CZ201523A3 - Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí - Google Patents
Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí Download PDFInfo
- Publication number
- CZ201523A3 CZ201523A3 CZ2015-23A CZ201523A CZ201523A3 CZ 201523 A3 CZ201523 A3 CZ 201523A3 CZ 201523 A CZ201523 A CZ 201523A CZ 201523 A3 CZ201523 A3 CZ 201523A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- preparation
- dual
- microbial
- microbiome
- component
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 313
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 185
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 title claims abstract description 141
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims description 58
- 230000007774 longterm Effects 0.000 title claims description 28
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 title claims description 26
- 230000001629 suppression Effects 0.000 title claims description 17
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 87
- 241000131360 Pythium oligandrum Species 0.000 claims abstract description 86
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 83
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000190882 Capnocytophaga sputigena Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 7
- 244000005702 human microbiome Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000829 suppository Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 30
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 23
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 claims description 13
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 claims description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 244000005714 skin microbiome Species 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 4
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 claims description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 claims 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 abstract description 11
- 239000013011 aqueous formulation Substances 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 84
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 73
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 46
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 35
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 35
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 34
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 32
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 31
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 29
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 29
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 26
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 23
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 22
- 241000233639 Pythium Species 0.000 description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 22
- 241000039796 Pythia Species 0.000 description 20
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 20
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 20
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 19
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 17
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 17
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 17
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 17
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 17
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 16
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 15
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 14
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 14
- 241001480043 Arthrodermataceae Species 0.000 description 13
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 13
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 230000037304 dermatophytes Effects 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000005830 Pythium oligandrum M1 Substances 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 10
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 9
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 9
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 9
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 206010012504 Dermatophytosis Diseases 0.000 description 8
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000006787 czapek-dox agar Substances 0.000 description 8
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 8
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 8
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 8
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 8
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 241001460074 Microsporum distortum Species 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 6
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 6
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 6
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 5
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 5
- 241000122973 Stenotrophomonas maltophilia Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 5
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229960004022 clotrimazole Drugs 0.000 description 5
- VNFPBHJOKIVQEB-UHFFFAOYSA-N clotrimazole Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(N1C=NC=C1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 VNFPBHJOKIVQEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000007938 effervescent tablet Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 208000007565 gingivitis Diseases 0.000 description 5
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 5
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 4
- 241001459572 Trichophyton interdigitale Species 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 4
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 4
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 description 3
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 3
- 241001045773 Trichophyton erinacei Species 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 3
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 2
- 241000190890 Capnocytophaga Species 0.000 description 2
- 235000007866 Chamaemelum nobile Nutrition 0.000 description 2
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 208000007163 Dermatomycoses Diseases 0.000 description 2
- 241000588878 Eikenella corrodens Species 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 244000042664 Matricaria chamomilla Species 0.000 description 2
- 235000007232 Matricaria chamomilla Nutrition 0.000 description 2
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001480037 Microsporum Species 0.000 description 2
- 241000893980 Microsporum canis Species 0.000 description 2
- 241000893974 Nannizzia fulva Species 0.000 description 2
- 208000010195 Onychomycosis Diseases 0.000 description 2
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 2
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 241000194026 Streptococcus gordonii Species 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 241000223238 Trichophyton Species 0.000 description 2
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012871 anti-fungal composition Substances 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 2
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 2
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010972 statistical evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 201000005882 tinea unguium Diseases 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 2
- 241001024600 Aggregatibacter Species 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000190885 Capnocytophaga ochracea Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000222290 Cladosporium Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241001517041 Corynebacterium jeikeium Species 0.000 description 1
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 208000002064 Dental Plaque Diseases 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 101100007584 Entamoeba histolytica CPNP gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 240000006890 Erythroxylum coca Species 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 241000193789 Gemella Species 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 206010054923 Inflammation of wound Diseases 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 description 1
- 241000207923 Lamiaceae Species 0.000 description 1
- 208000005230 Leg Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 description 1
- 241000555676 Malassezia Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 241000243190 Microsporidia Species 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- ZRWPUFFVAOMMNM-UHFFFAOYSA-N Patulin Chemical compound OC1OCC=C2OC(=O)C=C12 ZRWPUFFVAOMMNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 241000605862 Porphyromonas gingivalis Species 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- 241001135221 Prevotella intermedia Species 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037569 Purulent discharge Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000194025 Streptococcus oralis Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241001135235 Tannerella forsythia Species 0.000 description 1
- 241000589892 Treponema denticola Species 0.000 description 1
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 1
- 201000007096 Vulvovaginal Candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003339 best practice Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000008957 cocaer Nutrition 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N ***e Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 210000003298 dental enamel Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N diammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(C(=O)O)CC([O-])=O YXVFQADLFFNVDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000000598 endocrine disruptor Substances 0.000 description 1
- 231100000049 endocrine disruptor Toxicity 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 1
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100001143 noxa Toxicity 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940055019 propionibacterium acne Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 206010046901 vaginal discharge Diseases 0.000 description 1
- 208000013464 vaginal disease Diseases 0.000 description 1
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/02—Algae
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
- A61K36/062—Ascomycota
- A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
Abstract
Duální mikrobiální preparát zahrnuje mikroskopickou řasovku Pythium oligandrum a komponenty fyziologického mikrobiomu. Mikroskopická řasovka Pythium oligandrum i komponenta fyziologického mikrobiomu jsou v duálním preparátu přítomné v podobě umožňující jejich vzklíčení, následné namnoží a kolonizaci cílových tkání. Mikroskopická řasovka Pythium oligandrum obsahuje 10.sup.3.n.– 10.sup.8.n.KTJ (kolonie tvořících jednotek), s výhodou 10.sup.5.n.až 10.sup.6.n.KTJ na jeden cyklus aplikací. Komponentu fyziologického mikrobiomu obsahuje 5 x 10.sup.6.n.až 5 x 10.sup.10.n.KTJ, s výhodou 5 x 10.sup.7.n.až 5 x10.sup.9.n.KTJ na jeden cyklus aplikací. Pro obě mikrobiální komponenty je zdrojem živin fermentovaný substrát obsažený v řasovce Pythium oligandrum. Duální mikrobiální preparát dále obsahuje nejméně jednu z pomocných složek ze skupiny zahrnující desikant, komponenty pufračního systému, protispékací látku, a prostředek pro tvorbu fyziologického osmotického prostředí. Komponentou fyziologického mikrobiomu je lidský mikrobiom, a to jeden z mikrobů zeleného komplexu, jako je bakterie Capnocytophaga sputigena, nebo jedna z komponent zdravého mikrobiomu kůže, jako je bakterie Staphyloccocus epidermidis, nebo jedna z komponent zdravého vaginálního mikrobiomu, jako je peroxidy produkující Lactobacillus crispatus. V duálním mikrobiálním preparátu jsou buď mikroskopická řasovka Pythium oligandrum nebo komponenta fyziologického mikrobiomu přítomny ve formě usmrcených buněk, buněčných extraktů, nebo isolovaných buněčných frakcí. Pro řasovku Pyhtium oligadrum je mikrobiálním aktivátorem kvasničný autolyzát v množství 0,1 % až 10 % hmotn. Pomocné látky jsou upraveny způsobem umožňujícím aplikaci ve formě mastí, krémů, olejů, čípků nebo ve formě tekutého vodného přípravku.
Description
Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí
Oblast techniky
Vynález se týká duálního mikrobiálního preparátu pro dlouhodobé potlačení symptomů oportunních mikrobiálních infekcí, zejména oportunních mikrobiálních infekcí, způsobených dysbiosou (porušením mikrobiální rovnováhy).
Dosavadní stav techniky
Výskyt oportunních (příležitostných) mikrobiálních infekcí, zanícených nebojících se ran, infekcí agresivními formami komensálních kvasinek a mykotické infekce dermatofyty jeví v současné době zvyšující se tendenci, čímž začíná zasahovat významný segment populace. Je to způsobeno zejména tím, že nárůst výskytu těchto onemocnění není zpravidla způsoben ani vnějšími epidemiologickými faktory ani genetickými defekty způsobujícími zásadní narušení fyziologického programu obranných imunitních reakcí hostitele. Hlavní příčinou oportunních mikrobiálních infekcí je dnes zejména dočasné oslabení imunitního systému a přirozených obranných reakcí, nejčastěji v důsledku stresu, náročného životního stylu, nadměrné zátěže organismu u sportovců nebo těžce pracujících, stáří spojenému s přirozeným oslabením imunitních reakcí, nebo v důsledku působení závažných doprovodných onemocnění a projevů, jako je například cukrovka, obezita, potravinové alergie, autoimunitní onemocnění aj. Nápadným doprovodným jevem většiny oportunních mikrobiálních infekcí pak bývá dysbiosa, tedy porušení fyziologické rovnováhy ve složení zdravé mikrobiální flóry charakteristické pro jednotlivé části našeho těla. Výše uvedené jevy tedy nabývají masivních rozměrů a ovlivňují zdravotní stav populace více než tradiční příčiny onemocnění (úrazy, infekce, genetika).
Dosavadní léčba oportunních mikrobiálních infekcí, probíhajících bez pochopení jemné rovnováhy mezi složením fyziologické mikroflóry a imunitním systémem hostitele, se ukazuje jako velmi málo účinná, zejména z dlouhodobého pohledu. Časté používání antibiotik, antimykotik a antiseptických látek s sebou nese riziko zátěže organismu reaktivními chemickými látkami, které navíc málokdy bývají bez vedlejších toxických účinků, jakými je například účinek antimykotik jako endokrinních disruptorů narušujících přirozenou hormonální regulaci organismu. Neuvážené používání antibiotik, které je známé a kritizované, ale přesto k němu neustále dochází, je typickým příkladem nefyziologického a nekauzálního přístupu k léčbě oportunních mikrobiálních infekcí dlouhodobě narušující citlivou rovnováhu přirozené mikroflóry na povrchu kůže a různých sliznic. Antibiotika nejčastěji zlikvidují potřebné mikrobiální komponenty přirozené mikroflóry, přičemž mají minimální účinek na patogenní mikroorganismy, zvláště na patogeny schopné tvořit mikrobiální biofilmy. Jejich dlouhodobé používání pak vede jen k vytvoření odolnosti vůči antibiotikům, antimykotikům a dokonce i antiseptikům, čímž tyto látky rychle ztrácejí i poslední zbytky svých účinků. Rezistence vůči dostupným antibiotikům nabyla epidemických rozměrů a stává se důvodem obav odborných lékařských společností i široké veřejnosti. Oportunní mikrobiální infekce nejčastěji nepatří k onemocněním bezprostředně ohrožující život, byť zásadním způsobem zhoršují jeho kvalitu. Při jejich léčbě se potom nedostatečnost použití chemických prostředků projevuje jako časté znovuobjevení se infekce a jejích symptomů po předcházející „úspěšné“ léčbě, přičemž frekvence opakujících se infekcí se neustále zvyšuje, až se pacient dostane do jakéhosi permanentního cyklu infekce - léčba - reinfekce - léčba atd.
Mezi nejdůležitější příklady oportunních mikrobiálních infekcí se řadí zánět dásní a periodontální onemocnění, mikrobiální zanícení způsobující komplikace u nebojících se ran, oportunní kvasinkové infekce postihující sliznice urogenitálního traktu, dermatofytární onemocnění u lidí nebo zvířat a mikrobiální infekce komplikované tvorbou biofilmu. Všechna tato onemocnění zahrnují jako každé infekční onemocnění silný vliv životního prostředí. Proto se dnes péče o čisté pracovní a životního prostředí považuje za integrální součást moderní, účinné léčby.
Akutní zánět dásní a chronické periodontální onemocnění jsou dvě stádia dysbiosy v dutině ústní, způsobující zánětlivou reakci imunitního systému vedoucí k destrukci periodontálních struktur, oslabení závěsného aparátu zubu a nakonec jeho úplné ztrátě [20]. V agresivním prostředí dutiny ústní se stávají patogenní baktérie dutiny ústní, nefyziologicky namnožené za podmínek dysbiosy, součástí polymikrobiálních společenstev, tzv. biofilmů, což jim umožňuje odolávat jak obranným reakcím imunitního systému, tak i antibiotikům podaným lokálně nebo celkově [30], [9], [4], [5], [27], Moderní studie již také dostatečně přesně identifikovaly jednak zdravý mikrobiom dutiny ústní, charakterizovaný přítomností zeleného mikrobiálního komplexu, zahrnujícího baktérie rodů Streptococcus, Prevotella, Veilonella, Gemella, Granulicalella, Eikenela a Cypnocytophaga, stejně jako posun od G+ aerobních bakterií ke G- anaerobům druhům Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia a Treponema denticola, charakterizujícím oranžový a červený mikrobiální komplex, jehož výskyt je typický pro rozvinutou dysbiosu [I], [11], 19], Přemnožení patogenních baktérií v dutině ústní pak klinicky způsobuje zejména krvácivost dásní, která se charakterizuje hodnotou PB1 indexu (Bleeding on Probing Index) a dále celkové zhoršení stavu chrupu a jeho prognózy, které je charakterizováno komunitním CP1TN indexem dle WHO [2], [25]. Dosavadní postupy, spočívající v použití lokálních nebo celkových antibiotic, lokálních desinfekčních činidel (chlorhexidine a jiné) nebo pouhého mechanického čištění a bělení zubů, nepřinášejí očekávané dlouhodobé účinky [5], Alternativní postupy spočívající v použití probiotik nejsou příliš účinné, což se přičítá zejména tomu, že byly doposud používány komponenty odvozené od normálních mikrobiomů v jiných prostředích lidského těla než v ústní dutině [35].
Mikrobiální zanícení ran představuje jeden z kritických komplikujících faktorů při léčbě bércových vředů a to nejen u diabetiků, ale i u nediabetiků [15], Společenská závažnost tohoto onemocnění je dána nejen jeho dlouhodobými následky z hlediska pracovní neschopnosti a sociální diskriminace postižených jedinců, ale zejména jeho masivním rozšířením, představujícím až 980 tisíc případů ročně pouze v zemích EU (Evropské unie), stejně jako ohromnými náklady na léčbu, odhadované na 6,5 mid. EUR ročně v zemích EU [12]. Chronický průběh bércových vředů zvyšuje sám o sobě náchylnost k infekcím v důsledku poškození kožní bariéry, problémů s cirkulací a inhibici obranných reakcí imunitního systému [37]. Příznaky klinické infekce zahrnují zejména zarudnutí, bolest, vznik edémů, pachové symptomy a hnisavé výtoky, které mohou přejít až v život ohrožující septické stavy [8], Nedávno publikovaný materiál odborné společnosti EWMA se staví velmi kriticky k léčbě mikrobiálních infekcí lokálními antibiotiky nebo antiseptiky a vyzývá k hledání nových řešení. Množství inovativních přístupů je však velmi omezené a 85 % celosvětového trhu prostředků na odstranění zánětu nebojících se ran je stále založeno na použití koloidního stříbra, prostředku známého již od antiky, a to bez ohledu na současné zevrubné znalosti normálního kožního mikrobiomu [18], [13] dosud zúročené jen minimálně.
Naše znalosti etiologie oportunních infekcí patogenními kvasinkami na kůži a sliznicích zaznamenaly v poslední době exponenciální nárůst, který se však bohužel zatím projevil jen omezeně v návrhu nových terapeutických modalit. Samotné označení kvasinky Candida albicans, a jí příbuzných druhů jako patogenní kvasinky, není příliš přesné. Jedná se o organismus hojně přítomný v životním prostředí, který žije jako komensální mikroorganismus na kůži a sliznicích člověka a je u zdravých jedinců převážně neškodný. Oslabení imunity, byť dočasné, však dokáže velmi dobře rozpoznat a vůči imunokompromitovaným jedincům se začne chovat agresivně. Přitom používá jednotlivé virulentní faktory, jejichž molekulární povaha je již od 90. let minulého století neustále upřesňována - jde zejména o adhezivní proteiny odpovědné za silné uchycení na povrch epiteliální buňky hostitele, faktory odpovědné za změnu morfologie z jednobuněčné na hyfální formu, a hydrolytické enzymy, jako jsou sekretované aspartátové proteinasy nebo fosfolipasy [6]. Další faktory mohou mít povahu uvolňovaných rozpustných glukanů, které potlačují cytokinovou signalizaci monocytů a inhibují též specifickou imunitu závislou na T-lymfocytech [29]. Velkým nebezpečím mohou potom být kandidy (jednobuněčné kvasinky) pro trvale imunosuprimované pacienty, protože u nich mohou přežívat dokonce v cirkulaci a způsobovat smrtící infekce [14]. Orální a vaginální kandidové infekce jsou však velmi časté u jedinců trpících pouze mírně oslabenou imunitou [21]. Znalosti přírodních mechanismů infekce kandidou bylo doposud využito jen minimálně. Ve stádiu laboratorních zkoušek se nacházejí protilátky proti výše uvedeným virulentním faktorům nebo chemické inhibitory sekretovaných aspartátových proteinas, většího klinického rozšíření však doposud nedosáhly [10], Mechanismy imunitní odpovědi vůči kvasinkám se průběžně doplňují, zatím však nebyl identifikován žádný jejich přirozený biologický nepřítel [16],
Podobně jako u kandidias (kvasinkových infekcí), i u dermatofytóz může trvalé oslabení imunitního systému vést k systémovým infekcím. Nedávné sekvenování genomů několika dermatofyt otevřelo cestu k identifikaci jejich infekčních genů a molekulární diagnostice [3]. Jinak je však léčba těchto onemocnění stále závislá zejména na použití chemických antimykotik nechvalně proslulých jak svými vedlejšími účinky, tak pouze dočasným potlačením infekce.
Dermatofytózy patří mezi plísňové infekce rozšířené u lidí i u zvířat. Řadíme je mezi zoonózy. U lidí může často být infekce zvířecího původu. Možný je ovšem i opačný přenos z člověka na zvíře. Riziko přenosu stoupá i v dnešní moderní době, kdy mykotické infekce nepostihují pouze farmáře, tedy chovatele v přímém styku s potravinovými zvířaty a koňmi [28], ale i obyvatele měst, kde k přenosu infekce dochází blízkým stykem s domácími zvířecími mazlíčky chovanými ve společné domácnosti, kteří žijí v denním úzkém kontaktu sjejich majiteli [24]. U zvířat je často obtížné dosáhnout infekce v případě zcela zdravých jedinců. Poměrně častý je však výskyt těchto infekcí u stresovaných jedinců s oslabeným imunitním systémem a u plemen s dědičnými predispozicemi ke kožním chorobám. Tato onemocnění se vyskytují též ve formě druhotných infekcí, výrazně ztěžujících průběh primárního onemocnění. Dermatofytické infekce jsou časté ve velkých chovech. K propuknutí dochází zejména při nedodržení karantény při příchodu nového jedince a při celkovém nedodržování zoohygienických podmínek chovu. V chovech hospodářských zvířat mohou být příčinou významných ekonomických ztrát. Zoonózy způsobené patogeny rodu Trichophyton podléhají povinnému hlášení příslušným autoritám. Léčba těchto infekcí pomocí klasických chemických prostředků tak představuje zátěž nejen pro zvíře, ale také pro majitele. U zvířat, jejichž produkty, jako maso a mléko se dostávají do potravinového řetězce, takováto léčba znemožňuje zpracování těchto surovin ve stanovených ochranných lhůtách tak, aby spotřebitel nebyl ohrožen rezidui používaných terapeutik.
Teprve nedávno se začalo přistupovat k problematice oportunních mikrobiálních infekcí diferencovaně a komplexně, na základě důkladného studia a dobrých znalostí jejich příčin a s důrazem na účinné přírodní metody, související s tzv. biologickou léčbou. Zásadním přínosem pro zvyšující se popularitu biologických přístupů pak byly nedávné výsledky mezinárodního výzkumného konsorcia Human Microbiome Project Consortium, které provedlo na základě moderních metod molekulární genetiky detailní rozbor jednotlivých fyziologických mikrobiálních společenstev vyskytujících se na kůži, sliznicích a v respiračním, trávicím a urogenitálním traktu [22], Na základě těchto mezinárodně prověřených a neustále doplňovaných analýz, se poprvé vědecká a lékařská veřejnost dozvěděla dosud jen částečně objasněná fakta o složení mikrobiálních společenstev v různých částech našeho těla u dostatečného, statisticky významného souboru zdravých jedinců, což umožnilo zcela nový pohled na jejich individuální variabilitu, časovou stabilitu, a zejména na změny v těchto společenstvech charakterizující jednotlivé patologické stavy.
Po zveřejnění výsledků výše uvedeného konsorcia pro lidské mikrobiomy, očekávala vědecká a lékařská veřejnost rychlé využití těchto poznatků pro návrh nových a účinných léčebných postupů, mj. právě též v oblasti léčby oportunních mikrobiálních infekcí, o jejichž vazbě na mikrobiální dysbiosy již existovala řada důkazů. Z hlediska výše uvedených očekávání je možno konstatovat, že množství prakticky odzkoušených léčebných postupů, používajících výše uvedené revoluční poznatky i množství postupů založených na jakémkoliv biologickém způsobu léčby, doposud zůstalo daleko za očekáváním. Z hlediska použití biologických způsobů léčby oportunních infekcí, stojí za zmínku CZ 9883 U (18. 4. 2000) [36], popisující prostředky na ochranu kůže, používající houbu Pythium oligandrum ve formě biologického prostředku pro potírání původců dermatofytóz, který obsahuje jako účinnou složku uvedený houbový organismus ve formě oospór s tím, že celkový počet oospór je maximálně 2 x 10’ na 1 g prostředku.
Použití mikroorganismu Pythium oligandrum, jako nástroje k biologickému boji s plísňovými a jinými infekcemi, byla následně značně rozšířena v CZ 302 297 (9. 2. 2011) [34], jehož majitel je přihlašovatelem tohoto vynálezu. Vynález popisuje protiplísňovou směs s houbovým organismem Pythium oligandrum, určenou pro potírání lidských chorob a chorob zvířat plísňového, bakteriálního či jiného původu a pro narušení biofilmů na cizorodých materiálech, užívaných v humánní i veterinární medicíně, a pro eliminaci mikroflory z různých předmětů, přicházejících do styku s lidmi nebo zvířaty. Navrhovaná protiplísňová směs využívá účinné látky houbového organismu Pythium oligandrum ve směsi s inertními složkami. Aktivita houbového organismu Pythium oligandrum ve směsi nastává v okamžiku, kdy tento organismus přijde do styku s vlhkostí. Řešení dle CZ 302 297 [34] je pojaté ve vztahu k lékařskému využití oomycety Pythium oligandrum pro potlačení symptomů řady různých onemocnění, nejen chorob plísňového původu. Na základě tohoto patentu přistoupil jeho majitel a současně přihlašovatel této předložené přihlášky vynálezu, k vývoji, odzkoušení a prodeji řady kosmetických přípravků. Tyto přípravky jsou v prodeji v lékárnách a u veterinárních lékařů v České republice, a jsou v závislosti na platné legislativě též notifikovány podle požadavků EU v příslušném evropském portálu. Ve vztahu k lékařskému použití je třeba zmínit zejména nízkou toxicitu, která je v současné době podpořena jak zkušenostmi řady uživatelů, tak i laboratorními testy, přikázanými pro posouzení bezpečnosti kosmetického přípravku odpovědnými orgány. Dlouhodobým užíváním tohoto v podstatě jednosložkového preparátu s účinnou složkou Pythium oligandrun se velmi osvědčilo. Přesto se ukázalo, že některým pacientům nevyhovuje v dlouhodobém horizontu. Ukázalo se, že se jedná o pacienty s oslabenou nebo jinak porušenou imunitou.
Použití biologických prostředků pro ochranu proti oportunním infekcím je dále předmětem několika zahraničních patentů a patentových přihlášek. US 5,190,746 (2. 3. 1993) [7] navrhuje použít hexasacharid o molekulární hmotnosti 959, isolovaného z orálního mikroba Streptococcus oralis pro blokování vzájemné interakce tohoto streptokoka s komponentou bakteriálního zubního plaku Capnocytophaga ochracea. Přestože byl efekt oligosacharidu testován pouze v laboratorním testu, ve vynálezu se předpokládá, že by mohl být účinný při prevenci, inhibici nebo rozrušení mikrobiálních depozit v zubním plaku, a to například při použití v zubních pastách nebo ústní vodě. CA 2 374 938 AI (30. 11.2001) [31] popisuje metodu pro inhibici infekce ran u savců spočívající v podání probiotických organismů přímo do rány, přičemž jako probiotický organismus je navrhováno několik kmenů laktobacilů, například Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum a.j. Tatáž metoda je navrhována pro inhibici tvorby biofilmů, nikoliv ovšem v nebojících se ranách, ale na různých operačních nástrojích. WO 2008/ 077 251 A (3.7.2008) [32] se zabývá použitím laktobacilů k eliminaci methicillin-rezistentního patogena Staphylococcus aureus na základě laboratorního testu. WO 2013/122 931 A2 (22.8.2013) [26] popisuje použití prebiotik, podporujícího rozvoj zdravých komensálních mikroorganismů kůže, jmenovitě bakterií Streptococcus epidermidis, Corynebacterium jeikeium a Propionibacterium acnes, pro zlepšení fyziologického stavu a vzhledu kůže. Kolonizace těmito mikroorganismy byla prokázána in vivo testem. Ve studii však není uveden žádný důkaz pro blahodárný efekt takto aplikovaných mikroorganismů na kůži nebo pro jejich použití pro léčbu.
Ve vědecké a lékařské literatuře byly zaznamenány úspěšné výsledky s použitím laktobacilů pro zvýšení odolnosti žen s opakovanými kvasinkovými vulvovaginálními infekcemi. Za zmínku v této souvislosti stojí zejména výsledky získané s preparátem Lactin V firmy Osel ve studiích sponzorovaných University of Washington. Výsledky fáze Ha a lib těchto studií, které jsou k dispozici ve vědeckých publikacích [33], ukázaly, že opakované infekce urogenitálního traktu se vyskytovaly u 15 % žen léčených Lactinem V, zatímco u skupiny neléčených žen byla incidence vyšší, kolem 27 %. Kolonizace laktobacilem byla prokázána genetickým testem a byla zjištěna statisticky významná korelace mezi takto zjištěnou kolonizací a snížením opakovaných vaginálních infekcí i infekcí urogenitálního traktu.
Výše uvedené vynálezy mají však některé zásadní nevýhody. Všechny uvedené principy byly prokázány pouze v laboratorních testech, maximálně na zvířecích experimentálních modelech. Tento nedostatek je zásadní povahy, neboť je odborníkům v oboru dobře známo, že výsledky získané na zvířecích modelech nemusí vždy platit v případě humánní léčby, a nemusí mít univerzální platnost ani pro léčbu veterinární; tj. nálezy učiněné na jednom živočišném druhu nelze vždy účinně aplikovat pro jiný živočišný druh. Navíc byly jako probiotické organismy použity mikroorganismy bez jakékoliv fyziologické relevance k místu léčby - nejčastěji se jednalo o laktobacily, které tvoří predominantní mikrobiální komponentu vaginálního mikrobiomu, ale u ostatních mikrobiomů se fyziologicky prakticky vůbec nevyskytují. Pouze v případě řešení dle US 5,190,734 A [7] a WO 2013/122 931 A2 [26] byly využity komponety přirozených, fyziologických mikrobiomů v dutině ústní resp. v kůži. V těchto případech se však jednalo o použití prebiotik, nikoliv probiotik. Prebiotika jsou sloučeniny, které mohou - ale nemusí -- povzbudit růst a namnožení příslušných probiotických organismů. I v těchto případech platí námitka, že účinnost těchto přípravků byla prokázána pouze v laboratorních testech a ne v reálné situaci v klinických studiích.
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody se odstraní nebo podstatně omezí u duálního mikrobiálního preparátu pro dlouhodobé potlačení symptomů nebo pro prevenci oportunních mikrobiálních infekcí, zejména způsobených dysbiosou, podle tohoto vynálezu. Podstata tohoto vynálezu spočívá v tom, že dvojsložkový mikrobiální preparát obsahuje dvě základní mikrobiální komponenty, a to mikroskopickou řasovku Pythium oligandrum a komponenty mikrobiomu, přičemž komponentou mikrobu je fyziologický mikrobiom lidského či zvířecího původu nebo mikrobiom pochází z životního prostředí. . Mikroskopická řasovka je přítomna ve formě propagulí a různých uvolňovaných látek makromolekulám! i nízkomolekulární povahy jako jedna komponenta.
Druhá komponenta je klinickými studiemi prověřená baktérie obsažená ve fyziologickém mikrobiomu, která se dodává z duálního mikrobiálního preparátu až do ustavení požadované mikrobiální rovnováhy v lidském nebo případně zvířecím organismu. Komponenta fyziologického mikrobiomu je lidského nebo zvířecího původu nebo pochází z životního prostředí. Komponenta fyziologického mikrobiomu lidského původu se použije pro eliminaci a prevenci symptomů způsobených dysbiózou u lidí, přičemž je nezbytné zohlednit topologickou lokalizaci této dysbiózy, např. pro dutinu ústní připadá v úvahu užití pouze komponenty ústního mikrobiomu. Komponenta fyziologického mikrobiomu zvířecího původu se použije pro eliminaci a prevenci symptomů způsobených dysbiózou u zvířat, přičemž je nezbytné zohlednit topologickou lokalizaci této dysbiózy, např. pro infekci dermatofyty na kůži srsti zvířete připadá v úvahu využití pouze komponenty kožního mikrobiomu. Komponenta mikrobiomu z životního prostředí se použije pro nastolení mikrobiální rovnováhy příznivé pro eliminaci a prevenci plísní a kvasinek ze životního a pracovního prostředí.
Hlavní výhodou tohoto vynálezu je, že duální mikrobiální preparát navozuje stav dlouhodobé a trvalé stabilizace zdravého mikrobiomu v místě aplikace. Velkou předností tohoto řešení je, že obě základní komponenty mikrobiálního duálního preparátu působí vzájemně se zesilujícím a vzájemně působícím (synergním) mechanismem, společně s imunitním systémem hostitele eliminaci původců a podmínek vybraných patologických stavů. Po eliminaci patologické noxy umožněné unikátními aktivitami Pythium oligcmdrum přetrvává tato řasovka v místě aplikace v klidové podobě, zatímco druhá mikrobiální komponenta posiluje fyziologické komponenty normálního zdravého mikrobiomu a svými metabolickými procesy stabilizuje a nastoluje požadované zdravé mikroprostředí v místě aplikace.
Velmi významnou předností je dlouhodobý příznivý účinek duálních mikrobiálních preparátů podle tohoto vynálezu, čímž se liší od alternativních chemických prostředků, které mívají zpravidla pouze krátkodobý účinek. Tento krátký účinek je možné kompenzovat pouze opakovaným podáváním chemických přípravků, během něhož však většinou začínají cílové patogenní organismy projevovat rezistenci na tyto chemické prostředky. Jediným způsobem překonání této rezistence pak je progresivní podávání stále vyšších dávek chemických prostředků, čímž se ovšem ještě násobí případné vedlejší účinky a toxické působení těchto chemikálií. Použití biologických prostředků má nespornou výhodu vtom, že používají naprosto odlišné mechanismy působení více slučitelné s odstraněním patogenní infekce a dlouhodobými stabilizujícími účinky.
V konkrétním případě navrhovaného duálního mikrobiálního preparátu podle tohoto vynálezu výsledky ukazují, že každý zobou použitých mikroorganismů projevuje v místě aplikace přípravku vlastní populační křivku vycházející zjeho biologických vlastností. Jedna složka, Pythium oligcmdrum, zaznamenává rychlý nárůst v počáteční fázi v závislosti na přítomnosti potencionálních živin a po vyčištění místa aplikace a potlačení patogenů ještě přežívá na místě aplikace ve sporulující podobě. Druhá složka, stabilizující komponenta normálního zdravého mikrobiomu, přežívá na místě aplikace dlouhodobě a posiluje příznivé účinky již přítomné normální mikroflóry, které pomáhá při její stabilizaci.
Duální mikrobiální preparát podle tohoto vynálezu přispívá k potlačení a eliminaci oportunních plísňových, kvasinkových a bakteriálních infekcí lidí a zvířat a navození zdravého mikrobiomu dutiny ústní, povrchu nebojících se ran a sliznic zasažených kvasinkovými infekcemi narušeného v důsledku stresu, nezdravého životního stylu, mechanického namáhání nebo nadužívání chemických prostředků osobní hygieny.
Předkládaný vynález je vhodný zejména pro potlačení řady patologických symptomů založené na stabilizaci normálních, zdravých fyziologických mikrobiomů, jejichž přirozená rovnováha je narušena v případě stresu, nadměrné fyzické zátěže, oslabení organismu, genetické poruchy nebo jiného onemocněních. Předkládaný vynález je založený na synergním působení mikroskopické řasovky Pythium oligandrum, jejíž úlohou je zejména vyčištění aplikačního mikroprostředí, eliminace plísňové nebo kvasinkové zátěže, rozrušení mikrobiálního biofilmu v místě aplikace a potlačení růstu patogenních bakterií a dominantní mikrobiální komponenty zdravého fyziologického mikrobiomu.
Je výhodné, když mikroskopická řasovka Pythium oligandrum i komponenta fyziologického mikrobiomu jsou přítomny v podobě umožňující jejich vzklíčení, následné namnožení a kolonizací cílových tkání, v nichž, uplatňují v závislosti na lokálních podmínkách své běžné metabolické aktivity, včetně schopnosti uvolňovat do svého okolí biologicky aktivní makromolekulám! nebo nízkomolekulární látky. Fyziologické regulační mechanismy, spolu s omezenou povrchovou kapacitou kůže a sliznic, zároveň účinně zabraňují možnosti dodání nadměrného množství komponenty fyziologického mikrobiomu, neboť v takovém případě dochází rychle k nasycení povrchové vazebné kapacity a přebytečné komponenty jsou automaticky odstraňovány.
Duální mikrobiální preparát podle tohoto vynálezu obsahuje optimálně účinné zjištěné rozmezí obou základních složek, a to mikroskopickou řasovku Pythium oligandrum v množství 103 až 108, přednostně 105 až 106, KTJ (kolonie tvořících jednotek, anglický ekvivalent CFU) na jeden gram preparátu, v kombinaci s dominantní komponentou relevantního fyziologického mikrobiomu v množství 5 x 106až 5 x I O10, přednostně 5 x 107 až 5 x 109, KTJ (kolonie tvořících jednotek, CFU) na jeden gram preparátu. Bylo zjištěno, že nižší hodnoty nárokovaného rozmezí složek nejsou dostatečně účinné, zatímco vyšší hodnoty by mohly zbytečně zatěžovat lidský organismus. Poměr obou použitých mikrobiálních komponent přitom vhodně vychází ze vzájemného kapacitního biosyntetického poměru obou použitých mikroorganismů, který je v podstatě definován poměrem objemů obou použitých buněk a je tedy charakterizován přepočítacím faktorem cca 2350, při uvažovaném rozměru řasovky Pythium oligandrum 18 x 18 x 18 μιη a bakterie 1x1x2 μιη.
V duálním mikrobiálním preparát podle tohoto vynálezu může sloužit substrát, fermentovaný během nárůstu řasovky Pythium oligandrum, jako zdroj živin pro obě mikrobiální komponenty. Živiny a prebiotika podporují metabolismus obou mikrobiálních komponent.
Optimální aplikaci duálního mikrobiálního preparátu podle tohoto vynálezu podporují pomocné složky, obsahující nejméně jednu z pomocných složek ze skupiny, zahrnující: desikant jako je oxid křemičitý; komponenty pufračního systému jako je kyselina citrónová, hydrogenuhličitan sodný a uhličitan sodný navozující správné pH během aplikace; protispékací látku, jako je sorbitol nebo polyethylenglykol; a prostředek pro tvorbu fyziologického osmotického prostředí, jako je chlorid sodný.
Pomocí testů specifity vzájemného působení za podmínek blízkých různým částem lidského těla bylo zjištěno, že vhodnou mikrobiální komponentou duálního mikrobiálního preparátu je vždy dominantní mikrobiální komponenta příslušného mikrobiomu, který je relevantní za podmínek pro podmínky příslušné povrchové lokality.
Pro dlouhodobé potlačení příznaků periodontálního onemocnění a dlouhodobé udržování zdravé dutiny ústní je výhodné, když komponentou fyziologického mikrobiomu je zdravý lidský mikrobiom, a to jeden z mikrobů zeleného komplexu, jako je bakterie Capnocytophaga sputigena, přičemž jeho kvantitativní množství odpovídá obsahu komponenty fyziologického mikrobiomu.
Podobně pro dlouhodobé potlačení symptomů klinické infekce u nebojících se ran u nediabetických pacientů, rozrušení biofilmů v nebojících se ranách, včetně biofilmů způsobovaných mikroorganismy Stenotrophomonas maltophila a Pseudomonas aeruginosa a pro dlouhodobé udržování zdravé pokožky, je výhodné, když komponentou fyziologického mikrobiomu je lidský mikrobiom, a to jedna z komponent zdravého mikrobiomu kůže, jako je bakterie Staphyloccocus epidermidis.
Pro dlouhodobé potlačení kvasinkových infekcí urogenitálního traktu a kůže, vaginální sliznice je výhodné, když komponentou fyziologického mikrobiomu je lidský mikrobiom, a to jedna z komponent zdravého vaginálního mikrobiomu, jako je peroxidy produkující Lactobacillus crispatus.
Pro kosmetické účely nebo pro pacienty s oslabenou imunitou je výhodné, když jsou v duálním mikrobiálním preparátu přítomny buď mikroskopická řasovka Pythium oligandrum nebo komponenta fyziologického mikrobiomu ve formě neživých složek, jako jsou usmrcené buňky, buněčné extrakty, nebo isolované buněčné frakce.
Bylo zjištěno, že pro eliminaci původců mykotických onemocnění kůže a dermatofytóz u zvířat a dlouhodobé udržování zdravé kůže je výhodné, když pro řasovku Pythium oligandrum je mikrobiálním aktivátorem kvasničný autolyzát v množství 0, 1 % - 10 % hm. z celkového množství duálního mikrobiálního preparátu.
Pro snadnější aplikaci duálního mikrobiálního preparát podle tohoto vynálezu je vhodné, když pomocné látky jsou ve formě mastí, krémů, olejů, čípků nebo ve formě tekutého vodného přípravku.
Vzhledem k teplotní růstové limitaci mikroskopické řasovky Pythium oligandrum, při aplikaci duálního mikrobiálního preparátu podle tohoto vynálezu by měla být teplota vždy nižší než fyziologická teplota, jako je teplota např. kolem 35 °C. Tato limitace prakticky vylučuje použití duálních mikrobiálních preparátů podle tohoto vynálezu pro vnitřní užití. Proto zůstává jejich použití omezené na kůži a sliznice dutiny ústní a urogenitálního traktu, které je možné oplachovat vodnými roztoky navrženého preparátu právě za teplot poněkud nižších, než je teplota lidského těla.
Duální mikrobiální preparát se při aplikaci aktivuje stykem s vlhkostí. Aktivita duálního mikrobiálního preparátu ve směsi se ustaví v okamžiku, kdy tento preparát přijde do styku s vlhkostí, resp. s navlhčenými inertními komponentami. Aplikace zvlhčeného, aktivovaného preparátu se provádí zejména oplachy postižených míst, jinými způsoby vlhké aplikace, popřípadě mohou být komponenty dodány ve formě mastí, krémů, olejů, čípků, ve formě suchých lyofilizovaných směsí, obsažených v těchto kosmetických přípravcích nebo ve formě tekutého vodného přípravku.
Pro potlačení nebo rozrušení biofilmů odolných vůči působení jednotlivých isolovaných komponent, při rozrušení biofilmů způsobených mikroorganismy jako je např. Stenotrophomonas maltophila nebo Pseudomonas aeruginosa, pro eliminaci plísní, kvasinek a patogenních bakterií z životního prostředí, je výhodné, když komponentou mikrobiální složky je některá z bakterií, zejména bacilů, schopných potlačovat rozvoj plísní v životním prostředí, v množství 105 až 1012 KTJ (kolonie tvořících jednotek) na 1 g. Přednostně je touto mikrobiální komponentou pocházející ze životního prostředí baktérie Bacillus amyloliquefaciens.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález je dále podrobně popsán na příkladných provedeních a blíže osvětlen na připojených schematických výkresech, v nichž je znázorněn na obr. 1A, obr. 1B, obr.lC test účinnosti duálního mikrobiálního preparátu pro dutinu ústní, pro jednotlivé pacienty (očíslované): a to v levé části pro „responzivní pacienty“ za podmínek odpovídajících aplikací dvousložkového mikrobiálního preparátu dle vynálezu; v pravé části pro „neresponzivní pacienty“ za podmínek odpovídajících aplikaci jednosložkového preparátu na bázi Pythium ligandrum dle vynálezu CZ 302 297 B6, a podrobněji obr. 1A ukazuje závislost indexu krvácivosti PBI dásní před aplikací, 2 měsíce po aplikaci a 6 měsíců po aplikaci, obr. 1B ukazuje závislost intenzity hybridizace v rj- (relativních jednotkách), odpovídajících počtu rozpadů radioaktivní značky pro mikroorganismy náležící do uvedených mikrobiálních komplexů, obr. 1C ukazuje závislost obsahu bakterií zeleného komplexu Capnocytophaga sputigena a Eikenella corrodens vyjádřenou jako procento hybridizačního signálů; dále jsou znázorněny na obr. 2 časová stabilita komponent duálního mikrobiálního preparátu pro léčbu příznaků gingivitidy (zánětu dásní) a periodontální onemocnění v dutině ústní, ukazující závislost počtu kolonií KTJ (CFU) na měsících skladování pro Pythium ligandrum a pro Capnocytophaga sputigena·, obr.3 test účinnosti duálního preparátu pro nehojící se rány, ukazující procento původního stavu: v levé části pro jednotlivé „Responzivní pacienty“ za podmínek odpovídajících aplikaci dvoj složkového mikrobiálního preparátu podle vynálezu; a v pravé části pro „Neresponzivní pacienty“za podmínek odpovídajících aplikaci jednosložkového preparátu na bázi Pythium oligandrum dle vynálezu CZ 302 297 B6.
obr. 4 časová stabilita komponent duálního mikrobiálního přípravku pro nehojící se rány, a to závislost počtu kolonií na měsících skladování pro Pythium oligandrum a pro Staphylococcus epidermidis;
obr. 5A, obr. 5B, obr. 5C test účinnosti duálního preparátu pro sliznice náchylné k výskytu kvasinek, pro jednotlivé pacienty: a to v levé části pro „Responzivní pacienty“ za podmínek odpovídajících aplikaci dvousložkového mikrobiálního preparátu dle vynálezu; a v pravé části pro „Neresponzivní pacienty“ za podmínek odpovídajících aplikaci jednosložkového preparátu na bázi Pythium ligandrum dle vynálezu CZ 302 297 B6, kde obr. 5A ukazuje klinickém hodnocení na škále 1 až 6, a to na počátku před a po 3 měsících po aplikaci, kde „1“ označuje odstranění jednoho a 6 je odstranění všech 6 symptomů, přičemž sledované byly nepohodlí, svědění, pálení, výtok, bolest a zarudnutí, a obr. 5B ukazuje počet kvasinek v arbitrárních jednotkách, kde značí „1“ výskyt pouze po kultivaci, „2“ sporadický výskyty, „3“ četný výskyt, „4“ masivní výskyt, a to na počátku před aplikací,a 3 měsíce po aplikaciy, obr. 5C ukazuje počet Lactobacillus v arbitrárních jednotkách, shora uvedených, a to na počátku před aplikací, 3 měsících po aplikaci; dále jsou znázorněny na obr. 6 časová stabilita duálních mikrobiálních preparátů pro kůži a sliznice náchylné k namnožení patogenních kvasinek, ukazující závislost počtu kolonií na měsících skladování pro Pythium oligandrum a Lactobacillus crispatus', obr. 7 test účinnosti in vitro pro duální mikrobiální preparát pro mykózy nohou; ukazující závislostpočtu kolonií KTJ v % vztažených vůči placebu, kde K je Kontrola odpovídající placebu, PO je Pythium oligandrum, KA je kvasničný autolyzát, PO + KA Pythium oligandrum a kvasničnýautolyzát; testované kmeny dermatofytů byly sbírkové kmeny Trichophyton interdigitale DMF2477 (TÍDMF2477), Trichophyton interdigitale
DMF3857 (TÍDMF3857), Trichophyton erinacei P837 (TeP837), Trichophyton erinacei
P852 (TeP852), Microsporumfloccosum ME1236 (MfME1236), Microsporum floccosum P245 (MfP245) a Microsporum canis DMF2374 (McDMF2374);
obr. 8A, obr. 8B, test vlivu počtu plísňových spor v ovzduší a test zamoření plísněmi ve stěrech u dvou různých místností s výskytem plísní na stěnách s dominantním výskytem plísně
Aspergillus niger a Cladosporium spp., kde Kjsou hodnoty odpovídající kontrole bez jakéhokoliv ošetření, P.o. jsou hodnoty odpovídající použití jednosložkového preparátu na bázi Pythium ligandrum dle vynálezu CZ 302 297 B6, B.a. jsou hodnoty odpovídající aplikaci samotného bacilu Bacillus amyloliquefaciens a P.o.+B.a. jsou hodnoty odpovídající aplikaci dvousložkového mikrobiálního preparátu dle vynálezu, kde obr. 8A ukazuje počet plísňových spor na I m3 vzduchu v zamořené místnosti zjištěný Omeljanského metodou po odběru spadů na misky s tím, že dle standardů WHO by měla být tato hodnota pod limitní hodnotu 500, obr. 8B ukazuje výsledky mikrobiálních odběrů a kultivací ze seškrabů vyjádřené v arbitrárních jednotkách ve škále lékařských hodnocení 1 až 4, kde značí „1“ výskyt pouze po kultivaci, „2“ sporadický výskyty, „3“ četný výskyt, „4“ masivní výskyt.
Příklady provedení vynálezu
Námi navrhované řešení je umožněno na základě detailní analýzy výsledků laboratorních a praktických zkoušek kosmetických přípravků založených na výše uvedeném patentu CZ 302 297 B6 [34], jejichž detailní formulace byla optimalizována pro výrobky, např. s ohledem na pomoc při eliminaci symptomů oportunních infekcí v dutině ústní Chytrá houba® Pythie® BioPlus, v prostředí nebojících se ran Biomycosin, na povrchu sliznic urogenitálního traktu FeelFresh a s ohledem na eliminaci původců plísňových infekcí kůže Chytrá houba® Pythie® Biodeur® Nail, veterinární přípravek Chytrá houba® Ecosin. Všechny tyto přípravky, obsahující jako účinnou látku pouze Pythium oligandrum, s optimalizovanou formulací prošly toxikologickými a bezpečnostními zkouškami dle zásad evropské notifikace kosmetických přípravků, v případě veterinárního přípravku byly schválené Ústavem pro státní kontrolu biopreparátů a léčiv, přičemž hodnocení bezpečnosti přípravků jsou k dispozici na evropském notifikačním portálu CPNP. Jednotlivé takto formulované přípravky byly poté testovány v klinických zkouškách za podmínek odpovídajících fázi II klinických zkoušek nezbytných pro vývoj léčiva.
Příklad 1 (Obr. 1A, obr. 1B, obr. 1C, obr. 2)
Přípravek Chytrá houba® Pythie® BioPlus ve formě šumivé tablety byl testován v multicentrické studii zahrnující tři stomatologická pracoviště a jedno pracoviště klinické mikrobiologie. Skupiny účastníků studie trpících periodontálním onemocněním (paradentózou) se nacházely na třech dentálních klinikách v Praze, v Kladně a v Košicích. Skupina v Praze zahrnovala 7 participant, skupina v Kladně 15 participant a skupina v Košicích 22 participant. Celkový počet participant ve studii tedy činil 44. Paralelně byla stejným způsobem léčena i kontrolní skupina, dostávala však nikoliv biologický, ale klasický chemický přípravek chlorhexidin gel. Účastníci studie byli pravidelně monitorování měřením PBI (Probing of Bleeding Index) indexu krvácivosti, který odráží okamžitý stav zánětu v dásních a CPITN ( Community Periodontal Index of Treatment Needs) indexu, který je měřítkem dlouhodobého stavu chrupu i předpovědí potřeb z hlediska jeho ošetření. Studie probíhala dvojitě zaslepeným způsobem, v němž byly obálky s preparáty připraveny a očíslovány administrativním pracovníkem nezasvěceným do průběhu studie. Po provedení dentální hygieny a podepsání informovaného souhlasu byli jednotliví pacienti instruováni, jak provádět večerní dentální hygienu a aplikovat přípravky. Aplikace byla prováděna formou výplachů vždy večer po skončení orální hygieny pět dnů po sobě. Dentální prohlídka byla provedena na počátku studie, po 2 měsících a po 6 měsících, přičemž byl kontrolován stav chrupu a na konci studie po 6 měsících i kolonizace mikroby zdravého orálního mikrobiomu na základě genetického testu.
Statistickým vyhodnocením výsledků bylo zjištěno, že účinek chemického dezinfekčního prostředku chlorhexidinu byl pouze krátkodobý, neboť došlo ke statisticky významnému snížení PBI indexu p < 0.05 pouze po 2 měsících sledování, nikoliv však na konci studie po 4 měsících. Naopak dlouhodobé výsledky ve skupině s podáním biologického přípravku byly výborné. Došlo v krátkodobém zhodnocení ke statisticky významnému p < 0,05 a v dlouhodobém zhodnocení ke statisticky vysoce významnému p < 0,01 snížení indexu krvácivosti a stabilizaci stavu chrupu až po dobu 6 měsíců, po níž byli participant! studie sledováni. U největší skupiny participant na dentální klinice v Košicích byly výsledky heterogenní a po statistickém vyhodnocení nebylo očekávaných léčebných účinků, na rozdíl od dvou výše uvedených skupin, dosaženo. Pro vyjasnění této situace byly využity detaily klinického hodnocení a skutečnosti, že u této skupiny participant byl před podáváním preparátu sledován úplný mikrobiální profil ústní mikroflóry genetickým testem. Vzájemnou korelací klinických a laboratorních výsledků bylo možno konstatovat, že se tato heterogenní skupiny skládá ze tří podskupin, označených jako nízkoriziková, středně riziková a vysoce riziková skupina. Nápadným rysem vysoce rizikové skupiny je nízký obsah fyziologických orálních bakterií tzv. zeleného ochranného komplexu, zahrnující analyzované druhy Eikenella corrodens a Capnocytophaga sputigena.
Výsledky jsou uvedeny na obrázku 1A, IB, 1C. Na obr. 1A a jsou znázorněny hodnoty indexu krvácivosti PBI, jednak pro pacienty, za podmínek odpovídajících aplikaci preparátu s Pythiem oligadrum, označených v grafu jako „Neresponzivní pacienti“ a jednak pro pacienty za podmínek odpovídajících aplikaci duálního mikrobiálního preparátu označených v grafu jako „Responzivní pacienti“, a to před aplikací, po 2 měsících aplikace a po 6 měsících aplikace.
Na počátku studie před aplikací (černé sloupce) nebyl mezi oběma skupinami statisticky významný rozdíl. „Neresponzivní pacienti“ měli hodnoty indexu krvácivosti PBI 38,8± 5,8 a „Responzivní pacienti“ měli hodnotu indexu krvácivosti 44,6 ± 4,7. Hodnota pravděpodobnosti odlišnosti obou skupin byla p = 0,121; tedy, obě skupiny pacientů tedy nebyly statisticky významně rozdílné. Na konci studie, po 6 měsících, měli „Neresponzivní pacienti“ za podmínek odpovídajících aplikaci Pythium oligandrum hodnoty krvácivosti PBI statisticky významně vyšší, oproti „Responzivním pacientům“ za podmínek odpovídajících aplikaci duálního mikrobiálního preparátu podle vynálezu. Vypočtené hodnoty indexu krvácivosti PBI činily po 6 měsících 39,4 ± 10,8 pro pacienty za podmínek odpovídajících aplikaci pouze Pythium oligandrum, zatímco hodnoty za podmínek odpovídajících aplikaci duálního mikrobiálního preparátu podle vynálezu činily 10,6 ± 2.4. Hodnota pravděpodobnosti odlišnosti obou skupin byla p = 0,0003. Podobné byly i výsledky týkající se CP1TN indexů, který je však méně pohotovým indikátorem, vzhledem kjeho pomalejší reakci na stav dutiny ústní a odrážejícím spíše dlouhodobé trendy.
Obr. 1B znázorňuje závislost intenzity hybridizace genetických sond detekujících jednotlivé skupiny orálních mikroorganismů náležejících do zeleného, oranžového nebo červeného komplexu. Na obr. 1B jsou uvedeny výsledky genetické analýzy přítomnosti vybraných mikrobů zeleného orálního komplexu (černé sloupce), oranžového orálního komplexu (světle šedé sloupce) a červeného orálního komplexu (tmavě šedé sloupce) uvedeny vjednotkách, odpovídajících počtu rozpadů za minutu radiokativně značených DNA sond. Participant! v kontrolní skupině za podmínek, odpovídajících podávání Chytrá houba® Pythie® BioPlus (vpravo obr. IB) a v experimentální skupině za podmínek odpovídajících podávání duálního mikrobiálního preparátu (vlevo obr. 1B), mají vysoký obsah mikrobů oranžového a červeného komplexu, což podporuje jejich diagnózu vážného periodontálního onemocnění. Mezi oběma skupinami nebyly pozorovány statisticky významné rozdíly. V experimentální skupině responzivních participant je ovšem nápadný statisticky významně vyšší obsah bakterií zeleného komplexu: 14908 ± 1489 rel. j. oproti 2750 ±1171 rel. j., p<0,001, a to zejména bakterie Capnocytophagy, jak je ukázáno na obrázku 1C (tmavé sloupce).
Tyto výsledky potvrzují, že duální mikrobiální preparát podle tohoto vynálezu pro použití v dutině ústní vykazuje statisticky významně lepší výsledky ve srovnání se standardním preparátem. Na základě těchto výsledků jsme zvažovali a hledali řešení pro účinný a dlouhodobý efekt řasovky Pythium oligandrum na odstranění příznaků paradentózy a zánětu dásní, zkoušeli a vyvíjeli jsme experimenty na prokázání kooperace tohoto mikroorganismu Pythium oligandrum s mikrobiálními komponentami zdravého ústního mikrobiomu, zejména pak s bakterií Capnocytophaga sputigena.
Byly připraveny celkem tři verze duálního mikrobiálního přípravku pro použití v dutině ústní a byla prokázána stabilita takových přípravků a provedeno jejich klinické testování u pacientů s periodontálním onemocněním. Detailní popis získaných výsledků je uveden dále podrobněji v tomto příkladu provedení tohoto vynálezu. Souhrnně výsledky tohoto testování prokázaly, že při aplikaci duálního mikrobiálního přípravku podle tohoto vynálezu ve formě šumivé tablety pro ústní výplachy, což je forma preferovaná většinou uživatelů dosavadních preparátů, nedocházelo k negativnímu ovlivnění stability žádné z komponent během skladování v suchém stavu. Po aplikaci duálního přípravku formou uživatelsky jednoduchých výplachů dutiny ústní docházelo k účinné kolonizaci a posílení komponenty normálního orálního mikrobiomu, což vedlo k významnému zvýšení úspěšnosti odstranění symptomů hodnoceného dle standardních indexů.
1. Příprava, kontrola a testováni účinnosti duálního mikrobiálního preparátu vhodného pro odstranění příznaků gingivitidy a periodontálního onemocnění v dutině ústní.
i. I Protokol pro přípravu duálního mirkrobiálního preparátu pro použiti v dutině ústní.
1.1.1 Příprava technického preparátu Pythium oligandrum Μ1 ATCC 38472.
Inokulum pro kultivaci mikroskopické řasovky Pythium oligandrum kmene Ml ATCC 38472 se připraví s použitím firemního systému „master cell bank“ - „working cell bank“. V master cell bank je uchovávaný firemní kmen Pythium oligandrum Ml ATCC 38472 dlouhodobě zmražením v kapalném dusíku při -150°C. Z master cell bank je podle protokolu produkováno limitované množství alikvotů pro working cell bank tak, aby počet reprodukčních generací nepřesáhnul celkový počet 50. Tím je zajištěna genetická stabilita firemního kmene. Kultivace násady probíhá na reciproké třepačce s rozkyvem 10,5 cm a 96 kyvy za minutu po dobu 48 hodin při 28 °C.
Mezitím připravíme jahelný substrát pro pevnou kultivaci Pythium oligandrum Ml: 500 g loupaného prosa typu Panicům miliaceum se důkladně promyje tekoucí studenou vodou. Ve 200 ml destilované vody se rozpustí 50 mg ZnSO4, 150 mg KH2PO4, 50 mg MgSO4 a 250 mg CaCI2. Poté se roztok zahřeje k bodu varu a nalije na promyté proso. Po povaření se nádoba s prosem přikryje a nechá stát 30 min. Poté se proso rozprostře na filtrační papír v tenké vrstvě a nechá se vychladnout a oschnout.
Takto připravené proso se rozváží po 30 g do 500 ml Erlenmayerových baněk a probíhá sterilizace v parním autoklávu při teplotě 120 °C po dobu 40 min. Po 24 hod je sterilizace opakována, po každé sterilizaci se proso lehce protřepe.
Vysterilizované proso očkujeme 4 ml inokula připraveného podle výše uvedeného postupu. Po naočkování se proso důkladně protřepe s inokulem a nakonec mírným poklepem vyrovná do stejnoměrné vrstvy.
Pevná kultivace na jahelném substrátu se provádí v termostatu při teplotě 28 °C a relativní vlhkosti 70 % po dobu 14 dnů. Fermentovaný substrát s nárůstem kultury Pythium oligandrum se poté suší při 30 °C v sušárně po dobu 48 hodin na konečnou vlhkost 5 %.
Takto získaný fermentovaný substrát se rozemele s použitím kulového mlýnu na částice o velikosti menší než 0.6 mm.
V takto připraveném preparátu technické kvality se nakonec stanoví počet oospór na I g preparátu a vzcházivost podle níže uvedených postupů. Asi 1 g připraveného technického preparátu Pythium oligandrum se odváží přesně na analytických vahách a rozmixuje 1 min v mixeru v destilované vodě tak, aby byla dodržena koncentrace přesně 2 g/l. Poté se přenese cca 1 ml suspenze do Sedgewick-Rafterovy počítací komůrky a v mikroskopu se počítají jednotlivé charakteristické oospory i oospory ve shlucích tak, aby bylo celkově napočítáno minimálně 100 oospór. Celé měření se třikrát opakuje, přičemž se před každým odběrem do komůrky suspenze oospór pečlivě promíchá. Nakonec se počet oospór na 1 g preparátu vypočítá podle vzorce n = (a.c)/(b.d.e), kde a je počet zjištěných oospór,
Z> je objem jednoho čtverce v komůrce (IxlxO. I mm = 1 x 10'4ml), c je objem destilované vody použité pro přípravu vzorku v ml (500 ml), d je váha vzorku v g (1 g) a e je počet čtverců v komůrce, v nichž byl fakticky napočítán zjištěný počet oospór.
Vzcházivost technického preparátu Pythium oligandrum se stanoví navážením cca 10 mg technického preparátu přesně na analytických vahách, a jeho rozmixováním ve vodě na vortexovém mixeru na koncentraci 1 mg/ml. Z takto připravené suspenze připravíme tří následná desetinásobná ředění a poté vysejeme po 100 I každého ředění na MEA médium.
Klíčivost odečítáme po 8 hodinách a 16 hodinách kultivace v sušárně při 28 °C, a poté též odečteme finální počet kolonií po 7 dnech kultivace.
Počet získaných oospór se pohybuje mezi 0,8 a 1,4 x 106 /g preparátu podle tohoto vynálezu v závislosti na použité šarži. Klíčivost se pohybuje zpravidla od 2 do 10 %. Šarže použitá v příkladu provedení 1 měla 1,0 x 106 oospór na g a klíčivost 13,1 %, tj. obsahovala 0,131 x 106 KTJ (kolonie tvořících jednotek, ekvivalent CFU - z anglického colony forming unit) na 1 g.
1.1.2 Příprava technického preparátu Capnocytophaga sputigena CCM3712
Původní kultura Capnocytophaga sputigena CCM3712 je po doručení ze sbírky mikroorganismů uchovávána při -70 °C. Pro kultivaci je malé množství kultury nejprve přeneseno na misku s „čokoládovým agarem“ obsahující tryptikasový sojový agar s 0,1 % kvasničným extraktem, 5 % defibrinovanou koňskou krev. Misky byly kultivovány v 5 % CO2 při 37 °C přes noc. Druhý den byly narostlé kolonie přeneseny do kapalné kultury obsahující tryptikasovou sojovou půdu s 0,1 % kvasničným extraktem, 0,002 % koňským heminem III, 0,0001 % menadionem a 0,1 % hydrogenuhličitanem sodným. Kultura byla třepána v atmosféře 5 % CO2 na orbitální třepačce při 200 ot/min. Jakmile dosáhla kultura středu logaritmické fáze I09 buněk/ml, byly baktérie sedimentovány centrifugám 10000 x gm, po dobu 20 min a poté promyty třikrát v 0,1 M sodnocitrátovém pufru pH 6,0. Po posledním promytí byl sediment baktérií pečlivě zbaven zbytků pufru a vysušen mrazovou sublimací (lyofiIizací).
Tímto postupem byl získán z 1 I kultury cca I g lyofilizovaných bakterií obsahujících 109 KTJ (CFU) na 1 mg prášku.
1.1.3 Příprava finální formulace duálního preparátu pro použití v dutině ústní.
Pro přípravu finální formulace byly použity tři různé varianty přípravku lišící se vzájemně svým relativním obsahem baktérie Capnocytophaga sputigena CCM3712. Tyto tři varianty byly označeny zkratkou PlaqueA, PlaqueB a PlaquelC. Přípravky byly připravovány pro zalisování do šumivé tablety o celkové váze 3 g na jednu aplikaci, proto jsou jednotlivé receptury přepočteny na tuto hmotnost. Složení jednotlivých přípravků je uvedeno v Tabulce 1.
Složka Pythium oligcmdrum je obsažena v duálním mikrobiálním preparátu PlaqueA, PlaqueB a PlaqueC v množství 0,6663.104 KTJ na 1 g.
Složka Capnocytophaga sputigena CCM3712 je obsažena v duálním mikrobiálním preparátu PlaqueA v množství 0,333.108 KTJ na 1 gram; v preparátu PlaqueB v množství 0,333.109 na 1 gram; a v preparátu PlaqueC v množství 3,333.1010 KTJ na 1 g.
Tabulka 1
| Složení duálních mikrobiálních preparátů pro použití v dutině ústní (mg na 3 g tabletu). Léčebná kůra zahrnuje 5 aplikací (5 tablet). | ||||
| Název přípravku | PlaqueA | PlaqueB | PlaqueC | |
| Název látky | CAS No. | Obsah (mg) | ||
| Pythium ol. | Viz. 1.1.1 | 150 (20x103 KTJ) | 150 (20x103 KTJ) | 150 (20x103 KTJ) |
| Capnocytoph. | Viz. 1.1.2 | 0.1 (108 KTJ) | 1 (109KTJ) | 10(10'° KTJ) |
| Sorbitol | 50-70-4 | 719,9 | 719 | 710 |
| PEG 6000 | 25322-68-3 | 90 | 90 | 90 |
| Menth.aroma | - | 30 | 30 | 30 |
| Oxid křemičitý | 7631-86-9 | 210 | 210 | 210 |
| Kys.citrónová | 77-92-9 | 930 | 930 | 930 |
| NaHCO3 | 144-55-8 | 810 | 810 | 810 |
| Na2CO3 | 497-19-8 | 60 | 60 | 60 |
| Celkem (mg) | 3000 | 3000 | 3000 |
1.2 Zkouška stability duálního mikrobiálního preparátu pro použití v dutině ústní
Zkouška stability duálního mikrobiálního preparátu pro použití v dutině ústní musí zjistit, zda nedošlo ke vzájemnému negativnímu působení obou mikrobiálních komponent po dobu skladování připraveného preparátu, nejméně však po dobu vykonání testů efektivity in vitro a in vivo. Jedna tableta s přípravkem PlaqueA, PlaqueB nebo PlaqueC se rozpustí ve 100 ml vlažné vody při cca 35 °C. Po dokonalém rozpuštění se odebere 1 ml na stanovení klíčivosti Pythia a 0.1 ml na stanovení KTJ Capnocytophagy.
Pro stanovení KTJ u Capnocytophagy ještě vzorek ředíme desítkovou ředicí řadou. Na stanovení KTJ použijeme třetí ředění pro PlaqueA , např. ředění I O3 x, čtvrté ředění pro PlaqueB např. ředění 104 x a páté ředění pro PlaqueC, např. ředění 10'x.
Zkouška stability se provádí ihned po výrobě přípravku, a dále po 1, 2, 3, 4, 5 a 6 měsících. Výsledky typického stabilitního testu jsou uvedené na obr. 2, znázorňujícím závislost počtu koloni na měsících skladování. Z výsledku je možné uzavřít, že vzcházivost Pythia se během šesti měsíců 17 skladování a následného použití preparátu nejprve poněkud snížila, a posléze ustálila na hodnotě odpovídající cca 75 % původně deklarované nominální hodnoty. Naopak u Capnocytophagy nedocházelo během zkoušeného období k význačným změnám ve viabilitě, která odpovídala původně deklarované hodnotě. Výsledek uvedený na obr. 1 se týká preparátu označeného jako PlaqueB. Výsledky získané s preparáty PlaqueA a PlaqueC byly v podstatě identické a nejsou proto v grafu pro jeho větší přehlednost uvedeny.
Lze tedy konstatovat, že zalisování původních aktivních komponent do šumivé tablety ani její aktivace před použitím duálního mikrobiáního preparátu podle tohoto vynálezu nesnižovaly významným způsobem životaschopnost ani jedné z komponent duálního preparátu pro použití v ústní dutině.
1.3 Zkouška efektivity připravených směsi s použitím in vitro testu
Cílem in vitro efektivitních testů je prokázat, že kombinace řasovky Pythium oligandrum Ml ATCC38472 a bakterie zeleného orálního komplexu Capnocytophaga sputigena CCM3712 bude působit synergním způsobem, tj. dojde ke zvýšení některé měřitelné in vitro aktivity řasovky Pythium oligandrum. Z tohoto hlediska byl zvolen standardní laboratorní test potlačení růstu patogeních kvasinek Candida albicans třech různých hyfy tvořících kmenů získaných z klinických isolátů v Nemocnici Pardubice a převezených pro další experimenty na MBÚ AV ČR (laboratoř Dr. Kolaříka). Vlastní provedení testu spočívalo v použití standardního aplikačního protokolu, který je vždy zahájen rozpuštěním tablety s obsahem samotného pythia (přípravek Chytrá houba® Pythie® BioPlus), popřípadě některé z výše uvedených testovacích tablet označovaných jako PlaqueA, PlaqueB a PlaqueC. Tablety byly rozpuštěny ve 100 ml vlažné vody při cca 35 °C. Poté 12,5 ml této suspenze bylo poté smícháno přímo s 12,5 ml dvakrát koncentrované směsi pro přípravu CDA (Czapek Dox Agar) agarových destiček. Na takto připravené desky bylo po jejich zchladnutí aplikováno rovnoměrně 105 patogenních kvasinek Candida albicans. Výsledky tohoto testu jsou uvedeny níže v Tabulce 2. Výsledky ukazují, že zatímco samotné Pythium oligandrum mělo významný vliv na potlačení růstu kvasinek na experimentálních miskách. Avšak, jeho kombinace s Capnocytophagou produkovala další posílení účinku. V případě všech tří patogenních získaných z klinických isolátů. Po týdenní kultivaci při 28 °C byl odečten počet narostlých kolonií ve srovnání s kontrolní miskou, přičemž snížení počtu kolonií oproti kontrole je měřítkem účinnost Pythia kvasinkových kmenů byl nejúčinnější přípravek za podmínek in vitro preparát PlaqueB, přípravky ve složení označeném jako PlaqueA a PlaqueC dosahovaly zhruba kolem 80 % této účinnosti.
Vzhledem k náročnosti klinických zkoušek prováděných s velkým množstvím duálních mikrobiálních preparátů podle tohoto vynálezu je jako přípravek pro preklinické a klinické zkoušky vybrán nejúčinnější přípravek PlaqueB.
Tabulka 2
| Testování duálních preparátů pro dutinu ústní v in vitro testu | ||||||
| C. albicans 2944 | C. albicans 2548 | C. albicans 2508 | ||||
| Počet | Relativní | Počet | Relativní | Počet | Relativní | |
| kolonií | účinnost | kolonií | účinnost | kolonií | účinnost | |
| na misce | vůči kontrole | na misce | vůči kontrole | na misce | vůči kontrole | |
| Kontrola | 954 | - | 1014 | - | 1253 | - |
| Pythium | 330 | 65,4 | 450 | 55,6 | 432 | 65,5 |
| PlaqueA | 285 | 70,1 | 230 | 77,3 | 253 | 79,8 |
| PlaqueB | 95 | 90,0 | 85 | 91,6 | 80 | 93,6 |
| PlaqueC | 273 | 71,4 | 243 | 76,0 | 260 | 79,2 |
Příklad 2 (Obr. 3, Obr. 4)
Kosmetický přípravek Biomycosin s účinnou látkou Pythium oligandrum byl na žádost Krajské nemocnice v Pardubicích ověřován na dvou skupinách pacientů s mikrobiálně zanícenými nebojícími se ranami, a to diabetické a nediabetické. Účastníci studie nebyli random izo ván i, ale jejich diabetický status byl monitorován, což na závěr studie umožnilo rozdělení dat do diabetické a nediabetické skupiny. Pokud jde o nediabetické pacienty, jejich průměrný věk činil 63,7 ±13,1 roků, přičemž pacienti byli ve věkovém rozpětí 37 - 79 let. Celkový počet sledovaných pacientů činil 19, z toho bylo 14 žen a 5 mužů, protože incidence zanícených bércových vředů je vyšší u žen než u mužů. Aplikace Biomycosinu proběhla v nemocnici pod dohledem lékařského personálu. Ambulantní pacienti byli po dobu podávání přípravku hospitalizováni. Jedno balení Biomycosinu bylo použito pro tři osmihodinové vlhké aplikace, přičemž celkem probíhala aplikace 4 dny po sobě. Tři dni po poslední aplikaci byly odebrány vzorky na mikrobiologické vyšetření a poté byli ambulantní pacienti propuštěni. Nadále probíhaly pravidelné měsíční kontroly u ambulantních i neambulantních pacientů po dobu 6 měsíců od aplikace. Výsledky jednoznačně prokázaly významné snížení mikrobiální zátěže a to zejména u G- tyčinek, anaerobních mikroorganismů a patogenních kvasinek. Korelační analýzou výsledků získaných pro nediabetické pacienty byla jasně prokázána negativní korelace mezi snížením mikrobiální zátěže G+ koky a zlepšením stavu klinické infekce u těchto pacientů. Tato negativní korelace byla zvláště nápadná pro kategorii „ostatních stafylokoků“, z nichž má na kůži zásadní důležitost zejména baktérie Staphylococcus epidermidi. Negativní korelace (y) pro ostatní stafylokoky byla charakterizovaná rovnicí y = -0,56x + 85,8 s korelačním koeficientem R2 = 0,87.
Vzhledem k závislosti průběhu léčby u tohoto onemocnění na věku a pohlaví, protože ženy jsou více náchylné, museli být nejprve pacienti rozděleni do dvou skupin a randomizováni v závislosti na věku a pohlaví. Průměrný věk pacientů v kontrolní skupině odpovídající podmínkám ošetření přípravkem obsahujícím pouze P. oligandrum činil 77,6 ± 9,8 let. U experimentální skupiny odpovídající ošetřovaní duálním preparátem tento parametr činil 78,0 ± 10,3 roků. Mezi věkem pacientů v obou skupinách tedy nebyl statisticky významný rozdíl. V obou skupinách byly zařazeny 3 ženy a 2 muži, procento žen tedy bylo v obou skupinách identické a činilo 67 %. Výsledky získané po oba způsoby aplikace jsou znázorněné na obr. 3. Ze získaných výsledků je reciproční vztah mezi množstvím odstraněných stafylokoků a sníženým zlepšením klinických příznaků infekce jasně patrný. U klinicky responzivních pacientů znázorněných na obr. 3 v levé části je jasně patrný vysoký obsah zachovaných stafylokoků během léčby preparátem s obsahem řasovky P. oligandrum a zároveň je jasné významné zlepšení klinických známek infekce, většinou na 20 až 50 % původního stavu. Naopak skupina klinicky neresponzivních pacientů, jejichž výsledky jsou znázorněné na obr. 3 v pravé části pozorujeme velmi výrazné snížení počtu stafylokoků zjištěných kultivačně (včetně druhu Staphylococcus epidermidis), avšak pokrok při odstranění klinických symptomů infekce byl u těchto pacientů velmi nízký.
Na základě těchto výsledků jsme zvažovali a ověřovali hypotézu, že potlačení některých G+ koků nebylo žádoucí, neboť postihlo zástupce fyziologické mikroflóry. Tuto pracovní hypotézu jsme testovali, tak že byly připraveny celkem tři verze duálního mikrobiálního přípravku podle tohoto vynálezu pro použití pro dlouhodobou eliminaci symptomů klinické infekce u nebojících se ran. Byla prokázána stabilita takových přípravků a provedeno sledování jejich efektivity v relevantním laboratorním testu. Detailní popis získaných výsledků je uveden v tomto příkladu, dále podrobněji popsaném. Souhrnně výsledky tohoto testování prokázaly, že při skladování ve formě suchého přípravku nedocházelo k negativnímu ovlivnění ani jedné z komponent duálního preparátu. Ve srovnání s doposud používaným jednosložkovým preparátem na bázi Pythium oligandrum pak došlo při použití mikrobiálního duálního preparátu ke statisticky významnému snížení mikrobiální kvasinkové zátěže i zlepšení vývoje klinické infekce.
2. Příprava, kontrola a testování účinnosti duálního mikrobiálního preparátu vhodného pro eliminaci symptomů klinické infekce u nehájících se ran u nediabetiků.
2.1 Protokol pro přípravu duálního mikrobiálního preparátu pro použití na nehájící se rány nediabetiků.
2.1.1 Příprava technického preparátu Pythium oligandrum Ml ATCC 38472.
Postup použitý pro tuto přípravu je identický s postupem popsaným v části 1.1.1.
Šarže použitá v příkladu provedení 2 měla 1,1 x I06 oospór na g a klíčivost 14,3 %, tj. obsahovala 0,157 x 106 KTJ (kolonie tvořících jednotek, ekvivalent CFU) na 1 g.
2.1.2 Příprava technického preparátu Staphylococcus epidermidis CCM2124
Původní kultura Staphylococcus epidermidis CCM2124 je po doručení ze sbírky mikroorganismů uchovávána při -70 °C. Pro kultivaci je malé množství kultury nejprve přeneseno na misku s tryptone soya agarem CM131 Oxoid. Misky byly kultivovány při 37 °C přes noc. Deset dobře separovaných kolonií bylo přeneseno do 21 Erlenmayerovy baňky obsahující 500 ml média o složení 30 g/1 peptonu, 10 g/1 kvasničného autolyzátu, 5 g/1 NaCI, 0.1 g CaCI2.2H2O a 1 ml trybutyrinu, pH média bylo upraveno na 8.0. Baktérie byly kultivovány do středu logaritmické fáze, poté byly baktérie sedimentovány centrifugací 10000 x g„, po dobu 20 minut a třikrát promyty v 0.1 M sodnocitrátovém pufru pH 6.0. Po posledním promytí byl sediment baktérií pečlivě zbaven zbytků pufru a vysušen mrazovou sublimací - lyofilizací.
Z 1 I kultury byl získán cca 0.6 g lyofilizovaných bakterií obsahujících 108 KTJ (CFU) na 1 mg prášku.
2.1.3 Příprava finální formulace duálního mikrobiálního preparátu pro použití na nehojící se rány nediabetiků.
Pro přípravu finální formulace byly použity tři různé varianty přípravku lišící se vzájemně svým relativním obsahem baktérie Staphylococcus epidermidis CCM2124, tyto tři varianty byly označeny pracovně zkratkou NonhealA, NonhealB a NonhealC. Přípravky byly připravovány pro použití vjednom balení obsahujícím 10 g sypkého preparátu na jednu aplikaci. Složení jednotlivých přípravků je níže uvedené v Tabulce 3 na následující straně.
Složka Pythium oligandrum je obsažena v duálním mikrobiálním preparátu NonhealA a NonheallB v množství 7,85.103 KTJ na 1 g; a NonhealC v množství 7,85.103 KTJ na 1 g.
Složka Staphylococcus epidemis CCM2124 je obsažena v duálním mikrobiálním preparátu NonhealA v množství 1 x 106 KTJ na 1 g; v preparátu NonhealB v množství I x 107 KTJ na I g; a v preparátu NonhealC v množství 1 x 108KTJ na 1 g.
2.2 Zkouška stability duálního mikrobiálního preparátu pro použití na nehojící se rány nediabetiků Zkouška stability duálního preparátu pro použití v dutině ústní musí zjistit, zda nedošlo ke vzájemnému negativnímu působení obou mikrobiálních komponent po dobu skladování připraveného preparátu, nejméně však po dobu vykonání testů efektivity in vitro a in vivo. Jedno balení, 10 g přípravku Nonheal A, Nonheal B nebo Nonheal C se resuspenduje v 250 ml vlažného fyziologického roztoku 9 g/1 NaCI při teplotě cca 35 °C. Po dokonalém resuspendování se odebere 1 ml na stanovení klíčivosti Pythia a 0,1 ml na stanovení KTJ (CFU) jednotek staphylokoka. Pro stanovení KTJ u staphylokoka ještě vzorek ředíme desítkovou ředicí řadou, a na stanovení KTJ použijeme prvé ředění pro Nonheal A, např. ředění 10 x, druhé ředění pro Nonheal B, např. ředění I02 x a třetí ředění pro Nonheal C, např. ředění 103 x. Zkouška stability se provádí ihned po výrobě přípravku, a dále po 1,2, 3, 4, 5 a 6 měsících. Výsledky typického stabilitního testu jsou uvedené na obr. 3. Z výsledku je možné konstatovat, že viabilita Pythia se během šesti měsíců skladování a následného použití preparátu nejprve poněkud snížila, a posléze ustálila na hodnotě odpovídající cca 75 % původně deklarované nominální hodnoty. Naopak, u staphylokoka nedocházelo během zkoušeného období k význačným změnám ve viabilitě, která odpovídala téměř původně deklarované hodnotě. Výsledek uvedený na obr. 4 se týká preparátu označeného jako NonhealB. Výsledky získané s preparáty NonhealA aNonhealC byly velmi podobné a nejsou proto v grafu pro jeho větší přehlednost uvedeny.
Tabulka 3
| Složení duálních mikrobiálních preparátů pro použití na nehojící se rány nediabetiků. Složení je uvedené v mg na 10 g sypkého přípravku. 1 léčebná kůra zahrnuje 4 aplikace (4 balení přípravku). | ||||
| Název přípravku | NonhealA | NonhealB | NonhealC | |
| Název látky | CAS No. | Obsah (mg) | ||
| P. oligandrum | Viz. 2.1.1 | 500 (78xlO;iKTJ) | 500 (78x10’KTJ) | 500 (78xlO’KTJ) |
| Staphylococcus. | Viz. 2.1.2 | 0,1 (107 KTJ) | 1 (108KTJ) | 10 (10y KTJ) |
| Oxid křemičitý | 7631-86-9 | 9499,9 | 9499 | 9490 |
| Celkem (mg) | 10000 | 10000 | 10000 |
Lze tedy konstatovat, že vysušením původních aktivních komponent a jejich uchovávání v přítomnosti silikagelu ani jejích aktivace před použitím preparátu podle tohoto vynálezu nesnižovaly významným způsobem viabilitu žádné z komponent duálního preparátu pro použití v ústní dutině. 2.3 Zkouška efektivity připravených směsí duálního mikrobiálního preparátu použitím in vitro testu
Cílem in vitro efektivitních testů je prokázat, že kombinace řasovky Pythium oligandrum Ml ATCC38472 a zdravé bakterie normálního kožního mikrobiomu Staphylococcus epidermidis CCM2124 bude působit synergním způsobem, tj. dojde ke zvýšení některé měřitelné in vitro aktivity řasovky Pythium oligandrum. Z tohoto hlediska byl zvolen standardní laboratorní test potlačení růstu patogeních kvasinek Candida albicans třech různých hyfy tvořících kmenů získaných z klinických isolátů v Nemocnici Pardubice a převezených pro další experimenty na MBLJ AV ČR. Vlastní provedení testu spočívalo v použití standardního aplikačního protokolu, který je vždy zahájen resuspendováním suchého přípravku s obsahem samotného pythia (přípravek Biomycosin), popřípadě některé z výše uvedených testovacích přípravků označených jako Nonheal A, B nebo C. Přípravky byly resuspendovány v 250 ml vlažného při teplotě cca 35 °C fyziologického roztoku. Poté 12,5 ml této suspenze bylo smícháno přímo s 12,5 ml dvakrát koncentrované směsi pro přípravu CDA (Czapek Dox agar) agarových destiček. Na takto připravené desky bylo po jejich zchladnutí aplikováno rovnoměrně 105 patogenních kvasinek Candida albicans získaných z klinických isolátů. Po týdenní kultivaci při 28 °C byl odečten počet narostlých kolonií ve srovnání s kontrolní miskou, přičemž snížení počtu kolonií oproti kontrole je měřítkem účinnost pythia. Výsledky tohoto testu jsou uvedeny níže v Tabulce 4. Výsledky ukazují, že zatímco samotné pythium mělo významný vliv na potlačení růstu kvasinek na experimentálních miskách, jeho kombinace se staphylokokem produkovala další posílení účinku. V případě všech tří patogenních kvasinkových kmenů byl nejúčinnější přípravek za podmínek in vitro preparát Nonheal B, přípravky ve složení označeném jako Nonheal A a Nonheal C dosahovaly zhruba kolem 50 % této účinnosti.
Vzhledem k náročnosti klinických zkoušek prováděných s velkým množstvím preparátů podle tohoto vynálezu je jako výchozí přípravek pro preklinické a klinické zkoušky navrhován nejúčinnější přípravek NonhealB.
Tabulka 4
| Testování duálních mikrobiálních preparátů pro nehojící se rány v in vitro testu | ||||||
| Číslo kmene | C. albicans 2944 | C. albicans 2548 | C. albicans 2508 | |||
| Sledované | Počet | Relativní | Počet | Relativní | Počet | Relativní |
| parametry | kolonií na | účinnost | kolonií na | účinnost | kolonií na | účinnost |
| misce | vůči kontrole | misce | vůči kontrole | misce | vůči kontrole | |
| Kontrola | 980 | - | 1013 | 988 | - | |
| Pythium | 335 | 65,8 | 364 | 64,1 | 370 | 62,6 |
| NonhealA | 270 | 72,4 | 255 | 74.8 | 262 | 73,5 |
| NonhealB | 102 | 89,6 | 98 | 90,3 | 107 | 89,2 |
| NonhealC | 283 | 71,1 | 248 | 75,5 | 260 | 73,7 |
Uvedený příklad na použití duálního mikrobiálního preparátu uvedený v tomto příkladu provedení pro nehojící se rány na kůži není omezující. Jsou samozřejmě možné i jiné použití zde neuvedené, např. použití v jiných případech oportunních mikrobiálních infekcí doprovázených dysbiózou na kůži, jako je atopický ekzém a lupenka.
Příklad 3 (Obr. 5A, Obr. 5B, Obr. 5C, Obr. 6,)
Z klinických pozorování získaných v oblasti péče o zdravou dutinu ústní, nehojící se rány a potlačení kvasinky u vaginálních kandidóz byly získány přesvědčivé důkazy, že Pythium oligandrum potlačuje a zabíjí patogenní kvasinky rodů Candida a Malassezia. Tento závěr byl pak nezávisle potvrzen laboratorním kultivačním testem na Mikrobiologickém ústavu AV ČR v Praze. V laboratorním testu byly zkoušeny v kompetičním testu celkem 4 klinické kmeny patogenní kvasinky Candida albicans, které byly isolovány v Nemocnici Pardubice, přičemž byla zjištěna jejich schopnost přecházet do hyfální formy růstu, což je důkazem klinické agresivity těchto kmenů. Jednalo se o kmeny Candida albicans označené 2508, 2548, 2558 a 2944. V kompetičním testu Pythium 23 oligandrum zcela přerostlo všechny 4 testované kmeny a to jak s použitím média MEA (malt extract agar), tak s použitím média PDA (potato dextrose agar). Po 10 dnech experimentu, tj. po skončení experimentu, byly ještě zbytky kvasinkových kmenů přerostlé pythiem přeneseny na médium CDA (Czapek-Dox agar). Na tomto médiu rostou kvasinky, ale ne Pythium oligandrum. Nicméně k žádnému růstu kvasinek na tomto testovacím médiu nedocházelo, což ukazuje, že Pythium oligandrum patogenní kvasinky nejen přerostlo, ale i zabilo. V návaznosti na tyto výsledky laboratorních zkoušek proto proběhly ve spolupráci s lékaři gynekologických ordinací v Praze, Rychnově nad Kněžnou, Vysokém Mýtě, Klášterci nad Ohří, Plzni a Uhlířských Janovicích následné systematické studie srovnávající účinky chemického antimykotika Clotrimazolu a přípravku FeelFresh u žen s opakovaným výskytem vaginálních kandidos. Na začátku testování bylo provedeno klinické hodnocení žen lékařem na šestibodové škále zahrnující nepohodlí, přítomnost vaginálního výtoku, svědění, bolesti, pálení a zarudnutí. Bylo provedeno počáteční mikrobiologické vyšetření na přítomnost patogenních kvasinek rodu Candida a laktobacilů, které jsou dominantními mikroorganismy normálního vaginálního mikrobiomu. Aplikace probíhaly po dobu 5 po sobě následujících dní aplikací Clotrimazolu nebo pomocí sedacích koupelí s přípravkem FeelFresh. Následně proběhla mikrobiologická kontrola po 10 dnech a 1 měsíci. Nakonec byla provedena studie závěrečná klinická a mikrobiologická kontrola po 3 měsících od aplikace. Na počátku studie byla intenzita klinických příznaků v kontrolní skupině s aplikací Clotrimazol a experimentální skupině s aplikací FeelFresh srovnatelné. Avšak, po 3 měsících byly výsledky hodnocení klinických příznaků (počet zjištěných klinických příznaků) statisticky významně lepší u skupiny aplikující FeelFresh ve srovnání s chemickým antimykotikem Clotrimazolenr. 2,57 ± 0,53 a 1,00 ± 1,52, p=0,035. Intenzitu kvasinkové infekce bylo možné sledovat kultivačně po 10 dnech, 1 měsíci a 3 měsících, tedy častěji než klinický obraz. Také výsledky v tomto ohledu byly velmi zajímavé, neboť prokázaly rychlé a statisticky významné snížení výskytu patogenních kvasinek u Clotrimazolu po 10 dnech, kdy počáteční hodnoty v arbitrárních jednotkách byly 3,71 ± 0,75 a 3,71 ± 0,48 pro aplikaci s Clotrimazol a Feel Fresh. Po 10 dnech však odpovídající hodnoty v arbitrárních jednotkách činily 1,28 ± 0,48 a 1,85 ± 0,38, p=0,04. Nicméně po 1 měsíci nebo dokonce 3 měsících se situace zcela obrátila a snížená hladina patogenních kvasinek již byla stabilizována pouze u pacientek používajících FeelFresh, kdy hodnoty po 1 měsíci u kontroly a aplikaci v arbitrárních jednotkách FeelFresh činily 2,42 ± 0,53 a 1,28 ± 0,48, p=0,008. Hodnoty v arbitrárních jednotkách po 3 měsících činily 3,14 ± 0,69 a 1,42 ± 0,78, p=0,007. Velmi zajímavá ovšem ještě byla pozitivní korelace jednak mezi zlepšením klinického stavu a koncentrací laktobacilů a jednak mezi odstraněním kvasinkové infekce a koncentrací laktobacilů. Tyto výsledky jasně ukazují, podobně jako již v předcházejících uváděných příkladech, že léčebný efekt mikroorganismu Pythium oligandrum obsaženého v přípravku FeelFresh je významně potencován přítomností zdravé mikroflory, v tomto případě laktobacilů. Z těchto výsledků bylo možné vyvodit pracovní hypotézu, že přítomnost laktobacilů významným způsobem zvyšuje účinnost potlačení kvasinky řasovkou P. oligandrum.
Studie k průkazu úlohy laktobacilů probíhala dvojitě zaslepeným způsobem, v němž byly obálky s preparáty připraveny a očíslovány administrativním pracovníkem nezasvěceným do průběhu studie. Po potvrzení klinické diagnózy a prvém odběru mikrobiologie podepsaly pacientky informovaný souhlas a byli instruování, jak aplikovat přípravky. Aplikace byly prováděny formou výplachů pět dnů po sobě pomocí dodaného vaginálního aplikátoru. Odborná prohlídka gynekologem byla provedena na počátku studie, a po 3 měsících, přičemž byl vždy kontrolován stav kvasinkové infekce, stav osídlení vaginální sliznice laktobacily. Výsledky klinické studie jsou přehledně prezentovány v grafické podobě na obr. 5A, 5B, a 5C.
Z hlediska klinického hodnocení na počátku a na konci studie je kontrolní skupina s aplikací klasického přípravku obsahujícího pouze řasovku Pythium oligandrum rozkolísaná, u některých žen došlo k účinné eliminaci příznaků, avšak u jiných pacientek nikoliv, jak je zřejmé z obr. 5A. Proto byly pacientky rozděleny do dvou skupin klinicky responzivních pacientek v levé části obr. 5 a klinicky neresponzivních pacientem v pravé části tohoto obrázku.
U klinicky responzivních pacientek došlo po třech měsících použití přípravku k významnému snížení výskytu kvasinka Candida albicans nq všech případech, zatímco u neresponzivních paceintek k takovému snížení nedocházelo (v případě jedné pacientky se dokonce objevilo zvýšení - obr. 5B). Zajímavý nicméně zůstává zejména fakt, že u responzivních pacientek byl ve všech případech výskyt laktobacilů mnohem vyšší, a v průběhu studie dokonce docházelo kjeho nárůstu na fyziologicky vysoké hodnoty (obr. 5C), zatímco u neresponzivních pacientek byl výskyt kvasinky významně nižší, ve dvou případech ještě doprovázený dalším poklesem.
Tyto výsledky potvrzují, že duální mikrobiální preparát pro použití na potlačení a eliminaci patogenních kvasinek vykazuje ve všech parametrech ve všech parametrech statisticky významně lepší výsledky ve srovnání se standardním preparátem.
Tuto hypotézu jsme proto ověřovali a testovali: byly připraveny celkem tři verze duálního mikrobiálního přípravku podle tohoto vynálezu pro použití v dutině ústní a byla prokázána stabilita takových přípravků a provedeno jejich klinické testování u pacientů s periodontálním onemocněním. Detailní popis získaných výsledků je uveden v Příkladu 3 tohoto vynálezu. Souhrnně výsledky tohoto testování prokázaly, že během vysušení a skladování v suchém stavu nedošlo ke vzájemnému negativnímu ovlivnění obou účinných mikrobiologických komponent. Výsledky laboratorních testů prokázaly největší účinnost pro duální přípravek VaginalB.
3. Příprava, kontrola a testování účinnosti duálního mikrobiálního preparátu podle tohoto vynálezu vhodného pro aplikaci na kůži a sliznice náchylné k výskytu patogenních kvasinek.
3.1 Protokol pro přípravu duálního mikrobiálního preparátu pro aplikaci na kůži a sliznice náchylné k výskytu kvasinek.
3.1.1 Příprava technického preparátu Pythium oligandrum Μ1 ATCC 38472.
Postup použitý pro tuto přípravu je identický s postupem uvedeným v části 1.1.1. Šarže použitá v příkladu provedení 3 měla 0,8 x 106 oospór na g a klíčivost 12,8 %, tj. obsahovala 0,102 x IO6 KTJ (kolonie tvořících jednotek, ekvivalent CFU) na 1 g preparátu.
3.1.2 Příprava technického preparátu Lactobacillus crispatus CCM7010
Původní kultura Lactobacillus crispatus CCM7010 je po doručení ze sbírky mikroorganismů uchovávána při -70 °C. Pro kultivaci je malé množství kultury nejprve přeneseno na agarovou misku s médiem pro kultivaci laktobacilů, obsahujícím v množství 5 g/1 kvasničný autolyzát, 10 g/1 hovězí extrakt, 10 g/1 peptone, 20 g/1 glukózu, 5 ml/1 Tween 80, 2 g/1 K2HPO4, 5 g/1 octan sodný, 2 g/1 diamonium citrát, 0,2 g/1 MgSO4.7H2O a 0,05 g/1 MnSO4.7H2O. pH po přidání všech komponent upravíme na hodnotu pH 6,2 - 6,6. Misky byly kultivovány při 37 °C přes noc. Deset dobře separovaných kolonií bylo přeneseno do 21 Erlenmayerovy baňky obsahující 500 ml média 6 o výše uvedeném složení. Baktérie byly kultivovány do středu logaritmické fáze, poté byly baktérie sedimentovány centrifugací 10000 x g,„ po dobu 20 min a třikrát promyty v 0,1 M sodnocitrátovém pufru pH 6.0. Po posledním promytí byl sediment baktérií pečlivě zbaven zbytků pufru a vysušen mrazovou sublimací - lyofilizací.
Z 1 I kultury byl získán cca 0,8 g lyofilizovaných bakterií obsahujících 109 KTJ (CFU) na 1 mg prášku.
3.1.3 Příprava finální formulace duálního preparátu pro aplikaci na kůži a sliznice náchylné k výskytu kvasinek.
Pro přípravu finální formulace byly použity tři různé varianty přípravku lišící se vzájemně svým relativním obsahem baktérie Lactobacillus crispatus CCM7010, tyto tři varianty byly označeny zkratkou VaginalA, VaginalB a VaginalC. Přípravky byly připravovány pro použití v jednom balení obsahujícím 2 g sypkého preparátu. Složení jednotlivých přípravků je níže uvedené v Tabulce 5 na následující straně. V přípravku jsou Pythium a Lactobacillus aktivními komponentami, silikagel se přidává jako sušidlo u důvodu uchování originálních vlastností a vzcházivosti obou aktivních komponent. Malé množství přidaného chloridu sodného napomáhá lepší aktivaci biologického prostředku, heřmánkové aroma funguje jako parfém.
Složka Pythium oligandrum je obsažena v duálním mikrobiálním preparátu VaginalA, VaginalB v množství 19,2.103 KTJ na 1 g. VaginalC v množství 19,2.103 KTJ na 1 g.
Složka Lactobacillus crispatus CCM7010 je obsažena v duálním mikrobiálním preparátu VaginalA v množství 0,5.108 KTJ, v preparátu VaginalB v množství 0,5.109 KTJ na 1 g, a v preparátu VaginalC v množství 0,5.1010 KTJ na I g.
3.2 Zkouška stability duálního preparátu pro použiti na kůži a sliznice náchylné k výskytu kvasinek.
Zkouška stability duálního preparátu pro použití na kůži a sliznice náchylné k výskytu kvasinek musí zjistit, zda nedošlo ke vzájemnému negativnímu působení obou mikrobiálních komponent po dobu skladování připraveného preparátu, nejméně však po dobu vykonání testů efektivity in vitro a in vivo. Jedno balení 2 g přípravku VaginalA, VaginalB nebo VaginalC se resuspenduje ve 500 ml vlažné vodovodní vody při teplotě cca 35 °C. Po dokonalém resuspendování se odebere 1 ml na stanovení klíčivosti Pythium oiligandrum a 0,1 ml na stanovení KTJ (CFU) jednotek laktobacila. Pro stanovení KTJ u laktobacila ještě vzorek ředíme desítkovou ředicí řadou, a na stanovení KTJ použijeme prvé ředění pro VaginalA - ředení 100 x, druhé ředění pro VaginalB - ředění 103 x a třetí ředění pro VaginalC - ředění 104 x. Zkouška stability se provádí ihned po smíchání přípravku a dále po 1,2, 3, 4, 5 a 6 měsících. Výsledky typického stabilitního testu jsou uvedené na obr. 6. Z výsledku je možné uzavřít, že viabilita Pythia se během šesti měsíců skladování a následného použití preparátu nejprve poněkud snížila, a posléze ustálila na hodnotě odpovídající cca 80 % původně deklarované nominální hodnoty. Naopak u laktobacila došlo během zkoušeného období pouze k mírnému snížení viability asi o 10 %. Výsledek uvedený na obr. 6 se týká preparátu označeného jako VaginalB. Výsledky získané s preparáty VaginalA a VaginalC byly velmi podobné a nejsou proto v grafu pro jeho větší přehlednost uvedeny.
Tabulka 5
| Složení duálních preparátů pro použití na kůži a sliznice náchylné k výskytu kvasinek. Složení je uvedené v mg na 2 g sypkého přípravku. 1 léčebná kůra zahrnuje 5 aplikací (5 přípravků). | ||||
| Název přípravku | VaginalA | VaginalB | VaginalC | |
| Název látky | CASNo. | Obsah (mg) | ||
| Pythium oligandrum | Viz. 3.1.1 | 376 (38,4 x 103 KTJ) | 376 (38,4 x 103 KTJ) | 376 (38,4 x I03 KTJ) |
| Lactobacillus | Viz. 3.1.2 | 0,1 (108 KTJ) | 1 (109KTJ) | 10(10'° KTJ) |
| Oxid křemičitý | 7631-86-9 | 1618.9 | 1618 | 1609 |
| NaCI | 7647-14-5 | 4 | 4 | 4 |
| Heřmánk. olej | 8022-66-2 | 1 | 1 | 1 |
| Celkem (mg) | 2000 | 2000 | 2000 |
Lze konstatovat, že vysušením původních aktivních komponent a jejich uchovávání v přítomnosti silikagelu ani jejích aktivace před použitím preparátu podle tohoto vynálezu nesnižovaly významným způsobem vzcházivost žádné z komponent duálního preparátu pro použití v ústní dutině.
3.3 Zkouška efektivity připravených směsí s použitím in vitro testu
Cílem in vitro efektivitních testů je prokázat, že kombinace řasovky Pythium oligandrum Ml ATCC38472 a zdravé bakterie normálního vaginálního mikrobiomu Lactobacillus crispatus CCM7010 bude působit synergním způsobem, tj. dojde ke zvýšení některé měřitelné in vitro aktivity řasovky Pythium oligandrum. Z tohoto hlediska byl zvolen standardní laboratorní test potlačení růstu patogeních kvasinek Candida albicans třech různých hyfy tvořících kmenů získaných z klinických isolátů v Nemocnici Pardubice a převezených pro další experimenty na MBÚ AV ČR (laboratoř Dr. Kolaříka). Vlastní provedení testu spočívalo v použití standardního aplikačního protokolu, který je vždy zahájen resuspendováním suchého přípravku s obsahem samotného Pythia oligandrum (přípravek FeelFreshi), popřípadě některé z výše uvedených testovacích přípravků označených jako Vaginal A, B nebo Vaginal C. Přípravky byly resuspendovány v 500 ml vlažné vody o teplotě cca 35 °C, a 12,5 ml této suspenze bylo poté smícháno přímo s 12,5 ml dvakrát koncentrované, ochlazené na teplotu 45 °C směsi pro přípravu CDA (Czapek Dox agar) agarových destiček. Na takto připravené desky bylo po jejich zchladnutí aplikováno rovnoměrně 105 patogenních kvasinek Candida albicans získaných z klinických isolátů. Po týdenní kultivaci při 28 °C byl odečten počet narostlých kolonií ve srovnání s kontrolní miskou, přičemž snížení počtu kolonií oproti kontrole je měřítkem účinnost Pythia oligandrum. Výsledky tohoto testu jsou uvedeny níže v Tabulce 6. Výsledky ukazují, že zatímco samotné Pythium oligandrum mělo významný vliv na potlačení růstu kvasinek na experimentálních miskách, jeho kombinace s laktobacilem produkovala další posílení účinku. V případě všech tří patogenních kvasinkových kmenů byl nejúčinnější přípravek za podmínek in vitro preparát VaginalB, přípravky ve složení označeném jako VaginalA a VaginalC dosahovaly zhruba kolem 50 % této účinnosti.
Vzhledem k náročnosti klinických zkoušek prováděných s velkým množstvím preparátů byl jako přípravek pro další preklinické a klinické zkoušky vybrán nejúčinnější duální mikrobiální preparát VaginalB.
Tabulka 6
Testování duálních mikrobiálních preparátů pro potlačení kvasinek v in vitro testu
| C. albicans 2944 | C. albicans 2548 | C. albicans 2508 | ||||
| Počet kolonií na misce | Relativní účinnost oproti kontrole | Počet kolonií na misce | Relativní účinnost oproti kontrole | Počet kolonií na misce | Relativní účinnost oproti kontrole | |
| Kontrola | 1013 | - | 998 | - | 1120 | - |
| Pythium | 302 | 70,2 | 325 | 67,4 | 332 | 70,3 |
| VaginalA | 272 | 73,1 | 265 | 73,4 | 273 | 75,6 |
| VaginalB | 102 | 89,9 | 103 | 89,5 | 89 | 86,7 |
| VaginalC | 273 | 73,1 | 273 | 72,6 | 267 | 76,2 |
Příklad 4 (Obr. 7)
Významná pozitivní korelace mezi přítomností kvasinek a zlepšením klinického stavu infekce u nebojících se ran se projevila stejně u diabetických jako u nediabetických pacientů. Příslušné korelační koeficienty činily 0,4 a 1,0. Tato korelace vedla k úvaze, zda přítomnost kvasinek nebo jejich komponent nemůže způsobovat aktivaci mikroorganismu Pythium oligandrum. Vzhledem ktomu, že biologické testy obsahující současně tři různé mikroorganismy jsou z hlediska svého provedení a vyhodnocení velmi složité, byla zvolena varianty zahrnutí mrtvých pekařských kvasinek Saccharomyces cerevisiae ve formě tzv. kvasničného autolyzátu, který je běžně komerčně dostupný. Pomocí standardního destičkového testu na MEA agaru. Jeho složení bylo: 20g/L sladový extrakt, 20 g/L glukóza, I g/L pepton, 20 g/L agar. Byla sledována interakce řasovky Pythium oligandrum s dermatofyty Trichophyton interdigitale DMF2477 a Microsporum fulvum P245, u nichž bylo již dříve vyzkoušeno, že potlačují růst těchto dermatofytů asi na 50 % neinhibovaného růstu. Po přidání kvasničného extraktu v koncentraci 1 g/L do agarového nosiče však opravdu došlo k aktivaci Pythia spojené se zvýšením inhibice růstu na 75 % u trichophytona a 80 % u microspora. Také tento výsledek tedy prokázal, jak je výsledek biologické schopnosti Pythia potlačovat některé dermatofyty závislý na jeho fyziologickém stavu, přičemž může být jeho biologická schopnost významně zvýšena přítomnosti dokonce i usmrcených cílových organismů nebo jejich další formou zpracovaných komponent a extraktů, v tomto případě komerčního kvasničného autolyzátu. Z těchto výsledků bylo možné vyvodit pracovní hypotézu, že dokonce i usmrcené kvasinky mají vliv na zvýšení účinnosti řasovky Pythium oligandrum.
Optimální duální přípravek pro eliminaci původců mykóz (dermatofytóz) byl zkoušen u pacientů s mykotickým onemocněním nohou zahrnujícím dermatofytální infekce na ploskách, v meziprstí a za nehty - onychomykózy. Léčebný efekt byl hodnocen klinicky kožními lékaři a zároveň byly na počátku a na konci sledovaného období prováděné mikrobiologické testy. Pacienti byli randomizováni do 2 skupin. V prvé skupině probíhala léčba jednosložkovým přípravkem s obsahem řasovky P. oligandrum, ve druhé skupině byl podán kombinovaný preparát s obsahem kvasničného autolyzátu. Výsledky prokázaly dobrou klinickou účinnost již u preparátu obsahujícího pouze P. oligandrum, u duálního mikrobiálního preparátu však byla klinická účinnost ještě zlepšena (kontrola 3,0 ± 0, experiment 3,6 ± 0,5, t-test, p=0,01). Podobně tomu bylo i u zlepšení mikrobiologie dle Obr. 9C (kontrola 2,0 ± 0, experiment 2,6 ± 0,5, t-test, p=0,01).
Tyto výsledky potvrzují, že duální mikrobiální preparát podle tohoto vynálezu pro použití na mykózy nohou vykazuje statisticky významně lepší výsledky ve srovnání se standardním monopreparátem.
Celkem u 25 morčat domácích typu Cavia porcellus proběhla studie sledující účinky jednosložkového přípravku obsahující řasovku P. oligandrum. Efekt přípravku byl hodnocen veterinárními lékaři a zároveň potvrzen odběrem mikrobiologických vzorků vždy na počátku a na konci sledovaného období, kde byl po ukončení pokusu u všech jedinců negativní na přítomnost dermatofytních plísní a kvasinek. Celkové skóre klinického hodnocení účinků přípravku bylo 1,72 ± 0,87, p < 0,05, při známce 1 - výborný efekt až ke známce 4 bez efektu. Mnohokrát vědci popsaná zoonotická charakteristika dermatofytických infekcí nám zaručuje, že mechanismus těchto infekcí u zvířat je totožný s mykotickými infekcemi u lidí. Vzhledem k náročnosti klinických zkoušek a k faktu, že výsledky získané při hodnocení efektivity jednosložkového preparátu je shodovaly v porovnání testovaných humánních i zvířecích skupin, pro další ověření efektivity duálního preparátu je možné odkázat se na bod 4.3.
Obě série výše provedených experimentů prokázala potencující vliv kvasinek nebo produktů jejich metabolismu na účinnost přípravků obsahujících P. oligandrum při eliminaci původců dermatofytóz. Tento potencující účinek mohl být způsobován aktivací živými kvasinkami nebo aktivací jejich metabolity bez bezprostředního požadavku výskytu živých kvasinek. Systematickým výzkumem se jevila poslední možnost jako pravděpodobnější a byla tedy vyslovena hypotéza, že P. oligandrum je ve své schopnosti eliminovat dermatofyty povzbuzováno určitými komponentami souvisejícími s kvasinkovým metabolismem.
Tato pracovní hypotéza byla proto testována: byly připraveny celkem tři verze duálního mikrobiálního přípravku podle tohoto vynálezu pro použití na mykózy nohou a byla prokázána stabilita takových přípravků a provedeno jejich klinické testování u pacientů s tímto onemocněním. Detailní popis získaných výsledků je uveden v Příkladu 4 tohoto vynálezu. Souhrnně výsledky tohoto testování prokázaly, že ve srovnání s živou variantou duálních mikrobiálních preparátů musí být usmrcený, neživý partnerský mikroorganismus resp. jeho komponenty přidávány v relativně velkém množství, v případě testovaného kvasničného autolyzátu se osvědčilo přidání do cca 10 hmotn. %. U takto připraveného preparátu pak opravdu docházelo ke statisticky významnému zvýšení účinnosti oproti klasickému jednosložkovému přípravku. Toto zvýšení bylo ekvivalentní zvýšení pozorovanému v případě, že se vyskytla kvasinková infekce endogenně v důsledku přirozeně se vyskytující koinfekce, k níž dochází cca ve 20 % případů.
4. Příprava, kontrola a testování účinnosti duálního mikrobiálního preparátu podle tohoto vynálezu vhodného pro aplikaci v případě mykóz nohou včetně onychomykóz u lidí a dermatofytóz u zvířat.
4.1 Protokol pro přípravu duálního preparátu pro použití u mykóz lidí a zvířat.
4.1.1 Příprava technického preparátu Pythium oligandrum Ml ATCC 38472. Postup použitý pro tuto přípravu je identický s postupem uvedeným v části 1.1.1. Šarže použitá v příkladu provedení 4 měla 1,3 x I06 oospór na g a klíčivost 14.5 %, tj. obsahovala 0,189 x 106 KTJ (kolonie tvořících jednotek, ekvivalent CFU) na 1 g preparátu.
4.1.2 Kvasničný autolyzát, představující druhou komponentu tohoto preparátu, byl zakoupen u firmy Oxoid.
4.1.3 Příprava finální formulace duálního preparátu pro aplikaci u mykóz
Pro přípravu finální formulace byly použity tři různé varianty přípravku lišící se vzájemně svým relativním obsahem kvasničného autolyzátu, tyto tři varianty byly označeny zkratkou MycosinA, MycosinB a MycosinC. Přípravky byly připravovány pro zalisování do šumivé tablety o celkové váze 3 g, proto jsou jednotlivé receptury přepočteny na tuto hmotnost. Složení jednotlivých přípravků je níže uvedené v Tabulce 7.
Složka Pythium oligandrum je obsažena v duálním mikrobiálním preparátu MycosinA, MycosinB a MycosinC v množství 12,6.103 KTJ na I g.
Složka kvasničného autolyzátu je obsažena v duálním mikrobiálním preparátu MycosinA v množství 50 mg na 3g tabletu, tj. v množství 1,66 % hmotn. na jednu tabletu; v preparátu MycosinB v množství 100 mg na 3g tabletu, t.j. 3,33 % na 3 g tabletu; a 5 % hmotn. na jednu 3g tabletu.
Tabulka 7
Složení duálních preparátů pro použití u mykóz a dermatofytóz.
Složení je uvedené v mg na 3 g tabletu.
léčebná kůra zahrnuje 3 aplikace (3 tablety).
| Název přípravku | MycosinA | MycosinB | MycosinC | |
| Název látky | CASNo. | Obsah (mg) | ||
| Pythium oligandrum | Viz. 4.1.1 | 200 (37,8 x 10’ KTJ) | 200 (37,8 x 10’ KTJ) | 200 (37,8 x 10 KTJ) |
| Kvasnič.autolyz. | Viz. 4.1.2 | 50 | 100 | 150 |
| Oxid křemičitý | 7631-86-9 | 110 | 60 | 10 |
| Sorbitol | 50-70-4 | 1260 | 1260 | 1260 |
| Kyselina citrónová | 77-92-9 | 690 | 690 | 690 |
| NaHCO3 | 144-55-8 | 540 | 540 | 540 |
| PEG 6000 | 25322-68-3 | 90 | 90 | 90 |
| Na2CO} | 497-19-8 | 60 | 60 | 60 |
| Celkem (mg) | 3000 | 3000 | 3000 |
4.2 Zkouška stability duálního preparátu vhodného pro aplikaci v případě mykóz a dermatofytóz
Zkouška stability nebyla pro daný preparát prováděna, jelikož je z literárních údajů dobře známé, že přítomnost kvasničného autolyzátu ve vysušeném preparátu neovlivňuje vlastnosti řasovky P. oligandrum.
4.3 Zkouška efektivity připravených směsí s použitím in vitro testu
Cílem in vitro efektivitních testů je prokázat, že kombinace řasovky Pythium oligandrum Ml ATCC38472 a komponent usmrcených kvasinek obsažených v kvasničném autolyzátu budou působit synergním způsobem, tj. dojde ke zvýšení některé měřitelné in vitro aktivity řasovky Pythium oligandrum. Z tohoto hlediska byl zvolen standardní laboratorní test potlačení růstu čtyř druhů dermatofytů, o nichž je prokázáno, že jsou známými původci mykotických onemocnění zoonotického charakteru. Konkrétně byly testy provedeny s použitím čtyř běžných dermatofytů, od každého z nich byly použity dva různé kmeny: a to Trichophyton interdigitale (Ti), Trichophyton erinacei (Te), Microsporum fulvum (Mf) a Microsporum canis (Mc). Výsledky stanovení aktivit jednotlivých přípravků jsou uvedeny na obr. 8, přičemž počet narostlých kolonií dermatofytů je vztažen ke kontrole bez účinné látky. Výsledky ukázané na obr. 8 se týkají přípravku MycosinB, výsledky získané s přípravky MycosinA a MycosinC byly kvalitativně obdobné, ale výsledná schopnost potlačit dermatofyty dosahovala pouze asi 30 % nárůstu na kontrole. Výsledek na obr. 7 jasně prokazuje, že schopnost potlačovat dermatofyty má jednoduchý přípravek obsahující pouze P. oligandrum jako účinnou látku, bylo dosaženo potlačení na úrovni 50 - 60 % kontrolního nárůstu. Samotný kvasničný autolyzát v použitém testu žádné schopnosti potlačit růst dermatofytů neměl, výsledky byly zhruba na úrovni kontrolního experimentu. U duálního preparátu bylo prokázáno statisticky významné zvýšení účinnosti zhruba na úroveň 10 % infekce u kontrolních vzorků.
Vzhledem k náročnosti klinických zkoušek prováděných s velkým množstvím preparátů podle tohoto vynálezujel jako přípravek pro preklinické a klinické zkoušky navrhován nejúčinnější přípravek Mycosin B.
Příklad 5
Také aktivace jiných unikátních schopností mikroskopické řasovky Pythium oligandrum komponentami zdravé mikroflóry stojí za zaznamenání. V našich předcházejících studiích byla prokázána unikátní schopnost technické látky Pythium oligandrum rozrušovat biofilmy tvořené patogenními bakteriemi osídlujícími nebojící se rány. Výsledky studie byly přednesené na XII. celostátním kongresu s mezinárodní účastí na téma „Mezioborová spolupráce při léčbě ran a kožních defektů“ konaném ve dnech 23. a 24. ledna 2014 na fakultě zdravotnických studií Univerzity Pardubice. Provedená měření prokázala, že ze 160 zkoušených bakteriálních kmenů klinicky izolovaných z nebojících se ran jich 129 tvořilo biofilm. Dále bylo prokázáno 70 % snížení tvorby biofilmu u biofilm-pozitivních kmenů po přidání zárodků řasovky Pythium oligandrum přípravkem Biomycosin, z tohoto počtu bylo ti 43 % testovaných kmenů zjištěné snížení biofilmu velmi výrazné, došlo ke snížení aktivity tvorby biofilmu o více než 50 %. U 17 % vyšetřovaných kmenů nebyla in vitro zaznamenána žádná změna v intenzitě tvorby biofilmu, u zbývajících 13 % sledovaných kmenů nebyly získány reprodukovatelné výsledky. Nejméně se in vitro dařilo ovlivnit produkci biofilmů v případě sledovaných kmenů Stenotrophomonas maltophilia a Pseudomonas aeruginosa. Pokud však byly do inkubačních směsí přidány kromě zárodků řasovky též baktérie normálního kožního mikrobiomu Staphylococcus epidermidis, došlo ke snížení tvorby biofilmů o více než 50 % i u dvou výše zmíněných obtížných kmenů. Tento zajímavý jev společně s poznatky již publikovanými [32], společně prokazují, že komponenty normálního fyziologického mikrobiomu se mohou kromě svých metabolických regulačních funkcí též podílet na snížení intenzity biofilmu tvořícího se s účastí patogenních mikroorganismů.
Cílem in vitro efektivitních testů je prokázat, že kombinace řasovky Pythium oligandrum Ml ATCC38472 a zdravé bakterie normálního kožního mikrobiomu bude působit synergním způsobem, tj. dojde ke zvýšení některé měřitelné in vitro aktivity řasovky Pythium oligandrum. Dalším velmi důležitým faktorem, který je třeba ověřit, je specifita takového působení. V předcházejících experimentech byly v probiotických preparátech často aplikovány komponenty fyziologického mikrobiomu, ovšem bez zachování topologické specifity. Účinnost takto podaných preparátů byla většinou velmi nízká, což dobře koreluje s odlišným mikrobiálním složením fyziologických mikrobiomů v topologicky odlišných lokalitách lidského těla s různou expozicí vnějšímu prostředí i různými metabolickými niché. Jednoduchý laboratorní test tvorby biofilmů byl tedy použit pro ověření této hypotézy, jak je popsáno v tomto příkladu provedení. Tvorba biofilmu byla měřena na základě absorbce modrého mikrobiálního barviva znázorňujícího intenzitu tvorby biofilmu, přičemž každý experiment byl prováděn třikrát nezávisle vtriplikátu [38]. Pro průkaz ovlivnění životaschopnosti mikroorganismů obsažených v biofilmech byla ještě tato životaschopnost také měřena testem vitálního barvení podle literární citace [39].
Výsledky těchto stanovení prováděných jednak s preparáty obsahujícími pouze mikroskopickou řasovku P. oligandrum podle vynálezu CZ 302 297 B2, jednak s optimalizovanými duálními mikrobiálními preparáty popsanými v příkladech provedení 1, 2 a 3 dle předkládaného vynálezu jednoznačně prokázaly, že k optimálnímu rozrušení biofilmů docházelo vždy pouze v případě duálních preparátů obsahujících fyziologickou mikrobiální komponentu obsaženou v mikrobiomu relevantní topologie. Biofilmy dutiny ústní tedy byly nejúčinněji rozrušovány duálním mikrobiálním preparátem obsahující dominantní fyziologický mikrob této lokalizace, zatímco efekt jiných fyziologických komponent byl minoritní. Podobné důkazy o specifitě pak byly prokázány i v případě kožního a vaginálního mikrobiomu.
Takto získané výsledky jsou velmi významné, protože ukazují, že neexistuje univerzální probiotický ani duální mikrobiální preparát vhodný pro dlouhodobé potlačení symptomů oportunních mikrobiálních infekcí, ale účinný je vždy pouze preparát s obsahem topologicky relevantní mikrobiální komponenty.
Tabulka 8.
| Vliv duálních mikrobiálních přípravků podle patentu CZ 302 297 B2 a podle tohoto vynálezu na tvorbu a aktivitu mikrobiálních společenstev tvořících biofdm v dutině ústní (konkrétně sledována tvorba biofilmů pro baktérie Streptococcus gordonii a Fusobacterium nucleatum). | ||
| Použitý preparát | Tvorba biofilmů (Asvll) * | Aktivita biofilmů (A4V0)* |
| Kontrola | 1,05 ±0.15 | 0,90 ± 0,04 |
| Chytrá Houba Pythie BioPlus | 0,69 ±0,10 | 0,57 ± 0,04 |
| Plaque B | 0,12 ±0,08 | 0,10 ±0,01 |
| Biomycosin | 0,70 ±0.11 | 0.56 ±0.03 |
| Nonheal B | 0.72 ±0.10 | 0.53 ±0.04 |
| Feel Fresh | 0,50 ± 0,08 | 0,45 ± 0,03 |
| Vaginal B | 0,51 ±0,07 | 0,44 ± 0,04 |
* Je uvedena průměrná hodnota absorbance ± směrodatná odchylka vypočtená ze třech nezávislých stanovení, z nichž každé bylo provedeno v triplikátu (tři nezávislá měření).
5.1 Vliv duálních mikrobiálních preparátů na rozrušení biofilmů obsahujících bakterie dutiny ústní.
V tomto testu byly použity jednoduché laboratorní testy tvorby a viability biofilmů používající jako sledované komponenty dvě bakterie dutiny ústní, Streptococcus gordonii a Fusobacterium nucleatum. Obě tyto bakterie mají při tvorbě mikrobiálních biofilmů dutiny ústní klíčovou úlohu: Streptococcus je totiž jedinou bakterií schopnou se zachytit přímo na zubní sklovině v agresivním prostředí dutiny ústní, zatímco svým rozměrem veliké baktérie rodu Fusobacterium tvoří důležitá záchytná centra pro kolonizaci bakteriemi oranžového a červeného komplexu a invazivními patogeny typu Aggregatibacter actinomycetemcommitans. Výsledky laboratorního testu jsou uvedené v Tabulce 8 na předcházející straně. Výsledky jasně ukazují, že zatímco u jednoduchého preparátu obsahujícího pouze řasovku P. oligandrum docházelo pouze k menšímu ovlivnění biofilmů, k velmi výtaznému rozrušení i omezení viability orálního biofilmů došlo pouze pomocí duálního preparátu PlaqueB. Poněkud významnější rozrušení biofilmů způsobené přípravkem FeelFresh a VaginalB lze přičítat vyššímu procentuálnímu obsahu pythia v tomto přípravku.
5.2 Vliv duálních mikrobiálních preparátů na rozrušení biofilmů obsahujících bakterie nehájících se ran.
V tomto testu byly použity jednoduché laboratorní testy tvorby a viability biofilmů používající jako sledované komponenty dvě bakterie tvořící biofilmy v nebojících se ranách, totiž Stenotrophomonas maltophilia a Pseudomonas aeruginosa. Tyto bakterie byly použity z toho důvodu, že v předcházejících testech prováděných Dr. Karlem Menclem na Oddělení klinické mikrobiologie Nemocnice Pardubice byly tyto dva kmeny odolné na rozrušení biofilmu pomocí jednoduchých preparátů používajících pouze řasovku Pythium oligandrum. Výsledky uvedené v Tabulce 9 ovšem jasně ukazují, že duální mikrobiální preparát určený pro zlepšení klinické infekce u nebojících se ran a 5 obsahující normální komponentu kožního mikrobiomu Staphylococcus epidermidis byl schopen tento nedostatek účinně překonat a zajistit účinné rozrušení biofilmu u těchto odolných druhů. Určitý menší vliv zaznamenal i preparát VaginalB obsahující laktobacily, u nichž byla taková aktivita popsána [33].
Tabulka 9
| Vliv duálních mikrobiálních přípravků podle patentu CZ 302 297 B2 a podle tohoto vynálezu a aktivitu mikrobiálních společenstev tvořících biofilm v nebojících se ranách (konkrétně sledována tvorba biofilmu pro baktérie Stenotrophomonas maltophilia a Pseudomonas aeruginosa). | ||
| Použitý preparát | Tvorba biofilmu (A5W)) * | Aktivita biofilmu (A4ím)* |
| Kontrola | 1,10 ± 0.25 | 0,86 ±0,05 |
| Chytrá Houba Pythie BioPlus | 0,70 ±0,08 | 0,58 ± 0,03 |
| Plaque B | 0,68 ± 0,07 | 0,56 ± 0,04 |
| Biomycosin | 0,60 ±0,10 | 0,50 ±0,03 |
| Nonheal B | 0,13 ±0,07 | 0,10 ± 0,01 |
| Feel Fresh | 0,50 ±0,08 | 0,44 ± 0,04 |
| Vaginal B | 0,31 ±0,07 | 0,25 ± 0,02 |
* Je uvedena průměrná hodnota absorbance ± směrodatná odchylka vypočtená ze třech nezávislých stanovení, z nichž každé bylo provedeno v triplikátu (tři nezávislá měření).
Tabulka 10
| Vliv duálních mikrobiálních přípravků podle patentu CZ 302 297 B2 a podle tohoto vynálezu na tvorbu a aktivitu mikrobiálních společenstev tvořících biofilm v místech náchylných ke kvasinkovým infekcím (konkrétně sledována tvorba biofilmu pro patogenní kvasinku Candida albicans). | ||
| Použitý preparát | Tvorba biofilmu (A5m) * | Aktivita biofilmu (A4W)* |
| Kontrola | 1,08 ±0,20 | 0,96 ± 0,05 |
| Chytrá Houba Pythie BioPlus | 0,72 ± 0,09 | 0,56 ±0,04 |
| Plaque B | 0,70 ± 0,08 | 0,55 ± 0,05 |
| Biomycosin | 0,70 ±0,10 | 0,54 ± 0,02 |
| Nonheal B | 0,68 ± 0,07 | 0,53 ± 0,02 |
| Feel Fresh | 0,50 ± 0,07 | 0,44 ±0,01 |
| Vaginal B | 0,07 ± 0,02 | 0,06 ±0,01 |
* Je uvedena průměrná hodnota absorbance ± směrodatná odchylka vypočtená ze třech nezávislých stanovení, z nichž každé bylo provedeno v triplikátu (tři nezávislá měření).
5.1 Vliv duálních mikrobiálních preparátů na rozrušení biofilmů tvořených patogenními kvasinkami
V tomto testu byly použity jednoduché laboratorní testy tvorby a viability biofilmů používající jako sledovanou komponetu kvasinku Candida albicans. K nejúčinnějšímu rozrušení tohoto biofilmů docházelo pomocí duálního mikrobiálního preparátu VaginalB, jak je evidentní z výsledků uvedených v Tabulce 10 výše. Tyto poznatky mohou mít obecný význam, protože patogenní kvasinka Candida albicans často tvoří kombinované mikrobiální biofilmy v kombinaci s některými druhy patogenních bakterií.
Příklad 6 (Obr. 8)
Velkou předností duálních mikrobiálních preparátů podle předkládaného vynálezu je možnost jejich preventivního použití, k čemuž je možno využít až desetinásobně nižších hodnot aktivních komponent na základě možnosti účinné kolonizace a dlouhodobé propagace na místě určení. Účinného mykoparazitismu řasovky P. oligandrum a antifungálního působení některých jiných mikrobiálních kmenů je ovšem možné použít též k ochraně životního a pracovního prostředí před plísněmi.
V lékařské literatuře je dobře popsáno, že plísně nacházející se v životním a pracovním prostředí mohou vystřelovat škodlivé spory do svého okolí. Jestliže jejich průměrná koncentrace ve vzduchu přesáhne hodnotu 500 životaschopných spor na 1 m3, mohou se podle standardů Světové zdravotnické organizace (WHO) již plně projevit škodlivé vlivy vedoucí k alergiím, respiračním onemocněním nebo dokonce depresím.
Na základě vynálezu CZ 302 297 B2 byl vyvinut a je úspěšně používán protiplísňový prostředek BioRepel obsahující P. oligandrum sloužící zejména k eliminaci plísní ze zdí, stropů, podlah a jiných prostor zamořených místností. Současně jsou k tomuto účelu používány jiné mikrobiální preparáty schopné eliminovat plísně na základě principu antibiózy využívající k těmto účelům zejména hojně rozšířený bacil Bacillus amyloliquefaciens.
Efektivita duálního preparátu pro eliminaci plísní a kvasinek z životního prostředí založeného na kombinaci dvou výše uvedených mikroorganismů se testuje v terénních experimentech za podmínek jejich faktického použití. Experimentálním objektem je například stěna ve vlhké místnosti s rovnoměrným výskytem černé plísně Aspergillus niger, přičemž před aplikací a 6 měsíců po aplikaci měříme koncentraci spor v místnosti a kvantitavně se vyhodnocuje též přítomnost plísně přímo ve stěrech z materiálu odebraného ze stěn standardním způsobem. Pro aplikaci se 3 g preparátu rozdělí do dvou sáčků, sáček A obsahuje 1 g přípravku a sáček B obsahuje 2 g přípravku. Sáček A se resuspenduje v 10 I vlažné vody a veškerá zasažená plocha se přetře houbičkou namočenou do tohoto přípravku. Po zavadnutí se ještě stejná oblast přetře houbičkou navlhčenou do roztoku B, který se připravý resuspendováním sáčku B v 1.5 I vlažné vody. Odběry na zjištění efektivity jsou prováděny po 1 měsíci, 3 měsících a 6 měsících, kdy je terénní pokus ukončen. Jako efektivní je přípravek hodnocen v případě, kdy se množství spor ve spadu sníží na méně než 500 (WHO norma) a přítomnost plísně zjišťovaná stěrovou zkouškou sníží na stupeň 1 (přítomná sporadicky pouze po kultivaci). Konkrétní výsledek terénních experimentů ve dvou různých lokalitách je znázorněn na Obr. 8. Je zřetelné, že v obou sledovaných lokalitách po 6 měsících po aplikaci došlo k požadovanému snížení koncentrace spor v ovzduší na hodnotu pod 500 pouze při použití duálního preparátu, ačkoliv obě jeho komponenty vykazovaly jisté snížení oproti kontrole (Obr. 8A). Podobně pouze duální preparát snížil faktický výskyt plísní na zdi prokazovaný stěrovou zkouškou na cílovou hodnotu kolem 1,0. I v tomto případě byl efekt jednotlivých preparátů pouze částečný a nebylo dosaženo cílové hodnoty (Obr. 8B).
Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že duální mikrobiální preparát pro eliminaci plísní a kvasinek z životního prostředí vykazuje lepší výsledky než standardní preparát.
Tato hypotéza byla námi dále systematicky testována a ověřována. V rámci tohoto ověření jsme připravili dle postupů popsaných v tomto příkladu provedení tři různé varianty kombinovaného preparátu a jejich účinnost vůči cílovým plísním jsme ověřovali za podmínek in vitro.
5. Příprava, kontrola a testování účinnosti duálního mikrobiálního preparátu vhodného pro eliminaci plísní a kvasinek z životního prostředí.
6.1 Protokol pro přípravu duálního preparátu pro použiti na nehájící se rány nediabetiků.
6.1.1. Příprava technického preparátu Pythium oligandrum Μ1 ATCC 38472.
Postup použitý pro tuto přípravu je identický s postupem uvedeným v části 1.1.1. Šarže použitá v příkladu provedení 6 měla 1,0 x 106 oospór na g a klíčivost 12,6 %, tj. obsahovala 0,126 x 106 KTJ (kolonie tvořících jednotek, ekvivalent CFU) na 1 g preparátu.
6.1.2. Příprava technického preparátu Bacillus amyloliquefaciens CCM1084
Původní kultura Bacillus amyloliquefaciens CCM 1084 je po doručení ze sbírky mikroorganismů uchovávána při -70 °C. Pro kultivaci je malé množství kultury nejprve přeneseno na misku s agarem a médiem 10 pro kultivaci bacilů o složení peptone, 5 g/l, hovězí extrakt, 3 g/l, MnSO4.H2O 0.01 g/l, pH média upraveno na 7.0. Misky byly kultivovány při 37 °C přes noc. Deset dobře separovaných kolonií bylo přeneseno do dvou 21 Erlenmayerovy baňky obsahující 500 ml média 10 výše uvedeného složení. Baktérie byly kultivovány do středu logaritmické fáze, poté byly baktérie sedimentovány centrifugací (10000xgav, 20 min) a třikrát promyty v 0.1 M sodnocitrátovém pufru pH 6.0. Po posledním promytí byl sediment baktérií pečlivě zbaven zbytků pufru a vysušen mrazovou sublimací (lyofilizací).
Z I I kultury byl získán cca 0.6 g lyofilizovaných bakterií obsahujících 108 KTJ (CFU) na 1 mg prášku.
6.1.3. Příprava finální formulace duálního preparátu pro použití pro eliminaci plísní a kvasinek z životního prostředí.
Pro přípravu finální formulace byly použity tři různé varianty přípravku lišící se vzájemně svým relativním obsahem baktérie Bacillus amyloliquefaciens CCM1084, tyto tři varianty byly označeny zkratkou MouldA, MouldB a MouldC. Přípravky byly připravovány pro použití v jednom balení obsahujícím 3 g sypkého preparátu (jde o sáček A obsahující 1 g a sáček B obsahující 2 g sypkého preparátu). Složení jednotlivých přípravků je níže uvedené v Tabulce 11.
Tabulka 11
| Složení duálních preparátů pro eliminaci plísní a kvasinek z životního prostředí. Složení je uvedené v mg na 3 g sypkého přípravku. | ||||
| Název přípravku | Mould A | MouldB | MouldC | |
| Název látky | CASNo. | Obsah (mg) | ||
| Pythium | Viz. 1.1.1 | 750 (94,5 x 103 KTJ) | 750 (94,5 x 10 KTJ) | 750 (94,5 x 104 KTJ) |
| Bacilus | Viz. 1.1.2 | 0,1 (107 KTJ) | 1 (IO8KTJ) | 10(109 KTJ) |
| Silikagel | 7631-86-9 | 2499,9 | 2499 | 2490 |
| Celkem | 3000 | 3000 | 3000 |
6.2 Zkouška stabilit duálního preparátu pro eliminaci plísní a kvasinek z životního prostředí
Zkouška stability duálního preparátu pro použití v dutině ústní musí zjistit, zda nedošlo ke vzájemnému negativnímu působení obou mikrobiálních komponent po dobu skladování připraveného preparátu, nejméně však po dobu vykonání testů efektivity in vitro a in vivo. Jedno balení (3 g) přípravku MouldA, MouldB nebo MouldC se resuspenduje v 10000 ml vlažné vody (teplota cca 35 °C). Po dokonalém resuspendování se odebere 10 ml na stanovení klíčivosti Pythia a I ml na stanovení KTJ (CFU) jednotek bacila. Pro stanovení KTJ u bacila ještě vzorek ředíme desítkovou ředicí řadou, a na stanovení KTJ použijeme neředěný preparát pro MouldA (ředení 1 x), prvé ředění pro MouldB (ředění 10 x) a druhé ředění pro MouldC (ředění 10” x). Zkouška stability se provádí ihned po výrobě přípravku, a dále po 1, 2, 3, 4, 5 a 6 měsících. Z výsledku je možné uzavřít, že viabilita Pythia se během šesti měsíců skladování a následného použití preparátu nejprve poněkud snížila, a posléze ustálila na hodnotě odpovídající cca 75 % původně deklarované nominální hodnoty. Naopak u bacila nedocházelo během zkoušeného období k význačným změnám ve vzcházivosti, která odpovídala téměř původně deklarované hodnotě.
Lze tedy uzavřít, že vysušením původních aktivních komponent a jejich uchovávání v přítomnosti silikagelu významným způsobem vzcházivost žádné z komponent duálního preparátu.
6.3 Zkouška efektivity připravených směsí s použitím in vitro testu
Cílem in vitro efektivitních testů je prokázat, že kombinace řasovky Pythium oligandrum Ml ATCC38472 a zdravé bakterie normálního kožního mikrobiomu Staphylococcus epidermidis CCM2124 bude působit synergním způsobem, tj. dojde ke zvýšení některé měřitelné in vitro aktivity řasovky Pythium oligandrum. Z tohoto hlediska byl zvolen standardní laboratorní test potlačení růstu kontaminující plísně na stěnách Aspergillus niger. Vlastní provedení testu spočívalo v použití standardního aplikačního protokolu, který je vždy zahájen resuspendováním suchého přípravku s obsahem samotného pythia (přípravek BioRepel), popřípadě některé z výše uvedených testovacích přípravků označených jako MouldA, B nebo C. Přípravky byly resuspendovány v 250 ml vlažného (cca 35 °C) fyziologického roztoku, a 12,5 ml této suspenze bylo poté smícháno přímo s 12,5 ml dvakrát koncentrované směsi pro přípravu MEA agarových destiček. Na takto připravené desky bylo po jejich zchladnutí aplikováno rovnoměrně 105 plísňových mikrokonidií plísně Aspergillus niger.. Po týdenní kultivaci při 28 °C byl odečten počet narostlých kolonií ve srovnání s kontrolní miskou, přičemž snížení počtu kolonií oproti kontrole je měřítkem účinnost pythia. Výsledky tohoto testu jsou uvedeny níže v Tabulce 12. Výsledky ukazují, že zatímco samotné pythium mělo významný vliv na potlačení růstu kvasinek na experimentálních miskách, jeho kombinace se staphylokokem produkovala další posílení účinku. V případě všech tří patogenních kvasinkových kmenů byl nejúčinnější přípravek za podmínek in vitro preparát MouldB, přípravky ve složení označeném jako MouldA a MouldC dosahovaly zhruba kolem 50 % této účinnosti. Vzhledem k náročnosti terénních tesů je pro další terénní zkoušky navrhován nejúčinější přípravek MouldB.
Tabulka 12
| Testování duálních preparátů pro eliminaci plísní a kvasinek z prostředí | ||||||
| Aspergillus niger | Aspergillus niger | Aspergillus niger | ||||
| Počet | Rel.účin. | Počet | Rel.účin. | Počet | ReLúčin. | |
| Kontrola | 1054 | - | 1064 | - | 1110 | - |
| Pythium | 340 | 67,7 | 350 | (>Ί,\ | 352 | 68,2 |
| MouldA | 287 | 72,8 | 280 | 73,7 | 273 | 75,4 |
| MouldB | 105 | 90,0 | 85 | 92,0 | 80 | 92,8 |
| MouldC | 289 | 72,5 | 283 | 73,4 | 270 | 75,7 |
Uvedený příklad na použití duálního mikrobiálního preparátu uvedený v tomto příkladu provedení pro eliminaci plísní nebo kvasinek z okolního prostředí není omezující. Tento typ duálního mikrobiálního preparátu může být výhodně použit jako prevence výskytu plísní a kvasinek v životním a pracovním prostředí, což může být pro osoby trpící oportuními mikrobiálními infekcemi důležité.
Průmyslová využitelnost
Řešení je určeno pro aplikace pro zdravou dutinu ústní, nebojící se rány jako jsou bércové vředy, na kůži a pro potlačení kvasinek vyskytujících se na výše uvedených místech a na sliznici urogenitálního traktu, i projiná místech lidského těla, zejména potom na kůži napadené plísňovými nebo kvasinkovými infekcemi.
A 4A ·· ·:
Citovaná literatura [1] Aas J A, Paster BJ, Stokes LN a spol (2005) J Clin Microbiol 43, 5721-5732.
[2] Ainamo J, Barmes D, Baegric D (1982) Int Dent J 32, 281-289.
[3] Arabatzis M a spol (2007) Br J Dermatol 157, 681-689.
[4] Berezov AB, Darveau RP (2011) Periodontol 2000 55, 36-47.
[5] Burne RA, Zeng L, Ahn SJ a spol (2012) Adv Dent Res 24, 77-80.
[6] Calderone RA, Fonzi WA 62001) Trends Microbiol 9, 327-335.
[7] US 5,190,746 A (issued March 2, 1993), Cassels JF, London J.
[8] Cutting KF, White R (2004) Br J Community Nurs 9:S6-S 15.
[9] Darveau RP (2010) Nat Rev Microbiol 8, 481-490.
[10] DeBernardis F, Liu H, O‘Mahony R a spol (2007) J Infect Dis 195, 149-157.
[1 l]Dewhirst FE, Chen T, Izard J a spol (2010) J Bacteriol 192, 5002-5017.
[12]EWMA Patient Outcome Group (2010) J Wound Care 19, 239-268.
[ 13]Findley K, Oh J, Yang J a spol (2013) Nature 498, 367-370.
[!4]Frandin C, Kretschmar M, Nichterlein T a spol (2003) Mol Microbiol 47, 1523-1543.
[15] Gottrup E, Apelqvist J, Bjansholt T a spol (2013) J Wound Care 22, S1-S89.
[16] Gow NAR, Hubě B (2012) Curr Opin Microbiol 15, 406-412.
[18] Grice EA, Segre JA (2012) Annu Rev Genomics Human Genet 13, 151-170.
[19] Hajishengalis G, Liang S, Payne MA a spol (2011) Cell Host & Microbe 10, 497-506.
[20] Holt SC, Ebersole JL (2005) Periodontol 2000 38, 72-122.
[21 ]Hube B (2004) Curr Opin Microbiol 7, 336-341.
[22] Human Microbiome Project Consortium (2012) Nature 486, 207-214.
[23] Kostov G, Angelev M, Denkova Z a spol. (2011) Eng Life Sci 11,517-527.
[24] Kotnik T (2007) Slov Vet Res, 44 (3): 63-73.
[25] Lang NP, Adler R, Joss A a spol (1990) J Clin Periodontol 17, 714-721.
[26] WO 2013/122 931 A2 (publ. 22.8.2013), Lanzalaco AC,Charbonneau DL,Howard BW.
[27] Liu B, Faller RR, Klitgord N a spol (2012) PLoS One 7, e37919.
[28] Morrell J, Stratman E (2011) J Agromedicine, 16:4, 244-250.
[29] Nakagawa Y, Ohno N, Murai T (2003) J Infect Dis 187, 710-713.
[30] Okuda K, Kato T, Ishihara K (2004) Oral Dis 10, 5-12.
[31] CA 2374938 Al (publ. 30. 11.2000) Reid G, Bruce A.
[32] WQ2008/077251(publ.3.7.2008),Smoragiewicz W,Karska-Wysocki,Bazo,Ruiz Liquet.
[33] Stapleton AE a spol (2011) Clin Infect Dis 52, 1212-1217.
[34] CZ 302 297 B6 (publ. 29.12.2010), Suchánek M, Klimeš R.
[35] Teughels W, Durukan A, Ozcelik O a spol (2013) J Clin Periodontol 40, 1025-1035.
[36] CZ 9883 U (publ. !4.4.2000)._Veselý, D, Veselý L.
[37] Wounds UK (2010) Aberdeen: Wounds UK 2010. Best practice statement: use of topical antiseptic antimicrobial agents in wound management.
[38] Moskowitz SM, Foster JM, Emerson J aspol. (2004) J Clin Microbiol 42, 1915-1920.
[39] Bruzual I, Riggler P, Hadley S a spol. (2007) J Antimicrob Chemother 59, 441-450.
Claims (15)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí, zejména symptomů způsobených dysbiosou, vyznačující se tun, ze zahrnuje dvě základní mikrobiální komponenty ve vzájemném synergním působeni, a to mikroskopickou řasovku Pythium oligandrum a komponentu mikrobiomu, přičemž komponentou mikrobu je fyziologický mikrobiom lidského nebo zvířecího původu nebo mikrobiom pochází ze životního prostředí.
- 2. Duální mikrobiální preparát podle nároku 1 vyznačující se tím, že mikroskopická řasovka Pythium oligandrum i komponenta fyziologického mikrobiomu jsou přítomny v podobě umožňující jejich vzklíčení, následné namnožení a kolonizací cílových tkání.Duální mikrobiální preparát podle nároků 1 a 2 vyznačující se tím, že mikroskopická rasovka Pythium oligandrum obsahuje množství 103 až 107 KTJ (kolonie tvořících jednotek) na 1 g.
- 4. Duální mikrobiální preparát podle nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že mikroskopická rasovka Pythium oligandrum obsahuje množství 104až I05 KTJ (kolonie tvořících jednotek) na 1 g.
- 5. Duální mikrobiální preparát podle nároku 1 až 4 vyznačující se tím, že komponenta fyziologického mikrobiomu obsahuje množství 105až x 1012 KTJ (kolonie tvořících jednotek) na1 g·
- 6. Duální mikrobiální preparát podle nároku 1 až 5 vyznačující se tím, že komponenta fyziologického mikrobiomu obsahuje množství 106 až 1O8 * 10 * KTJ (kolonie tvořících jednotek) naI g·
- 7. Duální mikrobiální preparát podle nároku 1 až 6 vyznačující se tím, že pro obě mikrobiální komponenty je zdrojem živin fermentovaný substrát obsažený v řasovce Pythium oligandrum.
- 8. Duální mikrobiální preparát podle nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že dále obsahuje nejméně jednu z pomocných složek ze skupiny zahrnující:desikant jako je oxid křemičitý;komponenty pufračního systému jako je kyselina citrónová, hydrogenuhličitan sodný a uhličitan sodný;protispékací látka, jako je sorbitol nebo polyethylenglykol; a prostředek pro tvorbu fyziologického osmotického prostředí, jako je chlorid sodný.
- 9. Duální mikrobiální preparát podle nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že komponentou fyziologického mikrobiomu je jedna z komponent zdravého mikrobu dutiny ústní, jako je bakterie Capnocytophaga sputigena.
- 10. Duální mikrobiální preparát podle nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že komponentou fyziologického mikrobiomu je lidský mikrobiom, a to jedna z komponent zdravého mikrobiomu kůže, jako je bakterie Staphyloccocus epidermidis.
- 11. Duální mikrobiální preparát podle nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že komponentou fyziologického mikrobiomu je lidský mikrobiom, a to jedna z komponent zdravého vaginálního mikrobiomu, jako je peroxidy produkující Lactobacillus crispatus.
- 12. Duální mikrobiální preparát podle nároku 1 vyznačující se tím, že buď mikroskopická řasovka Pythium oligandrum nebo komponenta fyziologického mikrobiomu jsou přítomny ve formě neživých složek, jako usmrcené buňky, buněčné extrakty, nebo isolované buněčné frakce.
- 13. Duální mikrobiální preparát podle nároku 12, vyznačující se tím, že pro řasovku Pythium oligandrum je mikrobiálním aktivátorem kvasničný autolyzát v množství 0, 1 % až 10 % hm. z celkového množství duálního preparátu.
- 14. Duální mikrobiální preparát podle nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že pomocné látky jsou upraveny způsobem umožňujícím aplikaci ve formě mastí, krémů, olejů, čípků nebo ve formě tekutého vodného přípravku.
- 15. Duální mikrobiální preparát podle nároku 1, vyznačující se tím, že mikrobiální komponenta pocházející ze životního prostředí obsahuje 105 až 10rKTJ (kolonie tvořících jednotek) na 1 g.
- 16. Duální mikrobiální preparát podle nároku 15, vyznačující se tím, že mikrobiální komponentou pocházející ze životního prostředí je baktérie Bacillus amyloliquefaciens.
Priority Applications (14)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-23A CZ201523A3 (cs) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí |
| AU2016207124A AU2016207124A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections |
| CN201680016097.2A CN107405407A (zh) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | 用于长期抑制或预防机会性微生物感染症状的二元微生物制品 |
| MX2017009315A MX2017009315A (es) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | Preparacion microbiana dual para la supresion o prevencion a largo plazo de los sintomas de infecciones microbianas oportunistas. |
| JP2017537954A JP2018507185A (ja) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | 日和見微生物感染症の症状の長期抑制または予防のための複合微生物製剤 |
| EP16712714.1A EP3244902B1 (en) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections |
| US15/543,471 US20180000877A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections |
| PCT/CZ2016/000007 WO2016112881A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections |
| CA2973127A CA2973127A1 (en) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections |
| KR1020177022684A KR20170123613A (ko) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | 기회 감염성 미생물 감염증의 증상의 장기간 억제 또는 예방용 이중 미생물 제제 |
| BR112017014974A BR112017014974A2 (pt) | 2015-01-16 | 2016-01-15 | preparação microbiana dupla para supressão a longo prazo ou prevenção de sintomas de infecções microbianas oportunistas. |
| PH12017501264A PH12017501264A1 (en) | 2015-01-16 | 2017-07-10 | Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections |
| ZA2017/04740A ZA201704740B (en) | 2015-01-16 | 2017-07-13 | Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections |
| IL253485A IL253485A0 (en) | 2015-01-16 | 2017-07-13 | A dual antimicrobial preparation for the suppression or long-term prevention of symptoms of opportunistic microbial infections |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-23A CZ201523A3 (cs) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ201523A3 true CZ201523A3 (cs) | 2016-07-27 |
Family
ID=55642194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-23A CZ201523A3 (cs) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Duální mikrobiální preparát pro dlouhodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20180000877A1 (cs) |
| EP (1) | EP3244902B1 (cs) |
| JP (1) | JP2018507185A (cs) |
| KR (1) | KR20170123613A (cs) |
| CN (1) | CN107405407A (cs) |
| AU (1) | AU2016207124A1 (cs) |
| BR (1) | BR112017014974A2 (cs) |
| CA (1) | CA2973127A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ201523A3 (cs) |
| IL (1) | IL253485A0 (cs) |
| MX (1) | MX2017009315A (cs) |
| PH (1) | PH12017501264A1 (cs) |
| WO (1) | WO2016112881A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA201704740B (cs) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190064563A (ko) * | 2016-07-01 | 2019-06-10 | 바이오 아겐스 리서치 앤드 디벨롭먼트-바드 에스.알.오. | 피부 및 점막 상에 피부진균증 및 효모 감염의 치료를 위해 생존가능한 마이코기생충 미생물 피티움 올리간드럼(Pythium oligandrum)을 갖는 제제, 미생물 피티움 올리간드럼의 세포 생존능을 결정하는 방법 및 상기 제제를 적용하는 방법 |
| KR20240017085A (ko) * | 2016-10-14 | 2024-02-06 | 바이오프레파라티, 스폴. 에스 알. 오 | 피씨움 올리간드럼을 함유한 생물학적 액체 항진균 산물 및 제조 방법 |
| CZ201975A3 (cs) * | 2019-02-11 | 2020-03-11 | BiomCare s.r.o. | Kombinované několikastupňové mikrobiální přípravky a způsob jejich aplikace |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5190746A (en) | 1989-05-10 | 1993-03-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Plaque inhibiting oligosaccharide |
| US5190734A (en) | 1991-02-22 | 1993-03-02 | Frushour Robert H | Modified end assembly for high pressure, high temperature reaction vessels |
| CA2374938A1 (en) | 1999-05-25 | 2000-11-30 | Gregor Reid | Lactobacillus compositions and methods for preventing wound infections and biofilm formation on implantable surgical devices |
| CZ9883U1 (cs) | 1999-11-18 | 2000-04-14 | Dasa Doc Ing Drsc Vesely | Prostředek na ochranu pokožky využívající houbu Pythium oligandrum |
| US20030091540A1 (en) * | 2001-10-16 | 2003-05-15 | Nawaz Ahmad | Compositions and methods for delivering antibacterial, antifungal and antiviral ointments to the oral, nasal or vaginal cavity |
| SE528382C2 (sv) * | 2004-10-05 | 2006-10-31 | Probi Ab | Probiotiska lactobacillusstammar för förbättrad vaginal hälsa |
| US20090324547A1 (en) * | 2006-01-04 | 2009-12-31 | Wikstroem Maude | Probiotic Oral Health Promoting Product |
| WO2008077251A1 (en) | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Bio-K Plus International Inc. | Growth inhibition and elimination of methicillin-resistant staphylococcus aureus by lactic acid bacteria |
| CZ302297B6 (cs) | 2009-11-04 | 2011-02-09 | Bio Agens Research And Development - Bard, S.R.O. | Protiplísnová smes s houbovým organismem Pythium oligandrum |
| WO2011128297A2 (en) * | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations |
| JP6284881B2 (ja) * | 2011-10-25 | 2018-02-28 | アーチ・パーソナル・ケアー・プロダクツ・リミテッド・パートナーシップ | 連続または同時発酵の抽出物を含有する組成物 |
| CA2863681A1 (en) * | 2012-02-14 | 2013-08-22 | The Procter & Gamble Company | Topical use of a skin-commensal prebiotic agent and compositions containing the same |
| WO2014147528A1 (en) * | 2013-03-20 | 2014-09-25 | Basf Corporation | Synergistic compositions comprising a bacillus subtilis strain and a biopesticide |
| CN103651582B (zh) * | 2013-09-17 | 2016-03-02 | 周剑平 | 广谱复合微生物杀菌剂及其制备方法 |
-
2015
- 2015-01-16 CZ CZ2015-23A patent/CZ201523A3/cs unknown
-
2016
- 2016-01-15 JP JP2017537954A patent/JP2018507185A/ja active Pending
- 2016-01-15 EP EP16712714.1A patent/EP3244902B1/en active Active
- 2016-01-15 BR BR112017014974A patent/BR112017014974A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-01-15 CN CN201680016097.2A patent/CN107405407A/zh active Pending
- 2016-01-15 AU AU2016207124A patent/AU2016207124A1/en not_active Abandoned
- 2016-01-15 WO PCT/CZ2016/000007 patent/WO2016112881A1/en active Application Filing
- 2016-01-15 KR KR1020177022684A patent/KR20170123613A/ko unknown
- 2016-01-15 CA CA2973127A patent/CA2973127A1/en not_active Abandoned
- 2016-01-15 US US15/543,471 patent/US20180000877A1/en not_active Abandoned
- 2016-01-15 MX MX2017009315A patent/MX2017009315A/es unknown
-
2017
- 2017-07-10 PH PH12017501264A patent/PH12017501264A1/en unknown
- 2017-07-13 IL IL253485A patent/IL253485A0/en unknown
- 2017-07-13 ZA ZA2017/04740A patent/ZA201704740B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2973127A1 (en) | 2016-07-21 |
| WO2016112881A1 (en) | 2016-07-21 |
| ZA201704740B (en) | 2018-08-29 |
| AU2016207124A1 (en) | 2017-07-27 |
| MX2017009315A (es) | 2017-11-08 |
| CN107405407A (zh) | 2017-11-28 |
| KR20170123613A (ko) | 2017-11-08 |
| EP3244902A1 (en) | 2017-11-22 |
| US20180000877A1 (en) | 2018-01-04 |
| IL253485A0 (en) | 2017-09-28 |
| EP3244902B1 (en) | 2020-09-16 |
| BR112017014974A2 (pt) | 2018-03-20 |
| PH12017501264A1 (en) | 2018-02-05 |
| JP2018507185A (ja) | 2018-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harriott et al. | Importance of Candida–bacterial polymicrobial biofilms in disease | |
| Silva et al. | Comparison of denture microwave disinfection and conventional antifungal therapy in the treatment of denture stomatitis: a randomized clinical study | |
| de Almeida Gomes et al. | In vitro evaluation of the antimicrobial activity of calcium hydroxide combined with chlorhexidine gel used as intracanal medicament | |
| Bowler et al. | Wound microbiology and associated approaches to wound management | |
| JP7189899B2 (ja) | 哺乳動物において健康な微生物フローラを促進するための組成物および方法 | |
| Gottumukkala et al. | Comparative evaluation of the efficacy of two controlled release devices: Chlorhexidine chips and indigenous curcumin based collagen as local drug delivery systems | |
| Gottschick et al. | Screening of compounds against Gardnerella vaginalis biofilms | |
| Uludamar et al. | Clinical and microbiological efficacy of three different treatment methods in the management of denture stomatitis | |
| Rossoni et al. | Galleria mellonella as an experimental model to study human oral pathogens | |
| Jafari et al. | Vinegar as a removing agent of Candida albicans from acrylic resin plates | |
| Tamura et al. | Ions released from a S-PRG filler induces oxidative stress in Candida albicans inhibiting its growth and pathogenicity | |
| Öztan et al. | Antimicrobial effect, in vitro, of gutta-percha points containing root canal medications against yeasts and Enterococcus faecalis | |
| EP3244902B1 (en) | Dual microbial preparation for long-term suppression or prevention of symptoms of opportunistic microbial infections | |
| Ariamanesh et al. | The effectiveness of Nigella sativa alcoholic extract on the inhibition of Candida albicans colonization and formation of plaque on acrylic denture plates: An in vitro study | |
| Pärnänen et al. | Antimicrobial and Anti-Inflammatory Oral Effects of Fermented Lingonberry Juice—A One-Year Prospective Human Intervention Study | |
| Kang et al. | Facilitated saliva secretion and reduced oral inflammation by a novel artificial saliva system in the treatment of salivary hypofunction | |
| CZ28816U1 (cs) | Duální mikrobiální preparát pro dloubodobé potlačení nebo prevenci symptomů oportunních mikrobiálních infekcí | |
| Pequeno et al. | Matricaria Recutita Extract (Chamomile) to reduce Candida Albicans and Entrobacter Cloacae biofilms: in vitro study | |
| Le Bars et al. | Denture Plaque Management of Denture-Related Stomatitis | |
| JP6667501B2 (ja) | 生存菌類寄生微生物ピシウム・オリガンドラムを含む、皮膚および粘膜の皮膚糸状菌症および酵母感染症の処置用製剤、微生物ピシウム・オリガンドラムの細胞生存率を決定する方法ならびに該製剤の適用方法 | |
| Massoura | An investigation into the antibacterial mechanism of honey | |
| Leelapornpisid et al. | Effectiveness of Maprang “Bouea macrophylla Griffith” seed extract against endodontopathogenic microorganisms in a multispecies bacterial-fungal biofilm | |
| Krynicka et al. | The role of sodium hypochlorite in atopic dermatitis therapy: a narrative review | |
| Roeslan et al. | Efficacy of World Health Organization-recommended homemade hand sanitizer against bacteria and fungus | |
| Martorano-Fernandes et al. | Cinnamaldehyde and α-terpineol as an alternative for using as denture cleansers: antifungal activity and acrylic resin color stability |