CZ2014714A3

CZ2014714A3 - Interferometrický systém a způsob měření prostorového rozložení indexu lomu

Info

Publication number: CZ2014714A3
Application number: CZ2014-714A
Authority: CZ
Inventors: Pavel Kolman; Radim ChmelĂk
Original assignee: Vysoké Učení Technické V Brně
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2014-10-20
Publication date: 2016-06-22
Also published as: CZ306015B6; US20170322151A1; WO2016062296A1; EP3209999A1

Abstract

Způsob měření prostorového rozložení indexu lomu je vhodný k využití v digitální holografické mikroskopii k pozorování vzorků v odraženém i procházejícím záření a k pozorování luminiscenčních vzorků. Interferometrický systém zahrnuje první větev (9.1) a druhou větev (9.2) s množstvím optických prvků. První větev (9.1) zahrnuje v rovině opticky sdružené s předmětovou rovinou (8.1) difrakční mřížku (7) pro vytvoření achromatického hologramu s prostorovou nosnou frekvencí ve výstupní obrazové rovině (8.2).

Description

Interferometrický systém a způsob měření prostorového rozložení indexu lomu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká interferometrického systému a způsobu měření prostorového rozložení indexu lomu k využití v digitální holografické mikroskopii k pozorování vzorků v odraženém i procházejícím záření a k pozorování luminiscenčních vzorků.

Dosavadní stav techniky

V současnosti je známo několik uspořádání interferometrických systémů založených na mřížkovém interferometru.

Příklady takových uspořádáni jsou uvedeny například v užitných vzorech CZ 8547, CZ 19150 a v patentu CZ P 302491. Tyto systémy využívají interference dvou vzájemně koherentních svazků, přičemž jeden je ovlivněn pozorovaným předmětem a druhý prochází zcela mimo předmět. Dva vzájemně koherentní svazky vzniknou rozdělením osvětlovacího svazku vycházejícího z externího zdroje.

V těchto uspořádáních dosud nebylo možné využít výhod holografického zobrazení pro fluoreskující předměty. V případě fluorescence je zdrojem světla sám vzorek, který mohl být dosud umístěn pouze v jedné větvi, a jím emitované záření nebylo koherentní se zářením v referenční větvi a nemohl tedy vzniknout interferenční obraz (interferogram). Předchozí systémy přihlašovatele umožňují zobrazovat pomocí záření emitovaného pozorovaným předmětem pouze tak, jako v běžném (nekonfokálním) fluorescenčním mikroskopu, tedy tak, že se k zobrazování využívá pouze jedna větev interferometru, v rovině detektoru nevzniká hologram a v každém okamžiku se zobrazuje intenzita zdrojů záření z celého objemu předmětu bez možnosti získat úplnou informaci o předmětové vlně, tj. její amplitudu a fázi a bez možnosti hloubkového rozlišení, tj. nevznikají optické řezy.

Pro vytvoření optického řezu v celém zorném poli se běžně využívají konfokální mikroskopy, u nichž je nutné rastrovat jedním bodem, nebo skupinou vzájemně dostatečně vzdálených bodů, což je časově nevýhodné. Navíc zde není možnost získat kvantitativní fázové zobrazení.

-2Další příklady jsou uvedeny v patentových dokumentech U

58551.

V těchto dokumentech je interferometr v osovém uspořádání, kde osy obou svazků jsou v rovině detektoru rovnoběžné a sjednocené. Zařízení popsaná v těchto dokumentech jsou achromatická, takže zdroj záření může být polychromatický. Hlavní nevýhodou těchto zařízení je, že pro získání úplné informace o předmětové vlně (amplitudy a fáze) je nutno zaznamenat množství interferogramů (alespoň tři) lišících se rozdílem dob šíření emitovaného záření v první a v druhé větvi. Metod pro záznam a rekonstrukci je několik, liší se počtem interferogramů, které je třeba zaznamenat a diferencí rozdílu dob šíření - při menším počtu záznamů musí být velikost diference mezi jednotlivými interferogramy známá a přesně nastavená hodnota (chyba nastavení negativně ovlivňuje přesnost získané informace - zejména fáze), při větším počtu záznamů není nutné dodržet přesnou hodnotu diference mezi jednotlivými interferogramy. Pro nastavení diference se používá různých zařízení umožňujících změnu optické délky větve (zrcadlo, soustava zrcadel, soustava klínových destiček, atd.).

Zařízení dle U má pouze jeden detektor, takže je možné snímat pouze v časové posloupnosti, což prakticky omezuje použití takového zařízení na statické objekty.

Přesnost přístroje (přesnost získané informace - zejména fáze) ovlivňuje také proudění vzduchu a prostředí obklopujícího vzorek, protože rozdíl dob šíření vlnění procházejícího první větví a vlnění procházejícího druhou větví se v čase náhodně mění (navíc různě pro různé obrazové elementy interferogramů), čímž je do vstupních dat (interferogramů) pro výpočet amplitudy a fáze vnesena náhodná a neznámá funkce, která zvyšuje nepřesnost (chybu) výpočtu.

Systém uvedený v patentovém dokumentu U^00^158551 využívá kombinačního členu (děliče), který rozdělí svazky z první a z druhé větve a přivede je současně k několika detektorům. Kombinační člen zajistí časově neměnnou diferenci rozdílu dob šíření emitovaného záření v první a v druhé větvi, různou pro různé detektory. Všechny detektory mohou snímat synchronně. Oproti zařízení dle (U^7^85) není přesnost měření ovlivněna prouděním okolního prostředí. Nevýhodou tohoto systému je, že použitý kombinační člen může vnášet do zobrazení vady související sjeho konstrukcí, např. poměr intenzit záření dopadajícího na různé detektory může záviset na vlnové délce (dle konstrukce interferenčních vrstev na dělicích plochách - výroba vrstev je finančně náročná, vrstvy jsou navrženy na omezený spektrální interval, propustnost/odrazivost není na daném intervalu konstantní). Další nevýhodou je to, že všechny detektory musí zobrazovat tutéž rovinu (nutno nastavit posunutí ve směru kolmém k rovině detektoru a náklon roviny detektoru), totéž zorné pole (nutno nastavit posunutí ve směru rovnoběžném s rovinou detektoru) a pro všechny detektory musí

-3být zaručeno i shodné zvětšení mezi předmětovou rovinou a rovinou detektoru, což je prakticky velmi obtížně splnitelné. Nedokonalosti nastavení lze částečně korigovat numerickým předzpracováním, což zvyšuje časovou náročnost výpočtu.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky odstraňuje způsob měření prostorového rozložení indexu lomu vzorku v interferometrickém systému zahrnujícím externí zdroj záření, první větev a druhou větev, soustavu odražečů a detektor umístěný ve výstupní obrazové rovině a připojený k výpočetní jednotce, kde první větev zahrnuje první vstupní zobrazovací soustavu a první výstupní zobrazovací soustavu a druhá větev zahrnuje druhou vstupní zobrazovací soustavu, přičemž první vstupní zobrazovací soustava a druhá vstupní zobrazovací soustava jsou umístěny v jedné ose z proti sobě tak, že mají společnou předmětovou rovinu, v níž se nachází luminiscenční vzorek a je opticky sdružená s výstupní obrazovou rovinou spočívající v tom, že zahrnuje krok excitace luminiscenčních částic obsažených v tomto vzorku externím zdrojem záření, přičemž luminiscenční částice poté emitují záření vlastní, toto emitované záření prochází první větví a druhou větví a dopadá na detektor, kde spolu záření z obou větví interferuje a krok zachycení prvního interferogramu na detektoru a jeho uložení do výpočetní jednotky, krok posunutí vzorku ve směru společné osy z vstupních zobrazovacích soustav vůči předmětové rovině, krok zachycení druhého interferogramu a jeho uložení do výpočetní jednotky, krok vypočtení amplitudy vlnění emitovaného vzorkem a rozdílu fází mezi první větví a druhou větví z prvního a z druhého interferogramu, krok vypočtení rozdílu mezi rozdílem fází z prvního interferogramu a rozdílem fází z druhého interferogramu a krok vypočtení průměrné hodnoty indexu lomu v objemovém elementu definovaném velikostí obrazového elementu a velikostí uvedeného posunu vzorku v ose z.

Ve výhodném provedení je vypočtení průměrné hodnoty indexu lomu nfx.y) vdaném objemovém elementu vzorku provedeno pomocí vztahu:

a _ AOPDi&y) , W-y)- 2ň_Zi ⁺ⁿ0~ 4náz_ř ^{+ Π}°' kde AOPDi je změna rozdílu optických drah, n₀ je index lomu prostředí obklopujícího vzorek, Δζι je velikost posunu vzorku v ose z, λ je vlnová délka záření emitovaného vzorkem, Δψι je změna rozdílu fází na intervalu Δζι.

V dalším výhodném provedení se k vypočtení změny rozdílu fází použije obrazový element *«· t · · 9··

-4prvního a druhého fázového obrazu o stejných souřadnicích (x,y).

Nedostatky systémů známých ze stavu techniky dále odstraňuje interferometrický systém zahrnující externí zdroj záření, první větev a druhou větev, soustavu odražečů a detektor umístěný ve výstupní obrazové rovině, kde první větev zahrnuje první vstupní zobrazovací soustavu a první výstupní zobrazovací soustavu a druhá větev zahrnuje druhou vstupní zobrazovací soustavu, přičemž první vstupní zobrazovací soustava a druhá vstupní zobrazovací soustava jsou umístěny v jedné ose proti sobě tak, že mají společnou předmětovou rovinu opticky sdruženou s výstupní obrazovou rovinou spočívající v tom, že v rovině opticky sdružené s předmětovou rovinou dále zahrnuje alespoň jednu difrakční mřížku pro vytvoření achromatického hologramu s prostorovou nosnou frekvencí ve výstupní obrazové rovině.

Ve výhodném provedení je soustava odražečů uzpůsobena tak, že je na detektor směrován nenulový difrakční řád záření difraktovaného na zmíněné difrakční mřížce.

Interferometrický systém může pro získání obrazové informace využívat záření z externího zdroje, které interagovalo se vzorkem nebo obrazovou informaci ze záření emitovaného vzorkem.

V dalších provedeních může zahrnovat různé typy difrakční mřížky, které je navíc možné realizovat jako vyměnitelné.

Další přednosti a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé po důkladném přečtení příkladů provedení s odpovídajícími odkazy na průvodní obrázky.

Objasnění výkresů

Obr. 1 je schématické znázornění příkladu výhodného provedení interferometrického systému

Obr. 2 je schematické znázornění druhého příkladu výhodného provedení interferometrického systému

Obr. 3 je schematické znázornění třetího příkladu výhodného provedení interferometrického systému

Obr. 4 je schematické znázornění čtvrtého příkladu výhodného provedení interferometrického systému

-5Obr. 5 je schematické znázornění pátého příkladu výhodného provedení interferometrického systému

Obr. 6 je schematické znázornění šestého příkladu výhodného provedení interferometrického systému

Obr. 7 je schematické znázornění sedmého příkladu výhodného provedení interferometrického systému

Obr. 8 je schematické znázornění osmého příkladu výhodného provedení interferometrického systému

Obr. 9 je příklad zpracování holografického záznamu za účelem získání zobrazení amplitudy (modul komplexní amplitudy) a fáze (argument komplexní amplitudy)

Obr. 10 je znázornění posuvného panelu pro výměnu difrakčních mřížek

Obr. lije znázornění otočného panelu pro výměnu difrakčních mřížek

Obr. 12 a) schematické znázornění optických drah první a druhé větve zobrazovacího interferometru s vloženým předmětem, b) posunutí předmětu o Δζι, c) průběh indexu lomu ve zvoleném obrazovém elementu podél osy z a průměrný index lomu τή na intervalu Az_it d) průběh rozdílu fází φ mezi první a druhou větví v závislosti na poloze předmětu podél osy z, e) průběh funkce φ = mod_2re(0), která značí zbytek po dělení rozdílu fází φ hodnotou 2 π, f) navzorkované hodnoty funkce φ

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad výhodného provedení interferometrického systému je schematicky znázorněn na obr. 1. Jedná se o interferometrický systém pro vytvoření hologramu luminiscenčního vzorku 1 nebo vzorku 1 nasvíceného vhodným externím zdrojem záření.

Luminiscenční vzorek 1 je obvykle vzorek fluorescenční, tj. luminiscenčními částicemi jsou částice fluorescenčního barviva obsažené ve vzorku 1. Další možné příklady luminiscenčního vzorku 1 zahrnují např. autofluorescenci nebo fosforescenci. Vhodnými příklady takového vzorku 1 jsou rostlinné i živočišné buňky, shluky buněk, mikroorganizmy anebo technické mikroobjekty. Sledování luminiscenčních částic vzorkďzde tedy probíhá až po jeho excitaci (ozáření) externím zdrojem záření. Dále v příkladech uskutečnění vynálezu budou uvedeny příklady s fluorescenčním barvivém.

·

Předpokládá se, že odborník znalý této oblasti techniky je schopen aplikovat uvedené příklady i na ostatní typy luminiscence.

V případě vzorku 1 nasvíceného vhodným externím zdrojem záření je vzorek ozařován např. časově a prostorově nekoherentním externím zdrojem záření, přičemž je zkoumáno záření, které interagovalo se vzorkem 1. Za interakci se považují například odraz, ohyb, rozptyl, absorpce a fázový posun. To se využije u vzorků 1, které nevykazují luminiscenci.

Na obr. 1 se nachází příklad interferometrického systému tvořený externím zdrojem záření (není na obrázku), první větví 9.1, druhou větví 9.2, přenosovou soustavou odražečů a detektorem 5.

První a druhá větev (9.1, 9.2) začínají v předmětové rovině 8.1 a končí ve výstupní obrazové rovině 8.2. První a druhá větev (9.1, 9.2) obecně v různých provedeních obsahují množinu optických prvků, zahrnující například odražeč nebo čočku a také složitější optické prvky, jako je objektiv, prvek s měnitelnou ohniskovou vzdáleností, vychylovací prvek, soustava odražečů, prvek s pevnou optickou délkou či prodlužovací prvky.

Předmětová rovina 8.1 prochází vzorkem 1. První větev 9.1 a druhá větev 9.2 mají přibližně stejnou optickou délku a přibližně stejné zvětšení, a to od začátku po konec větví. Rozdíl mezi dobou šíření záření v první větvi 9.1 a ve druhé větvi 9.2 je tedy menší než koherenční doba použitého záření. Toto může být v systému z obr. 1 provedeno tak, že jsou optické délky komponent v obou větvích voleny tak, aby kompenzovaly různé geometrické délky větví a použití odlišných zobrazovacích soustav, nebo lze pro nastavení shodných optických délek využít prodlužovací prvek 4.1 (4.2), jak je uvedeno v dalších provedeních. Zvětšení v první větvi 9.1 a v druhé větvi 9.2 od předmětové roviny 8.1 až po výstupní obrazovou rovinu 8.2 je přibližně stejné a první výstupní obraz vytvořený první větví 9.1 ve výstupní obrazové rovině 8.2 a druhý výstupní obraz vytvořený druhou větví 9.2 ve výstupní obrazové rovině 8.2 se v podstatě překrývají, čímž je zajištěna interference záření z obou těchto větví.

Externí zdroj záření je připojen tak, aby umožnil ozáření vzorku 1 umístěného v předmětové rovině 8.1. Toto může být provedeno například ozářením skrze jednu vstupní zobrazovací soustavu, nebo současně skrze obě vstupní zobrazovací soustavy, přičemž proti sobě jdoucí záření z externího zdroje v okolí předmětové roviny 8.1 konstruktivně interferuje, nebo ozářením vzorku 1 světelným listem (light-sheet) vně vstupních zobrazovacích soustav, přímo v předmětové rovině 8.1. Externí zdroj záření, ozařující vzorek 1 může být zdroj s libovolným stupněm časové i prostorové koherence. Šipka na obrázku znázorňuje libovolné záření z externího zdroje 6.

V první větvi 9.1 je umístěna první vstupní zobrazovací soustava 2.1 a první výstupní zobrazovací soustava 3.1. První primární obrazová rovina 8.3 je opticky konjugovaná s předmětovou rovinou 8.1 skrze první vstupní zobrazovací soustavu 2.1 a s výstupní obrazovou rovinou 8.2 skrze první výstupní zobrazovací soustavu 3.1.

V druhé větvi 9.2 je umístěna druhá vstupní zobrazovací soustava 2.2. Výstupní obrazová rovina 8.2 je opticky konjugovaná s předmětovou rovinou 8.1 skrze druhou vstupní zobrazovací soustavu 2.2. Uvedené vstupní zobrazovací soustavy jsou v tomto provedení sestaveny z objektivů zobrazujících v nekonečnu a z objektivů zobrazujících v konečné vzdálenosti. V jiných provedeních může být využit pouze jeden z uvedených typů objektivů nebo jejich libovolná kombinace. Objektivem chápeme první zobrazovací prvek umístěný za sledovaným objektem, který vytváří jeho obraz buď v konečné nebo nekonečné vzdálenosti za tímto zobrazovacím prvkem, nebo komponentu k tomuto účelu určenou. První vstupní zobrazovací soustava 2.1 a druhá vstupní zobrazovací soustava 2.2 jsou umístěny v jedné ose proti sobě tak, že mají společnou předmětovou rovinu 8.1. Optické osy první výstupní zobrazovací soustavy 3.1 a druhé vstupní zobrazovací soustavy 2.2 jsou v rovině detektoru sjednocené a rovnoběžné s normálou detektoru. V tomto provedení je první výstupní zobrazovací soustava 3.1 složena ze dvou optických prvků, mezi nimiž je umístěn odražeč, jak je znázorněno na obr. 1. Např.: první optický prvek první výstupní zobrazovací soustavy 3.1 je umístěn tak, že jeho předmětové ohnisko leží v blízkosti první primární obrazové roviny 8.3 a druhý optický prvek první výstupní zobrazovací soustavy 3.1 íe umístěn tak, že jeho obrazové ohnisko leží v blízkosti výstupní obrazové roviny 8.2.

Nejdůležitějším prvkem interferometrického systému je první difrakční mřížka 7.1, která je v tomto provedení umístěna v první primární obrazové rovině 83.

Svazek záření v první větvi 9.1, jehož osa je sjednocena s osou první vstupní zobrazovací soustavy 2.1, vychází z této zobrazovací soustavy 2,1 a směřuje do první primární obrazové roviny 8.3, difraktuje na první difrakční mřížce 7.1 a dále se šíří směrem k první výstupní zobrazovací soustavě 3.1.

Osa svazku je za difrakční mřížkou 7.1 v obecném případě odkloněna od osy první výstupní zobrazovací soustavy 3.1 o úhel a_x, pro který platí: sin^) = s/f, kde s je celé číslo a značí

-8difrakční řád, λ je vlnová délka difraktovaného záření a f je prostorová frekvence difrakční mřížky (hustota vrypů).

V případě nultého difrakčního řádu je s = 0, tj. také = Oa osa svazku v nultém difrakčním řádu 11 je za difrakční mřížkou sjednocena s osou první výstupní zobrazovací soustavy 3.1. Zrcadlo 12 je zároveň umístěno pod takovým úhlem, že kdyby bylo větší tak, aby odráželo i svazek v nultém difrakčním řádu, byla by osa tohoto svazku rovnoběžná s normálou výstupní obrazové roviny 8.2. Protože je ovšem žádoucí směrovat na detektor 5 pouze jeden difrakční řád, a to jiný než nultý, tj. např. první, je velikost a poloha zrcadla volena tak, aby svazky ostatních difrakčních řádů včetně nultého odfiltrovalo, jak je zřejmé z obrázků. To lze alternativně řešit i pomocí utlumovacích prvků umístěných v dráze svazku.

V případě prvního difrakčního řádu je s = 1, tj. o) ΐ 0a osa svazku v prvním difrakčním řádu je za difrakční mřížkou různoběžná s osou první výstupní zobrazovací soustavy 3.1 a svírá s ní nenulový úhel op. Svazek záření difraktovaný difrakční mřížkou 7.1 pod nenulovým úhlem op tedy vstupuje do první výstupní zobrazovací soustavy 3.1 s osou odkloněnou rovněž o úhel cp vzhledem k optické ose první výstupní zobrazovací soustavy 3.1 a vystupuje z výstupní zobrazovací soustavy 3.1 s osou odkloněnou o nenulový úhel β₁ vzhledem k optické ose první výstupní zobrazovací soustavy 3.1 a poté vstupuje do výstupní obrazové roviny 8.2 interferometru sosou odkloněnou rovněž o úhel β^ vzhledem k normále výstupní obrazové roviny 8.2.

Mezi úhly a β_τ platí vztah sin^) = εΐπία!)/^, kde je zvětšení první výstupní zobrazovací soustavy 3.1.

Ostatní difrakční řády, zejména nultý a druhý se obecně za difrakční mřížkou vyskytují a jejich relativní intenzita se mění s vlnovou délkou, ale pro zobrazování v tomto provedení nejsou využity. Naopak jsou pro zvýšení kvality zobrazení odfiltrovávány. V alternativním provedení ovšem lze pracovat s jiným, například druhým difrakčním řádem a odstraňovat řády ostatní.

A. Svazek záření v druhé větvi 9.2, jehož osa je sjednocena s osou druhé vstupní zobrazovací soustavy 2.2, vychází z této zobrazovací soustavy 2.2 a směřuje do výstupní obrazové roviny 8.2. Normála výstupní obrazové roviny 8.2 je rovnoběžná s osou druhé vstupní zobrazovací soustavy 2.2.

Osa svazku první větve 9.1 a osa svazku druhé větve 9.2 spolu ve výstupní obrazové rovině 8.2 svírají obecně nenulový úhel β^ pro nějž platí: sin^) = ΞΙΞίΞιζ = ίΔΙ Svazek první větve 9.1 771 i 771 j a svazek druhé větve 9.2 jsou vzájemně koherentní, interferují spolu a ve výstupní obrazové rovině

-95 f

8.2 vzniká interferogram s prostorovou nosnou frekvencí nezávislou na vlnové délce (tj. interferogram je achromatický). Prostorová nosná frekvence interferogramu není závislá na poloze zdroje záření v předmětové rovině 8.1, tj. předkládaný interferometrický systém je prostorově invariantní. Ve výstupní obrazové rovině 8.2 se nachází detektor 5.

V jiných provedeních může být difrakční mřížka 7 umístěna ve druhé větvi 9.2, případně ve větvích obou. Frekvence f difrakční mřížky 7 musí být větší než čtyřnásobek převrácené hodnoty násobku minimální vlnové délky pro kterou je difrakční mřížka 7 určena a numerické apertury NA_d svazku dopadajícího na difrakční mřížku 7, tedy musí splňovat vztah f > —-—. Interferogram

Amín^NA _dje pak hologramem.

V provedení na obr. 1 je využita difrakční mřížka 7 transmisní, alternativně však lze využít i reflexní difrakční mřížku 7.

V příkladu na obr. 2 se jedná o analogii výše popsaného systému znázorněného na obr. 1 s tím rozdílem, že první výstupní zobrazovací soustava 3.1 zobrazuje v nekonečnu a je přidána společná zobrazovací soustava 10, kterou může být například objektiv s měnitelnou ohniskovou vzdáleností.

V dalším příkladu na obr. 3 se jedná o obdobný systém jako na obr. 1 s tím rozdílem, že je použita první výstupní zobrazovací soustava 3.1 zobrazující v konečné vzdálenosti.

Na obr. 4 se nachází analogie výše popsaného systému znázorněného na obr. 3. První větev 9.1 a druhá větev 9.2 začínají v předmětové rovině 8.1, ve které leží vzorek 1 a končí ve výstupní obrazové rovině 8.2. V první větvi 9.1 je umístěna první vstupní zobrazovací soustava 2.1 a první výstupní zobrazovací soustava 3.1 a prodlužovací prvek 4.1. První primární obrazová rovina 8.3 je opticky konjugovaná s předmětovou rovinou 8.1 skrze první vstupní zobrazovací soustavu 2.1 a s výstupní obrazovou rovinou 8.2 skrze první výstupní zobrazovací soustavu 3.1.

Prodlužovací prvek 4.1 slouží k nastavení shodných optických délek obou větví a optickou délku může prodlužovat i zkracovat, takže je zřejmé, že v jiném provedení vynálezu může být prodlužovací prvek 4.1 umístěn pouze ve druhé větvi 9.2 nebo ve větvích obou.

Ve druhé větvi 9.2 je umístěna druhá vstupní zobrazovací soustava 2.2 a druhá výstupní zobrazovací soustava 3.2. Druhá primární obrazová rovina 8.4 je opticky konjugovaná s předmětovou

-10rovinou 8.1 skrze druhou vstupní zobrazovací soustavu 2.2 a s výstupní obrazovou rovinou 8.2 skrze druhou výstupní zobrazovací soustavu 3.2.

Uvedené zobrazovací soustavy jsou sestaveny z objektivů zobrazujících v nekonečnu nebo zobrazujících v konečné vzdálenosti nebo z jejich libovolné kombinace. Jak bude uvedeno dále v popisu vynálezu, výstupní zobrazovací soustavy (3.1 a 3.2) obou větví mohou mít některé prvky společné. V tomto příkladu provedení mají společnou zobrazovací soustavu 10, kterou může být například objektiv s měnitelnou ohniskovou vzdáleností (nazýváno též transfokátor, nebo zoom). První vstupní zobrazovací soustava 2,1 a druhá vstupní zobrazovací soustava 2.2 jsou umístěny v jedné ose proti sobě tak, že mají společnou předmětovou rovinu 8.1.

V příkladu na obr. 5 se jedná o analogii výše popsaného systému znázorněného na obr. 4 s tím rozdílem, že v druhé větvi je umístěn prodlužovací prvek 4.2.

V příkladu na obr. 6 se jedná o příklad jiného prostorového uspořádání systému znázorněného na obr. 4, s tím rozdílem, že první větev 9.1 kromě první vstupní zobrazovací soustavy 2.1, difrakční mřížky 7.1 a první výstupní zobrazovací soustavy 3.1, zahrnuje také první prodlužovací prvek 4.1 tvořený přenosovou soustavou odražečů. Dále už shodně druhá větev 9.2 zahrnuje druhou vstupní zobrazovací soustavu 2.2 a druhou výstupní zobrazovací soustavu 3.2. Obě soustavy zahrnují společnou zobrazovací soustavu 10, která směruje záření z obou větví na detektor 5.

Další příklad provedení interferometrického systému podle vynálezu je uveden na obr. 7. Jedná se o analogii výše popsaného systému znázorněného na obr. 6 s tím rozdílem, že v obou větvích, tedy v první i druhé, je zařazena difrakční mřížka (7.1 a 7.2). Jedná se tedy o uspořádání, kdy je v blízkosti první primární obrazové roviny 8.3 umístěna první difrakční mřížka 7.1 a v blízkosti druhé primární obrazové roviny 8.4 je umístěna druhá difrakční mřížka 7.2. Prodlužovací prvky 4.1 a 4.2 mohou být realizovány mnoha způsoby. V tomto provedení jsou tvořeny přenosovými soustavami odražečů.

Mezi úhly a₂ a β₂ platí obdobný vztah jako mezi úhly a_t a β₁ popsaný výše v příkladu provedení z obr. 1.

Další příklad provedení interferometrického systému podle vynálezu je uveden na obr. 8. Jedná se o analogii výše popsaného systému znázorněného na obr. 6 s tím rozdílem, že je v druhé větvi 9.2 použit druhý prodlužovací prvek 4.2 jiného typu a že transmisní difrakční mřížka 7.1 je

-11nahrazena difrakční mřížkou 7.1 reflexní. Reflexní difrakční mřížku 7.1 lze využít i u všech dříve uvedených příkladů provedení.

Relativní intenzita difrakčních řádů závisí na vlnové délce difraktovaného záření. Difrakční mřížku 7 je vhodné navrhnout tak, aby účinnost mřížky byla maximální pro využívaný difrakční řád X (např. blejzované mřížky). To platí pouze pro jednu vlnovou délku, pro ostatní vlnové délky účinnost využívaného difrakčního řádu klesá a naopak roste relativní intenzita nevyužívaných řádů. Je proto výhodné, aby difrakční mřížka 7 byla uložena vyměnitelně, aby bylo možno interferometrický systém přizpůsobit vlnové délce záření dopadajícího na difrakční mřížku.

Difrakční mřížka 7 je ve výhodném provedení umístěna na panelu obdélníkového tvaru, na kterém je možno umístit několik difrakčních mřížek 7. Výměna difrakční mřížky 7 je pak provedena posunutím panelu s difrakčními mřížkami 7, a to buď ručně, nebo s pomocí libovolného pohonu. Na obr. 9 je uveden příklad posuvného panelu difrakční mřížky 7.

V dalším provedení je difrakční mřížka 7 umístěna na panelu kruhového tvaru, na něhož je možno umístit několik difrakčních mřížek 7. Výměna difrakční mřížky 7 je pak provedena otočením panelu s difrakčními mřížkami 7, a to také buď ručně, nebo s pomocí libovolného pohonu. Na obr. 10 je uveden příklad otočného panelu difrakční mřížky 7.

Při práci ve fluorescenčním režimu jsou částice fluorescenčního barviva obsažené ve vzorku 1 vloženém mezi první vstupní zobrazovací soustavou 2.1 a druhou vstupní zobrazovací soustavou 2.2 v předmětové rovině 8.1 excitovány externím zdrojem záření a poté emitují záření vlastní. Záření emitované částicemi fluorescenčního barviva ve vzorku 1 je časově nekoherentní. Jeho spektrální šířka je v řádu jednotek až desítek nanometrů. Jednotlivé částice fluorescenčního barviva navíc emitují vzájemně nekoherentní záření. Fluorescenční vzorek 1 se tedy makroskopicky chová jako širokopásmový (časově nekoherentní) objemový prostorově nekoherentní zdroj záření. Emitované záření se šíří do všech směrů, prochází první větví 9.1 a druhou větví 9.2 a dopadá na detektor 5, kde spolu záření zobou větví interferuje a detektor 5 snímá výsledný interferogram, který je díky konstrukci interferometrického systému achromatickým, mimoosovým hologramem. Interferometrický systém je prostorově invariantní vtom smyslu, že vytvářený hologram má prostorovou nosnou frekvenci nezávislou na poloze zdroje záření.

Výstupní přenosová soustava odražečů 12 (viz obr. 8) usměrňuje záření na detektor 5. Tato soustava může být provedena mnoha způsoby. Detektor 5 bývá obvykle provedený jako plošný detektor 5, např. jako CCD čip. Jak bylo zdůrazněno v popisu výše, interference může nastat pouze v případě, že záření emitované částicemi fluorescenčního barviva má v obou větvích

-12interferometrického systému rozdíl optických drah menší než je koherenční délka tohoto záření. K detektoru 5 je připojena výpočetní jednotka (není na obrázku), která může být provedena jako standardní počítač.

Například s využitím výše popsaných příkladů interferometrického systému lze realizovat způsob měření prostorového rozložení indexu lomu. Na detektoru 5 se tedy nejdříve zaznamená intenzita interference první a druhé větve 9.1 a 9.2, tj. interferogram, který je dále uložen do výpočetní jednotky. U interferenčního systému podle vynálezu je zaznamenaný interferogram hologramem, tj. obsahuje úplnou informaci o předmětové vlně (o její amplitudě a fázi). U jiných systémů známých ze stavu techniky je třeba získat interferogramů několik a z nich až následně rekonstruovat předmětovou vlnu (její amplitudu a fázi).

Rekonstrukci amplitudy a fáze předmětové vlny lze provést několika způsoby, které se liší především dle použitého interferenčního systému a zároveň lze pro jeden typ interferometrického systému použít různé numerické metody. U interferenčního systému podle vynálezu se využívá např. filtrace spektra prostorových frekvencí hologramu ve fourierovském prostoru. Spektrum prostorových frekvencí hologramu lze získat např. využitím 2D diskrétní Fourierovy transformace. V postranním pásmu spektra prostorových frekvencí se provede výřez oblasti okolo prostorové nosné frekvence hologramu a na výřezu se provede zpětná 2D diskrétní Fourierova transformace. Prostorová nosná frekvence je frekvence, ve které nabývá frekvenční spektrum v postranním pásmu svého maxima. Velikost výřezu je dána kružnicí se středem v nosné frekvenci a poloměrem úměrným ²^° , kde NA₀ je numerická apertura objektivu, Z_min je minimální vlnová délka emitovaného záření ^{m A}min a m je celkové zvětšení mezi předmětovou rovinou 8.1 a výstupní obrazovou rovinou 8.2.

Výsledkem inverzní Fourierovy transformace je komplexní amplituda předmětové vlny, jejíž modul udává reálnou amplitudu předmětové vlny a argument komplexní amplitudy udává fázi předmětové vlny. Vypočtené hodnoty fáze jsou omezeny na interval < —π·, π >. Pro správné zobrazení a interpretaci fáze je nutné fázové skoky odstranit (tzv. navázat fázi) přičtením celých násobků hodnoty 2π. Obr. 11 popisuje právě zpracování holografického signálu popsaného výše.

Holografický signál lze tedy odvodit z teorie interference záření, a to např. postupem popsaným výše. Shrneme-li výše uvedený postup, tak se numerickým zpracováním získá fázové zobrazení a amplitudové zobrazení. Numerické zpracování zahrnuje operace Fourierova transformace, filtrace spektra prostorových frekvencí, inverzní Fourierova transformace. Výsledkem je komplexní amplituda signálu, jejíž modul představuje amplitudu a argument jeho fázi.

-13Ostatní způsoby výpočtu amplitudy a fáze předmětové vlny není třeba popisovat, protože jsou v oboru dobře známé. Dále už se bude u různých systémů postupovat obdobně.

V dalším kroku se vzorek 1 posune ve směru osy z a zachytí se druhý interferogram, který je dále uložen do výpočetní jednotky. Takovým posouváním vzorku 1 ve směru optické osy z po intervalech délky Δζί, lze tedy získat sérii N hologramů, přičemž index i = 1,2, ...,N - 1 značí pořadové číslo intervalu posunutí mezi i. a (i + 1). snímkem hologramů. Velikost posunutí Δζι se může lišit pro různé snímky, proto se rozlišují indexem i. Amplitudové zobrazení vytváří optický řez. Zobrazuje pouze tu část vzorku 1, která leží v blízkém okolí společné předmětové roviny 8.1. Ze série těchto řezů (sada N obrazů) lze zrekonstruovat prostorové rozložení částic fluorescenčního barviva ve vzorku 1. Ze série fázových zobrazení lze získat prostorové rozložení indexu lomu uvnitř měřeného vzorku 1.

Na obr. 12 a) je schematické znázornění optických drah první větve 9.1 a druhé větve 9.2 interferometrického systému s vloženým vzorkem 1. První větev 9.1 je od předmětové roviny 8.1 směrem k detektoru 5 nalevo, druhá větev směrem k detektoru 5 napravo. Obě větve mají shodnou Χς délku.

Částice fluorescenčního barviva umístěná na optické ose z v bodě + D emituje záření do všech směrů. Paprsek jdoucí proti směru osy z, tj. první větví 9.1 směrem k detektoru 5 nalevo, projde optickou dráhu OPL^x.y) danou vztahem:

OPL^x.y) = f‘n_odz + f^a‘^+Dn(x,y,z)dz.

X

Paprsek jdoucí po směru osy z, tj. druhou větví 9.2 směrem k detektoru 5 napravo, projde optickou dráhu danou vztahem:

OPR^x.y} = f^_+Dn(x,y,z)dz+ £^i+2D n_odz.

Rozdíl optických drah mezi prvou a druhou větví je pak dán vztahem:

OPDi(x,y) = OPLi(x,y) — OPRi(x,y) = fl rat+D *r rai+2D = j n_odz+ j n(x,y,z)dz — I n(x,y,z)dz- I n_odz.

•'cii Ů Jat+D Jr

Posuneme-li vzorek 1 vůči předmětové rovině 8.1 o Az_it tj. z polohy ai + D do polohy a_i+1 + D, jak je znázorněno na obrázku 12 b), změní se OPDí na OPD_i+1. Změna rozdílu optických drah ΔΟΡΰ^χ,γ) je rovna:

ΔΟΡΰ^χ,γ) = OPD_i+^x,y) - OPD^x.y) = 2 n(x,y,z) - n_odz.

-14Pak ΔΟΡΰιίχ,γ) odpovídá dvojnásobku vyšrafované plochy v obr. 12 c). Na obr 12 c) je zakreslen průběh indexu lomu n(z) ve zvoleném obrazovém elementu v místě o určitých souřadnicích (x,y) podél osy z. Obrazový element je tedy například pixel CCD čipu nebo jde o libovolnou část interferogramu, tedy skupinu pixelů. Průměrný index lomu új(x,y) na intervalu Δζι je:

Rozdíl optických drah OPD(x,y) lze přepočítat na rozdíl fází φ podle vztahu φ = — OPD, λ kde λ je vlnová délka emitovaného záření. Průběh φ(ζ) pro index lomu n^z) z obrázku 12 c) je zakreslen na obrázku 12 d). Pro ΔΟΡΌι(χ,γ) platí:

ΔΟΡΰ^χ,γ) = Δφι(χ,γ)^, kde Δφί = φ_ί+1 — φί je rozdíl mezi rozdílem fází vypočteným z prvního interferenčního obrazu a rozdílem fází vypočteným z druhého interferenčního obrazu a vyjadřuje změnu rozdílu fází na intervalu Δζ,, tj. mezi polohami + D a a_i+í + D vzorku 1.

Fázová informace rekonstruovaná např. výše popsaným postupem z digitálního záznamu hologramu je diskrétním souborem hodnot které vzorkují funkci φ = mod_27r(0), která značí zbytek po dělení rozdílu fází φ hodnotou 2π. Grafické zobrazení funkce φ(ζ) je na obrázku 12 e). Navzorkované hodnoty φι jsou znázorněny na obrázku 12 f). Vzorkovaní musí být dostatečné, tj. interval Δζι dostatečně malý, aby bylo možné navzorkovanou funkci φ spolehlivě navázat (odstranit skoky o 2π), tedy získat funkci φ = φ + ρ2π, kde p je neznámé celé číslo. Nejkratší interval m, na kterém se φ změní o 2π, určíme z podmínky:

2π

Δφί = Φί+ι ~Φΐ = —ΔΟΡϋι < 2π Λ ~ ⁿ<>^dz -^2π' přičemž levá strana nerovnice bude největší pro λ = Á_min an = n_max. Po úpravě dostáváme: m = a_i+1 - Ui< ^Amin—-.

^(ⁿmax ⁿo)

Maximální interval vzorkování Δζ^ volíme menší než m/3 a tedy j_z. < —.

Nⁿmax ⁿo)

Navazování funkce φ se provádí v prostoru (x,y,z). Hodnotu parametru p není nutné znát, protože pro výpočet prostorového rozložení indexu lomu uvnitř měřeného vzorku 1, tj. průměrné

-15hodnoty indexu lomu nj(x,y) na každém intervalu Δζ^, je potřeba znát změnu rozdílu fází Δφ^ a jelikož platí: Δφι = Δφι, je tedy:

Fázového zobrazení lze využít také k upřesnění polohy částic fluorescenčního barviva ve směru optické osy.

Způsob měření prostorového rozložení indexu lomu i samotný interferometrický systém je možné použít i pro množství jiných zařízení spadajících do rozsahu ochrany tohoto vynálezu, přestože je popsán ve vztahu k jeho výhodným provedením. Předpokládá se, že se uvedené patentové nároky vztahují i na tyto varianty a úpravy zařízení spadající do skutečného rozsahu ochrany vynálezu.

Průmyslová využitelnost

Průmyslové využití interferometrického systému a způsobu měření prostorového rozložení indexu lomu dle vynálezu je např. pro kvantitativní monitorování změn prostorového rozložení buněčné hmoty v čase v závislosti na vnějších podmínkách, tj. pozorování např. živých buněčných kultur a mikroorganizmů a jejich reakci na různé vnější podněty např. tlak, teplota, toxické látky, léčiva apod. Index lomu buněčných struktur je totiž přímo úměrný hustotě hmoty v těchto strukturách obsažené.

-16Seznam vztahových značek vzorek

2.1 první vstupní zobrazovací soustava

2.2 druhá vstupní zobrazovací soustava

3.1 první výstupní zobrazovací soustava

3.2 druhá výstupní zobrazovací soustava .1 první prodlužovací prvek .2 druhý prodlužovací prvek detektor záření z externího zdroje difrakční mřížka

7.1 první difrakční mřížka

7.2 druhá difrakční mřížka

8.1 předmětová rovina

8.2 výstupní obrazová rovina

8.3 první primární obrazová rovina

8.4 druhá primární obrazová rovina

9.1 první větev

9.2 druhá větev společná zobrazovací soustava osa svazku v nultém difrakčním řádu výstupní soustava odražečů

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob měření prostorového rozložení indexu lomu vzorku (1) v interferometrickém systému zahrnujícím externí zdroj záření, první větev (9.1) a druhou větev (9.2), soustavu odražečů a detektor (5) umístěný ve výstupní obrazové rovině (8.2) a připojený k výpočetní jednotce, kde první větev (9.1) zahrnuje první vstupní zobrazovací soustavu (2.1) a první výstupní zobrazovací soustavu (3.1) a druhá větev (9.2) zahrnuje druhou vstupní zobrazovací soustavu (2.2), přičemž první vstupní zobrazovací soustava (2.1) a druhá vstupní zobrazovací soustava (2.2) jsou umístěny v jedné ose z proti sobě tak, že mají společnou předmětovou rovinu (8.1), v níž se nachází luminiscenční vzorek (1) a je opticky sdružená s výstupní obrazovou rovinou (S.Zj^yznačující se tím, že zahrnuje krok excitace luminiscenčních částic obsažených v tomto vzorku (1) externím zdrojem záření, přičemž luminiscenční částice poté emitují záření vlastní, toto emitované záření prochází první větví (9.1) a druhou větví (9.2) a dopadá na detektor (5), kde spolu záření z obou větví interferuje a krok zachycení prvního interferogramu na detektoru (5) a jeho uložení do výpočetní jednotky, krok posunutí vzorku (1) ve směru společné osy z vstupních zobrazovacích soustav (2.1, 2.2) vůči předmětové rovině (8.1), krok zachycení druhého interferogramu a jeho uložení do výpočetní jednotky, krok vypočtení amplitudy vlnění emitovaného vzorkem (1) a rozdílu fází mezi první větví (9.1) a druhou větví (9.2) z prvního a z druhého interferogramu, krok vypočtení rozdílu mezi rozdílem fází z prvního interferogramu a rozdílem fází z druhého interferogramu a krok vypočtení průměrné hodnoty indexu lomu v objemovém elementu definovaném velikostí obrazového elementu a velikostí uvedeného posunu vzorku (1) v ose z.
2. Způsob měření prostorového rozložení indexu lomu podle nároku ^vyznačující se tím, že vypočtení průměrné hodnoty indexu lomu ňj(x,y) vdaném objemovém elementu . , - r \ AOPDi(x,y) , Δψί(χ,γ)λ vzorku (1) je provedeno pomoci vztahu: ΐΐΐχχ,γ) = ——--H n₀ =--1- n₀, kde

ΖΔΖ[ 41T ΔΖ^

ΔΟΡΰι je změna rozdílu optických drah, n_Q je index lomu prostředí obklopujícího vzorek, Δζι je velikost posunu vzorku (1) v ose z, λ je vlnová délka záření emitovaného vzorkem (1), Δψι je změna rozdílu fází na intervalu Δζ^.
3. Způsob měření prostorového rozložení indexu lomu podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že se k vypočtení změny rozdílu fází použije obrazový element prvního a druhého fázového obrazu o stejných souřadnicích (x,ý).
4. Interferometrický systém zahrnující externí zdroj záření, první větev (9.1) a druhou větev (9.2), soustavu odražečů a detektor (5) umístěný ve výstupní obrazové rovině (8.2), kde první větev (9.1) zahrnuje první vstupní zobrazovací soustavu (2.1) a první výstupní zobrazovací soustavu (3.1) a druhá větev (9.2) zahrnuje druhou vstupní zobrazovací soustavu (2.2), přičemž první vstupní zobrazovací soustava (2.1) a druhá vstupní zobrazovací soustava (2.2) jsou umístěny v jedné ose proti sobě tak, že mají společnou předmětovou rovinu (8.1) opticky sdruženou s výstupní obrazovou rovinou (8.2)^vyznačující se tím, že v rovině opticky sdružené s předmětovou rovinou (8.1) dále zahrnuje alespoň jednu difrakční mřížku (7) pro vytvoření achromatického hologramu s prostorovou nosnou frekvencí ve výstupní obrazové rovině (8.2).
5. Interferometrický systém podle nároku 4, dále zahrnuje prodlužovací prvek (4.1) pro nastavení shodných optických délek obou větví.
6. Interferometrický systém podle nároku 4 nebo 5, dále zahrnuje druhou výstupní zobrazovací soustavu (3.2).
7. Interferometrický systém podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6 vyznačující se tím, že soustava odražečů je uzpůsobena tak, že je na detektor (5) směrován nenulový difrakční řád záření difraktovaného na zmíněné difrakční mřížce (7).
8. Interferometrický systém podle kteréhokoliv z nároků 4 až 7, vyznačující se tím, že pro získání obrazové informace využívá záření z externího zdroje, které interagovalo se vzorkem (1).

a
9. Interferometrický systém podle nároku 4 až 7, vyznačující se tím, že získává obrazovou informaci ze záření emitovaného vzorkem (1).
10. Interferometrický systém podle kteréhokoliv z nároků 4 až 9fVyznačující se tím, že detekované záření není koherentní.
11. Interferometrický systém podle kteréhokoliv z nároků 4 až ^vyznačující se tím, že první výstupní zobrazovací soustava (3.1) a druhá výstupní zobrazovací soustava (3.2) mají alespoň jeden optický prvek společný.
12. Interferometrický systém podle kteréhokoliv z nároků 4 až ll_fvyznačující se tím, že difrakční mřížka (7) je provedena jako transmisní amplitudová difrakční mřížka (7) nebo transmisní fázová difrakční mřížka (7).
13. Interferometrický systém, podle kteréhokoliv z nároků 4 až llfvyznačující se tím, že difrakční

-19mřížka (7) je provedena jako reflexní amplitudová difrakční mřížka (7) nebo reflexní fázová difrakční mřížka (7).
14. Interferometrický systém podle kteréhokoliv z nároků 4 až 13^ vyznačující se tím, že dále zahrnuje alespoň jeden prvek s měnitelnou ohniskovou vzdáleností.
15. Interferometrický systém kteréhokoliv z nároků 4 až 14₍vyznačující se tím, že difrakční mřížka (7) je vyměnitelná.
16. Interferometrický systém podle kteréhokoliv z nároků 4 až 15₁ vyznačující se tím, že k detektoru (5) je připojena výpočetní jednotka pro numerické zpracování výstupu.