CZ2020276A3 - Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použit - Google Patents
Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použit Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2020276A3 CZ2020276A3 CZ2020276A CZ2020276A CZ2020276A3 CZ 2020276 A3 CZ2020276 A3 CZ 2020276A3 CZ 2020276 A CZ2020276 A CZ 2020276A CZ 2020276 A CZ2020276 A CZ 2020276A CZ 2020276 A3 CZ2020276 A3 CZ 2020276A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mesylate
- common
- purine
- hydroxy
- crystalline
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P21/00—Plant growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
- C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
- C07D473/32—Nitrogen atom
- C07D473/34—Nitrogen atom attached in position 6, e.g. adenine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
- C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Abstract
Předmětem předkládaného vynálezu jsou mesyláty heterocyklických cytokininů obecného vzorce I, kde R je vybrán ze skupiny obsahující C3-C15 cykloalkyl, furfuryl, allyl, 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl, 3-methylbut-2-en-1-yl, 4-hydroxy-3-methylbutyl, 4-hydroxy-1,3-dimethylbut-2-en-1-yl, 4-hydroxy-1,3-dimethylbutyl, benzyl; kde cykloalkyl, allyl, benzyl a furfuryl mohou být nesubstituovány nebo volitelně substituovány 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny obsahující hydroxy, halogen, methyl, hydroxymethyl a methoxy. Tyto sloučeniny jsou vhodné zejména pro zemědělské a biotechnologické využití, a jejich velkou výhodou je zvýšená vodorozpustnost oproti volným bázím heterocyklických cytokininů.
Description
Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká mesylátových solí heterocyklických cytokininů, jejich použití v zemědělství a v biotechnologických aplikacích, a přípravků obsahujících tyto deriváty.
Dosavadní stav techniky
Cytokininy (CKs) jsou adeninové deriváty obsahující různé substituenty připojené na atomu N6 heterocyklické molekuly adeninu. V závislosti na struktuře postranního řetězce je rozdělujeme na dvě skupiny a nazýváme je isoprenoidní nebo aromatické CKs. Isoprenoidní cytokininy jsou skupinou, která se v přirozených podmínkách vyskytuje častěji. Hlavní představitelé isoprenoidní ch cytokininů jsou N6-isopentenyladenin (iP) a jeho hydroxylovaná forma /ram-zcatin (/Z). Oba zmiňované isoprenoidní CKs jsou považovány za aktivní, vzhledem k silné vazbě na cytokininové receptory v Arabidopsis (Inoue et al., 2001, Nature 409, 1060-1063). Zeatin existuje také jako cri-isomer (cZ), který vykazuje nižší cytokininovou aktivitu (Spíchal et al., 2004, FEBS Journal 276, 244-253.), ale je přirozeně se vyskytujícím CK v rostlinách (Gajdošová et al., 2011, J Exp Bot 62, 2827 - 2840). Nasycení dvojné vazby v isoprenoidním řetězci zeatinu může vést ke vzniku dihydrozeatinu (DHZ), který vykazuje nižší biologickou aktivitu ve tkáňových kulturách než zeatin (Letham, 1963, Life Sci, 8:569-573).
Kromě volných bází, které jsou aktivními formami cytokininů v rostlinách, se CKs také vyskytují v přírodním materiálu jako ribosidy (v nichž je ribóza připojena zpravidla na atom N9 purinového skeletu) a ribotidy (v nichž ribóza ještě obsahuje fosfátovou skupinu v poloze 5 ). Cytokininy jsou rostlinně-specifické chemické přenašeče informací (fýtohormony), které hrají ústřední roli v regulaci rostlinného buněčného cyklu a v mnoha dalších růstových a vývojových procesech.
Po objevu hydroxylovaných aromatických cytokininů topolinů, jako přirozeně se vyskytujících cytokininů (Strnad 1997, Physiol Plant 101, 674-688), se tyto nové látky začaly uplatňovat namísto dlouho používaných cytokininů, například 6-benzylaminopurinu (BAP), /ram-zcatinu (tZ) anebo kinetinu (K) v rostlinných tkáňových kulturách (RTK) jako vhodná alternativa. Celosvětově se v posledních patnácti letech používají topoliny a jejich deriváty ve výzkumných laboratořích. Topoliny, zejména meto-topolin a jeho deriváty, jsou využívány k iniciaci kultury výhonů a pupenů, při optimalizacích mikropropagačních protokolů a pro potlačení různých in vitro vyvolaných fýziologických poruch (např. hyperhydricita, nekróza vzrostných vrcholů, tvorba chimér, inhibice tvorby kořenů během aklimatizace a časná senescence) u mnoha různých druhů rostlin pěstovaných v in vitro kultuře. Mnoho studií svědčí o rostoucí popularitě a výhodách (ačkoliv ne univerzálně pro všechny rostlinné druhy) topolinů v porovnání s jinými CKs (Adeyemi et al. 2012, Plant Tissue Organ Cult. 108: 1-16.). Cytokininy jsou bohužel prakticky nerozpustné ve vodě, ačkoliv mají vysokou permeabilitu buněčnou membránou. Nízká rozpustnost ve vodě a pomalá rychlost rozpouštění jsou pak často limitujícími factory odpovědnými za nízkou biodostupnost těchto sloučenin, což limituje jejich aplikační možnosti. Navzdory dlouho známému faktu, že cytokininy mají schopnosti regulovat růst a vývoj rostlin, nebyly zatím implementovány téměř žádné jednoduché technologie ošetření rostlin. Jedním z přijatelných vysvětlení je právě špatná rozpustnost a špatná biologická dostupnost, jakož i rychlý metabolismus cytokininů v jejich známých formách.
Soli aktivních látek mohou existovat v různých fýzikálních formách včetně amorfních a krystalických forem. Zatímco amorfní formy sestávají z neuspořádaného uspořádání molekul, krystalické formy mají molekuly uloženy s periodicky opakovanou strukturu v konkrétní krystalové mřížce. Pokud pevná látka existuje ve dvou nebo více krystalových formách, které mají
- 1 CZ 2020 - 276 A3 odlišné rozložení a/nebo konformaci molekuly v krystalové mřížce, říkáme, že vykazují polymorfismus a rozdílné krystalové formy jsou nazývány polymorfý. Polymorfý pevných látek mohou mít odlišné fýzikální charakteristiky a chemické chování v pevné fázi (například reaktivitu). Polymorfý se liší ve své vnitřní sruktuře (uspořádání), a proto mají odlišné fyzikální a chemické vlastnosti, například tzv. crystal packing, termodynamiku, spektroskopická data, kinetiku, interfaciální a mechanické vlastnosti. Tyto vlastnosti mohou mít dopad na vlastnosti, kvalitu nebo účinnost produktu, včetně stability, rozpustnosti nebo biodostupnosti. Příprava amorfních forem v průmyslovém měřítku je často problematická. Mnoho procesů používaných k přípravě tzv. aktivních farmaceutických ingrediencí (API), zejména pak krystalických, není vhodných pro použití v průmyslovém měřítku.
Krystalizací nových cytokininových solí, tzn. nových pevných forem dané sloučeniny, mohou být dosaženy unikátní vlastnosti v porovnání s existujícími pevnými formami cytokininů nebo jejich stávajících popsaných solí. Krystalografické a spektroskopické vlastnosti konkrétních forem jsou kromě jiných technik klasicky stanovovány za pomocí rentgenové práškové difrakce (XRPD) a monokrystalové rentgenové difrakce. Konkrétní krystalické formy často vykazují odlišné termické vlastnosti, například odlišný bod tání.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou mesyláty (mesylátové soli) N6-substituovaných adeninových derivátů obecného vzorce I,
(I) kde Rje vybrán ze skupiny obsahující C3-C15 cykloalkyl, fúrfiiryl, allyl, 4-hydroxy-3-methylbut2-en-l-yl, 3-methylbut-2-en-l-yl, 4-hydroxy-3-methylbutyl, 4-hydroxy-l,3-dimethylbut-2-en-lyl, 4-hydroxy-1,3-dimethylbutyl, benzyl, kde cykloalkyl, allyl, benzyl a fúrfiiryl mohou být nesubstituovány nebo volitelně substituovány 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny obsahující hydroxy, halogen, methyl, hydroxymethyl a methoxy.
Mesyláty heterocyklických cytokininů obecného vzorce I podle tohoto vynálezu také zahrnují případné opticky aktivní izomery a jejich směsi včetně racemátů.
V celé specifikaci, pokud z kontextu nevyplývá jinak, názvy substituentů mají následující význam:
Halogen znamená radikál fluoru, bromu, chloru nebo jódu;
Hydroxyl znamená skupinu -OH;
Methyl znamená skupinu -CH3;
Methoxy znamená skupinu -OCH3;
-2 CZ 2020 - 276 A3
Hydroxymethyl znamená skupinu HO-CH2-;
C3-C15 cykloalkyl znamená mono- nebo polycylickou alkylovou skupinu sestávající ze 3 až 15-ti uhlíkových atomů (s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl aadamantyl).
Výhodně jsou sloučeniny obecného vzorce I vybrané ze skupiny zahrnující:
6-(2-hydroxycyklopropylamino)purin mesylát, 6-(3-hydroxycyklobutylamino)purin mesylát, 6-(3methoxycyklobutylaminojpurin mesylát, 6-(3-methoxycyklopentylamino)purin mesylát, 6cyklohexylaminopurin mesylát, 6-(3-hydroxycyklohexylamino)purin mesylát, 6-(3methoxycyklohexylaminojpurin mesylát, 6-(3-hydroxyfurfurylamino)purin mesylát, 6-(4hydroxyfurfurylaminojpurin mesylát, 6-(5-hydroxyfurfurylamino)purin mesylát, 6-(3methoxyfurfurylaminojpurinmesylát, 6-(4-methoxyfurfurylamino)purin mesylát, 6-(5methoxyfurfurylaminojpurin mesylát, 6-(2-hydroxy-3-chlorbenzylamino)purin mesylát, 6-(2hydroxy-5-chlorbenzylamino)purin mesylát, 6-(4-hydroxy-3-chlorbenzylamino)purin mesylát, 6(3-hydroxy-5-chlorbenzylamino)purin mesylát, 6-(2-hydroxy-3-jodbenzylamino)purin mesylát, 6(2-hydroxy-5-jodbenzylamino)purin mesylát, 6-(4-hydroxy-5-jodbenzylamino)purin mesylát, 6(3-hydroxy-5-jodbenzylamino)purin mesylát, 6-(2-hydroxy-3-brombenzylamino)purin mesylát, 6(4-hydroxy-3-brombenzylamino)purin mesylát, 6-(3-hydroxy-5-brombenzylamino)purin mesylát, 6-(2-hydroxy-3-fluorbenzylamino)purinmesylát, 6-(2-hydroxy-5-fluorbenzylamino)purin mesylát, 6-(4-hydroxy-3-fluorbenzylamino)purin mesylát, 6-(3-hydroxy-5fluorbenzylaminojpurin mesylát, 6-(2,3-dihydroxy-4-methoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(2,4dihydroxy-3-methoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(2,5 -dihydroxy-4methoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(2-hydroxybenzylamino)purin mesylát, 6-(3hydroxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(3-hydroxy-4-methoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(3hydroxy-5-methoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(4-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(2-hydroxy-4methoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(4-hydroxy-2-methoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(2methoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(3-methoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(4methoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(2,3-dimethoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(2,4dimethoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(2,5-dimethoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(3,4dimethoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(2,3,4-trimethoxybenzylamino)purin mesylát, 6-(2,3,5trimethoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(3,5-dimethyl-4-hydroxybenzylamino)purin mesylát, 6allylaminopurin mesylát, 6-isopentenylaminopurin mesylát, 6-(3,3-dimethylallylamino)purin mesylát, 6-(3-hydroxymethyl-3-methylallyl)amino)purin mesylát, 6-(Z)-(4-hydroxy-3-methylbut2-en-l-ylamino)purin mesylát, 6-(E)-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)purin mesylát, 6(Z)-(l-methyl-4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylaminojpurin mesylát, 6-(E)-(l '-methyl-4hydroxy-3 -methylbut-2-en-1 -ylaminojpurin mesylát, 6-(4-hydroxy-3 -methylbutylaminojpurin mesylát, and 6-(l'-methyl-4-hydroxy-3-methylbutylaminojpurin mesylát.
Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou heterocyklické cytokininové mesyláty obecného vzorce I vybrané ze skupiny zahrnující 6-furfurylaminopurin mesylát, 6-(2chlorbenzylaminojpurin fluorbenzylaminojpurin fluorbenzylaminojpurin hydroxybenzylaminojpurin methoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(3-chlorbenzylamino)purin mesylát,6-(2mesylát, 6-(3-fluorbenzylaminojpurin mesylát,6-(4mesylát, 6-(2-hydroxybenzylamino)purin mesylát, 6-(3mesylát, 6-(2-methoxybenzylaminojpurin,6-(3mesylát, 6-(3-methylbut-2-en-l-ylaminojpurin mesylát, 6 benzylaminopurin mesylát, 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylaminojpurin mesylát, 6-(Z)-(4hydroxy-3 -methylbut-2-en-1 -ylaminojpurin mesylát, 6-(E)-(4-hydroxy-3 -methylbut-2-en-1 ylaminojpurin mesylát, 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3-dimethylbut-2-en-l-ylamino)purin mesylát, 6-(Ej(4-hydroxy-1,3 -dimethylbut-2-en-1 -ylaminojpurin mesylát, 6-(4-hydroxy-3 methylbutylaminojpurin mesylát a 6-(4-hydroxy-l,3-dimethylbutylamino)purin mesylát.
V jednom aspektu vynálezu jsou předmětem vynálezu krystalické mesyláty N6-substituovaných
-3 CZ 2020 - 276 A3 adeninových derivátů obecného vzorce I.
S výhodou je předmětem vynálezu krystalický benzylaminopurin mesylát mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 6.2; 10.0; 15.2; 15.7; 18.6; 18.8; 19.3; 20.4; 23.5; 23.8; 24.4; 27.6 ± 0.2° 2-theta.
S výhodou je předmětem vynálezu krystalický meta-topolin mesylát ((3hydroxybenzylaminojpurin mesylát) mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 8.1; 9.7; 13.1; 15.6; 16.8; 17.6; 19.1; 19.5; 22.2-, 24.6; 24.8; 24.9; 25.7 ±0.2° 2-theta.
S výhodou je předmětem vynálezu krystalický ortho-topolin mesylát ((2hydroxybenzylamino)purin mesylát) mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 9.8; 12.1; 16.8; 17.8; 18.3; 18.3; 20.7; 23.3; 24.1; 25.1; 26.8 ± 0.2° 2-theta.
S výhodou je předmětem vynálezu krystalický kinetin mesylát (furfůrylaminopurin mesylát) mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 6.2; 18.9; 19.8; 20.4; 22.6; 23.9; 27.7; 27.8 ± 0.2° 2-theta.
Mesylátové soli vzorce I se obecně připraví reakcí báze (N6-substituovaného adeninového derivátu) a methylsulfonové kyseliny v polárním rozpouštědle, zejména C1-C4 alkoholu, nej výhodněji v methanolu. Krystalizace se pak provádí s výhodou z acetonu.
Mesylátové soli purinových cytokininů vzorce I, a zejména jejich krystalické formy, mají zlepšené fýzikálně-chemické vlastnosti, a to zejména lepší rozpustnost v polárních rozpouštědlech včetně vody, vyšší stabilitu a biodostupnost, a snazší průmyslovou přípravu těchto látek.
Cytokininové mesyláty obecného vzorce I podle předkládaného vynálezu mají širokou škálu biologických aktivit, včetně antioxidační, anti-senescentní, podporující nakládání floému, ovlivnění tvorby nadzemní části rostliny i kořene, pro-diferenciační aktivity, které jsou zvláště užitečné v zemědělských a biotechnologických aplikacích (např. k ošetření rostlinných pletiv a buněk). Jejich velkou výhodou, zvyšující i jejich biologické aktivity, je zvýšená rozpustnost ve vodě a biodostupnost. Sloučeniny dle předkládaného vynálezu (a přípravky je obsahující) mají minimální nebo nulovou toxicitu. To umožňuje jejich použití v širokém rozsahu aplikací.
Předmětem vynálezu je použití sloučenin obecného vzorce I pro ochranu rostlinných buněk in vivo a in vitro proti oxidativnímu a elektrofilnímu stresu.
Předmětem vynálezu je také použití sloučenin obecného vzorce I jako antioxidantů pro inhibici lipidové, proteinové a DNA peroxidace v rostlinách in vivo nebo in vitro.
Tento vynález se dále týká použití cytokininových mesylátů obecného vzorce I pro zvýšení výnosu, zlepšení zakořeňování, zvýšení počtu odnoží, zvýšení multiplikace a oddálení senescence v produkci užitkových rostlin a zemědělských plodin, zejména obilovin (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, žito, oves, čirok a příbuzné druhy), řepy (cukrové a krmné řepy), malvic, peckovic a drobného (měkkého) ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, borůvky), luštěnin (fazole, čočka, hrách, sója), olejovin (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, Ricinus, kakaové plody, arašídy), tykvovitých (okurky, dýně, melouny), vláknitých rostlin (bavlna, len, konopí, juta), citrusů (pomeranče, citróny, grepy, mandarinky), zeleniny (špenát, skořicovník, kafr) nebo rostlin jako tabák, ořechy, lilek, cukrová třpina, čaj, vinná réva, chmel, banány a přírodní kaučuk a léčivé rostliny, stejně jako okrasné rostliny. Plodiny zahrnují takové rostliny, které se ukázaly tolerantní vůči různým skupinám růstových regulátorů/faktorů při použití konvenčních šlechtitelských metod nebo při metodách genetického inženýrství.
-4 CZ 2020 - 276 A3
Předmětem vynálezu je také použití sloučenin obecného vzorce I jako růstově-regulační a prodiferenciační faktory. Mohou být využity k optimalizaci podmínek v rostlinné tkáňové kultuře in vitro. Konkrétně pro in vitro zahrnují somatickou embryogenezi, mikropropagaci, androgenezi, gynogenezi, suspenzní a protoplastové kultury. Sloučeniny dle předkládaného vynálezu mohou být take použity jako inhibitory růstu kořene v rostlinné tkáňové kultuře.
Cytokininové mesyláty obecného vzorce I mohou být podle předkládaného vynálezu dále využity v rostlinných tkáňových kulturách k potlačení nežádoucích fýziologických poruch, jako jsou např. hyperhydricita, nekróza vzrostných vrcholů, tvorba chimér, inhibice tvorby kořenů během aklimatizace a časná senescence.
Předmětem vynálezu je použití sloučeniny obecného vzorce I jako růstového regulátoru v rostlinných tkáňových kulturách ke stimulaci proliferace a morfogeneze.
Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučenin obecného vzorce I jako růstové regulátory při klonování rostlinných i živočišných zárodečných buněk a embryí, s výhodou oocytů.
Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučenin obecného vzorce I pro inhibici nebo oddálení senescence rostlinných buněk a celých rostlin.
Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučenin obecného vzorce I v zemědělství a v biotechnologiích pro inhibici, oddálení nebo redukci nepříznivých efektů souvisejících se senescencí, a to jak in vivo tak in vitro, tato použití také zahrnují zlepšení celkového vzhledu a kondice rostlin, konkrétně rostlinných epidermálních a mezofylových buněk, a také pro inhibici, oddálení nebo redukci senescence, žloutnutí, ztráty chloroplastů a/nebo chlorofylu.
Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučenin obecného vzorce I pro omlazení rostlinných buněk a/nebo stimulaci buněčné proliferace a/nebo jejich diferenciace v organismu.
Výše uvedená použití sloučenin obecného vzorce I obvykle zahrnují aplikaci účinného množství alespoň jedné sloučeniny obecného vzorce I na buňky (např. v tkáňové kultuře), rostlinné organely, části rostlin nebo na celé rostliny. Sloučeniny vzorce I lze aplikovat samotné, nebo - obvykleji - v podobě přípravku s rozpouštědly, nosiči a/nebo pomocnými látkami.
Vynález dále zahrnuje zemědělské a biotechnologické přípravky obsahující nejméně jeden cytokininový mesylát obecného vzorce I a vhodný nosič. Sloučeniny podle obecného vzorce I jsou použity v nezměněné formě nebo výhodně společně s pomocnými látkami, běžně používanými pro formulaci přípravků. Za tímto účelem jsou přípravky výhodně formulovány jako koncentráty, účinné látky, jakož i suspenze a disperse, s výhodou izotonické vodné roztoky, zředěné emulze, rozpustné prášky, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a take obalované formulace, např. polymemími látkami. Stejně jako u typu přípravku, způsoby aplikace, jako je postřik, rozprašování, práškování, rozptyl, natírání nebo zalévání, se volí v souladu se zamýšlenými cíli a převažujícími okolnostmi. Přípravky mohou být sterilizovány a/nebo mohou obsahovat další pomocné látky neutrální povahy, jako jsou konzervační činidla, stabilizátory, smáčedla nebo emulgátory, solubilizační činidla, stejně jako hnojivá, donory stopových prvků nebo jiných prostředků k dosažení speciálních efektů.
Cytokininové mesyláty podle obecného vzorce I mohou být smíseny s jinými růstově regulačními látkami (růstovými regulátory), hnojivý a pesticidy, což může vést k synergické aktivitě.
V tomto textu termín in vivo znamená použití v živé celé rostlině nebo části rostliny schopné samostatného života. Termín in vitro znamená v buňce, v organele nebo v odebrané části rostliny, nebo v uspořádání zahrnujícím pouze fúnkční sloučeniny z rostlin či zvířat, jako jsou enzymy či látky pro přenos informací v buňce.
- 5 CZ 2020 - 276 A3
PŘÍPRAVKY
Přípravky obsahující sloučeninu vzorce obecného I (aktivní složka) a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty) a smáčedla.
Příklady vhodných aniontových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34485.
Také vhodné pro přípravu kompozic, které obsahují sloučeninu vzorce I jsou povrchově aktivní látky běžně používané při formulaci prostředků, které jsou popsány např. v McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981; Stache, H., Tensid-Taschenbuch, Carl Hanser Verlag, Munich, 1981; a M. a J.Ash, Encyclopedia of Surfactants, Vol.1-3, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81.
Formulace přípravku obsahuje váhově od 0.1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0.1 do 95% (w/w) aktvní složky cytokininového mesylátu, přičemž obsahuje váhově smáčedlo a to od 0.1 do 25%.
Ačkoliv jsou komerční produkty obvykle připravovány ve formě koncentrátů, konečný uživatel upotřebí naředěný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou stabilizátory', např. rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný palmový olej, řepkový olej nebo sojový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory', zvlhčovadla nebo emulgátory, viskozitní činidla, poj iva, lepidla, a take hnoj iva a další aktivní přísady. S výhodou jsou používány přípravky následujícího složení (% - hmotnostní procento).
Emulgované koncentráty:
Aktivní složka: smáčedlo: kapalný nosič:
Prášky:
Aktivní složka:
Pevný nosič:
Suspenzní koncentráty:
Aktivní složka: voda: smáčedlo:
Smáčívé prášky: Aktivní složka: Smáčedlo: Pevný nosič:
až 90 %, s výhodou 5 až 20 % až 30 %, s výhodou 10 až 20 % až 94 %, s výhodou 70 až 85 %
0.1 až 10 %, s výhodou 0.1 až 5 %
99.9 až 90 %, s výhodou 99.9 až 95 % až 75 %, s výhodou 10 až 50 % 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 % až 40 %, s výhodou 2 až 30 %
0.5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 % 0.5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 % až 95 %, s výhodou 15 až 90 %
Granule:
Aktivní látka:
Pevný nosič:
0.1 až 30 %, s výhodou 0.1 až 15 %
99.9 až 70 %, s výhodou 99.9 až 85 %
Pro použití sloučenin vzorce I nebo kompozic je obsahujících se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:
-6CZ 2020 - 276 A3
Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje (epoxidizovaný kokosový olej, řepkový olej nebo sojový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučenin obecného vzorce I nebo jejich solí, nebo kompozic je obsahujících, se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:
i) Obalování osiva
a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulaci sloučeninu vzorce I, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování). V tomto případě se použije 1 až 500 g sloučeniny podle obecného vzorce I (4 g až 2 kg smáčivého prášku) na 100 kg semen.
b) Obalování osiva emulzifíkovaným koncentrátem sloučeniny podle obecného vzorce I v souladu s metodou a) (mokré obalování)
c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do 1000 ppm sloučeniny podle obecného vzorce I s výhodou následného usušení semen (imeryní obalování)
Obalování semen nebo ošetřování klíčících semenáčků je přirozeně preferovanou metodou aplikace, jelikož ošetření aktivní látkou je směřováno a cílí na plodiny. Obecně je sloučenina vzorce I používána v množství 1 až 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin, určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).
ii) Aplikace cisternové směsi i postřikem
Kapalná formulace je aplikována samotná nebo ve směsi s dalším růstovým regulátorem postřikem na rostliny, v množství od 0,05 g do 0,5 kg sloučeniny vzorce I na hektar. Taková cisternová aplikace se provádí před anebo po setí, zejména na vzešlé rostliny (listová aplikace) v množství postřikové jíchy nebo smáčedla 100 - 600 1/ha v závislosti na druhu plodiny.
iii) Aplikace do semenné brázdy
Sloučenina dle obecného vzorce I je zavedená do otevřené brázdy oseté semenem ve formě emulzifíkovaného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulator aplikován cestou obvykle používanou při pre-emergentním procesu.
iv) Kontrolované uvolňování aktivních látek
Sloučenina/ny vzorce I jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizovaným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny. Jestliže je to žádoucí, je možné take aplikovat obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou dobu (obalované granule).
Objasnění výkresů
Obr. 1 ukazuje srovnání XRPD difraktogramů BAP mesylátu krystalické soli s BAP.
Obr. 2 ukazuje srovnání XRPD difraktogramů krystalické soli meto-topolin mesylátu a metatopolinu.
Obr. 3 ukazuje srovnání XRPD difraktogramů krystalické soli or/ňo-topolin mesylátu a ortho
-7CZ 2020 - 276 A3 topolinu.
Obr. 4 ukazuje molekulární strukturu krystalické soli meta-topolinu mesylátu získanou za pomocí monokrystalové rentgeno-struktumí analýzy, včetně sítě intermolekulámích vodíkových vazeb
Obr. 5 ukazuje molekulární strukturu krystalické soli ortúo-topolinu mesylátu získanou za pomocí monokrystalové rentgenostruktumí analýzy včetně sítě intermolekulámích vodíkových vazeb
Obr. 6 ukazuje XRPD difraktogram krystalické soli meto-topolin mesylátu jeden měsíc po uskladnění v pevném stavu
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu bez omezení jeho rozsahu. Pokud není uvedeno jinak, všechna procenta a podobná množství jsou založena na hmotnosti.
Příklad 1 Příprava krystalické soli wieřa-topolin [6-(3-hydroxybenzylamino)purin] mesylátu
6-(3-hydroxybenzylamino)purin (meto-topolin volná báze, 241 mg; 1 mmol) byl suspendován v methanolu (10 ml) při laboratorní teplotě a byla přidána po kapkách methansufonová kyselina (100 mg; 1.03 mmol). Po krátkém čase reakční směs změnila barvu z čiré (bílé) i strukturu na nažloutlý roztok. Výsledná reakční směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 20 min a pak odpařena na vakuové rotační odparce do vzniku nažloutlého pevného rezidua, který byl smíchás s 10 ml heptanu a po zfiltrování a promytí heptanem (3x5 ml) byl získán nažloutlý krystalický prášek, který byl vysušen do konstantní hmotnosti při 60° C.
Výtěžek: 88 %; čistota (HPLC-UV/VIS): 98 %+; ESI-MS: [M + H]+= 338.5
Průsvitné bílé krystaly vhodné pro provedení monokrystalové rtg difrakce za účelem stanovení molekulové struktury a práškové difrakce byly připraveny rozpuštěním výše uvedené látky v metanolu po sedmidenním stání a volném vypařování rozpouštědla.
Příklad 2: Příprava krystalické soli orZAo-topolin [6-(2-hydroxybenzylamino)purinu] mesylátu
6-(2-hydroxybenzylamino)purin (ortho-topol in volná báze, 241 mg, 1 mmol) byl suspendován a míchán v methanolu (15 ml) při laboratorní teplotě a byla přidána po kapkách methansulfonová kyselina (100 mg, 1.03 mmol). Výsledná směs byla míchána při laboratorní teplotě po dobu 30 min a pak odpařena na vakuové odparce do vzniku bílé pevné látky, do které byl vlit hexan (10 ml) byla získána bílá krystalická látka. Produkt byl zfiltrován promyt hexanem (3x5 ml) a vysušen při 60 °C do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 310 mg (92 %); čistota (HPLC-UV/VIS): 99 %+; ESIMS: [M + H]+ = 338.51. Průsvitné bílé jehličko vité krystaly vhodné pro monokrystalovou rentgenostruktumí analýzu a práškovou difrakci byly připraveny rozpuštěním pevné látky v metanolu po sedmidenním volném odpařování rozpouštědla.
Příklad 3: Příprava krystalické soli 6-benzylaminopurinu mesylátu
500 mg 6-benzylaminopurinu bylo rozpuštěno v methanolu při 50 °C po dobu 30 min. Poté, co byl BAP zcela rozpuštěn byla přidána po kapkách metansulfonová kyselina (144 μΐ). Roztok byl hodinu refluxován, pak ochlazen na laboratorní teplotu a přemístěn do kádinky opatřené parafilmem. Roztok byl ponechán ke krystalizaci volným odpařováním rozpouštědla po dobu 7 dnů. Krystalická látka byla zfiltrována a promyta ledovým metanolem. Výtěžek: 86 %, čistota (HPLC-UV/VIS): 98 %, ESI-MS: [M + H]+= 322.11. Malé bílé krystalky vhodné pro práškovou difrakci byly připraveny rozpuštěním výše uvedené látky v metanolu a krystalizaci substance při
- 8 CZ 2020 - 276 A3 °C po dobu sedmi dnů.
Příklad 4: Příprava krystalické soli 6-furfuryladeninu (kinetinu) mesylátu
500 mg 6-furfůryladeninu (kinetinu) bylo rozpuštěno v 50 ml metanolu při 50°C po dobu 30 min.
Po úplném rozpuštění kinetinu bylo do směsi přidáno 158 μΐ kyseliny metansulfonové po kapkách. Roztok byl následně hodinu refluxován, pak zchlazen na laboratorní teplotou a ponechán k volnému odpařování rozpouštědla v kádince zakryté parafilmem. Po sedmi dnech stání při teplotě 7 °C byla krystalická látka zfiltrována a promyta ledovým methanolem. Výtěžek: 85 %, čistota (HPLC-UV/VIS): 98 %, ESI-MS: [M + H]+= 312.11. Malé čiré krystaly vhodné pro XRPD práškovou difrakci byly připraveny opětovným rozpuštěním pevné látky v methanolu a volným odpařováním rozpouštědla po dobu 6 dnů při 7 °C.
Příklad 5: Příprava krystalické soli (E)-zeatin (trans-zeatin) mesylátu ((E)-4-((9/ř-purin-6ylamino)-2-methylbut-2-en-l-ol) methansulfonátu) (E)-zeatin (219 mg; 1 mmol) byl rozpuštěn v methanolu (25 ml) a k roztoku byla přidána po kapkách kyselina methasulfonová (100 mg; 1,03 mmol). Roztok byl míchán 20 minut za laboratorní teploty a poté zahuštěn na rotační vakuové odparce na pevný žlutobílý odparek, který byl vymíchán v acetonu (10 ml) za lab. teploty. Bílý krystalický produkt byl odfiltrován, promyt acetonem (3x5 ml) a vysušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek: (255 mg; 81 %).
Čistota (HPLC-UV/VIS): 98 % +, ESI-MS: [M + H]+= 220.11
Příklad 6: Příprava krystalické soli (Z)-zeatin (cřs-zeatin) mesylátu ((Z)-4-((9/7-purin-6ylamino)-2-methylbut-2-en-l-ol) methansulfonátu)
Připraven identickým postupem jako (E) - isomer (viz příklad 5). Výtěžek: 240 mg; 76 %). Čistota (HPLC-UV/VIS): 98 % +, ESI-MS: [M + H]+= 220.11
Příklad 7: Příprava krystalické soli RS-(+/-)-dihydrozeatin mesylátu ((RS)-4-((9/ř-purin-6ylamino)-2-methylbutan-l-ol) methansulfonátu)
RS-(+/-)-dihydrozeatin (221 mg; 1 mmol) byl rozpuštěn v methanolu (20 ml) a k roztoku byla přidána po kapkách kyselina methasulfonová (100 mg; 1.03 mmol). Roztok byl míchán 30 minut za laboratorní teploty a poté zahuštěn na rotační vakuové odparce na pevný téměř bílý odparek, který byl vymíchán v acetonu (10 ml) za lab. teploty. Bílý krystalický produkt byl odfiltrován, promyt acetonem (3x5 ml) a diethyletherem (2x5 ml) a vysušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 260 mg (82 %). Čistota (HPLC-UV/VIS): 98 % +, ESI-MS: [M + H]+= 222.13
Příklad 8: Příprava krystalické soli isopentenyladenin mesylátu (/V-3-(methylbut-2-en-l-yl)9/7-purin-6-amin methansulfonátu)
Isopentenyladenin (203 mg; 1 mmol) byl rozpuštěn v methanolu (25 ml) a k roztoku byla přidána po kapkách kyselina methasulfonová (100 mg; 1,03 mmol). Roztok byl míchán 30 minut za laboratorní teploty a poté zahuštěn na rotační vakuové odparce na pevný bílý odparek, který byl vymíchán v acetonu (10 ml) za lab. teploty. Bílý krystalický produkt byl odfiltrován, promyt acetonem (3x5 ml) a vysušen do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 257 mg (86 %). Čistota (HPLCUV/VIS): 99 % +, ESI-MS: [M + H]+= 204.12
Příklad 9: Prášková difrakce (XRPD) krystalických solí BAP mesylátu, meta-topolin mesylátu, ortho-topolin mesylátu a kinetin mesylátu a porovnání jejich difraktogramů s difraktogramy odpovídajících volných baží BAP, wieřa-topolinu, orZAo-topolinu a kinetinu.
-9CZ 2020 - 276 A3
Prášková rentgenová difrakce (XRPD) byla provedena na přístroji Bruker D8 Avance ECO diffractometer s použitím Cu K-alfa záření a SSD160 detektoru. Přibližně 5 mg vzorku bylo jemně natlačeno do XRPD držáku vzorku. Vzorek byl poté umístěn do přístroje v transmisním módu a analyzován při experimentálních podmínkách popsaných v tabelovaném přehledu viz níže:
XRPD podmínky měření
Scan axis gonio | |
počáteční pozice [°2th.] | 4.0000 |
koncová pozice [°2th.] | 40.00 |
velikost scanu [c2th.] | 0.0100 |
Doba scanu [s] | 0.3 (48) s |
typ scanu | kontinuální |
typ divergenční štěrbiny | fixní |
velikost divergenční štěrbiny [°] | 0.3000 |
délka vzorku [mm] | 10.00 |
teplota měření [° c.] | 25.00 |
materiál anody | Cu |
K-alpha 1 [á] | 1.54060 |
K-alpha2 [á] | 1.54443 |
K-beta [á] | 1.39225 |
K-a2.k-al poměr | 0.50000 |
nastavení generátoru | 40 ma, 25 kv |
poloměr goniometru [mm] | 250.00 |
Dist. Focus-diverg. štěrbiny [mm] | 110.00 |
Spinning | ne |
Srovnání difraktogramů krystalické soli BAP mesylátu a BAP volné báze překrytím obou difraktogramů je uvedeno na obr. 1, zatímco intenzita difraktovaného záření změřená detektorem pro krystalickou sůl BAP mesylátu je uvedena v tabulce 1. Intenzita difraktovaného záření (píků) pro BAP volnou bázi je uvedena v tabulce 2. Srovnání difraktogramů meto-topolin mesylátu a meta-topolinu je uvedeno na obrázku 2 formou překrytí difraktogramů. Intenzita difraktovaného záření zachycená detektorem pro meto-topolin mesylát je uveden v tabulce 3 zatímco pro metatopolin volnou bázi v tabulce 4. Srovnání difraktogramů ortho-topolin mesylátu a ortho-topolinu formou překrytí je uvedeno na obr. 3. Intenzita difraktovaného záření zachyceného detektorem je pro or/Ao-topolin mesylát je uvedena v tabulce 5 zatímco pro o/vóo-topolin uvedena v tabulce 6. Intenzita difraktovaného záření pro krystalickou sůl kinetin mesylátu je uvedena v tabulce 7, zatímco pro kinetin volnou bázi v tabulce 8. Jak je viditelné z překryvů difraktogramů i intenzit difraktovaného záření krystalické soli cytokinin mesylátů se zásadním způsobem liší od difraktogramů volných bází cytokininů a všechny materiály, které byly k měření použity, byly materiály krystalické povahy.
Tab. 1: Relativní intenzity difraktovaného záření, úhly, d-spacing získané práškovou difrakcí pro krystalickou sůl BAP mesylátu
úhel (2-theta) | d-spacing (Á) | rel. intenzita |
5,721 | 15,43427 | 6,9 % |
6,155 | 14,34703 | 100,0 % |
8,216 | 10,75322 | 1,0 % |
8,453 | 10,45186 | 3,5 % |
9,961 | 8,87309 | 17,5 % |
11,405 | 7,75224 | 1,3 % |
12,331 | 7,17224 | 1,6 % |
12,68 | 6,97581 | 5,1 % |
- 10CZ 2020 - 276 A3
12,908 | 6,85299 | 2,0 % |
14,62 | 6,05411 | 0,4 % |
15,205 | 5,82247 | 11,9% |
15,698 | 5,64048 | 11,8 % |
16,037 | 5,5221 | 2,3 % |
16,472 | 5,37725 | 1,6 % |
16,681 | 5,31033 | 0,9 % |
16,872 | 5,25081 | 3,8 % |
17,214 | 5,14723 | 0,8 % |
17,683 | 5,01177 | 0,3 % |
18,035 | 4,91453 | 0,2 % |
18,557 | 4,7775 | 55,5 % |
18,764 | 4,72538 | 17,3 % |
19,319 | 4,59075 | 21,4 % |
19,986 | 4,43908 | 8,1 % |
20,139 | 4,4056 | 4,7 % |
20,448 | 4,33983 | 11,3 % |
20,868 | 4,25336 | 3,4 % |
21,508 | 4,12834 | 5,7 % |
22,022 | 4,03299 | 1,4 % |
22,449 | 3,95727 | 1,3 % |
22,85 | 3,8887 | 0,6 % |
23,055 | 3,85465 | 0,2 % |
23,5 | 3,78255 | 21,4 % |
23,805 | 3,73478 | 20,5 % |
24,427 | 3,6411 | 17,4 % |
24,807 | 3,58623 | 2,1 % |
24,973 | 3,56275 | 0,5 % |
25,33 | 3,51335 | 0,9 % |
25,519 | 3,48779 | 7,8 % |
26,035 | 3,41984 | 7,3 % |
26,174 | 3,40192 | 4,6 % |
26,749 | 3,33008 | 1,3 % |
27,077 | 3,29052 | 3,2 % |
27,558 | 3,23414 | 25,5 % |
28,193 | 3,16277 | 0,7 % |
28,69 | 3,1091 | 1,2 % |
28,949 | 3,08183 | 1,5 % |
29,474 | 3,02815 | 1,0 % |
29,782 | 2,99751 | 0,3 % |
29,838 | 2,992 | 0,3 % |
30,234 | 2,95367 | 0,8 % |
30,69 | 2,91085 | 2,9 % |
31,133 | 2,87043 | 0,9 % |
31,55 | 2,83341 | 1,2 % |
31,852 | 2,80728 | 0,4 % |
32,137 | 2,78299 | 2,1 % |
32,388 | 2,76198 | 3,4 % |
33,356 | 2,68404 | 2,2 % |
33,503 | 2,67258 | 1,1 % |
34,184 | 2,62088 | 0,3 % |
34,666 | 2,58558 | 0,8 % |
- 11 CZ 2020 - 276 A3
35,559 | 2,52264 | 0,8 % |
36,197 | 2,47962 | 1,1 % |
36,583 | 2,45432 | 0,2 % |
36,947 | 2,43102 | 0,9 % |
37,494 | 2,39679 | 0,9 % |
37,754 | 2,38088 | 0,9 % |
38,059 | 2,36248 | 0,2 % |
38,77 | 2,32077 | 0,6 % |
39,185 | 2,29713 | 0,3 % |
39,679 | 2,26968 | 0,9 % |
Tab. 2: Změřené úhly, d-spacing a relativní intenzita v procentech získaná práškovou difrakcí pro BAP volnou bázi
Úhel (2-theta) | d spacing (Á) | rel. intenzita |
5,831 | 15,14553 | 0,3 % |
6,448 | 13,69776 | 100,0 % |
10,915 | 8,09952 | 0,6 % |
11,793 | 7,49808 | 0,2 % |
12,925 | 6,8441 | 0,1 % |
13,512 | 6,54808 | 0,5 % |
15,623 | 5,66738 | 11,7% |
17,209 | 5,14865 | 0,0 % |
18,198 | 4,87094 | 2,3 % |
19,068 | 4,65074 | 2,2 % |
19,429 | 4,56515 | 0,1 % |
19,951 | 4,44672 | 0,3 % |
20,532 | 4,32216 | 1,3 % |
20,844 | 4,25832 | 0,9 % |
21,952 | 4,04573 | 0,8 % |
23,292 | 3,81593 | 2,7 % |
23,789 | 3,73726 | 1,9 % |
24,89 | 3,57441 | 0,5 % |
25,067 | 3,54962 | 0,2 % |
25,985 | 3,42626 | 2,5 % |
26,73 | 3,33245 | 0,9 % |
27,312 | 3,26272 | 3,6 % |
27,878 | 3,19774 | 0,8 % |
28,408 | 3,13926 | 0,4 % |
30,068 | 2,96962 | 1,0 % |
31,591 | 2,8299 | 0,0 % |
32,359 | 2,76439 | 0,1 % |
33,177 | 2,69810 | 0,5 % |
33,867 | 2,64472 | 0,2 % |
34,606 | 2,58989 | 0,0 % |
34,978 | 2,56322 | 0,1 % |
36,63 | 2,45128 | 0,0 % |
36,856 | 2,43680 | 0,0 % |
37,421 | 2,40128 | 0,1 % |
37,819 | 2,37693 | 0,0 % |
38,447 | 2,33951 | 0,0 % |
38,777 | 2,32039 | 0,1 % |
- 12CZ 2020 - 276 A3
39,762 | 2,26515 | 0,0 % |
Tab. 3: Změřené úhly, d-spacing a relativní intensity v procentech získaná práškovou difraci pro krystalickou sůl meto-topolin mesylátu (m-topolin mes)
Úhel (2-theta) | d spacing (Á) | rel. intenzita |
4,708 | 18,75442 | 4,1 % |
8,107 | 10,89665 | 67,3 % |
8,872 | 9,95929 | 2,9 % |
9,295 | 9,5067 | 2,0 % |
9,683 | 9,12666 | 78,1 % |
10,077 | 8,77112 | 0,7 % |
13,118 | 6,74372 | 46,6 % |
14,081 | 6,28446 | 1,1 % |
14,26 | 6,20607 | 2,0 % |
14,589 | 6,06695 | 15,9 % |
15,55 | 5,6941 | 63,7 % |
16,821 | 5,26641 | 100,0 % |
17,614 | 5,03108 | 98,6 % |
17,896 | 4,9525 | 18,9 % |
18,234 | 4,86135 | 4,3 % |
19,066 | 4,6511 | 43,0 % |
19,17 | 4,62614 | 36,0 % |
19,405 | 4,57075 | 20,8 % |
19,466 | 4,55634 | 31,6% |
19,508 | 4,54665 | 67,9 % |
19,554 | 4,53623 | 33,9 % |
19,685 | 4,50619 | 6,9 % |
20,343 | 4,36194 | 2,4 % |
21,195 | 4,1885 | 26,7 % |
22,198 | 4,00154 | 58,1 % |
22,97 | 3,86865 | 39,2 % |
23,64 | 3,76049 | 21,9 % |
24,576 | 3,61945 | 51,3 % |
24,785 | 3,58936 | 57,8 % |
24,862 | 3,57834 | 72,9 % |
25,198 | 3,53144 | 9,8 % |
25,673 | 3,46723 | 69,1 % |
26,227 | 3,39523 | 12,7 % |
26,754 | 3,32944 | 6,5 % |
27,512 | 3,23941 | 7,0 % |
27,455 | 3,24599 | 8,3 % |
27,833 | 3,20287 | 6,1 % |
28,679 | 3,1102 | 6,7 % |
29,083 | 3,06798 | 10,5 % |
29,423 | 3,03326 | 19,7 % |
29,57 | 3,01855 | 14,6 % |
29,799 | 2,9958 | 9,4 % |
30,172 | 2,95961 | 3,7 % |
30,861 | 2,89509 | 6,1 % |
31,554 | 2,83313 | 7,7 % |
32,193 | 2,77827 | 1,9 % |
- 13 CZ 2020 - 276 A3
32,495 | 2,75319 | 1,0 % |
33,01 | 2,7114 | 3,1 % |
33,24 | 2,69315 | 9,1 % |
34,109 | 2,62647 | 1,7 % |
34,52 | 2,59613 | 0,7 % |
35,075 | 2,55631 | 4,9 % |
35,718 | 2,51178 | 1,3 % |
36,412 | 2,46549 | 1,4 % |
36,776 | 2,44189 | 2,4 % |
37,815 | 2,37715 | 1,0 % |
38,246 | 2,35137 | 1,8 % |
38,611 | 2,32997 | 0,5 % |
39,182 | 2,29732 | 5,0 % |
39,606 | 2,27371 | 9,3 % |
39,728 | 2,267 | 4,8 % |
Tab. 4: Změřené úhly, d-spacing, relativní intenzita v procentech získaná práškovou difrakcí pro meto-topolin volnou bázi
Úhel (2-theta) | d spacing (Á) | rel. intenzita |
7,074 | 12,48654 | 100,00% |
10,535 | 8,39088 | 7,00% |
12,208 | 7,24412 | 67,80% |
14,224 | 6,22163 | 24,20% |
14,583 | 6,06943 | 32,50% |
17,44 | 5,08094 | 19,30% |
17,656 | 5,01919 | 29,80% |
18,011 | 4,92124 | 38,00% |
18,513 | 4,78881 | 4,50% |
19,534 | 4,54079 | 2,50% |
20,278 | 4,37586 | 13,70% |
21,16 | 4,19532 | 77,10% |
22,552 | 3,93939 | 12,90% |
23,403 | 3,79813 | 30,30% |
23,729 | 3,74668 | 49,90% |
24,726 | 3,59781 | 30,70% |
25,839 | 3,44522 | 19,00% |
26,523 | 3,35799 | 48,20% |
26,944 | 3,3064 | 2,50% |
27,56 | 3,23397 | 4,50% |
27,913 | 3,19379 | 3,20% |
28,666 | 3,11159 | 16,90% |
29,751 | 3,00056 | 6,70% |
30,444 | 2,93381 | 6,50% |
31,066 | 2,87647 | 4,10% |
31,706 | 2,81986 | 10,60% |
32,102 | 2,78599 | 0,70% |
33,171 | 2,69862 | 5,50% |
33,784 | 2,65098 | 2,60% |
34,586 | 2,59131 | 0,30% |
34,935 | 2,56625 | 0,80% |
35,963 | 2,49523 | 1,70% |
- 14CZ 2020 - 276 A3
36,907 | 2,43353 | 1,30% |
37,415 | 2,40164 | 1,90% |
38,336 | 2,34605 | 0,50% |
38,773 | 2,32058 | 0,80% |
39,396 | 2,28533 | 1,30% |
39,654 | 2,27104 | 4,20% |
Tab. 5: Změřené úhly, d-spacing a relativní intenzita v procentech získaná práškovou difrakcí pro krystalickou sůl ortúo-topolin mesylátu
Úhel (2-theta) | d-spacing (Á) | rel. intenzita |
8,207 | 10,76503 | 1,5 % |
8,365 | 10,56215 | 4,4 % |
9,644 | 9,16369 | 7,4 % |
9,822 | 8,99838 | 27,1 % |
12,147 | 7,28043 | 81,2% |
14,156 | 6,25123 | 17,3 % |
14,648 | 6,04243 | 14,3 % |
15,391 | 5,75247 | 1,7 % |
16,582 | 5,34174 | 8,1 % |
16,629 | 5,32689 | 9,9 % |
16,759 | 5,28574 | 22,8 % |
16,961 | 5,22346 | 2,7 % |
17,8 | 4,97896 | 20,7 % |
17,834 | 4,96969 | 13,5 % |
18,155 | 4,88242 | 16,1 % |
18,287 | 4,84747 | 45,7 % |
18,311 | 4,84129 | 44,5 % |
18,566 | 4,77537 | 14,5 % |
19,707 | 4,50128 | 13,2 % |
20,296 | 4,37198 | 14,9 % |
20,656 | 4,29662 | 26,5 % |
20,797 | 4,26783 | 12,4 % |
21,745 | 4,08382 | 18,2% |
22,724 | 3,90994 | 4,3 % |
22,832 | 3,89183 | 5,9 % |
23,271 | 3,81932 | 100,0 % |
23,584 | 3,76928 | 1,9 % |
24,136 | 3,68442 | 21,5 % |
24,45 | 3,63775 | 14,9 % |
24,497 | 3,63088 | 15,6 % |
24,992 | 3,56012 | 11,8% |
25,149 | 3,53816 | 50,5 % |
25,535 | 3,48558 | 3,8 % |
25,897 | 3,43771 | 1,2 % |
26,166 | 3,40301 | 2,7 % |
26,793 | 3,32473 | 21,4% |
26,863 | 3,3162 | 12,6 % |
27,16 | 3,28067 | 12,7 % |
27,544 | 3,23576 | 12,2 % |
28,019 | 3,18198 | 6,5 % |
28,483 | 3,1312 | 6,2 % |
- 15 CZ 2020 - 276 A3
28,558 | 3,12315 | 5,5 % |
29,5 | 3,02553 | 18,3 % |
29,98 | 2,97813 | 2,2 % |
30,364 | 2,94131 | 8,5 % |
30,451 | 2,9332 | 5,8 % |
31,057 | 2,87724 | 1,9 % |
31,189 | 2,86543 | 2,1 % |
31,772 | 2,81412 | 4,8 % |
31,852 | 2,80724 | 2,5 % |
32,132 | 2,78343 | 1,6 % |
32,714 | 2,73524 | 0,3 % |
32,738 | 2,7333 | 0,6 % |
33,533 | 2,67029 | 4,3 % |
33,717 | 2,6561 | 3,6 % |
33,921 | 2,64059 | 3,9 % |
33,969 | 2,63703 | 3,7 % |
34,322 | 2,61069 | 1,2 % |
34,567 | 2,5927 | 2,8 % |
34,616 | 2,58918 | 2,8 % |
34,912 | 2,56788 | 3,4 % |
34,884 | 2,56987 | 3,3 % |
35,213 | 2,54666 | 1,0 % |
35,852 | 2,50272 | 2,0 % |
36,231 | 2,47738 | 2,3 % |
36,614 | 2,45234 | 2,9 % |
36,723 | 2,4453 | 2,6 % |
37,02 | 2,42637 | 3,5 % |
37,351 | 2,40559 | 1,3 % |
38,549 | 2,33356 | 2,1 % |
38,481 | 2,33752 | 5,0 % |
38,532 | 2,33455 | 3,3 % |
39,233 | 2,29444 | 4,1 % |
Tab. 6: Změřené úhly, d-spacing a relativní intenzita v procentech získaná práškovou difrakcí pro ortúo-topolin volnou bázi
Úhel (2-theta) | d-spacing (Á) | rel. intenzita |
6,36 | 13,88626 | 100,0 % |
12,609 | 7,01461 | 1,5 % |
15,507 | 5,70981 | 12,2 % |
15,559 | 5,6907 | 12,1 % |
15,655 | 5,65596 | 13,9 % |
16,71 | 5,30113 | 59,4 % |
17,436 | 5,0821 | 45,2 % |
18,947 | 4,6801 | 31,6% |
19,014 | 4,66371 | 35,6 % |
19,1 | 4,643 | 43,8 % |
19,97 | 4,44267 | 4,9 % |
20,587 | 4,31072 | 11,0% |
23,786 | 3,73771 | 26,2 % |
25,028 | 3,5551 | 18,8 % |
25,225 | 3,52769 | 12,2 % |
- 16CZ 2020 - 276 A3
25,301 | 3,51731 | 12,8 % |
25,889 | 3,4387 | 4,0 % |
26,566 | 3,35267 | 37,7 % |
27,318 | 3,26203 | 41,6% |
28,028 | 3,18093 | 1,2 % |
28,188 | 3,16328 | 1,6 % |
29,166 | 3,05934 | 14,9 % |
29,491 | 3,02645 | 11,9% |
31,195 | 2,86489 | 3,4 % |
31,596 | 2,82945 | 2,3 % |
32,75 | 2,73234 | 6,4 % |
32,792 | 2,72894 | 6,6 % |
33,425 | 2,67866 | 3,1 % |
33,651 | 2,66118 | 2,9 % |
34,95 | 2,56521 | 4,4 % |
35,816 | 2,50514 | 2,3 % |
Tab. 7: Změřené úhly, d-spacing relativní intenzita v procentech získaná práškovou difrakcí pro krystalickou sůl kinetin mesylátu
Úhel (2-theta) | d-spacing (Á) | rel. intenzita |
6,238 | 14,15724 | 100,0 % |
6,971 | 12,67021 | 1,2 % |
9,416 | 9,38466 | 1,1 % |
10,148 | 8,70928 | 6,9 % |
10,292 | 8,5877 | 3,5 % |
10,603 | 8,33663 | 4,4 % |
11,24 | 7,86575 | 2,1 % |
11,475 | 7,70524 | 1,1 % |
12,17 | 7,2667 | 2,5 % |
12,377 | 7,14537 | 4,7 % |
12,562 | 7,04094 | 4,6 % |
13,128 | 6,73835 | 9,6 % |
14,323 | 6,17907 | 3,1 % |
15,051 | 5,88178 | 4,5 % |
15,176 | 5,83327 | 1,1 % |
15,799 | 5,60469 | 3,3 % |
16,203 | 5,46585 | 6,8 % |
17,095 | 5,18275 | 2,1 % |
17,327 | 5,11395 | 2,2 % |
17,515 | 5,05948 | 2,0 % |
18,665 | 4,75008 | 14,0 % |
18,882 | 4,69604 | 38,7 % |
19,835 | 4,47249 | 26,0 % |
20,119 | 4,4101 | 23,2 % |
20,389 | 4,35212 | 46,9 % |
20,668 | 4,29413 | 10,2 % |
20,839 | 4,25928 | 14,0 % |
21,397 | 4,14938 | 6,6 % |
21,976 | 4,04131 | 3,3 % |
22,634 | 3,92529 | 27,4 % |
22,76 | 3,90391 | 17,3 % |
- 17CZ 2020 - 276 A3
22,981 | 3,86685 | 22,7 % |
23,923 | 3,71668 | 33,8 % |
24,132 | 3,68494 | 13,2 % |
24,844 | 3,58099 | 3,8 % |
24,978 | 3,5621 | 5,8 % |
25,218 | 3,52875 | 3,4 % |
26,172 | 3,40223 | 1,5 % |
26,445 | 3,36765 | 4,7 % |
26,65 | 3,34226 | 9,3 % |
26,861 | 3,31649 | 4,6 % |
27,417 | 3,25044 | 1,9 % |
27,672 | 3,22113 | 39,9 % |
27,755 | 3,21163 | 72,5 % |
28,062 | 3,17716 | 9,0 % |
28,536 | 3,12548 | 2,0 % |
29,344 | 3,04125 | 0,5 % |
30,394 | 2,93849 | 1,1 % |
31,452 | 2,84201 | 0,9 % |
32,349 | 2,76522 | 3,0 % |
32,49 | 2,75361 | 4,5 % |
32,868 | 2,72281 | 4,2 % |
34,527 | 2,59567 | 0,8 % |
34,779 | 2,5774 | 1,4 % |
35,09 | 2,55526 | 1,4 % |
35,526 | 2,5249 | 0,7 % |
36,152 | 2,48262 | 0,7 % |
37,197 | 2,41524 | 0,9 % |
37,472 | 2,39811 | 1,2 % |
37,808 | 2,37761 | 1,7 % |
38,303 | 2,34798 | 0,9 % |
39,807 | 2,26269 | 0,5 % |
Tab. 8: Změřené úhly, d-spacing a relativní intenzita v procentech získaná práškovou difrakcí pro kinetin volnou bázi
Úhel (2-theta) | d-spacing (Á) | rel. intenzita |
6,418 | 13,76056 | 0,2 % |
7,098 | 12,44319 | 100,0 % |
11,394 | 7,75957 | 0,5 % |
12,7 | 6,96462 | 0,3 % |
14,157 | 6,25098 | 0,4 % |
15,491 | 5,71548 | 0,0 % |
17,176 | 5,15854 | 10,2 % |
19,236 | 4,61044 | 5,7 % |
19,726 | 4,49692 | 0,3 % |
20,872 | 4,25261 | 3,6 % |
21,345 | 4,15939 | 0,6 % |
23,024 | 3,85973 | 4,4 % |
23,553 | 3,77427 | 3,1 % |
24,12 | 3,68676 | 1,6 % |
24,812 | 3,58546 | 1,2 % |
25,478 | 3,49323 | 1,5 % |
- 18 CZ 2020 - 276 A3
26,028 | 3,42071 | 0,7 % |
26,976 | 3,30263 | 6,8 % |
27,391 | 3,2535 | 0,4 % |
28,441 | 3,13568 | 7,8 % |
28,699 | 3,10812 | 1,3 % |
29,636 | 3,01194 | 0,7 % |
30,132 | 2,96351 | 0,1 % |
31,561 | 2,83251 | 0,4 % |
32,169 | 2,7803 | 0,1 % |
33,332 | 2,6859 | 0,2 % |
34,734 | 2,58068 | 0,7 % |
35,37 | 2,53568 | 0,2 % |
36,032 | 2,49063 | 0,3 % |
36,686 | 2,44772 | 0,1 % |
38,07 | 2,3618 | 0,1 % |
38,712 | 2,32411 | 0,3 % |
Příklad 10: Charakterizace krystalických solí BAP mesylátu, we/u-topolin mesylátu, orthotopolin mesylátu and kinetin mesylátu metodou Ή-nukleární magnetické rezonance (NMR)
Ή Nukleární magnetická rezonance (Ή NMR) byla provedena na přístroji JEOL 500 SS pracujícím při teplotě 300 K a frekvenci 500,13 MHz. Vzorky byly připraveny rozpuštěním látek v DMSO-d6. Tetramethylsilan (IMS) byl použit jako interní standard. Kalibrace chemických posunů byla vztažena k reziduálnímu píku rozpouštědla Ή DMSO-de, 2.50 ppm. Každý vzorek byl připraven v ca. 5 mg koncentraci. Chemické posuny indentifikované ve spektru krystalickým solím cytokininových mesylátů odpovídají popsané chemické sloučenině a jsou následující:
wiďřa-topolin mesylát (6-(3-hydroxybenzylamino)purin mesylát): Ή NMR (500 MHz, DMSOA) δ 9.55 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 7.28 (t, J= 7.9 Hz, 1H), 7.00 - 6.94 (m, 2H), 6.87 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 4.81 (s, 2H), 2.35 (s, 3H).
BAP mesylát: Ή NMR (500 MHz, DMSO-A) δ 9.66 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.40 7.29 (m, 5H), 7.26 (t, J= 7.1 Hz, 1H), 4.80 (d, J= 5.9 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H).
kinetin mesylát: Ή NMR (500 MHz, DMSO-A) δ 9.53 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.56 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 6.45 (s, 2H), 4.85 (s, 2H), 2.40 - 2.34 (m, 3H).
orřAo-topolin mesylát (6-(2-hydroxybenzylamino)purin mesylát): Ή NMR (500 MHz, DMSOA) δ 9.27 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.18 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.14 - 7.07 (m, 1H), 6.83 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 6.74 (t, J= 7.3 Hz, 1H), 4.69 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 2.29 (s, 3H).
(Z)-zeatin (cís-zeatin): ‘HNMR (DMSO-í/6): δ 1.67 (s, 3H); 3.81 (d, 2H, J= 5.2); 4.15 (m, 2H); 4.72 (t,lH,J= 5.55); 5.55 (t, 1H, J= 6.8); 7.67 (bs, 1H); 8.07 (s, lH);8.19(s, 1H) (E)-zeatin (Zraws-zeatin): ΉNMR (DMSO-í/6): 1.69 (s, 3H); 3.80 (d, 2H, J= 7.0); 4.15 (bs, 2H);
4.75 (t, 1H); 5.53 (t, 1H, J= 7.0); 8.09 (s, 1H); 8.19 (s, 1H)
Dihydrozeatin (racemát): Ή NMR (DMSO-í/6): 1.00 (d, 3H, J = 6.8); 1.51 (m, 1H); 1.75 (m, 1H); 1.85 (m, 1H); 3.44 (dd, 1H, J= 11.0,7=6.0); 3.48 (dd, 1H, J= 11.0); 3.66 (m, 2H); 8.06 (s, 1H), 8.22 (s, 1H)
Isopentenyladenin: ΉNMR (DMSO-76): 1.67 (s, 3H), 1.70 (s, 3H), 4.08 (br s, 1H), 5.31(s,lH), 7.55 (bs,lH), 8.04 (s,lH), 8.16 (s.lH)
- 19CZ 2020 - 276 A3
Při porovnání naměřených chemických posunů Ή NMR spekter výše uvedených cytokininových mesylátů s jejich odpovídajícími volnými bázemi (BAP, meto-topolin, ortúo-topolin a kinetin), což jsou známé, v literatuře popsané látky, jsou patrné signifikantní rozdíly, zejména u těch hodnot chemických posunů, které jsou v blízkosti protonizovaných vodíků.
Příklad 12: Monokrystalová rentgenostrukturní analýza a popis určené molekulové struktury krystalické soli meta-topolin mesylátů
Příprava monokrystalu: Krystaly byly získány z meto-topolin mesylátů (ca 100 mg), který byl rozpuštěn vmethanolu (40 cm3). Roztok byl pak ponechán k volnému vypařování rozpouštědla skrze parafilm, kterým byla přetažena kádinka, cca 14 dnů při RT.
Monokrystalová RTG difrakce: Vhodné krystaly byly vybrány ze vzorku připraveného viz výše. Difrační data byla sbírána za pomocí čtyřkruhového difraktometru Supernova s Cu/Κα zářením kolimovaným pomocí tenkovrstvých zrcadel, s použitím uzavřené mikro-fokusované rtg trubice, který je vybaven CCD detektorem Atlas S2, pracujícím při teplotě 94.94 (13) K. Při analýze krystalové struktury bylo zjištěno, že struktura 6-(3-hydroxypurinia mesylátů (meto-topolin mesylátů) se jeví jako centrosymetrický dimer spojený níže diskutovanými vodíkovými vazbami. Krystalová soustava byla určena jako kosočtverečná (orthorombická) s prostorovou skupinou Pna21 a s následujícími parametry základní buňky: a=14,9313 (1), b=7,8302 (3), c=25,1594(1) Á, α=90°, β=90°, γ=90°, objemem základní buňky V=2941.51 Á3. Sběr dat, redukční a absorpční korekce byly uskutečněny s použitím CrysAlisPro software (Rigaku Oxford Diffraction, 2018) CrysAlis version 1.171.40.53). Asymetrická jednotka zkoumané sloučeniny je tvořena kationtem 6-(3-hydroxybenzylamino)purinium a mesylátovým aniontem. Vodíkové atomy připojené na uhlíky byly umístěny do struktury ve vypočtených pozicích. Některé vodíky připojené na kyslík byly lokalizovány v diferenční mapě. Intermolekulámí vodíkové interakce mezi vodíky N-H purinového kationtu a kyslíkovým atomem mesylátového aniontu spojují dvě molekuly sloučeniny do centrosymetrického dimeru. Tyto vodíkové vazby stabilizují system a spojují N6a..H6b purinového kationtu s 01a mesylátového aniontu, N7a..H7a purinu s 05b mesylátového aniontu, O4b..H4b hydroxylu připojeného na benzenový kruh meta-topolinového kationtu s O5b mesylátového aniontu a vice versa O4a...H4a meta-topolinového kationtu s Olb mesylátového aniontu (obr. 4). Výsledný “konvenční” R-faktor (založený na F a 5945 reflexích s [F2> 2σ (F2)] byl 0.0257.
Monokrystalová struktura krystalické soli meto-topolinu mesylátů ukazuje, že sloučenina má obecný sumární vzorec C13H15N5O4S a je složena z 6-(3-hydroxybenzylamino)purinium kationtu a mesylátového aniontu, viz obrázek 4. Centrosymetrické dimery jsou spolu spojeny množstvím intermolekulámích vodíkových interakcí, které jsou zejména realizovány mezi vodíky napojenými na dusíky protonizováného kationtu a kyslíky mesylátového aniontu a dále mezi vodíkem hydroxylové skupiny napojené na benzenový kruh a kyslíkem mesylátového aniontu, což pravděpodobně přispívá k výborné rozpustnosti dané sloučeniny ve vodě. Důležité torzní úhly, které mají také dopad na fyzikální vlastnosti a rozpustnost zkoumaných látek jsou silně ovlivněny právě vytvořením husté sítě mezimolekulámích vodíkových vazeb.
Příklad 13: Monokrystalová rtg difrakce /analýza/ krystalické soli orZAo-topolinu mesylátů
Příprava monokrystalu:
Krystaly byly připraveny rozpuštěním 100 mg ort/zo-topolinu mesylátů v metanolu (30 cm3). Roztok byl ponechán v kádince přikryté parafilmem k volném odpařování rozpouštědla. Čiré krystaly se vytvořily po sedmi dnech od vytvoření roztoku.
Monokrystalová rtg difrakce: Z krystalizovaného vzorku byly vybrány vhodné krystaly pro sběr dat. Difrakční data byla naměřena s použitím čtyřkruhového difraktometru Xcalibur Gemini ultra s Cu/Κα zářením (λ = 1,54184 Á) s grafitovým monochromátorem vybaveným CCD detektorem
-20CZ 2020 - 276 A3
Atlas S2 pracujícím při 120.01(10) K. Krystalografická soustava byla identifikována jako monoklinická s prostorovou grupou P2i/c s následujícími parametry základní buňky: a=10,3822 (4), b=21,0265 (5), c=8,1025 (2) Á, α=90°, β=107.466°, γ=90°, objemem základní buňky V=1688,21 (9) Á3. Strukturní model byl nalezen za použití software Superflip nebo SHELXT a vypřesněn metodou nejmenších čtverců softwarem JANA2006. Sběr dat, redukční a absorpční korekce pro danou sloučeninu byly provedeny za pomocí software CrysAlisPro Software (Rigaku, Oxford Diffraction, 2018, CrysAlis version 1.171.40.35a). Rentgenostruktumí analýzou bylo určeno, že asymetrická jednotka zkoumané sloučeniny sestává z 6-(2hydroxybenzylamino)purinium kationtu a mesylátového aniontu, ale také z jedné molekuly rozpouštědla, tzn. metanolu. Vodíkové atomy připojené na uhlík byly umístěny ve vypočítaných pozicích. Některé vodíkové atomy připojené na kyslíky byly lokalizovány v diferenční mapě. Mezimolekulámí vodíkové vazby jsou lokalizovány mezi N-H atomy puriniového kationtu a kyslíkovými atomy mesylátového aniontu a puriniový kationt je také vodíkovou vazbou propojen s molekulou rozpouštědla metanolu. Vodíkové vazby stabilizují celý systém a spojují N6..H6 vodíkový atom purinové struktury s 02 atomem mesylátového aniontu, dále N7..H7 purinové struktury s 02 atomem mesylátového aniontu. Dále, 05...H5 vodíkový atom methanolu je vodíkovým můstkem spojen s 02 mesylátového aniontu a současně k N7...H7 purinového skeletu ortho-topolinového kationtu.
Struktura molekuly je zachycena na obrázku 5. O1..H1 vodíkový atom hydroxylové skupiny připojené na benzenový kruh je vodíkovou vazbou spojený s 03 atomem mesylátového aniontu. Výsledný “konvenční” R-faktor [založený na F a 3024 reflexích s [F2> 2σ (F2)] byl 0.0324. Monokrystalová struktura krystalické soli orí/jo-topolin mesylátu obecného sumárního vzorce C14H19N5O5S sestává z 2-hydroxybenzylaminopurinium kationtu a mesylátového aniontu doprovázeného molekulou solvatovaného methanolu. Centrosymetrické dimery asymetrické základní jednotky jsou spolu propojeny sítí výše uvedených intermolekulámích vodíkových vazeb, které jsou realizovány zejména mezi protonizovanými kationty a mesylátovými anionty, ale zahrnují také solvatovaný metanol. Tyto vodíkové vazby silně ovlivňují torzní úhly v molekule, které mají dopad na fýzikálně chemické vlastnosti molekul a tím, spolu se samotnou tvorbou vodíkových vazeb, přispívají k výrazně lepší rozpustnosti připravené molekuly ve vodě a polárních rozpouštědlech.
Příklad 14: Rozpustnost krystalické soli wieřa-topolin mesylátu ve vodě
Rozpustnost ve vodě byla stanovena následujícím protokolem. Byl připraven supemasycený roztok krystalické soli meto-topolin mesylátu. Roztok byl přefiltrován od viditelných nerozpuštěných částic soli a byl obdržen homogenní nasycený roztok. Nasycený roztok byl zředěn 1:10 000 a měřen s použitím HPLC Alliance Waters 2690 s C18 kolonou s průměrem 2.1 mm, délkou 150 mm a porozitou 5 pm. Vzorek byl rozpuštěn v mobilní fázi (MeOH: HCOONH4 -1:9). Vzorek byl proplachován metanolem s gradientem (10-90%, 35 min) při pH 4 a průtokové rychlosti 0.3 ml/min. Absorbance byla měřena v UV oblasti záření při 210 až 400 nm. Plocha píku krystalické soli meto-topolin mesylátu byla 595 027. Získaná plocha píku byla porovnána s plochami píku při určitých koncentracích naměřených viz. tabulka 9 při určitých konkrétních koncentracích látky ve vodě atak byla určena finální koncentrace nasyceného roztoku meto-topolin mesylátu ve vodě.
Tab. 9: Měřené plochy píku pro konkrétní koncentrace meto-topolin mesylátu ve vodě.
c (pM) | Plocha píku meto-topolin mesylátu |
10 | 261426 |
25 | 637311 |
50 | 1253289 |
-21 CZ 2020 - 276 A3
To tedy znamená, že nasycená koncentrace meto-topolin mesylátu byla přibližně stanovena na 24010,81 μΜ, což znamená 24,011 mM (8 mg/ml), což je řádově lepší rozpustnost ve vodě, než je popsána u meta-topolinu volné báze. U meta-topolinu volné báze se uvádí rozpustnost menší než 0.25 mg/ml; my jsme měřením zjistili koncentraci nasyceného roztoku pouze 0.06 mg/ml. Rozpustnost dalších mesylátů byla také stanovena tímto způsobem a koncentrace nasycených roztoků jsou uvedeny níže:
Volná CK báze | c původní látky [mM] | Mesylát cytokininu | c mesylátu cytokininu [mM] |
6-(2- hydroxybenzylamino)purin (o-topolin) | 0,03 | 6-(2-hydroxybenzylamino)purin mesylát | 82,3 |
6-(3- hydroxybenzylamino)purin (m-topolin) | 0,06 | 6-(3- hydroxybenzylamino)purinmesyl át | 24,011 |
6-(benzylamino)purin (BAP) | 0,37 | 6-(benzylamino)purin mesylát | 354,13 |
6-(3- methoxybenzylaminpjpurin | 0,21 | 6-(3 -methoxybenzylamino)purin mesylát mesylát | 47,54 |
Kinetin | 0,14 | kinetin mesylát | 92,56 |
Příklad 15: Rozpustnost krystalické soli wieta-topolin mesylátu ve srovnání s wieřa-topolinem v různých organických rozpouštědlech
Rozpustnost v různých organických rozpouštědlech byla měřena za použití následujícího protokolu. Pňbližně 25 mg vzorku krystalické soli meta-topolinu mesylátu a meta-topolinu byly umístěny do 48 vialek. Pět objemových alikvot každého rozpouštědla bylo postupně přidáno do jednotlivých vialek. Před každým následujícím přidáním byla směs ověřena na rozpustnost, a pokud nebyl vzorek rozpuštěn, bylo pokračováno s přídavkem dalšího alikvotu rozpouštědla.
Výsledky jsou shrnuty v tabulce 10. Zatímco rozpouštění v polárních rozpouštědlech (voda, alkoholy) se výrazně liší, téměř žádné rozdíly mezi mesylátovou solí a volnou baží nebyly zaznamenány v organických nepolárních rozpouštědlech.
Tab. 10: Rozpustnost meta-topolinu mesylátu ve srovnání s meto-topolinem volnou baží v různých organických rozpouštědlech
Rozpouštědlo | metatopolin mes | metatopolin |
methanol | 0,7 mg/ml | 5 mg/ml |
ethanol | 0,4 mg/ml | 5 mg/ml |
DMF | 6 mg/ml | 6 mg/ml |
DMSO | 22 mg/ml | 24 mg/ml |
aceton | 0,4 mg/ml | 0,4 mg/ml |
heptan | <0,1 mg/ml | <0,1 mg/ml |
acetonitril | <0,25 mg/ml | <0,25 mg/ml |
Příklad 16: Stabilita krystalické soli wieta-topolin mesylátu při skladování po dobu 30 dní v pevném stavu a ověření stability XRPD
-22CZ 2020 - 276 A3 mg vzorku krystalické soli meto-topolin mesylátu bylo umístěno do ependorfky a uzavřeno. Stabilita vzorku byla testována uskladněním pevné látky 25° C po 30 dnech od uložení vzorku. Nebyly pozorovány žádné opticky hodnotitelné změny jako například změna barvy nebo struktury materiálu a žádná změna nebyla pozorována ani u XRPD záznamu látky pořízeného po 30 dnech od uskladnění. Obr. 6 ukazuje práškový difraktogram meto-topolin mesylátu po 60 dnech srovnaného s difraktogramem vzorku soli pořízeného po přípravě látky.
Příklad 17: Disproporcionační studie krystalické soli wieřa-topolin mesylátu mg vzorku krystalické soli meto-topolin mesylátu bylo rozpuštěn v 250 mikroL destilované vody, ponecháné 48 v roztoku a pak vykrystalováné a byl změřen XRPD difraktogram, aby byly zjištěny případné disproporcionační změny. Z difraktogramu nebyla žádná disproporcionace pozorována, látka svou strukturu nezměnila.
Příklad 18: In vitro cytotoxická aktivita nových krystalických solí cytokinin mesylátů (metabolizace calceinu)
Protože toxické sloučeniny negativně ovlivňují metabolické procesy buněk, je mnoho standardních testů cytotoxicity založeno na měření rychlosti metabolizace různých umělých substrátů. Výsledný produkt je pak kvantifikován například pomocí spektrometrie. Testy lze snadno modifikovat pro použití v 96-jamkových destičkách. Pro vyhodnocení cytotoxicity cytokininů, například metatopolinu, ort/io-topolinu, kinetinu, BAP anebo jejích mesylátových solí, ale I řady dalších derivátů cytokininových mesylátů podle vynálezu byl použit mikrotitrační test založený na kvantifikaci metabolizace Calceinu AM. Test je široce používán v programech screeningu léků a při testování chemosenzitivity. V živých buňkách je Calcein AM enzymaticky hydrolyzován a kumulace výsledného kalceinu se projevuje zelenou fluorescencí.
Následující buněčné linie - RPMI 8226 (mnohočetný myelom), CEM (T-lymfoblastická leukémie), K562 (chronická myeloidní leukémie), HL-60 (promyelocytámí leukémie), MCF-7 (adenokarcinom prsu), HeLa (karcinom děložního čípku), G361 (maligní melanom), HOS (lidský osteosarkom) a BJ (lidské předkožkové fíbroblasty) - byly získány ze sbírky American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Tyto buňky byly udržovány ve standardním médiu DMEM nebo RPMI (Sigma, MO, USA) doplněném tepelně inaktivovaným fetálním hovězím sérem (10%) 2 mM L-glutaminem a penicilin-streptomycínem (1%) za standardních podmínek buněčné kultury (37°C, 5% CO2 ve vlhkém prostředí) a subkultivovány dvakrát nebo třikrát týdně pomocí standardního trypsinizačního postupu.
Přibližně 10 000 buněk v 80 pl média bylo naočkováno do 96-jamkové mikrotitrační destičky. Po 12 hodinách inkubace byly sloučeniny, které se měly testovat, přidány ve 20 μΐ podílech. Kontrolní kultury byly ošetřeny samotným DMSO. Konečná koncentrace DMSO v médiu nepřesáhla 0,5%. Byla testována sériová, trojnásobná ředění (celkem šest, nejvyšší koncentrace v inkubacích 166 μΜ) každé sloučeniny. Po 72 hodinách inkubace byl přidán roztok Calcein AM (Molecular Probes) do konečné koncentrace 1 pg/ml a buňky byly inkubovány další hodinu. Fluorescence volného kalceinu byla poté kvantifikována s použitím fluorometru Fluoroscan Ascent (Microsystems) a procento přežívajících buněk v každé jamce bylo vypočteno dělením OD získané z každé buňky exponovanými buňkami střední OD získanou z kontrolních jamek x 100%. Nakonec byly vypočteny hodnoty IC50 (koncentrace způsobující 50% pokles aktivity buněčné esterázy) pro každou sloučeninu generovaných z křivek závislosti odpovědi na dávce (Kryštof et al., 2005, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 3283-3286). Zde uvedené hodnoty IC50 jsou průměry získané z alespoň tří nezávislých experimentů, kde jednotlivé hodnoty replikace spadaly do 20% průměru. Inhibice růstu byla vypočtena pomocí následující rovnice: IC50 = (průměr FDjamka exponovaná k léčivu průměr FDbiank) / (průměr FDkontroinijamky- průměr FDbiank) x 100%. Hodnota IC50, koncentrace léčiva způsobující 50% snížení konverze Calceinu AM, byla vypočtena z získaných křivek závislosti odpovědi na dávce.
-23 CZ 2020 - 276 A3
Cytoxicita sloučenin byla testována na panelu buněčných linií různého histogenetického a druhového původu. Jak je uvedeno v Tab. 11, IC50 cytokinin mesylátů překročila obvykle maximální testovanou koncentraci, což naznačuje, že sloučeniny by mohly být aplikovány v koncentracích vyvolávajících požadovaný účinek bez negativních vedlejších účinků. Pro srovnání, 5 mnoho mesylátových solí přirozeně se vyskytujících cytokininů nevykazovaly ani nízkou cytotoxicitu.
Tab. 11. Cytotoxická aktivita cytokininových mesylátů vyjádřená v hodnotách IC50 po 3-denním Calcein-AM testu. Prezentované hodnoty jsou průměry alespoň 3 nezávislých experimentů, kde 10 jednotlivé replikáty spadají do 20% interval spolehlivosti.
testovaná buněčná linie/ICso (pmol/L) | ||||||||
Sloučenina | HOS | K-562 | MCF7 | B16-F0 | NIH-3T3 | G-361 | CEM | HL60 |
Kinetin | >166,7 | >166,7 | >166,7 | 155,1 | ||||
Kinetin mesylát | >166,7 | >166,7 | >166,7 | |||||
isopentenyladenin | >166,7 | 146,9 | >166,7 | 92,2 | >166,7 | |||
isopentenyladenin mesylát | 162,2 | >166,7 | 127,9 | |||||
6-benzylaminopurin | >166,7 | 138,9 | 166,1 | >166,7 | >166,7 | |||
6-benzylaminopurin mesylát | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | ||||
cis-zeatin (cZ) | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | |||
cis-zeatin mesylát | >166,7 | >166,7 | >166,7 | |||||
dihydrozeatin (DHZ) | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | |||
dihydrozeatin mesylát | >166,7 | >166,7 | >166,7 | |||||
meta-topolin (mT) | >166,7 | 128,4 | >166,7 | 90,6 | >166,7 | 90,1 | 79,2 | |
meta-topolinmesylát | 141,7 | >166,7 | >166,7 | |||||
or/ňo-topolin (oT) | >166,7 | >166,7 | >166,7 | 150 | 103,4 | 69,2 | 78,0 | |
ortho-topolin mesylát | >166,7 | >166,7 | 89,4 | |||||
6-(2-fluorobenzylamino)purin | >166,7 | 136,1 | >166,7 | 27,7 | 106,4 | 98 | ||
6-(2-fluorobenzylamino)purin mesylát | >166,7 | 70,7 | >166,7 | 99,5 | 126,5 | |||
6-(2-chlorobenzy lamino jpurin | 84,9 | 101,0 | 164,1 | 16,9 | >166,7 | 56,6 | 58,4 | 109,6 |
6-(2-chlorobenzy lamino jpurin mesylát | 100.4 | 90.4 | 128.4 | 112,5 | ||||
6-(3 -chlorobenzy lamino jpurin | >166,7 | >166,7 | >166,7 | 148,6 | >166,7 | >166,7 | ||
6-(3 -chlorobenzy lamino jpurin mesylát | >166,7 | >166,7 | ||||||
6-(3 -fluorobenzylaminojpurin | >166,7 | 105,2 | 163,2 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | ||
6-(3 -fluorobenzylaminojpurin mesylát | 135,7 | >166,7 | >166,7 | |||||
6-(4- fluorobenzylaminojpurinBAP | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | 66,4 | 59,2 | ||
6-(4- fluorobenzylaminojpurinmesy lát | >166,7 | >166,7 | ||||||
6-(3- methoxybenzylaminojpurin | >166,7 | >166,7 | >166,7 | 41,5 | >166,7 | 124,7 | >166,7 | >166,7 |
6-(3- methoxybenzylaminojpurin mesylát | >166,7 | >166,7 | >166,7 | |||||
6-(4- methoxybenzylaminojpurin | >166,7 | >166,7 | >166,7 | 84,7 | >166,7 | 166,7 | >166,7 | >166,7 |
6-(4- methoxybenzylaminojpurin mesylát | >166,7 | 118,0 | >166,7 | >166,7 |
-24CZ 2020 - 276 A3
6-(2-methylbenzylamino)purin | >166,7 | 156,6 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | ||
6-(2-methylbenzylamino)purin mesylát | >166,7 | >166,7 | >166,7 | |||||
6-(4-chlorobenzy lamino )purin | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | |||
6-(4-chlorobenzy lamino )purin mesylát | >166.7 | >166.7 | >166.7 | |||||
6-(2- methoxybenzylamino)purin | >166,7 | 115,8 | 153,0 | 63,4 | >166,7 | |||
6-(2- methoxybenzylaminojpurin mesylát | 116,7 | >166,7 | 98,2 | |||||
6-(2-hydroxy-3- methoxybenzylamino)purin | >166,7 | 26,6 | 69,0 | 41,6 | 64,3 | |||
6-(2-hydroxy-3methoxybenzylaminojpurin mesylát | >166,7 | 32,1 | 51,0 | 67,8 | ||||
trans-zQatva. (tZ) | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 | ||||
trans-zeatin mesylát | >166,7 | >166,7 | >166,7 | >166,7 |
Příklad 19: In vitro cytotoxicita nových derivátů v nekarcinogenních buňkách - kožní fibroblasty (BJ) a keratinocyty (HaCaT, ARPE-19) - stanovená za pomoci resazurinové redukční eseje
Resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide) je modrá slabě fluorescentní látka, která je mitochondiremi ireverzibilně redukována na červený vysoce fluorescentní resofurin. Používá se proto k hodnocení viability bakteriálních i eukaryotických buněk. V testu byl sledován vliv 72 hodinového působení několika koncentrací látek (trojnásobná ředící řada, maximální koncentrace = 100 mikroM) na viabilitu kožních fíbroblastů BJ, keratinocytů HaCaT a buněk sítnice ARPE-19.
Buňky byly pěstovány ve standardních kultivačních podmínkách (5.5 % CO2, 37° C, 100 % vdušná vlhkost) v médiu DMEM s 10 % fetálním bovinním sérem. Subkultivace byla prováděna dvakrát týdně. Na test toxicity bylo 5000 buněk vyseto do jednotlivých jamek 96-jamkové mikrotitrační destičky. Pět krát koncentrované testované látky byly přidány po 24 hodinách. Po 72-hodinovém působení byl přidán 1 Ix koncentrovaný roztok resazurinu do finální koncentrace 0.0125 mg/ml.
Fluorescence bylaměřenapo 1-hodinové (ARPE-19) případně 3-hodinové (HaCaTaBJ) inkubaci. Hodnoty IC50 byly vypočteny z dávkových křivek pomocí programu v jazyce R využívajícího knihovnu drc.
Tab. 12. Cytoxicita sloučenin vůči kožním fibroblastům, HaCaT a keratinocytům (IC50, μΜ)
sloučenina | BJ | HaCaT | ARPE-19 |
kinetin | >100 | >100 | >100 |
kinetin mesylát | >100 | >100 | >100 |
isopentenyl | 100 | >100 | >100 |
isopentenylmesylát | >100 | >100 | >100 |
6-benzylaminopurin | >100 | >100 | >100 |
6-benzylaminopurin mesylát | >100 | >100 | >100 |
meto-topolin (mT) | >100 | >100 | >100 |
meto-topolin mesylát | >100 | >100 | >100 |
ortúo-topolin (oT) | 98.7 | >100 | >100 |
ortúo-topolin mesylát | >100 | >100 | >100 |
/ra«y-zeatin (tZ) | >100 | >100 | >100 |
trans-zeatin mesylát | >100 | >100 | >100 |
-25 CZ 2020 - 276 A3
Příklad 20: Inhibice senescence novými cytokininovými mesyláty testovaná na listových segmentech ozimé pšenice
Semena ozimé pšenice Triticum aestivum cv. Hereward byla promyta pod tekoucí vodou apo 24 h a poté vyseta do mermikulitu nasyceného Knopovým živným roztokem. Nádoby se semeny byly umístěny do klimatizované růstové komory s 16/8 hodinovou světelnou periodou (světelná intenzita 50 pmokmÁs1). Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 5 rostlin byly odebrány vrchové sekce dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, abyjejich váza byla přesně 100 mg. Bazální konce těchto listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitračních polystyrénových destiček obsahujících 150 pL roztoku testované látky. Destičky byly umístěny do plastového boxu vystlaného filtračním paírem, který byl nasycen vodou za účelem vytvoření maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25 °C byly listové segmenty vyjmuty a chlorofýl extrahován v 5 ml 80 % ethanolu (v/v). Objem vzorku byl poté doplněn na 5 mL přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofýlové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v deionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 5-ti opakování a celý experiment byl zopakován minimálně 2x. Ze získaných dat byla vybrána koncentrace s nejvyšší aktivitou u každé testované sloučeniny. Relativní aktivity sloučenin při této koncentraci byly vypočítány a nachízí se v tabulce 13. Aktivita získaná pro ΙΟ-4 M 6benzylaminopurin (BAP) byla stanovena jako 100%. Cytokininy, které byly testovány, byly nejprve rozpuštěny v DMSO a pak byl roztok vyředěn na 10-3M destilovanou vodou. U těch krystalických solí cytokininových mesylátů, které to umožňovaly (BAP mesylát, meto-topolin mesylát, kinetin mesylát) nebyly rozpouštěny v DMSO, ale rovnou byl připravován 10-3M roztok v destilované vodě. Tento zásobní roztok byl pak ředěn na koncentrace v rozmezí 108M až 104M. Finální koncentrace DMSO v médiu, pokud bylo použito nepřevýšila 0.2% a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13 a ukazují, že některé krytalické soli cytokinin mesylátů dokonce vedly ke zvýšení cytokininové aktivitě v senescenčním testu ve srovnání s volnými bázemi těchto cytokininů.
Tab. 13. Vliv nových cytokininových mesylátů na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Heraward ve tmě.
testovaná sloučenina | koncentrace s nejvyšší aktivitou (mol.l1) | aktivita (%) [104 mol.I1 BAP = 100%] |
6-benzylaminopurin (BAP) | 10-4 | 100 (±9,5) |
6-benzylaminopurin mesylát | 10-4 | 108 (±10,7) |
6-(2-hydroxybenzylamino)purin - ort/zo-topolin (oT) | 10-4 | 67 (±6,7) |
6-(2-hydroxybenzylamino)purin mesylát | 10-4 | 69 (±9,1) |
6-(3-hydroxybenzylamino)purin - meto-topolin (mT) | 10-4 | 117 (±11) |
6-(3 -hydroxybenzylaminojpurin me sylát | 10-4 | 119 (±13) |
6-(3 -methoxybenzylamino)purin | 10-4 | 101(±9) |
6-(3 -methoxybenzylamino)purin me sylát | 10-4 | 125 (±8) |
6-furfiirylaminopurin (Kinetin) | 10-4 | 103 (±12) |
6-furfiirylaminopurin (Kinetin) mesylát | 10-4 | 110.9 (±11) |
Isopentenyladenin (iP) | 10-4 | 93 (±10,8) |
Isopentenyladenin mesylát | 10-4 | 95 (±12,6) |
Dihydrozeatin (DHZ) | 10-4 | 81 (±9,2) |
Dihydrozeatin mesylát | 10-4 | 82 (±9,7) |
/ram-zcatin (tZ) | 10-4 | 110 (±13,2) |
trans-zeatin mesylát | 10-4 | 114 (±12,8) |
-26CZ 2020 - 276 A3
6-(2-fluorobenzylamino)purin | ΙΟ’4 | 169 (±20) |
6-(2-fluorobenzylamino)purin mesylát | ΙΟ’4 | 175 (±18) |
6-(3 -fluorobenzylamino)purin | ΙΟ’4 | 200 (±25) |
6-(3-fluorobenzylamino)purin mesylát | 10’4 | 210 (±23) |
6-(4-fluorobenzylamino)purin | 10’4 | 95,5 (±3,5) |
6-(4-fluorobenzylamino)purin mesylát | 10’4 | 98 (±12) |
6-(2-chlorobenzylamino)purin | ΙΟ’4 | 116,5 (±6,5) |
6-(2-chlorobenzylamino)purin mesylát | ΙΟ’4 | 122 (±13) |
6-(3 -chlorobenzylamino)purin | ΙΟ’4 | 82 (±2) |
6-(3-chlorobenzylamino)purin mesylát | 10’4 | 82 (±7) |
6-(2-methoxybenzylamino)purin | 10’4 | 269 (±12) |
6-(2-methoxybenzylamino)purin mesylát | 10’4 | 271 (±18) |
6-(3 -methoxybenzylamino)purin | ΙΟ’4 | 178 (±16) |
6-(3 -methoxybenzylamino)purin me sylát | 10-4 | 184 (±21) |
6-(2-methylbenzylamino)purin | 10-4 | 158 (±29) |
6-(2-methylbenzylamino)purin mesylát | 10-4 | 157 (±14) |
6-(2,4-difluorobenzylamino)purin (2,4diFBAP) | 10’5 | 139(±2) |
6-(2,4difluorobenzylamino)purin mesylát | 10’5 | 141(±13) |
6-(3,5 -difluorobenzylamino)purin (3,5 diFBAP) | 10-5 | 156(±4) |
6-( 3,5 -difluorobenzylamino)purin me sylát | 10-5 | 168(±9) |
Příklad 21: Testování vlivu nových cytokininových mesylátů na buněčné dělení rostlinných buněk
Stimulační vliv nově připravených cytokininových mesylátů byl testován v kalusovém biotestu za použití cytokinin-dependentního kalusu tabáku. Tento cytokinin-dependentní kalus Nicotiana tabacum L.cv. Wisconsins 38 byl udržován při 25 °C na modifikovaném mediu Murashige-Skoog (MS) obsahujícím na 1 litr 4pmol kyseliny nikotinové, 2.4 pmol pyridoxin hydrochloridu, 1.2 pmol thiaminu, 26.6 pmol glycinu, 1.37 pmol glutaminu, 1.8 pmol myo-inositolu, 30 g sacharózy, 8 g agaru, 5.37 pmol NAA a 0.5 pmol BAP. Subkultivace probíhala každé tři týdny. 14 dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na medium bez BAP. Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován min 2x. Ze získaných dat byla vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (tab. 14). Aktivita při koncentraci ΙΟ-5 M 6-benzylaminopurinu byla postulována jako 100%. Zkoumané látky byly rozpouštěny v DMSO a roztok byl zředěn na 10-3M destilovanou vodou. U těch krystalických solí cytokininových mesylátů, které to umožňovaly (BAP mesylát, meto-topolin mesylát, kinetin mesylát) nebyly rozpouštěny v DMSO, ale rovnou byl připravován 10-3M roztok v destilované vodě. Tento zásobní roztok byl dale ředěn na potřebné koncentrace pohybující se v rozmezí ΙΟ-8 M až ΙΟ-4 M. Výsledná koncentrace DMSO nepřekročila 0.2% a neovlivnila tak biologickou aktivitu zkoumaných sloučenin. Výsledky v tabulce 14 ukazují, že krystalické soli cytokininových mesylátů vedou ke zvýšení cytokininové activity v kalusovém testu ve srovnání s klasickými bázemi těchto cytokininů.
Tab. 14. Vliv nových cytokininových mesylátů na růst cytokinin-dependentního tabákového kalusu Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38
testovaná sloučenina | koncentrace s nejvyšší aktivitou (mol.I1) | aktivita (%) [10“ WT1 BAP = 100%] | |
1. | 6-benzylaminopurin (BAP) | 10’5 | 100 (±13) |
2. | 6-benzylaminopurin (BAP) mesylát | 10-5 | 104 (±11) |
-27CZ 2020 - 276 A3
3. | 6-(2-hydroxybenzylamino)purin - or/Ao-topolin (oT) | 10-5 | 86 (±15) |
4. | 6-(2-hydroxybenzylamino)purin mesylát | IO’5 | 87 (±16) |
5. | 6-(3-hydroxybenzylamino)purin - meta-topolin (oT) | IO5 | 105 (±23) |
6. | 6-(3 -hydroxybenzylamino)purin me sylát | IO’5 | 111 (±21) |
7. | isopentenyladenin (iP) | IO’5 | 93 (±14) |
8. | isopentenyladenin mesylát | IO’5 | 95 (±17) |
9. | dihydrozeatin (DHZ) | IO5 | 78 (±18) |
10. | dihydrozeatin mesylát | IO5 | 78 (±21) |
11. | /ram'-zeatin (tZ) | IO5 | 109 (±21) |
12. | trans-zeatin mesylát | IO’5 | 111 (±22) |
13. | 6-(2-fluorobenzylamino)purin | IO’5 | 111 (±21) |
14. | 6-(2-fluorobenzylamino)purin mesylát | IO’5 | 110 (±15) |
15. | 6-(3 -fluorobenzylamino)purin | IO5 | 135 (±8) |
16. | 6-(3 -fluorobenzylamino)purinme sylát | IO5 | 137 (±15) |
17. | 6-(4-fluorobenzylamino)purin | IO5 | 122 (±12) |
18. | 6-(4-fluorobenzylamino)purin mesylát | IO’5 | 126 (±16) |
19. | 6-(2-chlorbenzylamino)purin | IO’5 | 93 (±4) |
20. | 6-(2-chlorobenzylamino)purin mesylát | IO’5 | 97 (±6) |
21. | 6-(3 -chlorobenzylamino)purin | 10-5 | 94 (±6) |
22. | 6-(3-chlorobenzylamino)purin mesylát | 10-5 | 101 (±12) |
23. | 6-(2-methoxybenzylamino)purin | IO’5 | 79 (±5) |
24. | 6-(2-methoxybenzylamino)purin mesylát | IO’5 | 82 (±8) |
25. | 6-(3 -methoxybenzylaminojpurin | IO’6 | 76 (±20) |
26. | 6-(3 -methoxybenzylaminojpurin me sylát | 10-6 | 83 (±14) |
27. | 6-(2-methylbenzylamino)purin | 10-6 | 118 (±3) |
28. | 6-(2-methylbenzylamino)purin mesylát | 10-6 | 121 (±11) |
Příklad 22: Účinek cytokininových mesylátů na in vitro a post vitro multiplikaci (množení) a zakořeňování růže (Rosa multiflora)
Účelem tohoto experimentu bylo zjistit, zdajsou nové cytokininové mesyláty prakticky využitelné ve tkáňových kulturách. Byl studován index množení a post vitro účinky. Růže (Rosa hybrida) byly pěstovány v 500 ml nádobách se šroubovacím uzávěrem. Každá nádoba obsahovala 100 ml autoklávovaného kultivačního media Murashige a Skoog (120 °C, 20 min). Rostliny byly kultivovány při teplotě 24±2 °C a světelné periodě 16 h při 40 μΜ m-2 s1 PAR. Základní medium obsahovalo mikroelementy, makroprvky a vitamíny podle Murashige and Skooga (1962), 95 μΜ NaFeEDTA, 555 μΜ myo-inositolu, 111 mM sacharózy, 1,332 mM glycinu, 684 μΜ L-glutaminu a 7g/l agaru. Toto medium bylo doplňováno 10 μΜ BAP mesylátů, mT mesylátů, and 3MeOBAP mesylátů a pro srovnání s příslušnými volnými bázemi odpovídajících cytokininů. Kontrolní medium neobsahovalo žádný cytokinin. Po uplynutí osmi týdnů byl stanoven přírůstek nových prýtů najeden explantát, stejně jako počet kořenů najeden explantát a celková délka kořenů na jeden explantát. Po odstranění kořenů byly explantáty (skupiny prýtů) přeneseny do substrátu. Po 4 týdnech aklimatizace byl znovu stanoven počet kořenů a jejich celková délka najeden explantát. Podle předpokladu neměly rostliny pěstované na médiu nebsahujícím cytokininy téměř žádné nové prýty. Původní explantáty vyrostly v kvalitní jednotlivé výhony, ale nezakořeňovaly dobře (viz tabulka 14). Explantáty rostoucí na cytokinininových mesylátech se vyznačovaly vysokým indexem množení (velké množství nových prýtů) a ve srovnání s volnými bázemi i lépe zakořeňovaly. Použití cytokininových mesylátů vedlo ke zvýšení všech sledovaných parametrů v rostlinné kultuře ve srovnání s volnými cytokininovými bázemi.
Tab. 15. Vliv cytokinin mesylátů na in vitro a post vitro množení a zakořeňování růže Rosa multiflora.
-28 CZ 2020 - 276 A3
Cytokinin | In vitro | Ex vitro | ||||
počet | počet | počet | celková | počet | celková | |
nových výhonů na explant | květů na explant | kořenů na explant | délka na explant (cm) | kořenů na rostlinu | délka rostliny (cm) | |
kontrola | 0.2 | 0.03 | 0.8 | 1.2 | 4.6 | 17.1 |
6-benzylaminopurin | 3.8 | 0.00 | 0.0 | 0.0 | 0.6 | 1.1 |
6-benzylaminopurin mesylát | 4.1 | 0.00 | 0.0 | 0.0 | 0.9 | 1.4 |
6-(3 -hydro xybenzylaminojpurin | 2.1 | 0.16 | 0.0 | 0.0 | 1.4 | 3.8 |
6-(3 -hydro xyaminojpurin mesylát | 2.4 | 0.17 | 0.0 | 0.0 | 1.8 | 4.3 |
6-(3 -metho xybenzylaminojpurin | 4.3 | 0.03 | 0.0 | 0.0 | 1.7 | 4.1 |
6-(3 -metho xybenzylaminojpurin mesylát | 4.5 | 0.02 | 0.0 | 0.0 | 1.9 | 4.5 |
Příklad 23: Zvýšení výnosu zrna a počtu produktivních odnoží jarního ječmene (var. Francin)
Jarní ječmen (odrůda Francin), byla v roce 2019 na lokalitě v Olomouci, ošetřena postřikem látek - označených BAP (benzylaminopurin), meto-topolin mesylátu a BAP mesylátu. Výsevek byl 3,5 milionu klíčivých semen, pokus byl založen v 5 randomizovaných opakováních pro každou variantu, kontrola byla neošetřená varianta. Pokus probíhal podle metodiky GEP (Good Experimental Practise), velikost jednotlivých parcel byla 10 m2. Aplikace látek byla provedena v ίο možství 300 1/ha, v růstové fázi BBCH 31-33 (začátek sloupkování). Koncentrace testovaných látek v postřikové jíše byla 5 pMol. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 15 níže.
Tab. 16: Účinek látek BAP, meto-topolin mesylátu and BAP mesylátu na jarní ječmen.
název sloučeniny (varianta) | Kontrola (neošetřeno) | BAP | m-topolin mesylát | BAP mesylát |
koncentrace | 5 uMol | 5 uMol | 5 uMol | |
aplikace (BBCH) | BBCH 31- 33 | BBCH 31- 33 | BBCH 31-33 | |
Výnos zrna (t/ha) při 14 % vlhkosti | 7,42 | 7,42 | 8,01 | 7,74 |
% srovnáno s kontrolou | 100 | 100,13 | 108,03 | 104,34 |
T-Test | 0,747 | 0,443 | 0,418 | |
Silné odnože (počet) | 1,8 | 2,8 | 2,45 | 2,75 |
% srovnáno s kontrolou | 100 | 155,56 | 136,11 | 152,78 |
T-Test | 0,001 | 0,018 | 0,001 | |
Střední odnože (počet) | 2,1 | 1,7 | 1,25 | 1,35 |
% srovnáno s kontrolou | 100 | 80,95 | 59,52 | 64,29 |
T-Test | 0,149 | 0,008 | 0,004 | |
Slabé odnože (počet) | 1,85 | 2,1 | 1,8 | 2,25 |
% srovnáno s kontrolou | 100 | 113,51 | 97,3 | 121,62 |
T-Test | 0,534 | 0,878 | 0,165 | |
SUMA odnoží | 5,75 | 6,6 | 5,5 | 6,35 |
% srovnáno s kontrolou | 100 | 114,78 | 95,65 | 110,43 |
-29CZ 2020 - 276 A3
T-Test | 0,069 | 0,581 | 0,134 | |
Výška rostlin | 82,8 | 82,5 | 83,1 | 83,2 |
% srovnáno s kontrolou | 100 | 99,64 | 100,36 | 100,48 |
T-Test | * | * | * | |
počet klasů na čtvereční metr | 676,8 | 752 | 721,6 | 758,4 |
% srovnáno s kontrolou | 100 | 111,11 | 106,62 | 112,06 |
T-Test | 0,15 | 0,39 | 0,094 |
Foliámí aplikace všech cytokininových derivátů, zvýšila počet silných (produktivních) odnoží (o 36,11 až 55,56 % nad úroveň kontroly), zatímco počet středních odnoží poklesl. Výnos zma se zvýšil po aplikaci látek meto-topolin mesylát a BAP mesylát (108,03 a 104,34 % na kontrolu).
Jakou pozitivní kontrola byl použit BAP, který výnos zma neovlivnil. U všech testovaných variant, byla pozorována vyšší hustota rostlin na čtverečním metru (106,62 - 112,06 % na kontrolu).
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Mesylát V^-substituovaného adeninového derivátu obecného vzorce I,O' (I) kde Rje vybrán ze skupiny obsahující C3-C15 cykloalkyl, furfuryl, allyl, 4-hydroxy-3-methylbut2-en-l-yl, 3-methylbut-2-en-l-yl, 4-hydroxy-3-methylbutyl, 4-hydroxy-l,3-dimethylbut-2-en-lyl, 4-hydroxy-l,3-dimethylbutyl, benzyl; kde cykloalkyl, allyl, benzyl a furfuryl mohou být nesubstituovány nebo volitelně substituovány 1 až 3 substituenty vybranými ze skupiny obsahující hydroxy, halogen, methyl, hydroxymethyl a methoxy.
- 2. Sloučenina obecného vzorce I podle nároku 1, vybraná ze skupiny zahrnující 6furfurylaminopurin mesylát, 6-(2-chlorbenzylamino)purin mesylát, 6-(3-chlorbenzylamino)purin mesylát, 6-(2-fluorbenzylamino)purin mesylát, 6-(3-fluorbenzylamino)purin mesylát, 6-(4fluorbenzylaminojpurin mesylát, 6-(2-hydroxybenzylamino)purin mesylát, 6-(3hydroxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(2-methoxybenzylamino)purin mesylát,, 6-(3methoxybenzylaminojpurin mesylát, 6-(3-methylbut-2-en-l-ylamino)purin mesylát, 6benzylaminopurin mesylát, 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-l-ylamino)purin mesylát, 6-(Z)-(4hydroxy-3 -methylbut-2-en-1 -ylaminojpurin mesylát, 6-(E)-(4-hydroxy-3 -methylbut-2-en-1 ylaminojpurin mesylát, 6-(Z)-(4-hydroxy-l,3-dimethylbut-2-en-l-ylamino)purin mesylát, 6-(Ej(4-hydroxy-1,3 -dimethylbut-2-en-1 -ylaminojpurin mesylát, 6-(4-hydroxy-3 - methylbutylaminojpurin mesylát a 6-(4-hydroxy-l,3-dimethylbutylamino)purin mesylát.
- 3. Sloučenina vzorce 1 podle nároku 1, vybraná ze skupiny obsahující:- krystalický benzylaminopurin mesylát mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 6.2; 10.0; 15.2; 15.7; 18.6; 18.8; 19.3; 20.4; 23.5; 23.8; 24.4; 27.6 ± 0.2° 2-theta;- krystalický meta-topolin mesylát mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 8.1; 9.7; 13.1; 15.6; 16.8; 17.6; 19.1; 19.5; 22.2; 24.6; 24.8; 24.9; 25.7 ± 0.2° 2-theta;- krystalický ortho-topolin mesylát mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 9.8; 12.1; 16.8; 17.8; 18.3; 18.3; 20.7; 23.3; 24.1; 25.1; 26.8 ± 0.2° 2-theta;- krystalický kinetin mesylát mající charakteristické reflexe ve spektru rentgenové práškové difrakce měřené zářením CuKa: 6.2; 18.9; 19.8; 20.4; 22.6; 23.9; 27.7; 27.8 ± 0.2° 2-theta.-31 CZ 2020 - 276 A3
- 4. Použití sloučenin obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro ochranu rostlinných buněk in vivo a in vitro proti oxidativnímu a elektrofilnímu stresu; a/nebo jako antioxidantů pro inhibici lipidové, proteinové a DNA peroxidace v rostlinách in vivo nebo in vitro.
- 5. Použití sloučenin obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro zvýšení výnosu užitkových rostlin, zlepšení zakořeňování, zvýšení počtu odnoží, zvýšení multiplikace a/nebo oddálení senescence rostlin, zejména v produkci zemědělských plodin, především obilovin, řepy, malvic, peckovic a drobného ovoce, luštěnin, olej ovin, tykvovitých, vláknitých rostlin, citrusů, zeleniny nebo rostlin jako tabák, ořechy, lilek, cukrová třtina, čaj, vinná réva, chmel, banány, přírodní kaučuk, léčivé rostliny, a okrasné rostliny.
- 6. Použití sloučenin obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 ve tkáňových kulturách jako růstově-regulačních a prodiferenciačních faktorů, ke stimulaci buněčné proliferace a morfogeneze, k potlačení nežádoucích fyziologických poruch, jako jsou hyperhydricita, nekróza vzrostných vecholů, tvorba chimér, inhibice tvorby kořenů během aklimatizace a časná senescence.
- 7. Použití sloučenin obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 jako růstového regulátoru při in vitro klonování rostlinných či živočišných zárodečných buněk a embryí, s výhodou oocytů, a k množení a diferenciaci embryí.
- 8. Použití sloučenin obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro inhibici nebo oddálení senescence rostlinných buněk a celých rostlin; a/nebo pro zlepšení celkového vzhledu a kondice rostlin, konkrétně rostlinných epidermálních a mezofylových buněk, a také pro inhibici, oddálení nebo redukci žloutnutí, ztráty chloroplastů a chlorofylu; a/nebo pro omlazení rostlinných buněk a/nebo stimulaci buněčné proliferace a/nebo jejich diferenciace v organismu.
- 9. Zemědělské a/nebo biotechnologické přípravky, vyznačující se tím, že obsahují alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, a alespoň jedno rozpouštědlo, nosič a/nebo pomocnou látku.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2020276A CZ309368B6 (cs) | 2020-05-17 | 2020-05-17 | Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití |
US17/925,709 US20230192697A1 (en) | 2020-05-17 | 2020-08-22 | Mesylate salts of heterocyclic cytokinins, compositions containing these derivatives and use thereof |
PCT/CZ2020/050060 WO2021233485A1 (en) | 2020-05-17 | 2020-08-22 | Mesylate salts of heterocyclic cytokinins, compositions containing these derivatives and use thereof |
EP20768262.6A EP4153592B1 (en) | 2020-05-17 | 2020-08-22 | Mesylate salts of heterocyclic cytokinins, compositions containing these derivatives and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2020276A CZ309368B6 (cs) | 2020-05-17 | 2020-05-17 | Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ2020276A3 true CZ2020276A3 (cs) | 2021-11-24 |
CZ309368B6 CZ309368B6 (cs) | 2022-10-12 |
Family
ID=72428122
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2020276A CZ309368B6 (cs) | 2020-05-17 | 2020-05-17 | Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230192697A1 (cs) |
EP (1) | EP4153592B1 (cs) |
CZ (1) | CZ309368B6 (cs) |
WO (1) | WO2021233485A1 (cs) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU715538B2 (en) | 1996-03-15 | 2000-02-03 | Syngenta Participations Ag | Herbicidal synergistic composition and method of weed control |
CZ302225B6 (cs) * | 2007-07-04 | 2010-12-29 | Univerzita Palackého v Olomouci | Substituované 6-anilinopurinové deriváty jako inhibitory cytokinin oxidasy a prípravky obsahující tyto slouceniny |
CZ2010670A3 (cs) * | 2010-09-07 | 2012-03-14 | Univerzita Palackého v Olomouci | Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinu pro regulaci rustu a vývoje rostlin, rostlinných orgánu a bunek, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny |
US10662194B2 (en) * | 2014-12-15 | 2020-05-26 | Univerzita Palackeho V Olomouci | Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress |
-
2020
- 2020-05-17 CZ CZ2020276A patent/CZ309368B6/cs unknown
- 2020-08-22 US US17/925,709 patent/US20230192697A1/en active Pending
- 2020-08-22 EP EP20768262.6A patent/EP4153592B1/en active Active
- 2020-08-22 WO PCT/CZ2020/050060 patent/WO2021233485A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4153592B1 (en) | 2024-04-24 |
WO2021233485A1 (en) | 2021-11-25 |
EP4153592A1 (en) | 2023-03-29 |
US20230192697A1 (en) | 2023-06-22 |
CZ309368B6 (cs) | 2022-10-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20100240537A1 (en) | Substituted 6-(alkylbenzylamino)purine derivatives for use as cytokinin receptor antagonists and preparations containing these derivatives | |
ES2431926T3 (es) | Derivados de 6-anilinopurina sustituidos como inhibidores de citocinina oxidasa/deshidrogenasa y preparaciones que contienen estos derivados | |
CA2859282A1 (en) | Strigolactam derivatives as plant growth regulating compounds | |
US9220269B2 (en) | Use of 6-substituted 9-halogenalkyl purines for regulation of growth and development of whole plants, plant cells and plant organs; novel 6-substituted 9-halogenalkyl purines | |
US10662194B2 (en) | Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress | |
CZ2020276A3 (cs) | Mesylátové soli heterocyklických cytokininů, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použit | |
CN115279753A (zh) | (2r*,4r*)-4-[[(5s)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4h-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-羧酸甲酯的晶体形式及其除草协同作用 | |
US9993002B2 (en) | 1,2,3-thiadiazol-5yl-urea derivatives, use thereof for regulating plant senescence and preparations containing these derivatives | |
CN113582970B (zh) | 含酰胺及肟或肟醚结构的硫色满-4-酮衍生物的制备方法及应用 | |
US10550144B2 (en) | 6-aryl-9-glycosylpurines and use thereof | |
EP3191482B1 (en) | 1,2,3-thiadiazol-5yl-urea derivatives, use thereof for regulating plant senescence and preparations containing these derivatives | |
WO2021185391A1 (en) | Inhibitors of cytokinin oxidase derived from 1-[2-(hydroxyalkyl)phenyl]-3-ylurea, use thereof and preparations containing these derivatives | |
CZ305649B6 (cs) | Deriváty 1,2,3-thiadiazol-5-yl močoviny, jejich použití pro regulaci senescence rostlin a přípravky obsahující tyto deriváty | |
WO2022012702A1 (en) | Nitrogen heterocyclic cytokinin derivatives, compositions containing these derivatives and use thereof | |
CZ306009B6 (cs) | Použití N-furfuryl-N´-1,2,3-thiadiazol-5-yl močoviny pro inhibici senescence, stresu a oxidativního poškození |