CZ2016248A3 - A method of detecting specific microRNAs using template DNA and a template DNA molecule for use in this method - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nové metody pro stanovení množství mikroRNA (miRNA) v daném vzorku pomocí templátové DNA a působení exonukleázy 1 s následnou detekcí, případně kvantifikací DNA templátu pomocí kvantitativní PCR.The solution concerns a new method for determining the quantity microRNA (miRNA) in a given sample using template DNA and exonuclease 1 action with subsequent detection or quantification of the DNA template by quantitative PCR.

Description

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týká nové metody pro detekci a stanovení množství mikroRNA v daném vzorku pomocí templátové DNA a působení exonukleázy I s následnou kvantifikací DNA templátu.The present invention relates to a novel method for detecting and determining the amount of microRNAs in a given sample using template DNA and exonuclease I treatment followed by quantitation of the template DNA.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

MikroRNA jsou krátké nekódující RNA molekuly, které mají důležitou úlohu v regulaci exprese genů. První z těchto molekul byla objevena roku 1993 při studiu hlístice C. elegans (Lee and Ambros, 2001). Victor Ambros se svými kolegy zjistil, že gen lin-4 řídící larvální vývoj této hlístice nekóduje bílkoviny, ale dvě malé molekuly RNA (Ambros, 2001). A právě tyto RNA jsou jedny z prvních členů dnes již velmi početné rodiny malých regulačních RNA označovaných mikroRNA nebo zkráceně miRNA. Do roku 2001 bylo publikováno přes 100 dalších genů pro tyto miRNA, a to i v jiných organismech (Bartel, 2004). Podle miRBase databáze bylo v současné době již identifikováno jen v lidském genomu přes J^500 miRNA (www.mirbase.org). Předpokládá se, že více než třetina celého lidského genomu je ovlivňována právě miRNA (Lewis et al., 2005). Ačkoliv objeveny relativně nedávno, miRNA se tak stávají jednou z nejpočetnějších skupin molekul regulujích genovou expresi.MicroRNAs are short non-coding RNA molecules that play an important role in regulating gene expression. The first of these molecules was discovered in 1993 when studying the nematode C. elegans (Lee and Ambros, 2001). Victor Ambros and his colleagues found that the lin-4 gene driving the larval development of this nematode does not encode proteins but two small RNA molecules (Ambros, 2001). And these RNAs are one of the first members of the now very large family of small regulatory RNAs called microRNAs or miRNAs. By 2001, over 100 additional genes for these miRNAs have been published, including in other organisms (Bartel, 2004). According to the miRBase database, only J ^ 500 miRNAs have been identified in the human genome at present (www.mirbase.org). It is believed that more than a third of the entire human genome is affected by miRNA (Lewis et al., 2005). Although discovered relatively recently, miRNAs thus become one of the most numerous groups of molecules regulating gene expression.

MiRNA jsou molekuly RNA o délce 21 až 25 nukleotidů, které se účastní posttranskripční regulace exprese genů. Při jejich tvorbě nejprve vzniká primární transkript, který je ještě v jádře štěpen na kratší zhruba 70-ti nukleotidové pre-miRNA pomocí RNázy zvané Drosha. Pre-miRNA jsou exportovány do cytoplasmy, kde dochází k dalšímu opracování enzymem RNázou III zvaným Dicer a vzniká 21 až 25 nukleotidů dlouhá miRNA. Vlákno miRNA,které í je komplementární k mRNA^, se pak v komplexu zvaném RISC (RNA-induced silencing complex) váže na cílovou mRNA molekulu a dojde k represi translace či degradaci dané mRNA (He and Hannon, 2004). Později bylo také ukázáno, že miRNA mohou ovlivňovat expresi genů nejen negativně, ale i pozitivně (Vasudevan et al., 2007).MiRNAs are 21 to 25 nucleotide RNA molecules involved in post-transcriptional regulation of gene expression. First, they produce a primary transcript that is still cleaved into the nucleus to a shorter approximately 70 nucleotide pre-miRNA by an RNase called Drosha. Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm, where they are further treated with RNase III enzyme called Dicer to produce a 21 to 25 nucleotide long miRNA. The miRNA strand, which is complementary to mRNA, then binds to the target mRNA molecule in a RNA-induced silencing complex (RISC) and represses the translation or degradation of the mRNA (He and Hannon, 2004). It has also been shown later that miRNAs can influence gene expression not only negatively but also positively (Vasudevan et al., 2007).

* « , « i J ♦ í í « ♦♦ f , _t t íII» «,*«»« t i · « · ·* ·* «« I i i J ♦ «♦♦ f _t t III» «*« »« I · «* · · ·

MiRNA regulují mnoho vývojových a fyziologických procesů. Deregulace konkrétních miRNA je asociována s různými patologickými procesy. Studia profilu miRNA u zdravých a nemocných jedinců dokládají, že různé miRNA jsou užitečné biomarkery různých onemocnění. V literatuře se uvádí, že miRNA je deregulována u různých typů a stavů nádorových chorob, virových infekcí, onemocnění nervového systému, kardiovaskulárních chorob, diabetů a dalších (Wang et al., 2016). Při studii velkého množství nádorových vzorků bylo zjištěno, že exprese miRNA v nádorech je obecně nižší a expresní profil miRNA v rakovinných tkáních je specifický podle vývojového původu tkáně (Lu et al., 2005). Dalším nálezem dokládajícím význam miRNA biomarkerů pro diagnostické účely bylo zjištění, že miRNA kolují v krvi a tělních tekutinách ve stabilní formě a mohou tak být neinvazivními markéry (Mitchell et al., 2008). O miRNA se uvažuje nejen jako vhodných markérech diagnózy, ale také prognózy a odpovědi na léčbu (Takamizawa et al., 2004; Schetter et al., 2008).MiRNAs regulate many developmental and physiological processes. Deregulation of particular miRNAs is associated with various pathological processes. Studies of the miRNA profile in healthy and diseased individuals demonstrate that different miRNAs are useful biomarkers of different diseases. It has been reported in the literature that miRNA is deregulated in various types and conditions of cancer, viral infections, nervous system diseases, cardiovascular diseases, diabetes and others (Wang et al., 2016). In a study of a large number of tumor samples, miRNA expression in tumors has been found to be generally lower and the expression profile of miRNA in cancerous tissues is specific to the developmental origin of the tissue (Lu et al., 2005). Another finding demonstrating the importance of miRNA biomarkers for diagnostic purposes was that miRNAs circulate in blood and body fluids in a stable form and may thus be non-invasive markers (Mitchell et al., 2008). MiRNAs are considered not only as appropriate markers of diagnosis, but also prognosis and response to treatment (Takamizawa et al., 2004; Schetter et al., 2008).

Problémem s využití miRNA pro diagnostické účely však zůstává metoda detekce a kvantifikace miRNA. Doposud bylo vyvinuto několik metod, které však jsou značně časově náročné a komplikované a z tohoto důvodu jsou výsledky jednotlivých studií nekonzistentní. ť/However, the method of miRNA detection and quantification remains a problem with the use of miRNAs for diagnostic purposes. Several methods have been developed so far, but they are time-consuming and complicated and therefore the results of the individual studies are inconsistent. ť /

Nejstarší metodou je tzv. Northeň blot, jejímž principem je elektroforetické rozdělení molekul RNA podle velikosti, přenos na membránu a následná hybridizace s detekční sondou, která je komplementární ke stanovované sekvenci. Tato metoda je značně zdlouhavá a pracný a proto není vhodná pro experimenty většího rozsahu. Metoda byla modifikována pro miRNA inkorporací „locked nucleic acids“ (LNA) do sekvence DNA sondy, čímž došlo ke zvýšení specifity a sensitivity detekce miRNA (Valoczi et al., 2004), ale pracnost metody nebyla ovlivněna. Další metodou je in šitu hybridizace, při které není nutné sledované molekuly izolovat a přenášet na membránu, ale hybridizace se sondou proběhne přímo v buňkách na fixovaném histologickém řezu. Pro krátké molekuly miRNA byla tato metoda upravena tak, že po hybridizaci s delší sondou je řetězec miRNA dosyntetizován polymerázou a zároveň je inkorporován digoxigenin, který je detekován značenou protilátkou (Nuovo et al., 2009). Nízká citlivost detekce in šitu hybridizaci a značná pracnost však dělá tuto metodu nevhodnou pro rutinní kvantifikaci miRNA.The oldest method is the so-called Northen blot, which is based on the electrophoretic division of RNA molecules by size, transfer to the membrane and subsequent hybridization with a detection probe, which is complementary to the determined sequence. This method is very lengthy and laborious and therefore not suitable for larger scale experiments. The method was modified for miRNA by incorporating locked nucleic acids (LNA) into the DNA probe sequence, thereby increasing the specificity and sensitivity of miRNA detection (Valoczi et al., 2004), but the laboriousness of the method was not affected. Another method is in situ hybridization, in which it is not necessary to isolate and transfer the molecules of interest to the membrane, but the hybridization with the probe takes place directly in the cells on a fixed histological section. For short miRNA molecules, this method has been modified such that, after hybridization with a longer probe, the miRNA strand is synthesized by polymerase and at the same time digoxigenin is incorporated, which is detected by a labeled antibody (Nuovo et al., 2009). However, the low sensitivity of in situ detection of hybridization and considerable laboriousness make this method unsuitable for routine miRNA quantification.

Speciální skupinu tvoří metody využívající miRNA mikročipy, které umožňují simultánní stanovení velkého množství různých miRNA. V tomto případě jsou sondy (nejčastěji DNA) • · » · »A special group consists of methods using miRNA microarrays that allow simultaneous determination of a large number of different miRNAs. In this case, the probes (most commonly DNA) are • · »·»

e · « · · ·e · «· · ·

s komplementární sekvencí k různým miRNA imobilizovány na pevném nosiči. Principem metody je opět hybridizace cílové molekuly s její sondou. Během několika dnů je možné získat touto metodou celou řadu dat, což je jeden z důvodů, proč je tato metoda hojně využívaná. Nevýhodou je však vyšší požadavek na vstupní množství RNA vzorku a příprava specifického souboru požadovaných sond a výroba mikročipu před samotným experimentem (Meyer et al., 2010). Jedna z modifikací pro stanovení miRNA je využití LNA v sekvenci sond. LNA je syntetický analog RNA molekuly vykazující zvýšenou termostabilitu duplexů nukleových kyselin. Každý takový LNA monomer v sekvenci sondy zvyšuje teplotu tání (Tm) a tím umožňuje vyrobit čip s řadou sond o srovnatelné Tm. Tímto přístupem je možno zajistit vhodné hybridizační podmínky (Castoldi et al., 2008). Komerčně je dostupných několik variant těchto čipů. Díky omezené specifitě této metody, je však nutné prvotní nález ověřovat ještě druhou metodou, obvykle kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR).with a complementary sequence to different miRNAs immobilized on a solid support. The principle of the method is again hybridization of the target molecule with its probe. Within a few days it is possible to get a lot of data with this method, which is one of the reasons why this method is widely used. The disadvantage, however, is the higher requirement for the input amount of RNA sample and the preparation of a specific set of probes required and the production of the microchip prior to the experiment (Meyer et al., 2010). One modification for the determination of miRNA is the use of LNA in the probe sequence. LNA is a synthetic analogue of an RNA molecule showing increased thermostability of nucleic acid duplexes. Each such LNA monomer in the probe sequence increases the melting point (T m) and thereby allows the chip to be produced with a series of probes of comparable T m. This approach provides suitable hybridization conditions (Castoldi et al., 2008). Several variants of these chips are commercially available. However, due to the limited specificity of this method, it is necessary to verify the initial finding with a second method, usually real-time quantitative PCR (qRT-PCR).

V současné době nejpoužívanější metody pro stanovení miRNA jsou založené na qRT-PCR. Výhodami těchto metod je, že výsledky mohou být získány během jediného dne, stanovení většího množství vzorků najednou a velká citlivost metod (Meyer et al., 2010). Tyto metody spočívají v izolaci RNA, přepsání RNA do cDNA (v procesu reverzní transkripce s reverzní transkriptázou) a následné qRT-PCR. Protože miRNA obsahují jen malý počet nukleotidů, musí před samotnou reverzní transkripcí miRNA dojít k prodloužení těchto molekula to např. polyadenylací. Po polyadenylaci se využije oligo-dT sekvence jako primer pro reverzní transkripci a PCR pak probíhá s jedním univerzálním primerem a jedním specifickým pro danou miRNA (Fu et al., 2006; Balcells et al., 2011). Prodloužení miRNA molekul lze také docílit využitím tzv. „stem loop“ primerů. Tyto primery jsou nejprve hybridizovány s miRNA a pak teprve dochází k reverzní transkripci a následné detekci cDNA za použití běžné Taq Man qRT-PCR (Chen et al., 2005). K prodloužení miRNA molekuly může také dojít při ! reverzní transkripci za pomoci primerů s krátkou komplementární sekvencí k miRNA aCurrently, the most commonly used methods for determining miRNAs are based on qRT-PCR. The advantages of these methods are that the results can be obtained in a single day, the determination of multiple samples at a time and the high sensitivity of the methods (Meyer et al., 2010). These methods consist of RNA isolation, RNA transcription into cDNA (in the reverse transcription process with reverse transcriptase) and subsequent qRT-PCR. Because miRNAs contain only a small number of nucleotides, these molecules must be extended by polyadenylation before reverse transcription of the miRNA itself. Following polyadenylation, the oligo-dT sequence is used as a primer for reverse transcription and PCR then proceeds with one universal primer and one specific for a given miRNA (Fu et al., 2006; Balcells et al., 2011). The extension of miRNA molecules can also be achieved by using the so-called "stem loop" primers. These primers are first hybridized to miRNA and then reverse transcription followed by cDNA detection using conventional Taq Man qRT-PCR (Chen et al., 2005). Prolongation of the miRNA molecule can also occur at! reverse transcription using primers with a short complementary sequence to miRNA and

- dlouhým nespecifickým úsekem na jeho 5' konci. cDNA je následně kvantifikována SYBRa long non-specific region at its 5 'end. The cDNA is then quantified by SYBR

Green qRT-PCR s LNA obsahujícím specifickým primerem a druhým univerzálním primerem (Raymond et al., 2005).Green qRT-PCR with LNA containing specific primer and second universal primer (Raymond et al., 2005).

Pro stanovení miRNA se nově také používá vysokokapacitní sekvenování (tzv. „next generation sequencing“). Tato metoda je však spíše vhodná pro identifikaci nových miRNA než pro běžné rutinní testování. Existuje ještě několik dalších metod pro stanovení miRNA.High-throughput next generation sequencing has also recently been used to determine miRNAs. However, this method is more suitable for identifying new miRNAs than for routine testing. There are several other methods for determining miRNA.

> »> »

i * > i ·i *> i ·

• · » &• · »&

Tyto metody však nejsou určeny pro rutinní stanovení miRNA v běžné laboratoři a vyžadují specializované vybavení.However, these methods are not intended for routine miRNA determination in a conventional laboratory and require specialized equipment.

Všechny výše uvedené metody, kromě hybridizace in šitu, vychází z izolované RNA nebo miRNA. Samotná izolace RNA bývá však zdlouhavý a náročný proces, během něhož může dojít k degradaci RNA všudypřítomnými RNázami a k ovlivnění výsledků stanovení exprese miRNA. Druhým krokem bývá polyadenylace poly(A) polymerázou následovaná reverzní transkripcí, kdy dochází k přepisu RNA na cDNA a teprve ta bývá kvantifikována pomocí qRT-PCR. Citlivá metoda, která by umožnila stanovit miRNA bez nutnosti její izolace, polyadenylace a přepisu do cDNA by byla velice potřebná, neboť by velmi zjednodušila a zlevnila celý proces.All of the above methods, except for in situ hybridization, are based on isolated RNA or miRNA. However, RNA isolation itself is a lengthy and demanding process during which RNA can be degraded by ubiquitous RNases and the results of miRNA expression assays can be affected. The second step is polyadenylation of poly (A) polymerase followed by reverse transcription, where RNA is transcribed to cDNA and only quantified by qRT-PCR. A sensitive method that would allow the miRNA to be determined without the need for isolation, polyadenylation, and transcription into cDNA would be very necessary as it would greatly simplify and cheaper the whole process.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Předmětem vynálezu je nová metoda detekce miRNA. Termínem detekce se rozumí jak pouhé zjištění přítomnosti či nepřítomnosti miRNA ve vzorku, tak i kvantitativní stanovení, jako je např. stanovení počtu molekul miRNA přítomných ve vzorku. Principem metody je kontakt miRNA ze zkoumaného vzorku se syntetickou jedno-vláknovou templátovou DNA, která je navržena tak, aby se její část komplementárně vázala na studovanou miRNA. Je-li miRNA přítomna, dojde k její hybridizaci s templátovou DNA (volné v roztoku nebo imobilizované na povrch, magnetické partikule nebo jiný substrát), čímž vznikne hybridní dvouvláknová sekvence DNA-RNA, která je rezistentní k působení exonukleázy I. Exonukleáza I degraduje pouze jedno-vláknové DNA tím, že ve směru od 3fkonce k5Konci odštěpuje jednotlivé nukleotidy. Pokud však miRNA ve vzorku není (nebo není schopna se komplementárně vázat na templátovou DNA), nevznikne dvouvláknová struktura, templátová DNA je v přítomnosti exonukleázy I degradována a nemůže sloužit jako templát pro následnou qRT-PCR s přidanými oligonukleotidovými primery. Způsob podle předloženého vynálezu může být použit jak pro detekci (průkaz přítomnosti miRNA) tak i pro kvantifikaci, relativní (vzájemné porovnání množství miRNA v různých vzorcích) i absolutní (zjištění absolutního množství miRNA v původním vzorku).SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a novel method for detecting miRNAs. The term detection refers to both the mere detection of the presence or absence of miRNAs in a sample and quantitative assays, such as the determination of the number of miRNA molecules present in a sample. The principle of the method is the contact of miRNA from the sample with synthetic single-stranded template DNA, which is designed so that its part is complementary to the studied miRNA. If the miRNA is present, it will hybridize to the template DNA (free in solution or immobilized to a surface, magnetic particle or other substrate) to form a hybrid double stranded DNA-RNA sequence that is resistant to exonuclease I. Exonuclease I only degrades single-stranded DNA by cleaving single nucleotides downstream from the 3 'end to the 5' end. However, if the miRNA in the sample is not (or is unable to complement the template DNA), the double stranded structure does not arise, the template DNA is degraded in the presence of exonuclease I and cannot serve as a template for subsequent qRT-PCR with added oligonucleotide primers. The method of the present invention can be used for both detection (demonstration of the presence of miRNA) and quantification, relative (comparing the amount of miRNA in different samples) and absolute (finding the absolute amount of miRNA in the original sample).

Pro každou konkrétní miRNA je navržena specifická templátová DNA. Jedná se o synteticky připravený oligonukleotid o délce 50 až 150 nukleotidů, obvykle o délce 70 až 100 * · · · · • · · · · · • · · * · ♦ · «··· ·«···· . · · · · «··· ·· ·· *Specific template DNA is designed for each particular miRNA. It is a synthetically prepared oligonucleotide of 50 to 150 nucleotides in length, usually 70 to 100 in length. · · · · · · ·

nukleotidů, který je vhodný pro amplifíkaci v qRT-PCR a má dvě části: variabilní úsek, který je specifický pro danou miRNA, a konstantní úsek, který je konstantní pro stanovení různých miRNA.The nucleotide sequence is suitable for amplification in qRT-PCR and has two parts: a variable region that is specific for a given miRNA and a constant region that is constant for determining different miRNAs.

V jednom provedení je templátovou DNA oligonukleotid s konstantním úsekem začínajícím na 5' konci templátové DNA, kde je umístěna vazebná sekvence pro zakotvení templátové DNA. Pro toto zakotvení se obvykle využívá poly-A sekvence, o délce 15 až 40 nukleotidů, častěji 20 až 25 nukleotidů. Tato sekvence je důležitá pro zakotvení templátové DNA pomocí hybridizace s biotinylovanou poly-T sekvencí a následnou vazbou biotinu na streptavidin, který může být navázán na jakémkoliv povrchu, výhodně např. v jamkách PCR destičky, zkumavkách či magnetických partikulích. Nejvýhodnější je použití magnetických partikulí, kdy se přibližuje hybridizace optimálním podmínkám hybridizace v roztoku. Toto uchycení templátové DNA před hybridizací, případně s navázanou miRNA po hybridizaci, umožňuje odmýt možné inhibitory exonukleázy ze vzorku. Po vazebné sekvenci (výhodně poly-A sekvenci) následuje sekvence 15 až 30 nukleotidů, výhodně 18 až 26 nukleotidů, pro nasednutí forward primerů, následovaná úsekem extenze (prodlužujícím úsekem), jehož funkce spočívá pouze ve vhodném prodloužení velikosti PCR produktu (amplikonu). Sekvence prodlužujícího úseku by měla být navržena s ohledem na ostatní úseky templátovéIn one embodiment, the template DNA is a constant region oligonucleotide starting at the 5 'end of the template DNA where the binding sequence for anchoring the template DNA is located. A poly-A sequence of 15 to 40 nucleotides in length, more often 20 to 25 nucleotides, is usually used for this anchoring. This sequence is important for anchoring the template DNA by hybridization with a biotinylated poly-T sequence and subsequent binding of biotin to streptavidin, which can be bound to any surface, preferably in, for example, PCR plate wells, tubes or magnetic particles. Most preferred is the use of magnetic particles where hybridization approaches optimal hybridization conditions in solution. This attachment of the template DNA before hybridization, optionally with the attached miRNA after hybridization, allows to wash out possible exonuclease inhibitors from the sample. The binding sequence (preferably poly-A sequence) is followed by a sequence of 15 to 30 nucleotides, preferably 18 to 26 nucleotides, to anneal forward primers, followed by an extension region (extension region) whose function is only to appropriately increase the size of the PCR product (amplicon). The extension section sequence should be designed with respect to other template sections

DNA^a to tak, aby nedocházelo ke vzniku sekundárních struktur v rámci celé molekuly DNA.DNA to avoid secondary structures within the entire DNA molecule.

Její délka je závislá na délce ostatních úseků a je volena tak, aby při qRT-PCR vznikal vhodně dlouhý amplikon. Tím končí sekvence konstantního úseku a pokračuje variabilní úsek templátové DNA, který je komplementární sekvencí k stanovované miRNA a zároveň místem, kde při detekci pomocí qRT-PCR nasedá tzv. reverzní primer. Sekvence reverzního primerů je komplementární sekvencí alespoň k části variabilního úseku templátové DNA o délce 15 až 30 nukleotidů, výhodně v rozsahu 18 až 26 nukleotidů.Its length is dependent on the length of the other stretches and is chosen so as to produce a suitably long amplicon during qRT-PCR. This terminates the sequence of the constant region and proceeds with the variable region of the template DNA, which is complementary to the miRNA to be determined and at the same time as the reverse primer when detected by qRT-PCR. The reverse primer sequence is a complementary sequence to at least a portion of the variable region of the template DNA of 15 to 30 nucleotides in length, preferably in the range of 18 to 26 nucleotides.

V jiném provedení je templátovou DNA oligonukleotid, ve kterém je variabilní úsek navržen stejně jako v předchozím případě, ale v konstantním úseku molekuly chybí sekvence pro zakotvení, tj. sekvence pro hybridizaci na zakotvovací oligonukleotid. Na 5'^onci templátové DNA je umístěn biotin^ a je tedy možné ji přímo zakotvit na površích potažených streptavidinem, bez nutnosti hybridizace se zakotvenou poly-T sekvencí. Zbylé úseky molekuly jsou navrženy stejně jako v případě první templátové DNA (viz. výše).In another embodiment, the template DNA is an oligonucleotide in which the variable region is designed as in the previous case, but the constant region of the molecule lacks the anchor sequence, i.e., the sequence for hybridization to the anchor oligonucleotide. Biotin is placed on the 5 'end of the template DNA and can therefore be directly anchored on streptavidin-coated surfaces without the need for hybridization with an anchored poly-T sequence. The remaining regions of the molecule are designed as in the case of the first template DNA (see above).

• · > φ »• ·> φ »

Průkaz známé sekvence templátové DNA a její kvantifikace pomocí qRT-PCR je běžným laboratorním postupem známým odborníkům v oblasti průkazu specifických úseků DNA.Demonstration of a known template DNA sequence and its quantification by qRT-PCR is a conventional laboratory procedure known to those skilled in the art of detecting specific DNA regions.

Výhodou metody podle předloženého vynálezu je, že není nutné miRNA předem ze vzorku izolovat, což celý proces velmi zjednodušuje, zkracuje, snižuje ztráty molekul miRNA, snižuje variabilitu, chybovost a redukuje finanční náročnost.The advantage of the method of the present invention is that it is not necessary to isolate miRNAs from the sample beforehand, which greatly simplifies, shortens, reduces the loss of miRNA molecules, reduces variability, error rate, and reduces cost.

U většiny doposud používaných postupů pro kvantifikaci miRNA, následují po izolaci miRNA enzymatické reakce, které miRNA prodlužují (polyadenylace) a převádějí na cDNA (reverzní transkripce), aby ji bylo možné detekovat pomocí qRT-PCR. Nová metoda tyto enzymatické kroky nevyžaduje a tím dochází k dalšímu zjednodušení a zlevnění metody. Využitím qRT-PCR jako detekční metody dochází ke zvýšení citlivosti této metody ve srovnání s metodami, které využívají mikročipy.In most methods used to quantify miRNAs, isolation of miRNAs is followed by enzymatic reactions that prolong miRNAs (polyadenylation) and convert them to cDNA (reverse transcription) to detect it by qRT-PCR. The new method does not require these enzymatic steps and thus further simplifies and cheaper the method. Using qRT-PCR as a detection method increases the sensitivity of this method compared to methods using microarrays.

Předmětem vynálezu je v jednom provedení způsob detekce miRNA ve vzorku, způsob obsahuje kroky, kdy a) ke vzorku se přidá jednovláknová templátová DNA, která na svém 3'řonci obsahuje variabilní úsek a na svém 5'jkonci obsahuje konstantní úsek, kde variabilní úsek obsahuje sekvenci komplementární k sekvenci miRNA, která má být detekována, konstantní úsek obsahuje úsek pro nasednutí forward primerů, a úsek extenze ležící mezi variabilním úsekem a úsekem pro nasednutí forward primerů; b) detekovaná miRNA se ponechá hybridizovat s templátovou DNA za vzniku hybridní molekuly; c) na templátovou DNA se po hybridizaci působí exonukleázou I, čímž se degraduje nehybridizovaná jednovláknová DNA, přičemž hybridizovaná templátová DNA je k působení exonukleázy I rezistentní; d) užitím qRT-PCR s forward a reverzním primerem, přičemž forward primer má sekvenci shodnou s alespoň částí úseku templátové DNA pro nasednutí forward primerů a reverzní primer má sekvenci komplementární k alespoň části variabilního úseku templátové DNA, se detekuje, případně kvantifikuje templátová DNA rezistentní k působení exonukleázy I, přičemž množství templátové DNA odpovídá množství miRNA přítomné v původním vzorku.In one embodiment, the present invention provides a method for detecting miRNA in a sample, the method comprising the steps of: a) adding a single stranded template DNA to the sample which comprises a variable region at its 3 'end and a constant region at its 5' end; a sequence complementary to the miRNA sequence to be detected, the constant region comprises a forward primer annealing region, and an extension region lying between the variable region and the forward primer annealing region; b) allowing the detected miRNA to hybridize to the template DNA to form a hybrid molecule; c) the template DNA is treated with exonuclease I after hybridization, thereby degrading unhybridized single stranded DNA, wherein the hybridized template DNA is resistant to exonuclease I action; d) using qRT-PCR with a forward and reverse primer, wherein the forward primer has a sequence identical to at least a portion of the template DNA region for annealing the forward primers and the reverse primer has a sequence complementary to at least a portion of the variable region of the template DNA, is detected or quantified to exonuclease I, wherein the amount of template DNA corresponds to the amount of miRNA present in the original sample.

V jiném provedení způsob podle vynálezu dále obsahuje krok, kdy se templátové molekuly imobilizují na povrch, kde povrch je uzpůsoben pro navázání templátové DNA.In another embodiment, the method of the invention further comprises the step of immobilizing the template molecules to a surface, wherein the surface is adapted to bind template DNA.

« 4« * » »·♦ a > · « · » ·· · · · · · * · · ·· • · · · .......«4« * »» ♦ a> «>>>>>>> .... .... .... ....

4 4··· ·· • · · 4 · ·· ······ u4 4 ··· ·· · 4 · ······

Ve výhodném provedení způsobu se užije templátová DNA, která obsahuje na svém 5 [konci značící úsek, výhodně poly-A úsek.In a preferred embodiment of the method, a template DNA is used which comprises at its 5 'end a labeling region, preferably a poly-A region.

OO

V jiném výhodném provedení způspbu se v kroku a) dále přidá značící molekula DNA, která je komplementární ke značícímu úseku a obsahuje navázanou značku, výhodně se přidá molekula poly-T s navázaným biotinem.In another preferred embodiment of the method, in step a), a DNA labeling molecule is additionally added which is complementary to the labeling region and contains the bound label, preferably the biotin-linked poly-T molecule.

V ještě jiném výhodném provedení se v kroku a) dále přidá chaotropní ěinidlo, výhodně GuSCN, ve výsledné koncentraci 0,5 až 8 mol/1, výhodně 1,5 až 4 mol/1, nejvýhodněji 2 mol/1.In yet another preferred embodiment, in step a) a chaotropic agent, preferably GuSCN, is added in a final concentration of 0.5 to 8 mol / l, preferably 1.5 to 4 mol / l, most preferably 2 mol / l.

Při jednom provedení způsobu podle vynálezu je výhodně imobilizační povrch potažen molekulami pro navázání značky templátové DNA, výhodně molekulami streptavidinu.In one embodiment of the method of the invention, the immobilization surface is preferably coated with molecules for binding a template DNA tag, preferably streptavidin molecules.

Imobilizační povrch je výhodně vnitrní povrch jamky titrační/PCR destičky nebo povrch magnetické částice.The immobilization surface is preferably the inner surface of the well of the titration / PCR plate or the surface of the magnetic particle.

Dalším předmětem vynálezu je molekula jednovláknové templátové DNA pro použití při detekci přdxaniTbrě-o V miRNA způsobem výše popsaným, ikteréžiel molekula obsahuje na svém 3 Konci variabilní úsek specifický pro detekovanou miRNA, který obsahuje sekvenci komplementární k sekvenci miRNA, která má být detekována, a na svém 5^onci obsahuje konstantní úsek, který obsahuje úsek pro nasednutí forward primerů a úsek extenze ležící mezi variabilním miRNA-specifickým úsekem a úsekem pro nasednutí forward primerů.Another object of the invention is a single-stranded template DNA molecule for use in detecting the addition of silver-V miRNA as described above, wherein the molecule comprises at its 3 end a variable region specific for the detected miRNA comprising a sequence complementary to the miRNA sequence to be detected; it comprises a constant region comprising a forward primer annealing region and an extension region lying between the variable miRNA-specific region and the forward primer annealing region.

Molekula podle vynálezu výhodně dále obsahuje na svém 5^konci značku, výhodně molekulu pro zakotvení na pevném podkladu, výhodně biotin.The molecule of the invention preferably further comprises at its 5 'end a label, preferably a molecule for anchoring on a solid support, preferably biotin.

V jiném provedení molekula obsahuje na svém 5'líonci značící úsek, výhodně poly-A úsek. AIn another embodiment, the molecule comprises, at its 5 'end, a labeling region, preferably a poly-A region. AND

Výhodná molekula podle vynálezu je molekula, kde úsek pro nasednutí forward primerů je dlouhý 15 až 30 nukleotidů, výhodně 18 až 26 nukleotidů.A preferred molecule of the invention is a molecule wherein the forward primer annealing region is 15 to 30 nucleotides in length, preferably 18 to 26 nucleotides in length.

Výhodná je molekula podle vynálezu, kde úsek extenze je dlouhý 10 až 35, výhodně 18 až 26 nukleotidů.Preferred is a molecule of the invention wherein the extension region is 10 to 35, preferably 18 to 26 nucleotides in length.

V jednom výhodném provedení molekula podle vynálezu obsahuje sekvenci id. č. 1: 5'-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACG ATC ATC AGG AGA CAC T-3 ’.In one preferred embodiment, the molecule of the invention comprises sequence id. No. 1: 5'-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACG ATC AGC AGA CAC T-3 '.

C »C »

V jiném výhodném provedení molekula podle vynálezu obsahuje sekvenci id. č. 2: 5'-Btn-AA AAA CCT TAC CAA TTT GAC CCG TCT GCG -3’.In another preferred embodiment, the molecule of the invention comprises sequence id. No. 2: 5'-Btn-AA AAA CCT TAC CAA TTT GAC CCG TCT GCG -3 '

Podrobnější objasnění a výhody předloženého vynálezu budou odborníkovi zřejmé z následujících příkladů a obrázku.Detailed explanations and advantages of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following examples and figure.

^Pepis obrážku-í^ Pepis Shaper

Obr. 1. Schéma navržené metody detekce, případně kvantifikace miRNA. (1) Detekce/kvantifikace miRNA vyžaduje templátovou DNA unikátního složení, která je tvořena konstantním a variabilním úsekem. Konstantní úsek je tvořen úsekem pro nasednutí forward primerů, úsekem extenze a popřípadě ještě kotvicím úsekem (např. poly-A) pro zakotvení na pevný nosič (např. Btn-poly-T). Variabilní úsek představuje oblast unikátní sekvence, která je komplementární pro miRNA a na kterou se následně váže reverzní primer v průběhu qRT'PCR. (2) Vazba DNA templátu na streptavidin, který může být vázán kovalentně nebo nekovalentně na různé substráty. (3) Efekt exonukleázy I v přítomnosti (A) nebo nepřítomnosti (B) analyzované miRNA. (4) Detekce templátové DNA rezistentní k působení exonukleázy I (v důsledku vazby s miRNA) pomocí qRT-PCR s využitím dvojice oligonukleotidových primerů (forward a reverzní primer). Specifický amplikon se tvoří pouze v případě vazby miRNA na templátovou DNA.Giant. 1. Scheme of the proposed method of detection or quantification of miRNA. (1) The detection / quantification of miRNA requires a template DNA of unique composition, which consists of a constant and a variable region. The constant region is comprised of a forward primer annealing region, an extension region and optionally an anchoring region (eg, poly-A) for anchoring to a solid support (eg, Btn-poly-T). The variable region represents a region of a unique sequence that is complementary to miRNA and to which the reverse primer subsequently binds during qRT'PCR. (2) Binding of the DNA template to streptavidin, which may be covalently or non-covalently bound to various substrates. (3) Effect of exonuclease I in the presence (A) or absence (B) of the analyzed miRNA. (4) Detection of exonuclease I resistant DNA template (due to miRNA binding) by qRT-PCR using a pair of oligonucleotide primers (forward and reverse primer). A specific amplicon is generated only when the miRNA is bound to the template DNA.

Příklady provedení* vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

Princip způsobu kvantifikace miRNA podle předloženého vynálezu je osvětlen na výhodném provedení, které je schematicky znázorněno na obrázku 1. V následujícím experimentu je způsob ověřen stanovením miRNA-238 pomocí templátové DNA 440/238 a magnetických mikročástic potažených streptavidinem.The principle of the miRNA quantification method of the present invention is illustrated in a preferred embodiment, which is schematically illustrated in Figure 1.

-» f- »f

Stručný přehled hlavních kroků zpíisobw.A brief overview of the main steps of the process.

1) hybridizace templátové DNA, obsahující poly-A sekvenci v konstantním úseku a ve variabilním úseku sekvenci pro stanovení miRNA-238, syntetické miRNA-238 a biotinylovaného poly-T oligonukleotidu v hybridizačním roztoku, čímž vznikne biotinylovaná hybridní molekula;1) hybridizing a template DNA comprising a poly-A sequence in the constant region and in the variable region sequence for determining miRNA-238, synthetic miRNA-238, and biotinylated poly-T oligonucleotide in a hybridization solution to form a biotinylated hybrid molecule;

2) příprava magnetických částic potažených streptavidinem;2) preparing streptavidin-coated magnetic particles;

3) navázání biotinylované hybridní molekuly na magnetické částice potažené streptavidinem;3) binding the biotinylated hybrid molecule to streptavidin-coated magnetic particles;

4) promytí částic s navázanou hybridní molekulou;4) washing the particles with bound hybrid molecule;

5) degradace jednořetězcové DNA exonukleázou I;5) single stranded DNA degradation by exonuclease I;

6) separace hybridních molekul od magnetických částic;6) separation of hybrid molecules from magnetic particles;

7) qRT-PCR detekce templátové DNA užitím forward primerů a reverzního primerů7) qRT-PCR detection of template DNA using forward primers and reverse primers

Detailní protokolDetailed protocol

Použitý materiál a vybavení:Material and equipment used:

Syntetické oligonukleotidy:Synthetic oligonucleotides:

miRNA-238: 5’-UUU GUA CUC CGA UGC CAU UCA GA-3’miRNA-238: 5 '-UUU GUA CUC UGA UGC CAU UCA GA-3'

Poly-T-biotin: 5’-TTT TTTTTTTTTTTTTTTTT-3’-biotinPoly-T-biotin: 5´-TTT TTTTTTTTTTTTTTTTT-3´-biotin

Templátová DNA 440/238:Template DNA 440/238:

5'-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACG ATC ATC AGG AGA CAC TCA AAC TTC5'-AAA AAA AAA AAA AAA AAA

TCT AAC TTT CTG AAT GGC ATC GGA GTA CAA A-3’TCT AAC TTT CTG AAT GGC ATC

Primery: Forward 440: 5’-CGA TCA TCA GGA GAC ACT-3’Primers: Forward 440: 5 'CGA TCA GCA GCA ACT-3'

Reverzní 238: 5’-GTA CTC CGATGC CAT TCA G-3’Reverse 238: 5'-GTA CTC CGATGC CAT TCA G-3 '

Roztoky a enzymy:Solutions and enzymes:

z x SSC: 3M NaCI, 300ímM citrát sodný, pH 7,0 » i 1 j * » » · • » » > 9 t 9 • · ·z x SSC: 3M NaCl, 300µM sodium citrate, pH 7.0 »i 1 j

9* ·9 * ·

Hybridizační roztok: 5 x SSC, 0,1% N-lauryl sarkosin, 0,02% SDSHybridization solution: 5 x SSC, 0.1% N-lauryl sarcosine, 0.02% SDS

Promývací roztok: 5 jmM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 ImM EDTA, 1M NaCI tRNA: vodný roztok 2 mg/ml (Sigma, kat. č. R8759), skladován při -20i°CWashing solution: 5 µM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 µM EDTA, 1 M NaCl tRNA: 2 mg / ml aqueous solution (Sigma, Cat. No. R8759), stored at -20 ° C

TP SYBR 2x Master Mix (Top-Bio, kat. č. T605) lOx konc. PCR Blue Buffer (Top-Bio, kat. č. T058)TP SYBR 2x Master Mix (Top-Bio, Cat. No. T605) 10x conc. PCR Blue Buffer (Top-Bio, Cat. No. T058)

T04P2: 2x koncentrovaný vodný roztok obsahující 0,4iM L-trehalozu, 2(M 1,2-propandiol, 2x zT04P2: 2x concentrated aqueous solution containing 0,4iM L-trehalose, 2 (M 1,2-propanediol, 2x z

koncentrovaný Blue buffer, aditiva a stabilizátory Top-Bio provenience.concentrated Blue buffer, additives and stabilizers Top-Bio provenance.

*/* /

Exonukl^za I (Thermo Scientific, Kat. č. EN0581)Exonucleate I (Thermo Scientific, Cat. No. EN0581)

Další materiály:Other materials:

PCR destičky: BioRad plate 96-well s bílými jamkami (HSR 9905)PCR plates: BioRad plate 96-well with white wells (HSR 9905)

Magnetické partikule se streptavidinem (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen)Magnetic particles with streptavidin (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen)

PCR cykler: RealPlex EP Mastercycler (Eppendorf)PCR Cycler: RealPlex EP Mastercycler (Eppendorf)

1) V jamce 96-jamkové polypropylenové destičky pro PCR byl v hybridizačním roztoku smíchán poly-T-biotin (200 fmol) s templátovou DNA 440/238 (100 fmol) a do některých vzorků byla přidána syntetická miRNA-238 (200 fmol). Vzorky DNA a RNA byly ředěny ze zásobních roztoků za přítomnosti nosičové tRNA 100 pg/ml. Finální objem každého vzorku byl 10 μΐ. Vzorky byly inkubovány 1 h při pokojové teplotě. Vzorky bez přidání syntetické miRNA-238 sloužily jako pozitivní a negativní kontroly (DNA, DNA+Exo I - viz tabulka 1).1) In a 96-well polypropylene PCR plate well, poly-T-biotin (200 fmol) was mixed with template DNA 440/238 (100 fmol) in hybridization solution and synthetic miRNA-238 (200 fmol) was added to some samples. DNA and RNA samples were diluted from the stock solutions in the presence of 100 µg / ml carrier tRNA. The final volume of each sample was 10 μΐ. The samples were incubated for 1 hour at room temperature. Samples without the addition of synthetic miRNA-238 served as positive and negative controls (DNA, DNA + Exo I - see Table 1).

2) Během inkubace byly připraveny magnetické partikule s kovalentně navázaným streptavidinem. Potřebné množství (1 μΐ suspenze/vzorek) bylo odebráno, 4x promyto promývacím roztokem, naředěno a naneseno do jamek PCR destičky.2) During the incubation, magnetic particles with covalently bound streptavidin were prepared. The required amount (1 μΐ suspension / sample) was collected, washed 4 times with wash solution, diluted and plated in the wells of the PCR plate.

3) Do jamek s magnetickými partikulemi byl přidán celý objem hybridizovaného vzorku (10 μΐ) a destička byla inkubována 30 min při pokojové teplotě.3) The whole volume of the hybridized sample (10 μΐ) was added to the wells with magnetic particles and the plate was incubated for 30 min at room temperature.

< « « » fF

4) Magnetické partikule byly promyty 2x hybridizačním pufrem a 2x promývacím pufrem. Po přidání promývacího roztoku byl vzorek vždy ponechán 2 až 3 min na magnetickém stojánku před odebráním supernatantu.4) The magnetic beads were washed twice with hybridization buffer and 2x with wash buffer. After addition of the wash solution, the sample was always left for 2-3 minutes on a magnetic rack before the supernatant was collected.

5) Kpromytým partikulím byl přidán roztok exonukleázy I v lx T04P2 pufru (10 U/vzorek, • '0 finální objem 20 μΐ). Vzorky byly inkubovány 60 min při 37 C.5) To the washed particles, a solution of exonuclease I in 1x T04P2 buffer (10 U / sample, final volume 20 μΐ) was added. Samples were incubated for 60 min at 37 ° C.

6) Inaktivace exonuklázy I a separace vzorků od magnetických partikulí byla provedena zahřátím vzorků na po dobu 20 min. Po krátkém stočení, byly vzorky umístěny na magnetickou podložku a 15 μΐ z každého vzorku bylo přeneseno do nové PCR destičky.6) Inactivation of exonuclease I and separation of samples from magnetic particles was performed by heating the samples for 20 min. After a short spin, samples were placed on a magnetic plate and 15 μ 15 of each sample was transferred to a new PCR plate.

7) Detekce nedegradované DNA qRT-PCR: K 15 μΐ vzorku bylo přidáno 15 μΐ Master Mixu obsahujícího T04P2 pufr, příměry (výsledná koncentrace 150 nM), dNTPs (výsledná koncentrace 200 μΜ), Taq DNA polymerázu (1,5 U, výsledná koncentrace 0,05 U/μΙ) a SYBR Green I. Pro qPCR amplifikaci byl použit následný program: 3 min 95j°C, 40x (95^C7) Detection of undegraded DNA qRT-PCR: To 15 μΐ of sample was added 15 μΐ of Master Mix containing T04P2 buffer, primers (150 nM final concentration), dNTPs (200 μΜ final concentration), Taq DNA polymerase (1.5 U, final concentration) 0.05 U / μΙ) and SYBR Green I. The following program was used for qPCR amplification: 3 min 95 ° C, 40x (95 ° C)

10s,593°C 15 s,72°C 10 s).10s, 593 ° C for 15 s, 72 ° C for 10 s).

' Z )' OF )

Metoda qRT-PCR umožňuje kvantifikovat nárůst amplifikovaného fragmentu DNA v reálném čase měřením jeho fluorescence. Výsledky qRT-PCR jsou udávány jako počet cyklů (Ct), které proběhnou, než fluorescence daného vzorku překročí určitou hranici (treshold), která je pro všechny vzorky v daném měření stejná. Čím více DNA ve vzorku je, tím dříve překročí danou hranici a tím nižší hodnotu Ct dosáhne. V tabulce 1 jsou shrnuty výsledky experimentu. Přítomnost miRNA v původním vzorku byla jednoznačně prokázána detekcí templátové DNA. Je zřejmé, že miRNA se vázala na templátovou DNA a ochránila ji tak před degradací exonukleázou I.The qRT-PCR method allows quantification of the amplified DNA fragment growth in real time by measuring its fluorescence. QRT-PCR results are reported as the number of cycles (Ct) that occur before the fluorescence of a given sample exceeds a certain threshold (treshold), which is the same for all samples in a given measurement. The more DNA there is in the sample, the sooner it exceeds the threshold and the lower the Ct value. Table 1 summarizes the results of the experiment. The presence of miRNA in the original sample was unequivocally demonstrated by the detection of template DNA. Obviously, miRNA bound to template DNA and protected it from exonuclease I degradation.

» 9 • · · ·« · · · * 9 í» · ·» ti » ··»9 • ·« 9 9 9 í ti ti

Tabulka 1. Výsledky stanovení miRNA-238 udávané jako Ct hodnota vzorků: samotné templátové DNA (DNA), samotné templátové DNA po ošetření exonukleázou I (DNA + Exol), templátové DNA s navázanou miRNA po ošetření exonukleázou I (DNA + RNA + Exol).Table 1. Results of miRNA-238 assay reported as Ct value of samples: template DNA (DNA) alone, template DNA after exonuclease I treatment (DNA + Exol), miRNA-coupled template DNA after exonuclease I treatment (DNA + RNA + Exol) .

DNA 440/238 DNA 440/238 Vzorky: Samples: Ct Ct Průměr Diameter St. odchylka St. deviation DNA DNA 4,04 4.04 4,10 4.10 4,07 4.07 0,04 0.04 DNA + Exol DNA + Exol 13,16 13.16 13,08 13.08 13,12 13.12 0,06 0.06 DNA + miRNA + Exol DNA + miRNA + Exol 5,08 5.08 4,96 4.96 5,02 5.02 0,08 0.08

Příklad 2Example 2

Stanovení miRNA-238 pomocí templátové DNA 440/238 v absenci a přítomnosti 2M guanidinu thiokyanátu (GuSCN).Determination of miRNA-238 using template DNA 440/238 in the absence and presence of 2M guanidine thiocyanate (GuSCN).

Tento výhodný postup využívá poznatku, že RNA hybridizuje s templátovou DNA za přítomnosti chaotropních činidel (např. GuSCN), které jsou inhibitory RNáz. Tento postup je možné použít pro kvantifikaci miRNA v buňkách (Kaabache et al., 1995).This preferred approach utilizes the finding that RNA hybridizes to template DNA in the presence of chaotropic agents (eg, GuSCN) that are RNase inhibitors. This procedure can be used to quantify miRNAs in cells (Kaabache et al., 1995).

Postup kvantifikace miRNA je shodný s postupem v předchozím příkladu s výjimkou kroků 1 a 4. V kroku 1 probíhá hybridizace v hybridizačním roztoku anebo v T04P2 pufru s nebo bez přídavku GuSCN. V kroku 4 byly partikule promyty 3x TE pufrem.The procedure for miRNA quantification is the same as in the previous example except steps 1 and 4. In step 1, hybridization is performed in hybridization solution or in T04P2 buffer with or without the addition of GuSCN. In step 4, the particles were washed 3 times with TE buffer.

Byly použity stejné oligonukleotidy, enzymy, zařízení a roztoky jako v příkladu 1, navíc byl užit TE pufr:The same oligonucleotides, enzymes, equipment and solutions were used as in Example 1, in addition TE buffer was used:

lx TE pufr: lojmM Tris/HCl (pH 7,5), lmM EDTA1x TE buffer: 10 mM Tris / HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA

Detailní protokol (pouze kroky odlišné od příkladu 1):Detailed protocol (only steps different from example 1):

1) V jamce PCR destičky byl v hybridizačním roztoku nebo v T04P2 pufru s nebo bez GuSCN (výsledná konc. 2M) smíchán poly-T-biotin (200 fmol) s templátovou DNA 440/238 (100 fmol) a do některých vzorků byla přidána syntetická miRNA-238 (200 fmol). Finální objem byl 10 μΐ. Vzorky byly inkubovány 1,5 h při pokojové teplotě. Vzorky DNA a RNA byly ředěny ze zásobních roztoků za přítomnosti nosičové tRNA 100 pg/ml.1) Poly-T-biotin (200 fmol) was mixed with template DNA 440/238 (100 fmol) in a hybridization solution or in T04P2 buffer with or without GuSCN (final conc. 2M) in the well of the PCR plate and added to some samples synthetic miRNA-238 (200 fmol). The final volume was 10 μΐ. The samples were incubated for 1.5 hours at room temperature. DNA and RNA samples were diluted from the stock solutions in the presence of 100 µg / ml carrier tRNA.

4) Magnetické partikule byly promyty od nenavázaného materiálu 3x TE pufrem; každé promytí spočívalo v přidání promývacího roztoku a inkubaci vzorku 2 až 3 min na magnetickém stojánku před odebráním supematantu.4) Magnetic beads were washed from unbound material 3x with TE buffer; each wash consisted of adding the wash solution and incubating the sample for 2 to 3 minutes on a magnetic rack before removing the supernatant.

V tabulce 2 jsou shrnuty výsledky experimentu. Přítomnost miRNA v původním vzorku (T04P2 pufru nebo hybridizačním roztoku) byla jednoznačně prokázána detekcí templátové DNA. Je zřejmé, že miRNA se vázala na templátovou DNA a ochránila ji tak před degradací exonukleázou I i za přítomnosti 2M GuSCN.Table 2 summarizes the results of the experiment. The presence of miRNA in the original sample (T04P2 buffer or hybridization solution) was clearly demonstrated by the detection of template DNA. Obviously, miRNA bound to template DNA and protected it from exonuclease I degradation even in the presence of 2M GuSCN.

Tabulka 2. Výsledky stanovení miRNA-238 udávané jako Ct hodnota vzorků: samotné templátové DNA (DNA), samotné templátové DNA po ošetření exonukleázou I (DNA + Exol), templátové DNA s navázanou miRNA po ošetření exonukleázou I (DNA + RNA + Exol).Table 2. Results of miRNA-238 assay reported as Ct value of samples: template DNA (DNA) alone, template DNA after exonuclease I treatment (DNA + Exol), miRNA-coupled template DNA after exonuclease I treatment (DNA + RNA + Exol) .

dna 440/238 dna 440/238 Hybridizační roztok Hybridization solution T04P2 pufr T04P2 buffer GuSCN GuSCN - - 2M GuSCN 2M GuSCN - - 2M GuSCN 2M GuSCN Vzorky Samples Ct průměr Ct average Stand. odchylka Stand. deviation Ct průměr Ct average Stand. odchylka Stand. deviation Ct průměr Ct average Stand. odchylka Stand. deviation Ct průměr Ct average Stand. odchylka Stand. deviation DNA DNA 4,74 4.74 1,00 1.00 4,26 4.26 0,38 0.38 3,75 3.75 0,28 0.28 3,91 3.91 0,23 0.23 DNA/Exol DNA / Exol 14,41 14.41 0,68 0.68 11,24 11.24 0,49 0.49 10,13 10.13 0,65 0.65 11,97 11.97 0,62 0.62 DNA/RNA/Exol DNA / RNA / Exol 3,74 3.74 0,45 0.45 3,59 3.59 0,16 0.16 3,39 3.39 0,36 0.36 4,32 4.32 0,83 0.83

-i ·» · * » · · · · * » · · · »··· ♦♦·»»· ·· > a · · * ·♦ ₄ » j » * » 99 · a * »» ·-i · »·» · · · · »· · ·» · ··· ♦♦ »» · ··> a · · · * ♦ ₄ »j» »· and 99» »·

Příklad 3Example 3

Stanovení miRNA-122 v T04P2 pufru nebo v séru pomocí templátové DNA BtnAnchor. Vzorky byly analyzovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti 2M guanidinu thiokyanátu (GuSCN). Tento výhodný postup využívá poznatku, že RNA hybridizuje s templátovou DNA za přítomnosti chaotropních činidel (např. GuSCN), které jsou inhibitory RNáz a je možno je použít pro solubilizaci buněk (Kaabache et al., 1995). GuSCN přispívá také k rozrušení komplexů nukleových kyselin a proteinů. V tomto stanovení jsme využili templátovou DNA, na které je přímo konjugovaná biotinová značka., a není tedy nutné přidávat biotinylovaný poly-T oligonukleotid.Determination of miRNA-122 in T04P2 buffer or serum using BtnAnchor template DNA. Samples were analyzed in the presence or absence of 2M guanidine thiocyanate (GuSCN). This preferred approach utilizes the finding that RNA hybridizes to template DNA in the presence of chaotropic agents (eg, GuSCN) that are RNase inhibitors and can be used to solubilize cells (Kaabache et al., 1995). GuSCN also contributes to the breakdown of nucleic acid and protein complexes. In this assay, we used template DNA to which the biotin label is directly conjugated, and there is no need to add a biotinylated poly-T oligonucleotide.

Postup byl shodný s postupem v příkladu 2 s výjimkou kroků 1 a posledního kroku týkajícího se qPCR detekce. V kroku 1 probíhala hybridizace v T04P2 pufru (prostředí ve kterém již byla provedena úspěšná hybridizace) nebo ve vzorku séra s nebo bez přídavku GuSCN (finální koncentrace 2M). Jako vzorek séra bylo použito FBS (GE Healthcare). Byly použity stejné enzymy, zařízení a roztoky jako v příkladu 2.The procedure was the same as in Example 2 except for steps 1 and the last step regarding qPCR detection. In step 1, hybridization was performed in T04P2 buffer (medium in which successful hybridization had already been performed) or in a serum sample with or without the addition of GuSCN (2M final concentration). FBS (GE Healthcare) was used as a serum sample. The same enzymes, equipment and solutions were used as in Example 2.

Syntetické oligonukleotidy:Synthetic oligonucleotides:

miRNA-122: 5 '-UGG AGU GUG ACA AUG GUG UUU G-3'miRNA-122: 5 '-UGG AU GUG ACA AUG AUU G-3'

Templátová DNA BtnAnchor:BtnAnchor template DNA:

'-Btn-AA AAA CCT TAC CAA TTT GAC CCG TCT GCG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG CG AGC AAA CAC CAT TGT CAC ACT CCA-3''-Btn-AA AAA CCT TAC CAA TTT GAC CCG TCT GCG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG ACTG CG AGC

Primery: Forward TPL2: 5 '-CCT TAC CAA TTT GAC CCG TCT GCG- 3'Primers: Forward TPL2: 5 'CCT TAC CAA TTT GAC CCG TCT GCG-3'

Reverzní TPL2: 5 -TGG AGT GTG ACA ATG GTG TTT GCT CG- 3'Reverse TPL2: 5 -GG AGT GTG ACA ATG GTG TTT GCT CG-3 '

Detailní protokol (kroky odlišné od příkladu 2):Detailed protocol (steps different from example 2):

1) Do jamek PCR destičky byla do T04P2 pufru nebo do séra +/- GuSCN (výsledná konc. 2M) přidáno definované množství templátové DNA BtnAnchor (100 fmol). Do vybraných vzorků byla přidána syntetická miRNA-122 (200 fmol). Finální objem byl 10 μΐ. Vzorky byly inkubovány 1 h při pokojové teplotě. Vzorky DNA a RNA byly ředěny ze zásobních roztoků » A j » * > » • 4 4 4 · · · · | 4 4 4«1) A defined amount of BtnAnchor template DNA (100 fmol) was added to the wells of the PCR plate in T04P2 buffer or serum +/- GuSCN (final conc. 2M). Synthetic miRNA-122 (200 fmol) was added to selected samples. The final volume was 10 μΐ. The samples were incubated for 1 hour at room temperature. DNA and RNA samples were diluted from stock solutions »A j» 4 4 4 · · · · | 4 4 4 «

4 4 4 · »»>»»·»» »»

4 4» · »4 4 »

·> »4 » 4· 4 »4

S »· ·· i í 9 · za přítomnosti nosičové tRNA 100 pg/ml. Při qPCR detekci byl použit následující program: 3 min 95 °C 40x (95 °C 15 s^55 °C 15 s^72 °C 8 s) a specifické primery (viz. výše). Složení reakční směsi bylo stejné jako v předchozích příkladech.In the presence of a carrier tRNA of 100 pg / ml. For qPCR detection, the following program was used: 3 min 95 ° C 40x (95 ° C 15 sec 55 55 ° C 15 sec 72 72 ° C 8 sec) and specific primers (see above). The composition of the reaction mixture was the same as in the previous examples.

V tabulce 3 jsou shrnuty výsledky experimentu. Přítomnost miRNA v původním vzorku byla jednoznačně prokázána detekcí templátové DNA. Je zřejmé, že miRNA se vázala na biotinylovanou templátovou DNA a ochránila ji tak před degradací exonukleázou I jak v přítomnosti T04P2 pufru, tak i ve vzorku séra za přítomnosti 2M GuSCN. Naopak ve vzorku séra bez GuSCN templátová DNA zřejmě nehybridizovala s miRNA a následně došlo k její degradaci exonuklázou I.Table 3 summarizes the results of the experiment. The presence of miRNA in the original sample was unequivocally demonstrated by the detection of template DNA. Obviously, miRNA bound to biotinylated template DNA and protected it from exonuclease I degradation both in the presence of T04P2 buffer and in the serum sample in the presence of 2M GuSCN. In contrast, in a serum sample without GuSCN, the template DNA apparently did not hybridize to miRNA and subsequently degraded by exonuclease I.

Tabulka 3. Výsledky stanovení miRNA-122 udávané jako Ct hodnota vzorků: samotné templátové DNA (DNA), samotné templátové DNA po ošetření exonukleázou I (DNA + Exol), templátové DNA s navázanou miRNA po ošetření exonukleázou I (DNA + RNA + Exol).Table 3. Results of miRNA-122 assay reported as Ct value of samples: template DNA (DNA) alone, template DNA after exonuclease I treatment (DNA + Exol), miRNA-coupled template DNA after exonuclease I treatment (DNA + RNA + Exol) .

BtnAnchor BtnAnchor T04P2 pufr T04P2 buffer FBS FBS FBS/2M GuSCN FBS / 2M GuSCN Vzorky Samples Ct průměr Ct average Stand. odchylka Stand. deviation Ct průměr Ct average Stand. odchylka Stand. deviation Ct průměr Ct average Stand. odchylka Stand. deviation DNA DNA 3,09 3.09 0,05 0.05 4,78 4.78 0,38 0.38 3,45 3.45 0,06 0.06 DNA/Exol DNA / Exol 8,91 8.91 0,06 0.06 11,00 11.00 0,37 0.37 10,02 10,02 0,37 0.37 DNA/RNA/Exol DNA / RNA / Exol 3,90 3.90 0,58 0.58 10,59 10.59 0,54 0.54 4,17 4.17 0,49 0.49

Výzkum, který byl podkladem pro vytvoření vynálezu, byl částečně podpořen dotací Technologické agentury České republiky na řešení projektu č. TH01010244 s názvem MikroRNA biomarkery - nové metody kvantifikace.The research underlying the invention was partially supported by a grant from the Technology Agency of the Czech Republic for the project No. TH01010244 entitled MicroRNA Biomarkers - New Quantification Methods.

Seznam sekvencíSequence list

SEQUENCE LISTINGSEQUENCE LISTING

<110> <110> Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i., Praha, CZ Top-Bío, s.r.o., Praha, CZ Institute of Molecular Genetics of AS CR, v.v.i., Prague, CZ Top-Bío, sro, Praha, CZ <120> <120> Způsob detekce specifických mikroRNA pomocí templátové DNA a molekula templátové DNA pro použití při tomto způsobu A method for detecting specific microRNAs using template DNA and a template DNA molecule for use in the method <130> <130> P-0125-CZ P-0125-GB <160> <160> 2 2 <170> <170> Patentln version 3.5 3.5 <210> <210> 1 1 <211> <211> 40 40 <212> <212> DNA DNA <213> <213> syntetická molekula synthetic molecule <400> <400> 1 1

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacgatcatc aggagacactaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacgatcatc aggagacact

<210> <210> 2 2 <211> <211> 29 29 <212> <212> DNA DNA <213> <213> syntetická molekula synthetic molecule <223> <223> molekula biotinylovaná(Btn)na 5'konci a biotinylated (Btn) molecule at the 5 'end <400> <400> 2 2

Btn-aaaaacctta ccaatttgac ccgtctgcg • >» 4 3 » 4* • · ♦ ♦ · · · « · · · »· * » · * » ·»;«>· · · ·· • ·9 » * · * · 4·Btn-aaaaacctta ccaatttgac ccgtctgcg 4 3 4 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 9 10 ·

Seznam citované literaturyList of references cited

1. Ambros, V., 2001. microRNAs: tiny regulators with great potential. Cell 107, 823-826.1. Ambros, V., 2001. microRNAs: tiny regulators with great potential. Cell 107: 823-826.

2. Balcells, I., Cirera, S., Busk, P.K., 2011. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 11, 70.2. Balcells, I., Cirera, S., Busk, P.K., 2011. Specific and sensitive quantitative RT-PCR of miRNAs with DNA primers. BMC Biotechnol. 11, 70.

3. Bartel, D.P., 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116, 281-297.3. Bartel, D.P., 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 281-297.

4. Castoldi, M., Schmidt, S., Beneš, V., Hentze, M.W., Muckenthaler, M.U., 2008. miChip: an array-based method for microRNA expression profíling using locked nucleic acid capture probes. Nat. Protoč. 3, 321-329.4. Castoldi, M., Schmidt, S., Benes, V., Hentze, M.W., Muckenthaler, M.U., 2008. miChip: an array-based method for microRNA expression profiling using locked nucleic acid capture probes. Nat. Protoč. 3, 321-329.

5. Chen, C., Ridzon, D.A., Broomer, A.J., Zhou, Z., Lee, D.H., Nguyen, J.T., Barbisin, M., Xu, N.L., Mahuvakar, V.R., Andersen, M.R., Lao, K.Q., Livak, K.J., Guegler, K.J.,Chen, C., Ridzon, DA, Broomer, AJ, Zhou, Z., Lee, DH, Nguyen, JT, Barbisin, M., Xu, NL, Mahuvakar, VR, Andersen, MR, Lao, KQ, Livak , KJ, Guegler, KJ

2005. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, el79.2005. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, el79.

6. Fu, H.J., Zhu, J., Yang, M., Zhang, Z.Y., Tie, Y., Jiang, H., Sun, Z.X., Zheng, X.F.,Fu, H.J., Zhu, J., Yang, M., Zhang, Z.Y., Tie, Y., Jiang, H., Sun, Z.X., Zheng, X.F.,

2006. A novel method to monitor the expression of microRNAs. Mol. Biotechnol. 32, 197-204.2006. A novel method to monitor the expression of microRNAs. Mol. Biotechnol. 32, 197-204.

7. He, L., Hannon, G.J., 2004. MicroRNAs: smáli RNAs with a big role in gene regulation. Nat. Rev. Genet. 5, 522-531.7. He, L., Hannon, G.J., 2004. MicroRNAs: laugh RNAs with a large role in gene regulation. Nat. Roar. Genet. 5, 522-531.

8. Kaabache, T., Barraud, B., Feldmann, G., Bernuau, D., Lardeux, B., 1995. Direct solution hybridization of guanidine thiocyanate-solubilized cells for quantitation of mRNAs in hepatocytes. Anal. Biochem. 232, 225-230.8. Kaabache, T., Barraud, B., Feldmann, G., Bernuau, D., Lardeux, B., 1995. Direct solution hybridization of guanidine thiocyanate-solubilized cells for quantitation of mRNAs in hepatocytes. Anal. Biochem. 232, 225-230.

9. Lee, R.C., Ambros, V., 2001. An extensive class of smáli RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864.Lee, R.C., Ambros, V., 2001. An extensive class of laughs RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294: 862-864.

10. Lewis, B.P., Burge, C.B., Bartel, D.P., 2005. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 120, 15-20.10. Lewis, B.P., Burge, C.B., Bartel, D.P., 2005. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 120, 15-20.

11. Lu, J., Getz, G., Miska, E.A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., Sweet-Cordero, A., Ebert, B.L., Mak, R.H., Ferrando, A.A., Downing, J.R., Jacks, T., Horvitz, H.R., Golub, T.R., 2005. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nátuře. 435, 834-838.11. Lu, J., Getz, G., Bowl, EA, Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., Sweet-Cordero, A., Ebert, BL, Mak, RH, Ferrando, AA, Downing, JR, Jacks, T., Horvitz, HR, Golub, TR, 2005. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838.

12. Meyer, S.U., Pfaffl, M.W., Ulbrich, S.E., 2010. Normalization strategies for microRNA profíling experiments: a 'normál' way to a hidden layer of complexity? Biotechnol. Lett. 32, 1777-1788.12. Meyer, S.U., Pfaffl, M.W., Ulbrich, S.E., 2010. Normalization strategies for microRNA profiling experiments: a 'normal' way to a hidden layer of complexity? Biotechnol. Lett. 32, 1777-1788.

13. Mitchell, P.S., Parkin, R.K., Kroh, E.M., Fritz, B.R., Wyman, S.K., PogosovaAgadjanyan, E.L., Peterson, A., Noteboom, J., O'Briant, K.C., Allen, A., Lin, D.W., Urban, N., Drescher, C.W., Knudsen, B.S., Stirewalt, D.L., Gentleman, R., Vessella, β ·Mitchell, Parkin, RK, Kroh, EM, Fritz, BR, Wyman, SK, PogosovaAgadjanyan, EL, Peterson, A., Noteboom, J., O'Briant, KC, Allen, A., Lin, DW , Urban, N., Drescher, Knudsen, BS, Stirewalt, DL, Gentleman, R., Vessella, β ·

R.L., Nelson, P.S., Martin, D.B., Tewari, M., 2008. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A 105, 1051310518.R.L., Nelson, P.S., Martin, D. B., Tewari, M., 2008. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Why. Nati. Acad. Sci. U.S. 105, 1051310518.

14. Nuovo, G., Lee, E.J., Lawler, S., Godlewski, J., Schmittgen, T., 2009. In šitu detection of mature microRNAs by labeled extension on ultramer templates. BioTechniques 46, 115-126.14. Nuovo, G., Lee, E.J., Lawler, S., Godlewski, J., Schmittgen, T., 2009. In the detection of mature microRNAs by labeled extension on ultramer templates. BioTechniques 46, 115-126.

15. Raymond, C.K., Roberts, B.S., Garrett-Engele, P., Lim, L.P., Johnson, J.M., 2005. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744.Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J.M., 2005. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744.

16. Schetter, A.J., Leung, S.Y., Sohn, J.J., Zanetti, K.A., Bowman, E.D., Yanaihara, N., Yuen, S.T., Chán, T.L., Kwong, D.L., Au, G.K., Liu, C.G., Calin, G.A., Croce, C.M., Harris, C.C., 2008. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA. 299, 425-436.16. Schetter, AJ, Leung, SY, Sohn, JJ, Zanetti, KA, Bowman, ED, Yanaihara, N., Yuen, ST, Khan, TL, Kwong, DL, Au, GK, Liu, CG, Calin, GA , Croce, CM, Harris, CC, 2008. MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. PIT. 299, 425-436.

17. Takamizawa, J., Konishi, H., Yanagisawa, K., Tomida, S., Osada, H., Endoh, H., Háráno, T., Yatabe, Y., Nagino, M., Nimura, Y., Mitsudomi, T., Takahashi, T., 2004. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res. 64, 3753-3756.Takamizawa, J., Konishi, H., Yanagisawa, K., Tomida, S., Settlement, H., Endoh, H., Haran, T., Yatabe, Y., Nagino, M., Nimura, Y ., Mitsudomi, T., Takahashi, T., 2004. Reduced expression of let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res. 64, 3753-3756.

18. Valoczi, A., Homyik, C., Varga, N., Burgyan, J., Kauppinen, S., Havelda, Z., 2004. Sensitive and specifíc detection of microRNAs by northem blot analysis using LNAmodified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, el75.18. Valoczi, A., Homyik, C., Varga, N., Burgyan, J., Kauppinen, S., Havelda, Z., 2004. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNAmodified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, el75.

19. Vasudevan, S., Tong, Y., Steitz, J.A., 2007. Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation. Science. 318, 1931-1934.19. Vasudevan, S., Tong, Y., Steitz, J.A., 2007. Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation. Science. 318, 1931-1934.

20. Wang, J., Chen, J., Sen, S., 2016. MicroRNA as Biomarkers and Diagnostics. J. Cell Physiol. 231,25-30.20. Wang, J., Chen, J., Sen, S., 2016. MicroRNA Inc. Biomarkers and Diagnostics. J. Cell Physiol. 231,25-30.

Claims (15)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Způsob detekce miRNA^vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdyWhat is claimed is: 1. A method for detecting miRNAs comprising the steps of: a) ke vzorku se přidá jednovláknová templátová DNA, která na svém 3Áonci obsahuje y 4 variabilní úsek a na svém 5'Konci obsahuje konstantní úsek, kde variabilní úsek obsahuje sekvenci komplementární k sekvenci miRNA, která má být detekována, a konstantní úsek obsahuje úsek pro nasednutí forward primerů a úsek extenze ležící mezi variabilním úsekem a úsekem pro nasednutí forward primerů;(a) a single stranded template DNA is added to the sample which contains a γ 4 variable region at its 3 'end and a 5' end containing a constant region, wherein the variable region contains a sequence complementary to the miRNA sequence to be detected, and forward primer annealing and an extension region lying between the variable region and the forward primer annealing region; b) detekovaná miRNA se ponechá hybridizovat s templátovou DNA za vzniku hybridní molekuly;b) allowing the detected miRNA to hybridize to the template DNA to form a hybrid molecule; c) na templátovou DNA se po hybridizaci působí exonukleázou I, čímž se degraduje nehybridizovaná jednovláknová DNA, přičemž hybridizovaná templátová DNA je k působení exonukleázy I rezistentní;c) the template DNA is treated with exonuclease I after hybridization, thereby degrading unhybridized single stranded DNA, wherein the hybridized template DNA is resistant to exonuclease I action; d) užitím qRT-PCR s forward a reverzním primerem, přičemž forward primer má sekvenci shodnou s alespoň částí úseku templátové DNA pro nasednutí forward primerů a reverzní primer má sekvenci komplementární k alespoň části variabilního úseku templátové DNA, se detekuje, případně kvantifikuje templátová DNA rezistentní k působení exonukleázy I, přičemž množství templátové DNA odpovídá množství miRNA přítomné v původním vzorku.d) using qRT-PCR with a forward and reverse primer, wherein the forward primer has a sequence identical to at least a portion of the template DNA region for annealing the forward primers and the reverse primer has a sequence complementary to at least a portion of the variable region of the template DNA, is detected or quantified to exonuclease I, wherein the amount of template DNA corresponds to the amount of miRNA present in the original sample. 2. Způsob podle nároku 1^ vyznačující se tím, že způsob dále obsahuje krok, kdy se templátové molekuly imobilizují na povrch, kde povrch je uzpůsoben pro navázání templátové DNA.The method of claim 1, wherein the method further comprises the step of immobilizing template molecules to a surface, wherein the surface is adapted to bind template DNA. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2^vyznačující se tím, že templátová DNA dále obsahuje na svém 5 'konci značku, výhodně biotin.Method according to claim 1 or 2, characterized in that the template DNA further comprises a tag at its 5 'end, preferably biotin. 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2/vyznačující se tím, že templátová DNA obsahuje na svém 5 '^onci značící úsek, výhodně póly-A úsek.Method according to claim 1 or 2, characterized in that the template DNA comprises at its 5 'end a labeling region, preferably a poles-A region. Λ a 4 í «4 a 4 í « 5. Způsob podle kteréhokoliv nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že v kroku a) se dále přidá značící molekula DNA, která je komplementární ke značícímu úseku a obsahuje navázanou značku, výhodně se přidá molekula poly-T s navázaným biotinem.Method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that, in step a), a DNA labeling molecule that is complementary to the labeling region and contains the bound label is further added, preferably a poly-T molecule with biotin bound is added. 6. Způsob podle kteréhokoliv nároku 1 až 5 vyznačující se tím, že v kroku a) se dále přidá chaotropní činidlo, výhodně GuSCN, ve výsledné koncentraci 0,5 až 8 mol/l, výhodně 1,5 až 4 mol/l, nejvýhodněji 2 mol/l.Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that in step a) a chaotropic agent, preferably GuSCN, is added in a final concentration of 0.5 to 8 mol / l, preferably 1.5 to 4 mol / l, most preferably 2 mol / l. 7.7. Způsob podle kteréhokoliv nároku 2 až 6^ vyznačující se tím, že imobilizační povrch je potažen molekulami pro navázání značky templátové DNA, výhodně molekulami streptavidinu.The method according to any one of claims 2 to 6, characterized in that the immobilization surface is coated with template DNA binding molecules, preferably streptavidin molecules. 8. Způsob podle kteréhokoliv nároku 2 až 7 vyznačující se tím, že imobilizační povrch je vnitřní povrch jamky titrační/PCR destičky nebo povrch magnetické částice.The method of any one of claims 2 to 7, wherein the immobilization surface is the inner surface of the titration / PCR plate well or the surface of the magnetic particle. 9. Molekula jednovláknové templátové DNA pro použití při způsobu detekce miRNA podle prtczmf y nároku l,|kteřá2te( molekula obsahuje na svém 3'konci variabilní úsek specifický pro detekovanou miRNA, který obsahuje sekvenci komplementární k sekvenci miRNA, která má být detekována, a na svém 5jconci obsahuje konstantní úsek, který obsahuje úsek pro nasednutí forward primerů a úsek extenze ležící mezi variabilním miRNA-specifickým úsekem a úsekem pro nasednutí forward primerů.A single-stranded template DNA molecule for use in a method for detecting miRNAs according to claim 1, wherein the molecule comprises at its 3 'end a variable region specific for the detected miRNA, comprising a sequence complementary to the miRNA sequence to be detected, and it comprises a constant region which comprises a forward primer annealing region and an extension region lying between the variable miRNA-specific region and the forward primer annealing region. 10. Molekula jednovláknové templátové DNA podle nároku 9, která dále obsahuje na svém 5 Jconci značku, výhodně molekulu pro zakotvení na pevném podkladu, výhodně biotin.The single-stranded template DNA molecule of claim 9, further comprising a label at its 5 Jconci, preferably a solid-anchoring molecule, preferably biotin. AAND 11. Molekula jednovláknové templátové DNA podle nároku 9, která dále obsahuje na svém 5'konci značící úsek, výhodně póly-A úsek.The single-stranded template DNA molecule of claim 9, further comprising a 5 'end of the labeling region, preferably a poles-A region. AAND 12. Molekula jednovláknové templátové DNA podle kteréhokoliv nároku 9 až 11, kde úsek pro nasednutí forward primerů je dlouhý 15 až 30 nukleotidů, výhodně 18 až 26 nukleotidů.The single-stranded template DNA molecule of any one of claims 9 to 11, wherein the forward primer annealing region is 15 to 30 nucleotides in length, preferably 18 to 26 nucleotides in length. • « · a ·· · • · · *· · » e « · · · · · > 4 »· <> « «» · * > » · · * · * · aa· •» · · • ·· « ··«· 4 4 4 4 4 ·> 4 4 a a 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ·· 9 4 «« ·9 4 «« · 13. Molekula jednovláknové templátové DNA podle kteréhokoliv nároku 9 až 11, kde úsek extenze je dlouhý 10 až 35, výhodně 18 až 26 nukleotidů.The single-stranded template DNA molecule of any one of claims 9 to 11, wherein the extension region is 10 to 35, preferably 18 to 26 nucleotides in length. 14. Molekula jednovláknové templátové DNA podle kteréhokoliv nároku 9 až 13, která obsahuje sekvenci id. č. 1: 5'-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACG ATC ATC AGG AGA CAC T-3’.The single-stranded template DNA molecule of any one of claims 9 to 13, comprising the sequence of SEQ ID NO: 1. No. 1: 5'-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ACG ATC AGC AGA CAC T-3 '. 15. Molekula jednovláknové templátové DNA podle kteréhokoliv nároku 9 až 13, která obsahuje sekvenci id. č. 2: 5'-Btn-AA AAA CCT TAC CAA TTT GAC CCG TCT GCG-3’.The single-stranded template DNA molecule of any one of claims 9 to 13, comprising the sequence of SEQ ID NO: 1. No. 2: 5'-Btn-AA AAA CCT TAC CAA TTT GAC CCG TCT GCG-3 '