CZ2017193A3 - Multimodal stationary phases for liquid chromatography, a method of their preparation and their use - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení se týká multimodální stacionární fáze pro kapalinovou chromatografii obecného vzorce I a nosič stacionární fáze je vybraný ze skupiny sestávající z komerčně dostupných nebo laboratorně připravených anorganických částicových materiálů o velikosti částic od 1,5 do 10 μm a velikosti pórů od 9 do 20 nm, standardně používaných jako inertní nosiče v kapalinové chromatografii pro chemické ukotvení selektoru. Předkládané řešení se dále týká způsobu přípravy multimodální stacionární fáze a jejího použití.The present invention relates to a multimodal liquid chromatography phase of the general formula I and the stationary phase support is selected from the group consisting of commercially available or laboratory-prepared inorganic particulate materials having a particle size of 1.5 to 10 µm and a pore size of 9 to 20 nm, standardly used as inert carriers in liquid chromatography for chemical anchoring of the selector. The present invention further relates to a method for preparing a multimodal stationary phase and its use.

Description

Oblast technikyTechnical field

Předkládaný vynález se týká multimodálních stacionárních fází pro kapalinovou chromatografií, způsobu jejich přípravy a jejich použití v různých chromatografických módech a jako sorbentu pro extrakci na pevné fázi. Jejich struktura zajišťuje různou kvalitu hydrofobních interakcí selektorů a charakter se lektoru (silný katex, zwitteriontový ionex). Stacionární fáze lze použít ve vysokoúčinné kapalinové chromatografií (HPLC) i superkritické fluidní chromatografií (SFC) a jejích variantách, v širokém rozsahu chromatografických módů.The present invention relates to multimodal stationary phases for liquid chromatography, to a process for their preparation and to their use in various chromatographic modes and as a sorbent for solid phase extraction. Their structure ensures different quality of hydrophobic interactions of selectors and character of the lecturer (strong cation exchanger, zwitterion ion exchanger). The stationary phases can be used in high performance liquid chromatography (HPLC) and supercritical fluid chromatography (SFC) and its variants, in a wide range of chromatographic modes.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Jednou z nejvýznamnějších aplikačních oblastí HPLC je díky širokému aplikačnímu rozsahu chromatografie na reverzní fázi (Reversed-phase High-performance Liquid Chromatography; RP-HPLC). Tento chromatografícký mód je vhodný pro široké spektrum analytů, od malých organických molekul přes biologicky aktivní látky a jejich metabolity až po peptidy (T. Zhang, D. G. Watson, Current Metabolomics 1 (2013) 58). V tomto případě je separace založena na hydrofobních interakcích analytů s nepolární stacionární fází. Z toho důvodu jsou však polární nebo ionizované analyty buď velmi špatně (anebo vůbec) separovány (M. Lammerhofer, M. Richter, J. Wu, R. Nogueira, W. Bicker, W. Lindner, Journal of Separation Science 31 (2008) 2572). Alternativou v případě polárních analytů je použití chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic Interaction Chromatography; HILIC), kdy je použita polární stacionární fáze a pufrovaná mobilní fáze bohatá na organickou složku (zpravidla acetonitril) s malým množstvím vody. Separace analytů je pak založena na partičním mechanismu, tj. migraci analytů z mobilní fáze do povrchové vrstvy vody adsorbované na polárním povrchu stacionární fáze, následné interakci se stacionární fází a migraci zpět do mobilní fáze (M.R. Gama, R.G. da Costa Silva, C.H. Collins, C.B.G. Bottoli, TrAC Trends in Analytical Chemistry 37 (2012) 48). Je zřejmé, že HILIC mód je velmi obtížně použitelný pro látky nepolární, které nejsou na HILIC fázích zadrženy a jsou zpravidla eluovány v mrtvém čase kolony. Nabité analyty lze pak s výhodou separovat v polárním organickém módu, tj. za použití polární mobilní fáze (např. methanolu, směsi methanolu s acetonitrilem, atd.) s odpovídajícím pufrem na stacionárních fázích iontové povahy (ionexech; IEX). V tomto případě se využívá komplementarity funkčních skupinOne of the most important application areas of HPLC is due to the wide application range of Reversed-phase High-Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC). This chromatographic mode is suitable for a wide range of analytes, from small organic molecules to biologically active substances and their metabolites to peptides (T. Zhang, D.G. Watson, Current Metabolomics 1 (2013) 58). In this case, the separation is based on the hydrophobic interactions of the analytes with the non-polar stationary phase. For this reason, however, polar or ionized analytes are either very poorly (or not at all) separated (M. Lammerhofer, M. Richter, J. Wu, R. Nogueira, W. Bicker, W. Lindner, Journal of Separation Science 31 (2008) 2572). An alternative for polar analytes is the use of Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC), using a polar stationary phase and a buffered mobile phase rich in an organic component (typically acetonitrile) with a small amount of water. Separation of analytes is then based on the partition mechanism, ie migration of analytes from the mobile phase to the surface layer of water adsorbed on the polar surface of the stationary phase, subsequent interaction with the stationary phase and migration back to the mobile phase (MR Gama, RG da Costa Silva, CH Collins, CBG Bottoli, TrAC Trends in Analytical Chemistry 37 (2012) 48). Obviously, the HILIC mode is very difficult to use for non-polar substances that are not retained on the HILIC phases and are generally eluted in the dead time of the column. The charged analytes can then advantageously be separated in the polar organic mode, i.e. using a polar mobile phase (e.g. methanol, methanol-acetonitrile, etc.) with an appropriate buffer on stationary phases of ionic nature (ion exchangers; IEX). Complementarity of functional groups is utilized in this case

2selektoru stacionární fáze s funkčními skupinami analytů, kdy primární interakcí zodpovědnou za retenci analytů je přitažlivá síla mezi opačně nabitými funkčními skupinami selektoru a analytů (M. Lammerhofer, Journal of Chromatography A 1217 (2010) 814; M. Lámmerhofer, Analytical and Bioanalytical Chemistry 406 (2014) 6095). Ionexy lze zpravidla použít i v reverzní fázi, avšak nepolární a neionizující látky jsou na tomto typu stacionárních fází jen velmi obtížně separovatelné.2 of a stationary phase analyte functional group, wherein the primary interaction responsible for analyte retention is the attractive force between oppositely charged selector and analyte functional groups (M. Lammerhofer, Journal of Chromatography A 1217 (2010) 814; M. Lammerhofer, Analytical and Bioanalytical Chemistry 406 (2014) 6095). In general, ion exchangers can also be used in the reverse phase, but non-polar and non-ionizing substances are difficult to separate on this type of stationary phase.

Pro separaci směsi různě polárních, nepolárních a iontových analytů je tak nutné použít postupně několik různých stacionárních fází a separačních metod, což je příčinou zdlouhavého procesu separace analytů a velké spotřeby mobilních fází, čímž vzrůstá časová i finanční nákladnost separace.Thus, for the separation of a mixture of different polar, nonpolar and ionic analytes, it is necessary to use several different stationary phases and separation methods successively, which leads to a lengthy process of separation of analytes and high consumption of mobile phases, thus increasing the time and cost of separation.

Proto byly, na rozdíl od stacionárních fází typu RP, HILIC či IEX, které využívají hydrofobní, hydrofilní či elektrostatické interakce, vyvinuty tzv. multimodální stacionární fáze, kombinující alespoň dva tyto interakční módy. Multimodální chromatografie tedy umožňuje separaci látek, které nejsou na výše uvedených stacionárních fázích separovány anebo vůbec zadrženy. Díky těmto vlastnostem popularita multimodálních fází neustále vzrůstá, a to zejména v oblasti separace polárních a nabitých analytů či purifíkace komplexních matricí. Základní typy multimodálních stacionárních fází (RP-HILIC, RP-IEX, HILIC-IEX, atd.), přístupy kjejich syntéze a chromatografické použití jsou sumarizovány v recentních přehledných článcích (L. Wang, W. Wei, Z. Xia, X. Jie, Z.Z. Xia, TrAC Trends in Analytical Chemistry 80 (2016) 495; K. Zhang, X. Liu, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 128 (2016) 73; L. Zhang, Q. Dai, X. Qiao, C. Yu, X. Qin, H. Yan, TrAC Trends in Analytical Chemistry 82 (2016) 143). Převážná většina těchto materiálů je však určena pro HPLC separace v módu reverzní fáze a jejich využití v jiných chromatografických módech či superkritické fluidní chromatografii (Supercritical Fluid Chromatography; SFC) může být problematické.Therefore, unlike the RP, HILIC or IEX stationary phases, which use hydrophobic, hydrophilic or electrostatic interactions, so-called multimodal stationary phases have been developed, combining at least two of these interaction modes. Thus, multimodal chromatography allows the separation of substances which are not separated or retained at all in the above stationary phases. Thanks to these properties, the popularity of multimodal phases is constantly increasing, especially in the field of separation of polar and charged analytes or purification of complex matrices. The basic types of multimodal stationary phases (RP-HILIC, RP-IEX, HILIC-IEX, etc.), their synthesis approaches and chromatographic applications are summarized in recent review articles (L. Wang, W. Wei, Z. Xia, X. Jie). ZZ Xia, TrAC Trends in Analytical Chemistry 80 (2016) 495, K. Zhang, X. Liu, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 128 (2016) 73; L. Zhang, Q. Dai, X. Qiao, C. Yu , X. Qin, H. Yan, TrAC Trends in Analytical Chemistry 82 (2016) 143). However, the vast majority of these materials are intended for HPLC separations in reverse phase mode and their use in other chromatographic modes or Supercritical Fluid Chromatography (SFC) can be problematic.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Předkládaný vynález se týká multimodální stacionární fáze, obsahující nosič a selektor, přičemž selektor kombinuje dva segmenty tvořené alifatickými řetězci a oddělené heteroatomem, sterminální polární (sulfonovou) skupinou. Ionizovatelná polární skupina a ionizovatelný heteroatom ve struktuře selektoru multimodální stacionární fáze umožňuje její použití v polárním organickém módu. V závislosti na délce alifatických řetězců je charakter stacionární fáze posouván více do oblasti HILIC módu (kratší řetězce) nebo RP módu (delší řetězce). Přesná hranice však není stanovena a jednotlivé stacionární fáze lze používat bez omezení v obou chromatografických módech, v závislosti na použité mobilní fázi. Je-li heteroatomem dusík či substituovaný dusík, nabývají stacionární fáze zwitteriontové povahy s anexovým centrem na atomu dusíku a katexovým centrem tvořeným sulfonovou skupinou. Je-li heteroatomem kyslík či síra (i oxidovaná ve formě sulfoxidu či sulfonu), mají stacionární fáze povahu katexu. Příprava stacionární fáze vychází z nukleofilního otevírání sultonového kruhu vhodným alkoholátem či thiolátem (alkoholem či thiolem), aminem případně jeho vhodnou solí za tvorby základní struktury s dvěma alkylovými řetězci, terminální sulfonovou skupinou na straně jedné a terminální trojnou vazbou na straně druhé. Následuje reakce mezi azidovými jednotkami nosiče a terminální trojnou vazbou. Nosičem, na kterém je selektor imobilizován, je s výhodou silikagel, modifikovaný azidovými skupinami. Výslednou multimodální stacionární fázi podle předkládaného vynálezu lze následně plnit do chromatografických kolon libovolné délky a průměru a použít při vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) a/nebo superkritické fluidní chromatografii (SFC) a jejích variantách, a to v širokém rozsahu chromatografických módů. Materiál lze rovněž využít jako sorbent pro solid phase extraction (SPE), a to jak imobilizovaný na silikagel, tak na polystyren a jiné nosiče.The present invention relates to a multimodal stationary phase comprising a carrier and a selector, wherein the selector combines two segments formed by aliphatic chains and separated by a heteroatom, a sterminal polar (sulfone) group. The ionizable polar group and the ionizable heteroatom in the selector structure of the multimodal stationary phase allow its use in the polar organic mode. Depending on the length of the aliphatic chains, the character of the stationary phase is shifted more into the HILIC mode (shorter chains) or RP mode (longer chains). However, the exact limit is not set and the individual stationary phases can be used without restriction in both chromatographic modes, depending on the mobile phase used. When the heteroatom is nitrogen or substituted nitrogen, the stationary phases are zwitterionic in nature with an anion exchange center on the nitrogen atom and a cation exchange center formed by a sulfone group. If the heteroatom is oxygen or sulfur (even oxidized in the form of a sulfoxide or sulfone), the stationary phases are cation exchange. The preparation of the stationary phase is based on the nucleophilic opening of the sulton ring with a suitable alcoholate or thiolate (alcohol or thiol), an amine or a suitable salt thereof to form a double alkyl backbone, a terminal sulfone group on the one hand and a terminal triple bond on the other. The reaction follows between the azide units of the carrier and the terminal triple bond. The carrier on which the selector is immobilized is preferably azide-modified silica gel. The resulting multimodal stationary phase of the present invention can then be packed into chromatographic columns of any length and diameter and used in high performance liquid chromatography (HPLC) and / or supercritical fluid chromatography (SFC) and variants thereof, over a wide range of chromatographic modes. The material can also be used as a solid phase extraction (SPE) sorbent, both immobilized on silica gel and polystyrene and other carriers.

Předmětem předkládaného vynálezu je multimodální stacionární fáze pro kapalinovou chromatografii obecného vzorce £1)'It is an object of the present invention to provide a multimodal stationary phase for liquid chromatography of formula (I).

R je —O—, -S—, sulfoxid (-SO-), sulfon (-SO2-) nebo -N(R*)-;R is -O-, -S-, sulfoxide (-SO-), sulfone (-SO2-) or -N (R *) -;

přičemž R¹ je vybrané ze skupiny sestávající zH, (Cl až C6)alkylu, (C2 až C6)alkenylu, (C2 až C6)alkynylu, (C6 až C8)arylu, s výhodou je R¹ vybrané ze skupiny sestávající z H, -CH₃, -CH₂CH₃, allylu, propargylu, benzylu a fenylu;wherein R ¹ is selected from the group consisting of H, (C 1 -C 6) alkyl, (C 2 -C 6) alkenyl, (C 2 -C 6) alkynyl, (C 6 -C 8) aryl, preferably R ^{1 is} selected from the group consisting of H, -CH ₃ , -CH ₂ CH ₃ , allyl, propargyl, benzyl and phenyl;

n je celé číslo v rozmezí od 3 do 11;n is an integer ranging from 3 to 11;

m je celé číslo v rozmezí od 2 do 5;m is an integer ranging from 2 to 5;

z je celé číslo v rozmezí od 2 do 5;z is an integer ranging from 2 to 5;

L je triazol vzorcefII)L is a triazole of formula (II)

(ii);(ii);

a nosič stacionární fáze je vybraný ze skupiny sestávající z komerčně dostupných nebo laboratorně připravených anorganických částicových materiálů o velikosti částic od 1,5 do 10 pm a velikosti pórů od 9 nm do 20 nm, nejvýhodněji 12 nm, standardně používaných jako inertní nosiče v kapalinové chromatografii pro chemické ukotvení selektoru, s výhodou je nosičem silikagel (S1O2), alumina (AI2O3), ZrC>2, T1O2, a zeolity, zejména MCM-48, polystyrénové částice, částice s povrchově porézní vrstvou s pevným jádrem (v dané oblasti techniky běžně nazývané „core-shell“ částice) o velikosti od 1,6 do 5 pm s různou tloušťkou povrchově porézní vrstvy a velikostí pórů (R. Hayes, A. Ahmed, T. Edge, H. Zhang, Journal of Chromatography A 1357 (2014) 36). Nejvýhodněji je nosičem silikagel.and the stationary phase support is selected from the group consisting of commercially available or laboratory prepared inorganic particulate materials having a particle size of from 1.5 to 10 µm and a pore size of from 9 nm to 20 nm, most preferably 12 nm, standardly used as inert supports in liquid chromatography for chemical anchoring of the selector, preferably the carrier is silica gel (S1O2), alumina (Al2O3), ZrC > 2, T1O2, and zeolites, especially MCM-48, polystyrene particles, solid core surface porous layer particles (commonly known in the art) called "core-shell" particles ranging from 1.6 to 5 µm with different surface porous layer thicknesses and pore sizes (R. Hayes, A. Ahmed, T. Edge, H. Zhang, Journal of Chromatography A 1357 (2014) ) 36). Most preferably, the carrier is silica gel.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy multimodální stacionární fáze pro kapalinovou chromatografii podle předkládaného vynálezu, který obsahuje následující kroky:The present invention also provides a process for preparing a multimodal stationary phase for liquid chromatography according to the present invention, comprising the following steps:

a) připraví se selektor obecného vzorce ,(111)(a) a selector of the general formula is prepared, (111)

(III), obsahující ve své struktuře terminální trojnou vazbu, kde n je celé číslo v rozmezí od 3 do 11, m je celé číslo v rozmezí od 2 do 5 a R je -O-, -S-, -SO-, -SO2- nebo -N(R')-;(III), comprising in its structure a terminal triple bond wherein n is an integer ranging from 3 to 11, m is an integer ranging from 2 to 5 and R is -O-, -S-, -SO-, - SO 2 - or -N (R ') -;

přičemž R¹ je vybrané ze skupiny sestávající z H, (Cl až C6)alkylu, (C2 až C6)alkenylu, (C2 až C6)alkynylu, (C6 až C8)arylu, s výhodou je R¹ vybrané ze skupiny sestávající z H, -CH3, -CH2CH3, allylu, propargylu, benzylu a fenylu;wherein R ¹ is selected from the group consisting of H, (C 1 -C 6) alkyl, (C 2 -C 6) alkenyl, (C 2 -C 6) alkynyl, (C 6 -C 8) aryl, preferably R ^{1 is} selected from the group consisting of H , -CH 3, -CH 2 CH 3, allyl, propargyl, benzyl and phenyl;

tak, že se (C3 až Cl l)alkenolát nebo (C3 až Cl l)alkynolát nebo (C3 až Cl 1 )alkenthiolát nebo (C3 až Cl 1 )alkynthiolát nebo (C3 až C11 )alkenylamin nebo (C3 až Cl l)alkynylamin , který má násobnou vazbu na opačném konci uhlíkového řetězce než heteroatom, podrobí reakci s (C2 až C5)sultonem, případně se výsledný selektor, který obsahuje R = -S-, dále oxiduje prostou nebo katalizovanou oxidací vzdušným kyslíkem nebo peroxidem vodíku na R = -SO- a/nebo -SO2-; přičemž katalyzátorem pro oxidaci na sulfoxid (-SO-) je s výhodou flavinový katalyzátor (R.such that a (C3-C11) alkenolate or a (C3-C11) alkynolate or a (C3-C11) alkenethiolate or a (C3-C11) alkynthiolate or a (C3-C11) alkenylamine or a (C3-C11) alkynylamine which has a multiple bond at the opposite end of the carbon chain than the heteroatom, is reacted with (C2 to C5) sultone, optionally the resulting selector containing R = -S- is further oxidized by simple or catalyzed oxidation with air oxygen or hydrogen peroxide to R = -SO- and / or -SO 2 -; wherein the catalyst for oxidation to sulfoxide (-SO-) is preferably a flavin catalyst (R.

Cibulka, European Journal of Organic Chemistry 2015, 915), oxidace na sulfon (-SO2-) se provede peroxidem vodíku ve vodném prostředí;Cibulka, European Journal of Organic Chemistry 2015, 915), oxidation to sulfone (-SO2-) is carried out with hydrogen peroxide in an aqueous medium;

b) selektor obecného vzorce (III) se imobilizuje na nosič, vybraný ze skupiny sestávající z anorganických částicových materiálů o velikosti částic od 1,5 do 10 pm a velikosti pórů od 9 nm do 20 nm, nejvýhodněji 12 nm, standardně používaných jako inertní nosiče v kapalinové chromatografii pro chemické ukotvení selektroru, tak, že nosič, který je modifikovaný azidoalkylovými skupinami o počtu uhlíkových atomů v alkylenovém řetězci od 2 do 5, reaguje se selektorem obecného vzorce (III) za vzniku multimodální stacionární fáze obecného vzorce (IL S výhodou je nosič modifikovaný 3-azidopropylovými skupinami. S výhodou je selektor obecného vzorce f III)· imobilizován na povrch nosiče v množství od 100 pmol/g do 600 pmol/g nosiče. S výhodou je nosičem silikagel (S1O2), alumina (A1₂O₃), ZrCh, T1O2, a zeolit, zejména MCM-48, core-shell částice o velikosti 1,6 do 5 pm, nejvýhodněji je nosičem silikagel.b) the selector of formula (III) is immobilized on a carrier selected from the group consisting of inorganic particulate materials having a particle size of from 1.5 to 10 µm and a pore size of from 9 nm to 20 nm, most preferably 12 nm, normally used as inert carriers in liquid chromatography for chemical anchoring of the selector, such that the carrier, which is modified with azidoalkyl groups of 2 to 5 carbon atoms in the alkylene chain, reacts with a selector of formula (III) to form a multimodal stationary phase of formula (IL) Preferably, the selector of formula (III) is immobilized to the surface of the carrier in an amount of from 100 pmol / g to 600 pmol / g of carrier. Preferably, the carrier is silica gel (SiO ₂ ), alumina (Al ₂ O ₃ ), ZrCl 2, T1O 2, and zeolite, especially MCM-48, a core-shell particle of 1.6 to 5 µm, most preferably the carrier is silica gel.

Ve výhodném provedení je krokem b) Huisgenova dipolámí cykloadiční reakce mezi terminální trojnou vazbou selektoru obecného vzorcef JUXa azidovou skupinou látky obecného vzorce/III), (IV), kde z je celé číslo v rozmezí od 2 do 5, přičemž látka obecného vzorce (IVýse připraví dle některého z obecně známých postupů (např. K. M. Kacprzak, N. M. Maier, W. Lindner Tetrahedron Letters 47 (2006) 8721).In a preferred embodiment, step b) is a Huisgen dipolar cycloaddition reaction between the terminal triple bond of a selector of formula (JUXa) an azide group of a compound of formula (III), (IV) wherein z is an integer ranging from 2 to 5; prepared according to one of the generally known methods (eg KM Kacprzak, NM Maier, W. Lindner, Tetrahedron Letters 47 (2006) 8721).

Ve výhodném provedení proběhne reakce (C3 až C11 )alkenolátu nebo (C3 až Cl l)alkynolátu nebo (C3 až Cl 1 )alkenthiolátu nebo (C3 až Cl 1 )alkynthiolátu nebo (C3 až Cl 1 )alkenylaminu nebo (C3 až Cl l)alkynylaminu, který má násobnou vazbu na opačném konci uhlíkového řetězce než heteroatom, s (C2 až C5)sultonem v kroku a) při teplotě alespoň 50 °C a v atmosféře inertního plynu po dobu alespoň 10 hodin. Výhodněji je teplota v rozmezí od 50 °C do bodu varu použitého rozpouštědla (s výhodou tetrahydrofuran, acetonitril, Α,Α-dimethylformamid), ještě výhodněji je teplota v rozmezí od 60 °C do 80 °C, nejvýhodněji je teplota 60 °C. Inertním plynem je s výhodou N2 nebo Ar. Doba reakce je s výhodou 12 hodin.In a preferred embodiment, the reaction of (C3 to C11) alkenolate or (C3 to C1) alkynolate or (C3 to C1) alkenethiolate or (C3 to C1) alkynthiolate or (C3 to C1) alkenylamine or (C3 to C1) is carried out. an alkynylamine having a multiple bond at the opposite end of the carbon chain to the heteroatom, with (C 2 -C 5) sultone in step a) at a temperature of at least 50 ° C and an inert gas atmosphere for at least 10 hours. More preferably, the temperature is in the range of 50 ° C to the boiling point of the solvent used (preferably tetrahydrofuran, acetonitrile, α,-dimethylformamide), more preferably the temperature is in the range of 60 ° C to 80 ° C, most preferably 60 ° C. The inert gas is preferably N2 or Ar. The reaction time is preferably 12 hours.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití multimodální stacionární fáze podle předkládaného vynálezu pro chromatografickou separaci a purifikaci látek v polárním organickém módu, na reverzní fázi, při chromatografii hydrofilních interakcí a při superkritické fluidní chromatografii.The present invention further provides the use of the multimodal stationary phase of the present invention for the chromatographic separation and purification of substances in the polar organic mode, reverse phase, hydrophilic interaction chromatography and supercritical fluid chromatography.

Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž použití multimodální stacionární fáze podle předkládaného vynálezu jako sorbentu pro extrakci na pevné fázi (solid phase extraction, SPE).It is also an object of the present invention to use the multimodal stationary phase of the present invention as a sorbent for solid phase extraction (SPE).

Stručný popis vyobrazeníBrief description of the illustrations

Obr. 1: PCA analýza hodnot log k analytů na testovaných kolonách (SCX 1-3 a ZWIX 1-3) za použití polárního organického módu.Giant. 1: PCA analysis of log k analyte values on test columns (SCX 1-3 and ZWIX 1-3) using polar organic mode.

Obr. 2: PCA analýza log k analytů na nových multimodálních stacionárních fázích (SCX 1-3 a ZWIX 1 -3) v módu reverzní fáze.Giant. 2: PCA analysis of log k analytes on new multimodal stationary phases (SCX 1-3 and ZWIX 1 -3) in reverse phase mode.

Obr. 3: Výsledky PCA analýzy pro log k testovaných analytů na jednotlivých stacionárních fázích (SCX 1-3 a ZWIX 1-3) v HILIC módu.Giant. 3: Results of PCA analysis for log k of tested analytes on individual stationary phases (SCX 1-3 and ZWIX 1-3) in HILIC mode.

Obr. 4: Výsledky PCA analýzy hodnot log k analytů na nových multimodálních stacionárních fázích (SCX 1-3 a ZWIX 1-3) v SFC módu.Giant. 4: Results of PCA analysis of log k analyzer values on new multimodal stationary phases (SCX 1-3 and ZWIX 1-3) in SFC mode.

Obr. 5: Proložení 15 po sobě jdoucích nástřiků separace standardní směsi metabolitů tryptofanové metabolické dráhy na koloně SCX 3 v SFC-MS/MS módu.Giant. 5: Interleaving of 15 consecutive injections of separation of a standard mixture of tryptophan metabolic pathway metabolites on an SCX 3 column in SFC-MS / MS mode.

Příklady uskutečnění vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1: Syntéza vybraných selektoruExample 1: Synthesis of selected selectors

4-Allyloxybutan-l-sulfonová kyselina (SCX 1) — není předmětem vynálezu4-Allyloxybutane-1-sulfonic acid (SCX 1) - is not an object of the invention

Do tříhrdlé baňky důkladně promyté inertním plynem byl předložen prop-2-en-l-ol (18,8 mmol) a rozpuštěn v suchém tetrahydrofuranu (30 ml). K roztoku (ochlazenému na 0 °C) byla po částech přidána suspense hydridu sodného (60% v minerálním oleji) a rekční směs byla míchána 1 h při laboratorní teplotě. Poté byla reakční směs ochlazena na 0 °C a byl přikapán butan-1,4sulton (25,4 mmol). Chladící lázeň byla odstavena a reakční směs zahřívána na 60 °C v atmosféře inertního plynu 12 h. Vyloučená krystalická látky byla odfiltrována, promyta acetonem a vysušena. Bylo získáno 0,26 g (56 %) katexu SCX 1. *H NMR (400 MHz, D₂O) δ: 1,6 (m, 4 H, (CH₂)₂); 2,8 (t, 2 H, CHjSOjH); 3,4 (t, 2 H, OCH₂); 3,9 (dt, 2 H, CH₂O); 5,1 (m, 2H, CH?=CH); 5,6 (m, 1 H, CH₂=CH).Prop-2-en-1-ol (18.8 mmol) was charged to a three-necked flask thoroughly purged with inert gas and dissolved in dry tetrahydrofuran (30 mL). To the solution (cooled to 0 ° C) was added portionwise a sodium hydride suspension (60% in mineral oil) and the reaction mixture was stirred for 1 hour at room temperature. Then the reaction mixture was cooled to 0 ° C and butane-1,4sultone (25.4 mmol) was added dropwise. The cooling bath was removed and the reaction mixture heated to 60 ° C under an inert gas atmosphere for 12 h. The precipitated crystalline material was filtered off, washed with acetone and dried. 0.26 g (56%) of SCX 1 cation exchange resin was obtained. 1 H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ: 1.6 (m, 4 H, (CH ₂ ) ₂ ); 2.8 (t, 2H, CH 2 SO 3 H); 3.4 (t, 2H, _OCH2); 3.9 (dt, 2H, CH ₂ O); 5.1 (m, 2H, CH2 = CH); 5.6 (m, 1H, CH ₂ = CH).

4-(Pent-4-en-l-yloxy)butan-l-sulfonová kyselina (SCX2) - nenípředmětem vynálezu4- (Pent-4-en-1-yloxy) butane-1-sulfonic acid (SCX2) - not subject of the invention

- 7 —- 7 -

Shodným postupem jako pro SCX 1 byla z pent-4-en-1-olu (24,4 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (30 ml) přídavkem suspense hydridu sodného generován příslušný alkoholát. Ke směsi ochlazené na 0 °C byl přidán butan-1,4-sulton a reakční směs byla následně zahřívána 12 h na 60 °C. Vyloučená krystalická látky byla odfiltrována, promyta acetonem a vysušena. Bylo získáno 0,96 g (18 %) katexu SCX 2. 'H NMR (400 MHz, D₂O) δ: 1,6 (m, 6 H, (CH_z)7CH₇SO₃H: CH7CH7O); 2,0 (q, 2 H, CH,CHCH₂); 2,75 (t, 2 H, CH2SO3H); 3,35 (m, 4 H, CH7OCH7); 4,9 (m, 2 H, CH₂=CH): 5,7 (m, 1 H, CH₂=CH).Following the same procedure as for SCX 1, the corresponding alcoholate was generated from pent-4-en-1-ol (24.4 mmol) in dry tetrahydrofuran (30 mL) by addition of sodium hydride suspension. Butane-1,4-sultone was added to the cooled to 0 ° C and the reaction mixture was then heated to 60 ° C for 12 h. The precipitated crystalline material was filtered off, washed with acetone and dried. Yield 0.96 g (18%) of the second cation exchange SCX H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ: 1.6 (m, 6 H, (CH _z) 7CH ₇ SO ₃ H, CH7CH7O); 2.0 (q, 2H, CH, CH _2); 2.75 (t, 2H, CH 2 SO 3 H); 3.35 (m, 4H, CH 7 OCH 7); 4.9 (m, 2H, _CH2 = CH), 5.7 (m, 1H, CH ₂ = CH).

4-(Undec-10-en-l-yloxy)butan-l-sulfonová kyselina (SCX 3) — není předmětem vynálezu4- (Undec-10-en-1-yloxy) butane-1-sulfonic acid (SCX 3) - not subject of the invention

Obdobně jako pro SCX 1 byl v inertním plynem promyté baňce rozpuštěn alkohol (14,6 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (30 ml) a reakcí s hydridem sodným převeden na odpovídající alkoholát. Ten, stejným způsobem jako v případě kyseliny 1, reagoval s butan- 1,4-sultonem a byl zpracován. Bylo získáno 0,46 g (16 %) kyseliny SCX 3. ’h NMR (400 MHz, D₂O) δ: 1,1 (m, 12 H, 6 x -CH₂-); 1,4 (m, 2 H, CH₂); 1,6 (m, 4 H, OCH₇(CH7)₂CH₇SO₇H) 1,8 (q, 2 H, CH?=CHCH₂); 2,75 (t, 2 H, CHjSOjH); 3,25 (m, 4 H, CH7OCH7); 4,75 (m, 2 H, CH_?=CHk 5,6 (m, 1 H, CH₂=CH).Similar to SCX 1, the alcohol (14.6 mmol) in dry tetrahydrofuran (30 mL) was dissolved in an inert gas purged flask and converted to the corresponding alcoholate by treatment with sodium hydride. This was reacted with butane-1,4-sultone in the same manner as for acid 1 and worked up. 0.46 g (16%) of SCX 3 was obtained. 1 H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ: 1.1 (m, 12 H, 6 x -CH ₂ -); 1.4 (m, 2H, _CH2); 1.6 (m, 4H, OCH ₇ (CH ₇ ) ₂ CH ₇ SO ₇ H) 1.8 (q, 2H, CH ₂ = CHCH ₂ ); 2.75 (t, 2H, CH 2 SO 3 H); 3.25 (m, 4H, CH 7 OCH 7); 4.75 (m, 2H, _CH = CHK 5.6 (m, 1H, CH ₂ = CH).

Stejným způsobem jsou připraveny i selektory odvozené od příslušných thiolů a aminů. Výše uvedené reakční podmínky lze aplikovat na alkoholy, thioly a aminy obsahující ve strutuře jak dvojnou tak trojnou vazbu. Reakce rovněž bez problémů probíhá se sultony s větším a menším počtem atomů v cyklu, viz. níže.Selectors derived from the respective thiols and amines are prepared in the same manner. The above reaction conditions can be applied to alcohols, thiols and amines containing both double and triple bonds in the structure. The reaction also proceeds without problems with sultones with more and less number of atoms in the cycle. below.

4-Allylaminobutan-l-sulfonová kyselina (ZWIX1) — nenípředmětem vynálezu4-Allylaminobutane-1-sulfonic acid (ZWIX1) - not subject of the invention

K roztoku allylaminu (24,4 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (20 ml) v tříhrdlé reakční nádobě promyté inertním plynem byl přidán butan-1,4-sulton (25,4 mmol) a reakční směs byla míchána a zahřívána na 60 °C v atmosféře inertního plynu po dobu 12 h. Vyloučená krystalická látka byla odfiltrována, promyta tetrahydrofuranem a vysušena. Bylo získáno 0,60 g (13 %) selektoru ZWrX 1. 'H NMR (400 MHz, D₂O) δ: 1,7 (t, 4 H, (CH₂)₂); 2,8 (t, 2 H, CH₂SO₃H); 2,9 (t, 2 H, NHCH₂); 3,5 (d, 2 H, CH^CHCHaNH); 5,35 (m, 2H, CH₂=CH); 5,8 (m, 1 H, CH₂=CH).To a solution of allylamine (24.4 mmol) in dry tetrahydrofuran (20 mL) in a three-necked reaction gas purged flask was added butane-1,4-sultone (25.4 mmol) and the reaction mixture was stirred and heated to 60 ° C in inert gas for 12 h. The precipitated crystalline material was filtered off, washed with tetrahydrofuran and dried. 0.60 g (13%) of a ZWrX 1 selector was obtained. 1 H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ: 1.7 (t, 4 H, (CH ₂ ) ₂ ); 2.8 (t, 2 H, CH ₂ SO ₃ H); 2.9 (t, 2H, NHCH _2); 3.5 (d, 2H, CH 2 CHCH 3 NH); 5.35 (m, 2H, CH ₂ = CH); 5.8 (m, 1H, CH ₂ = CH).

4-(Prop-2-yn-l-ylamino)butan-l-sulfonová kyselina (ZWIX2)4- (Prop-2-yn-1-ylamino) butane-1-sulfonic acid (ZWIX2)

K roztoku propargylaminu (25,4 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (20 ml) v tříhrdlé reakční nádobě promyté inertním plynem byl přidán butan-1,4-sulton (25,4 mmol) a reakční směs byla míchána a zahřívána na 60 °C v atmosféře inertního plynu po dobu 12 h. Vyloučená krystalická látka byla odfiltrována, promyta tetrahydrofuranem a vysušena. Bylo získáno 0,94 g (19 %) selektoru ZWIX 2. ’H NMR (400 MHz, D₂O) δ: 1,7 (m, 4 H, (CH₂)₂); 2,1 (s, 3 Η, NH, CH=C,To a solution of propargylamine (25.4 mmol) in dry tetrahydrofuran (20 mL) in a three-necked reaction gas purged flask was added butane-1,4-sultone (25.4 mmol) and the reaction mixture was stirred and heated to 60 ° C in inert gas for 12 h. The precipitated crystalline material was filtered off, washed with tetrahydrofuran and dried. 0.94 g (19%) of the ZWIX 2 selector was obtained. 1 H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ: 1.7 (m, 4 H, (CH ₂ ) ₂ ); 2.1 (s, 3 ohms, NH, CH = C,

SO₃H); 2,8 (t, 2 H, CH₂SO₃H); 3,0 (t, 2 H, CH?NH); 3,75 (s, 2H, CH=CCH₂NH).SO ₃ H); 2.8 (t, 2 H, CH ₂ SO ₃ H); 3.0 (t, 2H, CH 2 NH); 3.75 (s, 2H, CH-CCH ₂ NH).

3-Allylaminopropan-l-sulfonová kyselina (ZWIX 3) - není předmětem vynálezu3-Allylaminopropane-1-sulfonic acid (ZWIX 3) - is not an object of the invention

K roztoku allylaminu (17,1 mmol) v suchém acetonitrilu (10 mí) byl v atmosféře inertního plynu přidán propan-1,3-sulton (11,4 mmol) a rekační směs byla zahřívána k varu 12 h. Vyloučená krystalická látka byla odfiltrována, promyta acetonitrilem a vysušena za vakua. Bylo získáno 1,6 g (82 %) zwitteriontového selektoru 3. 'Η NMR (400 MHz, D₂O) δ: 1,9 (m, 2 H,To a solution of allylamine (17.1 mmol) in dry acetonitrile (10 mL) was added propane-1,3-sultone (11.4 mmol) under an inert gas atmosphere and the reaction mixture was heated to boiling for 12 h. The precipitated crystalline material was filtered off , washed with acetonitrile and dried under vacuum. 1.6 g (82%) of the zwitterionic selector 3 were obtained. 1 H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ: 1.9 (m, 2H,

NHCH?CH?CH₂SO₃H); 2,8 (t, 2 H, CH₂SO₃H); 3,0 (t, 2 H, NHCH₂); 3,5 (d, 2 H,NHCH ₂ CH ₂ CH ₂ SO ₃ H); 2.8 (t, 2 H, CH ₂ SO ₃ H); 3.0 (t, 2H, NHCH _2); 3.5 (d, 2H,

CH₂CHCH->NH); 5,3 (m, 2H, CH₇=CHk 5,7 (m, 1 H, CH₂=CH).CH ₂ CHCH → NH); 5.3 (m, 2H, CH = CHK ₇ 5.7 (m, 1H, CH ₂ = CH).

3-Allylthiopropan-l-sulfonová kyselina - není předmětem vynálezu3-Allylthiopropane-1-sulfonic acid - is not the subject of the invention

K 60% suspensi hydridu sodného v minerálním oleji (37,5 mmol) v suchém THF (30 ml) byl v inertní atmosféře argonu při 0 °C (chlazeno zevně ledem) přikapán allylthiol (32,8 mmol). Získaná suspense byla dále míchána 30 min při 0 °C a následně 30 min při laboratorní teplotě. Poté byl přidán propan-1,3-sulton a reakční směs byla míchána a zahřívána v inertní atmosféře 12 h. Rozpouštědlo bylo sfiltrováno, filtrační koláč byl promyt THF (2x^5 ml) a získaný pevný produkt byl po vysušení na vzduchu suspenován ve vodě. Suspense byla okyselena vodnou kyselinou chlorovodíkovou na pH~3 a míchána za laboratorní teploty 30 min. Poté byla sfiltrována, filtrační koláč byl promyt THF (10 ml) a pevný produkt byl vysušen za vakua. Bylo získáno 1,8 g (56 %) bílé krystalické látky. *H NMR (400 MHz, D₂O) δ: 1,9 (m, 3 H,To a 60% suspension of sodium hydride in mineral oil (37.5 mmol) in dry THF (30 mL) was added dropwise allylthiol (32.8 mmol) under an inert argon atmosphere at 0 ° C (ice-cold). The resulting suspension was further stirred for 30 min at 0 ° C followed by 30 min at room temperature. Propane-1,3-sultone was then added and the reaction mixture was stirred and heated under an inert atmosphere for 12 h. The solvent was filtered, the filter cake was washed with THF (2 x 5 mL) and the resulting solid was suspended in water after air drying . The suspension was acidified with aqueous hydrochloric acid to pH ~ 3 and stirred at room temperature for 30 min. It was then filtered, the filter cake was washed with THF (10 mL) and the solid product was dried under vacuum. 1.8 g (56%) of a white crystalline solid were obtained. 1 H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ: 1.9 (m, 3 H,

HO₃SCH₂CH₂CH?S); 2,6 (t, 2 H, HO₃SCH₂CH2CH₂S); 2,9 (t, 2 H, HCbSCH_?CH,CH,S); 3,2 (d,HO ₃ SCH ₂ CH ₂ CH ₂ S); 2.6 (t, 2H, HO ₃ SCH ₂ CH ₂ CH ₂ S); 2.9 (t, 2H, _HCbSCH? CH, CH, S); 3.2 (d,

H, SCH₂); 5,1 (m, 2H, CH2=CHCH₂S); 5,8 (m, 1 H, CH₂=CHCH₂S).H, _SCH2); 5.1 (m, 2H, CH 2 = CHCH ₂ S); 5.8 (m, 1H, CH ₂ = CHCH ₂ S).

4-[N-Methyl(prop-2-yn-l-yl)amino]butan-l-sulfonová kyselina4- [N-Methyl (prop-2-yn-1-yl) amino] butane-1-sulfonic acid

K roztoku propargylaminu (14,2 mmol) v suchém acetonitrilu (10 ml) v tříhrdlé reakční nádobě promyté inertním plynem byl přidán butan-1,4-sulton (12,7 mmol) a reakční směs byla míchána a zahřívána na 55 °C v atmosféře inertního plynu po dobu 14 h. Vyloučená krystalická látka byla odfiltrována, promyta tetrahydrofuranem a vysušena. Bylo získáno 1,1 g (42 %) selektoru obsahujícího ve struktuře terciární aminoskupinu. *H NMR (400 MHz, D₂O) δ: 1,5 (m, 4 H, (CH₂)₂)To a solution of propargylamine (14.2 mmol) in dry acetonitrile (10 mL) in a three-necked reaction gas purged flask was added butane-1,4-sultone (12.7 mmol) and the reaction mixture was stirred and heated to 55 ° C in inert gas for 14 h. The precipitated crystalline material was filtered off, washed with tetrahydrofuran and dried. 1.1 g (42%) of a tertiary amino group selector were obtained. 1 H NMR (400 MHz, D ₂ O) δ: 1.5 (m, 4 H, (CH ₂ ) ₂ )

- 9 Shodným způsobem jako u příkladů uvedených výše jsou syntetizovány další homology s délkou alkenylových, resp. alkynylových řetězců n = 3 až 11. Zároveň jsou stejným způsobem připraveny i homology s počtem m = 2 až 5, optimálně m = 3 nebo 4. Je zřejmé, že použití přebytku aminu významným způsobem zvyšuje výtěžek reakce (viz. ZWIX 2 a ZWIX 3).In the same manner as in the examples above, other homologues of alkenyl length, respectively, are synthesized. At the same time, homologues of m = 2 to 5, preferably m = 3 or 4, are prepared in the same way. It is clear that the use of excess amine significantly increases the yield of the reaction (see ZWIX 2 and ZWIX 3). ).

Přebytek některé z výchozích složek není na závadu, neboť lze z produktu snadno odstranit při filtraci opakovaným promytím krystalického produktu. Selektory jsou touto jednoduchou čisticí operací získány ve vysoké čistotě, která umožňuje jejich imobilizaci na nosič bez nutnosti dalších čisticích operací.Excess of some of the starting components is not a problem as it can be easily removed from the product by filtration by repeated washing of the crystalline product. The selectors are obtained by this simple cleaning operation in high purity, which allows them to be immobilized onto the carrier without the need for further cleaning operations.

Příklad 2: Imobilizace selektorů na nosičExample 2: Immobilization of selectors on a support

Selektory s dvojnou vazbou jsou na nosič stacionární fáze (přednostně silikagel) imobilizovány radikálovou adicí sulfanylové skupiny na řečenou dvojnou vazbu selektorů. Tato radikálová reakce je iniciována radikálovým iniciátorem (azobis(isobutyronitril), dibenzoylperoxid, atd). Reakce je provedena v běžném organickém rozpouštědle (např. methanol). Selektor je imobilizován v množství od 100 pmol/g do 600 pmol/g nosiče. Radikálová adice sulfanylové skupiny na dvojnou vazbu je odborníkovi v oboru známá včetně vhodných iniciátorů a rozpouštědel.The double-bonded selectors are immobilized to a stationary phase support (preferably silica gel) by radical addition of a sulfanyl group to said selector double bond. This radical reaction is initiated by a radical initiator (azobis (isobutyronitrile), dibenzoyl peroxide, etc.). The reaction is carried out in a conventional organic solvent (e.g. methanol). The selector is immobilized in an amount of from 100 pmol / g to 600 pmol / g of carrier. The free-radical addition of the sulfanyl group to the double bond is known to the person skilled in the art, including suitable initiators and solvents.

Selektory s trojnou vazbou mohou být na stacionární fázi (přednostně silikagel) imobilizovány Huisgenovou dipolámí cykloadiční reakcí mezi terminální trojnou vazbou a azidovou skupinou, známou též jako click-reakce, metodikou popsanou v literatuře (např. H. Hettegger, M. Kohout, V. Mimini, W. Lindner, Journal of Chromatography A 1337 (2014) 85). Mohou však být též imobilizovány radikálovou reakcí sulfanylových skupin na povrchu nosiče s řečenou trojnou vazbou selektorů. Selektor je imobilizován v množství od 100 pmol/g do 600 pmol/g nosiče.The triple bonded selectors can be immobilized on a stationary phase (preferably silica gel) by a Huisgen dipolar cycloaddition reaction between the terminal triple bond and an azide group, also known as a click reaction, by a method described in the literature (eg H. Hettegger, M. Kohout, V. Mimini, W. Lindner, Journal of Chromatography A 1337 (2014) 85). However, they can also be immobilized by the radical reaction of sulfanyl groups on the support surface with said selector triple bond. The selector is immobilized in an amount of from 100 pmol / g to 600 pmol / g of carrier.

Příklad 3: Chromatografické podmínky v jednotlivých chromatografických módechExample 3: Chromatographic conditions in individual chromatographic modes

Měření v polárním organickém módu jsou provedena v methanolu obsahujícím kyselinu mravenčí a diethylamin v poměru 2:1 jako pufrační směs. V módu reverzní fáze (RP) byla použitou mobilní fází směs acetonitrilu a vody v poměru 1:9 obsahující pufr skládající se z kyseliny mravenčí a diethylaminu v poměru 1:1. Měření v HILIC módu bylo provedeno s mobilní fází obsahující acetonitril a vodu v poměru 9:1 se shodným pufrem jako v RP módu. SFC experimenty byly provedeny s mobilní fází (superkritický CO₂) obsahující 25 % methanolu, do kterého byl přidán mravenčan amonný a kyselina mravenčí v poměru 2:1 jako pufr.Polar organic mode measurements are made in methanol containing 2: 1 formic acid and diethylamine as a buffer mixture. In reverse phase (RP) mode, the mobile phase used was a 1: 9 mixture of acetonitrile and water containing a 1: 1 formic acid-diethylamine buffer. Measurements in HILIC mode were performed with a mobile phase containing acetonitrile and water in a ratio of 9: 1 with the same buffer as in RP mode. SFC experiments were performed with a mobile phase (supercritical CO ₂ ) containing 25% methanol to which ammonium formate and formic acid were added in a 2: 1 ratio as a buffer.

Příklad 4: ChromatograficképoužitíExample 4: Chromatographic Application

Multimodální stacionární fáze podle předkládaného vynálezu lze použít pro separaci a purifíkaci širokého spektra analytů. Jako příklad použití jsou uvedeny separace vybraných léčiv, metabolitů a zwitteriontů. Separace byly provedeny ve všech výše zmíněných chromatografických módech (Příklad 3), tj. polárním organickém módu, RP, HILIC a SFC, aby byl zdokumentovánThe multimodal stationary phase of the present invention can be used to separate and purify a wide range of analytes. Separations of selected drugs, metabolites and zwitterions are mentioned as an example of use. Separations were performed in all the above chromatographic modes (Example 3), ie polar organic mode, RP, HILIC and SFC, to be documented

- 11 multimodální charakter nových stacionárních fází podle předkládaného vynálezu. Pro každý chromatografický mód byla provedena analýza hlavních komponent (principál komponent analysis - PCA) a chromatografické parametry byly porovnány s komerčními kolonami.The multimodal character of the novel stationary phases according to the present invention. For each chromatographic mode, principal component analysis (PCA) was performed and the chromatographic parameters were compared with commercial columns.

Separace analytů je diskutována na základě jejich hlavních rysů: primární aminy, amidy, farmaceutika, zwitterionty. Struktury analytů použitých pro vyhodnocení chromatografických parametrů nových multimodálních kolon jsou uvedeny v následujícím přehledu.Separation of analytes is discussed based on their main features: primary amines, amides, pharmaceuticals, zwitterions. The structures of the analytes used to evaluate the chromatographic parameters of the new multimodal columns are shown in the following overview.

Primární aminyPrimary amines

Anilin TryptaminAnilin Tryptamine

SerotoninSerotonin

NoradrenalinNoradrenaline

OktopaminOctopamine

Zwitteriontové analytyZwitteriontové analyty

KynureninKynurenin

Tryptofan (Trp)Tryptophan (Trp)

1-Methyttryptofan (1-Me-Trp)1-Methyttryptophan (1-Me-Trp)

5-Methyltryptofan (5-Me-Trp)5-Methyltryptophan (5-Me-Trp)

6-Methyl tryptofan (6-Me-Trp)6-Methyl tryptophan (6-Me-Trp)

7-Methyltryptofan (7-Me-Trp)7-Methyltryptophan (7-Me-Trp)

AmidyAmides

FarmaceutikaPharmaceuticals

Příklad 5: Chromatografie v polárním organickém móduExample 5: Chromatography in polar organic mode

V polárním organickém módu je hlavním příspěvkem k retenci a následně separaci analytů iontovýměnný proces, neboť hydrofobní interakce a tvorba vodíkových vazeb je potlačena vysokým obsahem methanolu v mobilní fázi. Tomuto předpokladu odpovídají retenční faktory separovaných látek, kdy nejdelší retenční časy jsou pozorovány pro primární aminy, dále farmaceutika (sekundární aminy), zwitterionty a amidy. Retenční faktory látek bazických jsou vyšší v případě použití SCX 1 až SCX 3, zatímco zwitteriontové analyty jsou více retenovány na kolonách ZWIX 1 až ZWIX 3. Amidy jsou eluovány na obou typech kolon v blízkosti to.In the polar organic mode, the main contribution to the retention and subsequent separation of analytes is the ion exchange process, as the hydrophobic interaction and hydrogen bond formation is suppressed by the high methanol content in the mobile phase. The retention factors of the separated substances correspond to this assumption, with the longest retention times being observed for primary amines, as well as pharmaceuticals (secondary amines), zwitterions and amides. The retention factors of basic substances are higher when SCX 1 to SCX 3 is used, while zwitterionic analytes are more retented on ZWIX 1 to ZWIX 3 columns. Amides are eluted on both types of columns near to it.

Separační vlastnosti nových kolon byly porovnány s komerčními kolonami pro RP a HILIC chromatografii, jmenovitě reverzní fází Phenomenex Eclipse C8 (alkylové řetězce délky C8 vázané na povrchu silikagelu) a Phenomenex Luna HILIC (zesíťované dioly na povrchu silikagelu). V případě reverzní fáze Eclipse C8 byly všechny analyty eluovány s mrtvým objemem kolony, na koloně Luna HILIC v blízkosti to.The separation properties of the new columns were compared with commercial columns for RP and HILIC chromatography, namely reverse phase Phenomenex Eclipse C8 (C8-length alkyl chains bound to silica gel surface) and Phenomenex Luna HILIC (cross-linked diols on silica gel surface). In the case of the reverse phase Eclipse C8, all analytes were eluted with a dead column volume, on a Luna HILIC column near it.

PCA analýza hodnot log k analyzovaných látek ukazuje, že analyty jsou seskupeny do klastrů podle podobnosti svých funkčních skupin (Obr. 1). První komponenta odráží eluční pořadí analytů na stacionárních fázích - vlevo nejdříve a vpravo nejpozději eluované analyty. Druhá komponenta je nejvíce ovlivněna hydrofobicitou stacionární fáze.PCA analysis of log values for the analyzed substances shows that the analytes are grouped into clusters according to the similarity of their functional groups (Fig. 1). The first component reflects the elution order of the analytes on the stationary phases - the first eluted first and right eluted analytes. The second component is most influenced by the hydrophobicity of the stationary phase.

Příklad 6: Chromatografle v módu reverznífázeExample 6: Chromatography in reverse phase mode

12Za podmínek isokratické eluce byly v reversním módu nejvyšší retenční faktory pozorovány u farmaceutik dále primárních aminů, amidů a zwitteriontů. Retenční faktory primárních aminů a farmaceutik byly zjevně navýšeny příspěvkem elektrostatických interakcí, neboť retenční faktory byly vyšší při použití SCX kolon. Na komerční reverzní fázi Phenomenex Eclipse C8 byly dosaženy vyšší retenční faktory pro amidy a zwitterionty. Na koloně Phenomenex Luna HILIC byly za daných podmínek analyty eluovány s to.Under the conditions of isocratic elution, in the reverse mode, the highest retention factors were observed in pharmaceuticals furthermore primary amines, amides and zwitterions. The retention factors of primary amines and pharmaceuticals were apparently increased by the contribution of electrostatic interactions, since retention factors were higher when using SCX columns. Higher retention factors for amides and zwitterions were achieved on the commercial reverse phase of Phenomenex Eclipse C8. On a Phenomenex Luna HILIC column, the analytes were eluted under given conditions.

Při porovnání retenčních faktorů primárních aminů a farmaceutik na kolonách SCX byl zjištěn následující trend retenčních faktorů: k (SCX 2) > k (SCX 1) > k (SCX 3), což značí, že vyjma iontovýměnných interakcí přispívají kretenci analytů i interakce hydrofobní. Je však zřejmé, že v případě smíšených SCX fází není optimum dosaženo s nejdelším alifatickým řetězcem a oba typy interakcí působí simultánně a vzájemně se ovlivňují. Kolony ZWIX pak více zadržují zwitteriontové analyty, a to díky simultánnímu působení obou ionizovaných center. Retenční časy aminů jsou naopak sníženy působením inherentního protiiontu ZWIX selektoru.When comparing primary amine retention factors and pharmaceuticals on SCX columns, the following trend of retention factors was observed: k (SCX 2)> k (SCX 1)> k (SCX 3), indicating that, apart from ion-exchange interactions, analyte shedding and hydrophobic interactions contribute. However, it is apparent that in the case of mixed SCX phases, the optimum is not achieved with the longest aliphatic chain and both types of interactions act simultaneously and interact. ZWIX columns then retain more zwitterionic analytes due to the simultaneous action of both ionized centers. Conversely, the retention times of amines are reduced by the action of an inherent counterion of the ZWIX selector.

PCA analýza při použití testovaných stacionárních fází neukazuje na žádný trend klastrování analytů podle druhu funkčních skupin (Obr. 2). První hlavní komponentou je opět eluční pořadí analytů s nejrychleji eluovanými analyty vlevo a nejpozději eluovanými vpravo. Hydrofobní příspěvky se lektorů jsou viditelné při porovnání elučního pořadí noradrenalinu a oktopaminu čiPCA analysis using the stationary phases tested showed no trend of clustering of analytes by functional group type (Fig. 2). The first major component is again the elution order of the analytes with the fastest eluting analytes on the left and at the latest eluting the right. Hydrophobic contributions from lecturers are visible when comparing the elution order of noradrenaline and octopamine or

-13 serotoninu a tryptaminu, kdy prvně jmenovaný je vždy eluován před druhým v pořadí. Druhou hlavní komponentu představuje log D analytů (při pH 4 použité mobilní fáze).-13 serotonin and tryptamine, the former being always eluted before the second in sequence. The second major component is the log D of the analytes (at pH 4 of the mobile phase used).

Příklad 7: Chromatografie v HILIC móduExample 7: Chromatography in HILIC mode

Použité multimodální stacionární fáze, především ty s kratšími alkylovými spojovacími řetězci, mohou být považovány za iontové HILIC fáze. Retenční faktory všech stacionárních fází v HILIC módu byly nižší než v módu reverzní fáze. Nejvyšší retenční faktory pak byly dosaženy pro primární aminy a zwitterionty. Pro zwitterionty byly na použitých stacionárních fázích (včetně komerční kolony Phenomenex Luna HILIC) pozorovány retenční faktory v pořadí: k (ZWIX 1) > k (ZWIX 3) > k (ZWIX 2) > k (Luna HILIC) > k (SCX 2) > k (SCX 1) > k (SCX 3) a pro primární aminy v pořadí k (ZWIX 1) > k (ZWIX 3) > k (SCX 2) > k (ZWIX 2) > k (SCX 1) > k (Luna HILIC) > k (SCX 3). Retenční faktory farmaceutik byly podobné jako v polárním organickém módu.The multimodal stationary phases used, especially those with shorter alkyl linkers, can be considered ionic HILIC phases. The retention factors of all stationary phases in the HILIC mode were lower than in the reverse phase mode. The highest retention factors were then achieved for primary amines and zwitterions. For zwitterions, retention factors were observed on the stationary phases used (including the commercial Phenomenex Luna HILIC column): k (ZWIX 1)> k (ZWIX 3)> k (ZWIX 2)> k (Luna HILIC)> k (SCX 2) > k (SCX 1)> k (SCX 3) and for primary amines in the order k (ZWIX 1)> k (ZWIX 3)> k (SCX 2)> k (ZWIX 2)> k (SCX 1)> k ( Luna HILIC)> k (SCX 3). Pharmaceutical retention factors were similar to those in the polar organic mode.

Pro posouzení vlivu partičního mechanismu separace typického pro HILIC stacionární fáze byly hodnoty log k vyneseny proti hodnotám log D jednotlivých analytů. Koeficient R² získaný lineární regresí pro jednotlivé stacionární fáze ukazuje, že v případě ZWIX materiálů je partiční mechanismus poměrně zásadním přispěvatelem k separaci analytů (Tabulka 1). Avšak i v případě SCX materiálů se partiční mechanismus významně podílí na separaci analytů a i SCX sorbenty tak lze považovat za vhodné materiály pro separace v HILIC módu.To assess the effect of the partition separation mechanism typical of the HILIC stationary phase, the log k values were plotted against the log D values of the individual analytes. The coefficient R ² obtained by linear regression for the individual stationary phases shows that, in the case of ZWIX materials, the partition mechanism is a relatively important contributor to the separation of analytes (Table 1). However, even in the case of SCX materials, the partition mechanism plays an important role in the separation of analytes and even SCX sorbents can be considered suitable materials for separation in the HILIC mode.

Tabulka 1 Korelační koeficient R² získaný vynesením závislosti log kna log D analytů separovaných na testovaných multimodálních stacionárních fázích.Table 1 Correlation coefficient R ² obtained by plotting the log k and log D of the analytes separated on the multimodal stationary phases tested.

Stacionární fáze Stationary phase Ř² Ř ² Luna HILIC Luna HILIC 0,74 0.74 SCX1 SCX1 0,55 0.55 SCX2 SCX2 0,42 0.42 SCX3 SCX3 0,49 0.49 ZWIX1 ZWIX1 0,67 0.67 ZWIX2 ZWIX2 0,68 0.68 ZWIX3 ZWIX3 0,66 0.66

PCA analýza s využitím hodnot log k jednotlivých analytů a lipofílicity testovaných fází (druhá komponenta) ukazuje, že analyty se seskupují podle svých strukturních charakteristik a lze jednoznačně definovat skupinu primárních aminů, farmaceutik, amidů a zwitteriontů (Obr. 3).PCA analysis using log k values of individual analytes and lipophilicity of the tested phases (second component) shows that the analytes are grouped according to their structural characteristics and a group of primary amines, pharmaceuticals, amides and zwitterions can be unambiguously defined (Fig. 3).

! I! AND

--14Příklad 8: Superkritická fluidní chromatografieExample 14: Supercritical fluid chromatography

V příkladech provedení bylo dosud ukázáno, že diskutované stacionární fáze jsou vhodné pro separaci různých analytů v různých HPLC chromatografických módech. Další možnou oblastí aplikace je superkritická fluidní chromatografie. Superkritický oxid uhličitý postrádá solvatační sílu potřebnou pro eluci polárních analytů, a proto se zpravidla přidává polární organické rozpouštědlo jako modifikátor mobilní fáze. Výsledná mobilní fáze je pak posunuta mimo superkritickou oblast do tzv. subkritické oblasti. Stále si však zachovává původní parametry, a to vysokou difuzivitu a nízkou viskozitu typickou pro superkritickou oblast, proto je termín SFC obecně přijímán pro všechny oblasti používané v této technice. Pro porovnání s ostatními výše uvedenými chromatografíckými technikami byly SFC experimenty provedeny v isokratickém módu.In the examples, it has been shown that the stationary phases discussed are suitable for the separation of different analytes in different HPLC chromatographic modes. Another possible field of application is supercritical fluid chromatography. Supercritical carbon dioxide lacks the solvating power required to elute the polar analytes, and therefore, a polar organic solvent is generally added as a mobile phase modifier. The resulting mobile phase is then shifted outside the supercritical region into the so-called subcritical region. However, it still retains the original parameters, namely the high diffusivity and low viscosity typical of the supercritical region, hence the term SFC is generally accepted for all regions used in this technique. For comparison with the other chromatographic techniques mentioned above, SFC experiments were performed in isocratic mode.

Na stacionárních fázích podle předkládaného vynálezu byly nejvyšší retenční faktory získány pro primární aminy, zwitterionty, farmaceutika a nejnižší pro amidy. Retenční faktory na jednotlivých stacionárních fázích klesaly v následujícím pořadí: pro zwitterionty k (ZWIX 3) > k (ZWIX 1) > k (SCX 2) > k (ZWIX 2) > k (SCX 1) > k (SCX 3) > k (Luna HILIC); pro primární aminy k (SCX 2) > k (SCX 1) > k (ZWIX 1) > k (ZWIX 3) > k (ZWIX 2) > k (SCX 3) > k (Luna HILIC) a farmaceutika k (SCX 2) > k (SCX 1) > k (SCX 3) > k (ZWIX 1) > k (ZWIX 3) > k (ZWIX 2) > k (Luna HILIC). Z uvedených výsledků lze usuzovat, že hlavním příspěvkem k retenci analytů v SFC módu jsou iontové interakce. PCA analýza hodnot log k ukazuje, že analyty se seskupují dle svých strukturních rysů (Obr. 4). První komponenta přísluší v tomto případě náboji analytů, druhá komponenta vystihuje lipofilicitu stacionární fáze (polární v horní části, nepolární ve spodní části). Neionizující amidy jsou seskupeny vlevo, ionizující a zwitteriontové analyty jsou pak vpravo mezi více retenovanými analyty.On the stationary phases of the present invention, the highest retention factors were obtained for primary amines, zwitterions, pharmaceuticals and lowest for amides. Retention factors on individual stationary phases decreased in the following order: for zwitterions k (ZWIX 3)> k (ZWIX 1)> k (SCX 2)> k (ZWIX 2)> k (SCX 1)> k (SCX 3)> k (Luna HILIC); for primary amines k (SCX 2)> k (SCX 1)> k (ZWIX 1)> k (ZWIX 3)> k (ZWIX 2)> k (SCX 3)> k (Luna HILIC) and pharmaceutical k (SCX 2) )> to (SCX 1)> to (SCX 3)> to (ZWIX 1)> to (ZWIX 3)> to (ZWIX 2)> to (Luna HILIC). From these results it can be concluded that ionic interactions are the main contribution to the analytical retention in SFC mode. PCA analysis of log k values shows that the analytes are grouped according to their structural features (Fig. 4). The first component is in this case the charge of the analytes, the second component describes the lipophilicity of the stationary phase (polar in the upper part, non-polar in the lower part). Non-ionizing amides are grouped on the left, ionizing and zwitterionic analytes are then on the right among the more retented analytes.

Příklad 9: Srovnání chromatografické účinnosti kolon v různých módechExample 9: Comparison of chromatographic efficiency of columns in different modes

Jako vhodný parametr pro srovnání účinnosti nových multimodálních kolon byla zvolena selektivita, kdy serotonin slouží jako referenční analyt. Selektivita testovaných kolon vůči analytům byla vztažena k serotoninu, a proto jsou hodnoty této redukované selektivity (Tabulka 2 až 5) pro některé analyty menší než 1.Selectivity was chosen as a suitable parameter for comparing the efficacy of the new multimodal columns, where serotonin serves as a reference analyte. The selectivity of the test columns to the analytes was related to serotonin and therefore the values of this reduced selectivity (Tables 2 to 5) for some analytes are less than 1.

- 15 Tabulka 2: Retenční faktory a redukované selektivity analytů na různých kolonách v polárním organickém módu.Table 2: Retention factors and reduced selectivity of analytes on different columns in polar organic mode.

Analyt Analyt SCX1 SCX1 SCX2 SCX2 SCX3 SCX3 k to a and k to a and k to a and Niacin Niacin Tryptamin Tryptamine 18,38 18.38 1,19 1.19 30,51 30.51 1,33 1.33 5,10 5.10 0,99 0.99 Serotonin Serotonin 21,87 21.87 1,00 1.00 40,69 40.69 1,00 1.00 5,05 5,05 1,00 1.00 Oktopamin Octopamine 12,32 12.32 1,78 1.78 20,37 20.37 2,00 2.00 3,44 3.44 1,47 1.47 Noradrenalin Noradrenaline 15,54 15.54 1,41 1.41 26,38 26.38 1,54 1.54 3,65 3.65 1,38 1.38 Kynurenin Kynurenin 0,90 0.90 24,26 24.26 1,12 1.12 36,26 36.26 0,32 0.32 15,55 15.55 Tryptofan Tryptophan 1,17 1.17 18,71 18.71 1,49 1.49 27,39 27.39 0,45 0.45 11,29 11.29 1-Me-Trp 1-Me-Trp 0,88 0.88 24,84 24.84 1,04 1.04 39,10 39.10 0,40 0.40 12,75 12.75 5-Me-Trp 5-Me-Trp 1,06 1.06 20,60 20.60 1,31 1.31 31,07 31.07 0,42 0.42 12,02 12.02 6-Me-Trp 6-Me-Trp 1,10 1.10 19,82 19.82 1,34 1.34 30,35 30.35 0,43 0.43 11,83 11.83 7-Me-Trp 7-Me-Trp 1,06 1.06 20,61 20.61 1,31 1.31 31,16 31.16 0,43 0.43 11,83 11.83 Nikotinamid Nicotinamide 0,09 0.09 242,25 242.25 0,12 0.12 345,52 345.52 0,03 0.03 164,63 164.63 Kofein Caffeine 0,07 0.07 305,75 305.75 0,08 0.08 523,22 523.22 0,09 0.09 57,81 57.81 Theofylin Theophylline 0,09 0.09 256,03 256.03 0,10 0.10 403,96 403.96 0,07 0.07 74,25 74.25 NAS OUR 0,25 0.25 85,81 85.81 0,33 0.33 123,18 123.18 0,09 0.09 53,71 53.71 Melatonin Melatonin 0,18 0.18 118,39 118.39 0,22 0.22 184,36 184.36 0,11 0.11 45,08 45.08 Tryptofanamid Tryptophanamide 14,20 14.20 1,54 1.54 22,62 22.62 1,80 1.80 3,86 3.86 1,31 1.31 Clenbuterol Clenbuterol 9,84 9.84 2,22 2.22 14,10 14.10 2,89 2.89 4,00 4.00 1,26 1.26 Propranolol Propranolol 13,15 13.15 1,66 1.66 18,72 18.72 2,17 2.17 5,32 5.32 0,95 0.95 Butoxamin Butoxamine 6,19 6.19 3,53 3.53 7,04 7.04 5,78 5.78 3,16 3.16 1,60 1.60 Efedrin Ephedrine 9,33 9.33 2,34 2.34 11,80 11.80 3,45 3.45 3,74 3.74 1,35 1.35 Isoxsuprin Isoxsuprin 9,01 9.01 2,43 2.43 11,23 11.23 3,62 3.62 3,64 3.64 1,39 1.39 ZWIX1 ZWIX1 ZWIX2 ZWIX2 ZWIX3 ZWIX3 Analyt Analyt k to a and k to a and k to a and Niacin Niacin 0,28 0.28 5,42 5.42 0,09 0.09 14,58 14.58 0,29 0.29 8,75 8.75 Tryptamin Tryptamine 2,16 2.16 0,69 0.69 1,06 1.06 1,18 1.18 1,64 1.64 1,56 1.56 Serotonin Serotonin 1,50 1.50 1,00 1.00 1,25 1,25 1,00 1.00 2,56 2.56 1,00 1.00 Oktopamin Octopamine 1,74 1.74 0,86 0.86 0,85 0.85 1,46 1.46 1,38 1.38 1,85 1.85 Noradrenalin Noradrenaline 2,52 2.52 0,59 0.59 1,01 1.01 1,23 1,23 2,02 2.02 1,27 1,27 Kynurenin Kynurenin 1.28 1.28 1.16 1.16 0,70 0.70 1,80 1.80 1,29 1.29 1,98 1.98 Tryptofan Tryptophan 1,46 1.46 1,02 1,02 0,59 0.59 2,12 2.12 1,35 1.35 1,90 1.90 1-Me-Trp 1-Me-Trp 1,09 1.09 1,37 1.37 0,52 0.52 2,40 2.40 1,02 1,02 2,52 2.52 5-Me-Trp 5-Me-Trp 1,27 1,27 1,18 1.18 0,52 0.52 2,43 2.43 1,16 1.16 2,21 2.21 6-Me-Trp 6-Me-Trp 1,33 1.33 1,12 1.12 0,56 0.56 2,22 2.22 1,23 1,23 2,09 2.09 7-Me-Trp 7-Me-Trp - - - - 0,58 0.58 2,14 2.14 1,22 1,22 2,10 2.10 Nikotinamid Nicotinamide 0,12 0.12 12,54 12.54 0,07 0.07 18,09 18.09 0,13 0.13 20,43 20.43 Kofein Caffeine 0,07 0.07 22,83 22.83 0,07 0.07 18,25 18.25 0,09 0.09 29,43 29.43 Theofylin Theophylline 0,11 0.11 13,99 13.99 0,06 0.06 20,89 20.89 0,12 0.12 22,25 22.25

NAS OUR 0,28 0.28 5,33 5.33 0,09 0.09 14,07 14.07 0,26 0.26 9,97 9.97 Melatonin Melatonin 0,18 0.18 8,37 8.37 0,06 0.06 19,67 19.67 0,16 0.16 15,91 15.91 Tryptofanamid Tryptophanamide 2,34 2.34 0,64 0.64 0,80 0.80 1,56 1.56 2,05 2.05 1,25 1,25 Clenbuterol Clenbuterol 1,20 1.20 1,25 1,25 0,72 0.72 1,74 1.74 0,87 0.87 2,94 2.94 Propranolol Propranolol 1,48 1.48 1,01 1.01 0,86 0.86 1,46 1.46 1,10 1.10 2,34 2.34 Butoxamin Butoxamine 0,81 0.81 1,84 1.84 0,58 0.58 2,17 2.17 0,58 0.58 4,44 4.44 Efedrin Ephedrine 1,16 1.16 1,29 1.29 0,80 0.80 1,57 1.57 0,85 0.85 3,00 3.00 Isoxsuprin Isoxsuprin 0,80 0.80 1,87 1.87 0,54 0.54 2,33 2.33 0,85 0.85 3,00 3.00

Tabulka 3: Retenční faktory a redukované selektivity analytů na různých kolonách v SFC.Table 3: Retention factors and reduced selectivity of analytes on different SFC columns.

Analyt Analyt SCX1 SCX1 SCX2 SCX2 SCX3 SCX3 k to a and k to a and k to a and Niacin Niacin 1,43 1.43 76,94 76.94 1,69 1.69 105,87 105.87 0,94 0.94 36,69 36.69 Tryptamin Tryptamine 51,22 51.22 2,15 2.15 67,98 67.98 2,62 2.62 21,80 21.80 1,58 1.58 Serotonin Serotonin 110,26 110.26 1,00 1.00 178,39 178.39 1,00 1.00 34,51 34.51 1,00 1.00 Oktopamin Octopamine 52,19 52.19 2,11 2.11 71,13 71.13 2,51 2.51 18,41 18.41 1,87 1.87 Noradrenalin Noradrenaline 109,66 109.66 1,01 1.01 168,50 168.50 1,06 1.06 33,86 33.86 1,02 1,02 Kynurenin Kynurenin 62,49 62.49 1,76 1.76 79,50 79.50 2,24 2.24 19,86 19.86 1,74 1.74 Tryptofan Tryptophan 74,24 74.24 1,49 1.49 107,89 107.89 1,65 1.65 21,92 21.92 1,57 1.57 1-Me-Trp 1-Me-Trp 36,19 36.19 3,05 3.05 43,83 43.83 4,07 4.07 15,22 15.22 2,27 2.27 5-Me-Trp 5-Me-Trp 63,74 63.74 1,73 1.73 80,53 80.53 2,22 2.22 22,98 22.98 1,50 1.50 6-Me-Trp 6-Me-Trp 66,46 66.46 1,66 1.66 84,50 84.50 2,11 2.11 22,73 22.73 1,52 1.52 7-Me-Trp 7-Me-Trp 66,80 66.80 1,65 1.65 85,23 85.23 2,09 2.09 23,62 23.62 1,46 1.46 Nikotinamid Nicotinamide 1,34 1.34 82,27 82.27 1,58 1.58 113,09 113.09 0,92 0.92 37,66 37.66 Kofein Caffeine 0,23 0.23 476,71 476.71 0,28 0.28 637,12 637.12 0,44 0.44 78,81 78.81 Theofylin Theophylline 0,55 0.55 200,10 200.10 0,66 0.66 269,27 269.27 - - - - NAS OUR 5,02 5.02 21,98 21.98 6,35 6.35 28,09 28.09 2,41 2.41 14,34 14.34 Melatonin Melatonin 1,98 1.98 55,83 55.83 2,30 2.30 77,48 77.48 1,50 1.50 22,96 22.96 Tryptofanamid Tryptophanamide 86,01 86.01 1,28 1,28 152,65 152.65 1,17 1.17 29,29 29.29 1,18 1.18 Clenbuterol Clenbuterol 17,72 17.72 6,22 6.22 21,01 21.01 8,49 8.49 11,60 11.60 2,98 2.98 Propranolol Propranolol 18,03 18.03 6,11 6.11 21,43 21.43 8,33 8.33 12,44 12.44 2,77 2.77 Butoxamin Butoxamine 8,72 8.72 12,64 12.64 9,28 9.28 19,23 19.23 7,00 7.00 4,93 4.93 Efedrin Ephedrine 13,42 13.42 8,21 8.21 16,02 16.02 11,14 11.14 8,62 8.62 4,00 4.00 Isoxsuprin Isoxsuprin 21,89 21.89 5,04 5.04 25,23 25.23 7,07 7.07 12,32 12.32 2,80 2.80 ZWIX1 ZWIX1 ZWIX2 ZWIX2 ZWIX3 ZWIX3 Analyt Analyt k to a and k to a and k to a and Niacin Niacin 3,27 3.27 28,11 28.11 2,49 2.49 25,57 25.57 3,55 3.55 23,26 23.26 Tryptamin Tryptamine 24,85 24.85 3,70 3.70 17,18 17.18 3,70 3.70 23,80 23.80 3,47 3.47 Serotonin Serotonin 91,97 91.97 1,00 1.00 63,57 63.57 1,00 1.00 82,66 82.66 1,00 1.00 Oktopamin Octopamine 34,44 34.44 2,67 2.67 24,86 24.86 2,56 2.56 29,78 29.78 2,78 2.78 Noradrenalin Noradrenaline 102,02 102.02 0,90 0.90 87,86 87.86 0,72 0.72 96,32 96.32 0,86 0.86 Kynurenin Kynurenin 78,48 78.48 1,17 1.17 65,14 65.14 0,98 0.98 89,49 89.49 0,92 0.92

Tryptofan Tryptophan 127,33 127.33 0,72 0.72 95,69 95.69 0,66 0.66 116,80 116.80 0,71 0.71 1-Me-Trp 1-Me-Trp 42,41 42.41 2,17 2.17 34,09 34.09 1,86 1.86 47,34 47.34 1,75 1.75 5-Me-Trp 5-Me-Trp 91,01 91.01 1,01 1.01 70,33 70.33 0,90 0.90 98,59 98.59 0,84 0.84 6-Me-Trp 6-Me-Trp 96,41 96.41 0,95 0.95 72,98 72.98 0,87 0.87 104,49 104.49 0,79 0.79 7-Me-Trp 7-Me-Trp 96,84 96.84 0,95 0.95 72,82 72.82 0,87 0.87 104,00 104.00 0,79 0.79 Nikotinamid Nicotinamide 1,08 1.08 84,99 84.99 0,88 0.88 72,27 72.27 1,20 1.20 69,16 69.16 Kofein Caffeine 0,12 0.12 774,20 774.20 0,13 0.13 491,31 491.31 0,19 0.19 440,13 440.13 Theofylin Theophylline 0,45 0.45 205,71 205.71 0,41 0.41 156,26 156.26 0,50 0.50 164,51 164.51 NAS OUR 8,68 8.68 10,59 10.59 5,63 5.63 11,30 11.30 8,10 8.10 10,20 10.20 Melatonin Melatonin 2,39 2.39 38,53 38.53 1,54 1.54 41,19 41.19 2,27 2.27 36,48 36.48 Tryptofanamid Tryptophanamide 67,27 67.27 1,37 1.37 49,80 49.80 1,28 1,28 70,17 70.17 1,18 1.18 Clenbuterol Clenbuterol 7,60 7.60 12,10 12.10 5,57 5,57 11,42 11.42 6,75 6.75 12,25 12.25 Propranolol Propranolol 7,30 7.30 12,59 12.59 4,97 4.97 12,79 12.79 6,79 6.79 12,17 12.17 Butoxamin Butoxamine 3,79 3.79 24,29 24.29 3,10 3.10 20,48 20.48 3,60 3.60 22,95 22.95 Efedrin Ephedrine 5,55 5.55 16,57 16.57 4,49 4.49 14,15 14.15 5,48 5.48 15,09 15.09 Isoxsuprin Isoxsuprin 12,89 12.89 7,14 7.14 8,62 8.62 7,37 7.37 10,60 10.60 7,80 7.80

Obdobně jako pro výše diskutované retenční faktory byla selektivita obecně vyšší pro SCX fáze než pro ZWIX fáze. Nejvyšší selektivita byla pozorována pro amidy, dále zwitterionty, farmaceutika a aminy (Tabulka 2 a 3).As with the retention factors discussed above, the selectivity was generally higher for the SCX phase than for the ZWIX phase. The highest selectivity was observed for amides, zwitterions, pharmaceuticals and amines (Tables 2 and 3).

Tabulka 4: Souhrn retenčních faktorů a selektivit (serotonin jako referenční analyt) v RP módu.Table 4: Summary of retention factors and selectivities (serotonin as reference analyte) in RP mode.

Analyt Analyt SCX1 SCX1 SCX2 SCX2 SCX3 SCX3 k to a and k to a and k to a and Niacin Niacin 0,18 0.18 86,12 86.12 0,08 0.08 284,62 284.62 0,41 0.41 17,56 17.56 Tryptamin Tryptamine 26,62 26.62 0,59 0.59 33,04 33.04 0,68 0.68 9,91 9.91 0,72 0.72 Serotonin Serotonin 15,59 15.59 1,00 1.00 22,49 22.49 1,00 1.00 7,13 7.13 1,00 1.00 Oktopamin Octopamine 3,36 3.36 4,64 4.64 4,50 4.50 4,99 4.99 2,45 2.45 2,91 2.91 Noradrenalin Noradrenaline 2,23 2.23 6,98 6.98 3,23 3.23 6,95 6.95 2,11 2.11 3,38 3.38 Kynurenin Kynurenin 0,72 0.72 21,74 21.74 0,58 0.58 38,97 38.97 1,24 1.24 5,73 5.73 Tryptofan Tryptophan 1,00 1.00 15,63 15.63 0,87 0.87 25,76 25.76 1,76 1.76 4,06 4.06 1-Me-Trp 1-Me-Trp 1,31 1.31 11,87 11.87 1,10 1.10 20,53 20.53 2,96 2.96 2,41 2.41 5-Me-Trp 5-Me-Trp 1,44 1.44 10,81 10.81 1,27 1,27 17,77 17.77 2,87 2.87 2,49 2.49 6-Me-Trp 6-Me-Trp 1,45 1.45 10,74 10.74 1,29 1.29 17,46 17.46 2,89 2.89 2,47 2.47 7-Me-Trp 7-Me-Trp 1,41 1.41 11,03 11.03 1,24 1.24 18,12 18.12 3,08 3.08 2,32 2.32 Nikotinamid Nicotinamide 1,03 1.03 15,10 15.10 0,94 0.94 23,95 23.95 1,29 1.29 5,51 5,51 Kofein Caffeine 1,52 1.52 10,26 10.26 1,19 1.19 18,91 18.91 2,90 2.90 2,46 2.46 Theofylin Theophylline 0,60 0.60 26,02 26.02 0,49 0.49 45,52 45.52 1,79 1.79 3,99 3.99 NAS OUR 3,49 3.49 4,46 4.46 3,66 3.66 6,14 6.14 4,61 4.61 1,55 1.55 Melatonin Melatonin 6,96 6.96 2,24 2.24 6,41 6.41 3,51 3.51 12,54 12.54 0,57 0.57 Tryptofanamid Tryptophanamide 3,15 3.15 4,95 4.95 3,15 3.15 7,13 7.13 4,74 4.74 1,50 1.50 Clenbuterol Clenbuterol 41,71 41.71 0,37 0.37 47,23 47.23 0,48 0.48 31,45 31.45 0,23 0.23 Propranolol Propranolol 123,00 123.00 0,13 0.13 134,00 134,00 0,17 0.17 - - - -

Butoxamin Butoxamine 46,94 46.94 0,33 0.33 43,41 43.41 0,52 0.52 Efedrin Ephedrine 10,57 10.57 1,48 1.48 12,19 12.19 1,84 1.84 8,64 8.64 0,82 0.82 Isoxsuprin Isoxsuprin 21,45 21.45 0,73 0.73 17,47 17.47 1,29 1.29 - - - - ZWIX1 ZWIX1 ZWIX2 ZWIX2 ZWIX3 ZWIX3 Analyt Analyt k to a and k to a and k to a and Niacin Niacin 0,35 0.35 20,64 20.64 0,31 0.31 21,31 21.31 0,30 0.30 24,36 24.36 Tryptamin Tryptamine 10,24 10.24 0,70 0.70 6,73 6.73 0,98 0.98 9,01 9.01 0,81 0.81 Serotonin Serotonin 7,21 7.21 1,00 1.00 6,61 6.61 1,00 1.00 7,31 7.31 1,00 1.00 Oktopamin Octopamine 2,01 2.01 3,59 3.59 2,16 2.16 3,06 3.06 2,08 2.08 3,51 3.51 Noradrenalin Noradrenaline 1,99 1.99 3,62 3.62 2,36 2.36 2,81 2.81 1,88 1.88 3,88 3.88 Kynurenin Kynurenin 0,85 0.85 8,51 8.51 0,63 0.63 10,42 10.42 0,73 0.73 9,97 9.97 Tryptofan Tryptophan 1,24 1.24 5,83 5.83 0,82 0.82 8,03 8.03 0,96 0.96 7,61 7.61 1-Me-Trp 1-Me-Trp 1,51 1.51 4,77 4.77 0,86 0.86 7,65 7.65 1,14 1.14 6,39 6.39 5-Me-Trp 5-Me-Trp 1,63 1.63 4,43 4.43 0,90 0.90 7,38 7.38 1,18 1.18 6,20 6.20 6-Me-Trp 6-Me-Trp 1,66 1.66 4,34 4.34 0,92 0.92 7,21 7.21 1,20 1.20 6,10 6.10 7-Me-Trp 7-Me-Trp 1,62 1.62 4,45 4.45 0,89 0.89 7,46 7.46 1,17 1.17 6,25 6.25 Nikotinamid Nicotinamide 0,98 0.98 7,36 7.36 0,86 0.86 7,67 7.67 0,87 0.87 8,45 8.45 Kofein Caffeine 1,32 1.32 5,48 5.48 0,95 0.95 6,99 6.99 1,15 1.15 6,37 6.37 Theofylin Theophylline 1,10 1.10 6,55 6.55 0,71 0.71 9,35 9.35 0,85 0.85 8,64 8.64 NAS OUR 2,87 2.87 2,51 2.51 1,47 1.47 4,51 4.51 2,07 2.07 3,53 3.53 Melatonin Melatonin 4,81 4.81 1,50 1.50 1,71 1.71 3,87 3.87 3,05 3.05 2,40 2.40 Tryptofanamid Tryptophanamide 2,47 2.47 2,92 2.92 1,30 1.30 5,07 5,07 1,86 1.86 3,93 3.93 Clenbuterol Clenbuterol 13,48 13.48 0,53 0.53 6,90 6.90 0,96 0.96 12,29 12.29 0,59 0.59 Propranolol Propranolol 39,00 39,00 0,18 0.18 13,63 13.63 0,48 0.48 32,00 32,00 0,23 0.23 Butoxamin Butoxamine 12,98 12.98 0,56 0.56 6,02 6.02 1,10 1.10 10,76 10.76 0,68 0.68 Efedrin Ephedrine 4,53 4.53 1,59 1.59 3,90 3.90 1,69 1.69 4,54 4.54 1,61 1.61 Isoxsuprin Isoxsuprin 11,86 11.86 0,61 0.61 2,87 2.87 2,31 2.31 6,98 6.98 1,05 1.05

Tabulka 5: Souhrn retenčních faktorů a selektivit (serotonin jako referenční analyt) vHILIC módu.Table 5: Summary of retention factors and selectivities (serotonin as reference analyte) in HILIC mode.

Analyt Analyt k to SCX1 a SCX1 and k to SCX2 a SCX2 and SCX3 k a SCX3 to a Niacin Niacin 0,29 0.29 10,38 10.38 0,38 0.38 11,83 11.83 0,33 0.33 3,54 3.54 Tryptamin Tryptamine 2,23 2.23 1,36 1.36 3,05 3.05 1,49 1.49 1,19 1.19 0,98 0.98 Serotonin Serotonin 3,03 3.03 1,00 1.00 4,54 4.54 1,00 1.00 1,16 1.16 1,00 1.00 Oktopamin Octopamine 2,44 2.44 1,24 1.24 3,65 3.65 1,24 1.24 0,97 0.97 1,20 1.20 Noradrenalin Noradrenaline 3,13 3.13 0,97 0.97 4,87 4.87 0,93 0.93 1,12 1.12 1,04 1.04 Kynurenin Kynurenin 1,09 1.09 2,79 2.79 1,43 1.43 3,17 3.17 0,72 0.72 1,61 1.61 Tryptofan Tryptophan 1,25 1,25 2,43 2.43 1,69 1.69 2,69 2.69 0,77 0.77 1,51 1.51 1-Me-Trp 1-Me-Trp 0,93 0.93 3,24 3.24 1,20 1.20 3,80 3.80 0,77 0.77 1,52 1.52 5-Me-Trp 5-Me-Trp 1,12 1.12 2,70 2.70 1,48 1.48 3,06 3.06 0,78 0.78 1,49 1.49 6-Me-Trp 6-Me-Trp 1,13 1.13 2,68 2.68 1,50 1.50 3,02 3.02 0,83 0.83 1,41 1.41

7-Me-Trp 7-Me-Trp 1,14 1.14 2,65 2.65 1,51 1.51 3,01 3.01 0,79 0.79 1,48 1.48 Nikotinamid Nicotinamide 0,25 0.25 12,22 12.22 0,35 0.35 12,96 12.96 0,27 0.27 4,28 4.28 Kofein Caffeine 0,03 0.03 115,20 115.20 -0,02 -0.02 - - 0,09 0.09 12,99 12.99 Theofylin Theophylline 0,21 0.21 14,36 14.36 0,29 0.29 15,49 15.49 0,25 0.25 4,61 4.61 NAS OUR 0,21 0.21 14,63 14.63 0,30 0.30 14,99 14.99 0,20 0.20 5,78 5.78 Melatonin Melatonin 0,01 0.01 512,00 512.00 -0,03 -0.03 - - 0,18 0.18 6,39 6.39 Tryptofanamid Tryptophanamide 0,39 0.39 7,81 7.81 0,53 0.53 8,54 8.54 0,37 0.37 3,15 3.15 Clenbuterol Clenbuterol 0,92 0.92 3,30 3.30 1,13 1.13 4,02 4.02 0,86 0.86 1,35 1.35 Propranolol Propranolol 0,98 0.98 3,08 3.08 1,21 1,21 3,76 3.76 1,02 1,02 1,14 1.14 Butoxamin Butoxamine 0,76 0.76 4,01 4.01 0,84 0.84 5,41 5.41 0,82 0.82 1,42 1.42 Efedrin Ephedrine 1,52 1.52 1,99 1.99 1,95 1.95 2,33 2.33 1,08 1.08 1,08 1.08 Isoxsuprin Isoxsuprin 0,20 0.20 14,86 14.86 0,29 0.29 15,79 15.79 0,30 0.30 3,81 3.81 ZWIX1 ZWIX1 ZWIX2 ZWIX2 ZWIX3 ZWIX3 Analyt Analyt k to a and k to a and k to a and Niacin Niacin 1,85 1.85 2,80 2.80 1,38 1.38 2,79 2.79 1,77 1.77 2,61 2.61 Tryptamin Tryptamine 2,70 2.70 1,92 1.92 2,06 2.06 1,87 1.87 2,44 2.44 1,89 1.89 Serotonin Serotonin 5,18 5.18 1,00 1.00 3,86 3.86 1,00 1.00 4,60 4.60 1,00 1.00 Oktopamin Octopamine 4,54 4.54 1,14 1.14 3,60 3.60 1,07 1.07 4,13 4.13 1,11 1.11 Noradrenalin Noradrenaline 7,69 7.69 0,67 0.67 5,83 5.83 0,66 0.66 6,58 6.58 0,70 0.70 Kynurenin Kynurenin 4,32 4.32 1,20 1.20 3,27 3.27 1,18 1.18 3,94 3.94 1,17 1.17 Tryptofan Tryptophan 5,17 5.17 1,00 1.00 3,65 3.65 1,06 1.06 4,63 4.63 0,99 0.99 1-Me-Trp 1-Me-Trp 3,36 3.36 1,54 1.54 2,52 2.52 1,53 1.53 3,14 3.14 1,46 1.46 5-Me-Trp 5-Me-Trp 4,32 4.32 1,20 1.20 3,08 3.08 1,25 1,25 3,87 3.87 1,19 1.19 6-Me-Trp 6-Me-Trp 4,47 4.47 1,16 1.16 3,26 3.26 1,18 1.18 3,92 3.92 1,18 1.18 7-Me-Trp 7-Me-Trp 4,48 4.48 1,16 1.16 3,15 3.15 1,22 1,22 3,99 3.99 1,15 1.15 Nikotinamid Nicotinamide 0,56 0.56 9,19 9.19 0,46 0.46 8,39 8.39 0,55 0.55 8,43 8.43 Kofein Caffeine 0,10 0.10 50,12 50.12 0,10 0.10 36,84 36.84 0,11 0.11 41,43 41.43 Theofylin Theophylline 0,53 0.53 9,74 9.74 0,44 0.44 8,75 8.75 0,55 0.55 8,42 8.42 NAS OUR 0,54 0.54 9,51 9.51 0,44 0.44 8,77 8.77 0,53 0.53 8,67 8.67 Melatonin Melatonin 0,11 0.11 47,19 47.19 0,09 0.09 42,70 42.70 0,10 0.10 46,87 46.87 Tryptofanamid Tryptophanamide 0,76 0.76 6,86 6.86 0,56 0.56 6,86 6.86 0,70 0.70 6,61 6.61 Clenbuterol Clenbuterol 0,86 0.86 5,99 5.99 0,82 0.82 4,69 4.69 0,90 0.90 5,14 5.14 Propranolol Propranolol 0,97 0.97 5,34 5.34 0,85 0.85 4,55 4.55 0,97 0.97 4,75 4.75 Butoxamin Butoxamine 0,70 0.70 7,42 7.42 0,69 0.69 5,56 5,56 0,74 0.74 6,18 6.18 Efedrin Ephedrine 1,65 1.65 3,14 3.14 1,41 1.41 2,73 2.73 1,67 1.67 2,76 2.76 Isoxsuprin Isoxsuprin 0,13 0.13 40,83 40.83 0,12 0.12 32,02 32.02 0,11 0.11 41,16 41.16

V RP módu (Tabulka 4) a HILIC módu (Tabulka 5) byly nejvyšší selektivity dosaženy v pořadí SCX 1 > SCX 2 > ZWIX 2 > ZWIX 3 > ZWIX 1 > SCX 3 > Phenomenex Eclipse C8. Nejvyšší selektivity byly pozorovány pro amidy a zwitterionty.In RP mode (Table 4) and HILIC mode (Table 5) the highest selectivities were achieved in the order of SCX 1> SCX 2> ZWIX 2> ZWIX 3> ZWIX 1> SCX 3> Phenomenex Eclipse C8. The highest selectivities were observed for amides and zwitterions.

-20“-20 "

Příklad 10: Stabilita stacionárních fází a retenčních časů ve spojení s hmotnostní spektrometriíExample 10: Stability of stationary phases and retention times in conjunction with mass spectrometry

Kompatibilita stacionárních fází podle předkládaného vynálezu s tandemovým uspořádáním kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie byla otestována za použití SFC-MS systému s kolonou SCX 3. Jako analyt posloužila směs metabolitů tryptofanové metabolické dráhy, jmenovitě: melatonin, serotonin, NAS, niacin a tryptofan. Separace byla provedena v gradientním SFC s methanolem obsahujícím 50 mM mravenčanu amonného jako pufrovaným organickým modifíkátorem. Analyty byly úspěšně separovány během 10 min. Možné ovlivnění stability signálu uvolňováním selektoru z kolony (column bleeding) bylo ověřeno pomocí 15 následných nástřiků (Obr. 5). Jak retenční čas, tak i detekovaný signál byly konstantní, což značí, že k uvolňování selektoru z kolony za daných podmínek nedochází a stacionární fáze je stabilní a použitelná i v SFC-MS/MS módu.The compatibility of the stationary phases of the present invention with tandem liquid chromatography and mass spectrometry was tested using an SFC-MS system with an SCX 3 column. Separation was performed in gradient SFC with methanol containing 50 mM ammonium formate as a buffered organic modifier. The analytes were successfully separated within 10 min. Possible effects on signal stability by releasing the selector from the column (column bleeding) were verified by 15 subsequent injections (Fig. 5). Both the retention time and the detected signal were constant, indicating that the release of the selector from the column does not occur under the given conditions and the stationary phase is stable and usable even in SFC-MS / MS mode.

Claims (7)

1. Multimodální stacionární fáze pro kapalinovou chromatografií obecného vzorce j(I) (I), kdeMultimodal stationary phase for liquid chromatography of general formula j (I) (I), wherein R je -0-, -S-, -S0-, -S0₂- nebo -N(R*)-;R is -O-, -S-, -SO-, -SO ₂ - or -N (R *) -; přičemž R¹ je vybrané ze skupiny sestávající zH, (Cl až C6)alkylu, (C2 až C6)alkenylu, (C2 až C6)alkynylu, (C6 ažC8)arylu, s výhodou je R¹ vybrané ze skupiny sestávající z H, -CH3, -CH2CH3, allylu, propargylu, benzylu a fenylu;wherein R ¹ is selected from the group consisting of H, (C 1 -C 6) alkyl, (C 2 -C 6) alkenyl, (C 2 -C 6) alkynyl, (C 6 -C 8) aryl, preferably R ^{1 is} selected from the group consisting of H, - CH 3, -CH 2 CH 3, allyl, propargyl, benzyl and phenyl; n je celé číslo v rozmezí od 3 do 11;n is an integer ranging from 3 to 11; m je celé číslo v rozmezí od 2 do 5;m is an integer ranging from 2 to 5; z je celé číslo v rozmezí od 2 do 5;z is an integer ranging from 2 to 5; L je triazof vzorce/11} (II);L is a triazoph of formula (II) (II); a nosič stacionární fáze je vybraný ze skupiny sestávající z anorganických částicových materiálů o velikosti částic od 1,5 do 10 μιη a velikosti pórů od 9 nm do 20 nm.and the stationary phase support is selected from the group consisting of inorganic particulate materials having a particle size of 1.5 to 10 µmη and a pore size of 9 nm to 20 nm. 2. Multimodální stacionární fáze podle nároku 1, vyznačená tím, že nosič je vybraný ze skupiny sestávající ze silikagelu, aluminy, ZrO₂, TiO₂ a zeolitů, zejména MCM-48, a core-shell částic, s pevným jádrem a porézní svrchní vrstvou tvořenou SiO₂, o velikosti od 1,6 do 5 pm.Multimodal stationary phase according to claim 1, characterized in that the carrier is selected from the group consisting of silica gel, alumina, ZrO ₂ , TiO ₂ and zeolites, in particular MCM-48, and core-shell particles, with a solid core and a porous topsheet. consisting of SiO ₂ , of a size from 1.6 to 5 µm. 3. Způsob přípravy multimodální stacionární fáze pro kapalinovou chromatografii podle nárokuA method for preparing a multimodal stationary phase for liquid chromatography according to claim 1 nebo 2, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:1 or 2, characterized in that it comprises the following steps: a) připraví se selektor obecného vzorce j(III) (III), obsahující ve své struktuře terminální trojnou vazbu, kde n je celé číslo v rozmezí od 3 do 11, m je celé číslo v rozmezí od 2 do 5 a R je -O-, -S-, -SO-, -SO₂- nebo -N(R^]) přičemž R¹ je vybrané ze skupiny sestávající zH, (Cl až C6)alkylu, (C2 až C6)alkenylu, (C2 až C6)alkynylu, (C6 ažC8)arylu, s výhodou je R¹ vybrané ze skupiny sestávající z H, -CH3, -CH2CH3, allylu, propargylu, benzylu a fenylu;a) prepare a selector of the formula j (III) (III) containing in its structure a terminal triple bond, wherein n is an integer ranging from 3 to 11, m is an integer ranging from 2 to 5 and R is -O -, -S-, -SO-, -SO ₂ - or -N (R ¹ ) wherein R ¹ is selected from the group consisting of H, (C 1 -C 6) alkyl, (C 2 -C 6) alkenyl, (C 2 -C 6) alkynyl, (C 6 -C 8) aryl, preferably R ^{1 is} selected from the group consisting of H, -CH 3, -CH 2 CH 3, allyl, propargyl, benzyl, and phenyl; tak, že se (C3 až C11 )alkenolát nebo (C3 až Cl l)alkynolát nebo (C3 až Cl 1 )alkenthiolát nebo (C3 až Cl l)alkynthiolát nebo (C3 až Cll)alkenylamin nebo (C3 až Cl l)alkynylamin, který má násobnou vazbu na opačném konci uhlíkového řetězce než heteroatom, podrobí reakci s (C2 až C5)sultonem; případně se výsledný selektor, který obsahuje R = -S-, dále oxiduje prostou nebo katalizovanou oxidací vzdušným kyslíkem nebo peroxidem vodíku na selektor obsahující R = -SO- a/nebo -SO2-;such that a (C3-C11) alkenolate or a (C3-C11) alkynolate or a (C3-C11) alkenethiolate or a (C3-C11) alkynthiolate or a (C3-C11) alkenylamine or a (C3-C11) alkynylamine, which has a multiple bond at the opposite end of the carbon chain than the heteroatom, reacts with (C2 to C5) sultone; optionally, the resulting selector containing R = -S- is further oxidized by simple or catalyzed oxidation with air oxygen or hydrogen peroxide to a selector containing R = -SO- and / or -SO 2 -; b) selektor obecného vzorce j(III) se imobilizuje na nosič vybraný z anorganických částicových materiálů o velikosti částic od 1,5 do 10 pm a velikosti pórů od 9 nm do 20 nm, používaných jako inertní nosiče v kapalinové chromatografii pro chemické ukotvení selektoru, tak, že nosič, který je modifikovaný azidoalkylovými skupinami o počtu uhlíkových atomů v alkylenovém řetězci od 2 do 5, reaguje se selektorem obecného vzorce flll)' za vzniku multimodální stacionární fáze obecného vzorce/I).(b) the selector of formula (j) (III) is immobilized on a support selected from inorganic particulate materials having a particle size of from 1.5 to 10 µm and a pore size of from 9 nm to 20 nm used as inert supports in liquid chromatography for chemical anchoring of the selector; such that the carrier, which is modified with azidoalkyl groups having a number of carbon atoms in the alkylene chain of 2 to 5, is reacted with a selector of formula (III) to form a multimodal stationary phase of formula (I). 4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že krok b) jeThe method of claim 3, wherein step b) is Huisgenova dipolámí cykloadiční reakce mezi terminální trojnou vazbou selektoru obecného vzorce'(Ill)a azi dovou skupinou látky obecného vzorce/IV.) (nosič)—^-CH₂-^—N₃ (IV), kde z je celé číslo v rozmezí od 2 do 5.Huisgen dipolar cycloaddition reaction between the terminal triple bond of the selector of the formula '(III) and azido DOVO group of compounds of the formula / IV). (Medium) - ^ - _CH2 - ^ - N ₃ (IV) wherein z is an integer in the range from 2 to 5. 5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačený tím, že reakce (C3 až Cl l)alkenolátu nebo (C3 až Cll)alkynolátu nebo (C3 až Cll)alkenthiolátu nebo (C3 až Cll)alkynthiolátu nebo (C3 až Cl l)alkenylaminu nebo (C3 až Cl l)alkynylaminu, který má násobnou vazbu na opačném konci uhlíkového řetězce než heteroatom, s (C2 až C5)sultonem v kroku a) proběhne při teplotě alespoň 50 °C a v atmosféře inertního plynu po dobu alespoň 10 hodin.Process according to claim 3 or 4, characterized in that the reaction of (C3 to C1) alkenolate or (C3 to C1) alkynolate or (C3 to C1) alkenethiolate or (C3 to C1) alkynthiolate or (C3 to C1) alkenylamine or (C 3 to C 11) alkynylamine having a multiple bond at the opposite end of the carbon chain to the heteroatom, with (C 2 to C 5) sultone in step a) is conducted at a temperature of at least 50 ° C and an inert gas atmosphere for at least 10 hours. 6. Použití multimodální stacionární fáze podle nároku 1 nebo 2 pro chromatografickou separaci a purifikaci látek v polárním organickém módu, na reverzní fázi, při chromatografii hydrofilních interakcí a při superkritické fluidní chromatografii.Use of a multimodal stationary phase according to claim 1 or 2 for chromatographic separation and purification of substances in polar organic mode, on reverse phase, in hydrophilic interaction chromatography and in supercritical fluid chromatography. 7. Použití multimodální stacionární fáze podle nároku 1 nebo 2 jako sorbent pro extrakci na pevné fázi.Use of a multimodal stationary phase according to claim 1 or 2 as a sorbent for solid phase extraction.