilátky může být detekována fluorescencí aktivované třídy buněk po promytí přebytečné značené protilátky nebo vazebného proteinu. Jiné běžné techniky dobře známé v oboru mohou také být použity.

Jsou také dodány kity pro použití s kompozicemi protilátek a rekombinantních vazebných proteinů pro detekci přítomnosti mutantních lidských gp39 molekul v roztoku nebo na aktivovaných T buňkách. Tak, mohou být poskytnuty kompozice předmětné monoklonální protilátky a rekombinantního vazebného proteinu podle předkládaného vynálezu, obvykle lyofilizované formě buď jednotlivě, nebo v kombinaci s protilátkami, které vážou jiné specifické lidské gp39 mutanty. Protilátky a rekombinantní vazebné proteiny, které mohou být konjugovány na značku nebo mohou být nekojugovány, jsou obsaženy v kitu spolu s pufry, jako je Tris, fosfát, karbonát, atd., stabilizery, biocidy, inertními proteiny, např. hovězím sérovým albuminem, a podobné. Obecně budou tyto materiály přítomny v množství menším než 5% hmotnosti vzhledem k množství aktivní protilátky, a obvykle budou přítomny v celkovém množství alespoň 0,001% hmotnosti vzhledem k množství protilátky. Často bude žádoucí, aby obsahoval inertní extender nebo excipient pro ředění aktivních složek, kde excipient bude přítomen od 1 do 99% hmotnosti celkové kompozice. Tam, kde je využita sekundární protilátka schopná vazby monoklonální protilátky nebo rekombinantního vazebného proteinu, bude obvykle přítomna v samostatné lahvičce. Druhá protilátka je typicky konjugována se značkou a formulována obdobným způsobem jako formulace popsaná výše.

Monoklonální protilátky, jednotlivé rekombinantní vazebné proteiny, chimérické protilátky a humanizované protilátky podle předkládaného vynálezu mohou také být inkorporovány jako složky farmaceutických kompozic obsahujících množství vazebného proteinu, které je účinné, například, pro modulování imunitní odpovědi, (t.j. autoimunitní odpovědi nebo alergické reakce) s farmaceuticky akceptovatelným nosičem. Farmaceuticky akceptovatelná adjuvans (pufrovací agens, přípravná agens) mohou také být inkorporována do farmaceutické kompozice. Taková kompozice může obsahovat jednu monoklonální protilátku nebo rekombinantní vazebný protein specifický pro lidský gp39. Alternativně může farmaceutická kompozice obsahovat jiné biologicky aktivní molekuly, například lymfokiny, cytokiny, jiné monoklonální protilátky nebo fusní proteiny (t.j. CD28-Ig, CTLA4-Ig).

Monoklonální protilátky, rekombinantní vazebné proteiny a jejich farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu jsou zejmena užitečné pro orální nebo parenterální podání. Preferovaně mohou být farmaceutické kompozice podány perenterálně, t.j. subkutánně, intramuskulárně nebo intravenosně. Tak tento vynález poskytuje kompozice pro parenterální podání, které obsahují roztok monoklonální protilátky nebo rekombinantního vazebného proteinu rozpuštěného v akceptovatelném nosiči, preferovaně ve vodném nosiči. Může být použito množství vodných nosičů, např. voda, pufrovaná voda, maltosa, 0,4% salinický roztok, 0,3% glycin a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní o prosté jednotlivých hmot. Tyto kompozice mohou být sterilizovány běžnými, dobře známými sterilizačními technikami. Kompozice mohou obsahovat farmaceuticky akceptovatelné pomocné substance pro přiblížení se fyziologickým podmínkám jako jsou agens upravující pH a pufrovací agens, toxicitu upravující agens a podobně, například, octan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, laktát sodný atd. Koncentrace protilátky nebo rekombinantního vazebného proteinu v těchto formulacích se může velmi lišit, t.j. od méně než asi 0,5%, obvykle alespoň 1% do až 15 nebo 20% hmotnosti a bude vybrána na základě objemu tekutiny, viskozitě atd., preferovaně pro vybraný způsob podání.

Tak typická farmaceutická kompozice pro intramuskulární podání může být vyrobena tak, aby obsahovala 1 ml sterilní pufrované vody, a asi 50 mg monoklonální protilátky. Typická farmaceutická kompozice pro intravenosní podání může být vyrobena tak, aby obsahovala, například, 250 ml sterilního Ringerova roztoku a asi 150 mg monoklonální protilátky nebo rekombinantního vazebného proteinu.Aktuální metody pro přípravu kompozic pro parenterální podání budou odborníkům známé a jsou podrobněji popsány, například, v Remington's Pharmaceuticel Science, 15 vydání, Much Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), což je zde uvedeno jako odkaz.

Monoklonální protilátky a rekombinantní vazebné proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být lyofilizovány pro uskladnění a mohou být rekonstituovány vhodným nosičem před použitím. Odborníkům bude zřejmé, že rekonstituování může vést k různým stupňům ztráty aktivity protilátky a hladiny, které jsou použity, mohou toto upravit.

»

Farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu nacházejí uplatnění in vivo pro inhibici CD40/gp39 interakce. Blokování této interakce limituje jak primární, tak sekundární protilátkovou odpověď na antigeny závislé na T buňkách a produkci protilátek specifických pro tyto antigeny. Proto, monoklonální protilátky, antigen vazebné fragmenty a rekombinantní vazebné proteiny mohou být použity pro inhibici aktivace B buněk, modulování nebo inhibici autoimunitních onemocnění (např. psoriasy, revmatoidní artritidy, systémového lupus erythematodes, diabetes mellitus atd.), alergických onemocnění, orgánové rejekce nebo reakce štěpu proti hostiteli. Kompozice mohou také být použity pro zobrazení tumorů, které exprivují gp39, pokud jsou značeny detekovatelným markérem. Pokud jsou konjugovány s terapeutickým agens nebo pokud to jsou fusní proteiny s terapeutickým agens, mohou být monoklonální protilátky, antigen vazebné fragmenty a rekombinantní vazebné proteiny použity k zaměření terapeutického agens na nádorové buňky.

Farmaceutické kompozice podle předkládaného vynálezu nacházejí uplatnění in vivo pro inhibici CD40/gp39 interakce. Blokování této interakce limituje jak primární, tak sekundární protilátkovou odpověď na antigeny závislé na T buňkách a produkci protilátek specifických pro tyto antigeny.

Tento vynález je ilustrován v příkladech, které následují. Příklady jsou poskytnuty pro pochopení a nikoliv pro omezení vynálezu, jak je dán v patentových nárocích.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Generování a počáteční charakterizace monoklonálních protilátek specifických pro gp39 - fůse 1

A. Imunizace

Šest až osm týdnů staré samice BALB/c myší byly prvotně imunizovány intraperitoneálně 30 μ<3 gp39-CD8 fusního proteinu (sgp39, Holleribaughtet al., 1992, EMBO J. 11: 4313 - 4321) v obemu 100 μΐ kompletního Freundova adjuvans. O přibližně dva týdny později byly myší injikovány obdobně s tou výjimkou, že použitým vehikulem bylo nekopletní Freundovo adjuvans. 0 tři týdny později myši obdrželi pre-fusní nárazovou injekcí 23 μ$ sgp39 v objemu 100 μΐ fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS).

B. Fúse

Tři dny po pre-fusní nárazové dávce byly odebrány lymfatické uzliny (axilární, popliteální, inguinální a mesenteriální) a slezina. Byly rozřezány na malé kousky skalpelem a mírně stlačeny mezi zmrazenými skleněnými konci a skleněnými mikroskopickými sklíčky za přítomnosti nekompletního Iscovova media (Iscovovo modifikované

Dulbeccovo medium doplněné penicilinem a streptomycinem do konečné koncentrace 100 U/ml a 100 gg/ml, v příslušném pořadí) pro získání lymfocytů z pojivové tkáně. Suspenze byla jemně pipetována pro další oddělení buněk jedné od druhé a potom byla suspenze protlačena skrz buněčný filtr /Falcon 2350) pro dstranění shluků drtě pojivové tkáně. Buněčná suspenze byla promyta dvakrát centrifugací při 200 g po 10 minut a potom následovala resuspense buněčných pelet v nekompletním Iscove mediu. Po promytí bylo počítáno celkové množství životaschopných leukocytů, jak je rčeno vylučováním trypanové modři.

Fusní postup byl založen na metodě podle Lané et al., 1986 (Methods Enzymol. 121: 183 - 192). Myelomové buňky (X-63-Ag8.653, Kearney et al., 1979, J. Immunol. 123: 1548 1550) v log fázi růstu byly promyty dvakrát centrifugací při 200 g po 5 min, a potom následovala resuspense buněčných pelet v nekompletním Iscove mediu. Buňky byly potom komínovány s promytýmy leukocyty v 50 ml plastové centrifugační tubě v poměru 1:4 myelomových buněk k leukocytům a byly centrifugovány při 200 g po 10 minut. Po aspiraci media byla tuba šetrně vypuštěna, dokud se peleta buněk nestala resuspendovanou ve zbylém malém množství media. Po inkubaci tuby ve vodní lázni o 37 °C po 1 minutu bylo přidáno 1,5 ml čerstvě připraveného 37 °C polyethylen glykol - dimethylsulfoxidového roztoku (50% (hmotnost/objem) Kodak 1450 polyethylene glykol, 5% (objem/objem) dimethylsulfoxid, a 45% (objem/objem) fosfátem pufrovaný salinický roztok neobsahující žádný vápník nebo hořčík) k buňkám na 45 sekund s konstantním kroužením tuby ve 37 °C vodní lázni. Fusní směs byla potom ředěna v 50 ml 37 °C kompletního Iscove media (inkompletní Iscove medium doplněné extra 2mM L-glutaminem a 15% (objem/objem) fetálního telecího séra (FCS)) po 90 sekund následovně: 3 ml po prvních 30 sekund, 9 ml po dalších 30 sekund a zbytek po dalších 30 sekund. Tuba byla inkubována při 37 °C po 10 minut a potom byla centrifugována při 200 g po 5 minut, supernatant byl aspirován a buňky byly resuspendovány ve 120 ml hybridomového media (kompletní Iscove medium doplněné hypoxantinem (1 x 10^-4 konečná koncentrace), aminopterinem (4 x 10~⁷ konečná koncentrace), thymidinem (l,6x 10^--7 konečná koncentrace) a 10% (objem/objem) hybridomovym klonovacím faktorem (Boehringer Mannheim)). Suspenze buněk byla umístěna na šest 96 jamkových kultivačních ploten (200 gg/amku) za vzniku hustoty 243000 buněk (pre-fusních) na jamku. Buňky byly vykrmeny den 3 a 5 po fůzi nahrazením poloviny supernatantu čerstvým hybridomovým mediem a byly testovány na anti-gp39 specifické protilátky v den 8.

C. Vyšetřování

Supernatanty z buněčných kultur majících rostoucí buňky byly iniciálně vyšetřovány na reaktivitu s gp39 proteinovým imunogenem následovně, Dynatech Immulon 2EIA plotny byly potaženy 1 ^g/ml (100 /zg/jamku) protilátky 53-6 (krysí anti-myší CD8, ATCC TIB 105) v 0,05 M pufru uhličitan sodný/hydrogenuhličitan sodný pufru, pH 9,6. Plotny byly uzavřeny a inkubovány přes noc při teplotě 4 °C. Všechny následující kroky byly provedeny při pokojové teplotě. Potahovací agens bylo odstraněno a jamky byly blokovány blokovacím reagens ((ředidlo vzorků (Genetics Systems Corp.,

Settle, WA) ředěným 1:10 v deionizované vodě)) po jednu hodinu. Blokující reagens bylo odstraněno a supernatant COS buněk obsahující sgp39 protein, ředěný 1:4 v kompletním Iscove mediu obsahujícím 2% FCS (2% FCS-Iscove) byl přidán {100 ^g/jamku) a inkubován po jednu hodinu. Fusní protein byl odstraněn a jamky byly jedenkrát promyty 200 μΐ PBS-Tween (PBS obsahující 0,05% (objem/objem) Tween 20). Supernatant buněčné kultury byl potom přidán (50 ^g/jamku) a inkubován po jednu hodinu. Supernatant buněčné kultury byl odstraněn a jamky byly jedenkrát promyty PBS-Tween před přidáním křenovou peroxidasou (HRP) značeného kozího anti-myšího IgG (JAckson Immunological Laboratories) ředěného 1:100000 v blokujícím reagens a potom následovala jednohodinová inkubace. Přebytek protilátky byl odstraněn a jamky byly třikrát promyty PBS-Tween. To bylo následováno přidáním 100 ^g/jamku tetramethylbenzidinu (Genetics System Corp.) ředěného 1:100 v 0,1 M citrátového pufru, pH 5,5 obsahujícího 0,015% a 30% roztok H₂O₂. Plotny byly inkubovány po 15 minut a reakce byla ukončena přidáním 3N kyseliny sírové (50 ^g/jamku). Optická densita byla měřena při 450/630 nm na Bio-Tek Instruments EL312 čtečce mikroploten.

Ty supernatanty buněčných kultur, o kterých bylo zjištěno, že jsou pozitivní ve vazbě sgp39 byly potom testovány na vazbu na CD72-CD8 fusní protein (sCD72) pro hodnocení protilátek specifických pro gp39 více než myší CD8 část fušního proteinu. Popis konstrukce chimérického genu kódujícího sCD72 a exprese fusního proteinu v COS buňkách je popsána Hollenbaught et al., 1992 (zde citováno jako odkaz ve své úplnosti). ELISA test na vazbu na sCD72 byl identický jako ten, který je popsán pro sgp39 s tou výjimkou, že byl použit neředěný supernatant COS buněk obsahující SCD72 místo sgp39.

Všechny supernatanty, které byly reaktivní s sgp39 a nikoliv s sCD72 byly potom testovány na svou schopnost inhibovat azbu CD40-Ig fusního proteinu na sgp39. Stručně, Dynatech Immulon 2 EIA plotny byly potaženy protilátkou 53-6 jak je popsáno výše. Jamky byly blokovány a promyty jak je uvedeno výše a supernatant COS buněk obsahující sgp39 ředěný 1:4 ve 2% FCS.Iscove byl přidán (100 /xg/jamku) a inkubován po ednu hodinu. sgp39 byl odstraněn a plotny byly promyty 200 μΐ PBS Tween. Byly přidány supernatanty kultur (50 pg/jamku) a byly inkubovány po jednu hodinu, pak odstraněny a jamky byly promyty jedenkrát PBS-Tween. Purifikovaný CD40-Ig fusní protein (EP 555880) byl potom ředěn na ^g/ml v 2% FCS-Iscove, přidán do všech jamek (50 pg/jamku) a plotny byly inkubovány po jednu hodinu. Přebytek fusního proteinu byl odstraněn a jamky byly jedenkrát promyty PBS-Tween před přidáním křenovou peroxidasou (HRP) značeného kozího anti-lidského IgG (Jackson Immunological Laboratories) ředěného 1:10000 v blokujícím reagens (50 pg/jamku). Po jednohodinové inkubaci při pokojové teplotě bylo HRP značené reagens odstraněno a plotny byly promyty třikrát PBS-Tween. Odhalení navázaného HRP značeného reagens a měření výsledné optické density bylo stejné, jako je popsáno v ELISA popsané výše.

D. Klonování

Bylo nalezeno množství jamek, které obsahovaly protilátku specifickou pro gp39 a které inhibovaly interakci gp39 s jeho ligandem CD40 v ELISA. Buňky rostoucí v těchto jamkách byly potom klonovány a podrobeny dalším vyšetřovacím kriteriím.

Klonování bylo iniciováno mini-cloning procedurou, ve které buňky z označených originálních jamek byly nejprve umístěny v hustotě 10 nebo 20 buněk na jamku na 96 jamkové buněčné kultivační plotny s plochým dnem. Byly vyrobeny edna nebo dvě plotny na každou původní jamku v kultivačním mediu kompletního Iscove media doplněného 10% (objem/objem) hybridomním klonovacím faktorem (klonovací medium) v objemu 200 gg/jamku. Buňky byly kultivovány po 7 nebo 8 dní a potom byly supernatanty znovu testovány na gp39 reaktivitu a schopnost inhibovat vazbu CD40-Ig na gp39 fusní protein ELISA (popsáno výše). Z jamek každé miniklonovací sady, která vyhověla těmto kriteriím, byla jedna klonována. Buňky byly odstraněny z vybraných jamek a byly ředěny na takovou koncentraci v klonovacím mediu, která poskytla kalkulovanou densitu jedné buňky na každé dvě jamky. Buňky byly umístěny na dvě poloviční oblasti 96 jamkových buněčných kultivačních ploten (Costar) v objemu 100 nebo 150 qg/jamku.

Po pěti nebo šesti dnech kultivace byly jamky vyšetřovány na invertovaném mikroskopu a byly označeny jamky obsahující jeden klon. Po dalších třech až čtyřech dnech kultivace byly supernatanty ze všech jamek testovány na gp39 reaktivitu (gp39-CD8 fusní protein ELISA, popsáno výše) a na schopnost inhibovat vazbu CD40-Ig na gp39-CD8 ELISA (popsáno výše). Supernatanty z jamek, které byly reaktivní s gp39-CD8, blokovaly interakci CD40-Ig s gp39-CD8 a pocházely z jamek obsahujících jeden klon byly dále vyšetřovány na jejich schopnost vázat se na Jurkat T buněčnou linii, která konstitutivně exprivuje gp39 na svém povrchu (BMS-10,

R.Mittler, Bristol-Myers Squibb) a a na schopnost blokovat vazbu CD40-Ig fušního proteinu na tyto buňky. Klony, které vyhověly těmto dalším dvěma kriteriím, byly vybrány pro další studium.

Vazba protilátek na BMS-10 buňky byla určena fluorescentní analýzou buněk. Stručně, 250000 BMS-10 buněk bylo spočítáno, přidáno do každé tuby a centrifugováno při 250 g po 5 minut. Kultivační medium bylo aspirováno a 100 μΐ každého supernatantu obsahujícího protilátku reaktivní s gp39-CD8 v ELISA bylo přidáno do tuby. Kontroly obsahovaly pouze kultivační medium nebo kultivační medium obsahující negativní kontrolní myší monoklonální protilátku. Směs byla inkubována na ledu po 30 minut a potom byly přidány 2 ml 2% FCS-Iscove media. Tuby byly centrifugovány při 250 g po 5 minut a supernatant byl odebrán. FITC značený F(ab')₂ kozí anti-myší IgG F(ab') (Jackson Immunological Laboratories) byl ředěn 1:500 ve 2% FCS-Iscove a bylo přidáno 100 μΐ do každé tuby.

Po 30 minutové inkubaci na ledu byly buňky dvakrát promyty 1 ml 2% FCS-Iscove a resuspendovány v 250 μΐ 2% FCS-Iscove před analýzou na Becton Dickinson FACSan™.

Hodnocení schopnosti protilátek blokovat vazbu CD40-Ig na BMS-10 buňky využívalo výše popsané procedury s tou výjimkou, že po promytí nenavázané anti-gp39 protilátky byl do každé tuby přidán CD40-Ig, 100 μ9/^^, ředěný na 20 ^g/ml v 10% FCS-Iscove. Po 30 minutové inkubaci na ledu byly do každé tuby přidány 2 ml 2% FCS-Iscove, tuby byly pět minut centrifugovány při 250 g a supernatant vyl aspirován pro odstranění nenavázaného CD40-Ig. Místo FITC značeného anti-myší Ig reagens byl přidán do každé tuby vhodně ředěný

PE- nebo FITC-značený F(afc>')₂ kozí anti-lidský IgG (Jackson Immunological Laboratories) pro detekci navázaného CD40-Ig. Test byl dokončen a buňky byly analyzovány jak je popsáno výše.

Podle postupu popsaného výše bylo odvozeno celkem 23 myších anti-lidský gp39 monoklonálních protilátek. Každá monoklonální protilátka byla izotypována pro určení její IgG podtřídy a její schopnost rozpoznávat gp39 byla dále charakterizována. Analýza rozdíly epitopové specificity mezi monoklonálními protilátkami byly také provedeny, podle schopnosti protilátek inhibovat na T buňkách dependentní proliferaci B buněk a produkci imunoglobulinů.

Příklad 2

Generování a počáteční charakterizace krysích monoklonálních protilátek specifických pro gp39 - fůse 5

A. Imunizace

Čtyři týdny staré samice Lewis krys byly imunizovány 50 M9 gp39-CD8 fusního proteinu (Hollenbaughtet et al.) suspendovaného v objemu 400 μΐ Ribi adjuvans (Ribi Immunochem) podle návodu výrobce. Z tohoto objemu bylo 200 μΐ podáno intraperitoneálně (IP) a zbývající objem byl rovnoměrně rozdělen do dvou subkutáních míst. O tři týdny později byla zvířata reimunizována IP 300 μΐ PBS obsahujícího 50 μΐ gp39-CD8 fusního proteinu. O měsíc později byla tato zvířata znovu imunizována IP 300 μΐ PBS obsahujícího 30 μΐ gp39-CD8 fusního proteinu.O tři a půl týdnu později tyto krysy obdržely intravenosní (IV) pre-fusní nárazovou injekcí 30 μ<3 gp39-CD8 v objemu 300 μΙΡΒδ.

B. Fuse a vyšetřování

O tři dny později bylo odebrání, příprava a fůze krysích buněk lymfatických uzlin a sleziny s myšímy myelomovými buňkami provedeny jako v případě fuse 1 popsané v příkladu 1 s následujícími modifikacemi. Krysí leukocyty byly fúsovány s variantou X63-Ag8.653 myší myelomové buněčné linie nazvané H10 která byla transformována genem resistence G^41S. Suspenze buněk z každé fúse byla umístěna na sedm 96 jamkových kultivačních ploten v hustotě 236000 buněk (pre-fusních) na jamku a byla kultivována v hybridomovém mediu doplněném finální koncentrací 0,25 mg/ml geneticinu.

Supernatanty v buněčných kultivačních jamkách ve fúsi 39-5 byly vyšetřovány na specifickou reaktivitu s gp39 za použití gp39-CD8 a CD72-Cd8 fusních proteinů v ELISA jak je popsáno v příkladu 1 s následujícími dvěma modifikacemi. Myší anti-myší CD8 monoklonální protilátka produkovaná 116-13.1 hybridomem (ATCC HB 129) v koncentraci 5 ^g/ml byla použita jako záchytná protilátka pro fúsní proteiny místo 53-6 protilátky a HRP značený anti-krysí IgG (Fc specifický) (Jackson Immunological Laboratories) v ředění 1:20000 byl použit jako sledovací protilátka pro detekci vazby anti-fúsní protein protilátky místo HRP značeného kozího anti-myšího IgG. Byly nalezeny čtyři jamky obsahující protilátku specifickou pro gp39-CD8 a ne pro CD72-CD8 fúsní protein. Z těchto protilátek byla nalezena pouze jedna (39-5.6E9), která barvila gp39+

4Ί buněčnou linii BMS-10 při vyšetřování průtokovou cytometrií jak je popsáno výše. Supernatant z této jamky byl potom určen jako kompletně blokující vazbu CD40-Ig na gp39-CD8 za použití blokující ELISA jak je popsáno výše a jako kompletně inhibující vazbu CD40-Ig na BMS-10 buňky při hodnocení průtokovou cytometrií. Klonální buněčná linie vlastnící všechny výše uvedené charakteristiky byla získána mini-cloning/klonovacím procesem popsaným výše.

Příklad 3

Generování a počáteční charakterizace monoklonálních protilátek specifických pro gp39 - fůse 7

A. Imunizace

Šest až osm týdnů staré samice BALB/c myší byly prvotně imunizovány subkutánně 30 /zg gp39-CD8 fušního proteinu kompletním Freundově adjuvans. O přibližně dva a pět týdnů později byly tyto myši injikovány obdobně 30 /zg a 25 /zg, v příslušném pořadí, gp39-CD8 s tou výjimkou, že vehikulem pro antigen bylo nekompletní Freundovo adjuvans. Pět týdnů po prvotní imunizaci byly tyto myši injikovány intraperitoneálně 10 /zg fúsního proteinu v nekompletním Freundově adjuvans.

O dva týdny později myši obdrželi intravenosní pre-fusní nárazovou injekcí 30 /zg gp39-CD8 fušního proteinu v PBS.

B. Fúse a vyšetřování

O tři dny později bylo odebrání, příprava a fůze myších buněk lymfatických uzlin a sleziny s myšímy myelomovými buňkami provedeny jako v případě fúse 39-1 s tou výjimkou, že byl použit pouze 1 ml polyethylene glykolu pro fúsi buněk. Suspenze buněk vzniklá z této fúse byla umístěna na 10 96 jamkových kultivačních ploten v hustotě 183000 buněk (pre-fusních) na jamku. Jamky byly vykrmeny v den 3 a 6 po fúsi nahrazením poloviny supernatantu čerstvým hybridomovým mediem a testovány na anti-gp39 specifickou protilátku v den 9.

Supernatanty byly nejprve vyšetřovány na anti-gp39 specificitu v ELISA testu vazby buněk. Falcon a Costar 96 jamkové plotny s plochým dnem byly potaženy 3,5 gg/cm²Cell-Tak (Collaborative Biomedical Products ředěný v 0,1 M bikarbonátu sodného, pH 8,0. Plotny byly inkubovány při pokojové teplotě po 30 minut. Nenavázaný Cell-Tak byl aspirován a jamky byly promyty dvakrát 150 μg/jamku ze skla destilované vody. BMS-10 buňky byly centrifugovány a resuspendovány do koncentrace 2 x 10^s buněk/ml v séru prostém Iscove mediu. 50 μΐ této suspenze buněk bylo přidáno do každé jamky a plotny byly centrifugovány po 5 minut při 250 g. Plotny byly potom inkubovány při pokojové teplotě po 30 minut a potom bylo medium aspirováno z jamek za použití osmikánálového zařízení (Drummond). Supernatanty kultur byly potom znovu umístěny na testovací plotny, 50 μΐ/jamku, a plotny byly inkubovány po 1 hodinu. Supernatanty byly aspirovány a plotny byly inkubovány po jednu hodinu. Supernatanty byly aspirovány a plotny byly promyty jedenkrát 150 μΐ/jamku PBS obsahujícím 1% FCS. Byl přidán HRP značený anti myší IgG (Zymed) ředěný v PBS obsahujícím 5% FCS, 50 μΐ/jamku. Po jednohodinové inkubaci při pokojové teplotě bylo HRP značené reagens odstraněno a plotny byly promyty třikrát

PBS obsahujícím 1% fetální telecí sérum. Znázornění vazby HRP značeného reagens a měření výsledné optické density bylo provedeno jak je popsáno v jiných ELISA testech výše.

Jako sekundární vyšetření byly supernatanty z pozitivních amek v BMS-10 ELISA testovány na reaktivitu s gp39 a sCD72 za použití ELISA příslušného fušního proteinu jak bylo popsáno dříve. V tomto testu HRP značený anti myší IgG (Zymed) nahradil kozí anti myší IgG použitý v dříve popsaných testech. Potvrzení specifické reaktivity s gp39 pozitivními BMS-10 buňkami bylo potom provedeno za použití nepřímé imunofluorescenční a FACS analýzy jak bylo popsáno dříve. Supernatanty byly také testovány na svou schopnost inhibovat CD40-Ig vazbu na sgp39 za použití blokující ELISA jak bylo popsáno dříve. Supernatanty byly dále analyzovány jako jejich izotypy za použití gp39-CD8 ELISA s jednou modifikací. Každý supernatant byl testován čtyřnásobně a navázaná anti-gp-39 protilátka byla potom znázorněna čtyřmi různými HRP značenými anti myšími izotypově specifickými reagens (Zymed, krysí anti myší IgGl, IgG2a nebo IgG2b, č. 04-6120, 04-6220 nebo 04-6320, v příslušném pořadí, a králičí anti myší IgG3, č. 61-0420). Tato analýza identifikovala jednu jamku, která obsahuje protilátku specifickou pro gp39 exprivovaný na povrchu buněk, která blokuje vazbu CD40-Ig na gp39-CD8 a která má IgG2a izotyp. Vhodné protilátky produkující buňky z jamek označených 39-7.3E12, 39-7 7.7G4 a 39-7.4C1 byly miniklonovány a klonovány jak bylo popsáno dříve.

Příklad 4

Generování a počáteční charakterizace monoklonálních protilátek specifických pro gp39 - fůse 9

A. Imunizace

Šest až osm týdnů staré samice BALB/c myší byly prvotně imunizovány subkutánně ve čtyřech místech celkem 30 ptg gp39-CD8 fusního proteinu v kompletním Freundově adjuvans.

O dva, pět, 28 a 30.5 týdnů později byly tyto myši injikovány obdobně 30 μg, 25 ^g, 25 μ$ a 25 μg_l v příslušném pořadí, gp39-CD8 v nekompletním Freundovo adjuvans. O tři týdny později myši obdrželi intravenosní pre-fusní dosycovací injekci 35 μg gp39-CD8 v PBS.

B. Fúse a vyšetřování

O tři dny později bylo odebrání, příprava a fůze myších buněk lymfatických uzlin a sleziny s myšímy myelomovými buňkami X63-Ag8.653 provedeny jako v případě fúse 39-1 s tou výjimkou, že poměr myelomových buněk byl jako pro fůsi 39-1 s výjimkou toho, že poměr myelomových buněk k leukocytům byl 1:3 místo 1:4. Suspenze buněk vzniklá z této fúse byla umístěna na 15 96 jamkových kultivačních ploten v hustotě 187000 buněk (pre-fusních) na jamku.

Supernatanty z buněčných kulitavačních jamek ve fůsi 39-9 byly vyšetřovány na anti-gp39 protilátky za použití vazby BMS-10 buněk ELISA jak bylo popsáno dříve. Všechny pozitivní supernatanty z tohoto vyšetření byly potom vyšetřeny na svou schopnost blokovat vazbu CD-40-Ig na gp39-CD8 za použití dříve popsané blokující ELISA. Bylo zaznamenáno množství buněk pozitivních na obě kriteria.

Aby se identifikovaly ty jamky, které obsahují protilátku s gp39 epitopovou specificitou, která se liší od dříve identifikovaných anti gp39 monoklonálních protilátek, byl každý CD40-Ig blokující, BMS-10 pozitivní supernatant vyšetřován ELISA na sérii gp39 mutantních proteinů které byly popsány dříve pro analýzu epitopů protilátek z fůse 1. Toto vyšetření identifikovalo několik jamek, včetně 39-9.27, 39-9.68, 39-9.246 a 39-9.274, pro které zde nebyla signifikantní ztráta vazby na jakýkoliv z vyšetřovaných mutantů.

Kromě toho, jamka označená 39-9.11 vykazovala signifikantně redukovanou vazbu na K143/A a zejména na N180/A mutaty, což nebylo dříve pozorováno. V tomto testu bylo také ukázáno, že tyto supernatanty rozpoznávají nativní sgp39 a nikoliv negativní kontrolní sCD72 fusní protein. Vhodná protilátku secernující klonální buněčná linie pro každou z těchto pěti jamek byla získána klonováním s limitovaným ředěním jak bylo popsáno dříve. Následující analýza průtokovou cytometrií klonované monoklonální protilátky z každé z těchto buněčných linií ukázala, že jsou specificky reagující s BMS-10 buněčnou linií a že jsou všechny schopné blokování interakce CD-40 Ig s touto buněčnou linií. Každá z těchto monoklonálních protilátek byla izotypována jak je popsáno dále a všechny kromě 39-9.36, která byla myší IgG2b, byly myší IgGl.

Příklad 5

Charakterizace anti gp39 monoklonálních protilátek

A. Izotypizace

Každá z myších monoklonálních protilátek získaných výše uvedenými postupy byla izotypována pro identifikaci své IgG podtřídy za použití Isotype Ab-Stat Kit™ (SangStat Medical Corporation, Menlo Park, CA) nabo ISOStrip™ kitu (Boehringer Mannheim) podle návodu výrobce.Izotyp krysí monoklonální protilátky získané ve fůsi 5 (39-5.6E9) byl stanoven za použití gp39-CD8 fúsního proteinu ELISA jak bylo popsáno dříve s tou výjimkou, že křenovou peroxidasou značené monoklonální protilátky specifické pro krysí IgGl, IgG2a, IgG2b a IgG2c (Zymed Laboratories, San Francisko, CA) v ředění 1:1000 byly jednotlivě použity jako stopovací protilátky. Jedinou stopovací protilátkou, která se navázala na 39-5.6E9 byla anti-krysí IgG2a protilátka, což ukazuje, že tato monoklonální protilátka je IgG2a.

Monoklonální protilátky získané ve fůsi 7 byly analyzovány na svůj izotyp za použití sgp39 ELISA s jedinou výjimkou. Každý supernatant byl testován čtyřikrát a navázaná anti gp39 protilátka byla potom vyhledána čtyřmi různými HRP značenými anti myšími izotypově specifickými reagens (Zymed, krysí anti myší IgGl, IgG2a nebo IgG2b, v příslušném pořadí, nebo králičí anti myší IgG3). Izotypy monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu jsou ukázány v tabulce 1.

B. Wester Blot a imunoprecipitace

Hodnocení Western blotem bylo provedeno dvěma různými postupy. V jednom bylo 1,5 /xg purif ikovaného sgp39 fúsního proteinu ve 300 μΐ zavedeného barviva (250 mM Tris, 0,002% (objem/objem) bromfenolová modř, 40% (objem/objem) glycerol, pH 6,8, 15 μΐ 20% SDS, 10 μΐ 2 - merkaptoethanol) elektroporováno do 12% SDS-polyakrylamidového gelu při 150 V po 1 hodinu. Separované protieny byly transferovány na nitrocelulosový papír BioRad mini blot přenosovým aparátem podle návodu výrobce. Po přenosu byla nitrocelulosa sušena při pokojové teplotě a potom byla každá linie vystřižena ze vrstvy jako široký vertikální proužek, který byl jednotlivě umístěn do jamek BioRad mělké jamkové jednotky. Proužky byly inkubovány v 10 ml blokujícího roztoku Tris pufrovaného salinického roztoku obsahujícího 5% (hmotnost/objem) netučného sušeného mléka (TBS-T) po 2 hodiny při pokojové teplotě na houpacím zařízení pro ploché desky. Po inkubaci byl blokující roztok aspirován a proužky byly dvakrát vypláchnuty TBS-T.

Anti-gp39 monoklonální protilátka byla naředěna do koncentrace okolo 12 Mg/ml v TBS-T a 3 ml roztoku protilátky byly přidány ke každému proužku, jedna protilátka na proužek, po 2 hodiny při pokojové teplotě s houpáním.

Přebytek roztoku protilátky byl aspirován z každé jamky a proužky byly pětkráte promyty 10 ml TBS-T. Po promytí bylo přidáno do každé jamky 10 ml 1:3000 ředění HRP kozího anti myšího Ig (Tágo) v TBS-T. Proužky byly inkubovány po 2 hodiny při pokojové teplotě a potom pětkrát promyty jak bylo popsáno výše.

Detekce vazby HRP konjugované protilátky byla provedena za použití ECL detekčního činidla (Amersham) podle návodu výrobce. Detekční roztok byl aspirován a přebytek tekutiny na proužcích byl odstraněn dotykem konce proužku na papírovou utěrku. Proužky byly seřazeny do plastového ochranného obalu a ten byl uzavřen. Uzavřený obal byl potom vystaven autoradiografickému filmu po různou časovou periodu (1 sekunda až 15 minut) a film byl potom zpracován.

Ve druhém postupu bylo 200 μΐ vyčerpaného supernatantů z COS buněk transfektovaných sgp39 ředěno 25 μΐ zavedeného barviva, zahřáto na 100 °C po dobu 5 minut, ochlazeno na ledu a elektroforesováno na 10% SDS-polyakrylamidovém gelu. Separované proteiny byly transferovány do Bio-Rad PVDF™ membrány za použití Hoeffer semi-suchého přenosového přístroje podle návodu výrobce. Po přenosu separovaných proteinů na membránu byly membrány sušeny při pokojové teplotě a potom byl postup popsaný výše následován barvením membrán.

Anti gp-39 protilátky byly také testovány na schopnost imunoprecipitovat gp39 bud' z transfektovaných COS buněk nebo z aktivovaných T buněk. Stručně, COS buňky byly transfektovány cDNA kódující lidský gp39 DEAE-dextranovým postupem za použití 150 mm ploten v přibližně 70% konfluenci. Následující den byly COS buňky trypsinizovány a přemístěny do osmi T-150 cm² nádobek. Medium bylo odstraněno po inkubaci přes noc a buňky byly jedenkráte promyty modifikovaným Eagle mediem bez cysteinu nebo methioninu (Gibco-Select amine Kit) a potom bylo přidáno 20 ml čerstvého cystein/methionin prostého media obsahujícího 0,02 mCi/ml Tran ^3sS značky (ICN, Costa Mesa, CA) a buňky byly inkubovány přes noc. Následuj ící den bylo medium odstraněno a buňky byly vypláchnuty jedenkrát PBS a 2 ml lýzovacího pufru (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% deoxycholát) obsahujícím 1 nM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF) a do každé nádobky bylo přidáno 25 /xg/ml aprotininu. Nádobky byly na 10 minut umístěny na led a potom byl pufr odstraněn. Aliquoty byly připraveny a centrifugovány na mikrofuse při 4 OC při maximální rychlosti po 2 minuty. Supernatanty byly poolovány a uskladněny při -70 °C před imunoprecipitací.

Imunoprecipitace byla provedena roztáním lyzátů transfektovaných COS buněk na ledu a rozdělením celkového objemu do 10 aliquot. Do osmi tub bylo přidáno 10 ptg anti-gp39 protilátky, zatímco do jedné tuby byl přidán CD40 Ig jako pozitivní kontrola a do jedné nebylo přidáno žádné precipitační agens jako negativní kontrola. Vzorky byly inkubovány na ledu po 4 hodiny a potom byla do každé tuby přidáno 100 μΐ Protein G Sepharose FF™ (Pharmacia).

Tuby byly inkubovány na ledu po 1 hodinu s míšením každých 10 až 15 minut. Vzorky byly pulsně odděleny v mikrofuse a supernatant byl odložen. Pelety byly promyty resuspendováním a peletováním třikrát chladným lyzačním pufrem a potom jedenkrát chladným PBS. Po posledním promytí byly přidáno do každé tuby 30 μΐ SDS zaváděcího pufru obsahujícího β-merkaptoethanol. Vzorky byly zahřátý na 95 °C po 5 minut, pulsně odděleny a supernatant byl zaveden na 12% SDS polyakrylamidový gel. Po dokončení elektroforesy byl gel umístěn na 10% methanol, 10% kyselinu octovou ve vodě na dvě hodiny. Gel byl potom umístěn v Amplify™ fluorografickém agens (Amersham) obsahujím 10% glycerol po 15 minut. Gel byl sušen na Whatman 3M papíru ve vakuu při 80 °C po 45 minut a potom byl vystaven rentgenovému filmu při -70 °C po 1 až 7 dní. Výsledky tetsu jsou shrnuty v tabulce 1. Pozitivní imunoprecipitace byly ukázány přítomností proužku stejné molekulární hmotnosti jako má CD40-Ig kontrola.

Radioimunoprecipitace gp39 a aktivovaných T buněk lidské periferní krve byla provedena následovně. Čerstvá heparinizovaná plná krev byla ředěna 1:1 s PBS a 40 ml bylo překryto 10 ml Lymfocyte Separation Media™ (Organon Teknika) jak je popsáno výše. Vzorky byly centrifugovány po 30 minut při 220 g. Izolované lymfocyty byly promyty PBS a resuspendovány v modifikovaném Eagle mediu bez cysteinu a methioninu obsahujícím 10% dialyzované fetální telecí sérum a 0,02 mCi/ml Tran ^3SS Label™ do konečné density buněk 3 x 10^e buněk/ml. Buňky byly aktivovány přidáním PMA (10 ng/ml) a ionomycinu (1 gg/ml) po devět hodin, potom byly buňky peletovány, medium odstraněno a byla provedena lýza buněk lyzačním pufrem obsahujícím PMSF a aprotinin. Buňky byly inkubovány s lyzačním pufrem po 10 minut na ledu před přenosem vzorku do mikrofugačních tub a před centrifugací při 4 °C po 2 minuty.Precipitace byla provedena jak je popsáno výše pro transfektované COS buňky a výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1

Shrnutí anti - lidský gp39 mAb

— mAb	— izotyp\|	1 vazba na \| gp39+ \| Jurkat buňky \| I	— inhibice \| vazby CD-40-Ig \| na gp39+ Jurkat buňky	1 Western \| blot \| sgp39 \| 1	radioimuno precipita
39-1.3	IgGl	+	+	-	+ (a)
39-1.7	IgG2b	+	+	-	+(a.b)
39-1.21	IgGl	+	+		ND
39-1.25	IgGl	+	ND	-	ND
39-1.26	IgGl	+	+	-	+(a.b)
39-1.29	IgG2a	+	+	+	+ (a)
39-1.37	IgGl	+	+	-	ND
39-1.52	igGi	+	+	+	ND
39-1.59	igGi	+	+	-	ND
39-1.61	igGi	+	+	+	+ (b)
39-1.63	igGi	+	+	-	ND
39-1.77	igGi	+	+	+	+(a.b)
39-1.93	IgGl	+	+	+	ND
39-1.106	igGi	+	+	+	+ (b)
39-1.109	igGi	+	+	+	ND
39-1.122	IgG2b	+	+	-	ND
39-1.123	IgGl	+	+	-	ND
39-1.124	IgGl	+	+	+	ND
39-1.128	IgG2b	+	+	-	+
39-1.132	IgG2b	+	+		+
39-1.134	IgGl	+	+	+	+
39-1.138	igGi	+	+		ND
39-1.156	igGi	+	+	+	ND
39-7.3E12	IgG2a	+	+	-	ND
39-5.6E9	IgG2a	+	+	-	ND
39-7.7G4	IgG2a	+	+	+	ND
39-9.27	IgGl	+	+	+	ND
39-7.4C1	IgG2b	+	+	+	ND
39-9.68	IgG2b	+	+	+	ND
39-9.246	IgGl	+	+	+	ND
39-9.11	igGi	+	+	-	ND
39-9-274	IgGl	+	+	+	ND

a radioimunitní precipitát z gp39 transfektovaných COS buněk.

b radioimunitní precipitát z aktivovaných lidských T buněk

ND- neprovedeno

C. Vyšetření vazby anti-lidský gp39 monoklonálních protilátek na aktivované a neaktivované normální lidské T buňky

Reaktivita různých anti-lidský gp39 monoklonálních protilátek s aktivovanými a neaktivovanými normálními lidskými T buňkami byla hodnocena nepřímou fluorescencí, po které následovala FACS analýza. Lidské krevní mononukleární buňky (PBBMC) byly izolovány ředěním plné krve (1:1) s PBS a 25 ml bylo překryto 10 ml Lymfocyte Separation Media (LSM, Organon Teknika) a centrifugováno 25 minut při 450 g.

Buňky v rozhraní byly shromážděny a jedenkrát promyty v PBS. T buňky byly izolovány inkubací PBMC se 150-krát AET-SRBC (ovčí červené krvinky ošetřené 0,143 M 2-aminoethylisothiouroniumbromidem (Sigma)) po 5 - 10 minut na ledu. E-rozety pozitivní T buňky (E-T buňky) byly separovány ze zbývajících buněk pokrytím chladným LSM a centrifugací po 25 minut při 450 g. Pelety (obsahující rozety T buněk) byly shromážděny a ovčí erytrocyty byly lyžovány 0,83% chloridem amonným po 5 minut při pokojové teplotě. Výsledné T buňky byly jedenkrát promyty 2% FCS-Iscove a byly ínkubovány přes noc v 10% FCS-Iscove při 1 - 3 x 10^e buněk/ml v humidifikovaném 37 °C C/6% C0₂ inkubátoru. T buňky byly potom aktivovány přidáním 10 ng/ml forbol-12-myristate-13-acetáte (PMA) (Sigma) a 1 ^g/ml ionomycinu (Sigma) a další inkubací buněk po 5 - 6 hodin. Část T buněk, které nedostaly PMA a ionomycin, ale byly inkubovány po dalších 5-6 hodin je zde označována jako neaktivované T buňky. Nepřímá imunofluorescence a FACS analýza anti lidský gp39 mAb na těchto aktivovaných a neaktivovaných T buňkách byla provedena jak je popsáno dříve pro FACS analýzu anti gp39 protilátek na BMS-10 buňkách s výjimkou toho, že FITC značený kozí anti myší IgG (Becton Dickinson) byl použit jako reagens druhého kroku. Kromě toho, myší anti lidský CD69 monoklonální protilátka (Becton Dickinson) byla použita jako pozitivní kontrola pro aktivaci T buněk. Tímto způsobem byly vyšetřeny všechny anti-gp39 mAb. Všechny barvily aktivované T buňky a byly kompletně nereaktivní s neaktivovanými T buňkami.

Příklad 6

Konstrukce gp39 mutantních fúsních proteinů

A. Selekce gp39 residuí pro substituci

Residua pro mutagenesi na gp39 byla vybrána na základě dříve odvozeného srovnávacího proteinového modelu gp39 extracelulárního regionu (Aruffo et al., 1993, Cell 72: 291 - 300), na základě na struktuře založeného seřazení gp39 vs TNFfi a na základě popsaných krystalografických kontaktů ve struktuře TNFS/TNFR komplexu (Banner et al., 1993, Cell 73:

431 - 445) . Počítačová grafická analýza gp39 modelu byla provedena za použití Insigh n™ (BIOSYM Technologies lne.,

San Diego, CA) na Silicon Graphic Indigo workstation.

Sekvence byly nejprve seřazeny za použití GCG programů (Genetics Computer Group lne., Madison, WI) a byly manuálně modifikovány za použití trojrozměrné informace a působením TNFE (Eck et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 2119 - 2122) a TNFS/TNFR krystalické (Banner et al., výše) struktury.

B. Konstrukce gp39 mutantů

Aminokyselinové substituce a silentní mutace pro diagnostická štěpící místa pro restrikční enzymy byla zavedena do cDNA fragmentů kódujících extracelulární doménu gp39 za použití převrstvovacího prodlužovacího PCR protokolu (Ho et al., 1989, Gene 77: 51 - 59). Fúsní geny kódující mutantní solubilní gp39 (sgp39) proteiny byly připraveny subklonováním PCR amplifikovaného gp39 mutantů extracelulární domény do savčích expresních vektorů obsahujících cDNA fragment kódující extracelulární doménu myšího CD8 (Lyt 2a) (Hollenbaught et al., 1992, EMBO J. 11: 4313 - 4321). Forward a reversní PCR primery použité pro gp39 konstrukty byly popsány dříve (Hollenbaught et al., výše).

PCR primery použité pro gp39 mutanty jsou:

E129/A ^AATCCTCCAAATGCGGCACATGTGATCAGTGCGGCC AGCA GTAAAACAACA 3'

SEQ ID NO. 1

S131/A-T135/A

5CAAAATGCGGCACATGTGATCAGTGAGGCCGCCAG TAAAA CAGCATCTGTGTGTTACAGTGGGCT 3'

SEQ ID NO. 2

K143/A

5AGTAAAACAACATCTGTGCTGCAGTGGGCTGAAGCA GGAT ACTACACCATGAGC 3'

SEQ ID NO. 3

Y145/A

5AGTAAAACAACATCTGTGCTGCAGTGGGCTGAAAAA GGAG CCTACACCATGAGCAACACT 3'

SEQ ID NO. 4

N180/A

5'CAAGTCACCTTCTGTTCCGCTCGGGAGGCTTCGAGTC AAG CTCCA 3'

SEQ ID NO. 5

F201/A-E202/A

5'AGCCTCTGCCTAAAGTCCCCQGGGAGAGCCGCGAGA ATCT TACTCAGAGCT 3'

SEQ ID NO. 6

Korespondující reversní primery jsou reversní compliment sekvencí uvedených výše. Změny baží, které kódují aianin, jsou vyznačeny silným písmem. Přidaná nebo deletovaná diagnostická restrikční místa jsou podtržena.

C. Produkce a charakterizace přirozených a mutantních gp39 proteinů

Přirozené a mutantní gp39 proteiny byly produkovány z transientné transfektováných COS buněk jak je popsáno jinde (Hollenbaught et al., 1992, výše; Noelle et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6550 - 6554). COS buňky byly transfektovány za použití DEAE-dextranu. 48 hodin po transfekci byl sklízen supernatant kulotury obsahující solubilní přirozený gp39 a solubilní mutantní gp39 a byl testován na vazbu monoklonální protilátky a na určení epitopových specificit na lidském gp39.

D. Enzym vázaný imunotest na vazbu monoklonální protilátky na gp39 mutantní proteiny

Výsledky Western blot analýzy ukazují, že byly rozpoznávány alespoň dva různé epitopy na lidském gp39-CD8 fúsním proteinu. Monoklonální protilátky 39-1.29, 39-1.52, 39-1.61, 39-1.77, 39-1.93, 39-1.106, 39-1.109, 39-1.124, 39-1.134, 39-1.156, 39-7.7G4, 39-9.274, 39-9.27, 39-7.4C1, 39-9.68 a 39-9.246 se vázaly na gp39-CD8 ve Western blotu, zatímco ostatní protilátky nikoliv. Aby se dále definovaly epitopy rozpoznávané generovanou monoklonální protilátkou, byla každá z nich testována ELISA na vazbu na sérii gp39 mutantních proteinů obsahujících jednobodové nebo dvoubodové mutace, které nahrazují přirozené aminokyseliny alaninem.

Použitý ELISA test byl proveden následovně. Immulon 2 EIA plotny byly potaženy 100 /zg/jamku 0,8 Mg/ml roztokem monoklonální protilátky specifické pro myší Lyt 2 nebo 2.1 (53-6 (ATCC TIB 105) nebo 116.13-1 (ATCC HB 129) pro fúsi 5) ředěné v 0,05 M pufru uhličitan sodný/hydrogenuhličitan sodný, pH 9,6. Plotny byly uzavřeny a inkubovány přes noc při 4 °C.

Po inkubaci byla nenavázaná protilátka odstraněna a plotny byly blokovány po jednu hodinu ředidlem vzorku (Genetics Systems Corporation) ředěným 1:10 v deionizované vodě. Po odstranění blokujícího agens bylo přidáno 50 qg/jamku vhodně ředěného supernatantu COS buněk obsahujícího přirozený nebo mutantní gp39-CD8 fúsní protein nabo negativní kontrolu sCD72 fúsní protein. Po dvouhodinové inkubaci při pokojové teplotě byly fúsní proteiny odstraněny a plotny byly jedenkrát promyty 200 gg/jamku PBS-Tween. Supernatanty kultur obsahující gp39 specifické protilátky byly vhodně ředěny (viz níže) v 10% Iscove a každý byl přidán (50 gg/jamku) dvakrát do jamek obsahujících gp39 nebo kontrolní fúsní proteiny. Jako kontrola bylo přidáno 50 /zg/jamku biotynylované krysí anti-myší CD8 (viz níže) do každé různé fúsní proteiny obsahující jamky pro potvrzení toho, že v každé jamce je přítomno přibližně stejné množství každého fúsního proteinu. Po dvouhodinové inkubaci při pokojové teplotě byly nenavázané protilátky odstraněny a plotny byly jedenkrát promyty PBS-Tween. Pro protilátky z fúse 1, 7 as 9 byl přidán 50 qg/jamku HRP značený krysí anti myší IgG (Zymed a HRP značený streptavidin (Vector Laboratories) vhodně ředěný v blokujícím reagens do jamek, do kterých byla dříve přidána anti gp39 protilátka a anti myší CD 8, v příslušném pořadí. Pro protilátky z fúse 5 byl přidán HRp značený myší anti krysí IgG (Jackson Immunological Laboratories) ředěný 1:40000 v blokujícím reagens. Po jednohodinové inkubaci při pokojové teplotě bylo HRP značené reagens odstraněno a plotny byly třikrát promyty PBS-Tween. Znázornění HRP značeného reagens a měření výsledné optické density bylo provedeno stejně jako v jiných ELISA testech podrobněji popsaných výše.

Dva důležité parametry výše uvedených testů byly demonstrovány, še stejné množství různých fúsních proteinů bylo použito v (t.j. navázáno na) testovací plotny a nesaturační koncentrace anti gp39 protilátek byly použity, takže načtená optická densita spadala do lineární části křivky odpovědi. Pro normalizaci množství fúsního proteinu ve všech jamkách byla sériová ředění každého supernatantu COS buněk obsahujícího každý fusní protein hodnocena v testu popsaném výše a pro konečný test bylo vybráno takové ředění, které dávalo hodnotu optické density v lineární části křivky odpovědi (obvykle mezi 0,3 a 0,9 jednotek absorbance), což bylo ±10% hodnoty pozorované pro přirozený sgp39, když byl sledován s biotynylovanou krysí anti myší CD8 následovanou HRP značeným streptavidinem. Optimální ředění každého supernatantu obsahujícího protilátku použitého v konečném testu bylo určeno hodnocením sériových ředění každého supernatantu na přirozený sgp39 fúsní protin v ELISA jak je popsáno výše. Optimální ředění bylo definováno jako to, pro které dvě následující ředění vedou ke snížení hodnoty výsledné optické density. Optimální ředění stejně jako jeho dvě sériová dvojnásobná ředění byly hodnoceny v konečném testu pro každý fusní protein jak je popsáno výše.

Reaktivita každé anti gp39 mAb se šesti mutantními sgp39 proteiny je ukázána v tabulce 2. Hodnoty ukazují intensitu vazby na každý mutant va srovnání s intensitou pozorovanou na přirozený typ (vyjádřeno v procentech) a representují průměr dvou měření + standartní odchylku (SEM). Jsou ukázána data pouze z těch testů, ve kterých bylo množství různých fúsních proteinů na testovacích plotnách téměř stejné (jak je ukázáno sledováním s anti CD8) a která byla dosažena s nesaturující koncentrací anti gp39 mAb (obvykle dvojnásobné ředění optimálního ředění jak je definováno výše).

Na základě celkové podobnosti vazebného profilu každého z gp39 mutantů a v kombinaci s výsledky Western blotu bylo 32 anti gp39 mAb rozděleno do 12 skupin. Každá skupina je charakterizována jedinečnou vazbou, která naznačuje, že rozpoznávaný epitop v každé skupině protilátek je odlišný. Skupina 1, obsahující mAb 39-1.3, 39-1.21, 39-1.25, 39-1.63, 39-1.122, 39-1.123 a 39-1.138 měla zanamenatelný defekt v rozpoznání mutantů E129/A a S131/A-T135/A. Tyto mAb také demonstrovaly o něco méně významný defekt vazby na mutant K143/A. Reaktivita těchto protilátek s mutanty Y145/A,

N180/A a F201/A-E202/A je podobná jako na přirozený typ gp39. Skupina 2 je representována jednou mAb, 39-1.59. Tato protilátka je podobná protilátkám ve skupině 1 s ohledem na silně redukovanou vazbu na mutanty E129/A a S131/A-T135/A a K143/A, ale liší se v tom, že vykazuje také o něco slabší vazbu na mutanty Y145/A, N180/A a F201/A-E202/A. Protilátky ve skupině 3 (39-1.37 a 39-1.132) a skupině 4 (39-1.124 a 39-1.156) jsou navzájem podobné v tom, že rozpoznávají mutant E129/A zcela slabě a vykazují silnou deficienci vazby na mutant K143/A. Reaktivita těchto protilátek s jinými mutanty byla o něco slabší nebo stejná ve srovnání s reaktivitou pozorovanou pro přirozený gp39. Skupiny 3 a 4 se nicméně jasně odlišují jedna od druhé, jak je ukázáno odlišnými výsledky ve Western blot analýze, kde 39-1.37 a 39-1.132 jsou blot negativní, zatímco 39-1.124 a 39-1.156 jsou blot pozitivní. Protilátky ve skupině 5 zahrnují 39-1.7, 39-1.128 a 39-1.26. Tyto jsou podobné protilátká ve skupině 3 a 4 v tom, že demonstrují srovnatelnou ztrátu vazby na mutant K143/A, ale odlišují se v zaznamenaném lepším rozpoznávání mutantu E129/A. Vazba těcto protilátek na mutanty S131/A-T135/A, Y145/A, N180/A a F201/A-E202/A byla v podstatě ekvivalentní vazbě pozorované na přirozený typ gp39. Skupina 6, která obsahuje mAb 39-1.52, 39-1.61, 39-1.77, 39-1.93, 39-1.106, 39-1.109, a 39-1.134 se odlišuje od jiných anti gp39 mAb téměř úplnou ztrátou reaktivity s mutantem F201/A-E202/A. Kromě toho tyto protilátky demonstrují určitou, ačkoliv ne signifikantní redukci reaktivity s mutantem K143/A. Reaktivita této skupiny protilátek s jinými mutanty v panelu byla podobná reaktivitě pozorované pro přirozený typ gp39. Skupina 7 obsahuje jednu protilátku, 39-1.29. Tato mAb je velmi podobná protilátkám ve skupině 6 kromě toho, že rozpoznává mutant K143/A téměř stejně jako přirozený typ gp39. Jedna protilátka, 39-7.3E12, representuje skupinu 8. Tato protilátka se významně liší od všech ostatních v tom, že velmi dobře reaguje se všemi mutanty s pouze mírným snížením reaktivity s K143/A mutantem ve srovnání s přirozeným typem gp39. (Viz diskuse skupin 9 - 12) .

Skupina 9 obsahuje jednu protilátku, 39-6E9. Tato protilátka vykazuje podobnou vazebnou aviditu k mutantu E129/A jako je pozorováno pro přirozeným typem gp39 a o něco redukovanou vazebnou aviditu k mutantům S131/A-T135/A,

N180/A a F201/A-E2002/A, než je pozorována pro přirozený typ 9P39. Co zejména odlišuje tuto skupinu od jiných je slabá vazebná avidita na mutanty K143/A a Y145/A ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému typu gp39. Tato protilátka také nebyla schopna vazby na gp39 ve Western blotu.

Skupina 10 obsahuje protilátky 39-7.7G4, 39-9.27,

39-7.4C1, 39-9.68 a 39-9.246, které jsou charakterizovány shodnou nebo o něco redukovanou vazebnou aviditou ke všem mutantům ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému typu gp39. Všechny z těchto protilátek také byly schopny vazby na gp39 ve Western blotu.

Skupiny 11 a 12, protilátky 39-9.11 a 39-9.274, se podobají ve své reaktivitě s mutantními gp39 proteiny, ale liší se ve schopnosti vazby na gp39 ve Western blotu. Protilátka 39-9.11 je schopna vazby na gp39, zatímco 39-9.274 není schopna vazby na gp39 ve Western blotu. Reaktivita obou protilátek s mutantními gp39 proteiny byla charakterizována jako podobná jako reaktivita s přirozeným typem gp39 pro E129/A, S131/A-T135/A, Y145/A a F201/A-E2002/A. Vazebná avidita byla o něco redukována na mutant K143/A ve srovnání s vazebnou aviditou na přirozený typ gp39 a slabá na mutant N180/A.

Dohromady, data reaktivity s gp39 mutanty spolu s výsledky Western blotu definují alespoň 12 různých rozpoznávacích profilů a tak 12 různých epitopových specificit mezi 32 anti-lidský gp39 mAb. Jak je definováno výše,' zdá se, že mAb ve skupinách 1, 2, 3, 5, 8, 9 a ll rozpoznávají epitopy, které jsou přirozeně diskontinuitní nebo konformační, zatímco mAb ve skupinách 4, 6, 10 a 12 se zdají být specifické pro kontinuální nebo lineární sekvence gp39.

Frotil Ψ'ϊ	1 ..... ( protilátka	isotyp	\| protilátková reaktivita sgp39 Point mutauty* i	Western Blot
Ε129/A	S13I/A T135/A	KI43/A	YI45/A	NI80/A	F20I/A E202/A
		39-1,3	Gl	2 ± 0.3	8± 1.7	27 ±0.8	109 + 2.9	87 ±5.3	106 ±3.4	-
		39-1.21	Gl	II ±0.4	13 ±0.2	61 ±6.9	142 ± 11.9	126+13.6	103 ± l.l
1		39-1.25	Gl	0 ± 0.8	7± 1.2	63 ±8.8	135 ±0.3	124 ±7.7	114 ±8.4
		39-1.63	Gl	12 ± 3.1	14+ 1.8	26 ±0.6	122 + 1.5	98 ±9.2	84 ± 10.5
		39-1.122	G2b	4 + 0.9	4 ± 1.8	60 ±7.9	109 ± 17.7	83 ± 11 2	88 ± 9.3	-
		39-1.23	Gl	16 + 14	22 ± 0 0	59 ±0 7	95 ± 3.8	114 ±31.0	101 ±2.1	-
		39-1.138	Gl	-4 + 0.2	•3 ±0.7	54 ±3.5	116 ± 7.1	99 ±4.3	124 ±6.6	-
2	39-1.59	Gl	4 ±3.5	14 ±1.0	38 ±4.1	74 ±6.9	55 ± 6.8	59 ±7.4
		.39-1.137	Gl	8 ± 0.2	97 ±4.4	6 ± 0.1	111 ± 5.9	98 ± 11.2	90 ± 8.5
3		39-1.132	C2b	23 ±2.1	77 ±0.6	5 ±0.6	94 ±4.2	82 ±0.2	93 ± 11.2	-
		39-1 124	Gl	25 ± 12	69 ±6.7	4 ± 0.7	90 ± 9.3	75 ± 1.5	85 ± 2.0	+
4		39-1 156	Gl	31 ±0 8	84 ± 16,7	8+ 1.0	100 ± 25.6	73 ± 10.7	76 ± 2.5	+
		39-1.7	G2b	70 ±2.9	89 + 0.5	5 ± 0.1	106 ±4.3	93 ± 1.4	112 ±5.0	-
5		39-1.128	G2b	52 ±0.0	116 ±6.6	7± 1.8	123 ±5.6	133 ±j23.1	102 ±4.7
		39-1.26	Gl	96 ±3 7	103 ±6.3	6 ±0.3	128+ 1.9	137 ±16.3	lil ±4.3
		39-1.52	Gl	124 +0.6	109 ±6.8	68 ± 3 0	148 ± 15.8	144 ± 7 5	1 ±0 9	+
		39-1 61	Gl	94 ± 4 6	81+01	53 + 3.0	92 ± 2.4	92 + 3.1	0 ± 0 5
		39-1 77	Gl	128 + 35.0	II7±21.5	75 + 10.3	122 ±22 X	147 ± 2 6	3 ± 1.0	+
6		39-1.93	Gl	99 + 2 1	81 +6 5	46 ± 3.6	103 +8.9	114 ± 114	6± l.l	+
		39-1.1116	Gl	I3(l± 10.6	113 + 6.0	52 + 16.6	124 + 1.5	144 + 25.1	9 + 1.3	+
		39-1.109	Gl	96 ± 1.8	72 ± 0 6	54 + 8.5	108 + 13.6	82 ± 7.9	4 ± 4.5	+
		30-1.134	Gl	109 ± 0.8	79 ±0.0	53 ± 3.2	98 ± 4.6	82 + 7.7	3 ±0.2
7	39-1 29	G2íi	109 ± 14.5	105 + 7.1	91 ±0.6	125 ± 10.6	122 ±2.2	1 ±0.2	+
8	39-7.3 E12	G2u	102 ± l.l	82 ± 5.5	67 ±3.0	114 ±6.4	99 ± 5.8	94 ± 1.3
y	39-5.6E9	G2a	101 ± 9.3	65 ±3.0	3 ±6.0	20 ± 1.9	54 ±4.5	49 ±3.7
		39-7.7C.4	Ci2;t	87 ±0.5	75 ± 5.0	55 + 5.5	95 + 5.1	84 + 6 9	61 ±2.0
		79-9.27	Gl	117 + 26.5	89 ± 13.5	60 + 10.6	139+6 9	63 + 0.3	88 ± 1.2	+
lil		»9-7.40	G2b	100 + (1.7	89 + 8.8	64 + 3.4	116 ±0.0	III +7.0	81 ±5.7	+
		79-9 68	G2b	9.7 + 17 .7	78 + 7.9	78 + 4 7	85 ± 3.5	81 ±11«	79 + 10.0	+
		39-9.246	Gl	118 + 4.9	100 + 5.4	80 + 5.3	117+ 11.2	124 + 23.5	101 ±3.1
II	79-9 1 1	Gl	88 + 4.8	84 + 11.1	58 ± l.l	118 + 68	8 + l.X	89 ± 5.5
12	39-9 274	Gl 1	107 + 0 8	100 + 9 1	67 + 5.9	129 +17 8	20 + 2.2	130+ 1.2	+

Příklad 7

Inhibice na T buňkách dependentní proliferace B buněk a produkce imunoglobulinů

Aktivované T buňky mohou indukovat proliferaci a diferenciaci klidových B buněk do imunoglobuliny secernujících buněk. Kromě toho, buněčný kontakt mezi aktivovanými T buňkami a B buňkami je požadován pro přesmyk z IgM na IgG, IGA nebo IgE produkci. Protože se soudí, ze interakce mezi CD40 a jeho ligandem hraje zásadní roli v tomto procesu, bylo předpokládáno, že anti gp39 monoklonální protilátky by měly být schopné interference s touto formou

ΊΟ pomoci” Τ buněk.

Inhibiční účinky anti gp39 monoklonálních protilátek na aktivaci a proliferaci lidských B buněk byly hodnoceny in vitro testovacím systémem na T buňkách dependentní proliferace B buněk a syntézy imunoglobulinů. v tomto systému (Hirohata et al., 1988, J. Immunol. 140: 3736 3744) indukují aktivované T buňky aktivaci B buněk, jejich proliferaci a produkci polyklonálních protilátek (IgG, IgM a IgA) bez MHC restrikce, Ag nespecifickým způsobem. To vyžaduje přímý kontakt mezi B a T buňkami pro to, aby se vyskytly sledované události u B buněk a tak se soudí, že tento systém representuje relevantní in vitro systém pro studium interakcí B buňka/T buňka, které vedou k produkci Ab.

Stručně, mononukleární buňky lidské krve (PBMC) byly izolovány ředěním plné krve 1:1 s PBS, překrytím 25 ml na 10 ml Lymfocyte Separation media (LSM, Organon, Teknika) a centrifugováním po 25 minut při 450 g. Buňky v rozhraní byly shromážděny a jedenkrát promyty PBS. Izolované buňky byly zředěny na 5 x 10⁶/ml ve 2% FCS-Iscove obsahujícím 0,25 mM L-leucyl-L-leucin methyl ester hydrobromid (Leu-LeuOMe, Sigma) a byly inkubovány při pokojové teplotě po 15 minut pro usmcení monocytů a Nk buněk (Ohlin et al., 1989, Immunology 66: 485 - 490). ošetřené buňky byly promyty dvakrát 2% FCS-Iscove před separováním T a B buněk.

T buňky byly izolovány inkubováním Leu-LeuOMe ošetřených buněk s 150 násobkem AET-SRBC (ovčí erytrocyty ošetřené 0,143 M 2-aminoethylisothiouronium bromid (Sigma)) po 15 minut na ledu. E rozety pozitivní T buňky (E-T buňky) byly separovány od zbývajících buněk podvrstvením chladným LSM a centrifugováním při 450 g po 25 minut. Pelety (obsahující rozetované T buňky) byly shromážděny a ovčí erytrocyty byly byly lyžovány 0,83% chloridem amonným po pět minut při pokojové teplotě. Vzešlé T buňky byly jedenkráte promyty ve 2% FCS-Iscove. Tyto buňky byly potom ošetřeny mitomycinem C (5 x 10⁶ E-T buněk a 40 ^g mitomycinu C /ml) po 40 minut při 37 °C potom byly třikrát promyty v 2% FCS-Iscove. B buňky byly získány z rozhraní tub, ve kterých byly izolovány E-T buňky z AET-SRBC ošetřených PBMC centrifugací nad LSM polštářem (popsáno výše). Tyto buňky byly jedenkráte promyty v 2% FCS-Iscove a rerozetovány s AET-SRBC jak je popsáno výše pro odstranění jakýchkoliv residuálních T buněk a znovu centrifugovány nad LSM polštářem. Buňky v rozhraní byly shromážděny, jedenkráte promyty ve 2% FCS-Iscove a jsou zde označovány jako B buňky.

Costar 96 jamkové plotny byly potaženy 50 /tg/jamku 2 ^g/ml roztokem anti CD3 monoklonální protilátky 64.1 (Hansen et al., Leucocyte Typing, Springer - Verlag, lne., str. 195 - 212 (1984)) v séru prostém Iscove mediu po nejméně čtyři hodiny při pokojové teplotě. Přebytek protilátky byl aspirován z jamek a do každé jamky bylo přidáno 100000 mitomycinem C ošetřených T buněk a 2000 dvakrát rozetovaných B buněk v celkovém objemu 150 μΐ kultivačního media (Iscove modifikované Dulbecco medium doplněné 10% FCS).

Supernatanty odebrané z hybridomů produkujících anti gp39 monoklonální protilátku nebo negativní kontrolní monoklonální protilátku byly potom přidány do každé ze tří jamek, 100 μg/jamku. Další jamky dostaly pouze stejný objem kultivačního media. Po šesti dnech kultivace při 37 °C v inkubátoru obsahujícím 6% C0₂ byla každá sada trojitých jamek hodnocena na prolitferaci B buněk a celkový lidský IgG a IgM.

Proliferace B buněk byla měřena vychytáváním tritiovaného thymidinu. Po odebrání 100 gg/jamku supernatantu kultury pro analýzu IgM a IgG (viz níže) bylo 50 μΐ kultivačního media obsahujícího 1 μθί (³H)thymidinu (New England Nuclear) přidáno do každé jamky. Po dalších 18 hodinách kultivace při 37 °C byly plotny zmraženy, roztátý a buňky byly sklízeny na filtrační vložky ze skelných vláken s TOMTEG sklízečem buněčných ploten. Inkorporace (³H)thymidinu byla měřena LKB Wallace Beta-Plate kapalinovým scintilačním čítačem. Hodnoty z trojitě provedených jamek byly zprůměrovány a jsou presentovány v tabulce 3 jako procento + SD hodnot pozorovaných pro kontrolní jamky pouze s mediem.

Lidský IgG a IgM byly kvantifikovány potažením Immulon 2 EIA ploten (Dynatech) 100 μg/jamku 1 μg/ml roztokem kozího anti lidského Ig (Southern Biotechnology Associates) v 0,05 M pufru uhličitan sodný/hydrogen uhličitan sodný pufru, pH 9,6. Plotny byly uzavřeny a inkubovány přes noc při 4 °C. Přebytek protilátky byl odstraněn a plotny byly blokovány jak je popsáno v předchozích ELISA testech. Po blokování dostaly všechny jamky 50 μg/jamku 2XPTB (2 X PTB obsahující 2% hovězí sérový albumin (Intergen) a 1% Tween 20)).Supernatanty kultur ředěné 1:10 pro IgM analýzu) a 1:40 (pro IgG analýzu) v kultivačním mediu byly přidány do jamek, 50 μg/jamku, a byly inkubovány po jednu hodinu při pokojové teplotě. Tato ředění proběhla v předešlém pokusu za použití sériových ředění supernatantů z jamek obsahujících pouze medium a vybráním toho ředění, které dávalo hodnoty optické density v blízkosti nejvíce lineární části křivky odpovědi pro IgG a IgM. Supernatanty byly odstraněny, plotny byly dvakrát pomyty PBS-Tween a do příslušných jamek byla přidána HRP značená kozí anti lidská IgG nebo IgM (jackson Immunological Laboratories and), vhodně ředěná v 1XPTB (2XPTB ředěný 1:1 v PBS), 100 gg/jamku. Po jednohodinové inkubaci při pokojové teplotě bylo HRP značené reagens odstraněno a plotny byly promyty třikrát PBS-Tween.Znázornění HRP značeného reagens a měření výsledné optické density bylo provedeno stejně jako v jiných ELISA testech podrobněj i popsaných výše. Hodnoty z troj itě provedených j amek byly zprůměrovány a jsou presentovány v tabulce 3 jako procento + SD hodnot pozorovaných pro kontrolní jamky pouze s mediem.

Jak je ukázáno v tabulce 3, každá z testovaných monoklonálních protilátek byla schopna signifikantní inhibice T buňkami řízené proliferace B buněk, vož vedlo k hodnotám, které byly pouze 2-4% hodnot pozorovaných pro jamky bez gp specifické protilátky. Současně byla také signifikantně suprivována produkce IgG a IgM.

Inhibiční účinek různých anti gp39 monoklonálních protilátek na na T buňkách závislou produkci imunoglobulinů lidskými B buňkami byl dále zkoumán více kvantitativním způsobem za použití definovaných koncentrací purifikované protilátky. Protilátky byly afinitně purifikovány ze supernatantů kultur na Prótei A Sepharose nebo na GammaBind Plus Sepharose kolonách (Pharmacia) podle návodu výrobce a byly kvantifikovány absorbancí optické density za použití extinkčního koeficientu 1,4. Pokusy byly provedeny jak je popsáno výše s následujícími modifikacemi. Polovina plochy

Costar 96 jamkových ploten byla využita a použitá koncentrace CD3 protilátky byla 4 gg/ml. Do všech jamek bylo přidáno 150000 mitomycinem C ošetřených T buněk a 20000 B buněk v celkovém objemu 100 μΐ kultivačního media. Anti gp39 a negativní kontrolní protilátky byly ředěny 60, 6 a 0,6 gg/ml v kultivačním mediu a 50 μΐ každého ředění bylo přidáno do každé ze tří jamek pro konečnou koncentraci každé protilátky v kultuře 20, 2 a 0,2 μg/ml. Do kontrolních jamek bylo přidáno pouze kultivační medium 50 μg/jamku. Buňky byly kultivovány celkem 10 dní v 37 °C/6% C0₂ inkubátoru a potom byl supernatant z trojice jamek poolován a hodnocen na celkový lidský IgG a IgM. Měření lidského IgG a IgM bylo jak je popsáno výše s tou výjimkou, že každý poolovaný supernatant byl testován trojitě, supernatanty byly ředěny v 2% FCS-Iscove v mnohem vyšších ředěních daných delší periodou buněčné kultury (a tak produkce protilátek), jamky na testovacích plotnách nedostaly 2XPTB před přidáním ředěných supernatantů a HRP reagens bylo ředěno v blokujícím pufru.

Tabulka 3

Suprese in vitro proliferace B buněk a produkce protilátek anti lidský gp39 mAb

mAb \|	’ [Tfjthymídin ink>xporace , ' (% kontrolního media)	produkovaný lg (% kontrol, media)
		IgM \|	IgG
39-1.3	3.5 ±0.7	33.5 ± 15.4	60.2 ± 3.6
39-1.7	3.3 ± 0.5	13.9 ± 9.1	31.X ± 9.6
39-1.26	2.1 ±0.1	10.0 ± 3.7	24.0 ± 8.3
39-1.29	3.9±0.7	43.4 ± 11.4	39.8 ±6.4
39-1.37	2.4 ±0.2	20.2 ±4.1	44.8 ± 10.9
39-1.61	3.4 ±0.6	10.6 ±4.6	32.2 ± 15.0
39-1.77	2.1 ±0.6	1 1.7 ± 2.1	,41.9 ± 2.1
39-1.106	2.9 ± 0.3	17.9 ±4.9	2X.6 ± X.3
39-1.124	3.5 ± 0.6	17Ό ± 5.7	36.5 ± Ι6.υ
39-1.128	3.1 ± 0.5	21.7 ± 9.5	53.3 ± 6.2
39-1.132	3.3 ±0.4	13.0 ±4.7	50.1 ± 2.0
39-1.134	2.3 ± 0.8	12.5 ±4.1	33.5 ±10.2
39-1.156	2.7 ± 0.1	12.2 ± 4.8	26.9 ± 5.6
Neg. Cont.	87.9 ± 7.9	87.9 ± 13.8	1 14.9 ± 2X.5

Data z těchto pokusů jsou presentována v tabulce 4. Při nejvyšší použité koncentraci protilátky, 20 Mg/ml, inhibovaly všechny protilátky signifikantně produkci jak IgG, tak IgM. Při této koncentraci byly generované hladiny lidských protilátek konsistentně 10 - 30% hladin pozorovaných při přítomnosti pouze media. Při snížení koncentrace anti gp39 protilátky byla stejně snížena, obecně, úroveň inhibice. Při použití dvakrát nižší koncentrace anti gp39 protilátek, 2 a 0,2 μ3/νπ1, bylo jasně zřejmé, že jisté anti gp39 protilátky, konkrétně 39-1.7, 39-1.26, 39-1.77, 39-1.106, 39-1.134, 39-7.3E12 a 39-65.6E9 byly mnohem účinější v inhibici produkce lidských IgG a IgM než jiné. Toto pozorování naznačuje, že epitopová specificita a/nebo avidita protilátek jsou důležitým parametrem stupně, kterým může monoklonální protilátka namířená na gp39 interferovat s gp39-CD40 interakcí.

Tabulka 4

Srovnání in vitro suprese produkce protilátek B buňkami za použití anti lidský gp39 monoklonálních protilátek

Monoklonální protilátka	inhibice ai vitro protilátkové syntézy ’ °/o kontrol. media+SD*
IgG	IgM
20 pg/ml	2 pg/ml	0.2 pg/ml	20 pg/nil	2 pg/nil	0.2 ug/ml
39-1.3	9±7	5 3 ± 16	91 ± 7	23 ± 3	63 ± 17	94 ± 15
39-1.122	13± 1	28 ±6	70 ± 12	20 ± 23	60 ± 1 8	84 ± 6
39-1.138	21 ±4	60 ± 14	90 ± 9	29 ± 23	91 ± 29	101 ± 22
39-1.59	21 ± 6	57 ± 10	85 ± 22	34 ± 25	82 ± 35	84 ± 13
39-1.37	18±4	39 ± 23	74 ± 16	26 ± 16	62 ± ty	91 ± 12
39-1.132	11 =fc I	25 ± 17	66 ± 10	23 ± 24	60 ± 20	102 ± 23
39-1.124	11 ± 1	20 ± 8	54 ± 20	2'1 ± 28	47 ± 31	76 ± 13
39-1.156	11 ± 6	15 ± 13	43 ± 22	14 ± 6	28 ± 10	XI ± 8
39-1.7	17 ± 8	12 ± 7	34± 19	20 ± 6	27 ± 12	58 ± 15
39-1.128	19± 1	19 ±3	55 ± 18	26 ± 1 1	46 ± 22	85 ± 2 1
39-1.26	22 ±18	15 ± 9	41 ± 14	26 ± 13	27 ±28	78 ± 2
39-1.77	11 ±6	16 ± 5	38 ± 16	23 ± 39	28 ± 24	68 ± 34
39-1.106	8 ± 2	11 ±5	21 ± 12	27 ± 23	22 ± 21	41 ± 14
39-1.134	10 ±4	15 ±5	28 ± 7	23 ± 13	27 ± 26	65 ± 32
39-1.29	10± 1	13 ± 3	49 ± 23	23 ± 16	37 ± 11	86 ± υ
39-7.3E12	9± 1 ·	12 ± 4	37 ± 16	1 1 ± 2	18 ± 16	72 ± 10
39-5.6E9	16±4	1l±5	2O±15	27±4	14± 12	33±5
39-7.7G4	!2±l	10±6	57± 10	19±3	27±25	X()±14
39-9.11 ...	30±6	31± 17	72± 16	75±35	74±23	1O5±4O
39-9.274	1	I4±6	8 1±17	7±8	3 X ± 10	77±8
39-9.27	13±4	19±1 1	79±28	28± 14	41±28	108+23
39-7.4 Cl	13±4	3 l±7	74±\|M	22±S	49±27	X7±4
39-9.68	29±8	64± 15	9l± 1 7	5()± 17	88+21	1 14± 17
39-9.246	12±7	21 ±6	7 1± 16	29±I6	43±2^l)	íWiU

Příklad 8

Detekce mutantního gp39 u pacientů s X-vázaným hyper IgM

Monoklonální protilátky s různýmy vazebnými charakteristikami k lidskému mutantnimu gp39 byly použity pro určení toho, zda bodové mutace v gp39 mohou být rozpoznány ve vzorku krve odebraného od pacienta s X vázaným hyper IgM. V tomto testu, pacient, jehož buňky vykazují pozitivní barvení s gp39 monoklonálními protilátkami, ale nikoliv barvení s CD40Ig, normálním ligandem, by měl exprivovat gp39 protein, který je nefunkční a může být diagnostikován jako X-HIM. Použití panelu protilátek, se známými rozdíly v epitopech, umožňuje detekování většího počtu různých mutací v X-HIM vzorku. Za použití tohoto testu není úplně možné vyloučit běžnou variabilní imunodeficienci jako diagnosu, ale je očekáváno, že tímto postupem může být detekováno signifikantní procento X-HIM pacientů.

Podskupina X-HIM pacientů, těch, u kterých defekt v gp39 vede k chybění vnitřní exprese díky, například, mutaci stop kodonu časně v gp39 kódující sekvenci, také nemůže být potvrzena tímto přístupem.

Stručně, T buňky jsou izolovány ze vzorku lymfocytů periferní krve od pacienta za použití centrifuce s Ficoll gradientem po které následuje rozetování za použití ovčích erytrocytů. Barvení fixovaných, permeabilizovaných buněk je provedeno za použití metody podle Jung et al., (J. Immunol. Methods 159: 197 - 207 (1993) s modifikacemi jak je popsáno.

Izolované T buňky byly stimulovány PMA (10 ng/ml) a ionomycinu (1 /ttg/ml) za přítomnosti monensinu (3 mM) po tři hodiny. Stimulované buňky byly poté promyty PBS a fixovány inkubací ve 4% paraformaldehydu v Hankově vyváženém salinickém roztoku po 10 minut při 4 °C. Fixované buňky byly jedenkrát promyty PBS, potom permeabilizovány a blokovány inkubací v blokujícím pufru (0,1% saponin, 10% kozí sérum v PBS) po 10 minut při pokojové teplotě.

Buňky byly resuspendovány ve 0,1% saponinu, 2% fetálního hovězím séru v PBS a byly připraveny aliquoty pro barvení v přibližné hustotě 1 χ 10⁷ buněk/ml. Monoklonální protilátky byly přidány do konečné koncentrace 10 ng/ml a buňky byly inkubovány při pokojové teplotě po 30 minut před dvojnásobným promytím blokujícím pufrem a resuspendací v blokujícím pufru obsahujícím FITC-konjugovaný kozí anti myší Fc. Po dalších 20 minutách inkubace při pokojové teplotě byly buňky promyty dvakrát 2%FBS v PBS a analyzovány průtokovou cytometrií.

Jako kontrola a pro testování uskutečnitelnosti detekování gp39 uvnitř buněk byly izolovány normální T buňky a byly ošetřeny jak je uvedeno výše s tou výjimkou, že před fixací byly buňky ošetřeny po 5 minut trypsinem pro odstranění na povrchu exprivovaného gp39. Buňky byly potom fixovány a barveny jak je uvedeno výše. Srovnání barvení aktivovaných a neaktivovaných T buněk umožňuje demonstraci specifického barvení v normálních T buňkách.

V tabulce 5 je poskytnuto shrnutí barvení T buněk izolovaných od X-HIM pacienta za použití anti gp39 monoklonálních protilátek.

Tabulka 5

— Shrnutí barvení	T buněk	— izolovaných od X-HIM pacienta za
použití anti gp39 mAb
Protilátka	CD¹	NC²	Western	Izotyp
39-1.3	-	⁺	-	Gl
39-1.122	-	+	-	G2b
39-1.138	-	+	-	Gl
39-1.124	-		+	Gl
39-1.7	-		-	G2b
39-1.26	-	⁺	-	G2b
39-1.106		+		Gl
39-1.134 _	_	_	_	Gl 1

¹ X-HiM pacient CD (Aruffo et al., 1993, Cell 72: 291) ² Normální kontrola

Příklad 9

Biologická aktivita anti gp39 monoklonálních protilátek u cynomolgus opic

V tomto příkladu byly dvě myší monoklonální protilátky vážící se na různé epitopy lidského gp39 vyšetřovány na testování jejich schopnosti vázat se na aktivované T buňky, blokovat vazbu lidského CD40 lg na aktivované T buňky a inhibovat na T buňkách závislou produkci imunoglobulinů za použití lymfocytů periferní krve izolovaných z cynomolgus opic Macacca fascicularis a Macacca nemestrina. Výsledky za použití PBL z těchto nelidských primátů byly stejné jako byly výsledky získané za použití lidských PBL, což podporuje použití makaka jako vhodného zvířecího modelu.

Pro testování schopnosti vazby protilátek na T buňky makaka, Macacca nemestrina a Macacca fascicularis, byly mononukleární buňky periferní krve (PBMC) izolovány ředěním plné krve 1:1 s PBS, překrytím 25 ml na 10 ml 95% Lymfocyte Separation media (LSM, Organon, Teknika)/5% PBS a centrifugováním po 25 minut při 450 g. Buňky v rozhraní byly shromážděny a jedenkrát promyty PBS. T buňky byly izolovány inkubováním PBMC na ledu se 150 x AET-SRBC (ovčí erytrocyty ošetřené 0,143 M 2-aminoethylisothiouronium bromid (Sigma)) po 5 až 10 minut. E rozety pozitivní T buňky byly separovány podlitím chladným LSM a centrifugováním při 450 g po 25 minut. SRBC v peletě byly lyžovány 0,83% chloridem amonným po pět minut při pokojové teplotě. Vzešlé T buňky byly promyty a inkubovány přes noc v 10% FCS-Iscove mediu při 1 až 3 x 10^s buněk/ml v humidifikovaném inkubátoru při 37 °C, 6% C0₂. T buňky byly potom stimulovány PMA (Sigma) a ionomycinem (Sigma) v 10 ng/ml a 1 Mg/ml v příslušném pořadí v 10% FCS-Iscove po 5 - 6 hodin v humidifikovaném inkubátoru při 37 °C. 2,5 x 10^saktivovaných T buněk na 11 x 75 mm tubu bylo potom centrifugováno při 250 g po 5 minut a kultivační medium bylo aspirováno.

Supernatanty (100 μΐ) shromážděné z kultivovaných hybridomů obsahujících protilátky 106 a 7 nebo negativní kontrolní protilátku byly potom přidány do kjaždé tuby a inkubovány na ledu po 30 minut. Dva mililitry 2% Iscove media byly přidány do každé tuby a tuby byly centrifugovány při 250 g po 5 minut před aspirací supernatantů. FITC značené krysí anti myší IgG polyklonální antisérum (Zymed) ředěné 1:50 ve 2% Iscove mediu bylo přidáno do každé tuby v dávce 100 μΐ/tubu a bylo inkubováno na ledu po 30 minut.

Buňky v každé tubě byly dvakrát promyty 1 ml 2% Iscove media. Buňky byly potom barveny phycoerythrin myší anti lidský CD4 monoklonální protilátkou, promyty a nakonec suspendovány v dávce 250 μΐ/tubu ve 2% Iscove mediu před analýzou na Becton Dickinson FACScan. Jak je možné pozorovat na obrázku 1, monoklonální protilátky 7 (39-1.7) a 106 (39-1.106) byly obě schopny rozpoznávat aktivované lidské (obrázky IA a 1B) a makačí (obrázky ÍC a ID) CD4* T buňky.

Monoklonální protilátky 7 a 106 byly také testovány na svou schopnost blokovat vazbu CD40-Ig fúsního proteinu na aktivované buňky makaka. T buňky byly izolovány a aktivovány jak je popsáno výše. Po aktivaci bylo přidáno 2 χ 10⁵ T buněk do 11 x 75 mm tub a byly centrifugovány po 5 minut při 250 g. Kultivační medium bylo odstraněno aspirací a bylo přidáno 100 μΐ supernatantů obsahujícího anti gp39 monoklonální protilátku 7 nebo 106, pouze medium nebo negativní kontrolní protilátku do každé tuby pro 30 minutovou inkubaci na ledu. Supernatanty byly potom ředěny 2 ml 2% FCS Iscove media, tuby byly centrifugovány při 250 g po 5 minut a supernatant byl odstraněn aspirací. CD40-Ig ředěný na 20 μg/ml v 10% FCS Iscove mediu byl přidán do každé tuby, 100 μg/tubu a inkubován po 30 minut na ledu. 2 ml 2% FCS Iscove media byly přidány do každé tuby a tuby byly centrifugovány při

250 g po 5 minut. Supernatant byl odstraněn aspirací a phycoerythrin nebo fluorescein značený F(ab')² kozí anti lidský IgG (Fc) (Jackson Laboratories) byl ředěn 1:5000 nebo 1:500 v příslušném pořadí v 10% FCS Iscove mediu a byl přidán k buňkám. Po 30 minutové inkubaci na ledu byly buňky promyty dvakrát v 1 ml 2% FCS Iscove mediu a nakonec suspendovány ve 250 μΐ 2% FCS Iscove media a tubu před analýzou a Becton Dickinson FACSanu. Data jsou zobrazena na obrázku 2 a demonstrují, že obě myší anti gp39 monoklonální protilátky 7 a 106 jsou schopné inhibice vazby lidského CD40-Ig na aktivované lidské (obrázky 2A a 2B) a makačí (obrázky 2C a 2D) T buňky.

Pro testování schopnosti monoklonálních protilátek 7 a 106 blokovat schopnost B buněk produkovat rotilátky po kontaktu s aktivovanými T buňkami byly mononukleární buňky periferní krve (PBMC) izolovány od opice Macacca fascicularis jak bylo popsáno výše.

Frakce T buněk byla ošetřena mitomycinem C (5 x 1O^S buněk a 40 /xg mitomycinu C (Sigma) na ml) po 40 minut a potom následovalo trojí promytí v 10% FCS Iscove mediu. Frakce B buněk (mezivrstva z LSM centrifugace) byla rerozetována s AET-SRBC pro odstranění jakýchkoliv residuálních T buněk. Polovina plochy 96 jamkových ploten (Costar) byla potažena 50 μΐ 4 ^g/ml roztoku anti CD3 protilátky (FN-18, Clark, E.A. et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17: 1799 - 1805) v séru prostém Iscove mediu po minimálně čtyři hodiny při pokojové teplotě. Přebytek protilátky byl aspirován z jamek a 1,5 x 10^Bmitomycinem C ošetřených T buněk a 5 χ 10³ dvakrát rozetovaných B buněk v 10% FCS Iscove mediu bylo přidáno.

Purifikovaná anti gp39 a kontrolní protilátky byly ředěny v 10% FCS Iscove mediu do konečné koncentrace, v kultuře, 10,

1, 0,4 a 0,1 ^g/ml a byly přidány do jamek. Po 10 dnech byl supernatant kultur ze trojitě provedených jamek poolován, ředěn a testován na celkové makačí IgG a IgM.

IgG a IgM makaka byly kvantifikovány ak je popsáno pro lidský IgG a IgM s tou výjimkou, že supernatanty byly ředěny 1:640 a 1:40 pro IgG a IgM analýzu, v příslušném pořadí. Výsledky testu, když použitá koncentrace byla 0,4 ^g/ml lze vidět na obrázku 3 a jsou vyjádřeny jako procento celkového IgG a IgM ve srovnání s kulturami ošetřenými pouze kulitvačním mediem za absence protilátky. Protilátky Exa a IVA7 jsou izotypově odpovídající kontroly pro monoklonální protilátky 106 a 7, v příslušném pořadí. Dále, obě monoklonální protilátky 7 a 106 byly schopné inhibice na T buňkách závislé produkce IgG a IgM protilátek B buňkami makaka způsobem velmi podobným jako byl pozorován pro lidské buňky. Tato data naznačují, že cynomolgous opice by mohly být vhodným ne lidským zvířecím modelem pro hodnocení in vivo aktivity anti lidský gp39 monoklonálních protilátek.

Příklad 10

Schopnost myších anti lidský gp39 monoklonálních protilátek suprivovat na T buňkách závislou protilátkovou odpověď u cynomolgous opic.

V tomto příkladu byly hodnoceny tři gp39 vazebné proteiny, myší monoklonální protilátky 7 a 106 a lidský rekombinantní

CD40-Ig fúsní protein na svou schopnost suprivovat primární na T buňkách závislou protilátkovou odpověď na antigeny po intravenosním podání cynomolgous opici Macacca fascicularis. Při neoptimizovane testované dávce monoklonální protilátka 106 suprivovala humorální odpověď, což demonstrueje účinost anti gp39 podání pro supresi na T buňkách závislé humorální odpovědi u primátů.

Čtyři skupiny skládající se z ednoho samce a tří samic makaka byly ošetřeny 4 mg/kg monoklonální protilátky 7 nebo 106, nebo kontrolní protilátkou 1G1 (specifickou pro protein F Pseudomonas aeruginosa) nebo CD40-Ig v den l, 3, 5, 8, 10 a 12 (běh l)av den 50, 52, 54, 57, 59 a 61 (běh 2). Kromě toho bylo každé zvíře imunizováno intravenosně v den 1 (primární imunizace) a v den 50 (sekundární imunizace) 1,7 ml/kg 10% směsí ovčích erytrocytů, na T buňkách dependentním antigenem. Po eliminaci všech gp39 vazebných protinů ze séra zvířat pro dosažení detekovatelné hladiny bylo každé zvíře reimunizováno ovčími erytrocyty a ko-imunizováno 10 mg/zvíře neoantigenem hemocyaninem přílipky (KLH - keyhole limpet hemocyanine).

Sérum bylo odebíráno týdně a byly hodnoceny protilátky proti ovčím erytrocytům a anti KLH protilátky (IgG a IgM) ELISA testem. Titry protilátek proti ovčím erytrocytům byly testovány potažením Immulon I ploten SRBC membránami v koncentraci 5 Mg/ml v PBS a inkubováním po 12 až 18 hodin při 4 °C. Přebytek roztoku byl odstraněn a plotny byly promyty PBS-Tween. Po promytí byly plotny blokovány PBS-Tween po ednu hodinu při pokojové teplotě. Vzorky séra byly sériově ředěny v PS-Tween a 60 μ1 bylo přeneseno do každé jamky antigenem potažené plotny. Ředěné vzorky séra byly inkubovány s antigenem po 1,5 hodiny a přebytek vzorku byl odstraněn před promytím ploten PBS-Tween. Kozí anti-lidský F(ab')₂ fragment IgG nebo IgM (Jackson Laboratories) ředěný 1:10000, 100 μΐ byl přidán do vhodných jamek a byl inkubován po 1 hodinu při pokojové teplotě. Po inkubaci byly jamky promyty PBS Tween a byl přidán tetramethylbenzidin (Genetics System Corporation) ředěný 1:100 v substrátovém pufru (Genetics System

Corporation). Substrát byl inkubován po 15 minut při pokojové teplotě před přidáním 1 N H^SO^ pro ukončení reakce. Hodnoty absorbance byly měřeny při 450 nm/ 630 nm za použití čtečky mikroploten.

Titry protilátek k KLH byly určeny podobným testem jako je uvedeno výše. Stručně, Immulon II plotny byly potaženy KLH (Pacific BioMarine Labs) v 10 ^g/ml v 0,05

M uhličitan/hydrogenuhličitan pufru, pH 9,6 po 12 až 18 hodin při 4 °C. Plotny byly promyty PBS Tween a plotny byly blokovány Specimen Diluent (Genetics System Corporation) ředěným 1:100 v destilované vodě po 1 hodinu při pokojové teplotě. Vzorky séra byly sériově ředěny čtyřikrát v Specimen Diluent od 1/50. Šedesát μΐ/jamku každého ředění vzorku bylo přeneseno na antigenem potažené plotny a inkubováno po 1 hodinu při pokojové teplotě. Zbytek testu byl proveden jak je popsáno výše, kromě toho, že kozí anti-lidský F(ab')₂fragment IgG nebo IgM byl ředěn 1:5000.

Na obrázcích 4A a 4B jsou presentována data demonstrující že, při neoptimizované testované dávce, byla monoklonální protilátka 106 schopna in vivo suprese primární odpovědi makaka na ovčí erytrocyty. Suprese nebyla kompletní, ale byla přibližně 10 až 15-krát silnější než suprese pozorovaná pro jiné anti gp39 testované blokující proteiny. Po sekundární imunizaci nevyazoval žádný z těchto proteinů známky suprese, ačkoliv titry anti SRBC ve 106 ošetřené skupině byly signifikantně nižší než v jiných skupinách. Opice ze všech skupin dostaly 10 mg KLH intramuskulárně jako primární imunizaci v den 106 pro výzkum schopnosti opic odpovídat na nový antigen. Obrázek 5 ukazuje, že všechny skupiny opic byly schopné vykázat silnou odpověď na KLH, což demonstruje, že ošetření anti gp39 vazebnými proteiny není specificky imunosupresivní.

V jiné studii byla anti lidský gp39 monoklonální protilátka 106 podána cynomolgous opici v dávce 20 mg/kg v den 1, 3 a 5. Jako negativní kontrola byla použita anti-tumor asociovaná myší monoklonální protilátka L6 ATCC HB 8677. Všechna zvířata byla imunizována intravenosně v den 1 suspenzí ovčích erytrocytů (1,7 ml/kg 10% suspenze) těsné před podáním testované sloučeniny. Vzorky séra byly odebrány před podáním ovčích erytrocytů nebo myší monoklonální protilátky v den 8, 15, 22, 29, 36 a 43. Vzorky séra byly testovány na titry protilátek IgG a IgM proti ovčím erytrocytům.

Data z tohoto pokusu, jak jsou ukázána v tabulkách 6 a 7, ukazují, že myší anti lidský gp39 monoklonální protilátka 106 signifikantně redukuje schopnost opic vyvinout na T buňkách závislou imunitní odpověď na ovčí erytrocyty. Tato data potvrzjí výsledky pokusů provedených na myších s protilátkou 106 specifickou pro myší gp39 a in vitro studie s lidskými a opičímy lymfocyty periferní krve s myší anti lidský gp39 monoklonální protilátkou.

Tabulka 6

IgG odpověd proti ovčím erytrocytům

Zvíře Pohlaví pre-dávka Den 8 Den 15 Den 22 Den 29 Den 36 Den

Skup.1	223	Samec	30¹	30	30	10	<10	10	0
mAb 106	224	Samec	90	90	90	30	90	90	9
	225	Samice	10	<10	<10	<10	<10	810	2
	226	Samice	10	10	<10	<10	<10	90	9

Skup.2	227	Samec	10	270	810	810	810	810	2
mAb L6	228	Samec	30	270	2430	810	810	810	8
	228	Samice	10	2430	7290	2430	2430	810	8
	230	Samice	ND	ND	ND	ND	ND	ND	N
¹ Titry protilátek,	konečný	popisovaný titr	je definován

jako reciproční ředění, které je větší než dvojnásobek průměrného pozadí plotny ² ND, neprovedeno

Tabulka 7

IgM odpověd proti ovčím erytrocytům

Zvíře Pohlaví pre-dávka Den 8 Den 15 Den 22 Den 29 Den 36 Den

Skup.1	223	Samec	90¹	810	270	90	30	30	3
mAb 106	224	Samec	30	810	810	270	270	90	9
	225	Samice	30	270	90	90	90	2430	2
	226	Samice	90	270	270	810	810	2430	2

Skup.2	227	Samec	270	810	2430	810	810	810	8
mAb L6	228	Samec	30	21870	21870	7290	7290	2430	2
	228	Samice	90	7290	7290	2430	2430	2430	8
	230	Samice	90	2430	2430	2430	810	810	8

¹ Titry protilátek, konečný popisovaný titr je definován jako reciproční ředění, které je větší než dvojnásobek průměrného pozadí plotny

Příklad 11

Konstrukce rekombinantních anti gp 39 jednořetězcových variabilních regionů

V tomto příkladu jsou určeny a izolovány nukleotidové sekvence variabilního region těžkého řetězce (VH) a variabilního region lehkého řetězce (VL) dvou anti lidský gp39 monoklonálních protilátek (39-1.7(7) a 39-1.106(106)). DNA fragmenty kódující VH a VL každé monoklonální protilátky byly potom zařazeny do kontinuální expresní kazety za použití vložené sekvence kódující (Gly₄Ser)₃ linker. Kazety byly exprivovány v savčích buňkách a byla určena funkční aktivita rekombinantních molekul jednořetězcové protilátky (sFv).

A. Izolace RNA, syntéza cDNA a PCR amplifikace

RNA byla izolována z 5 χ 10⁷ hybridomních buněk klonu 106 nebo 7 za použití mRNA izolačního kitu (Stratagene, La Jolla,

CA). cDNA byla generována z RNA za použití StrataScript RT-PCR kitu (Stratagene, La Jolla, CA) a pro konstantní region imunoglobulinů specifických antisense primerů. C_kspecifický primer byl komplementární k nukleotidové sekvenci 228 až 257 myšího kappa lehkého řetězce konstantního regionu. Tento primer byl použit pro syntesu prvního řetězce obou VL cDNA klonu 106 a klonu 7. IgG^ specifický antisense primer nebo IgG₂ specifický antisense primer byly použity pro generování VH cDNA klonu 106 a 7, v příslušném pořadí. IgG^ specifický antisense primer byl komplementární k nukleotidům 100 až 121 CH1 regionu myšího IgG^ a IgG_z specifický antisense primer byl komplementární k nukleotidům 101 až 123

CH1 regionu myšího IgG_2j=}. Reakce prvního řetězce byly provedeny za použití 300 ng antisense primeru a 0,5 μg mRNA.

cDNA byly purifikovaný za použití Geneclean ™ (BiolOl, La Jolla, CA) a následně opatřeny polyG koncem za použití 10 mM dGTP a terminální deoxynukleotidyl transferasy (Stratagene) po 1 hodinu při 37 °C. PolyG koncem opatřené cDNA byly znovu purifikovány za použití Geneclean ™. Dva μΐ každé cDNA byly amplifikovány kotvící-PCR (Saiki et al., 1988, Science 239: 487 - 491) v celkovém objemu 100 μΐ za použití 20 μΜοΙ každého dNTP, 100 pM sense a antisense primerů a 2U Taq polymerasy. Sense primer obsahoval region komplementární k polyG konci (Loh et al., 1989, Science, 243: 217 - 220) a Xbal místo (podtrženo).

5'-CGTCGATCTAGAGCATGTGCAAGTCCGATGAGTCCCCCCCCCCCCCC-3'

SEQ ID NO: 7

Antisense primery byly uchycené primery obsahující HindlII místo (podtrženo) a tepelně zpracované k nukleotidům 101 125 myšího C_K.

5'- CGTCATAAGCTTCAGGAAGCACACGACTGAGGCAC-3’

SEQ ID NO: 8 nebo k nukleotidům 47 - 69 myšího IgG^ CH1

5'- CGTCATAAGCTTGTCACCATGGAGTTAGTTTG-3'

SEQ ID NO: 9 nebo k nukleotidům 38 - 62 myšího IgG_2to CH1

5'- CGTCATAAGCTTGAACCAGTTGTATCTCCACACCCAG-3’

SEQ ID NO: 10

Reakce byly provedeny na Perkin Elmer Cetus termálním cyklovači (Norwalk, CT) s 33 cykly programu 30 sekundové denaturace při 94 °C, 90 sekundovém tepelném zpracování při 45 °C a 90 sekundové extenzi při 72 °C.

PCR amplifikované VL a VH fragmenty byly tráveny Xbal a HindlII, ligovány do pUC19 vektoru a transformovány do DH5a E. coli. Klony obsahující VL nebo VH byly identifikány DNA sekvencováním. Konsensuální sekvence pro klon 106 (obrázek 6A a obrázek 6B) nebo klon 7 (obrázek 7A a obrázek 7B) byly určeny analyzováním sekvence mnohotných VL nebo VH klonů a srovnáním dedukované aminokyselinové sekvence s dříve publikovanými sekvencemi myších VL a VH (Kabat et al., 1987, U.S. Department of Health and Human Services). Nukleotid a dedukovaná aminokyselinová sekvence pro VL a VH klonu 106 jsou znázorněny na obrázku 6A a 6B (SEQ ID NO: 11 až 14) a nukleotid a dedukovaná aminokyselinová sekvence pro VL a VH klonu 7 jsou znázorněny na obrázku 7A a 7B (SEQ ID NO: 15 až 18) .

B. Konstrukce sFv expresních kazet klonu 7 a klonu 106.

Jednořetězcové sFv byly konstruovány v VL-VH orientaci pro jak 7, tak pro 106, každá kazeta obsahovala vmezeřený (Gly^Ser)₃ linker (Huston et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879 - 5883) . Pro vytvoření 106 VL-VH kazety by gen VL klonu 106 reamplifikován z pUC19 sekvencovacího konstruktu za použití sense PCR primeru (106 gammalSalI) , který kodoval Sáli místo ihned před sekvencí kódující první zbytek zralého VL. Antisense primer (106 gammavlLK3') byl komplementární k sekvenci kódující posledních devět zbytků VL a prvních 12 zbytků (Gly^Ser)₃ linkeru. Navíc, 106 VH byl reamplifikován z pUC19 sekvencovacího konstruktu za použití sense primeru (106 gammalvhLKS'), který kodoval posledních 11 zbytků (Gly₄Ser)₃ linkeru následovaných prvními devíti zbytky zralého VH a antisense primeru (106vhBclI) komplementárního k sekvenci kódující posledních devět zbytků VH regionu a Bell místo. Modifikované VL a VH PCR produkty byly potom purifikovány za použití Geneclean™ (BiolOl, La Jolla, CA) a byly přidány k jedné PCR reakci za přítomnosti přebytku sense VL (106gammalSalI) a antisense VH (106vhBclI) primerů, takže DNA kódující jednotlivé 106 VH a VL domény byly připojeny do jednotlivých kódujících regionů PCR s překrývajícími se rozsahy.

Obdobně, pro vytvoření 7 VL-VH kazety byl gen VL klonu 7 reamplifikován z pUC19 sekvencovacího konstruktu za použití sense PCR primeru (7 gamma2bSalI), který kodoval Sáli místo ihned před sekvencí kódující první zbytek zralého 7 VL; a antisense primeru (7 gamma2bvlLK3') komplementárního k sekvenci kódující posledních devět zbytků VL a prvních 12 zbytků (Gly^Ser)₃ linkeru. DNA kódující 7 VH byla reamplifikována z pUCl9 sekvencovacího konstruktu za použití sense primeru (7 gamma2bvhLK5'), který kodoval posledních 11 zbytků (Gly₄Ser) linkeru následovaných prvními devíti zbytky zralého VH a antisense primeru (7gamma2bvhBclI) komplementárního k sekvenci kódující posledních devět zbytků

VH regionu a Bell místo. DNA kódující jednotlivé 7 VH a VL byly připojeny do jednotlivých kódujících regionů PCR s překrývajícími se rozsahy za použití přebytku VL sense (7gamma2bSalI) a VH antisense (7gamma2bvhBclI) PCR primerů.

Tabulka 8

Primery použité pro konstrukci sFv expresních kazet klonu 7 a klonu 6

Primer	sekvence (5’áz 3 j

7 Y2bSaII	ATCGTCTAGGTCGACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTCC. SEQ ID. #19
7 y2bVILK3‘	GCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCCGTCTT ATTTCCAACTTTGTCCC. SEQ ID. #20
7 y2bVhLK5'	TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTCCAG CTGCAACAGTCTGGACCT. SEQ ID. #21
7 y2bBclI	TCAGTGCTGATCAGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCC. SEQ ID. #22
106 ylSalI	ATCGTCTAGGTCGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCC. SEQ ID. #23
106 yIVILK3'	GCCACCCGACCCACCACCGCCAGCGCCACCGCCACCCCGTTTC AGCTCCAGCTTGGTCCC. SEQ ID. #24
106 ylVhLK5’	TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAAGTGAAG CTGGTGGAGTCTGGGGGA. , SEQ ID. #25
106 ylBclI	TCAGTGCTGATCAGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACC. SEQ ID. #26

Restrikční místa jsou podtržena

106 a 7 VL-link-VH sFv genové kazety byly sestaveny pro sFv-Ig expresi ve variantě pUC19 nazvané pUC-Ig, který byl pasážován přes dam kmen E. coli (NEB 208) pro umožnění štěpení restrikčním enzymem v Bell místě. Tento vektor obsahoval L6 V_k leader sekvenci insertovanou jako HindlII-SalI fregment a Bell místo před sekvencí kódující pantový-CH₂-CH₃ lidského IgG^ jako cDNA, následovanou stop kodonem a Xbal místem. Cysteinové zbytky v pantovém regionu byly mutované na serinové zbytky pro usnadnění produkce monomerních sFvIg (Hayden et al., 1994, Therapeutic Immunol. 1:3- 15). 106 a 7 VL-link-VH sFv genové kazety byly štěpeny Sáli a Bell a byly ligovány do pUC-Ig. DH5a E. coli byly transformovány konstrukty a kolonie byly vyšetřovány na přítomnost insertů.

Celé L6V_k leader/VL-link-VH sFv/lidský Ig kazety pro oba 106 a 7 sFv byly vystřiženy z pUC-Ig za použití HindlII a Xbal a byly přeneseny do pCDM8 savčího expresního vektoru. Po ligací 7 a 106 SFv expresních kazet do modifikovaného pCDM8 vektoru byly plasmidy amplifikovány v MC1061/p3 E. coli buňkách a DNA byla odebrána a purifikována pro transfekci do COS buněk.

C. Transfekce COS buněk, purifikace a charakterizace sFv-Ig fúsních proteinů

COS buňky byly transfektovány expresními plasmidy jak bylo dříve popsáno (Linsey et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 721 - 730; Aruffo and Seed, 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8573 - 8577). Plasmidová DNA byla přidána do transfekčního media v koncentraci 1 ^g/ml v celkovém objemu 12 ml/ 150 mm plotnu. Po 7 až 10 dnech byl vyčerpaný supernatant kultury poolován a buněčná drť. byla odstraněna centrifugací při nízké rychlosti.

106 a 7 sFv-Ig byly purifikovány aplikací pročištěného supernatantu do kolony zmobilizovaného proteinu A (Repligen Corp., Cambridge, MA) ekvilibrované 0,05 M citrátu sodného, pH 8,0 (Linsey et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 721 - 730). Pro 500 ml supernatantu byl použit 1 ml baleného objemu lože proteinu A. Po zavedení do kolony (1 ml/minutu) byla kolona promyta 100 mM fosforečnan draselný pH 8,0 a navázaný protein byl eluován 0,05 M citrátu sodného, pH 3,0. Frakce byly neutralizovány, poolovány a dialyzovány proti PBS. Koncentrace proteinu byla určena za použití komerčně dostupného proteinového testovacího kitu (Bio-Rad, richmond, CA) založeného na Lowry technice.

Úroveň exprese a molekulární velikost fúsních proteinů byly určeny imunoprecipitací s proteinem A a SDS-PAGE, následovanými Western blotingem. Polyakrylamidové gely vytvářející lineární 6 - 15% gradient s 4% stohováním byly probíhány přes noc při 10 mAmp. Gely byly imunoblotovány na nitrocelulosové membrány za použití Western semi-dry přenosového přístroje (Ellard Instruments, Seattle, WA) při 3 mAmp/cm² po jednu hodinu. Bloty byly blokovány 2% netučným mlékem plus 0,1% Tween v PBS (blokující pufr) po 1 až 2 hodiny a potom inkubovány s alkalická fosfatasa konjugovaným kozím anti-lidským IgG (Boehringer Mannheim, Indianapolis,

IN) v ředění 1:1500 v blokujícím pufru po 1 hodinu. Bloty byly potom promyty třikrát v blokujícím pufru a byly vyvíjeny ve Western modři (Promega, Madison, WI) po 5 - 15 minut před ukončením vývoje barviva propláchnutím destilovanou vodou. ⁷ sFv-Ig a 106 sFv-Ig proteiny byly testovány na vazbu k

3Ί lidskému gp39 ELISA testem. Stručně, flexibilní 96 jamkové mikrotitrační plotny s plochým dnem (Falcon) byly přes noc potaženy krysí anti myší Lyt2A monoklonální protilátkou 53-6 v koncentraci 2 gg/ml v PBS při 4 °C. Po odstranění přebytku anti myší Lyt2a protilátky byl přidán dříve popsaný sgp39 do ploten (100 μΐ na jamku) a byl inkubován přes noc při 4 °C. Přebytek sgp39 byl odstraněn promytím a byly přidány klon 7 sFv-Ig nebo klon 106 sFv-Ig proteiny (100 μΐ na jamku). Plotny byly inkubovány po 2 hodiny při pokojové teplotě a byly dvakrát promyty PBS obsahujícím 0,1% BSA. Kozí anti lidský IgG konjugovaný na křenovou peroxidasu (American Qualex, Anaheim, CA) v konjugačním pufru (Genetics Systems, Seattle, WA) byl přidán (100 μΐ na jamku) a inkubován po 1 hodinu při pokojové teplotě. Nenavázaný konjugát byl odstraněn dvěma promytími PBS obsahujícím 0,1% BSA a 100 μΐ na jamku 1:100 ředěného EIA Buffered Substráte (Genetics Systems) bylo přidáno do jamek. Barvící reakce byla ukončena 30 μΐ na jamku 3M H^SO^ a byla měřena optická densita při 450 - 595 nm titertek multiwell čtečky mikroploten.

Transfekční supernatanty z několika klonů klon 106 sFv-Ig a klon 7 sFv-Ig se vázaly dobře na lidský gp39 a reagovaly velmi slabě (106) nebo vůbec (7) s myším gp39.

Representativní výsledky 106 a 7 sFv-Ig vazby jsou ukázány na obrázku 8. Bylo provedeno určení vazebné afinity pro 106 sFv-Ig versus nativní 106 monoklonální protilátka za použití purifikovaného radioznačeného proteinu. Křivky saturační vazby, ukázané na obrázku 9, ukazují, že značená nativní 106 monoklonální protilátka (obrázek 9A) se váže na Jurkat buňky konstitutivně exprivující gp39 s přibližně třikrát vyšší afinitou než 106 sFv-Ig (obrázek 9B). Nicméně, afinita 106 sFv-Ig byla stíle dosti vysoká (měřená K^ = 1,6 x 10~⁹).

Bylo určeno Scatchard transformací, že nativní 106 monoklonální protilátka se váže na 10000 míst na buňku, což plně odpovídá počtu míst na buňku, na které se váže 106 sFv-Ig (obrázky 9A a 9B).

Schopnost 7 sFv-Ig a 106 sFv-Ig inhibovat produkci IgG a IgM v in vitro systému na T buňkách závislé produkci protilátek B buňkami a srovnání této schopnosti se schopností pozorovanou pro původních 39-1.7 a 39-1.106 protilátek byla hodnocena jak je popsáno dříve pro původní protilátky s několika malými modifikacemi. Buněčné kultury byly iniciovány 100000 mitomycinem C ošetřenými T buňkami a 2000 B buňkami v Costar plotnách s poloviční plochou. Purifikované původní protilátky a jejich příslušné sFv-Ig byly kvantifikovány za použití Bio-Rad Protein testovacího kitu. Každá původní protilátka byla testována v konečné koncentraci 1, 0,5, 0,25 a 0,125 Mg/ml. Každý sFv-Ig byl hodnocen v konečné koncentraci 0,68, 0,34, 0,17 a 0,085 Mg/ml. Ačkoliv koncentrace původní protilátky a jejího příslušného sFv-Ig byly v M9/^ml odlišné, byla jejich koncentrace s ohledem na počet antigen vážících fragmentů ekvivalentní, pokud bylo počítáno s celkovou valencí (dva pro původní protilátku, jedna pro její sFv-Ig) a molekulovou hmotností (160000 kDa pro původní protilátku, 55000 kDa pro sFv-Ig). Tak konečné koncentrace antigen vazebných fragmentů (vazebných míst) srovnávaných v tomto experimetu byly 7,53, 3,76, 1,88 a 0,94 x 10¹² vazebných míst/ml.

Po přidání protilátek a sFv-Ig byly plotny inkubovány v humidifikovaném 37 °C/6% CO₂ inkubátoru po 10 dní, po kterých byl supernatant kultur ze trojích jamek poolován a hodnocen na celkový lidský IgG a IgM jak bylo popsáno dříve. Data jsou přítomna v tabulce 9, kde jsou hladiny Ig vyjádřeny jako procento hladiny pozorované pro kontroly, kde bylo přidáno pouze medium (bez anti gp39 protilátky). Jak je ukázáno v tabulce 9, jak 7 sFv-Ig, tak 106 sFv-Ig bylyu schopné významné suprese produkce jak IgG, tak IgM lidskými B buňkami. Zajímavé je, že jejich schopnost suprese byla alespoň ekvivalentní a v některých koncentracích lepší, než schopnost původních protilátek.

Tabulka 9

Suprese in vitro produkce protilátek kompletními anti lidský gp39 monoklonálními protilátkami a jejich sFv-Ig deriváty

Koncentrace Ab	Inhibice IgG syntesy	Inhibice	IgM	syntesy
(vazebná	Ό	kontroly			o, 75	kontroly
místa χ 10¹²)		(pouze medium)		(pouze medium)
	7	7 sFv -Ig	106	106 SFv-Ig	7	7 sFv-Ig	106	106 sFv-Ig
7.53	12	18	11	14	14	21	25	12
3.76	17	19	24	12	24	19	19	12
1.88	11	24	26	10	29	34	27	12
0.94	60	12	37	21	64	32	34	19

100

Příklad 12

Humanizace anti gp39 monoklonální protilátky

A. Určení lidských templátů pro 106 VL a VH

Myší 106 VL (kappa) a VH sekvence byly použity pro výběr podsady imunoglobulinových sekvencí z GenBank pro myší nukleotidová sekvence zárodečné linie s nejbližší homologii k 106 VL s FASTA výběrem za použití pouze nukleotidů kódujících zralý peptid. Tento výběr produkoval dvě myší sekvence následované množstvím lidských sekvencí, nejlépe odpovídající byla označena Musigva (přírůstkové č.

J00545). Homologie mezi translatovaným 106 VL a translatovaným J00545 (zárodečná linie 106) je ukázána na obrázku lOJsou vytištěny pouze rozdíly pro sekvenci zárodečné linie. Tyto odlišnosti jsou pravděpodobně místa somatických mutací. Nicméně, je možné, že 106 VL je odvozen od ještě nemodifikovaného genu myší zárodečné linie.

Aminokyselinová sekvence lidské zárodečné linie s netěsnější homologii k 106 VL byla určena provedením FASTA

I vyhledání na databas^ sekvencí imunoglobulinových proteinů. Tato sada dat obsahovala jak sekvence zárodečné linie, tak přeskupené sekvence. Po odstranění přeskupených sekvencí byla nalezena nejlépe odpovídající homologie pro zárodečnou sekvenci označenou 02 (přírůstkové č. X59315). Bylo zaznamenáno, že všechny kromě jedné (leu90) strukturálních determinant pro CDR smyčky byly konzervovány, stejně jako velikost CDR smyček mezi myším 106 VL a lidským templátem.

101

Bylo také zaznamenáno, že všechny CDR smyčky v lehkém řetězci myší sekvence a lidského templátu patří do stejné kanonické strukturální třídy.

Myší nukleotidové sekvence s nej těsnější homologií k 106 VH byla také určena provedením FASTA výběru podsady GenBank imunoglobulinových sekvencí za použití pouze nukleotidů kódujících zralý peptid jako dotazníkových sekvencí. Vyhledávání vedlo k lokalizaci dvou myších sekvencí následovaných mnoha lidskými sekvencemi. Myší sekvence označená Musighin (přírůstkové č. M21520) vykazovala signifikantně lepší homologii než jiné myší sekvence. GenBank anotace pro M21520 ji uvádí jako přeskupenou sekvenci. Za účelem nalezení pravděpodobných míst somatické mutace byla M21520 použita jako substituce zárodečné linie a rozdíly mezi ní a 106 VH jsou ukázány na spodní straně linií v obrázku 11.

Aminokyselinová sekvence lidské zárodečné linie s netěsnější homologií k 106 VH byla určena provedením FASTA vyhledání na podsíadě dat imunoglobulinových sekvencí. Po odstranění přeskupených sekvencí byla nalezena nejlépe odpovídající sekvence zárodečné linie Hhg4 (přírůstkové č. X62129). Bylo zaznamenáno, že velikost CDR smyček byla zachována mezi 106 VH a lidským templátem a že všechny kromě dvou strukturálních determinant pro CDR smyčky byly konzervovány. Žádná z jiných vysoce homologních sekvencí neodpovídala lépe ve strukturálních determinantách. Bylo také nalezeno, že HI smyčky myší sekvence a v lidském templátu patří do stejné kanonické strukturální třídy.

102

B. Zdokonalení 106 VL a VH humanizovaných templátů

Kanonické struktury smyček pro antigen vázající smyčky LI, L2 a L3 VL domény a Hl a H2 VH domény byly identifikovány a zbytky, které byly definovány jako strukturální determinanty (Chothia and Lesk, 1987, J.Mol. Biol. 196: 901; Lesk and Tramontano, v Antibody Engeneering, W.H. Freeman and Co., str. 1-38 (1992)) byly zachovány jako myší zbytky.

Myší 106 VL a VH aminokyselinové sekvence byly použity pro vyhledávání homologních sekvencí, u kterých byla rozpuštěna jejich krystalická struktura, v Brookhaven databance. VL z anti lysozym vázající monoklonální protilátky Dl.3 byla vybrána jako strukturální templát pro modelování 106 VL. VH z anti peptidové monoklonální protilátky 17/9 byla vybrána jako strukturální templát pro modelování 106 VH. Tyto struktury byly kombinovány pro poskytnutí kompozitního templátů pro modelování 106 za použití sady invariantních zbytků v VL-VH přechodu. Z modelu byly identifikovány tři další zbytky pracovního rámečku, které se zdály být významné pro zachování struktury antigen vazebných míst. V VL byla nalezen Ile48, který byl strukturálně významný a byl zachován jako myší sekvence.

V VH byly dva zbytky (Ala49 a Ile77) také zachovány jako myší sekvence. 106 model neurčoval, zda byly lidské nebo myší zbytky vhodně v pozicích 24, 55 a 56 106 VH.

C. Určení templátů J regionu

Nej lepší J_K sekvence byla vybrána na základě homologie s

103 myší J_K sekvencí v Kabat et al., (Sequences of Proteins of Immunological Interes, 4. vydání, U.S. Healthy and Human Services, Washington, D. C. (1987)). Obdobně, lidská JH sekvence byla vybrána na základě homologie s myší JH sekvencí v Kabat et al., výše.

D. Humanizace 106 VL

Oligonukleotidové primery použité pro humanizaci 106 VL jsou uvedeny v tabulce 8. První tři změny (Ala v pozici 9 na Ser, Glu v pozici 17 na Asp a Thr v pozici 18 na Arg) byly kódovány na HulO6VLAre2 sense primer. HindlII místo bylo přidáno bezprostředně 5' po sekvenci kódující zralý VL pro klonování finálně humanizovaného VL do pUC19 Další čtyři změny byly kódovány v HulO6VLB2 antisense primeru (Gin v pozici 40 na Pro, Arg v pozici 42 na Lys, Ser v pozici 43 na Ala a Gin v pozici 45 na Lys). Za použití HulO6VLAre2 a HulO6VLB2 s myší 106 sFv-Ig/CDM8 jako templátem byl získán první humanizovaný fragment za použití PCR. Sense PCR primer HulO6VLC a antisense PCR primer 2HulO6VLD byly použity pro humanizaci druhého fragmentu. Sekvence HulO6VLC přesahovala HulO6VLB2, takže stejné čtyři změny byly kódovány na HulO6VLC (Gin v pozici 40 na Pro, Arg v pozici 42 na Lys,

Ser v pozici 43 na Ala a Gin v pozici 45 na Lys). Kromě toho, Spěl místo bylo zapracováno do HulO6VLC jako diagnostické místo. Tyto změny neměnily proteinovou sekvenci. 2HulO6VLD primer kodoval další čtyři změny (Gin v pozici 70 na Asp, Ser v pozici 72 na Thr, Lys v pozici 74 na Thr a Asn v pozici 76 na Ser) . Za použití HulO6VLC a 2HulO6VLD s myší 106 sFv-Ig/CDM8 jako templátem byl získán druhý humanizovaný fragment za použití PCR.

104

Tabulka 10

Primery použité pro humanizaci 106 VL

HulO6VLAre2

96-mer sense

HindllI δ'-ATCGTCTAGAAGCTTGTCGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAT CATCCCTATCTGCATCTGTGGGAGATCGAGTCACCATCACATGT CGAGCAAGT - 3', SEQ ID. #33

HulO6VLB2

45-mer antísense

5'-TAGTAGCTTAGGTGCCTTTCCAGGTTTCTGCTGATACCAAGCT

AA - 3', SEQ ID. #34

HulOóVLC

60-mer antísense

2HulO6VLD

45-mer antísense

Spěl

5'-CCTGGAAAGGCACCTAAGCTACTAGTCTATAATGCAAAACCTT AGCAAAAACCTTAGCA - 3', SEQ ID. #35

5‘-GAGATCGTCAGTGTAAAGTCTGTGCCTGATCCACTGCCACTGA AC-3'. SEQ ID. #36

HulOóVLE 5’-GACTTTACACTGACGATCTCAAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTG

75-mer CAACTTATTACTGTCAACATCATTATAATACT - 3'.

sense SEQ ID. #37

HulOóVLF

82-mer anti-sense

Xbal

5'- TCAGTGCTTCTAGAGCCACCCCGTTTGATCTCGAC.CTTGGTC CCTCCACCGAACGTGAGCGGAGTATTATAATGATG TTGAC-3'

SEQ ID. #38

HulO6VLA2

24-mer 5’-ATCGTCTAGAAGCTTGTCGACATC - 3'. SEQ ID. #39 sense

HulO6VLF2

24-mer 5'-TCAGTGCTTCTAGAGCCACCCCGT - 3’. SEQ ID. #4!) anti-sense

105

Konečně humanizovaný VL fragment byl získán za použití HulO6VLE sense PCR primerem a HulO6VLF antisense PCR primerem s myší 106 sFv-Ig/CDM8 jako templátem. HulO6VLE částečně přesahoval HulO6VLD, takže kodoval stejné čtyři změny (Gin v pozici 70 na Asp, Ser v pozici 72 na Thr, Lys v pozici 74 na Thr a Asn v pozici 76 na Ser). Kromě toho, HulO6VLE kočoval dvě další změny (Gly v pozici 84 na Ala a Ser v pozici 85 na Thr). HulO6VLF kodoval poslední čtyři změny (Thr v pozici 100 na Gly, Leu v pozici 104 na Val, a Leu v pozici 106 na Ile). HulO6VLF také klonoval Xbal místo ihned 3' po VL sekvenci pro účely klonování. Humanizované fragmenty 2 a 3 byly potom seřazeny a amplifikovány PCR smísením dvou humanizovaných DNA dohromady za přítomnosti HulO6VLC sense primerů a HulO6VLF antisense primerů. Tento byl purifikován, smísen s humanizovaným fragmentem 1 a reamplifikován PCR za přítomnosti HulO6VLA2 sense primerů a HulO6VLF2 antisense primerů, takže byl získán jeden PCR fragment. Amplifikovaný humanizovaný 106 VL potom rozstřižen HindlII a Xbal a ligován do pUC19. E. coli (kmen DH5a) byl transformován obvyklým způsobem a plasmidová DNA z jednotlivých klonů byla sekvencována pro potvrzení správného uspořádání fragmentu humanizovaného 106 VL. Jeden individuální klon byl označen hulO6VL klon 10 a byl použit v dalších konstrukcích.

E. Humanizace 106 VH

Protože myší 106 model neurčoval, zda jsou lidské nebo myší zbytky vhodně v pozicích 24, 55 a 56 humanizovaného VH řetězce, byl proveden pokus o produkci všech 23 versí. Humanizované VH geny byly řazeny ve třech krocích. V prvním

106 kroku byly generovány PCR fragmenty kódující jednu ze dvou versí (korespondující k Ala nebo k Thr v aminokyselinové pozici 24) aminokyselinové sekvence od pozice 1 do pozice 51 a byly insertovány do HindlII/Xbal míst pUC19. Tyto PCR produkty obsahovaly zavedení jedinečného Nhel místa (v nukleotidové pozici 146), následované EcoRI, Pstl a Xbal místy pro pozdější inserci jiných fragmentů. Tyto změny neovlivnily proteinovou sekvenci 106 VH. Ve druhém kroku byly oligonukleotidy kódující jakoukoliv ze čtyř různých versí (korespondujících Asp-Ser, Asp-Tyr, Ser-Ser a Ser-Tyr v aminokyselinových pozicích 55 a 56) aminokyselinových zbytků 49 aš 80 tepelně zpracovány a inzertovány do Nhel a Pstl míst obou vektorů generovaných v kroku 1. Sedm z osmi možných různých vektorů bylo izolováno (Ala-Asp-Ser forma nebyla). Ve třetím kroku byl generován jeden PCR produkt kódující aminokyselinové zbytky 80 až 112, který obsahoval nukleotidovou sekvenci kódující zbylé zbytky pro humanizovaný 106 VH (obrázek 12), a byl insertován do Pstl a Xbal míst sedmi vektorů produkovaných v kroku 2.

107

Tabulka

Primery

106vhT-5‘

106-mer sense

106VHA-5

106-mer sense použité pro humanizaci 106 VH

IOÓvhNEP-3'

87-mer anti-sense

IO6vhSY-5’

97-mer sense

HindlII

5’-ATCGTCTAGAAGCTTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGG AGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCA ACCTCTGGATTCACTTTCAATA - 3' SEQ ID. #41

HindlII

5'- ATCGTCTAGAAGCTTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGG AGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTCTCCTGTGCA (7CCTCTGGATTCACTTTCAATA - 3' SEQ ID. #42

Xbal Pst! EcoR.1 Nhel

5’-TCAGTGCTCTAGAACCCTGCAGATCGAATTCAATGCTAGCG ACCCACTCCAGTCCCTTACCTGGTGCCTGGCGAACCCAAGACA TGG - 3' SEQ ID. #43 t

Nhel

5’- CTAGCATTAGTAGTGGTJGTTACATCTACTATGCTGACAGT GTGAAAGGCCGATTCACCATCTCGACjAGATAATGCCAAAAA CATCCTGTATCTGCA - 3' Xhol SEQ ID. #44

Pstl

106vhSY-3'

89-mer anti-sense

Xhol

5'- GATACAGGATGTTTTTGGCATTATCTCTCGAGATGGTGAAT CGGCCTTTCACACTGTCAGCATAGTAGATG7/HC7ACCACTAC TAATG - 3' SEQ ID. #45

106vhDY-5*

97-mer sense lOGvhDY-3'

89-mcr aiiti-sfense l06vhSS-5’

97-mer sense

106vhSS-3'

89-mer anti-sense

Nhel

5'- CTAGCATTAGTAGTGGTÍMTTACATCTACTATGCTGACAGT gtgaaaggccgattcaccatctcgagagataatgccaaaaa CATCCTGTATCTGCA - 3' Xhol SEQ ID. #46

Pstl

Xhol

CGGCCTTTCACACTGTCAGCATAGTAGATG'7/l/( 7'CACCACT ACTAATG-3' SEQ. ID #47

Nhel

5’- CTAGCATTAGTAGTGGT/1G'7/1G'CATCTACTATGCTGACAC.T GTGAAAGGCCGATTCACCATCTCGAGAGATAATGCCAAAAA CATCCTGTATCTGCA - 3'. Xhol SEQ ID. #4X

Pstl

Xhol

5'- GATACAGGATGTTTTTGGCATTATCTCTCGAGATGGTGAAT CGGCCTTTCACACTGTCAGCATAGTAGATCC7/1C7ACCACT

ACTAATG-3¹ SEQ ID. #47

108

Nhel

106vhDS-5' 5’- CTAGCATTAGTAGTGGT6/17X6’CATCTACTATGCTGACAGT

97-mer GTGAAAGGCCGATTCACCATCTCGAGAGATAATGCCAAAAA sense CATCCTGTATCTGCA - 3' Xhol SEQ ID. #51)

Pstl

Xhol

106vhDS-3' 5'- GATACAGGATGTTTTTGGCATTATCTCTCGAGATGGTGAAT

89-mer CGGCCTTTCACACTGTC AGC ATAGTAG ATÍ7C7/17’CACC ACT anti-sense ACTAATG-3' SEQ ID. #51

106vhPst5'

78-mer sense

106vhXba3’

69-mer anti-sense

Pstl

5'- ATCGTCTAGCTGCAGATGAACAGTCTGAGGGCAGAGGACAC GGCCGTCTATTACTGTGCAAGGCACTATGATTACGAC - 3'

SEQ ID. #52

Xbal Bell

5'- TCAGTGCTCTAGATGATCAGAGGAGACGGTGACC.AGGGTTC CTTGACCCCAGTAGTCCATAGCATAGCT- 3' SEQ ID. #53

Podrobněji, konstrukce dvou vektorů byla iniciována generováním dvou PCR fragmentů za použití 106 sFv-Ig/CDM8 jako templátu a buď 106vhT-5' nebo 106vhA-5' jako sense primeru a 106vhNEP-3' jako antisense primeru. Sense primery kódovaly HindlII místo ihned po 5' VH a první tři humanizované VH změny (Lys v pozici 3 na Gin, Lys v pozici 19 na Arg a Thr v pozici 23 na Ala). Kromě toho, 106vhA-5' primer humanizoval zbytek v pozici 24 na Ala, zatímco 106vhj-5' primer uchovával zbytek jako myší (Thr). Antisense primer kodoval změny ve zbytcích 40, 42 a 44 (Thr na Ala,

Glu na Gly a Arg na Gly, v příslušném pořadí) a také kodoval čtyři jedinečná restrikční místa (Nhel, EcoRI, Pstl a Xbal). Dvě PCR zpracované DNA byly potom klonovány do pUC19 jako HindlII-Xbal fragmenty a byly použity pro transformaci DH5a

E. coli. Klony obsahující oba inserty byly izolovány (106vhT-NEP) a verifikovány DNA sekvencováním. Plasmidy byly potom tráveny Nhel, EcoRI a Pstl a lineární DNA byla

109 izolována a purifikována.

Sense oligonukleotid v každém ze čtyř párů oligonukleotidů, které kódovaly změny v pozicích 55 a 56 byly fosforylovány a tepelně zpracovány na korespondující antisense oligonukleotidy. Tyto generované dsDNA fragmenty měly 5' Nhel přesah a 3' Pstl přesah a obsahovaly jedinečné Xhal místo. Primerový pár 106vhDS-5' a 106vhDS-3' kodoval myší zbytky v pozici 55 a 56 (Asp-Ser); 106vhDY-5' a 106vhDY-3' kodoval myší zbytky a lidské zbytky v pozici 55 a 56, v příslušném pořadí (Asp-Tyr); 106vhSS-5' a 106vhSS-3' kodoval lidské a myší zbytky v pozici 55 a 56, v příslušném pořadí (Ser-Ser); a 106vhSY-5' a 106vhSY-3' kodoval lidské zbytky v pozici 55 a 56, (Ser-Tyr). Všechny z primerových párů také kódovaly čtyři další změny z myší na lidskou sekvenci (Thr na Ile v pozici 57, Pro na Ala v pozici 60, Arg na Lys v pozici 64 a Arg na Lys v pozici 75). Čtyři fragmenty, které byly generovány, byly potom ligovány do 106vhA-NEP/pUC19 a 106vhTNEP/pUC19 nejprve tráveného restrikčními enzymy. Plasmidy byly použity pro transformaci DH5o; E. coli a DNA z klonů štěpených Xhol byla izolována a verifikována DNA sekvencováním. Z osmi kombinací bylo získáno sedm (106vhA-DS representující lidskou, myší, myší sekvenci v pozicích 24, 55 a 56 nebyl nikdy izolován z pUC19). Sedm plasmidů bylo tráveno Pstl a Xbal a nyní byly připraveny pro obdržení konečného fragmentu. Tři z klonů byly vybrány pro pozdější použití a byly označeny následovně: VH ASY 24-17 (hhh); VH TDS 15-34 (mmm); a VH ADY

7-8 (hmh).

Zbývající zbytky, které byly změněny na lidskou sekvenci,

110 byly kódovány na sense primeru 106vhPst5' (Ser na Asn v pozici 82a, Ser na Ala v pozici 84, a Met na Val v pozici 89) a antisense primeru 106vhPst3' (Ser na Leu v pozici 108). Pro účely klonování kodoval primer 106vhPst5' také Pstl místo a 106vhPst3' kodoval Xbal místo s Bell místem ihned před ním. Tento fragment byl získán PCR za použití 106 sFv-Ig/CDM8 jako templátu. Fragment byl tráven Pstl a Xbal a byl ligován do sedmi plasmidů. Opět byly plasmidy použity pro transformaci DH5a E. coli a DNA z klonů byla sekvencována pro verifikaci inserce.

F. Seskupení genových kazet humanizovaných 106 sFv

Humanizované expresní kazety jednořetězcového Fv pro 106 byly seskupeny jako původní myší 106 sFv, ale za použití následujících primerů:

111

Tabulka 12

Primery použité pro konstrukci genových kazet humanizovaného sFv 106 hulO6V_LSalI

45-mer sense

Sáli

5'- atcgtctaggtcgacatccagatgactcagtctcca

TCATCC-3’ SEQ ID.//54 hulO6V_LLK3' 5'- GCCACCCGACCCACCACCGCCAGCGCCACCGCCACC ⁶°-.^mer CCGTTTGATCTCGACCTTGGTCCC - 3’ SEQ ID. //55 anti-sense liu 106V₁₍LK5'

60-mer sense i-TCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAA GTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGA - 3' SEQ ID. //56 hulOÓVuBclI

45-mer anti-sense

Bell

5’- TCAGTGCTGATCAGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC TTGACC - 3' l SEQ ID.//57

Stručně, DNA kódující humanizovaný 106 VL byla vystřižena z pUC19 vektoru, ve kterém byla zařazena. DNA kódující sedm humanizovaných 106 VH byla také vystřižena z pUCl9. DNA fragmenty byly purifikovány a použity v následujících PCR reakcích. Humanizovaný 106 VL byl amplifikován za použití 106VLSalI sense primeru, který kodoval Sáli místo ihned před první zbytek zralého VL a antisense primeru (hulO6V_LLK3'), který byl komplementární k sekvenci kódující posledních devět zbytků VL a prvních 12 zbytků (Gly₄Ser)₃ linkeru. Navíc, sedm humanizovaných 106 VH bylo amplifikováno za použití sense primeru (hulO6V_HLK5'), který kodoval posledních 11 zbytků (Gly^Ser)₃ linkeru následovaných

112 prvními devíti zbytky zralého VH a antisense primeru (hulO6V_KBclI) komplementárního k sekvenci kódující posledních devět zbytků VH regionu a Bell místo.

Modifikované 106 VL byly smíseny s každou z modifikovaných 106 VH DNA za přítomnosti přebytku VL sense primeru (hulO6V SalI5') a VH antisense primeru (hul06V Bell), takže jednotlivé humanizované VL byly připojeny do každého z jednotlivých humanizovaných VH do sedmi VL-link-VH jednotlivých kódujících regionů PCR s překrývajícími se rozsahy.

Humanizované 106 VL-link-VH sFv genové kazety byly potom sestaveny pro sFv-Ig expresi v pUC19-Ig vektoru. Tento vektor obsahoval L6 V leader sekvenci následovanou Sáli místem a Bell místem před sekvencí kódující pant-CH₂-CH₃lidského IgG^ a stop kodonem sousedící s Xbal místem. Cysteinové zbytky v pant regionu byly mutované na serinové zbytky pro usnadnění monomerní exprese sFvIg fúsního proteinu. Humanizované 106 VL-link-VH sFv genové kazety byly štěpeny Sáli a Bell a byly ligovány do pUC-Ig. DH5a E. coli byly transformovány konstrukty a kolonie byly vyšetřovány na přítomnost insertů. Šest ze sedmi VH konstruktů bylo správně insertováno do pUC-Ig. Celé L6 V_k leader/humanizovaný 106 VL - link - VH sFv/lidcký Ig kazety byly vystřiženy z pUC-Ig za použití HindlII Xbal a byly transferovány do pCDM8 savčího expresního vektoru a byly amplifikovány transformací v E. coli kmen MC1061/p3. Ze šesti bylo pět správně insertováno do pCDM8. DNA od každého byla získána pro transfekci COS buněk.

Malý rozsah transfekci COS buněk byl proveden na 60 mm

113 tkáňových kultivačních plotnách za použití DEAE - dextranové metody. Tři ml transfekčního supernatantů byly z každé odebrány po třech dnech kultivace a byly testovány na přítomnost solubilního sFv-Ig fúsního proteinu Western blot a ELISA. Kromě toho, anti lidský Ig sendvičový ELISA test byl proveden pro kvantifikaci množství proteinu exprivovaného každým konstruktem a poměry různých proteinů vážících gp39 byly měřeny Biacore analýzou.

G. Předběžná analýza humanizovaných 106 sFv exprivovaných transientní transfekci v COS buňkách

SDS-PAGE a Western blot transfekčních supernatantů ukázaly, že z pěti konstruktů použitých pro transfekci COS buněk (humanizovaný 106 sFv obsahující VH fragmenty 106vhT-DS, 106vhT-SS, 106vhT-SY, 106vhA-DY a 106vhA-SY) čtyři secernovaly protein do supernatantů. Nebyl zde žádný protein exprivovaný humanizovaným 106 sFv obsahujícím 106vhT-SY (huVL/l06vhT-SY). Ze čtyř expresorů tři exprivovaly protein správné velikosti pro sFv-Ig fúsní protein (55 kda). HuVL/106vht-SS produkoval protein aberantní velikosti (přibližně 97 kDa). Hladiny exprese pro HuVL/l06vht-DS se zdály být podobné jako pro myší 106 sFv, zatímco hladiny pro expresi HuVL/106vhA-DY a HuVL/l06vhA-SY byly nižší.

Hladina proteinu bylůa detekována senvičovou ELISA pro detekci lidských Ig smyček. ELISA plotny byly potaženy kozím anti-lidským Ig v PBS a blokovány v PBS + 0,1% BSA. Transfekční supernatanty byly inkubovány pečlivě a v v ředění 1:5 po jednu hodinu při pokojové teplotě. Plotny byly

114 potom promyty a inkubovány s kozím anti lidským Ig-křenová peroxidasa v ELISA konjugovaném pufru po 1 hodinu při pokojové teplotě. Plotny byly znovu promyty a bylo přidáno 1:100 ředění EIA Buffered Substráte (Genetics System Corp.) Barvící reakce byla ukončena 3M H₂SO₄ a byla měřena optická densita při 450 - 595 nm Titertek multiwell čtečky mikroploten. Přibližné koncentrace proteinů byly určeny srovnáním se známými koncentracemi CD40Rgammal (CD40-Ig), které byly určeny Bio Rad kitem proteinové koncentrace. Proteinové koncentrace byly:

huVL/l06vhA-DY huVL/l06vhA-DY huVL/l06vhA-SY huVL/l06vhT-SY huVL/l06vhT-SS huVL/l06vhT-DS (klon 10) (klon 12) (klon 21) (klon 26) (klon 36) (klon 46)

0,62 ^g/ml 0,82 ^g/ml 0,77 /xg/ml 0 Mg/ml 0,15 Mg/ml 1,20 μ<3/™.1

Supernatanty byly testovány na svou schopnost blokovat expresi E selektinu na endoteliálních buňkách. Endoteliální buňky lidské umbilikální vény (HUVEC, Clonetics Corporation) byly kultivovány a stimulovány M199 (Medium 199, Gibco BRL) s přísadami následujících do konečných koncentrací: 4 mM L-glutamin, 48,5 M9/^ml penicilín, 80 μ^/ναΐ streptomycin, 1 mM pyruvát sodný (Sigma) , 90 μ??/™¹ heparin (Sigma) , 30 Mg/ml endoteliální růstový doplněk (Collaborative Biomedicals Products) a 20% fetální hovězí sérum. Endoteliální buňky byly kultivovány ve tkáňových kultivačních nádobách ošetřených 1% želatinou a byly umístěny v hustotě 1,5 χ 10⁴buněk/ml na 96 jamkových Costar tkáňových kultivačních plotnách s plochým dnem, které byly potaženy 1 Mg/jamku

115 fibronektinu (Collaborative Biomedicals Products).

Endoteliální buňky byly stimulovány 1-2 dny po umístění na plotny. Buňky byly použity v pasáži 4 nebo 5.

sgp39 a supernatanty obsahující humanizovaný sFv-Ig byly přidány v M199 mediu + přísady v 10 μΐ na jamku a byly inkubovány při 37 °C po 4 hodiny před testováním na expresi E-selektinu. Plotny byly potom dvakrát promyty chladným PBS, fixovány po 10 minut 0,5% glutaraldehydem v PBS při 4 °C, promyty čtyřikrát 3% kozí sérum/PBS/20 mM EDTA (blokující pufr) a blokovány po 1 hodinu při 37 °C nebo přes noc při 4 °C ve stejném pufru. Buňky byly ošetřeny 100 μΐ anti-E- a P-selectin (R and D Systems) v koncentraci 0,25 gg/ml v blokujícím pufru po 1 hodinu při 37 °C. Plotny byly čtyřikrát promyty blokujícím pufrem, inkubovány 1 hodinu při 37 °C s křenová peroxidasa konjugovaným anti myším IgG v blokujícím pufru (Jackson ImmunoResearch, 100 /xg/jamku, ředění 1:2000) a potom promyty čtyřikrát. Plotny byly vyvíjeny za použití EIA chromagen reagens v EIA pufrovaném substrátu (oboje od Genetics Systems, 100 gg/jamku, ředění 1:100) a ukončeny 1001 na jamku IN H₂SO₄. Absorbance byla měřena při dvojí vlnové délce 450 nm a 630 nm.

HuVL/l06vhA-DY, huVL/l06vhA-SY a huVL/l06vhT-DS všechny inhibovaly expresi E selektinu, ačkoliv ne tak účinně jako původní myší 106 sFv-Ig (obrázek 13). Rozdíly mohou být přičteny nízké proteinové expresi v huVL/106vhA-DY a huVL/106vhA-SY, ačkoliv u huVL/106vhT-DS se zdá, že exprivuje hladiny srovnatelné s původním myším 106 sFv-Ig.

Poměry různých proteinů vážících se na gp39 byly určeny za použití Biacore. HuVL/l06vhA-SY a huVL/l06vhT-DS se oba

116 vázaly těsně na lupínky potažené gp39, s aktivitou srovnatelnou s původním myším 106 sFv-Ig (obrázek 14). Protože se tyto proteiny nevydařily, nebylo jasné, zda afinity těchto sFv-Ig byly velmi vysoké (profily ukazují afinity Kd asi 10^1θ M nebo vyšší) nebo zda byly proteiny agregovány a byly vázány multivalentně. HuVL/l06vhA-DY je výsledkem. Z jeho profilu byla hodnocena afinita přibližně Kd = 10 ⁷ až 10 “^s M. U původního myšího 106 sFv-Ig byla měřena afinita Kd = 1,6 x 10® M, takže se zdá, že huVL/l06vhA-SY a huVL/l06vhT-DS jsou humanizované anti gp39 sFv s vysokou afinitou.

U huVL/l06vhA-SY a huVL/l06vhT-DS bylo zjištěno, že se těsně váží na lidský gp39 a vykazují funkční aktivitu v inhibici exprese E selektinu na endoteliálních buňkách. Ačkoliv se zdá, že huVL/106vhA-SY exprivuje nižší hladiny než huVL/l06vhT-DS, je nejvíce lidský z humanizovaných 106 sFv.

Příklad 13

Generování humanizované monoklonální protilátky 106 jako celé protilátky

Za použití humanizovaných 106 sFv-Ig jako templátu byly variabilní lehké řetězce a tři formy variabilních těžkých řetězců amplifikovány PCR za použití primerů, které zaváděly sekvence kódující signální sekvence templátu lidské protilátky. Tyto PCR produkty byly insertovány do vektoru obsahujícího sekvence kódující konstantní regiony lidského kappa (k) nebo lidského gamma (gammal) pro generování

117 kompletního lehkého nebo těžkého řetězce, v příslušném pořadí. Tyto vektory také obsahovaly vhodné geny lékové resistence pro generování a amplifikaci stabilních buněčných linií exprivujících protein. Proteiny každého ze tří konstruktů, (viz tabulka 13 pro nomenklaturu) byly produkovány transientní expresí v COS buňkáchTyto proteiny byly testovány jako surový supernatant v testech pro inhibici proliferace B buněk za použití solubilního gp39 (sgp39) za přítomnosti anti lidského IgM, produkci protilátek B buňkami stimulovanými aktivovanými T buňkami a indukci exprese E selektinu na endoteliálních buňkách gp39* linií T buněk.

Následuje stručný popis konstrukce expresních vektorů pro humanizovanou anti gp39 monoklonální protilátku 106 s aminokyselinami Thr, Asp, Ser v pozicích 24, 55 a 56, v příslušném pořadí (označen hl06-2). Konstrukce expresnmích vektorů proběhla přes sérii intermediátních plasmidů, kde byly manipulovány různé funkční regiony a restrikční místa. Také byly seskupeny různé regiony kódující požadované variabilní a jiné imunoglobulinové domény.

118

Tabulka 13

Nomenklatura

Sekvence v pozici Alternativní jména proteinů

24, 55, 56

TDS	mmm	hKl	hl06-2
ADY	hmh	hK6
ASY	hhh	hK8	hl06-l

Stručně, nejprve byly konstruovány tři plasmidy, pD13, pD16 a pD18, použité v konstrukci konečných vektorů a expresních kazet.

A. Konstrukce pD13

Plasmid pD13 byl konstruován a dvozen od pcDNA3 plasmidu (Invitrogen) ve dvou krocích. Nejprve, SV40 promotor/enhancer a gen resistence pro neomycin byly odstraněny trávením Nael a izolací 3,82 kb fragmentu. Tento byl nahrazen SV40 promotor/enhancerem a dhfr genem z pSV2-dhfr. pSV2-dhfr sekvence byla izolována jako 1,93 kb fragment po trávení PvuII a BamHI. 3,82 a 1,93 kb fragmenty byly společně ligovány do a použity k transformaci MC1061 bakterií po doplnění přesahujích konců 1,93 kb fragmentem z pSV2-dhfr. Správný produkt (označený pD12) byl potvrzen uvolněním 890 bp fragmentu po trávení HindlII.

Ve druhém kroku byl polylinker nahrazen alternativním restrikčním místem trávením výsledného vektoru vzniklého výše

119

Asp718 a Bspl201. Oligonukleotidy LH7 (SEQ ID NO: 64) a LH8 (SEQ ID NO: 65) byly tepelně zpracovány a klonovány ExoII klonováním (K. Hsio, 1993, Nucl. Acids Res. 21: 5528 - 5529) a byly použity pro kompletaci plasmidu pD13. Vzniklý plasmid byl použit pro transformaci kompetentních E. coli DH5o; a správný produkt byl potvrzen sekvencováním polylinkerového regionu.

B. Konstrukce pD16 a pD17

Plasmid pD16 byl konstruován a dvozen od pcDNA3 plasmidu (Invitrogen) v sérii kroků, které přidávaly (1) polilinker sekvenci upstream CMV promotoru pro linearizaci, (2) deletovaly SV40 promotor/enhancer a gen resistence a neomycin a nahrazovaly je histon H3 transkripční terminační sekvencí, SV 40 promotorem (enhancer deletovaným) a DHFR genem a (3) inserovaly gastrinovou transkripční terminační sekvenci upstream od CMV promotoru. Plasmid pD17 byl odvozen od pD16 odstraněním Nhel místa z linearizace polylinkeru.

Plasmid PD16 byl odvozen od pcDNA3 (invitrogen) nejprve trávením BglII a ligováním oligonukleotidů LH1 (SEQ ID NO:

58) a LH2 (SEQ ID NO: 59) do plasmidu po tepelném zpracování oligonukleotidů. Po ligaci byl vzniklý plasmid (pcDNA3-LSI) použit pro transformaci kompetentních E. coli DH5a a správný produkt byl potvrzen uvolněním 230 bp fragmentu po trávení restrikčními enzymy Nhel a Nrul.

Plasmid pcDNA3-LSI byl potom tráven NgoMI, Pvul a Bsml. Po trávení byl izolován 2,0 kb NgoMI-PvuI fragment. Plasmid pD12 (popsaný výše) byl tráven Pvul a Sphl pro odstranění

120

SV40 enhanceru a byl izolován 3,6 kb fragment.

Oligonukleotidy LH3 (SEQ ID NO: 60) a LH4 (SEQ ID NO: 61) kódující histon H3 transkripční terminační sekvencibyly tepelně zpracovány a potom ligovány s 2,0 NgoMI-PvuI fragmentem a 3,6 Pvul-Sphl fragmentem. Vzniklý plasmid pcTwD-LSl byl potvrzen produkcí 3,3, 0,95, 0,82 a 0,63 kb fragmentů po trávení Nhel plus Ncil a produkcí 4,2, 1,0,

0,26 a 0,23 b fragmentu po trávení Sphl plus BstEII.

Inserce gastrin transkripční terminační sekvence pro vytvoření plasmidů pD16 byla provedena trávením pcTwD-LSl BssHII a Narl a izolováním 5,7 kb fregmentu a ligováním s tepelně upravenými oligonukleotidy LH5 (SEQ ID NO: 62) a LH6 (SEQ ID NO: 63). Po ligaci byl produkt použit pro transformaci kompetentní E. coli MC1061 a správná konstrukce byla potvrzena produkcí 4,8, 0,6 a 0,31 kb fragmenty po trávení NgoMI plus Spěl a produkcí 3,3, 1,0, 0,82 a 0,67 fragmentů po trávení NgoMI plus Ncol.

Plasmid pD17 byl odvozen od pD16 trávením Bstl a Nhel a doplněním přesahujících konců za použití Klenow polymerasy. Reakční směs byla samoligována a použita ke transformaci kompetentních E. coli DH5qí. tento krok odstranil Nhel místo z linearizačního polylinkeru a byl významný pro pozdější krok v konstrukci pD17-hGla a pD17-hK8.Hl popsaný dále.

C. Konstrukce expresního vektoru lehkého řetězce

Expresní vektor pro lehký řetězec humanizovaného 106 byl konstruován ve dvou fázích. Nejprve e konstruována expresní kazeta lehkého řetězce obsahující lidský C_k gen a potom je

121 konstruován kompletní expresní vektor lehkého řetězce pD16-hK8.Ll (obrázek 15).

Stručné, 2,9 kb EcoRI fragment byl izolován z pGk.ll (Walls et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 2921 - 2929) a byl ligován do plasmidu pD13 (popsaného výše) neprve tráveného EcoRI. Tento konstrukt (pD13-hCka) obsahující lidský C_k exon a sousední intronové sekvence byl použit pro transformaci E, coli DH5a a správný proukt byl potvrzen restrikčním trávením. Trávení EcoRI vedlo k fragmentům 5,7, 2,8 a 0,3 kb a trávení Sací vedlo k fragmentům 7,1, 1,1 a 0,5b.

Konstrukce expresní kazety lehkého řetězce byla dokončea odstraněním C_K fragmentu spolu se sousedními polylinkerovými sekvencemi z pD13 a insertováním do pD16. Plasmid pD13-hCka byl tráven Asp7181 a Bspl201 pro uvolnění C_k fragmentu a polilinkerových sekvencí. Stejné enzymy byly použity pro linearizaci pD16 a C_K obsahující fragment byl ligován do pD16 za vytvoření pD16-hCka. Po transformaci DH5a E.coli a amplifikaci byl správný konstrukt potvrzen uvolněním 2,9 kb fragmentu po trávení Asp7181 a Bspl201 a linearizaci po trávení restrikčním enzymem přítomným v pD16, ale nikoliv pD13. Nukleotidová sekvence byla také potvrzena sekvencováním různých regionů konstruktu.

Ve druhé fázi konstrukce expresního vektoru lehkého řetězce byla sestavena oligonukleotidová sekvence kódující signální peptid a hlO6Vk sekvenci a byla insertována do EcoRV a Xhol míst pD16-hCka. Oligonukleotidová sekvence kódující signální sekvenci a hlO6Vk sekvence byly sestaveny pomocí PCR SOEing (splice by overlap extension reaction) (Ho, S. N. et

122 al., 1989, Gene, 77: 51 - 59) za použití hulO6VL klonu 10 jako templátu a primerů LH9 (SEQ ID NO: 66), LH10 (SEQ ID NO: 67), LH11 (SEQ ID NO: 68), a LH12 (SEQ ID NO: 69). V kombinacích kódují primery LH9. LH10 a LH11 EcoRV restrikční místo, signální peptid a 5' konec hulO6Vk. Primer LH12 kodue Jk, intronové sekvence a Xhol restrikční místo. Kompletní konstrukt byl použit pro transformaci kompetentních E. coli DH5a homologní rekombinací (Babek et al., Nucl. Acids Res., 21: 3601 - 3602) . Plasmidová DNA z kolonií byla vyšetřována PCR na přítomnost 441 bp insertu po trávení Asp7181 a Xhol.

Konečný konstrukt plasmidu je znázorněn na obrázku 15 a byl dále potvrzen sekvencováním celého V region insertu a některých sousedících regionů. Klony obsahující správné velikosti fragmentů byly označeny pD16-hK8.LIA, pD16-LK8.LIB, pD16-hK8.LIC. Sekvencování klonu pD16-hK8.LIA objevilo jednu mutaci v nukleotidové sekvenci klonu, u které se zdálo, že nenarušuje schopnost sekvence exprivovat protein a vedla ke zralému lehkému řetězci. Sekvence nukleových kyselin (SEQ ID NO: 76) a sekvence aminokyselin (SEQ ID NO: 77) jsou znázorněny na obrázku 16. Mutace změnila iniciační Methioninovou signální sekvenci na ATC, ale existuje zde jiný methionin kódovaný dvěma aminokyselinovými kodony downstream (obrázek 16).

D. Konstrukce expresního vektoru těžkého řetězce

Expresní vektory pro těžké řetězce celé humanizované protilátky 106 byly také konstruovány ve dvou fázích. V první fázy byla DNA kódující exony pro CH1, CH2 a CH3 lidského

123 gamma 1 konstantního regionu insertována do pD17. Ve druhé fázy byly sestaveny variabilní regiony monoklonální protilátky 106 a byly ligovány do vektoru obsahujícího sekvence pro konstantní regiony těžkého řetězce.

Za použití pNgammal.12 (Walls et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 2921 - 2929) jako templátu byl lidský gamma 1 gen amplifikován PCR za použití primerů LH13 (SEQ ID NO: 70) a LH14 (SEQ ID NO: 71). Sense primer (LH13) obsahoval Clal místo pro klonování do pIC20R následované sekvencí lidské gamma 1 5' CH1 domény. Nukleotidy kódující první dva aminokyselinové zbytky (alanin a serin) byly mutovány tak, že kočovaly Nhel restrikční místo (GCTAGC). LH14, antisense primer, měl jedinečné restrikční BstEII místo v CH1 následované Xhol místem pro klonování do pIC20R. 0,2 kb PCR fragment a pIC20R (dříve trávený Clal a Xhol) byly krátce ošetřeny exonukleasou III a použity ke transformaci E. coli DH5oí. Kolonie obsahující inserty byly určeny PCR a DNA sekvence byla verifikována. Vzniklý plasmid byl označen pIC-hGINhe.Bst.

Zbývající části lidského genomového genu pro imunoglobulin gamma 1 byly insertovány do expresní kazety trávením pNgl.16 (Walls et al., výše) HindlII a BamHl. HindlII místo je právě na 5' konci CH1, zatímco BamHl místo e na 3' CH3 domény. pIC-hGINhe.Bst byl tráven HindlII a BamHl a ligován do HindlII - BamHl fragmentu pNgl.16. Transformace vedla ke vzniku plasmidů nesoucího 5¹ konec gamma 1 genu následovaný celým gamma 1 genem. Toto bylo ptvrzeno uvolněním 3,1 a 2,6 kb fragmentů, když byl plasmid tráven EcoRI.

124

Opakované části gamma 1 genu byly odstraněny trávením BstEII, samoligací plasmidu a transformací. Delece opakujících se sekvencí byly potvrzeny DNA sekvencováním regionů okolo BstEII místa. Vzniklý vektor, označený pIC-hGINhe.Bam, obsahuje lidský gamma 1 gen začínající kodonem 1 (s arteficiálním Nhel místem) až BamHl místo 3' lidského gamma 1 CH3 domény.

pIC-hGINhe.Bam byl potom tráven Nhel a BamHl pro uvolnění gamma 1 insertu. Gamma 1 insert byl ligován do pD13 (popsaný výše), který byl nejprve tráven Nhel a BamHl a byl použit k transformaci E. coli DH5a. Správný produkt označený pD13-hGl byl potvrzen produkcí 5,1 a 3,25 kb fragmentů po trávení BglII a produkcí 3,25 a 1,54 fragmentů po trávení BglII a BamHl.

Expresní kazeta označená pD17-hGl byla konstruována z pD13-hGl trávením pD13-hGl Asp7181 a BamHl a izolováním 2,7 kb fragmentu, tento fragment obsahue lidský gamma 1 gen a sousední polylinkerové sekvence. DMI (Dam) bakterie byly použity pro amplifiaci pD17 a izolovaný plasmid byl tráven Asp7181 a Bell, což dávalo 5,6 kb vektorový fragment. 2,7 kb lidský gamma 1 kódující fragment byl ligován do izolovaného vektorového fragmentu a byl použit pro transformaci kompetentních E. coli DH5a a správnost konstrukce byla potvrzena uvolněním 7,13 a 1,26 kb fragmentů po trávení BstEII.

Konstrukce expresního vektoru těžkého řetězce byla dokončena insercí PCR fragmentu kódujícího signální peptid a hl06 Vh sekvenci, ASY, do Nhel a Xhol míst pD17-hGla. PCR

125 fragment byl konstruován splice overlap extension za použití V^ASY 24-17 (hhh) jako templátu a primerů LH15 (SEQ ID NO: 72), LH16 (SEQ ID NO: 73), LH17 (SEQ ID NO: 74) a LH18 (SEQ ID NO: 75). V kombinaci kódují primery LH15,

LH16 a LH17 EcoRV restrikční místo, signální peptid a 5' konec h 106 V_k. Primer LH16 kóduje JH část genu variabilního těžkého řetězce až arteficiální Nhel místo v 5' konci CHI domény. Tato konstrukce neposkytuje žádný intron mezi JH a CHI doménami. PCR reakce byly opakovány se dvěma vnějšími primery (LH15 a LH18) pro potvrzení úplné délky produktu. Vnější primery také poskytovaly dostatečný přesah se sekvencí vektoru v cílovém regionu a umožňovaly konování homologních rekombinací.

Pro inserci PCR fragmentů do pD17-hGla byly EcoRV a Nhel použity pro linearizaci vektoru a fragmenty byly ligovány a použity k transformaci kompetentních E, coli DH5a; homologní rekombinací (Babeck et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 3601 3602). Přítomnost insertů byla určena PCR a sekvencováním variabilního regionu. Obrázek 17 je znázorněním konečného konstruktu pro pD17-hK8.Hl. DNA sekvencování bylo provedeno pro insert a sousedící regiony pro potvrzení konečného produktu. Sekvence nukleových kyselin (SEQ ID NO: 78) a aminokyselinových zbytků (SEQ ID NO: 79) pro sekvencované regiony jsou znázorněny na obrázku 18.

Dva jiné konstrukty obsahující kodony, které kódují myší aminokyselinové zbytky v pozicích 24, 55 a 56 (pD17-hKl.Hl) variabilního regionu těžkého řetězce a lidské aminokyselinové zbytky v pozicích 24 a 56 a myší aminokyselinový zbytek v pozici 55 (pD17-hK6.Hl) byly také konstruovány. Konstrukce

126 byly provedeny stejným způsobem jako je popsáno výše pro pD17-hK8.Hl s tou výjimkou, že byly použity PCR templáty V^TDS 15-34 (mmm) a V^ADY 7-8 (hmh), v příslušném pořadí.

Tabulka 14

Primery použité pro konstrukci humanizované monoklonální protilátky 106

LH1 - 5' primer pro linearizující místo polylinkeru upstream od CMV promotoru

5'-GATCTGCTAGCCCGGGTGACCTGAGGCGCGCCTTTGGCGCC-3'

SEQ ID NO: 58

LH2 - 3' primer pro linearizující místo polylinkeru upstream od CMV promotoru psaný v orientaci 3' - 5'

3'-ACGATCGGGCCCACTGGACGCCGCGCGGAAACCGCGGCTAG-5'

SEQ ID NO: 59

LH3 - 5' primer pro histon H3 transkripční terminační sekvenci

5'-CCGGGCCTCTCAAAAAAGGGAAAAAAAGCATG-3'

SEQ ID NO: 60

LH4 - 3' primer pro histon H3 transkripční terminační sekvenci

127

J -CGGAGAGTTTTTTCCCTTTTTTTC-5'

SEQ ID NO: 61

LH5 - 5' primer pro gastrin transkripční terminační sekvenci 10 5'-CGCGCCGGCTTCGAATAGCCAGAGTAACCTTTTTTTTT A

ATTTT ATTTT ATTTT ATTTTTGAG AT GG AGTTT GG-3¹

SEQ ID NO: 62

LH6 - 3¹ primer pro gastrin transkripční terminační sekvenci 3'-GGCCGAAGCTTATCGGTCTCATTGGAAAAAAAAATTAA

AAT AAAATAAAATAAAAACTCT ACCTC A AACCGC-5 ’

SEQ ID NO: 63

LH7 - klonující polylinker pro pD13

5'TAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCAATTTAAATTGATATC TCCTTAGGTCTCGAGTCTCTAGATAACCGGTCAATCGAT

0 TGGGATTCTT 3' SEQ ID NO: 64

LH8 - klonující polylinker pro pD13

5' GACACTATAGAATAGGGCCCTTCCGCGGTTGGATCCAAC ACGTGAAGCTAGCAAGCGGCCGCAAGAATTCCAATCGAT

TGACCGGTTA 3' _{SEQ m NQ;}

LH9 - sense primer signálního peptidového regionu pro hu 106 VL ATCTCCTTAGGTCTCGAGACCATGGACATGAGGGTTCCGG CTC,

SEQ ID NO: 66

LH10 - anti-sense primer signálního peptidového regionu pro hu 106 VL

128

GGAGCCAGAGTAGCAGGAGCCCCAGGAGCTGAGCCGGAAC

CCTCA

SEQ ID NO: 67

LH11 - sense primer signálního peptidového regionu pro hu 106 VL

CTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGTGACATCCAGAT

GACTCAGTCTC

SEQ ID NO: 68

LH12 sense primer hu 106 VL, Jk- a 3' intron

GATTGACCGGTTATCTAGAGACTCGAGACTTACGTTTGATC

TCGACCTTGG

SEQ ID NO: 69

LH13 - sense primer Nhel až BstEII fragmentu lidského gamma 1 genu, Clal a Nhel místa jsou podtržena

5' GACCATGATTACGAATTCCATCGATGCTAGCACCAAGGG CCCATCGGTCTTCC 3'

SEQ ID NO: 7U

LH14 - anti-sense primer Nhel až BstEII fragmentu lidského gamma 1 genu, Xhol a Nhel místa jsou podtržena

5' AGCTTTCGCGAGCTCGAG_GGTCACCACGCTGCýGAGGGA

SEQ ID NO: 71

LH15 - sense primer pro signální peptidový reqion hu 106 VH

TTGCGGCCGCTTGCTAGCACCATGGAACTCGGCCTCCGCTG

GGTT

SEQ ID NO: 72

LH16 - anti-sense primer pro signální peptidový region hu 106 VH

129

5 CTGGACACCTTCT AAAATAGC AAC AAGGAAAACCCAGCGG A

GGCCGAG

SEQ ID NO: 73

LH17 - sense primer pro signální peptidový region hu 106 vh ATTTTAGAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTC

TGG

SEQ ID NO: 74

LH18 - anti-sense primer hu 106 VH, JH-CH1 region TGGGCCCTTGGTGCTAGCCGAGGAGACGC

CT SEQ ID NO: 75

Příklad 14

Testování humanizované monoklonální protilátky 106 na její biologickou aktivitu

V tomto příkladu byly tři formy humanizované monoklonální protilátky 106 produkovány transientní expresí z COS buněk. Protilátky byly testovány na (1) inhibici proliferace B buněk, (2) produkci protilátek B buňkami stimulovanými T buňkami a (3) induki exprese E selektinu na endoteliálních buňkách.

Transfekce COS buněk byla provedena jak je popsáno dříve (Linsley et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 721 - 73Q; Aruffo and Seed, 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8573 - 8577). Plasmidová DNA byla přidána do transfekčního media v koncentraci 1 ^g/ml v celkovém objemu 12 ml/150 mm plotnu. Po sedmi až deseti dnech bylo kultivační medium odebráno,

130 centrifugováno do čirosti a pasážováno přes protein

A sepharosovou kolonu jak bylo popsáno výše. Kolona byla potom promyta PBS a navázaná protilátka byla eluována 0,05 M citrátu sodného, pH 3,0. Frakce byly neutralizovány, poolovány a dialyzovány proti chladnému PBS. Dialyzovaný eluát byl koncentrován za použití Centriprep koncentrátoru (Amersham) a proteinová koncentrace byla určena absorbancí při 280 nm za použití extinkčního koeficientu 1,35 ml.mg-^cm¹.

Inhibice proliferace B buněk solubilní gp39 (sgp39) a anti-lidským IgM byla určena kultivací 5 χ 10^Ξ klidových lidských tonsilárních buněk za přítomnosti sgp39, králičích anti-lidský IgM imunokorálků a různých množství humanizované 106 monoklonální protilátky v 96 jamkových plotnách po 72 hodin při 37 °C, 6% CO₂. Plotny byly potom pulsovány 1 /xCi/jamku (³H)-thymidinu po 18 hodin a (³H) inkorporace byla určena. Všechny testy byly provedeny trojnásobně a výsledky jsou uvedeny jako procento inhibice ve srovnání s kulturami uchovávánými pouze v kultivačním mediu. Jak lze vidět na obrázku 19, všechny tři konstrukty humanizované celé protilátky monoklonální protilátky 106 byly schopné inhibice stimulace proliferace B buněk solubilním gp39 a anti-lidským IgM. Konstrukt obsahující aminokyselinové zbytky z myší sekvence v pozicích 24, 55 a 56 byl nejpodobnější původní myší protilátce.

Produkce protilátek lidskými periferními B buňkami stimulovanými aktivovanými T buňkami byla testována jak bylo popsáno výše. Stručně, lidské mononukleární buňky periferní krve byly zbaveny monocytů a přirozených zabiječů a potom

131 separovány na T buňky a B buňky E rozetováním. Izolované T buňky byly ošetřeny mitomycinem C a potom kokultivovány s B buňkami v anti CD3 monoklonální protilátkou potažených jamkách 96 jamkové plotny za přítomnosti různých koncentrací různých forem humanizovaných 106 monoklonálních protilátek. Všechny testy byly provedeny trojnásobně a výsledky jsou uvedeny jako procento inhibice ve srovnání s kulturami obsahujícími pouze kultivační medium, které neobsahovalo žádnou anti-gp39 monoklonální protilátku.

Jak lze vidět na obrázku 20, všechny protilátky byly schopny alespoň částečně blokovat schopnost aktivovaných T buněk stimulovat produkci protilátek B buňkami. Žádná z humanizovaných protilátek nebyla tak účinná jako myší anti-gp39 monoklonální protilátka v blokování produkce protilátek, Protilátka mající myší aminokyselinové zbytky v pozici 24, 55 a 56, hl06-2, byla nejúčinější.

Humanizované konstrukty celé protilátky byly také testovány na svou schopnost zabránit indukci exprese E selektinu na endoteliálních buňkách gp39 linií T buněk. To bylo provedeno jak je popsáno výše s tou výjimkou, endoteliální buňky lidské umbilikální vény byly kokultivovány s BMS-2 buňkami (Jurkat linií o které je známo, že konstitutivně exprivuje gp39) místo sgp39, za přítomnosti humanizovaných anti-gp39 monoklonálních protilátek. Po čtyřech hodinách byla úroveň exprese E selektinu měřena ELISA. Obrázek 21.

Výsledky tohoto testu, stejně jako předešlých testů, demonstrují, že všechny vyrobené konstrukty humanizovaných celých protilátek inhibují interakci mezi gp39 a CD40, což

132 brání, v tomto případě, indukci exprese E selektinu na endoteliálních buňkách aktivovanými T buňkami. Také, jak demonstruje výše uvedené testy, konstrukt mající myší aminokyselinové zbytky v pozicích 24, 55 a 56, hl06-2, byl nejpodobnější původní myší monoklonální protilátce 106.

Depozita buněčných linií

Následující hybridomní buněčné linie byly deponovány v American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-2776, USA za podmínek Budapešťské smlouvy.

Hybridom	ATCC označení
39-1.29	HB 11808
39-1.132	HB 11809
39-1.134	HB 11810
39-1.106	HB 11811
39-1.7	HB 11812
39-1.37	HB 11813
39-1.77	HB 11814
39-1.59	HB 11815
39-1.122	HB 11816
39-1.156	HB 11817
39-1.128	HB 11818
39-1.124	HB 11819
39-1.26	HB 11820
39-1.138	HB 11821
39-1.3	HB 11822

133

Claims

Faten-tové n á. ar o 3c ~y

1. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 a přirozený gp39 se stejnou vazebnou aviditou, kde mutantní forma obsahuje nahrazení tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaniu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem; (b) má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, nebo lysinu 143 alaninem; a (c) nereaguje s gp39 ve Western blotu.
2. Monoklonální protilátka podle nároku 1, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-1.3 označeným ATCC HB 11822, 39-1.122 označeným ATCC HB 11816 nebo 39-1.138 označeným ATCC HB 11821.
3. Antigen vazebný fragment podle nároku 1, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-1.3 označeným ATCC HB 11822, 39-1.122 označeným ATCC HB 11816 nebo 39-1.138 označeným ATCC HB 11821.
4. Antigen vazebný fragment podle nároku 3, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
5. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 1, kde protein je Fv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku

2 .

135
6. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp 39 s o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma obsahuje nahrazení tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaniu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem; (b) má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, nebo lysinu 143 alaninem; a (c) nereaguje s gp39 ve Western blotu.
7. Monoklonální protilátka podle nároku 6, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-1.59 označeným ATCC HB 11815.
8. Antigen vazebný fragment podle nároku 7, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-1.59 označeným ATCC HB 11815.
9. Antigen vazebný fragment podle nároku 8, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
10. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 6, kde protein je sFv nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku 7.
11. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp 39 s o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou

136 aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma obsahuje nahrazení šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem; (b) má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129 nebo lysinu 145 alaninem; a (c) nereaguje s gp39 ve Western blotu.
12. Monoklonální protilátka podle nároku 11, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-1.37 označeným ATCC HB 11813 nebo 39-1.132 označeným ATCC HB 11809.
13. Antigen vazebný fragment podle nároku 11, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-1.37 označeným ATCC HB 11813 nebo 39-1.132 označeným ATCC HB 11809.
14. Antigen vazebný fragment podle nároku 11, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
15. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 11, kde protein je Fv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku 12 .
16. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp 39 s o něco redukovanou vazebnou ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma obsahuje nahrazení šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo

137 fenylalaninu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem; (b) má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129 nebo lysinu 143 alaninem; a (c) reaguje s gp39 ve Western blotu.
17. Monoklonální protilátka podle nároku 16, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-1.124 označeným ATCC HB 11819 nebo 39-1.156 označeným ATCC HB 11817.
18. Antigen vazebný fragment podle nároku 16, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-1.124 označeným ATCC HB 11819 nebo 39-1.156 označeným ATCC HB 11817.
19. Antigen vazebný fragment podle nároku 18, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
20. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 16, kde protein je sFv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku 17.
21. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 s o něco redukovanou nebo podobnou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145, asparaginu 180 nebo fenylalaniu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem; (b) má

138 slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 obsahujícímu náhradu lysinu 143 alaninem; a (c) nereaguje s gp39 ve Western blotu.
22. Monoklonální protilátka podle nároku 21, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-1.7 označeným ATCC HB 11812, 39-1.128 označeným ATCC HB 11818 nebo 39-1.26 označeným ATCC HB 11820.
23. Antigen vazebný fragment podle nároku 21, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-1.7 označeným ATCC HB 11812, 39-1.128 označeným ATCC HB 11818 nebo 39-1.26 označeným ATCC HB 11820.
24. Antigen vazebný fragment podle nároku 23, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
25. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 21, kde protein je sFv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku 22 .
26. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 a přirozený gp39 se stejnou vazebnou aviditou, kde mutantní forma obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo asparaginu 180 alaninem;

(b) -má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, obsahujícímu nahrazení fenylalaninu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem;

139 (c) má o něco redukovanou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení lysinu 143 alaninem a (d) váže se na gp39 ve Western blotu.
27. Monoklonální protilátka podle nároku 26, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-1.77 označeným ATCC HB 11814, 39-1.106 označeným ATCC HB 11811 nebo 39-1.134 označeným ATCC HB 11810.
28. Antigen vazebný fragment podle nároku 26, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-1.77 označeným ATCC HB 11814, 39-1.106 označeným ATCC HB 11811 nebo 39-1.134 označeným ATCC HB 11810.
29. Antigen vazebný fragment podle nároku 26, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
30. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 26, kde protein je sFv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku

27.
31. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 30, kde protein je 106 sFv-Ig, 7sFv-Ig, humanizovaný 106 sFv-Ig nebo humanizovaný 7 sFv-Ig.
32. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 30, kde protein je humanizovaná monoklonální protilátka 106.

140
33. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 a přirozený gp39 se stejnou vazebnou aviditou, kde mutantní forma obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo asparaginu 180 alaninem;

(b) má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení fenylalaninu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem; (c) váže se na gp39 ve Western blotu.
34. Monoklonální protilátka podle nároku 33, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-1.29 označeným ATCC HB 11808 .
35. Antigen vazebný fragment podle nároku 33, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-1.29 označeným ATCC HB 11808.
36. Antigen vazebný fragment podle nároku 35, kde tento fragment je Fab, F(ab')_, nebo Fv.
37. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 33, kde protein je sFv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky produkované hybridomem 39-1.29 označeným ATCC HB 11808.
38. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 a přirozený gp39 se stejnou vazebnou aviditou, kde mutantní

141 forma obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo asparaginu 180 alaninem; (b) má o něco redukovanou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s přirozeným gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení lysinu 143 alaninem; (c) neváže se na gp39 ve Western blotu.
39. Monoklonální protilátka podle nároku 38, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-7.3E12 označeným ATCC HB 11823 .
40. Antigen vazebný fragment podle nároku 38, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-7.3E12 označeným ATCC HB 11823.
41. Antigen vazebný fragment podle nároku 40, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
42. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 38, kde protein je sFv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky produkované hybridomem 39-7.3E12 označeným ATCC HB 11823.
43. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 a přirozený gp39 se stejnou vazebnou aviditou, kde mutantní forma obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129 alaninem; (b) váže se na mutantní formu lidského gp39 s o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje

142 nahrazení šeřinu 131 a threoninu 135, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem; (c) má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení lysinu 143 nebo tyrosinu 145 alaninem a (d) nereaguje s gp39 ve Western blotu.
44. Monoklonální protilátka podle nároku 43, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-5.6E9 označeným ATCC HB .
45. Antigen vazebný fragment podle nároku 43, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-5.6E9 označeným ATCC HB _.
46. Antigen vazebný fragment podle nároku 45, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
47. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 43, kde protein je sFv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku 44 .
48. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 s podobnou nebo o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou pro přirozený gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, lysinu 143, tyrosinu, asparaginu 180 nebo fenylalaninu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem; a

143 (b)reaguje s gp39 ve Western blotu.
49. Monoklonální protilátka podle nároku 48, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-9.246 označeným ATCC HB _.
50. Antigen vazebný fragment podle nároku 48, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-9.246 označeným ATCC HB _.
51. Antigen vazebný fragment podle nároku 50, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
52. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 48, kde protein je sFv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku 49.
53. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 a přirozený gp39 se stejnou vazebnou aviditou, kde mutantní obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo fenylalaninu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem, (b) má o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení lysinu 143 alaninem; (c) má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení asparaginu 180 alaninem a (d) nereaguje s gp39 ve

144

Western blotu.
54. Monoklonální protilátka podle nároku 53, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-9.11 označeným ATCC HB _.
55. Antigen vazebný fragment podle nároku 53, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-9.11 označeným ATCC HB _.
56. Antigen vazebný fragment podle nároku 55, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
57. Rekombinantní vazebný protein podle nároku 53, kde protein je sFv, humanizovaná protilátka nebo rekombinantní protein obsahující variabilní region protilátky podle nároku 54.
58. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, která je specifická pro lidský gp39 a (a) váže se na mutantní formu lidského gp39 a přirozený gp39 se stejnou vazebnou aviditou, kde mutantní obsahuje nahrazení kyseliny glutamové 129, šeřinu 131 a threoninu 135, tyrosinu 145 nebo fenylalaninu 201 a kyseliny glutamové 202 alaninem, (b) má o něco redukovanou vazebnou aviditou ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení lysinu 143 alaninem; (c) má slabou vazebnou aviditu k mutantnímu gp39 ve srovnání s vazebnou aviditou k přirozenému gp39, kde mutantní forma gp39 obsahuje nahrazení asparaginu 180 alaninem a (d) reaguje s gp39 ve

145

Western blotu.
59. Monoklonální protilátka podle nároku 58, která je protilátkou secernovanou hybridomem 39-9.274 označeným ATCC HB _.
60. Antigen vazebný fragment podle nároku 58, který je fragmentem, který je odvozen od protilátky secernované hybridomem 39-9.274 označeným ATCC HB _.
61. Antigen vazebný fragment podle nároku 58, kde tento fragment je Fab, F(ab')₂ nebo Fv.
62. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, kde protilátka je reaktivní s lidským gp39, ale není vysoce reaktivní s mutantním lidským gp39, ve kterém je kyselina glutamová v pozici 129 nahrazena alaninem.
63. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 62, kde protilátka, její vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány vazbou na gp39 ve Western blotu.
64. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 62, kde protilátka, její vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány neschopností rozpoznávat lidský gp39 ve Western blotu.
65. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment

146 nebo rekombinantní vazebný protein, kde protilátka je reaktivní s lidským gp39, ale není vysoce reaktivní s mutantním lidským gp39, ve kterém jsou serin v pozici 131 a threonin v pozici 135 nahrazeny alaninem.
66. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 65, kde protilátka, její vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány vazbou protilátky nebo jejího antigen vazebného fragmentu na lidský gp39 ve Western blotu.
67. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 65, kde protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány neschopností rozpoznávat lidský gp39 ve Western blotu.
68. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, kde protilátka, antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein je reaktivní s lidským gp39, ale není podobně reaktivní s mutantním lidským gp39, ve kterém je lysin v pozici 143 nahrazen alaninem.
69. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 68, kde protilátka, její vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány neschopností vazby na lidský gp39 ve Western blotu.
70. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 68 kde protilátka,

147 její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány schopností vázat lidský gp39 ve Western blotu.
71. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, kde protilátka, antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein je reaktivní s lidským gp39, ale není vysoce reaktivní s mutantním lidským gp39, ve kterém je tyrosin v pozici 145 nahrazen alaninem.
72. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 71, kde protilátka, její vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány neschopností vazby na lidský gp39 ve Western blotu.
73. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, kde protilátka, antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein je reaktivní s lidským gp39, ale není podobně reaktivní s mutantním lidským gp39, ve kterém je asparagin v pozici 180 nahrazen alaninem.
74. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 73, kde protilátka, její vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány neschopností vazby na lidský gp39 ve Western blotu.
75. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 73, kde

148 protilátka, její vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány schopností vazby na lidský gp39 ve Western blotu.
76. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein, kde protilátka, antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein je reaktivní s lidským gp39, ale není vysoce reaktivní s mutantním lidským gp39, ve kterém je fenylalanin v pozici 201 a kyselina glutamová v pozici 202 nahrazen alaninem.
77. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 76, kde protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány neschopností vazby na lidský gp39 ve Western blotu.
78. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 76, kde protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou dále charakterizovány schopností vazby na lidský gp39 ve Western blotu.
79. Způsob pro detekci X vázaného hyer IgM syndromu vyznačující se tím, že obsahuje:

a) izolaci lymfocytů periferní krve od pacientů;

b) aaktivaci izolovaných lymfocytů periferní krve;

c) fixaci a imobilizování izolovaných a aktivovaných lymfocytů periferní krve;

d) smísení monoklonální protilátky, jejího antigen vazebného fragmentu nebo rekombinantního vazebného fragmentu

149 podle jakéhokoliv z nároků 1 až 78 s aktivovanými, fixovanými a permeabilizovanými lymfocyty periferní krve;

e) detekci protilátky navázané na buňky.
80. Způsob pode nároku 79 vyznačující se tím, že protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein jsou konjugovány s detekovatelnou značkou.
81. Způsob pode nároku 79 vyznačující se tím, že způsob dále obsahuje krok přidání značené sekundární protilátky specifické pro první protilátku její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein po kroku d).
82. Způsob pode nároku 81 vyznačující se tím, že značkou je fluorofor, radioaktivní izotop, enzym nebo chromofor.
83. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 78, konjugovaná na detekovatelný markér.
84. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 83, kde detekovatelný markér je fluorofor, radioaktivní izotop, enzym nebo chromofor.
85. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 78, kde je protilátka konjugovaná na terapeutické agens.

150
86. Monoklonální protilátka, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný protein podle nároku 85, kde terapeutické agens je radioizotop, toxin nebo chemoterapeutické agens.
87. Rekombinantní vazebný protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 78, kde rekombinantní vazebný protein obsahuje variabilní region schopný vazby na antigen a proteinový toxin nebo terapeutické agens ve formě fúsního proteinu.
88. Hybridom HB 11808, HB 11809, HB 11810, HB 11811, HB 11812, HB 11813, HB 11814, HB 11815, HB 11816, HB 11817, HB 11818, HB 11819, HB 11820, HB 11821, HB 11822, HB 11823, HB _, HB _, HB _ a HB _ jak sou deponovány v

American Type Culture Collection.
89. Izolovaná a purifikovaná sekvence nukleové kyseliny, která kóduje variabilní region lehkého řetězce imunoglobulinu majícího sekvenci aminokyselinových zbytků SEQ ID NO: 12.
90. Sekvence nukleových kyselin podle nároku 89, kde sekvencí nukleových kyselin je SEQ ID NO: 11.
91. Izolovaná a purifikovaná sekvence nukleové kyseliny, která kóduje variabilní region těžkého řetězce imunoglobulinu majícího sekvenci aminokyselinových zbytků SEQ ID NO: 14.
92. Sekvence nukleových kyselin podle nároku 91, kde sekvencí nukleových kyselin je SEQ ID NO: 13.
93. Izolovaná a purifikovaná sekvence nukleové kyseliny,

151 která kóduje variabilní region lehkého řetězce imunoglobulinu majícího sekvenci aminokyselinových zbytků SEQ ID NO: 16.
94. Sekvence nukleových kyselin podle nároku 93, kde sekvencí nukleových kyselin je SEQ ID NO: 15.
95. Izolovaná a purifikovaná sekvence nukleové kyseliny, která kóduje variabilní region těžkého řetězce imunoglobulinu majícího sekvenci aminokyselinových zbytků SEQ ID NO: 18.
96. Sekvence nukleových kyselin podle nároku 95, kde sekvencí nukleových kyselin je SEQ ID NO: 17.
97. Farmaceutická kompozice obsahující monoklonální protilátku, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný fragment podle jakéhokoliv z nároků 1 až 78 a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
98. Farmaceutická kompozice obsahující monoklonální protilátku, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný fragment podle jakéhokoliv z nároků 1 až 78 konjugovanou na detekovatelný markér a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
99. Farmaceutická kompozice obsahující monoklonální protilátku, její antigen vazebný fragment nebo rekombinantní vazebný fragment podle jakéhokoliv z nároků 1 až 78 konjugovanou na terapeutické agens a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
100. Způsob pro inhibici aktivace B buněk u zvířete

152 vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství farmaceutické kompozice podle nároku 76 zvířeti.
101. Způsob podle nároku 100 vyznačující se tím, že zvířetem je člověk.
102. Způsob pro inhibici aktivace B buněk u zvířete vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství farmaceutické kompozice podle nároku 78 zvířeti.
103. Způsob podle nároku 102 vyznačující se tím, že zvířetem je člověk.
104. Způsob pro inhibici růstu nádorových buněk exprivujících gp39 antigen vyznačující se tím, že obsahuje podání tumor inhibičního množství farmaceutické kompozice podle nároku 99 zvířeti.
105. Způsob podle nároku 104 vyznačující se tím, že zvířetem je člověk.
106. Způsob podle nároku 104 vyznačující se tím, že terapeutické agens je radioaktivní izotop nebo toxin.
107. Způsob podle nároku 102vyznačující se tím, že inhibice aktivace B buněk brání autoimunitní odpovědi, rejekci transplantovaného orgánu, reakci štěpu proti hostiteli, alergické odpovědi nebo zánětlivé odpovědi.

*

153
108. Způsob podle nároku 107 vyznačující se tím, že autoimunitním onemocněním je psoriasa, revmatoidní artritida, systémový lupus erythematodes nebo diabetes mellitus.
109. Způsob pro znázornění buněk exprivujících gp39 na svém povrchu u pacienta vyznačující se tím, že obsahuje:

a) podání farmaceutické kompozice podle nároku 97 pacientovi za podmínek umožňujících tvorbu komplexů vazebný protein/antigen na povrchu buněk exprivujících gp39; a

b) detekování přítomnosti komplexů vazebný protein/antigen na povrchu buněk jak je ukázáno přítomností detekovatelného markéru