CZ2014527A3 - Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů - Google Patents

Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů Download PDF

Info

Publication number
CZ2014527A3
CZ2014527A3 CZ2014-527A CZ2014527A CZ2014527A3 CZ 2014527 A3 CZ2014527 A3 CZ 2014527A3 CZ 2014527 A CZ2014527 A CZ 2014527A CZ 2014527 A3 CZ2014527 A3 CZ 2014527A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
analyte
analytes
detection probe
probe
binding
Prior art date
Application number
CZ2014-527A
Other languages
English (en)
Inventor
Václav Navrátil
Pavel Šácha
Jiří Schimer
Jan Konvalinka
Pavel Majer
Original Assignee
Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I. filed Critical Ústav Organické Chemie A Biochemie Akademie Věd Čr, V.V.I.
Priority to CZ2014-527A priority Critical patent/CZ2014527A3/cs
Priority to SG11201700589YA priority patent/SG11201700589YA/en
Priority to EP17184901.1A priority patent/EP3264091B1/en
Priority to PCT/CZ2015/000084 priority patent/WO2016019929A2/en
Priority to EP15767081.1A priority patent/EP3177931B1/en
Priority to DK15767081.1T priority patent/DK3177931T3/da
Priority to UAA201701964A priority patent/UA119466C2/uk
Priority to ES17184901T priority patent/ES2773056T3/es
Priority to AU2015299447A priority patent/AU2015299447B2/en
Priority to CA3006186A priority patent/CA3006186C/en
Priority to CA2957286A priority patent/CA2957286C/en
Priority to US15/500,970 priority patent/US10718772B2/en
Priority to JP2017506677A priority patent/JP6462851B2/ja
Publication of CZ2014527A3 publication Critical patent/CZ2014527A3/cs
Priority to IL25043417A priority patent/IL250434B/en
Priority to AU2018202250A priority patent/AU2018202250B2/en
Priority to JP2018245748A priority patent/JP6677793B2/ja
Priority to IL26571219A priority patent/IL265712B/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/17—Metallocarboxypeptidases (3.4.17)
    • C12Y304/17021—Glutamate carboxypeptidase II (3.4.17.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23005—Cathepsin D (3.4.23.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • C12Y304/23016—HIV-1 retropepsin (3.4.23.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01001—Carbonate dehydratase (4.2.1.1), i.e. carbonic anhydrase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/9506—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from viruses
    • G01N2333/9513—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from viruses derived from RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96472—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/988—Lyases (4.), e.g. aldolases, heparinase, enolases, fumarase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů, zahrnující kroky, v nichž se a) na povrch pevného nosiče imobilizuje analyt nebo skupina analytů ze vzorku nespecifickou nekovalentní adsorpcí, nebo kovalentní vazbou zvolených povrchových funkčních skupin analytu a odpovídajících funkčních skupin na pevném nosiči nebo s výhodou prostřednictvím na povrch pevného nosiče předem navázané molekuly, schopné během inkubace se vzorkem selektivně vázat v něm obsažený analyt či skupiny analytů; b) pevný nosič s takto imobilizovaným analytem či skupinou analytu se inkubuje s detekční sondou, která se prostřednictvím sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu selektivně naváže na analyt či skupinu analytů, přičemž se tato sonda skládá ze sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu; oligonukleotidové značky, případně s kovalentně připojeným fluoroforem, haptenem či chemickou skupinou a z chemického linkeru, kovalentně spojujícího sloučeninu pro selektivní vazbu a oligonukleotidovou značku; poté se c) pevný nosič promyje k odstranění nenavázané detekční sondy a nakonec se stanoví množství navázané detekční sondy, přičemž toto množství je přímo úměrné množství daného analytu či skupiny analytů v testovaném vzorku. Popsaný způsob nabízí široké uplatnění v medicíně. Vzhledem k výjimečné citlivosti v řádu pouze několika desítek molekul poskytuje možnost stanovení proteinových markerů v krvi v množství dosud neměřitelném

Description

Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů
Dosavadní stav techniky
Předkládané technické řešení umožňuje jak citlivou kvantifikaci aktivních forem analytů, s výhodou proteinů, tak i stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů. Dále jsou proto shrnuty přístupy k řešení obou zmíněných problémů.
Dnešním standardem pro citlivé a specifické stanovení proteinů (antigenů) v biologických vzorcích je tzv. “Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay“ (zkr. ELISA), v omezené míře také tzv. “Western Blot“ (zkr. WB).
V obou metodách se využívá možnosti připravit (monoklonální či polyklonální) protilátku specificky vázající daný antigen, přičemž množství navázané protilátky, které je úměrné množství antigenů ve vzorku, se převádí na měřitelný signál. Příprava takových protilátek se v posledních dvou desetiletích stala zcela rutinní a komerčně dostupnou metodou.
Nejuniverzálnější je zřejmě tzv. “Sendvičová ELISA“, při které se na pevný nosič imobilizuje první protilátka, na kterou se dále naváže antigen obsažený v biologickém vzorku, přičemž po promytí se na antigen naváže druhá protilátka (obě protilátky tedy musí rozeznávat různý epitop na stejném antigenů).
V nejjednodušším provedení se pak na druhou protilátku naváže univerzální protilátka, která je konjugovaná s enzymem (rozeznávající isotyp druhé protilátky, např. myší IgGl, který musí být odlišný od isotypu první protilátky). Po opětovném promytí a přidání substrátu vzniká v závislosti na volbě enzymu a substrátu např. barevný nebo luminiskující produkt, jehož množství je přímo úměrné množství antigenů ve vzorku. Sendvičovou ELISA a její modifikace lze využít v medicíně pro kvantitativní stanovování antigenů v krvi.
Výhodou sendvičové ELISA je kombinace specifity dvou různých protilátek, takže výrazně klesá nebezpečí falešně positivních výsledků v důsledku nespecifického navázání protilátek. Navíc díky amplifikaci signálu enzymovou reakcí jsou tyto eseje velmi citlivé. Použití imobilizované protilátky dále umožňuje stanovení antigenů v komplexních matricích (např. plasmě), neboť ostatní složky vzorku neinterferují se stanovením, jak je tomu při přímé sorpci vzorku (jednoduchá ELISA). Pokud je dostupná pouze jedna protilátka, je alternativou použití kompetitivní ELISA, kde rozpustný endogenní antigen kompetuje o vazbu protilátky s imobilizovaným antigenem, což také umožňuje stanovení v komplexních matricích, i když méně citlivé než pomocí sendvičové ELISA.
ELISA existuje v různých variantách, např. na univerzální (sekundární) protilátku může být místo enzymu připojen fluorofor nebo radionuklid. Stejně tak může být enzymem, fluoroforem, radionuklidem, biotinem atp. přímo značena druhá (primární) protilátka a pak není nutné, aby se lišila isotypem od první sorbované protilátky.
Pokud se týká citlivosti používaných metod, například prostatický specifický antigen (zkr. PSA) lze pomocí „ultrasensitivní“ sendvičové ELISA detekovat v koncentraci od 0,008 ng/ml krve (Abbott Diagnostics). Stanovení PSA v krvi se nyní rutinně používá pro plošné testování mužské populace na výskyt karcinomu prostaty a především pro sledování odezvy pacienta na léčbu, přičemž zvýšené hodnoty nad přibližně 2,5 až 4 ng/ml naznačují přítomnost karcinomu prostaty (Catalona et al. 1991, New England Journal of Medicine, str. 1156-1161; Stamey et al. 1987, New England Journal of Medicine, str. 909-916; Heidenreich A. 2012, European Guidelines on Prostate Cancer). Jedinou definitivní léčbu karcinomu prostaty představuje odebrání prostaty, přičemž po tomto zákroku PSA z krve vymizí. Pokud se při operaci nepodaří odebrat veškerou nádorovou tkáň, po nějakém čase koncentrace PSA opět vzroste na detekovatelnou mez. Protože po operaci je hladina PSA po dobu měsíců až let pod detekčním limitem dnešních metod, mohly by citlivější metody stanovení určit přesnou prognosu mnohem dříve než metody stávající (Lepor et al. 2012, BJU International, str. 1770-1775).
Obecné omezení velmi citlivého stanovení pomocí ELISA představuje přítomnost tzv. interferujících heterofilních protilátek v krvi. Ty mohou rozeznávat protilátky sendviče a tím je spojovat bez přítomnosti antigenů, což vede k falešně positivním výsledkům dokonce i v tak zavedené metodě, jako je stanovení PSA (Henry et al. 2009, Nature Clinical Practice Urology, str. 164-167; Loeb et al. 2009, Urology, str. 947-949; Preissner et al. 2005, Clinical Chemistry, str. 208-210). Proto je někdy nutné pro alespoň částečné odstranění těchto protilátek zařadit další kroky ve zpracování krve (de Jager et al. 2005, Journal of Immunological Methods, str. 124-135), k čemuž se využívá i komerční produkt (Scantibodies). Je také vhodné zařadit kontroly pro změření velikosti interference (Bjemer et al. 2005, Clinical Chemistry, str. 9-11). Komerční kity pro měření PSA běžně obsahují blokační přísady, které by měly zamezovat ovlivnění interferujícími protilátkami, případně obě protilátky sendviče nepochází ze stejného organizmu, ovšem ani tak nejsou zajištěny zcela spolehlivé výsledky (Loeb et al. 2009, Urology, str. 947-949; Preissner et al. 2005, Clinical Chemistry, str. 208-210).
Citlivost ELISA je pro většinu stanovovaných antigenů dostatečná, nicméně pro zmíněné stanovení PSA je další zvýšení citlivosti dnešních metod potřebné. Vzhledem k vysoké tkáňové expresi PSA lze předpokládat, že řada nádorových markérů bude v krvi ještě v podstatně menší koncentraci než PSA, obzvláště v raných stadiích nemoci. Nadto pokud pro daný nádorový antigen nejsou dostupné tak citlivé protilátky jako proti
PSA, citlivost detekce pomocí ELISA se snižuje. Obecně by citlivější detekce byla přínosná i pro brzkou detekci virových onemocnění (HIV) či spolehlivou diagnózu některých bakteriálních infekcí (lymská borelióza).
Výrazného zvýšení citlivosti při zachování jednoduchého formátu ELISA lze obvykle dosáhnout spojením protilátky s oligonukleotidem (Sáno et al. 1992, Science, str. 120-122), jež je následně kvantifikován pomocí polymerasové řetězové reakce v reálném čase, tj. real-time PCR (zkráceně qPCR). Pro navázání deoxyribonukleové kyseliny (dále DNA) na protilátku lze použít nekovalentní interakci biotinu se streptavidinem, tzv. univerzální immuno-PCR, zkr. iPCR (Ruzicka et al. 1993, Science, str. 698-699; Zhou et al. 1993, Nucleic Acids Research, str. 6038-6039; EP2189539) či kovalentní vazbu vytvořenou pomocí chemických činidel, tzv. přímá iPCR (Hendrickson et al. 1995, Nucleic Acids Research, str. 522-529; EP0544212; EP0625211), která jsou komerčně dostupná (např. firma Solulink).
Kovalentní navázání oligonukleotidu na protilátku obvykle zvyšuje citlivost a výrazně zjednodušuje proces stanovení. Např. stanovení purifikovaného PSA pomocí přímé iPCR bylo při použití stejných protilátek přibližně stonásobně citlivější než metodou ELISA, limit detekce (LOD) činil 200 fmol.r1 (odpovídá cca 6 pg/ml). Detekce pomocí universální iPCR byla přitom přibližně třikrát méně citlivá než pomocí přímé iPCR (Lind et al. 2005, Journal of Immunological Methods, str. 107-116).
Alternativou pro spojení protilátky a oligonukleotidu je použití zlatých nanočástic, které přináší amplifikaci signálu, neboť na jedinou částici lze kromě protilátky navázat až desítky molekul oligonukleotidu (Potuckova et al. 2011, Journal of Immunological Methods, str. 38-47). Nadto umožňuje detekci bez použití PCR. Limit detekce pro stanovení purifikovaného PSA činí 30 amoLl'1 (cca 1 fg/ml) bez použití PCR a 3 amol.l’1 (cca 0,1 fg/ml) za použití PCR (Nam et al. 2003, Science, str. 1884-6). Přes velkou citlivost iPCR v laboratorních podmínkách však obdobnou citlivost nelze očekávat při aplikaci v klinické praxi, protože iPCR je stejně jako sendvičová ELISA náchylná k chybným výsledkům způsobeným přítomností interferujích protilátek v biologických matricích, především v krevním séru a plasmě. Stále přetrvává potřeba nových ultracitlivých metod, použitelných bez omezení i pro stanovení v biologických matricích.
Takovou metodou je způsob popsaný v předkládané přihlášce, při kterém se svrchní protilátka sendviče nahradí sondou, složenou ze sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa daného analytu a pomocí linkeru kovalentně připojené oligonkleotidové značky, která slouží pro kvantifikaci analytu. S výhodou lze jako selektivně vazebnou část sondy použít např. známé inhibitory enzymů; agonisty nebo antagonisty receptorů, antagonisty transportérů nebo jimi přenášené látky.
Kromě výjimečné citlivosti, doložené limitem detekce prostatického specifického membránového antigenu (PSMA, odlišný antigen od PSA, bude diskutováno později) v řádu pouze několika desítek molekul, nabízí tento způsob extrémní dynamický rozsah stanovení přesahující šest řádů, což je o 3 až 4 řády více než v případě ELISA. Nadto lze díky sondě vázající se do aktivního místa analytu měřit sílu vazby testovaných látek do stejného aktivního místa daných analytů. Ve spojení s velkým dynamickým rozsahem umožňuje zde uvedený způsob stanovit hodnotu inhibiční konstanty těchto testovaných látek z pouze jediného měření a za použití jediné koncentrace testované látky. Vzhledem k velké citlivosti a selektivitě metody není nutné připravovat rekombinantní analyt, nýbrž postačí pouze analyt obsažený v biologické matrici, např. krvi nebo buněčném či tkáňovém lysátu. Výše zmíněné výhody předkládaného způsobu stanovení jsou unikátní a jsou zde demonstrovány nejen na proteinu PSMA, ale i dalších enzymech.
Základním způsobem testování inhibitorů enzymů je měření vlivu testovaných látek na rychlost enzymem katalyzované reakce (tzv. enzymová kinetika), což obvykle zahrnuje měření množství vzniklého produktu. Vhodným řešením je použití fluorogenního nebo chromogenního substrátu (Richards et al. 1990, Journal of Biological Chemistry, str. 7733-7736) či sledování koncentrace produktu pomocí spřažené chemiluminiscenční reakce (Fan et al. 2007, Assay and Drug Development Technologies, str. 127-136); tyto postupy jsou vhodné pro použití v hromadně prováděných (high througput) testovacích esejích. Pokud takový substrát není dostupný, je obvykle nutné oddělit produkty od substrátů pomocí různých chromatografíckých postupů a následně detekovat např. pomocí UV absorbance nebo radiaktivity (Robinson et al. 1987, Journal of Biological Chemistry, str. 14498-14506; Halsted et al. 1998, Journal of Biological Chemistry, str. 20417-20424; Barinka et al. 2002, Journal of Neurochemistry, str. 477-487). Takové postupy lze však jen velmi obtížně paralelizovat v hromadně prováděných testovacích esejích. Velmi používanou možností je proto vyvinutí inhibitoru, který po navázání do aktivního místa proteinu změní některé měřitelné fluorescenční vlastnosti, ať už spektrum v důsledku FRET efektu, či polarizaci fluorescence (Alquicer et al. 2012, Journal of Biomolecular Screening, str. 1030-1040). Pokud se testovaná látka váže také do aktivního místa enzymu, pak z aktivního místa vytěsňuje zmíněný inhibitor, což lze kvantifikovat právě pomocí měření zmíněných fluorescenčních vlastností. Nevýhodou jsou interference v důsledku fluorescence samotných testovaných látek. Testování látek vázajících se na receptory navíc obvykle obsahuje měření fenotypu celých buněk po vystavení testované látce (Hansen et al. 2010, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, str. 650-662).
Jak bylo zmíněno dříve, kromě PSA je znám další marker karcinomu prostaty, PSMA („prostate specific membrane antigen“, jinak též glutamátkarboxypeptidasa II, zkráceně GCPII) (Horoszewicz et al. 1987, Anticancer Research, str. 927-936). Jedná se o membránový protein podstupující konstitutivní i indukovanou internalizaci (Liu et al. 1998, Cancer Research, str. 4055-4060), což jej předurčuje pro použití pro zobrazování karcinomu prostaty, shrnuto v (Foss et al. 2012, Current Medicinal Chemistry, str. 1346-1359), stejně jako pro zacílení účinku léčiv (Xiang et al. 2013, Biomaterials, str. 6976-6991; Kloss et al. 2013, Nature Biotechnology, str. 71-75).
Přestože je PSMA velmi intenzivně studovaným medicínským cílem a přestože existuje celá řada velmi silně se vázajících a dobře charakterizovaných protilátek rozeznávající PSMA, ani přes řadu pokusů stále neexistuje standardizovaná imunologická metoda pro stanovení koncentrace PSMA v krvi. Pokusy měřit množství PSMA v krvi pomocí Western blotu vedly k rozporuplným výsledkům (Troyer et al. 1995, International Journal of Cancer, str. 552-558; Beckett et al. 1999, Clinical Cancer Research, str. 4034-4040). I když byla pro stanovení PSMA v tkáňových lysátech publikována jak kompetitivní ELISA (US5162504), tak sendvičová ELISA (Sokoloff et al. 2000, Prostate, str. 150-157), žádná z nich zjevně nebyla dostatečně citlivá pro stanovení PSMA v krevním séru, neboť o tom nejsou známé žádné údaje.
Dalším pokusem kvantifikovat PSMA v séru bylo vyvinutí tzv. SELDI eseje, ve které se PSMA ze séra vyvázal na imobilizovanou protilátku a následně byl detekován pomocí hmotnostní spektroskopie (Xiao et al. 2000, Protein Expression and Purification, str. 12-21). Naměřené koncentrace stovek ng/ml jsou nicméně v příkrém rozporu s koncentracemi naměřenými později pomocí standardizované metody vyvinuté v naší laboratoři. Tato naše metoda využívá vyhraněné substrátové specifíty a kvantifikuje PSMA v séru pomocí radioenzymové eseje. Koncentrace PSMA v plasmě zjištěné uvedenou metodou byly u zdravé populace v řádu jednotek ng/ml a tedy přibližně stokrát menší než koncentrace ze SELDI eseje (Knedlík et al. 2014, Prostate, str. 768-780).
Kromě zmíněných metod byla v poslední době vyvinuta další metoda stanovení PSMA založená na biosenzoru, využívajícím fágy dekorované PSMA vázajícími peptidy. Ta ale dosáhla citlivosti pouhých 10 ng/ml PSMA v jednoduché biologické matrici (modelová moč) a pro složitější biologické matrice jako je krevní plasma zjevně není použitelná (Mohan et al. 2013, Journal of the American Chemical Society, str. 7761-7767).
PSMA je kromě prostaty exprimovaný také v centrálním nervovém systému a inhibice jeho enzymové aktivity může být prospěšná v celé řadě neuropath (Zhou et al. 2005, Nature Reviews Drug Discovery, str. 1015-1026). Díky tomu je velmi dobře prozkoumána také enzymová funkce tohoto proteinu a jsou známy jeho dobře charakterizované inhibitory, přičemž stále pokračuje vývoj nových, orálně aplikovatelných inhibitorů (Ferraris et al. 2012, Current Medicinal Chemistry, str. 1282-1294; Pavliček et al. 2012, Current Medicinal Chemistry, str. 1300-1309). Přesto byla teprve nedávno (po přibližně dvaceti pěti letech zkoumání PSMA) vyvinuta esej pro hromadně prováděné testování nových inhibitorů, založená na polarizaci fluorescence kompetitivní próby po vazbě na enzym (Alquicer et al. 2012, Journal of Biomolecular Screening, str. 1030-1040). Oproti způsobu uvedenému v této přihlášce vynálezu má zmíněná esej ovšem jen malý dynamický rozsah, takže se z prvotního testování získá pouze kvantitativní informace o vazbě látky do aktivního místa. Navíc se jedná o metodu v roztoku, kdy látky nenavázané do aktivního místa nelze odmýt, což může v důsledku jejich interference se stanovením poskytnout chybné výsledky, zejména u fluoreskujících testovaných látek.
Až doposud byly jediné spolehlivé metody pro testování inhibitorů PSMA založeny na měření enzymové kinetiky, přičemž substrát byl buď radioaktivně značený (Robinson et al. 1987, Journal of Biological Chemistry, str. 14498-14506; Halsted et al. 1998, Journal of Biological Chemistiy, str. 20417-20424), nebo musel být analyzován pomocí HPLC (Barinka et al. 2002, Journal of Neurochemistry, str. 477-487). Jak je zřejmé, ani jedna z těchto metod není vhodná pro hromadně prováděné testování inhibitorů. To opět ukazuje přínos zde předloženého způsobu testování inhibitorů, představujícího nový princip, který umožní testování takových cílů, pro které je použití známých metod testování inhibitorů obtížné.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob detekce aktivní formy analytů a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů, přičemž se na analyt imobilizovaný na pevném nosiči, s výhodou selektivně prostřednictvím vybrané molekuly, selektivně naváže detekční sonda sestávající ze sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytů (ligandová část), výhodně o molekulové hmotnosti nižší než 2500 Da, výhodněji menší než 1000 Da, a DNA templátu pro polymerasovou řetězovou reakci (oligonukleotidová značka) kovalentně připojeného prostřednictvím chemického linkeru. Po odmytí nenavázané sondy se stanoví množství navázáné sondy, jež je přímo úměrné množství imobilizovaného analytů, s výhodou pomocí detekce oligonukleotidové značky v kvantitativní polymerasové řetězové reakci (qPCR). Sondu lze také inkubovat současně s imobilizovaným analytem i s testovanou látkou potenciálně se vázající do aktivního místa analytů, nebo směsí testovaných látek. Srovnáním množství navázané detekční sondy při inkubaci za přítomnosti a v nepřítomnosti testované látky nebo směsi testovaných látek lze určit sílu vazby testované látky nebo směsi testovaných látek do aktivního místa analytů.
Předmětem vynálezu je tedy způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů, zahrnující kroky, v nichž:
a) se na povrch pevného nosiče imobilizuje analyt nebo skupina analytů ze vzorku nespecifickou nekovalentní adsorpcí, nebo kovalentní vazbou zvolených povrchových funkčních skupin analytů a odpovídajících funkčních skupin na pevném nosiči;
b) pevný nosič s takto imobilizovaným analytem či skupinou analytů se inkubuje s detekční sondou, která se prostřednictvím sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu selektivně naváže na analyt či skupinu analytů; přičemž se tato sonda skládá ze
- sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu;
- oligonukleotidové značky, případně s kovalentně připojeným fluoroforem, haptenem či chemickou skupinou a;
- chemického linkeru, kovalentně spojujícího sloučeninu pro selektivní vazbu a oligonukleotidovou značku;
c) poté se pevný nosič promyje k odstranění nenavázané detekční sondy;
d) nakonec se stanoví množství navázané detekční sondy, přičemž toto množství je přímo úměrné množství daného analytu či skupiny analytů v testovaném vzorku.
Ve výhodném provedení popsaného způsobu stanovení se analyt nebo skupina analytů ze vzorku imobilizuje v kroku a) prostřednictvím na povrch pevného nosiče předem navázané molekuly, schopné během inkubace se vzorkem selektivně vázat v něm obsažený analyt či skupinu analytů; následující další kroky b) až d) způsobu jsou stejné jako v nároku 1.
V dalším výhodném provedení popsaného způsobu stanovení se před krokem a) testovaný vzorek obsahující analyt nebo skupinu analytů nejprve inkubuje s detekční sondou a způsob dále pokračuje kroky c) a d).
V jiném výhodném provedení popsaného způsobu stanovení se v kroku inkubace detekční sondy s analytem, ať imobilizovaným na pevném nosiči nebo přítomným v testovaném vzorku, přidá v různé koncentraci testovaná látka, potenciálně se vázající do aktivního místa, či směs takových látek.
V dalším výhodném provedeni popsaného způsobu stanoveni se navázaná detekční sonda před vlastním stanovením, tedy mezi krokem c) a d), uvolní z vazby na imobilizovaný analyt vymytím a poté se stanoví její koncentrace ve vymývacím roztoku.
Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu je analyt zvolen ze skupiny, zahrnující enzym nebo skupinu enzymů přičemž sloučeninou pro selektivní vazbu do aktivního místa je selektivní inhibitor tohoto enzymu nebo skupiny enzymů; receptor nebo skupinu receptorů přičemž sloučeninou pro selektivní vazbu do aktivního místa je selektivní agonista nebo antagonista daného receptorů či skupiny receptorů; a přenašeč nebo skupinu přenašečů kdy sloučeninou pro selektivní vazbu do aktivního místa je látka schopná selektivní vazby daného přenašeče nebo skupiny přenašečů v místě vazby přenášených molekul;
oligonukleotidová značka je jednovláknová či dvouvláknová DNA, přičemž na jedno nebo obě vlákna oligonukleotidové značky je případně na definovaném místě pomocí dalšího chemického linkeru kovalentně připojena jedna nebo více modifikujících skupin zvolených ze skupiny, zahrnující fluorofor, hapten, nebo reaktivní chemickou skupinu;
haptenem je biotin;
testovanou látkou je látka potenciálně se vázající do aktivního místa analytu a detekční sonda případně zahrnuje i konjugát detekční sondy jak je popsána výše, sestávající ze čtyř molekul sondy s připojeným biotinem, a avidinu, neutravidinu či streptavidinu, na který jsou případně kovalentně připojeny fluorofory nebo enzymy.
V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se množství navázané detekční sondy stanoví pomocí kvantitativní polymerasové řetězové reakce.
V jiném výhodném provedení způsobu podle vynálezu se množství navázané detekční sondy stanoví fluorescenčně nebo pomocí spřažené enzymové reakce spektrofotomericky či chemiluminiscenčně.
V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se v kroku inkubace detekční sondy s pevným nosičem, popřípadě v kroku inkubace vzorku s pevným nosičem, přidá do inkubovaného roztoku přídavná látka, zvolená ze skupiny, zahrnující iontové detergenty, neiontové detergenty, kasein a zněj připravená kaseinová blokační činidla, sérové albuminy, DNA, či immunoglobuliny.
Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se také molekula, schopná selektivně vázat analyt ze vzorku, zvolí ze skupiny, zahrnující protilátky či jejich fragmenty, proteinové molekuly mimikující protilátky jako jsou affibodies, antikaliny či DARPiny, a dále lektiny, avidin, neutravidin, streptavidin, oligopeptidy a chelatační činidla.
V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se v kroku (a) selektivní navázání sledovaného analytu nebo skupiny analytů na molekulu imobilizovanou na pevném nosiči uskuteční prostřednictvím haptenu, biotinu, univerzálního epitopu, afinitního nebo purifíkačního tágu, který se na sledovaný analyt nebo skupinu analytů kovalentně připojí.
V jiném výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako vzorek se použije komplexní biologická matrice, případně obsahující interferující protilátky, zvolená ze skupiny, zahrnující krev, krevní plasmu, krevní sérum, mozkomíšní mok, moč, bakteriální, kvasinkový, tkáňový nebo buněčný lysát, zabydlené bakteriální, kvasinkové nebo buněčné kultivační medium, synoviální tekutinu, plodovou vodu, ascites, pleurální tekutinu, perikardiální tekutinu, extrakt stolice, sliny, pot a semennou plasmu.
Výhodné provedení stanovení schopnosti testované látky vázat se do aktivního místa analytu zahrnuje určení hodnoty vazebné konstanty vazby této látky do aktivního místa analytu, která v případě, že analytem je enzym, odpovídá inhibiční konstantě, z rozdílu množství navázané detekční sondy po inkubaci bez testované látky a po inkubaci s pouze jedinou koncentrací testované látky.
V jiném výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako analyt použije lidský prostatický specifický membránový antigen, známý též jako glutamátkarboxypeptidasa II, a jako sloučenina pro selektivní vazbu pak inhibitor lidského prostatického specifického membránového antigenu.
V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako analyt použije lidský prostatický specifický antigen a jako sloučenina pro selektivní vazbu pak inhibitor lidského prostatického specifického antigenu.
V ještě dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako analyt použije lidská glutamátkarboxypeptidasa III a jako sloučenina pro selektivní vazbu pak inhibitor lidské glutamátkarboxypeptidasy III.
V ještě dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako analyt použije lidská karbonická anhydrasa IX a jako sloučenina pro selektivní vazbu potom inhibitor lidské karbonické anhydrasy IX.
V ještě dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako analyt použije lidská chřipková neuraminidasa a jako sloučenina pro selektivní vazbu pak inhibitor chřipkové neuraminidasy.
V dalším výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako analyt použije lidský fibroblast-aktivující protein a jako sloučenina pro selektivní vazbu pak inhibitor lidského fibroblast-aktivujícího proteinu.
V jiném výhodném provedení způsobu podle vynálezu se jako analyt použije lidská dipeptidylpeptidasa 4 a jako sloučenina pro selektivní vazbu potom inhibitor lidské dipeptidylpeptidasy 4.
Popsaný způsob stanovení probíhá typicky tak, že se na povrch vybraného typu pevného nosiče imobilizuje molekula schopná selektivně navázat analyt, přičemž analytem může s výhodou být enzym, receptor nebo přenašeč. Zpravidla po imobilizaci molekuly se povrch pevného nosiče zablokuje činidly pro potlačení nespecifické adsorpce. Následně se pevný nosič inkubuje se vzorkem obsahujícím analyt, který se selektivně naváže na imobilizovanou molekulu, přičemž vzorkem je typicky komplexní biologická matrice přirozeně obsahující daný analyt. Pevný nosič s imobilizovanou molekulou, na niž je navázaný analyt, se poté inkubuje s detekční sondou za selektivního navázání ligandové části sondy do aktivního místa analytu, přičemž množství navázané detekční sondy se po promytí kvantifikuje s výhodou pomocí qPCR.
Použití komplexního vzorku je podmíněno právě selektivitou vazby analytu na molekulu, která na rozdíl od neselektivního imobilizování umožní účinné navázání i v případě minoritní složky směsi. Vzorkem může být také roztok s analytem, připraveným rekombinantní expresí. Takový analyt pak může oproti přirozeně se vyskytujícímu analytu obsahovat uměle zavedený univerzální epitop selektivně vázaný imobilizovanou molekulou, konkrétně zvolenou pro tento případ.
V jiném uspořádáni se použije purifíkovaný analyt, ať už endogenní nebo rekombinantně připravený, a imobilizuje se (neselektivně) přímo na povrch vybraného typu pevného nosiče namísto molekuly schopné vazby analytu. Toto uspořádání je výhodné především pro testování síly vazby testovaných látek do aktivního místa analytu, neboť nevyžaduje molekulu selektivně vázající analyt, která může být pro některé analyty obtížně dostupná nebo drahá. Pokud se analyt na povrch pevného nosiče imobilizuje přímo, typicky se takový povrch následně blokuje činidly pro potlačení nespecifické adsorpce a poté se, takto upravený, inkubuje s detekční sondou za jejího selektivního navázání do aktivního místa analytu. Množství navázané sondy se po odmytí nenavázané sondy stanoví s výhodou pomocí qPCR.
Význakem vynálezu je to, že sloučeninou tvořící ligandovou část je s výhodou látka, která se zvolí ze skupiny, zahrnující inhibitor enzymu či skupiny enzymů; antagonistu přenašeče či skupiny přenašečů a jím nebo jimi přenášenou látku; agonistu, ko-agonistu, antagonistu či blokátor receptoru či skupiny receptorů; analyt se pak zvolí ze skupiny, zahrnující enzym, skupinu enzymů, přenašeč, skupinu přenašečů, receptor či skupinu receptorů. S výhodou má zmíněná sloučenina pro selektivní vazbu analytu organický charakter a celkovou molekulovou hmotnost do 2500 Da, výhodněji pak do 1000 Da.
Použití sloučeniny pro selektivní vazbu na definovanou skupinu analytů, ať už enzymů, přenašečů nebo receptorů, je výhodné pro kvantifikaci analytu, při níž lze s jednou připravenou detekční sondou kvantifikovat několik různých proteinů, neboť se ukázalo, že selektivita mezi členy dané skupiny je dostatečně zajištěna prostřednictvím imobilizované molekuly. Nadto je stejně výhodné i pro měření schopnosti vazby testovaných látek do aktivních míst analytů. neboť bylo vyzkoušeno, že s jednou připravenou detekční sondou je možné testovat jak vazebnou účinnost pro zamýšlený cíl, tak pro možné vedlejší cíle. Nakonec, po odstranění nenavázané sondy dostatečným promytím, se stanoví množství navázané detekční sondy.
Význakem vynálezu je dále to, že pro detekci a kvantifikaci imobilizované oligonukleotidové značky a tím i navázané detekční sondy se využije qPCR, což vede k velmi vysoké citlivosti stanovení. Například pro stanovení PSMA bylo po optimalizaci postupu předkládaným způsobem dosaženo citlivosti deseti attogramů, což odpovídá pouhým desítkám molekul proteinu. To je pro srovnání přibližně miliónkrát menší množství, než je stanovitelné dnešními metodami pro detekci PSMA. Taková citlivost stanovení dalších antigenů by mohla umožnit časnou detekci některých nádorových onemocnění, např. určení progrese karcinomu prostaty po radikální prostatektomii pomocí již v úvodu zmiňovaného stanoveni PSA. Stanovení qPCR také s výhodou umožňuje paralelní stanovení více analytů najednou, neboť paralelní stanovení více nukleotidových templátů v jedné směsi je standardní a rozšířenou metodou. Další zásadní výhodou stanovení pomocí qPCR představuje velký dynamický rozsah stanovení koncentrace analytu. Ukázalo se, že v některých příkladech dosahuje dokonce šest až sedm řádů rozdílu v koncentraci analytu v původním vzorku, což představuje o tři až čtyři řády větší rozsah než v případě stanovení ELISA. Zvýšením rozsahu o několik řádů oproti běžně používané konvenční ELISA by vedlo k úspoře finančních prostředků, neboť by ubylo opětovné přeměřování klinických vzorků, u nichž množství analytu přesáhlo krajní limity detekce.
Hlavní limitací citlivosti popsaného způsobu stanovení je vedle specifické afinity detekční sondy také jeji nespecifická adsorpce na povrch pevného nosiče. Význakem vynálezu je, že nespecifická adsorpce detekční sondy se výhodně potlačí nahrazením jednovláknové oligonukleotidové značky značkou dvouvláknovou. Význakem vynálezu je dále to, že dalšího zvětšení odstupu signálu od nespecifického pozadí lze dosáhnout naředěním vzorku a především detekční sondy v roztoku, obsahujícím různá blokační činidla potlačující nespecifickou adsorpci. Takovými činidly jsou výhodně neionické a ionické detergenty, albuminy a kaseinové přípravky.
Význakem vynálezu je dále to, že selektivní vazby detekční sondy do aktivního místa analytu se využije pro měření síly vazby testovaných látek do aktivního místa daného analytu. V takovém uspořádání se detekční sonda s analytem inkubuje v přítomnosti testované látky, nebo směsi testovaných látek. Pokud se testovaná látka váže do aktivního místa daného analytu, dojde k poklesu navázaného množství sondy ve srovnání s inkubací v nepřítomnosti testované látky. Jak je uvedeno dále v popisu a v příkladech tohoto vynálezu, bylo zjištěno, že z velikosti poklesu vazby sondy a použité koncentrace testované látky lze vypočítat disociační konstantu (Kj) dané testované látky, která v případě, že analytem je enzym, odpovídá inhibiční konstantě (Kt). Pro to je velmi zásadní velký dynamický rozsah stanovení, neboť z jediné koncentrace testované látky použité při měření lze v celém dynamickém rozsahu metody dopočítat disociační konstantu testované látky vůči analytu. To znamená, že při rozsahu metody šest řádů lze z použité koncentrace testované látky 1 mmol.l’1 (a použité koncentrace detekční sondy odpovídající jejímu Kj) stanovit kvantitativně disociační konstantu dané látky v rozmezí 0,5 mmoLF1 až 0,5 nmol.T1 nebo obdobně z použité koncentrace testované látky 1 μιηοΙ.Γ1 stanovit kvantitativně disociační konstantu dané látky v rozmezí 0,5 μιηοΙ.Γ1 až 0,5 pmol.1’1. Jak je ukázáno dále v popisu, rozsah měřitelných Kd lze měnit nejen změnou koncentrace testované látky, ale také změnou koncentrace detekční sondy.
Na rozdíl od současných způsobů stanovení tedy popsaný způsob umožňuje kvantitativní screening (testování) látek vázajících se do aktivních míst enzymů, receptorů či transportérů, ve kterém se z každé jamky mikrotitrační destičky získá přesné Kd testované další látky. Získání kvantitativní informace o inhibiční konstantě další látky tímto způsobem je velmi efektivní i v případě enzymů, neboť oproti qPCR je v používané enzymové kinetice vzhledem k podstatně menšímu dynamickému rozsahu běžných stanovení substrátů či produktů reakce potřebné proměřit pro každou inhibiční konstantu celou koncentrační řadu testované látky.
Extrémní citlivost předkládané metody přináší i další výhody při stanovení inhibičních konstant - účinnost inhibice se změří i s velmi malým množstvím analytů, což je výhodné zejména u membránových proteinů a jiných obtížně připravitelných proteinů. Překvapivě bylo také zjištěno, že citlivost a selektivita našeho stanovení je natolik vysoká, že pro screening inhibitorů lze použít např. krevní plasmu i v případě zcela minoritních proteinů, a to při spotřebě zlomků μΐ na jednu testovanou látku. Příkladem minoritního proteinu je v této přihlášce PSMA, který se v plasmě obvykle vyskytuje v koncentracích pod 1 ng.mr1 plasmy. Pro srovnání, koncentrace sérového albuminu se pohybuje v rozmezí od 35 do 50 mg.ml'1 plasmy a je tedy téměř o osm řádů vyšší.
Využití biologického materiálu přirozeně obsahujícího aktivní formu daného analytů má nejen tu výhodu, že není potřeba obtížné rekombinantní přípravy tohoto analytů, ale uplatní se i v tzv. personalizované medicíně. Jde například o měření resistence virových proteinů vůči léčivu v krvi infikovaných pacientů či o stanovení vazby léčiv na enzym cytochrom P-450 oxidázu pacienta a tím predikci rychlosti odbourání daných léčiv v organismu pacienta.
Nezanedbatelnou výhodou překládaného způsobu stanovení je také fakt, že použití pevného nosiče a možnost odstranění přebytku testované látky promytím činí tento způsob odolným vůči chybným výsledkům v důsledku fluorescence testovaných dalších látek. Tím se zásadně liší například od metod využívajících polarizaci fluorescence a ve svém důsledku umožňuje velmi efektivní hledání účinných látek vázajících se do aktivních míst enzymů, receptorů a přenašečů v nepurifikovaných směsích látek získaných extrakcí z rostlin či hub, neboť barevnost ani fluorescence zmíněných směsí nepředstavuje žádnou limitaci předkládaného způsobu.
Pevný nosič představuje v této přihlášce vynálezu matrici pro imobilizaci molekuly schopné selektivní vazby analytů, či pro přímou imobilizaci analytů. Pevný nosič umožňuje snadné odstranění přebytečných chemikálií promytím, především nenavázané detekční sondy a následné selektivní stanovení množství navázané sondy, obdobně jako je tomu u běžně používaných imunologických metod typu ELISA. Stejně tak umožňuje záměnu roztoků používaných pro vazbu molekuly, analytu i detekční sondy a pro detekci oligonukleotidové značky detekční sondy, s výhodou pomocí qPCR.
Materiál pevného nosiče se zvolí ze skupiny, zahrnující polyethylen, polypropylen, poly(4-methylbuten), polystyren, polymethacrylát, poly(ethylen tereftalát), nylon, poly(vinyl butyrát), sepharosu, sephadex, sklo, keramiku, kov a oxidy kovu. Povrch pevného nosiče může být pro usnadnění kovalentního navázání molekuly či analytu dále funkcionalizovaný, s výhodou může obsahovat chloromethylové, tosylové, mesylové, azidové, alkynové, karboxylové, aldehydové, ketonové, hydroxylové, sulfhydrylové, epoxy či amino skupiny.
Typ pevného nosiče se zvolí ze skupiny, zahrnující povrch jamky mikrotitrační destičky, mikročástice o průměru typicky od 100 nm do 400 pm a určité místo („spot“) na povrchu mikročipu. Způsob odstranění nenavázaných chemikálií promytím zahrnuje odebrání kapalné fáze, dekantaci kapalné fáze, filtraci, magnetickou separaci s následným odebráním supematantu a centrifugací s následným odebráním supematantu.
Význakem vynálezu je dále to, že na pevný nosič se s výhodou nejprve imobilizuje molekula schopná selektivní vazby analytu, která se zvolí ze skupiny, zahrnující protilátky a jejich fragmenty Fab, F(ab’)2, ScFv, Fv; dále protilátky tvořené pouze těžkým řetězcem (heavy chain antibody) a jejich fragment sestávající se z jediné domény (single domain antibody, VHH), kombinatomě připravované proteinové molekuly mimikující protilátky (jako jsou affibodies, antikaliny, DARPiny), lektiny, avidin, neutravidin, streptavidin, oligopeptidy a chelatační činidla.
Molekula se výhodně imobilizuje nespecifickou nekovalentní adsorpcí, s výhodou přímo na polystyrénový či polypropylenový povrch jamek mikrotitrační destičky nebo vícejamkové PCR destičky. Molekula schopná selektivní vazby analytu se na povrch pevného nosiče s výhodou imobilizuje také kovalentně. Proteinová molekula se imobilizuje reakcí svých povrchových skupin, které zahrnují primární amin, thiol (sulfhydryl), karboxyl, aldehyd, keton a hydroxyl. Reakce probíhá přímo s reaktivními nebo aktivovanými skupinami přítomnými na povrchu pevného nosiče, zvolenými ze skupiny, zahrnující epoxy, chloromethylové, tosylové, mesylové, azidové, alkynové, aktivované karboxylové, aldehydové, ketonové, hydroxylové, sulfhydrylové, či amino skupiny. Pevné nosiče, mající na povrchu aktivované skupiny, jsou komerčně dostupné (Invitrogen, PolyMicrospheres).
Imobilizace může být provedena i prostřednictvím heterobifunkčního spojovacího činidla, jehož jedna reaktivní skupina reaguje s odpovídající skupinou na povrchu molekuly a druhá reaktivní skupina reaguje s odpovídající skupinou na povrchu pevného nosiče. Nejuniverzálněji se kovalentního napojení na pevný nosič docílí zavedením bioortogonálních reaktivních párů skupin na povrch molekuly i pevného nosiče. Řada potřebných činidel je komerčně dostupná, např. od firem Solulink, Click Chemistry Tools, Jena Bioscience, Sigma Aldrich. Páry bioortogonálních skupin jsou stejné jako ty, které se využijí pro spojení ligandové a oligonukleotidové části sondy.
K. selektivní imobilizaci molekuly schopné selektivně vázat analyt se s výhodou použije vhodně upravený povrch pevného nosiče, zejména pokud uvedená molekula po přímé adsorpci na povrch ztrácí svoji aktivitu. Výhodně se použije povrch s imobilizovanou, biotin vázající složkou a molekula je povrchově biotinylována, například pomocí komerčně dostupných NHS-esterů biotinu (Pierce). Obdobně lze molekulu selektivně imobilizovat na vhodně zvolený povrch prostřednictvím zvoleného universálního epitopu. S výhodou se použijí peptidové a proteinové tágy, zvolené ze skupiny, zahrnující His-tag, Strep-tag, Avi-tag, Flag-tag, GST-Tag. Protilátku lze s výhodou navázat i na povrch s nespecificky imobilizovanou protilátkou nebo jinou molekulou, selektivně rozeznávající třídu dané protilátky.
Po navázání molekuly schopné selektivní vazby analytů se v dalším kroku zabrání nespecifické adsorpci na povrch pevného nosiče jeho inkubací s blokačním roztokem. Blokační roztok obsahuje s výhodou složky zvolené ze skupiny, zahrnující albuminy, kasein, kaseinové blokační přípravky, nukleové kyseliny, immunoglobuliny.
Pevný nosič s imobilizovanou molekulou schopnou selektivně vázat analyt se následně inkubuje se vzorkem. Selektivní vazba analytů umožňuje vyvázání analytů i ze složitých směsí, ve kterých je analyt minoritní složkou. Jako molekula se pro tento účel s výhodou použije monoklonální či polyklonální protilátka či její fragmenty selektivně rozeznávající analyt. Vysoká afinita protilátky k analytů umožní jeho velmi citlivou detekci, neboť se na protilátku naváže většina molekul analytů z komplexní matrice a nadto se neuvolni při promývání pevného nosiče, zejména při odmývání nenávázané sondy. Ve stanovení podle předkládaného vynálezu lze proto jako vzorek použít komplexní biologickou matrici, případně obsahující interferující protilátky, zvolenou ze skupiny, zahrnující krev, krevní plasmu, krevní sérum, mozkomíšní mok, moč, tkáňový nebo buněčný lysát, synoviální tekutinu, plodovou vodu, ascites, pleurální tekutinu, perikardiální tekutinu, extrakt stolice, sliny, pot a semennou plasmu.
Bylo také vyzkoušeno, že na rozdíl od dnes používaných imunologických metod využívajících pro stanovení analytů sendvič protilátek, jakými jsou sendvičová ELISA nebo immuno-PCR, není předkládaný způsob stanovení citlivý k přítomnosti interferujících protilátek - jejich přítomnnost ve vzorku nijak neovlivní výsledek měření koncentrace analytu. Pro potlačení nespecifické vazby složek vzorku se vzorek navíc s výhodou naředí roztokem obsahujícím složky zvolené ze skupiny, zahrnující ionické detergenty, neionické detergenty, kasein a z něj připravené kaseinové blokační činidla, sérové albuminy, DNA či immunoglobuliny.
V jiném výhodném uspořádání se jako vzorek použije roztok obsahující rekombinantně připravený analyt zvolený ze skupiny, zahrnující bakteriální, kvasinkový a buněčný lysát, zabydlené bakteriální, kvasinkové a buněčné medium. Rekombinantně připravený analyt může, podobně jako molekula pro jeho selektivní vazbu, obsahovat uměle zavedený universální epitop, který se použije pro selektivní navázání na zmíněnou molekulu imobilizovanou na povrchu pevného nosiče nebo na vhodně upravený povrch pevného nosiče, stejně jako je popsáno výše pro selektivní navázání molekuly na povrch pevného nosiče.
Pokud se jako vzorek použije roztok purifikovaného rekombinantního nebo puntíkovaného endogenního analytu, pro imobilizaci analytu na povrch pevného nosiče lze kromě selektivní vazby analytu na molekulu využít také nespecifické kovalentní či nekovalentní adsorpce analytu přímo na povrch pevného nosiče (stejně jako je popsáno pro přímou adsorpci molekuly). Pokud se analyt naváže na pevný nosič přímo, ať už nespecifickou nekovalentní adsorpci nebo kovalentně, povrch pevného nosiče se následně inkubuje s blokačním roztokem. Blokační roztok obsahuje s výhodou složky zvolené ze skupiny, zahrnující albuminy, kasein, kaseinové blokační přípravky, nukleové kyseliny, immunoglobuliny.
Po navázání analytu ze vzorku, ať už selektivním na molekulu, nebo přímém na povrch pevného nosiče, se pevný nosič inkubuje s roztokem detekční sondy, která se skládá ze sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu (ligandová část), kovalentně spojené prostřednictvím chemického linkeru s oligonukleotidovou značkou (amplifikovatelným DNA templátem), k selektivnímu navázání ligandové části sondy do aktivního místa imobilizovaného analytu. Pro potlačení nespecifické vazby detekční sondy se sonda pro inkubaci s výhodou naředí roztokem obsahujícím složky zvolené ze skupiny, zahrnující ionické detergenty, neionické detergenty, kasein a z něj připravené kaseinové blokační činidla, sérové albuminy, DNA či immunoglobuliny.
Bylo rovněž vyzkoušeno, že při selektivní imobilizaci analytu přes molekulu lze, ještě před inkubací analytu ve vzorku spolu s pevným nosičem, nejprve inkubovat analyt ve vzorku spolu s detekční sondou za selektivního navázání detekční sondy do aktivního místa analytu. S pevným nosičem s navázanou imobilizovanou molekulou se v tomto případě inkubuje až tato směs analytu a detekční sondy, tzn., že tento krok nahradí kroky inkubace analytu ve vzorku s pevným nosičem a následné inkubace detekční sondy spolu s pevným nosičem s navázaným analytem.
Takový způsob je výhodný zejména u endoproteas, které se obvykle autoproteolyticky degradují. Tím, že se nejprve inkubují s detekční sondou, která po navázání do aktivního místa inhibuje jejich proteolytickou aktivitu, a až poté s pevným nosičem, se účinně zamezí jejich degradaci. Naproti tomu v případě, kdy se nejprve inkubuje endoproteasa spolu s pevným nosičem s imobilizovanou molekulou a až pak s detekční sondou, může po dobu inkubace s pevným nosičem docházet k autoproteolytické degradaci dané proteasy. Inkubace detekční sondy s analytem ještě před inkubací analytu s pevným nosičem bývá výhodná také v případě, že aktivní forma daného analytu je destabilizována selektivní vazbou na molekulu navázanou na pevném nosiči či je jinak v čase nestálá, protože navázání detekční sondy do aktivního místa analytu obvykle aktivní formu stabilizuje. Navíc se tímto postupem ušetří jeden krok inkubace a případného promývání, což kromě urychlení stanovení může v některých případech vést ke zlepšení citlivosti stanovení.
V následujícím kroku se pevný nosič promytím zbaví nenavázané sondy a poté se stanoví množství navázané detekční sondy, s výhodou pomocí qPCR. K promytému pevnému nosiči se přidá směs pro qPCR reakci typicky obsahující polymerasu, směs deoxyribonukleotid trifosfátů (dNTPs), příměry, fluorogenní sondu či fluorescenčí barvu pro detekci dsDNA a pufr s aditivy. Následně se amplifíkuje množství oligonukleotidové značky v qPCR a během každého cyklu se odečítá hodnota fluorescence, ze které se pro každý vzorek odvodí hodnota tzv. Cq, která je nepřímo úměrné logaritmu koncentrace sondy, která je přímo úměrná koncentraci stanovovaného analytu. Způsob provedení a vyhodnocení qPCR je v dnešní době natolik rutinní činností, že není třeba jej podrobněji popisovat.
Množství navázané detekční sondy se stanoví buď přímo na použitém pevném nosiči tak, že se k pevnému nosiči přidá roztok sloužící pro detekci a následně se změří pozorovatelná veličina úměrná množství navázané sondy. To může zahrnovat nejen výše popsané stanovení pomocí qPCR, ale i řadu jiných způsobů, které jsou dále popsány podrobněji. V jiném uspořádání se k promytému pevnému nosiči nejprve přidá vymývací roztok a po uvolnění navázané sondy do tohoto roztoku se v něm stanoví její množství. Jak bylo zjištěno, pro uvolnění navázané sondy do roztoku lze bez ztráty citlivosti a rozsahu stanovení využít prostého uvolnění sondy z aktivního místa, které je popsáno rychlostní konstantou disociace, kOff. Alternativně chemický linker s výhodou obsahuje například disulfidický můstek, který je vhodným činidlem obsaženým ve vymývacím roztoku redukován, čímž dojde k rychlému a kvantitativnímu uvolnění oligonukleotidové značky z povrchu pevného nosiče do roztoku. S výhodou se jako redukční činidlo použijí běžná redukční činidla, jako dithiothreitol, β-merkaptoethanol, tris(2-karboxyethyl)fosfin (TCEP) a imobilizovaný TCEP, která jsou kompatibilní s DNA polymerasou v následujícím qPCR stanovení. Výhodou takového uspořádání je například možnost využití rozdílných mikrotitračních destiček pro imobilizaci analytu se sondou a pro její následnou detekci, protože roztok s uvolněnou sondou lze přenést do nové destičky. Takto lze pro imobilizaci při následné detekci qPCR použít i polystyrénovou destičku, přestože tato je nevhodná pro teplotní cyklování v termálních cyklerech pro qPCR.
Praktickou výhodou předkládaného vynálezu je to, že chemická struktura mnoha velmi potentních sloučenin selektivně se vázajících do aktivních míst důležitých analytů je již známa, především proto, že řada receptorů a enzymů je vhodným cílem terapeutického zásahu a jejich inhibice je prospěšná. Stejně tak bývají cílem terapeutického zásahu klíčové interakce mezi patogenem a hostitelem, zejména prostřednictvím inhibice interakcí mezi povrchovým ligandem patogenu a buněčným receptorem hostitele. Nejúspěšnější léky proti obtížně léčitelným nebo jinak vůbec neléčitelným virovým chorobám pak představují velmi potentní inhibitory klíčových enzymů pro replikaci viru. Mezi takové nejúspěšnější klinicky používané inhibitory patří inhibitory HIV proteasy, HIV reverzní transkriptasy a nově také HCV NS5B polymerasy. Zatímco pro klinické využití nesmí být nízkomolekulární látka toxická a zároveň musí být rozpustná ve vodné fázi, pro způsob uvedený v této přihlášce vynálezu se s výhodou použijí nejen obdobné sloučeniny pro selektivní vazbu analytu, ale i sloučeniny toxické či ve vodní fázi obtížně rozpustné nebo zcela nerozpustné. Nerozpustné sloučeniny pro selektivní vazbu analytu lze použít díky tomu, že připojení velmi polárního a rozpustného oligonukleotidů zvýší rozpustnost použité sloučeniny natolik, že výsledná detekční sonda se bez problémů rozpustí v koncentracích potřebných pro stanovení.
Inhibitorem enzymu se pro účely této přihlášky vynálezu rozumí látka schopná vazby do aktivního místa enzymu a tím i vytěsnění substrátu či substrátů a/nebo kofaktoru či kofaktorů enzymu z jeho aktivního místa, což zpomalí enzymem katalyzované reakce substrátu či substrátů. Enzymem se pak chápe biomakromolekula, skládající se nejčasteji z polypeptidového nebo polyribonukleového řetězce, mající specifickou trojrozměrnou strukturu, která selektivně katalyzuje vybrané chemické reakce snížením jejich aktivační bariéry volné energie. Selektivita katalýzy je důsledkem konkrétního uspořádáním aktivního místa enzymu, do kterého se selektivně váže substrát či substráty a případně kofaktory. Existují celé skupiny enzymů, které katalyzují stejný typ reakce a také společné inhibitory více enzymů v dané skupině, například pepstatin inhibuje velkou část aspartátových proteas. Přestože bezprostřední okolí štěpené vazby může být stejné, celá vazebná dutina aktivního místa bývá rozdílná, a díky tomu i v rámci takové skupiny (např. aspartátových proteas) každý enzym katalyzuje danou reakci jen u více či méně omezené skupiny substrátů. Vzhledem k popsaným odlišnostem ve vazebné dutině existují i specifické inhibitory vázající se selektivně do aktivního místa pouze jednoho enzymu, nebo jen několika různých enzymů. Velmi častým a obtížným problémem medicinální chemie je hledání specifických enzymů. Při vývoji inhibitoru jako nového léčiva se často začíná látkami, které inhibují několik různých enzymů a inhibitor se teprve postupně modifikuje tak, aby inhiboval pouze cílový enzym. Inhibice jiných než cílových enzymů je příčinou vedlejších účinků léků, příkladem jsou nesteroidní inhibitory COX-2, které zároveň inhibují COX-1.
Ve zde předkládaném způsobu kvantifikace analytů není úplná selektivita inhibitoru potřebná, protože kromě inhibitoru je selektivita stanovení dána i protilátkou použitou v sendviči. Výhodně lze jako ligandovou část detekční sondy použít společný inhibitor více enzymů a v kombinaci s různými protilátkami pak vyvinout esej pro selektivní stanovení několika analytů, zcela bez potřeby vyvíjet a syntetizovat detekční sondu jednotlivě pro každý z nich.
Pro testování inhibiční účinnosti testovaných látek se společný inhibitor několika enzymů použije ještě výhodněji, neboť pro syntézu detekční sondy se využije výchozí látka vývoje léčiva, která není dostatečně selektivní. S připravenou sondou se pak způsobem popsaným v této přihlášce vynálezu přímo kvantifikuje selektivita dalších připravovaných látek a na základě získaných výsledků lze vybrat ty látky, které dostatečně selektivně inhibují pouze cílový enzym. S jedinou sondou lze tedy vyvinout testovací esej právě pro ty enzymy, které jsou relevantní pro další vývoj léčiva. V příkladech této přihlášky vynálezu je popsáno využití specifického inhibitoru HIV proteasy, společného inhibitoru glutamát karboxypeptidas II a III (GCPII a GCPIII), společného inhibitoru karbonických anhydras II a IX (CA-II a CA-IX), společného inhibitoru neuraminidas lidských chřipkových subtypů NI a N2, a nakonec společného inhibitoru aspartátových proteas pepstatinu.
Receptorem je pro účely této přihlášky chápán protein, který je schopen po navázání ligandu, agonisty, vytvořit vnitrobuněčný signál, který se projeví změněnou enzymovou či jinou aktivitou samotného receptoru nebo s ním přímo či zprostředkovaně asociovaných proteinů, případně změnou koncentrace určitých iontů a tím změněnou enzymovou aktivitou či jinou aktivitou iontově závislých proteinů, popřípadě změnou koncentrace druhých poslů a tím změněnou aktivitou buněčných proteinů a v neposlední řadě případně změnou exprese některých genů. Příkladem takového receptoru je typicky membránově asociovaný protein, obvykle obsahující strukturní domény na obou stranách membrány, spojené jedním či více transmembránovými úseky. Klíčovou vlastností takových receptorů je, že po vazbě ligandu změní konformaci (často formou multimerizace) a tím přenesou informaci o navázání ligandu přes membránu.
U první velké skupiny receptorů dochází k přenosu signálu buď změněnou enzymovou aktivitou či jinou aktivitou strukturní domény na druhé straně membrány samotného receptoru nebo s ním asociovaných proteinů (enzymů), typicky GTP-as (G-proteinů) či proteinových kinas. Aktivované asociované proteiny mohou poté aktivovat další proteiny a tím spouštět celou signalizační kaskádu, často zahrnující takzvané druhé posly, jakými jsou například fosfatidylinositoltrifosfáty, diacyl glycerol, vápenaté ionty, cyklické AMP či GMP. Příkladem takových receptorů jsou tzv. metabotropní glutamátové receptory v lidské nervové soustavě, EGF-receptor, insulinový receptor, integrinové receptory a mnoho dalších.
U druhé významné skupiny receptorů pak dochází po navázání ligandu, ať už extracelulámě či intracelulámě, ke vzniku signálu změnou jejich propustnosti pro vybrané ionty, tj. změnou jejich koncentrace uvnitř buňky. Mechanismem účinku je pak zejména v případě vápenatých iontů specifická aktivace dalších proteinů těmito ionty, či v případě ostatních iontů změnou membránového elektrického potenciálu a tím otevřením či uzavřením napěťově řízených kanálů, což má obvykle za následek také změnu koncentrace vápenatých iontů.
Takové receptory pak bývají nazývány jako ionotropní receptory a příkladem jsou například glutamátové AMPA, kainátové či NMDA receptory. Jiným typem receptoru jsou například receptory steroidních hormonů nacházející se v cytoplasmě, které se po navázání ligandu přenesou do jádra, kde regulují expresi určitých genů. Ligandem receptorů může obecně být jiný protein, složky extracelulámí matrice, peptid či látka lipidického, aminokyselinového, sacharidového, steroidního či kombinovaného typu.
Protože efektorové místo receptoru, tzn. samotný iontový kanál či enzymově nebo jinak aktivní doména, a aktivní místo vázající ligand jsou od sebe prostorově odděleny, je použití nízkomolekulámích ligandů pro vazbu do aktivních míst receptorů komplikovanější než u enzymů. Agonista, ko-agonista, antagonista či blokátor receptoru či skupiny receptorů se pro účely této přihlášky definují pomocí příkladu na NMDA ionotropním glutamátové receptoru: pro aktivaci receptoru se do odpovídajících vazebných míst naváže agonista i ko-agonista, jejichž vazba způsobí konformační změny vedoucí k aktivaci receptoru. Každá z těchto látek se váže na jiné místo receptoru, agonistou je fyziologicky především L-glutamát, zatímco koagonistou je fyziologicky glycin. Do glutamátového vazebného místa se váží další agonisté, jako L-aspartát, či částeční agonisté jako N-methyl-D-aspartát, zkráceně NMDA, do glycinového vazebného místa se váží také další ko-agonisté, jako je D-serin, či částeční ko-agonisté. Kromě toho se na receptorech nachází alosterické místo, do kterého se váží modulátory receptoru, např. polyaminy nebo pregnenolon sulfát. Nakonec látky, které se váží přímo do iontového kanálu receptoru, slouží jako blokátory těchto receptorů, neboť znemožní průchod iontů kanálem. Antagonistou takového receptoru pak mohou být nejen zmíněné blokátory, akompetitivní antagonisté jako chloroform, fencyklidin nebo amantadin či nekompetitivní antagonisté jako aptiganel, ale také kompetitivní antagonisté vázající se do glutamátového nebo glycinového místa (jako je selfotel). Všechny zmíněné skupiny látek se využijí jako ligandová část v detekční sondě pro citlivou detekci receptorů, stejně jako pro stanovené síly vazby testovaných látek do aktivních míst receptorů.
V závislosti na typu látky použité pro vytvoření detekční sondy se pak testuje vazba testovaných látek do konkrétních vazebných míst na receptoru. Tento přístup je unikátní, pomocí současných testů založených na celých buňkách lze odhalit pouze účinek dané látky, nikoliv konkrétní místo vazby. Důležité je i testování selektivity inhibice receptorů, neboť největším problémem vývoje léků cílicích zejména na NMDA receptory je jejich nízká selektivita vůči ostatním glutamátovým receptorům, což vede k závažným vedlejším účinkům. Zde předkládaný způsob umožňuje (obdobně jako je výše popsané u enzymů) systematické testování těchto selektivit velkých souborů látek, což není současnými metodami možné. Ty totiž nejčastěji měří např. změnu koncentrace vápenatých iontů uvnitř buněk po jejich vystavení testované látce, což neumožňuje přesné rozlišení mechanismu účinku testované látky.
Dalším platným cílem předloženého vynálezu jsou výše zmíněné napěťově řízené kanály, které sice nespadají do definice receptorů, nicméně jsou pro ně známé nízkomolekulámí blokátory, například tetrodotoxin či lidokain. Ty jsou využitelné pro přípravu detekčni sondy schopné vazby do iontových kanálů a využitelné pro jejich kvantifikaci i pro hledání jejich dalších blokátorů.
Přenašeč se pro účely této přihlášky rovněž definuje na základě jeho biologické funkce. Jedná se o proteinovou molekulu schopnou selektivní vazby ligandu, tj. přenášené látky, a po jejím navázání schopné zprostředkovat i její přesun. Velmi často jde o přenos nízkomolekulámích látek přes lipidovou membránu, které by přes ni jinak neprocházely, nebo s jen velmi malou účinností, tzn., že se obvykle jedná o přenos látek dovnitř a vně buněk. Příkladem jsou vysokoafinní alfa folátové receptory umožňující přenos kyseliny listové a jejího analogu metotrexátu, používaného k léčení některých typů nádorů. Příkladem obdobného typu jsou také aminokyselinové přenašeče na hemoencefalitické bariéře. Příkladem odlišného typu přenašeče je pak manoso-6-fosfátový receptor, který po rozpoznání svého ligandu, kterým je specifická posttranslační modifikace proteinu, zprostředkuje transport navázaného ligandu do buněčné složky, v tomto případě lysozomu. Na tomto příkladu je vidět, že se nemusí jednat o přenos ligandu přes lipidickou dvouvrstvu, ale také o třídění a přesun ligandu do specifických buněčných součástí. Přenášená látka či jiný ligand schopný vazby do místa pro vazbu přenášené látky se využije jako ligandová část v detekční sondě pro citlivou detekci přenašečů, stejně jako pro testování inhibičních schopností testovaných látek vůči přenašečům.
Sloučenina pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu, tj. ligandová část detekční sondy, se s výhodou připraví s chemickým linkerem, jehož prostřednictvím se poté spojí s oligonukleotidovou značkou. Tento linker se na uvedenou sloučeninu připojí na takovém místě, aby neporušil její vazbu do aktivního místa analytu. Vhodné místo pro připojení linkeru se určí buď ze znalosti trojrozměrné struktury aktivního místa s navázanou sloučeninou pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu, nebo tak, že se připraví více látek s různým místem napojení linkeru a otestuje se síla jejich vazby do aktivního místa analytu. Dále se linker připraví v takové délce, aby po navázání zmíněné sloučeniny do aktivního místa analytu tento linker dosáhl mimo vazebnou dutinu analytu a tím umožnil napojení oligonukleotidové značky, které tak nebude interferovat s vazbou sloučeniny do aktivního místa analytu. Pokud se podaří najít vhodné místo napojení linkeru a vhodnou délku linkeru, tak lze pro přípravu ligandové části detekční sondy použít již známé sloučeniny vázající se do aktivního místa daného analytu. Chemický linker se s výhodou zvolí ze skupiny, zahrnující polyethylenglykolový; peptidový; polyamidový; alifatický či hydroxylovaný alifatický řetězec; případně organický polymer jako jsou polydextran, hydroxyethyl methakrylát (HEMA), hydroxypropyl methakrylamid (HPMA); a jejich kombinace. Daný linker se dále připraví s vybranou skupinou z páru bioortogonálně reaktivních skupin, přičemž se také připraví oligonukleotidová značka s druhou odpovídající skupinou z daného páru bioortogonálně reaktivních skupin. Reakcí těchto skupin se pak připraví výsledná detekční sonda, tzn. sloučenina pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu napojená přes chemický linker na oligonukleotidovou značku. Páry bioortogonálně reaktivních skupin se s výhodou zvolí ze skupiny, zahrnující amin - aktivovaný ester, hydroxyl - aktivovaný ester, amin - aktivovaný fosfát, azid-alkyn (katalýza Cu2+), azid - cyklooktyn, azid - dibenzylcyklooktyn, hydrazin - aldehyd nebo keton, aromatický hydrazin - aromatický aldehyd nebo keton, tetrazin - alken, sulfhydryl - alken, sulfhydryl - maleimid, sulfhydryl - sulfhydryl, amin nebo sulfhydryl - epoxyalkan, amin nebo sulfhydryl - tosylát nebo mesylát nebo alkylhalogenid, sulfhydryl - vinylsulfon, amin - aldehyd nebo keton (redukce kyanoborohydridem), isokyanát - amin nebo hydroxyl, amin - sulfonylchlorid, amin-amin (prostřednictvím sulfurylchlorid pyridinu nebo dichlorpyrimidinu nebo kyanurchloridu), azid - nitryl, diol - boronová kyselina, diol fenylboronová skupina, amin - hydroxyl (prostřednictvím kyanurchloridu).
Reakce sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu s linkerem s první z páru bioortogonálních skupin a oligonukleotidové značky obsahující druhou z páru bioortogonálních skupin se dosáhne prostým smícháním jejich roztoků ve vhodném poměru a vhodných podmínkách a nejvýhodněji necháním reagovat při teplotě místnosti přes noc. Pro kvantitativní rozsah reakce se použije molámí přebytek sloučeniny pro selektivní vazbu s linkerem, protože bývá připravitelná ve větších množstvích než oligonukleotid. Molámí přebytek této sloučeniny je důležitý zejména tehdy, pokud se připraví jako aktivovaný ester pro reakci ve vodné fázi např. s aminem na oligonukleotidu, protože aktivovaný ester je ve vodné fázi postupně hydrolyzován a částečně tak nestihne zreagovat s aminem oligonukleotidu. Sloučenina pro selektivní vazbu se s výhodou použije v 5 až 50 násobném molámím nadbytku, přičemž při použití organické fáze namísto vodní se kvantitativní konjugace dosáhne i při jejím nižším přebytku a dokonce i při ekvimolámím množství. Obdobně se i s malým přebytkem takové sloučeniny dosáhne velké účinnosti konjugace např. mezi alkynem a azidem přítomným na reaktantech. Konkrétní reakční podmínky se mohou zvolit téměř libovolně, optimálně s ohledem na typ konjugační reakce a typ nízkomolekulární látky. U některých typů reakcí se dostatečné účinnosti dosáhne pouze v úzkém rozmezí pH, např. u reakce aktivovaného esteru s aminem. Díky stabilitě DNA v širokém rozmezí pH lze proto pro konjugační reakci zvolit jak kyselé, tak neutrální, ale i zásadité pH. Jedná-li se o látku nerozpustnou ve vodné fázi, lze celou reakci provést v čistém organickém rozpouštědle, např. DMSO. Nerozpustnost dané sloučeniny pro selektivní vazbu na analyt ve vodné fázi nepředstavuje technický problém pro stanovení analytů, neboť po konjugaci s velmi polární a dobře rozpustnou DNA je celý konjugát rozpustným ve vodě bez ohledu na hydrofobicitu připojené nízkomolekulární látky. Jak se ukázalo, připojením DNA lze dosáhnout výrazně lepší rozpustnosti bez ztráty biologické aktivity původní sloučeniny. Organické fáze lze pro reakci využít také v případě, že některá z reaktivních bioortogonálních skupin není ve vodné fázi stabilní. Použití organické fáze je možné díky tomu, že pro funkci DNA jako templátu pro PCR reakci není nutná specifická trojrozměrná struktura a nevadí tak její rozrušení v důsledku rozpuštění v organickém rozpouštědle (na rozdíl od proteinů, zejména protilátek). Po konjugaci se vzniklá detekční sonda přečistí od zbylé sloučeniny pro selektivní vazbu analytu, s výhodou rozdělením na základě velmi odlišné molekulové hmotnosti detekční sondy (obvykle kolem 20 000 Da) a zmíněné sloučeniny (obvykle do 1 000, nanejvýš do 2 500 Da) pomocí ultrafíltrace v mikrocentrifugačních kolonkách. S výhodou se použije cut off' membrány, tedy zachycení látky o molekulové hmotnosti větší než 10 000 Da, což oddělí vytvořenou detekční sondu spolu s případně zbylým nezreagovaným oligonukleotidem od volné sloučeniny. Zatímco volná sloučenina pro selektivní vazbu by při vazbě na analyt vytěsňovala detekční sondu a je vhodněji oddělit, zbylý nezreagovaný oligonukleotid vlastnosti detekční sondy podstatně neovlivní a oddělovat jej není potřeba.
V základním provedení vynálezu je oligonukleotidovou značkou jednovláknová DNA o délce typicky do 200 baží, výhodně v rozmezí 30 až 80 baží. Pro stanovení množství navázané detekční sondy obsahující tuto oligonukleotidovou značku se množství této značky specificky kvantifikuje pomocí qPCR. Uvedená délka značky postačuje jako templát v qPCR, tzn., aby na její sekvenci dosedal pár primerů (forwardní a reverzní) a případně fluorogenní próba (např. hydrolyzační TaqMan próba o sekvenci komplementární k oligonukleotidové značce a obsahující fluorofor a zhášeč; po dosednutí próby a jejím rozštěpení polymerasou dojde k oddálení fluoroforu a zhášeče a tím zvýšení fluorescence). Pokud se nepoužije fluorogenní próba, postačuje použití fluorescenčních barviv jako je např. SYBR Green (např. Roche), vázajících se na dvouvláknovou DNA vznikající během qPCR. Sekvence oligonukleotidové značky je zcela libovolně volitelná, podle ní se zvolí sekvence primerů a případné fluorogenní próby.
To, že sekvence není nijak limitována, např. nutností tvorby specifické trojrozměrné struktury jako je tomu u aptamerů, výhodně umožňuje zvolit v odlišných detekčních sondách pro různé analyty odlišné sekvence tak, aby každou z těchto detekčních sond bylo možné ve směsi těchto detekčních sond specificky stanovit. To slouží například pro paralelní stanovení více analytů v jedné reakci. V takovém uspořádání se na pevný nosič imobilizuje směs molekul, z nichž každá rozeznává různý analyt. Poté se pevný nosič inkubuje se vzorkem za selektivního navázání daných analytů obsažených ve vzorku na molekuly a poté se nosič s navázanými analyty inkubuje se směsí detekčních sond, z nichž každá obsahuje jinou oligonukleotidovou značku a zároveň se každá z nich váže na různý analyt. Posléze se nenavázané detekční sondy odstraní promytím (odmyjí) a specificky se stanoví navázané množství každé z nich, které je přímo úměrné množství odpovídajících analytů ve vzorku.
Pokud je pevným nosičem povrch jamky mikrotitrační destičky, dosáhne se souběžného specifického stanovení různých sekvencí následujícími způsoby: v prvním způsobu se po odmytí nenavázané sondy přidá směs primerů pro ampliflkaci každé z oligonukleotidových značek detekčních sond, ať už specifických pro každou sekvenci nebo společných pro více sekvencí, a směs různě barevných fluorogenních prób, které jsou specifické (komplementární) pro každou jednotlivou sekvenci. V následném qPCR se tedy v jedné jamce mikrotitrační destičky najednou ampliflkují všechny sekvence všech přítomných detekčních sond a jejich specifické detekce se dosáhne pomocí různé barvy fluorescence prób, specifických vždy jen pro jednu danou sekvenci ze směsi. Omezení počtu takto souběžně stanovovaných sekvencí v jedné reakci je dáno počtem různých barevných filtrů v qPCR přístrojích a prakticky tedy představuje omezení na 5 až 6 sekvencí najednou. Druhým alternativním způsobem je převedení navázaných detekčních sond do roztoku, například prostým stáním ve vymývacím roztoku, a následné rozdělení tohoto roztoku do více jamek, přičemž v každé jamce se specificky amplifikuje a stanoví jedna ze sekvencí. Toho se dosáhne použitím specifických primerů, či alespoň jednoho specifického primeru a jednoho společného primeru; zároveň není třeba specifické fluorogenní próby. V případě použití specifické fluorogenní próby nemusí být použitý pár primerů zcela specifický, protože specifita detekce se dosáhne pomocí dané próby. Tímto způsobem není počet stanovovaných sekvencí nijak omezen. Další podobný způsob představuje preamplifikace sekvencí navázaných detekčních sond přímo v původní jamce pomocí specifických nebo společných primerů a následné rozdělení roztoku obsahujícího namnožené sekvence do více qPCR reakcí s následným stanovením stejně jako v předchozím způsobu. Souběžného stanovení většího množství navázaných jednotlivých prób se dosáhne také analýzou na čipu s hybridizačními sondami, nebo pomocí metod sekvenování nové generace.
Pro všechny výše uvedené způsoby stanovení, zejména pomocí qPCR, je možné použít i velmi krátkou oligonukleotidovou značku, typicky v délce mezi 10 a 30 bázemi. Takový oligonukleotid je sice příliš krátký pro použití jako templát v polymerasové řetězové reakci, ale slouží v takové reakci jako primer, který po dosednutí a dopolymerování polymerasou prodlouží přidanou templátovou DNA. Takto prodloužená templátová DNA se pak amplifikuje pomocí páru primerů v qPCR, přičemž celá nebo částečná komplementární sekvence jednoho z primerů není obsažena v původní neprodloužené templátové DNA, zatímco je přítomna v oligonukleotidové značce. Tím se kvantitativně stanoví množství velmi krátké oligonukleotidové značky.
Jednovláknovou DNA oligonukleotidové značky lze připravit v různě modifikovaných formách. Modifikace popsané dále v textu je možné buď přímo zavést do tohoto vlákna DNA, anebo lze toto vlákno spárovat s komplementárním vláknem obsahujícím cílovou modifikaci. Vzhledem k tomu, že detekční sonda je narozdíl od sond obsahujících protilátku tepelně stálá, specifické spárování s druhým vláknem lze provést nejen před konjugací oligonukleotidové značky s ligandovou částí, ale s výhodou také až po konjugaci. Výhodou takového postupuje, že s jednou chemicky syntetizovanou detekční sondou mající jednovláknovou oligonukleotidovou značkou se jednoduše připraví množství odvozených detekčních sond s dvouvláknovou DNA, nesoucí žádanou modifikaci. Oligonukleotidy s různými modifikacemi, kterými jsou nejvýznamněji fluorofory, biotin, thiolová skupina, aminoskupina, azidová skupina či oktynová skupina, jsou totiž běžně komerčně dostupné formou syntézy na zakázku. Samotného dosednutí druhého vlákna na původní vlákno DNA se docílí smícháním obou vláken (druhého vlákna a detekční sondy) ve vhodném poměru (obvykle ekvimolámím) a zahřátím s následným pomalým ochlazováním.
Alternativně se druhé vlákno obsahující žádoucí modifikace zavede pomocí primeru dosedajícího na původní vlákno oligonukleotidové značky a jeho extenzí polymerasou za současné inkorporace baží, nesoucích cílové modifikace. Takto modifikované báze jsou také běžně komerčně dostupné.
Oligonukleotidová značka pro stanovení pomocí qPCR může tedy být tvořena nejen jednovláknovou DNA, ale i dvouvláknovou. S výhodou se připraví detekční sonda obsahující na oligonukleotidové značce biotin; taková sonda se pak v molámím nadbytku inkubuje s tetravalentním vazebným proteinem pro biotin, s výhodou neutravidinem nebo streptavidinem, a po navázání na tento protein se celý komplex přečistí, s výhodou pomocí ultrafilrace přes membránu s póry pro zachycení sloučenin molekulových hmotností nad 100 KDa, přičemž daný komplex zůstane v retenátu, zatímco nenavázaná detekční sonda proteče. Takto vzniklý tetravalentní komplex se pak použije místo původní detekční sondy pro detekci aktivních forem analytů a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů. Výhodou takového komplexu je jeho tetravalence a tim zvýšená afinita, což je demonstrováno na příkladu detekční sondy pro stanovení karbonické anhydrasy IX, kde použití takového komplexu značně vylepšilo citlivost stanovení oproti použití původní monovalentní detekční sondy. Díky tomuto jevu se mohou pro přípravu detekční sondy použít i slabší inhibitory; v tomto případě byla pro vytvoření detekční sondy použita nízkomolekulámí látka se submikromolámi afinitou k analytu.
Způsobem jak dále zvýšit aviditu je napojení mnoha kopií detekční sondy na zlatou nanočástici. Za tímto účelem se s výhodou připraví detekční sonda obsahující na oligonukleotidové značce thiolové skupiny pro přímou konjugaci se zlatou nanočástici. Konjugace detekčních sond se zlatými nanočásticemi se pak dosáhne prostým smícháním roztoků obou složek, postupným zvyšováním ionotvé síly a následnou separací částic a nenavázaných detekčních sond centrifugací v sacharosovém gradientu. Ještě výhodnější způsob spočívá v přípravě zlatých nanočástic obalených filmem, sestávajícím z mnoha kopií molekul, tvořených thiolovými skupinami napojenými na nerozvětvený alkanový řetězec, obsahující optimálně 6 až 18 uhlíkových atomů. Tento řetězec je na opačném konci napojen na polyethylenglykolový řetězec, optimálně obsahující 3 až 18 ethylenglykolových jednotek, nesoucí na druhém konci některou s bioortogonálně reagujících skupin, s výhodou azidovou skupinu. Pomocí thiolových skupin se tyto molekuly napojí na zlatou nanočástici, přičemž alkanová a ethylenglykolová část vytvoří na povrchu částice semi-krystalickou strukturu a tím výrazně zlepší jejich koloidní stabilitu, zejména v pufrovaných roztocích s vyšší iontovou silou. Azidová skupina se pak využije pro jednoduchou konjugaci s detekční sondou, která s výhodou obsahuje dibenzylcyklooktynovou (DBCO) skupinu, která velmi ochotně reaguje s azidovou skupinou za tvorby triazolu bez nutnosti katalýzy. Detekční sonda sDBCO skupinou se s výhodou připraví tak, že se standardním způsobem připravená jednovláknová detekční sonda nechá párovat s komplementárním vláknem DNA, které obsahuje DBCO skupinu. DBCO skupina se na komplementární vlákno předem napojí tak, že se původně aminoskupinou modifikované vlákno nechá zreagovat s NHS-esterem DBCO a přečistí se od nenavázaného DBCO pomocí ultrafíltrace na membráně s póry pro zachycení molekul o velikosti více než 10 KDa.
Množství všech výše zmíněných detekčních sond, tzn. detekční sondy s jedno- nebo dvouvláknovou oligonukleotidovou značkou, tetramemího komplexu detekční sondy s neutravidinem či streptavidinem anebo detekčních sond navázaných na povrch zlatých nanočástic, se kvantifikuje pomocí qPCR. Výhodou stanovení qPCR je velký dynamický rozsah a velká citlivost stanovení. Obě vlastnosti jsou velmi podstatné pro klinickou praxi, neboť citlivé stanovení proteinových markérů v krvi je někdy nezbytně nutné pro stanovení správné prognózy pacientů, příkladem je citlivé stanovení PSA v krvi pacientů po radikální prostatektomii, které je popisováno už dříve v textu.
Citlivé stanovení proteinových markérů může být přínosné i u bioptických tkání, neboť by umožnilo odběr jen velmi malého množství tkáně, čímž by se snížila invazivita zákroku. Široký rozsah stanovení může být dále přínosný i pro stanovení řady dnes sledovaných proteinů vyskytujících se v krvi. Jejich množství bývá u jednotlivých pacientů natolik odlišné, že část vzorků je nutno měřit znovu v jiném ředění, protože při prvním měření výsledek přesahuje dynamický rozsah používané metody (nejčastěji ELISA). Jak je ukázáno v příkladech, pro stanovení PSMA se pomocí zde popsaného způsobu docílí citlivosti deseti attogramů, což odpovídá desítkám molekul. To je přibližně o šest řádů méně než pomocí dosud nejcitlivějšího stanovení PSMA pomocí Western blotu (limit detekce 100 pg) či ELISA (limit detekce 10 pg). Zároveň se dosáhne rozsahu stanovení více než šest řádů; v příkladech je ukázáno stanovení v rozsahu méně než 1 fg až více než 1 ng PSMA (maximální rozsah ELISA stanovení je kolem tří řádů).
Citlivost qPCR je v principu jediná molekula DNA, nicméně citlivost metod pro detekci proteinových analytů je obvykle i přes využití qPCR o mnoho řádů horší. Jedním z hlavních důvodů nižší citlivosti stanovení analytů než je teoretická citlivost qPCR je nespecifická adsorpce detekčních konjugátů obsahujících templátovou DNA na povrch pevného nosiče, přičemž takto nespecificky adsorbovaný detekční konjugát je detekován stejně jako detekční konjugát specificky navázaný na analyt. Nespecifická adsorpce je úměrná použité koncentraci detekčního konjugátu, takže při zvýšení použité koncentrace detekčního konjugátu dochází ke zvýšení nespecifické sorpce, z čehož vyplývá větší citlivost stanovení při použití těsněji se vázajících detekčních konjugátů.
Jak se ukázalo, stejná omezení platí i pro použití zde předkládané detekční sondy, bylo ale vyzkoušeno několik přístupů jak i přes zmíněná omezení dosáhnout co nejvyšší citlivosti. Kromě přípravy co nejtěsněji se vázající detekční sondy optimalizace zahrnovala také potlačení nespecifické vazby detekční sondy na pevný nosič a také určení optimální pracovní koncentrace detekční sondy. Pro stanovení PSMA se takto dosáhlo citlivosti v řádu desítek molekul, což se blíží maximální možné ctilivosti qPCR.
Zvýšení citlivosti stanovení (potlačením nespecifické adsorpce detekční sondy) bylo docíleno například přidáním vhodných látek do pracovního roztoku detekční sondy. Detekční sonda byla naředěna v roztoku obsahujícím přídavné látky, zvolené ze skupiny, zahrnující ionické detergenty, neionické detergenty, kasein a zněj připravené kaseinové blokační činidla, sérové albuminy, DNA či immunoglobuliny. Standardně se detekční sonda pro inkubaci s pevným nosičem s navázaným analytem ředí v pufrovaném roztoku o vhodném pH, s výhodou o fyziologickém pH 7,4. Pufrovaný roztok dále obvykle obsahuje rozpuštěné soli, s výhodou rozpuštěný chlorid sodný v koncentraci vyšší než 0 až do 1,5 mol.l'1. Tento roztok případně obsahuje i neionický detergent, s výhodou Tween-20 (polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurát), o koncentraci vyšší než 0% až do 1% (obj./obj.), lépe o koncentraci 0,1% (obj./obj.). Jak je ukázáno na několika příkladech, výrazného snížení nespecifické adsorpce sondy se dosáhlo přidáním nízké koncentrace dodecylsíranu sodného (SDS), s výhodou v rozmezí finálních koncentrací 0,001% až 0,02% (hm./obj.). Snížení nespecifické adsorpce sondy se dosáhlo také přidáním malého množství kaseinového blokovacího roztoku, s výhodou v rozmezí finálního 200 násobného až 5000 násobného ředění (koncentrace původního roztoku 5,5% (hm./obj.)). Přidáním jak SDS, tak i kaseinového blokátoru se dosáhne ještě většího potlačení nespecifické vazby. Jak je ukázáno v příkladech, pro každý analyt a odpovídající detekční sondu lze vyzkoušet několik koncentrací obou zmíněných látek a jejich kombinací, čímž se získá složení roztoku, ve kterém se daná detekční sonda nespecificky sorbuje v menší míře než v roztoku bez zmíněných přídavných látek a zároveň není významně ovlivněna afinita její specifické vazby do aktivního místa analytu. Pokles nespecifické sorpce se typicky pohybuje v rozmezí jednoho až dvou řádů (může být ale i podstatně větší), což přináší zvětšení odstupu signálu od pozadí a tím i zvýšení citlivosti stanovení stejnou měrou. Jak je také ukázáno v příkladech, další překvapivou možností jak potlačit nespecifickou vazbu přimejmenším o další řád a tím o řád zvýšit citlivost stanovení analytu je nahrazení jednovláknové oligonukleotidové značky značkou dvouvláknovou. Důvodem je, že dvouvláknová DNA se zřejmě v důsledku větší rigidity nespecificky sorbuje v podstatně menší míře než DNA jednovláknová.
Dalšího zvýšení citlivosti stanovení analytu bylo dosaženo tím, že se nosič s navázaným analytem inkuboval s detekční sondou v optimální pracovní koncentraci. Pro určení této optimální koncentrace se pro každou sondu určí její hodnota Kd vůči odpovídajícímu analytu, což se prakticky provede titrací, tzn. několika stanoveními při stejné koncentraci analytu a měnící se koncentraci sondy.
Rovnice pro disociační konstantu je:
Kd = [E] * [P] / [EP] (1), kde [E] je koncentrace volného analytu, [P] je koncentrace volné detekční sondy a [EP] je koncentrace komplexu analytu s navázanou detekční sondou. Koncentrace volného analytu odpovídá rozdílu celkové koncentrace analytu (Etot) a koncentrace analytu v komplexu se sondou ([EP]), dosazením tohoto vztahu do předchozího a vyjádřením pro [EP] se dostane vztah (obdobně jako pro stanovení Michaelisovy konstanty substrátu a enzymu):
[EP] = Etot* [P]/(Xd+[P]) (2).
Koncentrace volné detekční sondy [P] není známá, ale v případě, že je celková koncentrace analytu buď menší než Kd detekční sondy, anebo je celková koncentrace analytu menší než celková koncentrace detekční sondy Ptot, lze pro usnadnění vyhodnocení titrace [P] nahradit Ptot a poslední vztah pak lze psát jako: [EP] = Etot * Ptot / (Áj + Plot) (3).
Zmíněné podmínky je možné v praxi jednoduše dodržet, jak je popsáno v příkladech. Koncentrace navázané a imobilizované sondy v komplexu EP je pak veličinou měřenou pomocí qPCR. Samotná disociaění konstanta se určí vynesením naměřených hodnot množství EP v závislosti na použité analytické koncentraci detekční sondy a jejich proložením funkcí popsanou vztahem (3) spojeným například s numerickým dopočtením disociaění konstanty próby (a zároveň analytické koncentrace analytu, která nemusí být předem známá).
Grafickým vynesením závislosti [EP] na Ptot ze vztahu (3) se odvodí i řada empiricky pozorovatelných vlastností. Zatímco při koncentracích Ptot výrazně menších než Kd roste [EP] (tj. množství detekční sondy navázané a imobilizované na analyt) s rostoucím Ptot lineárně, při Ptot blížícím se Kd nárůst [EP] zpomaluje až postupně dosáhne plato při Ptot»Ád, kde hodnota [EP] odpovídá Etot. Např. při Ptot = /G vychází, že [EP] = /2 Etot, tzn. že přesně na polovinu analytu je navázána sonda. Oproti tomu pozorovaná závislost množství nespecificky adsorbované detekční sondy v závislosti na její celkové koncentraci (Ptot) je přibližně lineární ve všech testovaných koncentracích, tzn. jak v menší, podobné či větší koncentraci než odpovídá Kd specifické interakce, což lze vysvětlit tím, že nespecifická interakce je zřejmě charakteristická podstatně větší disociaění konstantou.
Ze zmíněných pozorování je možné odvodit optimální pracovní koncentraci detekční sondy. Pokud se použije koncentrace sondy desetkrát vyšší než je koncentrace odpovídající její Kd, pak oproti koncentraci odpovídající Kd se nespecifická adsorpce zvýší také desetkrát, neboť je přímo úměrná koncentraci, zatímco selektivní vazba na analyt se zvýší maximálně dvojnásobně, neboť už při koncentraci odpovídající Kd je polovina množství analytu vysycena vazbou sondy (platí pro koncentrace analytu menší než Kd sondy, při co necitlivějším stanovení jsou stanovované koncentrace analytu vždy nižší než Kd). Celkově tedy při takovém zvýšení koncentrace sondy dojde k pětinásobnému zmenšení odstupu signálu od nespecifického pozadí a tím k pětinásobnému zhoršení limitu detekce; při dalším zvyšování koncentrace sondy se citlivost dále zhoršuje. Na druhou stranu, pro koncentrace sondy výrazně menší než její Kd je její koncentraci přímo úměrná jak specifická vazba na analyt, tak nespecifická adsorpce a při změně koncentrace v tomto rozsahu nedochází ke změně podílu specifického signálu vůči pozadí a nemění se tak za předpokladu nenulové nespecifické adsorpce ani limit detekce (opět platí pro koncentrace analytu menší než Kd sondy). Při velkém ředění sondy se nicméně dojde do bodu, kdy nespecifická sorpce klesne na nulu a další zřeďování sondy vede ke snížení citlivosti. Navíc pro supercitlivé stanovení (například v řádu desítek molekul) je nutné použít takovou koncentraci sondy, při které je na velké procento analytu navázaná sonda, což je splněno, pokud koncentrace sondy není výrazně nižší než její Kd. Lze uzavřít, že nejvyšší citlivosti stanovení analytů se dosáhne, pokud se použije koncentrace sondy přibližně odpovídající jejímu Kd vůči danému analytu, případně koncentrace nižší než Kd vazby sondy na analyt s nenulovou nespecifickou adsorpci.
Námi předkládané technické řešení je výjimečné enormním dynamickým rozsahem stanovení, přičemž kvantitativní dynamický rozsah stanovení se definuje jako rozsah celkových koncentrací analytu, ve kterém je naměřený signál úměrný celkové koncentraci analytu. V tomto případě se pomocí qPCR měří hodnota Cq, která je nepřímo (lineárně se zápornou konstantou úměrnosti) úměrná logaritmu množství navázané detekční sondy na analyt ([EP]), které je v rámci zmíněného kvantitativního dynamickém rozsahu úměrné celkové koncentraci analytu (Etot), tzn. že poměr [EP] / Etot je v tomto rozsahu konstantní. Jak plyne z upraveného vztahu (2):
[EP]/Etot = [P]/(Kí/+[P]) (4), tato podmínka je splněna, pokud lze koncentraci sondy ([P]) zaměnit za její analytickou koncentraci Ptot, protože pak se celá pravá strana rovnice (4) rovná konstantě, neboť ani Ptol ani Kd nezávisí na měnícím se celkovém množství analytu Etot· Z upraveného vztahu (2):
[EP]/[P] = Etot/(Kd + [P]) (5), pak lze dále odvodit, že [P] lze zaměnit za Ptot za podmínek buď Etot < Kd anebo Etot < [P], případně Etot « Ptot, neboť pak platí [EP] < [P], a lze psát [P] = Ptot - [EP] ~ Ptot, neboť [EP] < Ptot. Za těchto podmínek tedy platí, že naměřený signál je úměrný Etot. Z toho plynou důležitá pozorování pro dynamický rozsah stanovení; při nízké koncentraci sondy menší nebo přibližně rovné Kd specifické vazby sondy na analyt je dynamický rozsah u spodního limitu detekce omezen nespecifickou adsorpci detekční sondy, zatímco horní limit detekce je omezen Kd sondy. Pokud se použije vyšší koncentrace sondy než je její Kd, dojde sice ke zvýšení nespecifické adsorpce, ale zároveň už není horní limit detekce limitován Kd, ale koncentrací sondy, která je vyšší. Použitím vyšší koncentrace sondy se tedy posouvá dynamický rozsah k vyšším koncentracím analytu, zatímco násobný rozdíl spodního a horního limitu detekce zůstává nezměněný.
Pro přesnější znalost rozsahu, ve kterém je [EP] přímo úměrné Etot se odvodí přesný vztah pro [EP]:
[EP] = (Kd + Ρω + Etot - t(Kd + Ptot + Etot)2 - 4 * (Ptot * Et0t))° 5)/2 (6).
Poté se porovnáním EP spočtených podle vztahů 3 (předpokládající lineární úměru) a 6 (přesný vztah) určí odchylka závislosti [EP] na Etot od lineární úměry. Například, je-li E^ > Ptot pak při E^ = ‘/z Kd je odchylka od linearity cca 40%, při Etot = % Kd je odchylka cca 20% a se snižující se koncentrací Etot odchylka dále klesá, tzn., že při Etot > Ptot dosahuje lineární rozsah stanovení ke koncentraci Etot přibližně 'Λ Kd. Naproti tomu, je-li Etot < Ptot pak bez ohledu na poměr Etot a Kd odchylka od linearity nikdy nepřekročí 25%, tzn., že lineární rozsah sahá vždy přinejmenším po koncentraci detekční sondy, což potvrzuje možnost posunutí dynamického rozsahu zvýšením koncentrace detekční sondy.
Celkový dynamický rozsah je ve skutečnosti ještě větší než lineární oblast, což je dobře vidět na kalibračních řadách analytů v příkladech. Například u stanovení PSMA je rozsah lineární oblasti ředící řady analytů šest řádů, zatímco celkový dynamický rozsah je přibližně o jeden řád větší. V krajních nelineárních oblastech lze přitom koncentraci analytů odečítat také, jen s menší přesností než v lineární oblasti.
Rozsah lineární oblasti stanovení je významný zejména pro určování disociačních konstant testovaných látek vázajících se do stejného aktivního místa jako detekční sonda. Principem, jak již bylo popsáno, je kompetice o vazbu do aktivního místa analytů mezi detekční sondou a testovanou látkou. Přestože takový princip není nový, možnost měření síly kompetice v tak velkém dynamickém rozsahu je zcela nová a dokonce je pro využití této výhody nutné odvodit některé nové vztahy dosud v enzymové kinetice neznámé.
Nejprve, za splnění podmínek odvozených výše, je stanovené množství navázané próby přímo úměrné množství imobilizovaného analytů, přesněji počtu volných aktivních míst analytů. Tzn., že bez přítomnosti testované látky vázající se do aktivního místa jsou všechna aktivní místa analytů volná a množství navázané sondy odpovídá celkovému počtu aktivních míst, zatímco pokud je v části aktivních míst navázána testovaná látka a nemůže se tak do nich už vázat sonda, je množství navázané sondy přímo úměrné počtu zbylých volných míst. Z poklesu naměřené koncentrace aktivních míst o x % tedy vyplývá, že x % aktivních míst je obsazeno testovanou látkou, porovnáním naměřených signálů s a bez testované látky se tedy přímo měří podíl aktivních míst s navázanou testovanou látkou.
Pro disociační (inhibiční) konstantu testované látky platí analogicky se vztahem (1) popisujícím disociační (inhibiční) konstantu detekční sondy:
Kt = [E] * [I] / [El] (7), kde Kj je disociační (inhibiční) konstanta testované látky, [E] koncentrace volného analytů, [I] koncentrace volné testované látky a [El] koncentrace komplexu analytů s navázanou testovanou látkou. Označení proměnných týkajících se detekční sondy zůstávají v dalším odvození stejná jako ve vztahu (1). Pro celkové množství analytů pak platí:
Etot = [E] + [EP] + [El](8), a zároveň podíl obsazených aktivních míst testovanou látkou je roven:
[El] / Etot = x/100(9), x je tedy podíl analytů s aktivním místem obsazeným testovanou látkou vyjádřený v procentech. Po vyjádření rovnice (9) pro Etot a dosazení do rovnice (8), úpravou a dosazením [EP] z rovnice (1), dosazením [El] z rovnice (7) a úpravou se dostane rovnice pro výpočet Kp.
^ = (100/x-l)*[I]/(l+([P]/O(10), ve které se koncentrace nenavázané testované látky [I] vyjádří pomocí celkové (analytické) koncentrace testované látky označené Itot, která je součtem koncentrací navázané a nenavázané sondy (Itot = [I] + [El]) a po dosazení za [El] z rovnice (9) a vyjádření pro [I] se dostane:
[I]= ICX -x*Etot/100 (11).
Výsledná rovnice pro výpočet Kt je tedy:
Kt = (100 / x - 1) * (Itot - x * Etot /100) / (1 + ([P] / Kd)) (12).
Tato rovnice se dále zjednoduší, pokud se při stanovení v kvantitativním dynamickém rozsahu koncentrace volné detekční sondy [P] nahradí analytickou koncentrací sondy Ptot, která je známá. Prakticky vždy platí, že Itot je výrazně vyšší než Etot, celý člen (x * Etot/100) se proto zanedbá oproti Itot. Zjednodušená rovnice je tedy:
X, = (100/x- 1) * It0t/(l+(Pt0t/O (13).
Prakticky se ale neměří přímo procento inhibice, ale porovnává se množství zbylého volného analytu po inkubaci s testovanou látkou (Etot - [El]) s celkovým množstvím analytu bez inkubace s testovanou látkou (Etot), tj. (Etot - [El]) / Etot- Pro každé z obou množství se naměří hodnota Cq, která je nepřímo úměrná danému množství, tzn. s klesajícím množstvím volných míst analytu naměřené Cq stoupá a pokud se definuje AC? jako Cq naměřené pro inkubaci bez testované laátky odečtené od Cq naměřeného pro inkubaci s testovanou látkou, pak platí, že:
(Et0t-[El])/Etot = (l + e#)'AC<? (14), kde eff. je účinnost PCR reakce, která je při optimálně zvolených podmínkách rovna jedné. Rovnice (13) se pak pomocí dříve uvedených vztahů pro procento inhibice přeformuluje:
Ki = ((1 + eff.)/ (1 - (1 + eff.)^)) * Itot /(1 + (Ptot /Kd)) (15).
Přesnost a rozsah měření Kl v závislosti na AC? se určí například grafickým vynesením této závislosti, ze kterého je zřejmé, že závislost log K, na ÁCř/ je lineární pro ACq > 3, zatímco pro menší ÁC? se od linearity odchyluje. To neznamená, že by pro menší ACq nebylo možné K, dopočítat, jen se určí s menší přesností než při větších ACq. Při obvyklé standardní odchylce stanovení Cq vqPCR rovné 0,15 cyklu jsou relativní standardní odchylky stanovených K, v závislosti na naměřeném ACq následující (asymetričnost odchylky je dána logaritmickou úměrou):
a) +164 % -41 % při ΔΟ? = 0,25 cyklu, což odpovídá 16% obsazenosti aktivních míst analytu testovanou látkou (tzn. 16% inhibici touto látkou),
b) +64 % -30 % při ACq = 0,42 odpovídající 25% inhibici,
c) +51 % -27 % při ACq = 0,5 odpovídající 29% inhibici,
d) +25 % -18 % při AC9 = 1,0 odpovídající 50% inhibici,
e) +15 % -13 % při ACq = 2,0 odpovídající 75% inhibici,
f) +13 % -11 % při ACq = 3,0 odpovídající 88% inhibici,
g) +11 % -10% při ACq > 5,0 odpovídající 97% a větší inhibici.
Tzn., že pro výpočet Kt je vhodné jakékoliv ACq větší nebo rovné 0,42, přičemž od ACq = 1,0 se dosáhne neobvykle velké přesnosti. Při kvantitativním rozsahu šesti řádů to znamená rozsah použitelných ACq od 0,42 do 20, což odpovídá procentuální inhibici v rozsahu od 25 % do 99,9999 %. Rozlišit tak malé absolutní rozdíly jako rozdíl v inhibici 99,9998 % a 99,9999 % je možné jednak díky tomu, že se měří zbylá volná místa analytu, kterých je v odpovídajícím případě 0,0002 % a 0,0001 % a navíc je detekce logaritmická, tzn., že se spíše než absolutní rozdíly detekují násobky, což pro daná čísla odpovídá dvojnásobku a tím pádem ACq rovnému jedné, který je velmi dobře a přesně měřitelný. Závislost K, na ACq včetně linií vyznačujících standardní odchylku je vynesena v grafu na obrázku 4.
Jak je ukázáno v příkladech, použitím předkládaného způsobu se zjistilo, že takto lze stanovovat hodnoty disociační konstanty dané testované látky z jediné její koncentrace. Porovnáním získaných hodnot s referenčními hodnotami odvozenými od jiných, pracnějších metod, především enzymové kinetiky, se zjistilo, že disociační konstanty testovaných látek jsou stanovovány s velkou přesností a opakovatelností bez ohledu na jejich použitou koncentraci (v rámci rozsahu metody, používané koncentrace byly v rozsahu nmol.l'1 až mmol.r1) a bez ohledu na jejich absolutní hodnotu (disociační konstanty měřených látek byly v rozmezí desítek pmol.l'1 až jednotek mmol.r1).
Jedinečnost tohoto přístupu oproti ostatním metodám představuje právě velký dynamický rozsah, díky kterému lze aplikovat výše odvozený aparát a tím určovat disociační konstantu z jediné koncentrace. Na rozdíl od jiných metod, především enzymové kinetiky, ve které se měří rychlost katalyzované reakce pomocí detekce substrátu/ů a/nebo produktu/ů, není nutné měřit celou titrační křivku s měnící se koncentrací inhibitoru. Teoreticky by tento aparát bylo možné aplikovat i na tyto metody, avšak jejich dynamický rozsah, který v praxi zpravidla umožňuje určit procento inhibice mezi 10% a 90%, to efektivním způsobem neumožňuje (kvůli malému rozsahu stanovení by stejně bylo nutné měřit celou ředící řadu). Zajímavostí je, že hodnota poloviční inhibice, tzv. ICm, je poměrně přesně měřitelná a používá se pro výpočet Kt pomocí tzv. Cheng-Prusoffovy rovnice, která je speciálním a jednodušším případem obecné rovnice (12). Ještě významnější zlepšení přináší tento přístup pro hledání a měření látek vázajících se do aktivních míst analytů, které nemají enzymovou aktivitu, neboť u nich nelze využít efektu zesílení detekce přetvořením více molekul substrátu na produkt jednou molekulou analytu. Pro ně je obvykle nutné hledat alternativní, méně citlivé způsoby stanovení, např. kompetici s fluorescenčně značenou látkou vázající se do aktivního místa. Předkládaný způsob, měřící sílu vazby do aktivního místa, lze ovšem použít se stejnou efektivitou jako pro enzymy. Pro všechny analyty je výhodná také vysoká citlivost předkládaného způsobu, neboť umožní testování schopnosti látek vázat se do aktivního místa daného analytu s velmi malou spotřebou analytu, jehož získání a purifíkace, zejména v případě receptorů, bývá obvykle značně obtížná. Velmi výhodná je také selektivita tohoto řešení, neboť využití imobilizace prostřednictvím selektivní molekuly umožňuje testovat schopnosti látek vázat se do aktivního místa daného analytu bez nutnosti daný analyt purifikovat. S výhodou se použije přímo endogenní analyt, případně pocházející přímo z odebraných biologických vzorků pacientů, což umožní citlivost a selektivita stanovení. Použití endogenního analytu je výhodné nejen tím, že jej není potřeba v laboratoři připravovat, ale také tím, že lze zjišťovat vazbu testovaných látek přímo na konkrétní endogenní analyt, který se může např. mezi jednotlivými lidmi výrazně lišit.
Testované látky bývají často rozpuštěné v organických rozpouštědlech, proto je výhodné, pokud způsob měření jejich vazby do aktivního místa analytu není těmito rozpouštědly ovlivněn. Stejně tak je výhodné, pokud samotné testované látky se stanovením neinterferují, neboť obvykle se používá velká koncentrace těchto látek. Uspořádání předkládaného způsobu představuje optimální řešení pro oba tyto parametry, neboť díky imobilizaci analytu lze po inkubaci s testovanou látkou a detekční sondou odmýt jak přebytečnou nenavázanou sondu, tak i nenavázanou testovanou látku i dané rozpouštědlo. Pokud rozpouštědlo analyt přímo nedenaturuje, je s popsaným stanovením kompatibilní a nijak jej neovlivňuje. Na příkladu PSMA se ukázalo, že DMSO v koncentraci vyšší než 0% až do nejméně 10% (obj./obj.) nijak neovlivňuje výsledek stanovení, stejně jako acetonitril a methanol ve stejném koncentračním rozmezí a podobně jako neionický detergent Tween 20 v rozmezí koncentrací vyšším než 0% až do 1% (obj./obj.). Na příkladu HIV-1 proteasy a karbonických anhydras a dalších proteinů se potvrdilo, že DMSO ani acetonitril ani methanol v koncentracích nejméně do 10% (obj./obj.) neovlivňují stanovení.
Disociační konstanta sloučenin pro selektivní vazbu analytu použitých pro přípravu detekční sondy, která postačuje pro vyvinutí popsaného způsobu testování vazby testovaných látek, může být na základě vyzkoušených příkladů přinejmenším od 100 pmol.l·1 do 1 μιηοΙ.Γ1.
Možnost kompetice vazby detekční sondy do aktivního místa analytu je výhodná i pro stanovení množství analytu v komplexních biologických matricích. Po naměření positivního signálu se titrací látkou, vázající se rovněž do aktivního místa, ověří, zda je naměřený signál opravdu důsledkem přítomnosti analytu. To představuje velkou výhodu oproti ELISA, kde by stejný způsob ověření byl sice možný, ale bylo by pro něj nutné použít velké množství purifíkovaného analytu, který obvykle není dostupný.
Doposud byl popsán způsob detekce navázané detekční sondy pomocí qPCR, který se vyznačuje enormním dynamickým rozsahem, ale s výhodou lze použít i jiný způsob detekce, například pomocí spřažené enzymové reakce spojené s tvorbou fotonů či pomocí fluorescence. Takové stanovení je oproti qPCR nejen rychlejší, neboť není třeba termálního cyklování v PCR, ale i levnější, neboť nejsou třeba poměrně drahé chemikálie, ani složité přístroje pro qPCR. Toto stanovení je nadto ještě přesnější než pomocí qPCR, neboť zatímco detekovaný signál v qPCR je úměrný logaritmu koncentrace navázané detekční sondy, při tomto stanovení je naměřený signál přímo úměrný koncentraci navázané detekční sondy a díky tomu se dosáhne přesnosti měření (standardní odchylky) v řádu jednotek procent. Nevýhodou alternativní detekce oproti qPCRje menší dynamický rozsah a menší citlivost. Jak je ale ukázáno na příkladu PSMA, je přesto dosaženo citlivosti stanovení 1 pg při dynamickém rozsahu stanovení tří řádů. Zároveň si stanovení zachovává ostatní výhody, tzn. nemožnost ovlivnění heterofilními interferujícími látkami vyskytujícími se v komplexních biologických matricích a detekci pouze aktivní formy analytů. Alternativní způsob detekce se tedy nejvýhodněji použije pro stanovení analytů v komplexních biologických matricích, jejichž koncentrace není natolik nízká, aby byla nutná detekce pomocí qPCR a zároveň jsou i velmi malé změny v jejich koncentraci významné například pro stanovení diagnózy.
Fluorescenční detekce se provádí tak, že se připraví oligonukleotidová značka obsahující fluorofory. Fluorofory může obsahovat buď přímo vlákno DNA kovalentně navázané na sloučeninu pro selektivní vazbu do aktivního místa analytů, nebo vlákno k tomuto vláknu párující. Druhá možnost je výhodnější, neboť takto lze fluorofory jednoduše připojit kjiž připravené detekční sondě prostým párováním komplementárního vlákna obsahujícího požadovanou modifikaci. Stejným způsobem lze připravit detekční sondu obsahující biotin. Jejím prostým smícháním s neutravidinem či jiným proteinem vázajícím biotin, pak lze vytvořit multivalentní částici, která se od volné detekční sondy oddělí na základě odlišné molekulové velikosti například pomocí ultrafiltrace. To je obzvláště výhodné, neboť existuje množství komerčně dostupných konjugátů neutravidinu s fluorofory nebo enzymy, zejména peroxidasou. Výsledná částice pak obsahuje celkem čtyři molekuly detekční sondy, každou s ligandovou částí, a biotin vázající protein s fluoroforem nebo enzymem pro detekci, přičemž větší počet ligandových částí vede k vyšší afinitě k analytů imobilizovaném na pevném nosiči díky možnosti zachycení na několika místech najednou. Pro porovnání, stejnou částici nelze stejným způsobem připravit s biotinylovanou protilátkou, neboť tu na rozdíl od detekční sondy nelze biotinylovat pouze na jediném místě a výsledkem smíchání protilátky svíce navázanými biotiny s neutravidinem nesoucím více biotin-vázajících míst je zesíťovaný produkt mnoha molekul protilátky a mnoha molekul neutravidinu, který není pro účely detekce analytů použitelný. Používá-li se dnes v tomto kontextu protilátka, pak se obvykle pevný nosič s navázaným analytem nejprve inkubuje s protilátkou a až poté s neutravidinem, což s sebou přináší inkubační a promývací kroky navíc, které vedou ke snížení citlivosti, navíc se nedosáhne vyšší afinity díky několika vazebným místům.
Popsanými postupy se podařilo připravit detekční sondy selektivně se vázající do aktivního místa řady různých enzymů. Zmíněné detekční sondy se skládaly ze sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivních míst těchto enzymů spojené chemickým linkerem s oligonukleotidovou značkou. Sloučeninou byl vždy buď selektivní inhibitor daného enzymu, nebo selektivní inhibitor skupiny enzymů, mezi něž daný enzym patří. Ve spojení s vhodným způsobem imobilizace enzymu, ať už selektivním či neselektivním, byly zmíněné detekční sondy úspěšně použity pro citlivou detekci těchto enzymů, stejně jako pro testování síly vazby látek do aktivních míst těchto enzymů.
Pomocí selektivní imobilizace přes protilátku a detekční sondy s kovalentně navázanou sloučeninou (S,S-2(3-(5-amino-l-karboxypentyl)-ureido)-pentan-l,5-diovou kyselinou) selektivně se vázající do aktivního místa lidského PSMA se podařilo kvantifikovat PSMA v rozpětí koncentrací více než šesti řádů, s limitem detekce 10 attogramů, což přibližně odpovídá 34 molekulám dimeru PSMA. Tento limit detekce představuje přinejmenším milionnásobné zlepšení oproti současným nej citlivějším metodám stanovení PSMA založených na ELISA. Pro takto ultracitlivou detekci a velký rozsah bylo použito stanovení pomocí kvantitativní polymerasové řetězové reakce, bylo ale zjištěno, že lze s výhodou použít i alternativní detekce, zejména chemiluminiscenční, neboť i při takovém způsobu detekce byla citlivost stanovení PSMA přinejmenším desetkrát vyšší než u dnešních nejcitlivějších metod. PSMA se se stejnou citlivostí a rozsahem podařilo kvantifikovat v různých matricích, kromě rekombinantního purifikovaného proteinu naředěného v pufru to byl přirozeně se vyskytující PSMA v lidské krvi, lidské moči nebo v tkáňových a buněčných lysátech. Pro spolehlivé stanovení koncentrace PSMA v lidské krevní plasmě stačil objem plasmy pouhých 0,01 μΐ. Pokud se detekční sonda s analytem inkubovala v přítomnosti testované látky potenciálně se vázající do aktivního místa PSMA, z poklesu množství navázané sondy oproti inkubaci bez testované látky se podařilo s velkou přesností určit sílu vazby do aktivního místa PSMA (odpovídající X,) všech takto testovných látek. Velký rozsah stanovení umožnil určit K, těchto látek z jediné jejich testované koncentrace v rozsahu šesti řádů inhibiční konstanty. Navíc se díky vysoké citlivosti podařilo stejným způsobem s velkou přesností určit X, těchto látek i na přirozeně se vyskytujícím PSMA v lidské krvi při zanedbatelné spotřebě biologického materiálu (1 μΐ plasmy na jednu testovanou látku). Možnost ovlivnění selektivní vazby detekční sondy současnou inkubací s jinou látkou vázající se do aktivního místa dále představuje jednoduchou kontrolu selektivity získaného signálu při detekci PSMA v komplexní biologické matrici, zejména krevní plasmě či séru. Použitá detekční sonda se s podobnou afinitou selektivně váže i do aktivního místa lidské glutamátkarboxypeptidasy III, proteinu blízce příbuznému PSMA. Bylo ukázáno, že při použití protilátky selektivně vázající pouze PSMA bylo celé stanovení selektivní pro PSMA, přítomnost GCPIII se stanovením neinterferovala až do koncentrací o šest řádů přesahujících koncentraci PSMA.
Pomocí selektivní imobilizace přes expresní tag a použití stejné detekční sondy se podařilo s velkou citlivostí detekovat a kvantifikovat množství rekombinantně připravených proteinů PSMA i GCPIII a na obou proteinech také s velkým rozsahem a velkou přesností stanovit sílu vazby do aktivních míst obou proteinů všech testovaných látek z jediné jejich testované koncentrace.
Velmi citlivé detekce se dosáhlo také pomocí selektivní imobilizace přes protilátku a detekční sondy se sloučeninou odvozenou od kovalentně se vázajícího peptidového inhibitoru obsahujícího boronovou skupinu i pro lidský prostatický specifický antigen (PSA). Citlivost stanovení byla méně než 1 pg PSA, přičemž PSA se podařilo stanovit v různých matricích, kromě purifikovaného PSA v pufru se podařilo stanovit PSA i v krevní plasmě a séru.
Obdobně se dosáhlo selektivní a citlivé detekce lidského fibroblast-aktivujícího proteinu (FAP) a lidské dipeptidylpeptidasy 4 (DPP-4) v roztoku, buněčných a tkáňových lysátech, moči, krevní plasmě a séru. V kombinaci s imobilizovanou selektivní protilátkou bylo stanovení selektivní pro každý z proteinů i při použití sloučeniny vázající se do aktivního místa obou proteinů. Zmíněný způsob také umožňuje určení síly vazby testovaných látek do aktivních míst obou proteinů a tím určování jejich selektivity.
Dále se podařilo, ať už selektivní imobilizaci přes protilátku či neselektivní přímou imobilizaci na povrch, kvantifikovat HIV proteasu v roztoku a s velkou přesností stanovit sílu vazby do aktivního místa HIV proteasy všech testovaných látek. Síla vazby těchto látek byla takto určena při různých pH. Použitá detekční sonda obsahovala sloučeninu odvozenou od klinicky používaného inhibitoru Ritonaviru.
Obdobně se s pomocí imobilizované protilátky podařilo velmi citlivě stanovit množství chřipkové neuraminidasy. Použitá detekční sonda vznikla kovalentním připojením sloučeniny l-(ó-Azidohexyl)(3R,4R5S)-4-acetylamino-5-N-terc-butoxykarbonyl-amino-3-(l-ethylpropoxy)-l-cyklohexen-l-fosfonát na oligonukleotidovou značku. Citlivost stanovení byla méně než 1 pg neuraminidasy NI pocházající z pandemického viru A/Califomia/07/2009, přičemž neuraminidasu se podařilo stanovit v různých matricích; kromě puntíkované neuraminidasy v pufru se podařilo stanovit neuraminidasu v tkáňových a buněčných lysátech, stejně jako v krevní plasmě a séru. Zmíněným způsobem se podařilo s velkou přesností stanovit sílu vazby testovaných látek do aktivního místa neuraminidasy a tím jejich inhibiční potenci v rozsahu více než tří řádů z jediné jejich testované koncentrace.
Byly také připraveny další detekční sondy kovalentním navázáním oligonukleotidové značky na sloučeniny selektivně se vázajících do aktivního místa lidských karbonických anhydras, zejména karbonické anhydrasy IX (CA-IX). V kombinaci se selektivní imobilizaci CA-IX přes monoklonální protilátku se dosáhlo velmi citlivého stanovení CA-IX v roztoku a v různých biologických matricích, zejména v tkáňových a buněčných lysátech, stejně jako v krevní plasmě a séru. Inkubováním detekční sondy s CA-IX v přítomnosti testovaných látek se podařilo s velkou přesností určit sílu vazby, tzn. inhibiční konstantu, všech těchto látek.
Objasnění obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje princip metody pro stanovení množství analytů. Ab je protilátka imobilizovaná na nosiči, En je enzym obsažený v testovaném vzorku rozeznávaný protilátkou.
Obr. 2A-E znázorňuje možné složení detekční sondy, skládající se ze sloučeniny pro selektivní vazbu analytů (zde inhibitoru), kovalentně spojené s oligonukleotidovou značkou, která je detekována pomocí qPCR. Oligonukleotidová značka může být jednovláknová DNA (ssDNA; A), dvouvláknová DNA (dsDNA;
B), případně obsahuje fluorofory nebo biotin (C). Biotin na detekční sondě lze využít pro vytvoření tetravalentní částice po navázání na tetramemí protein vázající biotin, například neutravidin (Neu), (D), popřípadě s kovalentně navázanými fluorofory nebo enzymy pro alternativní detekci. Detekční sondu lze také navázat na povrch zlatých nanočástic (Au), (E).
Obr. 3A,B znázorňuje princip stanovení vazebné potence testovaných látek do aktivních míst analytů. Na obr. 3A je znázorněna situace, kdy se pevný nosič s navázaným enzymem inkubuje pouze s detekční sondou, naměřený signál v qPCR je pak úměrný množství navázaného enzymu (dole). Na obr. 3B je znázorněna situace, kdy se pevný nosič s navázaným enzymem inkubuje se směsí detekční sondy a testované látky. Pokud se testovaná látka váže do aktivního místa, úměrně tomu klesne množství navázané detekční sondy, což se projeví vyšším Cq naměřeným v qPCR přičemž poměr zbylého volného enzymu, ku celkovému množství enzymu, je úměrný rozdílu hodnot Cq při inkubaci s testovanou látkou a inkubaci bez ní.
Obr. 4 znázorňuje přesnost stanovené disociační konstanty testované látky v závislosti na naměřeném ACq, tučnou čarou je vynesena závislost stanovené disociační konstanty testované látky v závislosti naměřeného rozdílu počtu cyklů mezi inkubací analytů s detekční sondou s testovanou látkou a bez ní. Logaritmus disociační konstanty je pro velké hodnoty ACq přímo úměrný danému ACq. Pro malé hodnoty ACq se závislost odchyluje od linearity, výrazný odklon je pozorován pro ACq menší nezjedná; tenkou čárkovanou čarou je pak znázorněna přímá úměra. Tenkými šedými čárami je znázorněna hodnota disociační konstanty +- standardní odchylka jejího stanovení.
Obr. 5 Znázorňuje strukturu detekční sondy pro selektivní vazbu PSMA (ssPSMA). Nukleotidy uvnitř sekvence oligonukleotidové značky jsou uvedeny pomocí jednopísmenného kódu.
Obr. 6 znázorňuje hmotnostní spektrum (na ose x jsou vyneseny hmotnosti vůči náboji) naměřené při LC/ESI-MS analýze pro detekční sondu selektivní pro PSMA (ssPSMA). Vypočtená hmotnost určená z popsaných píků je 17426,84.
Obr. 7 znázorňuje 3’ koncově modifikovaný oligonukleotid komplementární k iqPCRamino. Na 3’ konci jednovláknové DNA je přes chemický linker navázán biotin (2-hydroxy-18-oxo-22-((3aS,4S,6aR)-2oxohexahydro-1 H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-4,7,10,13-tetraoxa-17-azadocosyl fosfát).
Obr. 8 znázorňuje závislost naměřených hodnot Cq v závislosti na množství proteinu PSMA v jamce pro různé koncentrace různých detekčních sond.
Obr. 9 znázorňuje závislost naměřených hodnot Cq v závislosti na počtu molekul PSMA. Limit detekce (LOD) i limit kvantifikace (LOQ) je znázorněn pomocí čárkovaných svislých čar.
Obr. 10 znázorňuje korelaci koncentrací PSMA ve vzorcích lidské krevní citrátové plasmy od celkem 15 zdravých dárců naměřené předkládaným způsobem (na ose x) a radioenzymatickým stanovením (na ose y).
Obr. 11 znázorňuje korelaci inhibičních konstant K, různých látek vůči Avi-PSMA naměřených naším způsobem (osa y) a referenční enzymovou kinetikou (osa x). Pro lepší přehlednost grafu jsou obě osy znázorněny v logaritmickém měřítku.
Obr. 12 znázorňuje korelaci naším způsobem naměřených inhibičních konstant Kt různých látek pro rhPSMA (osa x) a endogenní PSMA z krevní plasmy (osa y).
Obr. 13 znározorňuje strukturu připravených detekčních sond pro selektivní vazbu analytů. Nukleotidy uvnitř sekvence oligonukleotidu jsou uvedeny pomocí jednopísmenného kódu:
A) detekční sonda se sloučeninou pro selektivní vazbu HIV proteasy (ssHIVP),
B) detekční sonda se sloučeninou pro selektivní vazbu karbonických anhydras (ssCA),
C) detekční sonda se sloučeninou pro selektivní vazbu aspartátových proteas (ssAP),
D) detekční sonda se sloučeninou pro selektivní vazbu chřipkových neuraminidas (ssAD_NA).
Obr. 14 znázorňuje korelaci inhibičních konstant K, různých látek vůči HIV protease naměřených naším způsobem při přímé sorpci antigenu a pH 6,0 (průměry ze dvou nezávislých měření, osa y) a referenční enzymovou kinetikou při pH 4,7 (osa x). Pro větší přehlednost jsou obě osy v logaritmickém měřítku.
Obr. 15 znázorňuje korelaci inhibičních konstant K, různých látek vůči HIV protease naměřených naším způsobem při pH 7,4 (osa y) a referenční enzymovou kinetikou při pH 4,7 (osa x). Pro větší přehlednost jsou obě osy v logaritmickém měřítku.
Obr. 16 znázorňuje korelaci inhibičních konstant K, různých látek vůči karbonické anhydrase IX naměřených způsobem dle vynálezu (osa y) a referenční enzymovou kinetikou (osa x). Pro větší přehlednost jsou obě osy v logaritmickém měřítku.
Příklady provedení vynálezu
Složení roztoků
modifikační pufr TBS 100 mmol.l'1 fosfátový pufr; 150 mmol.l'1 NaCl; pH = 7,8 20 mmol.l'1 Tris; 150 mmol.l·1 NaCl; pH = 7,4
TBST 20 mmol.l'1 Tris; 150 mmol.l'1 NaCl; pH = 7,4; 0,05% Tween20 (obj./obj.)
TBST200 20 mmol.l'1 Tris; 200 mmol.l'1 NaCl; pH = 7,4; 0,05% Tween20 (obj./obj.)
TSBT’ 20 mmol.l·1 Tris; 150 mmol.l'1 NaCl; pH = 7,4; 0,1% Tween20 (obj./obj.)
CaSDS 20 mmol.l'1 Tris; 150 mmol.l·1 NaCl; pH = 7,4; 0,1% Tween20 (obj./obj.); 0,005% SDS (hm./obj.); 500x ředěný kaseinový blokátor (SDT; kat. č. CBC1)
TBSE 20 mmol.l'1 Tris; 150 mmol.l·1 NaCl; pH = 7,4; 5 mmol.l'1 EDTA
MEST 20 mmol.l'1 MES; 750 mmol.l'1 NaCl; pH 6,0
CLP 50 mmol.l'1 Tris; 100 mmol.l'1 NaCl; pH 7.4
Vysvětlení pojmů a zkratek
GCPII glutamátkarboxypeptidasa II
PSMA prostatický specifický membránový antigen
Avi-PSMA protein sestávající se z extracelulámí části prostatického specifického membránového antigenu s N-koncově připojeným Avi-tagem
rhPSMA rekombinantní lidský prostatický specifický membránový antigen
GCPIII glutamátkarboxypeptidasa III
Avi-GCPIII protein sestávající se z extracelulámí části glutamátkarboxypeptidasy III s Nkoncově připojeným Avi-tagem
ssPSMA označení detekční sondy pro detekci PSMA (obsahující jednovláknovou oligonukleotidovou značku)
dsA3PSMA označení detekční sondy pro detekci PSMA (obsahující dvouvláknovou oligonukleotidovou značku)
dsbiotPSMA označení detekční sondy pro detekci PSMA (obsahující biotinylovanou dvouvláknovou oligonukleotidovou značku)
Neu_dsbiotPSMA označení detekční sondy pro detekci PSMA (obsahující biotinylovanou dvouvláknovou oligonukleotidovou značku navázanou na neutravidin)
NeuHRPdsbiotPSMA označení detekční sondy pro detekci PSMA (obsahující biotinylovanou dvouvláknovou oligonukleotidovou značku navázanou na neutravidin konjugovaný s peroxidasou)
ssHIV označení detekční sondy pro detekci HIV proteasy (obsahující jednovláknovou oligonukleotidovou značku)
CA-II karbonická anhydrasa II
CA-IX karbonická anhydrasa IX
ssCA označení detekční sondy pro detekci karbonických anhydras (obsahující jednovláknovou oligonukleotidovou značku)
NeudsbiotCA označení detekční sondy pro detekci karbonických anhydras (obsahující biotinylovanou u oligonukleotidovou značku navázanou na neutravidin)
ssAP označení detekční sondy pro detekci aspartátových proteas (obsahující jednovláknovou oligonukleotidovou značku)
ssAD označení oligonukleotidu s navázaným DBCO
ssAD_NA ekv. označení detekční sondy pro detekci chřipkových neuraminidas ekvivalent
RT retenční čas
Tween 20 polyoxyethylen (20) sorbitanmonolaurát (USB, kat. č. 20605)
DIAD diisopropylazadikarboxylát
DBCO dibenzyl cyklooktyn
HEPES N-2-hydroxyethylpiperazin-N' -2-ethansulfonová kyselina
SDS dodecyl síran sodný
SDS-PAGE polyakrylamidový gel s dodecylsíranem sodným pro elektroforézu
LC-MS kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie
ESI elektrosprej
FBS fetální hovězí serum
THF tetrahydrofuran
DMF dimethylfumarát
DIEA diisopropylethylamin
ACN acetonitril
TFA kyselina trifluoroctová
DPPA difenylfosforylazid
TEA triethylamin
PEG5 5 spojených ethylenglykolových jednotek
HOBT/DIC hydroxybenzotriazol/diisopropylkarbodiimid
Příklad 1: Kvantifikace PSMA, testování potence inhibitorů PSMA la: Příprava inhibitoru PSMA s linkerem a aktivovaným NHS esterem
Jako výchozí inhibitor PSMA pro tvorbu konjugátu s DNA byla zvolen močovinový inhibitor 5,S-2-[3-[5amino-l-karboxypentyl]-ureido]-pentanediová kyselina. Byl připraven jak derivát s linkerem zakončeným NHS-esterem pro připojení na amino skupinu oligonukleotidu (sloučenina 3), tak tento derivát zreagovaný s etanolaminem (sloučenina 4). Druhá látka sloužila jako referentní látka pro zjištění vlivu připojení DNA k inhibitoru v inhibičních testech.
Pokud není uvedeno jinak, všechny chemikálie byly od firmy Sigma-Aldrich, USA. Čistota výsledných látek byla testována pomocí analytické vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) Jasco PU-1580 vybavené kolonou Watrex C18 Analytical Column, 5 gm, 250 x 5 mm (průtok 1 ml.min'1, gradient 2-100 % (obj./obj.) ACN za 30 minut, pro každou sloučeninu uveden v textu retenční čas).
Výsledné produkty byly purifíkovány pomocí preparativní HPLC Waters Delta 600 vybavené kolonou Waters SunFire C18 OBD Prep Column, 5 gm, 19 x 150 mm (průtok 7 ml.min'', gradient a retenční čas uveden jednotlivě v textu pro každou sloučeninu). Struktura inhibitorů byla dále potvrzena pomocí vysoce rozlišovací hmotn. spektrometrie (HRMS) na přístroji LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific) a pomocí NMR na strojích Bruker Avance I™ 500 MHz vybaveným kryopróbou nebo Bruker Avance I™ 400 MHz.
Příprava 3,3'-oxydipropanové kyseliny (sloučenina 1): 2,38 ml (20 mmol) 3,3'-oxydipropannitrilu bylo rozpuštěno v 7 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a zahříváno 24 hodin na 50 °C. Reakční směs byla ponechána chladnout přes noc a kyselina chlorovodíková byla odfoukána proudem dusíku. Zbylá suspenze byla rozpuštěna ve vodě a lyofilizována. Bylo získáno 2,25 g bílého produktu (70% výtěžek). Spektrální analýza produktu se shodovala s výsledky popsanými v (White et al. 2003, Tetrahedron-Asymmetry, str. 3633-3638).
Příprava bis(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl) 3,3'-oxydipropanoátu (bisNHS-oxopentandiové kyselina, sloučenina 2): Do roztoku sloučeniny 1 (260 mg, 1,6 mmol, 1 ekv.) a N-hydroxy sukcinimidu (660 mg; 3,2 mmol; 2 ekv.) v 10 ml THF byl najednou přidán pevný dicyklohexylkarbodiimid (368 mg; 3,2 mmol; 2 ekv.). Reakce byla míchána přes noc, poté byla odfiltrována dicyklohexylmočovina a byly odpařeny těkavé látky. Surový produkt byl dále čištěn kolonovou chromatografií (hexamEtOAc; 1:2). Bylo získáno 338 mg čistého produktu (60% výtěžek izolovaného produktu). Retenční čas produktu při analytickém HPLC byl 16,2 minut.
Výsledky analýzy ‘H NMR (400 MHz, CDC13): δ 3,85 (t, J = 6,4 Hz, 4H), 2,90 (t, J = 6,4 Hz, 4H), 2,83 (bs, 8H) a 13C NMR (101 MHz, CDC13): δ 169,07, 166,77; 65,78; 32,20; 25,73.
Výsledek analýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C|4Hi6O9N2 [MNa]+ 379,07480, naměřená hmotnost 379,07469.
Příprava sloučeniny 3; 19-((2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy)-5,13,19-trioxo-16-oxa-4,6,12-triazanonadekan1,3,7-trikarboxylové kyseliny: Do míchaného roztoku sloučeniny 2 (69 mg; 193 pmol; 1,2 ekv., rozpuštěných v 1 ml DMF), byl za stálého míchání postupně během jedné hodiny přikapáván roztok di-terc-butyl 2-(3-(6amino-l-(tórc-butoxy)-l-oxohexan-2-yl)ureido)pentanedioátu (100 mg; 161 pmol; 1,0 ekv.; připravený dle (Murelli et al. 2009, Journal of the American Chemical Society, str. 17090-17092)) a DIEA (34 μΐ; 193 pmol; 1,2 ekv.) v 1 ml DMF. Reakční směs byla poté za stálého míchání ponechána reagovat další dvě hodiny, po kterých byla analyzována pomocí HPLC, která potvrdila nepřítomnost výchozích látek ve směsi. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno, přičemž produkt reakce byl zcela vysušen. K němu byl následně přidán 1 ml TFA a takto rozpuštěný surový produkt byl ponechán za teploty místnosti po dobu 1 hodiny. Poté byla TFA odfoukána proudem dusíku a finální produkt byl přečištěn pomocí preparativní HPLC (gradient 5-50 % (obj./obj.) ACN po dobu 40 min, retenční čas produktu 18 minut). Takto bylo získáno 20 mg čistého produktu (22% výtěžek izolovaného produktu). Retenční čas produktu při analytickém HPLC byl 13,7 minut. Výsledky analýzy Ή NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 7,80 (t, J = 5,6; 1H, NH-Lys-6), 6,32 (d, J = 8,3; 1H, NH-Glu-2), 6,29 (d, J = 8,2; 1H, NH-Lys-2), 4,09 (m, 1H, Glu-2), 4,03 (m, 1H, Lys-2), 3,55 (m, 4H, OCH2-CH2-COO, Lys-CO-CH2-CH2-O), 3,00 (m, 2H, Lys-6), 2,80 (bs, 4H, CO-CH2-CH2-CO), 2,41 (t, J = 6,3, 2H, O-CH2-CH2-COO), 2,31-2,20 (m, 4H, Lys-CO-CH2-CH2> Ghi-4), 1,91 (m, 1H, Glu-3b), 1,71 (m, 1H, Glu-3a), 1,63 (m, 1H, Lys-3b), 1,51 (m, 1H, Lys-3a), 1,37 (m, 2H, Lys-5), 1,26 (m, 2H, Lys-4).
Výsledky anlýzy 13C NMR (125,7 MHz, DMSO-d6): δ 174,77 (Lys-1), 174,40 (GLu-1), 173,95 (Glu-5), 172,89 (O-CH2-CH2-COO), 170,39 (CO-NH-CO), 170,00 (lys-CO-CH2-CH2-O), 157,52 (NH-CO-NH), 66,87 (lys-CO-CH2-CH2-O), 66,07 (O-CH2-CH2-COO), 52,46 (Lys-2), 51,85 (Glu-2), 38,54 (Lys-6), 36,25 (Lys-CO-CH2-CH2-O), 34,84 (O-CH2-CH2-COO), 31,97 (Lys-3), 30,09 (Glu-4), 29,00 (Lys-5), 27,71 (Glu3), 25,66 (CO-CH2-CH2-CO), 22,82 (Lys-4).
Výsledek analýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C22H32Oi3N4 [MNa]+ 583,18581, naměřená hmotnost 583,18596.
Příprava sloučeniny 4; l-hydroxy-4,10,18-trioxo-7-oxa-3,l l,17,19-tetraazadocosan-16,20,22-trikarboxylové kyseliny: 5 mg (9,87 pmol; 1 ekv.) sloučeniny 3 bylo rozpuštěno v 200 μΐ DMF a následně bylo přidáno 6 μΐ (99 pmol; 10 ekv.) ethanolaminu (Sigma) spolu s 14 μΐ (80,4 μητοί; 8 ekv.) DIEA a reakční směs byla ponechána přes noc za stálého míchání. Rozpouštědlo bylo odpařeno a výsledná směs byla postupně třikrát rozpuštěna ve směsi ACN a vody a třikrát lyofilizována (pro odstranění zbývajícího ethanolaminu). Tato sloučenina byla používána v inhibičních testech bez další purifikace (jediným znečištěním byl NHS), odhlédnuto od NHS byla čistota vyšší než 95% (dle HPLC). Retenční čas produktu při analytickém HPLC byl 11,3 min.
Výsledek analýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C2oH33OnN4 [M]+ 505,21513, naměřená hmotnost 505,21515.
1b: Příprava detekční sondy pro selektivní vazbu PSMA
Detekční sonda pro selektivní vazbu PSMA byla připravena zreagováním sloučeniny 3 a jednovláknové DNA s 3’ terminální 6-amino-2-(hydroxymetyl)hexyl fosfátovou modifikací o sekvenci CCT GCC AGT TGA GCA TTT TTA TCT GCC ACC TTC TCC ACC AGA CAA AAG CTG GAA A (zakázková syntéza GeneriBiotech, purifikace OPC).
Oligonukleotid (dále označovaný jako iqPCRamino) byl rozpuštěn v dvojitě destilované vodě v koncentraci 1 mmol.!'1 a následně byla u části roztoku voda zaměněna za 100 mmol.F1 fosfátový pufr s 150 mmol.l’1 NaCI (p.a.; Penta) o pH = 7,8 (dále jen modifikační pufr) pomocí opakované ultrafíltrace na Amicon Ultra 0,5 ml 3K kolonce (Millipore, kat. č. UFC500396). Se zbytkem roztoku se zacházelo stejně, jen byl po každém kroku ultrafíltrace ředěn v roztoku dvojitě destilované vody. V obou případech bylo původní rozpouštědlo celkem naředěno 105 násobně. Koncentrace oligonukleotidu ve výsledném roztoku byla vypočtena na základě naměřené absorbance při 260 nm (Nanodrop ND-1000, Thermo Scientific) a předpokládané optické hustoty roztoku oligonukleotidu 1 OD = 1744 pmoL
Pro ověření identity a čistoty byl roztok iqPCR amino v destilované vodě analyzován pomocí LC/ESI-MS metody na stroji Agilent 6230 TOF LC/MS (Agilent Technologies) vybaveném duálním AJS ESI zdrojem v nastavení pro detekci záporně nabitých iontů (4GHz, HiRes). Separace probíhala při teplotě místnosti na koloně Agilent Zorbax Extend-C18 1,8 pm (2.1x50 mm) gradientovou eluci v měnícím se poměru roztoku HFIP (200 mM vodný roztok l,l,l,3,3,3-hexafluoro-2-propanolu, pH upraveno na hodnotu 7,0 přidáním trietylaminu) a acetonitrilu při průtoku 0,3 ml.min’1 (2-45 % (obj./obj.) ACN za 6 min). Výsledkem analýzy 5 pmol iqPCR amino byl jediný absorbční pík při 260 nm a retenčním časem 4,84 min a naměřenou hmotou (spočtenou z nej intenzivnějších píků pro každý náboj z) 16981,87, přičemž nejhojnější hmota předpovězená programem ChemBioDraw Ultra 13.0.0.3015 (CambridgeSoft) je 16979,91 při molekulové hmotnosti 16983,09.
Příprava konjugátu oligonukleotidu (iqPCR amino) s inhibitorem PSMA (sloučeninou 3): K 10 μΐ oligonukleotidu v modifikačním pufru (10,2 nmol, 1 ekv.) bylo přidáno 6,9 μΐ 1 molT1 HEPES pufru o pH = 8,0 a po promíchání bylo přidáno 3,1 μΐ roztoku sloučeniny 3 o koncentraci 100 mmol.!'1 v bezvodém DMSO (307 nmol, 30 ekv.). Bezvodý DMSO byl připraven někalikahodinovou inkubací DMSO (Sigma, A.C.S. spectrophotometric grade) s aktivovanými molekulovými síty (Sigma, kat. č. 688363) za stálého třepání. Molekulová síta pak byla odstraněna krátkou centrifugací při 16000 g.
Výsledná směs byla po 24 hodinové inkubaci při teplotě místnosti naředěna do 500 μΐ destilovanou vodou a poté pro přečištění od produktů hydrolysy sloučeniny 3 nanesena na Amicon Ultra 0,5 ml 10K kolonku (Millipore, kat. č. UFC501096). Pomocí opakovaného zahuštění ultrafiltraci na této kolonce a opakovaného ředění bylo původní rozpouštědlo (spolu s hydrolytickými produkty reakce) naředěno celkem 1O10 násobně dvojitě destilovanou vodou. Takto bylo získáno 43 μΐ roztoku o koncentraci oligonukleotidu 215 ρπιοΙ.μΓ1 dle absorbance při 260 nm (9,2 nmol, 90% výtěžek), výsledný produkt je dále v textu nazýván ssPSMA, přičemž jeho předpokládaná struktura je znázorněna na obr. 5.
Pro ověření účinnosti konjugace byl ssPSMA analyzován pomocí LC-MS, postup byl identický jako u výchozího iqPCRamino (popsáno výše v tomto oddíle) a výsledkem byl jediný pík s absorbancí při 260 nm, retenčním časem 4,85 min (tzn. stejným retenčním časem jako výchozí iqPCR amino) a naměřenou hmotou (spočtenou z nej intenzivnějších píků pro každý náboj z) 17426,84 (obr. 6), přičemž nejhojnější předpovězená hmota je 17425,08 při molekulové hmotnosti 17428,52. Rozdíl naměřených hmotností konjugátu ssPSMA a výchozího oligonukleotidu iqPCR amino je 444,97 oproti předpokládanému rozdílu 445,17. Poměry hmotností vůči náboji odpovídající původnímu iqPCR amino nebyly ve spektrech detekovatelné, tudíž konverze výrazně převyšovala 90 %.
Roztok ssPSMA byl analyzován také pro přítomnost zbytkových produktů hydrolýzy sloučeniny 3, především
6,14-dioxo-3-oxa-7,13,15-triazaoktadekan-l,12,16,18-tetrakarboxylové kyseliny. Tato látka se zcela zjevně váže do aktivního místa PSMA a pokud by se ve vzorku vyskytovala v podobném nebo větším množství než samotná próba, mohla by s próbou kompetovat o vazbu a snižovat tak citlivost stanovení PSMA. Samotná analýza proběhla pomocí LC-MS stejným způsobem jako je popsáno výše, použita byla kolona Waters Acquity C18 BEH 1,8 pm (lOOx 2,lmm), mobilní fáze 0,1% (obj./obj.) kyselina mravenčí a acetonitril. Gradient eluce byl 2-100 % (obj./obj.) ACN za 6 min, přičemž během celé eluce nebyl detekován vůbec žádný signál ani přibližně odpovídající (±0.2) předpokládané hmotě 463,18 (m/z = 462.18).
Konjugát ssPSMA, stejně jako výchozí oligonukleotid iqPCR amino, byl před použitím v biologických stanoveních naředěn na výslednou koncentraci 5 μιηοΙ.Γ1 ve vodě a lOx koncentrátu TBS pufru (výsledná koncentrace TBS Ix: 20 mmoLl'1 Tris, 150 mmol.!'1 NaCl, pH = 7,4). V objemu 50 μΐ byl v tenkostěnné polypropylenové PCR zkumavce eppendorf (Biotix, kat. č. 3423 .AS) vystaven v termocykléru Biometra Tgradient (Labrepco) následujícímu teplotnímu cyklu (dále jen tepelné párování): rychlému zahřátí na 98° C, následovanému opakovaným zchlazením vždy o 1 °C (0.2 °C/s) a setrváním v každém kroku po dobu 5 min; po dosažení teploty 60 °C pak následovalo opakované zchlazení vždy o 5 °C (0.2 °C/s) a setrvání 5 min v každém kroku až do dosažení 20 °C; teplota víka byla během celého postupu nastavena na 99 °C.
Obdobným způsobem byly připraveny detekční sondy s dvouvláknovou oligonukleotidovou značkou: před tepelným párováním byl konjugát ssPSMA smíchán v přibližně ekvimolámím poměru postupně s několika různými komplementárními oligonukleotidy. Detekční sonda dsPSMA vznikla smícháním ssPSMA a jednovláknové DNA o sekvenci TTT CCA GCT TTT GTC TGG TGG AGA AGG TGG CAG ΑΤΑ AAA ATG CTC AAC TGG CAG G (optická hustota roztoku komplementárního vlákna použitá pro výpočet jeho koncentrace: 1 OD = 1649 pmol); detekční sonda dsASPSMA vznikla smícháním ssPSMA a jednovláknové DNA o sekvenci CCA GCT TTT GTC TGG TGG AGA AGG TGG CAG ATA AAA ATG CTC AAC TGG
CAG G (1 OD = 1721 pmol); zatímco detekční sonda dsbiotPSMA vznikla smícháním ssPSMA a jednovláknové DNA (dále jen iqPCR_biotiri) o sekvenci CCA GCT TTT GTC TGG TGG AGA AGG TGG CAG ATA AAA ATG CTC AAC TGG CAG GTA (1 OD = 1639 pmol) s 3’ terminálně navázaným biotinem, struktura této modifikace je znázorněna na obr. 7.
1c: Stanovení inhibičních konstant připravených sloučenin a detekčních sond
Biotinylovaná extracelulámí část PSMA (dále nazývaná Avi-PSMA) používaná v enzymové eseji byla připravena a purifikována dle (Tykvart et al. 2012, Protein Expression and Purification, str. 106-115), koncentrace čistého rekombinantního proteinu byla určena aminokyselinovou analýzou na přístroji Biochrom30 (Biochrom) dle pokynů výrobce. Enzym byl následně skladován v zamražených alikvotech při -80 °C. Koncentrace oligonukleotidů byla určena spektrofotometricky (viz výše), koncentrace sloučeniny 4 byla odvozena z navážky na analytických vahách (rozpuštěna v destilované vodě).
Hodnoty IC5o všech látek byly určeny pomocí metody založené na HPLC. V 96 jamkové destičce bylo smícháno 0,2 ng Avi-PSMA ve 25 mmol.r1 Bis-Tris propanu, 150 mmol.F1 NaCl, 0,001% (hm./obj.) oktaetylenglykol monododecyl eteru (Ci2E8), pH 7,4 (dále jen reakční pufr) spolu s testovaným inhibitorem v celkovém objemu 180 μΐ. Pro určení inhibiční křivky bylo použito 10 různých koncentrací inhibitoru ve čtyřkové ředící řadě. Reakce byly preinkubovány 5 min při 37 °C a poté startovány přidáním 20 μΐ 4 μιηοί.Γ1 pteroyl-bis-L-glutamátu (Schircks Laboratories) a inkubovány dalších 20 min při 37 °C. Zastavení enzymové reakce bylo dosaženo přidáním 20 μΐ 25 μιηοί.Γ1 inhibitoru 2-PMPA (2-(fosfonometyl)pentandiová kyselina (Jackson et al. 1996, Journal of Medicinal Chemistry, str. 619-622)).
Následně bylo 100 μΐ reakční směsi analyzováno pomocí HPLC na stroji Agilent 1200 Series vybaveného kolonou Acquity UPLC HSS T3 1,8 pm (2,l*100mm, Waters). Samotná eluce byla isokratická v 2,7% (obj./obj.) acetonitrilu a 97,3% (obj./obj.) 20 mmol.r1 fosfátu opH = 6,0 při průtoku 0,4 ml.min’1. Absorbance substrátu i produktu byla detekována při 281 nm, jejich velikost byla určena pomocí automatické integrace. Získaná data byla následně vyhodnocena v programu GraFit v.5.0.11 (Erithacus Software), takto byly získány hodnoty /Cje.
Kinetické parametry (KM a kcat) štěpení pteroyl-bis(L-glutamátu) Avi-PSMA v reakčním pufru byly určeny dle výše popsaného postupu bez přidání inhibitoru a s různými koncentracemi substrátu v rozmezí 15 nmolT1 až 400 nmolT1, přičemž konverze všech reakcí byla 13 ± 2 %. Pomocí těchto parametrů pak byly za předpokladu kompetitivní inhibice přepočteny hodnoty naměřených IC50 na hodnoty inhibičních konstant (Kfi dle Cheng-Prusoffovy rovnice (Cheng et al. 1973, Biochemical Pharmacology, str. 3099-3108).
Výsledná hodnota K, sloučeniny 4 byla 3,3 nmolT1, Kt výchozího oligonukleotidů iqPCRamino byla neměřitelná (ani při nejvyšší použité koncentraci 0,5 μιηοί.Γ1 nebyla pozorována žádná inhibice), K, detekční sondy ssPSMA byla 0,14 nmol.f1, K, sondy dsbiotPSMA byla 0,16 nmolT1 a K, sondy dsPSMA byla 0,28 nmolT1. Z těchto dat je zřejmé, že připojení jednovláknové oligonukleotidové značky nejen nezhoršilo inhibiční konstantu, ale dokonce ji o více než řád zlepšilo. Dále platilo, že přidání druhého vlákna nijak neovlivnilo inhibiční konstantu a tím schopnost vazby detekční sondy do aktivního místa PSMA, což znamená, že k výchozí jednovláknové detekční sondě ssPSMA lze pomocí dopárování modifikovaného komplementárního vlákna cíleně přidávat libovolné modifikace.
Id: Stanovení koncentrace detekčních sond pomocí qPCR
Sekvence jednovláknové DNA obsažené v ssPSMA byla při návrhu optimalizována ve Vector NTI 10.3 (Invitrogen) tak, aby netvořila silnou sekundární strukturu. Na okrajích byly použity sekvence komplementární k příměrům, u kterých bylo předem ověřeno, že v daných podmínkách jednak umožňují amplifikaci templátové DNA s vysokou účinností a jednak netvoří dimery, čímž se zajistila citlivost stanovení oligonukleotidové značky v sondě ssPSMA v řádu jednotek molekul. Sekvence použitých primerů byla CCA GCT TTT GTC TGG TGG AG a CCT GCC AGT TGA GCA TTT TT (Generi-Biotech, purifikace odsolením), pro detekci vznikající DNA v qPCR byla zvolena hydrolyzační sonda #87 z Roche „Universal Probe Library“ (LNA oktamer o sekvenci CTG CCA CC, kat. č. 04689127001).
Pro otestování účinnosti stanovení byla připravena desítková ředící řada detekční sondy ssPSMA v dvojitě destilované vodě v rozmezí koncentrací 10 nmol.f1 až 10 mol.l·’, což odpovídá koncentraci 6 až 6.109 kopií na μί roztoku. Tato ředící řada byla následně použita pro qPCR kalibraci: 10 μΐ reakční směsi se skládalo z LC 480 Probes Master (Roche, kat. č. 04707494001; výsledná koncentrace dle doporučení výrobce), obou primerů (výsl. konc. každého z nich 1 μιηοΙ.Γ1), fluorescenční hydrolyzační sondy (výsl. konc. 50 nmol.1'1) a 1 μί templátové DNA či 1 μί destilované vody v případě beztemplátové kontroly, každá koncentrace i beztemplátová kontrola byla měřena v trojím paralelním provedení. Použity byly 96 jamkové destičky FrameStar 480/96 (4titude, kat. č. 4ti-0951), které byly po napipetování reakčních směsí uzavřeny optickou adhesivní folií (Roche, kat. č. 4729692001). Časový průběh PCR zahrnoval postupně 3 min při 95 °C; poté 45 opakování sestávající ze tří kroků: 10 s při 95 °C, 30 s při 66 °C a 30 s při 72 °C; a nakonec 2 min při 37 °C. Použit byl přístroj Light Cycler 480 II (Roche) s předem připraveným nastavením excitačního a emisního filtru pro fluorofor FAM. Prahové cykly (C7) byly z naměřených křivek fluorescence získány pomocí metody maxima druhé derivace v Light Cycler 480 II softwaru (Roche).
Vynesením získaných Cq proti dekadickému logaritmu koncentrací templátu bylo shledáno, že lineární oblast stanovení byla v rozmezí 6 až 6.108 kopií při více než 90% účinnosti amplifikace, přičemž 6 kopií (Cq ~ 37 cyklu) se bezpečně odlišovalo od beztemplátové kontroly, ve které nebyl naměřen žádný signál. Naměřená data jsou uvedena v tabulce 1.
Tabulka 1: naměřené hodnoty Cq v závislosti na počtu kopií detekční sondy ssPSMA
počet kopií ssPSMA cq
6000000000 9,22
600000000 10,13
60000000 12,72
6000000 15,87
600000 19,10
60000 22,44
6000 26,17
600 29,96
60 33,47
6 37,39
0 > 45,00
le: Stanovení optimální pracovní koncentrace a optimálního ředícího roztoku detekční sondy pro stanovení množství PSMA
V jednotlivých pokusech pro určení disociační konstanty detekční sondy vůči PSMA bylo na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96 (4titude, kat. č. 4ti-0951) naneseno 10 μΐ roztoku různých protilátek rozeznávajících nativní formu PSMA (2G7, J415, J591; D2B, 107-1A4; popsány v Tykvart et al. 2014, Prostate, v tisku) o koncentraci 10 ng.pl'1 v pufru TBS a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 30 až 120 minut. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 100 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla („casein blocker biotin free 5,5 % w/v“; SDT; kat. č. CBC1) a inkubováno 1 až 15 hodin při laboratorní teplotě. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST (TBS s 0,05% (obj./obj.) Tween 20). Poté bylo na dno jamek přidáno buď 10 μΐ čistého pufru TBST’ (TBS s 0,1% (obj/obj.) Tween 20) anebo 10 μΐ roztoku TBST’ s purifíkovanou rekombinantně připravenou extracelulámí částí lidské PSMA (dále jen rhPSMA) o koncentraci 1 pg.gl·1, tzn. přibližně 10 pmol.l·1. rhPSMA bylo připraveno a vyčištěno dle popisu v (Barinka et al. 2002, Journal of Neurochemistry, str. 477-487), čistota ověřena pomocí SDS-PAGE a koncentrace určena aminokyselinovou analýzou na přístroji Biochrom30 (Biochrom) dle pokynů výrobce; alikvoty zásobního roztoku proteinu byly skladovány při -80 °C. Po 60 až 120 minutách inkubace při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky pětkrát promyty 200 μΐ TBST. Nakonec bylo na dno jamek přidáno 10 μΐ roztoku TBST’ s detekční sondou ssPSMA o několika různých koncentracích, lišících se navzájem desetinásobně v rozsahu 0,1 pmol.l·1 až 10 nmol.l·1 a inkubováno 15 až 75 minut při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky desetkrát promyty 200 μΐ TBST. Na dno jamky pak bylo přidáno 10 μΐ směsi pro qPCR o stejném složení jako v případě beztemplátové kontroly v předchozím příkladu Id a následně bylo stanoveno množství navázané detekční sondy pomocí qPCR stejně, jako je popsáno ve zmíněném příkladu Id.
Bylo tak změřeno množství neselektivně adsorbované sondy v závislosti na její použité koncentraci (ředící řadou detekční sondy v jamkách bez přidaného rhPSMA) a zároveň množství sondy selektivně navázané do aktivního místa PSMA v závislosti na její použité koncentraci (ředící řadou detekční sondy v jamkách s přidaným rhPSMA). Závislost selektivně navázané sondy na její koncentraci byla proložena funkcí popsanou rovnicí (3) pomocí doplňku „řešitel“ v Microsoft Office Excel 2003, kde řešenými proměnnými byly Etot (odpovídá maximálnímu množství selektivně navázané sondy) a Kd (disociační konstanta sondy), za minimalizace součtu kvadrátů relativních odchylek mezi naměřenými hodnotami a hodnotami vypočtenými z proložené funkce.
Celé stanovení bylo postupně zopakováno se všemi výše uvedenými protilátkami a bylo shledáno, že hodnota Kd vazby sondy ssPSMA do aktivního místa imobilizováného enzymu se vždy pohybovala v rozmezí 100 až 200pmol.T1, což velmi dobře odpovídá inhibiční konstantě 140 pmol.l'1, naměřené v enzymové eseji. Imobilizace enzymu na žádnou z těchto protilátek tedy nijak neovlivňuje afinitu vazby detekční sondy do aktivního místa. Maximální množství selektivně navázané sondy pro jednotlivé protilátky vedlo k Cq odečtenému z qPCR mezi 15 a 16; mezi protilátkami tedy nebyl výrazný rozdíl ani v účinnosti imobilizace enzymu z roztoku. Množství neselektivně adsorbované detekční sondy bylo u všech protilátek také podobné a bylo přímo úměrné koncentraci sondy v celém rozsahu použitých koncentrací. Odečtením naměřeného Cq v jamce bez enzymu (odpovídá neselektivně navázané sondě) a Cq v jamce s enzymem (odpovídá selektivně navázané sondě) při stejné použité protilátce a stejné koncentraci sondy byla zjištěna velikost odstupu signálu od pozadí. Ten byl největší pro koncentrace sondy menší nebo rovné Kd její vazby do aktivního místa PSMA a v závislosti na protilátce se pohyboval mezi 8 a 12 qPCR cykly, což odpovídá sto až tisíci násobnému rozdílu při daném množství rhPSMA 10 pg.
S protilátkou 2G7 byl celý experiment zopakován, přičemž různé koncentrace detekční sondy ssPSMA byly nanášeny po naředění v TBST’ nebo v TBST’ za přítomnosti SDS v rozmezí koncentrací 0,005% až 0,02% (hm./obj.) anebo kaseinového blokačního činidla naředěného v rozmezí stonásobně až tisícinásobně, nebo v TBST’ s oběma aditivy ve stejném rozmezí koncentrací. Jako optimální byl shledán TBST’ s 0,005% (hm./obj.) SDS a pětisetnásobně naředěným kaseinovým blokačním činidlem (dále jen pufr CaSDS), ve kterém se jen nepatrně zvýšila disociační konstanta selektivní vazby detekční sondy a selektivní vazba tak zůstala téměř nezměněna. Současně došlo ke snížení neselektivní adsorpce, které se projevilo zvýšením naměřeného Cq o 5 až 6 cyklů a tím stejnou měrou ke zvýšení odstupu signálu od pozadí. V dalších pokusech bylo prokázáno, že stejného efektu se dosáhne i při použití ostatních protilátek rozeznávajících nativní PSMA.
S použitím protilátky 2G7 byla v dalších pokusech stejným způsobem přesněji změřena disociační konstanta nejen sondy ssPSMA, ale i dsPSMA, dsA3PSMA a dsbiotPSMA. Narozdíl od předchozího postupu byla koncentrace naneseného rhPSMA 0,1 pg.pf' a každá sonda byla obvykle nanesena ve dvanácti různých koncentracích v rozmezí 3 až 1600 pmoLf1. Pro některé sondy bylo určení disociační konstanty několikrát zopakováno, přičemž výsledné hodnoty Kd určené z jednotlivých měření se od sebe téměř nelišily. Bylo zjištěno, že Kd sond ssPSMA, dsA3PSMA a dsbiotPSMA je v TBST’ přibližně 60 pmol.l·’, zatímco Kd sondy dsPSMA cca 100 pmol.l'1. V pufru CaSDS byla zjištěná disociační konstanta všech zmíněných sond velmi podobná, přibližně 100 pmol.l'1. Vzhledem k tomu, že pro každou koncentraci každé sondy byly zahrnuty i kontrolní jamky bez přidaného antigenu, bylo takto určeno, že neselektivní vazba jednovláknových a dvouvláknových sond se od sebe liší. Zatímco koncentrace 1000 pmol.l'1 sondy ssPSMA v TBST’ vede k neselektivnímu navázání množství sondy odpovídající Cq = 24 a stejná koncentrace téže sondy v CaSDS vede k Cq = 30, koncentrace 1000 pmol.l'1 sondy dsbiotPSMA (a jiných dvouvláknových sond) v TBST’ vede k neselektivnímu navázání množství sondy odpovídající Cq = 28 a stejná koncentrace téže sondy v CaSDS vede k Cq = 33. Stejným postupem byla v obou pufrech stanovena disociační konstanta sondy ssPSMA i pro další formy PSMA; do jamek byl tentokrát nanesen buď lysát lidské buněčné linie exprimující PSMA o koncentraci PSMA přibližně 0,1 pg.pl'1 (1 ng celkového proteinu; linie HEK 1-750 je popsána v Mlčochova et al. 2009, Prostate, str. 471-479), nebo desetinásobně naředěná lidská krevní citrátová plasma o koncentraci endogenního PSMA přibližně 0,1 pg.pl·1. Zjištěná disociační konstanta sondy vůči PSMA přítomné v buněčném lysátu byla v TBST’ přibližně 140 pmol.l'1, zatímco v CaSDS přibližně 250 pmol.l'1, disociační konstanta sondy vůči endogennímu PSMA obsaženému v plasmě byla v TBST’ přibližně 280 pmol.l'1, zatímco v CaSDS 450 pmol.l'1. Hodnoty Cq naměřené pro koncentrační řadu sondy ssPSMA s různými antigeny jsou shrnuty v tabulce 2.
Tabulka 2: Hodnoty Cq naměřené pro koncentrační řadu sondy ssPSMA s různými antigeny
pufr TBST pufr CaSDS
koncentrace ssPSMA, pmol.l·1 2 pg rhPSMA 1 ng HEK1-750 1 μΐ plasmy 2 pg rhPSMA 1 ng HEK1-750 Ιμΐ plasmy
1600 15,86 16,36 16,96 15,81 16,43 17,03
800 15,95 16,48 17,19 15,85 16,64 17,39
400 16,04 16,66 16,86 16,29 17,02 17,98
200 16,26 17,07 18,01 16,47 17,63 18,57
150 16,49 17,30 18,03 16,84 17,72 18,95
100 16,60 17,63 18,66 17,04 18,39 19,60
75 16,85 18,22 19,22 18,19 18,70 19,93
50 16,85 18,46 19,63 17,59 18,98 20,29
25 17,67 19,13 20,50 18,15 19,91 21,13
12,5 18,67 19,98 21,21 19,17 20,78 22,06
6,25 19,40 20,96 22,28 20,16 21,85 22,99
3,125 20,35 22,02 23,55 21,14 22,79 24,24
Obdobným způsobem byla stanovena disociační konstanta sondy ssPSMA i vůči purifikovaným rekombinantně připraveným biotinylovaným Avi-tagovaným proteinům Avi-PSMA a Avi-GCPIII. Purifikovaná Avi-GCPIII byla připravena dle postupu, popsaném v (Tykvart et al. 2014, Prostate, v tisku), koncentrace čistého proteinu byla určena aminokyselinovou analýzou na přístroji Biochrom30 (Biochrom) dle pokynů výrobce, přičemž alikvoty zásobního roztoku proteinu byly skladovány při -80 °C. GCPIII je blízký lidský homolog PSMA mající velmi podobnou enzymovou aktivitu, je proto dalším vhodným cílem pro kvantifikaci. Postup byl shodný s postupem popsaným na začátku tohoto odstavce, jen v prvním kroku byl do jamek nanesen misto roztoku protilátky roztok neutravidinu (Pierce, kat. č. 31000) vTBS o koncentraci 10 ng.pl1. Další kroky byly stejné, jen místo rhPSMA byly naneseny výše zmíněné Avi-PSMA naředěné v TBST’ na koncentraci 0,24 pg.pl1 nebo Avi-GCPIII naředěná v TBST’ na koncentraci 100 pg.pl1. Disociační konstanta sondy ssPSMA vůči Avi-PSMA byla 160 pmol.l*1 (140 pmol.1'1 dle enzymové kinetiky) a vůči Avi-GCPIII 1700 pmol.l1, což znamená, že sonda se účinně váže i do aktivního místa AviGCPIII.
lf: Stanovení koncetrace PSMA a jeho homologii GCPIII v roztoku
V jednotlivých pokusech pro stanovení koncetrace PSMA bylo na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96 naneseno buď 10 μΐ roztoku protilátky 2G7 anebo 10 μΐ roztoku neutravidinu, obojí o koncentraci 10 ng.pl1 v pufru TBS a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 30 až 120 minut. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 100 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 1 až 15 hodin při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo na dno jamek přidáno 10 μΐ roztoku TBST’ s různě koncentrovanými stanovovanými proteiny. Po 60 až 120 minutách inkubace při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky pětkrát promyty 200 μΐ TBST. Nakonec bylo na dno jamek přidáno 10 μΐ roztoku TBST’ s detekční sondou a inkubováno 15 až 75 minut při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky desetkrát promyty 200 μΐ TBST. Na dno jamky pak bylo přidáno 10 μΐ směsi pro qPCR o stejném složení jako v případě beztemplátové kontroly v příkladu Id a následně bylo stanoveno množství navázané detekční sondy pomocí qPCR stejně, jako je popsáno v příkladu Id.
V prvním uspořádání byla do jamek nanesena protilátka 2G7 a po zablokování povrchu přidáno 10 μΐ roztoku rhPSMA v rozmezí koncentrací 1 ng.pl1 až 0,1 fg.pl1 (připravené ředící řadou purifikovaného rhPSMA o známé koncetraci v TBST’ pufru). Pro detekci byl postupně vyzkoušen roztok ssPSMA o koncentraci 100 pmol.l1 v CaSDS, roztok dsbiotPSMA v koncentraci 1000 pmol.l1 vCaSDS a roztok NeudsbiotPSMA v koncentraci 60 pmol.l1 v CaSDS. Detekční sonda Neu dsbiotPSMA byla připravena smícháním 3 μΐ roztoku neutravidinu v koncentraci 1 mg.mr1 s 20 μΐ roztoku biotinylované detekční sondy dsbiotPSMA o koncentraci 10 pmol.l1 (odpovídající čtyřnásobnému molámímu přebytku oproti neutravidinu) v TBS pufru. Vzniklý komplex byl po inkubaci přes noc na ledu přečištěn od případného přebytku volné sondy dsbiotPSMA ultrafíltrací na Amicon Ultra 0,5 ml 100K, objem retenátu byl dvakrát po sobě desetinásobně naředěn v TBS. Výsledná koncentrace detekční sondy v komplexu byla stanovena pomocí qPCR porovnáním s ředící řadou standardu ssPSMA dle popisu v příkladu Id.
Takto bylo zjištěno, že pomocí roztoku detekční sondy dsbiotPSMA v koncentraci 1000 pmol.l·1 v CaSDS lze stanovit koncentraci rhPSMA v celém zkoušeném rozsahu, tzn. množství od 10 ng do 1 fg, při lineárním rozsahu stanovení přibližně šest řádů (od 1 ng do 1 fg, hodnota R2 spolehlivosti logaritmického proložení výsledků ze 7 koncentrací v tomto rozsahu, vypočteného v programu Microsoft Office Excel 2003, byla 1,00, viz obr. 8). Logaritmické proložení bylo použito proto, že lineární úměra platí pro závislost Cq na logaritmu koncentrace analytu (tzn. že pro závislost Cq na koncentraci analytu platí logaritmická úměra). Lineární rozsah za použití detekční sondy ssPSMA v koncentraci 100 pmol.l’1 v CaSDS byl přibližně v rozmezí stovek pg až jednotek fg rhPSMA (hodnota R2 logaritmického proložení výsledků z 12 koncentrací v rozsahu 316 pg až 1 fg byla 0,99, viz obr. 8). Bylo také zjištěno, že při použití komplexu detekční sondy NeudsbiotPSMA byly zachovány všechny výhodné znaky původní sondy týkající se citlivosti a dynamického rozsahu, tedy limit detekce výrazně pod 1 fg rhPSMA a lineární rozsah stanovení rhPSMA přinejmenším pět řádů (R2 logaritmického proložení výsledků z 5 koncentrací v rozsahu 20 pg až 2 fg bylo 1,00, viz obr. 8). Zmíněné hodnoty R2 dokazují vynikající přesnost stanovení koncentrace, neboť takových hodnot bylo dosaženo stanovením každé kocentrace pouze v jediné jamce, tzn. bez replikátů. Obdobných výsledků se dosáhlo i při naředění detekčních sond v TBST’ pufru, pouze dynamický rozsah byl přibližně o řád menší v důsledku vyšší nespecifické adsorpce detekčních sond v tomto pufru a z ní plynoucí menší citlivosti. Naměřené hodnoty Cq s pomocí jedno- a dvouvláknových sond (ssPSMA a dsbiotPSMA) v závislosti na množství rhPSMA jsou shrnuty v tabulce 3.
Tabulka 3: Hodnoty Cq naměřené s pomocí jedno- a dvouvláknových sond (ssPSMA a dsbiotPSMA) v závislosti na množství rhPSMA
množství rhPSMA, pg ssPSMA v CaSDS, 100 pmol.l'1 dsbiotPSMA v CaSDS, 1000 pmol.l'1
10000 neurčeno 8,20
1000 neurčeno 9,22
316 11,55 neurčeno
100 12,47 11,23
32 13,97 neurčeno
10 15,40 14,66
3,2 17,15 neurčeno
L0 18,58 18,18
0,32 20,34 neurčeno
0,10 22,14 21,21
0,032 23,87 neurčeno
0,010 25,26 24,78
0,0032 26,92 neurčeno
0,0010 27,88 27,47
žádné 29,91 29,84
Jak bylo ukázáno v předchozím příkladu le, detekční sonda pro PSMA se váže i do aktivního místa jeho blízkého homologu GCPI1I. Stejným postupem jako výše byla testována selektivita stanovení tak, že vedle 10 μΐ roztoku rhPSMA bylo do dalších jamek naneseno také 10 μΐ roztoku purifikované tagované a biotinylované Avi-GCPIII anebo 10 μΐ roztoku purifikované extracelulámí části lidské GCPIII, připravené rekombinantní expresí (dále jen rhGCPIII, připravené dle postupu v Hlouchova et al. 2007, Journal of Neurochemistry, str. 682-696), obojí v různých koncentracích v rozmezí 1 ng.pl’1 až 0,1 fg.pl’1. Pro detekci byl použit roztok sondy ssPSMA v CaSDS o koncentraci 1000 pmol.1’1. Zatímco rhPSMA byl stejně jako při předchozích stanoveních detekovatelný i v nejnižším naneseném množství 1 fg, tak u všech nanesnených množství Avi-GCPIII a rhGCPIII kromě dvou nej vyšších (1 a 10 ng) nebyl nalezen detekovatelný rozdíl oproti jamkám zcela bez analytů. Množství navázané detekční sondy v jamkách s 10 ng zmíněných proteinů přibližně odpovídalo množství navázané sondy v jamce s 10 fg, tzn., že stanovení PSMA by vedlo k falešně positivním výsledkům pouze v případě, že by koncentrace GCPIII v analyzovaném vzorku byla přimejmenším o šest řádů vyšší než koncetrace PSMA. Navíc, další řádový přírůstek selektivity je možné docílit desetinásobným snížením koncentrace detekční sondy až na Kd sondy vůči PSMA, neboť Kd sondy vůči GCPIII je téměř dvacetkrát vyšší. Tento příklad dokazuje, že i se sondou vázající se na více anlaytů lze v kombinaci se selektivní protilátkou dosáhnout neobyčejně vysoké selektivity.
V dalším uspořádání byl v prvním kroku do jamek nanesen roztok neutravidinu a po zablokování povrchu bylo do jamek naneseno 10 μΐ roztoku purifíkovaného tagovaného a biotinylováného Avi-PSMA anebo purifikované tagované a biotinylované Avi-GCPIII naředěné vTBST‘, a to v různých koncentracích. Pro detekci Avi-PSMA byl použit roztok sondy ssPSMA v CaSDS o koncentraci 1000 pmol.1’1, zatímco pro detekci Avi-GCPIII o koncentraci 10 000 pmol.1’1. Lineární rozsah stanovení Avi-PSMA byl v rozmezí 10 ng až 100 fg, zatímco lineární rozsah stanovení Avi-GCPIII byl v rozmezí 10 ng až 10 pg. Naměřené hodnoty Cq v závislosti na množství Avi-PSMA či Avi-GCPIII jsou shrnuty v tabulce 4.
Tabulka 4: Hodnoty Cq naměřené v závislosti na množství Avi-PSMA či Avi-GCPIII:
Množství, pg Avi-PSMA Avi-GCPIII
10 000 9,65 11,71
1 000 13,02 15,37
100 16,72 19,11
10 19,88 21,77
1 23,26 23,59
0,1 26,20 23,95
0,01 25,81 23,98
0,001 28,04 24,00
žádné 27,24 22,13
Ve všech stanoveních byly rovněž zahrnuty kontroly potvrzující selektivitu stanovení analytu, ve kterých do jamek nebyly naneseny protilátka či neutravidin pro selektivní imobilizaci stanovovaného proteinu a povrch byl jen zablokován, v tom případě bylo pozorováno množství navázané sondy odpovídající jamkám bez analytu. Případně byla detekční sonda do jamek přidána v roztoku obsahujícím známý kompetitivní inhibitor PSMA či GCPIII v koncentraci výrazně převyšující jeho inhibiční konstantu, což vedlo k výraznému poklesu navázané sondy oproti jamkám bez inhibitoru.
V dalším uspořádání byla testována možnost eluce sondy selektivně navázané do aktivního místa PSMA; postup byl stejný, jako je popsáno na začátku příkladu. Na povrch jamek byla nejprve imobilizována protilátka 2G7, po zablokování povrchu byla kromě samotného pufru TBST’ nanesena desítková ředící řada rhPSMA v TBST’ v rozmezí 2 pg až 2 fg rhPSMA na jamku. Pro detekci byl do jamek přidán roztok ssPSMA v CaSDS o koncentraci sondy 100 pmol.l'1. Nakonec, po odmytí nenavázané sondy bylo do některých jamek přidáno 10 μΐ TBST’ pufru. Po 1 hodině stání při teplotě místnosti byl roztok z těchto jamek odebrán (dále jen eluce) a jamky znovu desetkrát promyty 200 μΐ TBST. Teprve potom bylo do jamek přidáno 10 μΐ směsi pro qPCR o stejném složení jako v případě beztemplátové kontroly v příkladu Id a následně bylo stanoveno množství navázané detekční sondy pomocí qPCR stejně, jako je popsáno v příkladu Id. Kromě toho bylo v 1 μΐ odebraného objemu eluce stanoveno stejným způsobem množství sondy (do čisté jamky bylo přidáno 10 μΐ směsi pro qPCR o stejném složení jako výše, k té přidán 1 μΐ eluce a množství detekční sondy bylo stanoveno pomocí qPCR stejně jako výše). Porovnáním množství navázané detekční sondy v jamkách eluovaných TBST’ a neeluovaných bylo zjištěno, že za dobu jedné hodiny se z povrchu uvolnilo přibližně 50 % detekční sondy, což bylo v souladu s koncentrací sondy naměřené v eluci. Naměřené Cq v závislosti na koncentraci PSMA a postupu stanovení jsou shnuty v tabulce 5.
Tabulka 5: Hodnoty Cq naměřené v závislosti na koncentraci PSMA a postupu stanovení
Množství rhPSMA, fg neeluováno eluováno eluce
2000 18,88 19,60 23,88
200 22,35 23,50 27,45
20 25,73 26,68 30,61
2 28,85 29,76 32,85
žádné 29,96 31,91 34,79
Je zřejmé, že lineární rozsah i limit detekce je při stanovení eluované sondy stejný jako při stanovení sondy navázané na pevném nosiči. Tento postup lze tedy využít pro převedení navázané sondy do roztoku umožňujícího stanovení v jiném typu pevného nosiče, než na kterém probíhá imobilizace.
Ig: Určení limitu detekce PSMA v roztoku
Na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96 bylo naneseno 10 μΐ roztoku protilátky 2G7 v koncentraci 2,5 ng.gl·1 v pufru TBSE (TBS s EDTA v koncentraci 5 mmol.l'1) a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 6 hodin. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 200 μΐ v TBSE pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 18 hodin při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky pětkrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo na dno jamek přidáno buď 10 μΐ TBST’ pufru anebo 10 μΐ roztoku rhPSMA v TBST’ o známé koncentraci rhPSMA v rozmezí 0,1 fg.gl'1 až 0,5 ag-μΓ1, tzn. v celkovémmnožství rhPSMA v rozmezí 1 fg až 5 ag, přičemž každá koncentrace byla nanesena alespoň v triplikátu. Po 3 hodinách inkubace při laboratorní teplotě byl obsah jamek vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Nakonec bylo na dno jamek přidáno 10 μΐ roztoku detekční sondy dsA3PSMA(l:l,2) v pufru CaSDS o koncentraci sondy 75 pmolT1 a inkubováno 1 hodinu při teplotě místnosti. Sonda dsA3PSMA(l:l,2) byla připravena stejným postupem jako sonda dsA3PSMA stím rozdílem, že sonda ssPSMA byla párována s 1,2 molámím nadbytkem komplementárního vlákna, při koncentraci ssPSMA 1 μιηοΙ.Γ1. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky desetkrát promyty 200 μΐ TBST. Na dno jamky pak bylo přidáno 10 μΐ směsi pro qPCR o stejném složení jako v případě beztemplátové kontroly v příkladu Id a následně bylo stanoveno množství navázané detekční sondy pomocí qPCR stejně, jako je popsáno v příkladu Id.
Naměřené hodnoty Cq v závislosti na nanášeném množství rhPSMA jsou shrnuty v tabulce 6 a na obrázku 9. Je z nich patrné, že lineární rozsah kvantifikace rhPSMA sahá až k množství 0,1 fg (což při molekulové hmotnosti monomeru rhPSMA určené pomocí MALDI-TOF na 88,7 KDa odpovídá přibližně 680 molekulám rhPSMA, tzn. 340 dimerům). Limit detekce leží nejhůře mezi 10 a 25 ag, tzn. mezi 34 a 85 dimery, neboť rozdíl mezi průměrným Cq jamek bez rhPSMA a s 25 ag rhPSMA byl více než jeden cyklus.
Tabulka 6: Naměřené hodnoty Cq v závislosti na nanášeném množství rhPSMA
množství rhPSMA, fg G(l) G(2) G(3)
žádné 35,74 36,44 35,60
žádné 36,10 35,32 34,65
žádné 34,64 35,03 35,36
0,005 34,52 34,68 35,01
0,005 35,41 34,92 35,06
0,010 34,93 34,86 34,58
0,025 34,17 34,19 33,41
0,050 33,45 34,30 34,83
0,10 33,55 33,25 32,94
0,25 32,44 32,02 32,38
0,50 31,72 31,44 31,01
1,00 30,51 30,68 29,15
Každá nanáška byla měřena v triplikátu, jen nanáška 5 ag v šesti vyhotoveních a nulová nanáška v devíti vyhotoveních, proto je u těchto nanášek v tabulce více řádků.
Ih: Stanovení koncentrace PSMA v komplexních biologických matricích
Na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96 bylo naneseno 10 μΐ roztoku protilátky 2G7 v koncentraci 5 ng.pF1 v pufru TBS a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 až 1,5 hodiny. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 100 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 24 hodin při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo na dno jamek přidáno buď 10 μΐ roztoku standardu rhPSMA o 12 různých koncentracích v TBST’ (rozmezí 32 pg.pf' až 0,1 fg.pl’1), anebo analyzované vzorky buněčného lysátu, moče a krevní plasmy v různých ředěních v pufru TBST’. Po 1,5 hodinách inkubace při stanovení PSMA v moči a buněčném lysátu či po 18 hodinách inkubace při stanovení PSMA v krevní plasmě, vždy při teplotě místnosti, byl obsah jamek vyklepnut a jamky pětkrát promyty 200 μΐ TBST. Nakonec bylo na dno jamek přidáno 10 μΐ roztoku detekční sondy ssPSMA v pufru CaSDS o koncentraci sondy 1000 pmol.r’ a inkubováno 1 hodinu při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky desetkrát promyty 200 μΐ TBST. Na dno jamky pak bylo přidáno 10 μΐ směsi pro qPCR o stejném složení jako v případě beztemplátové kontroly v příkladu Id a následně bylo stanoveno množství navázané detekční sondy pomocí qPCR stejně jako je popsáno v příkladu Id.
Ze získaných dat byla nejprve vyhodnocena kalibrační řada, pro kterou byla závislost Cq na koncentraci rhPSMA logaritmicky proložena; kvalita a rozsah kalibrační řady byly stejné jako v předchozím příkladě. Z rovnice úměry získané pomocí kalibrační řady a znalosti naředění analyzovaných biologických vzorků pak byla dopočtena koncentrace PSMA v daných biologických vzorcích. Nejprve byla takto určena koncentrace PSMA v 15 vzorcích citrátové plasmy zdravých dárců, přičemž výsledná hodnota byla průměrem koncentrací určených při deseti-, sto- a tisícinásobně ředěných plasmách jednotlivých dárců. Koncentrace PSMA určené z jednotlivých ředění byly navzájem až na drobné variace totožné, navíc určená množství PSMA v jamce byla vždy vysoko nad limitem detekce (rozdíl Cq nejméně tří cyklů oproti nulovým kontrolám), a to i pro největší ředění vzorků s nejmenší koncentrací PSMA. To znamená, že pro stanovení PSMA v krevní plasmě popsaným způsobem postačuje objem plasmy nanejvýš 10 nl. Navíc, selektivita vazby detekční sondy prostřednictvím ligandové části byla ověřena jednak tím, že její vazba na povrch jamek s analyzovanými vzorky byla potlačena, pokud byl do nanášeného roztoku sondy přidán kompetitivní inhibitor PSMA, a dále tím, že na povrch jamek s analyzovanými vzorky nebyla pozorována vazba oligonukleotidu iqPCR amino neobsahujícího ligandovou Část převyšující neselektivní vazbu na povrch bez vzorku.
Naměřené koncentrace byly nakonec porovnány s koncentracemi určenými ve stejných vzorcích pomocí radioenzymatického eseje (postup odběru a zpracování citrátových plasem a stanovení koncentrace PSMA v těchto vzorcích pomocí radio-enzymatické eseje jsou popsány v Knedlík et al. 2014, Prostate, str. 768-780). Přestože absolutní hodnoty určené naší metodou byly v porovnání s radioenzymatickým stanovením přibližně desetkrát menší (tabulka 7), tak spolu hodnoty z obou metod velmi dobře korelovaly. To je vidět z grafického vynesení porovnání výsledků obou metod na obrázku 10 a z hodnoty spolehlivosti R2 přímé úměry mezi výsledky obou metod, která byla rovna 0,98. Rozdíl v naměřené absolutní koncentraci PSMA může být způsoben jejím nepřesným radioenzymatickým určením v důsledku rozdílných rychlostí štěpení substrátu mezi rhPSMA, který byl použit jako standard, a mezi endogenním PSMA stanovovaným v plasmě. Rychlost štěpení substrátu endogenním PSMA v daných podmínkách radí enzymatického eseje nebyla určena, předpokládalo se, zeje stejná jako u rhPMSA. Naproti tomu při stanovení naším způsobem byla změřena afinita sondy jak vůči standardu rhPSMA, tak vůči stanovovanému endogennímu PSMA a byla použita taková koncentrace sondy (výrazně nad Kd sondy k oběma proteinům) aby nedošlo ke zkreslení výsledků v důsledku rozdílně silné vazby sondy na jednotlivé proteiny.
Tabulka 7: Srovnání koncentrace PSMA změřené referenční a předkládanou metodou
koncentrace PSMA (ng.ml'1) naměřené:
metodou dle vynálezu radioenzymaticky
vzorek 1 0,43 5,7
vzorek 2 0,40 3,7
vzorek 3 0,14 1,4
vzorek 4 0,11 1,3
vzorek 5 0,26 3,0
vzorek 6 0,23 3,2
vzorek 7 0,94 9,9
vzorek 8 0,37 4,6
vzorek 9 0,41 4,0
vzorek 10 1,37 17
vzorek 11 0,25 3,4
vzorek 12 0,15 1,4
vzorek 13 0,18 2,3
vzorek 14 0,15 1,5
vzorek 15 0,20 2,4
Popsaným způsobem byla stanovena i koncentrace PSMA v deseti- a stonásobně v TBST’ naředěných vzorcích moče; variace mezi naměřenými koncentracemi byla velmi malá, typicky do deseti procent. Ve dvou vzorcích moče od pacientů trpících karcinomem prostaty byla naměřena koncentrace PSMA 33 a 192 pg.ml'1, ve vzorku moče zdravého muže koncentrace 15 pg.ml·1, zatímco v moči zdravé ženy pouhých 8 pg.ml1. Přestože pro stanovení PSMA předkládaným způsobem postačoval 1 μΐ moče, není v současné době dostupná žádná dostatečně citlivá referenční metoda, se kterou by bylo možné naměřené koncentrace porovnat. Nicméně stejně jako u krevní plasmy byla vazba detekční sondy potlačena přidáním kompetitivního inhibitoru PSMA, což prokazuje selektivní vazbu detekční sondy do aktivního místa PSMA prostřednictvím její ligandové části.
Popsaným způsobem byla stanovena také koncentrace v lysátech kultur buněčných linií odvozených od karcinomu prostaty, konkrétně od metastazujících buněk LNCaP, DU-145 a PC-3. Buňky kultivované při 37 °C v atmosféře 5% (obj./obj.) CO2 v mediu RPMI (Sigma, buněčná linie LNCaP) nebo mediu IMDM (Invitrogen) s přídavkem 10% (obj./obj.) FBS (Sigma) v petriho miskách o průměru 100 mm, určených pro tkáňové kultury (SPL Life Sciences), byly po dosažení přibližně 90% konfluence rozsuspendovány v tomto mediu, přeneseny do mikrozkumavky a odstřeďovány 5 min při 250 g při teplotě místnosti. Médium bylo následně odebráno a buňky ještě promyty 50 mmol.f1 Tris s 100 mmol.f1 NaCI o pH = 7.4 (dále jen CLP). Přibližně 20 miliónů buněk bylo následně suspendováno ve 300 μΐ CLP a přeneseno do 2 ml mikrozkumavky s kulatým dnem; k nim byla přidána ocelová kulička o průměru přibližně 3 mm. Buňky byly následně lyžovány a homogenizovány v přístroji Tissue Lyzer (Qiagen; 3 minuty na maximální výkon). Poté byl roztok přenesen do nové zkumavky, přidána 1/10 objemu 10% (hm./obj.) oktaethylenglykolmonododecyletheru (Affymetrix, kat. č. 0330; C]2E8) a po promíchání byl roztok sonikován 1 min v ledem vychlazené sonikační lázni Elmasonic S30. Výsledný roztok byl odstřeďován 15 min / 600 g / 4 °C a následně byl odebrán supernatant, který představuje lysát. Celková koncentrace proteinů v lysátu byla stanovena pomocí reagencie Biorad Protein Assay. Koncentrace PSMA byla stanovena v různých ředěních lysátu v TBST’, nanášené množství celkového proteinu se pohybovalo v rozmezí 100 ng až 100 pg. Naměřená koncentrace PSMA byla u LNCaP linie 0,27 ng/pg celkového proteinu, zatímco u linií DU-145 a PC-3 nebyl PSMA detekovatelný, což při daných podmínkách stanovení představovalo koncentraci menší než 0,1 pg/pg celkového proteinu. Vazba detekční sondy byla i v tomto případě potlačena přidáním kompetitivního inhibitoru PSMA a naměřené koncentrace byly rovněž v souladu se stanovením metodou Western blot.
li: Testování inhibiční potence látek vůči různým formám PSMA
Na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96 bylo naneseno 10 μΐ roztoku neutravidinu v koncentraci 10 ng.pf1 v pufru TBS a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodiny. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 200 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 24 hodin při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo na dno jamek přidáno 10 μΐ roztoku standardů v TBST’ o známých koncentracích Avi-PSMA (50 pg-μΓ1) nebo Avi-GCPPIII (2 ng.pf1), zahrnuty byly také nulové kontroly se samotným pufrem. Po 2 hodinách inkubace při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky pětkrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo přidáno 10 μΐ roztoku detekční sondy ssPSMA v pufru TBST‘ o koncentraci sondy 200 pmol.f1 na dno jamek s Avi-PSMA, či o koncentraci 1000 pmol.f1 na dno jamek s Avi-GCPIII. Následná inkubace probíhala 1 hodinu při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky desetkrát promyty 200 μΐ TBST. Na dno jamky pak bylo přidáno 10 μΐ směsi pro qPCR o stejném složení jako v případě beztemplátové kontroly v příkladu Id a následně bylo stanoveno množství navázané detekční sondy pomocí qPCR stejně, jako je popsáno v příkladu Id.
Přidání určité koncentrace testované látky k detekční sondě umožnilo z poklesu množství navázané detekční sondy odvodit inhibiční konstantu této látky. Testované látky byla přidána vždy jen jediná koncentrace, přičemž stanovení bylo provedeno ve dvou vyhotoveních. Pro testování bylo zvoleno 15 látek, u nichž byla inhibiční konstanta pro Avi-PSMA změřena také pomocí enzymového eseje, popsaného v příkladu 1c, Jejich inhibiční konstanty jsou v rozmezí desítek pmol.l·1 až stovek pmol.l·1. Odečtením Cq naměřeného v jamkách s enzymem a čistou detekční sondou od Cq naměřeného v jamkách se stejným enzymem a detekční sondou doplněnou testovanou látkou bylo vypočteno ACq, ze kterého bylo pomocí vzorců (9) a (14) vypočteno procento aktivních míst enzymu obsazeného testovanou látkou; za účinnost qPCR byla dosazena hodnota jedné. ACq získané odečtením Cq naměřeného v jamkách s enzymem od Cq naměřeného v nulové kontrole (jamkách bez enzymu) sloužilo pro zjištění maximálního rozsahu stanovení procentního množství obsazených aktivních míst daného enzymu. Dosazením koncentrace testované látky, ACq, Kd detekční sondy určené v příkladu le (160 pmol.l·1 pro ssPSMA a Avi-PSMA v TBST’; 1700 pmol.l·1 pro ssPSMA a Avi-GCPIII v TBST’) a koncentrace detekční sondy do rovnice (15) byla určena hodnota inhibiční konstanty dané látky. V tabulce 8 jsou shrnuty koncentrace testovaných látek použité při stanovení, procenta jimi obsazených aktivních míst daného enzymu, naměřené inhibiční konstanty vůči danému enzymu a referenční hodnoty inhibičních konstant naměřených metodou enzymové kinetiky popsanou v příkladu 1c. Pro enzym Avi-GCPIII nejsou referenční hodnoty známé, neboť pro změření Kt více látek je potřebné větší množství enzymu než bylo dostupné. Z tabulky je patrné, že u silně vázajících se inhibitorů je pro Avi-PSMA odchylka mezi oběma metodami nanejvýš v řádu desítek procent, u posledncíh šesti slaběji se vázajících inhibitorů jsou námi určené konstanty dva až čtyř násobně větší. Výborná shoda mezi oběma metodami je patrná z grafického porovnání výsledků obou metod na obrázku 11, hodnota spolehlivosti R2 lineární úměry mezi Kj určenými předkládanou metodu a Kt určenými referenční enzymovou kinetikou byla pro Avi-PSMA 0,94.
Drobné odchylky mezi oběma metodami mohou být dané jak nepřesností v našem stanovení, tak nepřesností ve stanovení enzymovou kinetikou. Naše stanovení by bylo možné zpřesnit změřením více replikátů, ať už se stejnou či různou koncentrací testovaných látek, a výsledné hodnoty zprůměrovat. Chyby ve stanovení v enzymové kinetice plynou především z nepřesného stanovení Km substrátu (systematický posun ve všech Kl) a z nesprávného proložení závislostí reakčních rychlostí na koncentraci inhibitoru. Na tomto místě je nutné zdůraznit, že ani správně změřenou hodnotu K nelze považovat za neměnnou tabelovatelnou hodnotu, neboť vlastnosti enzymů, v tomto kontextu zejména afinita enzymu k substrátu a rychlost enzymem katalyzované reakce, jsou zásadním způsobem závislé na složení roztoku. Naměřené N tak obvykle silně závisí na konkrétním pH roztoku, teplotě, použité pufrovací látce, iontové síle roztoku, povaze iontů v roztoku, různých aditivech (např. detergentech) a na dalších vlivech. Dokonce i pokud se Ki stanoví enzymovou kinetikou za velmi podobných výsledků, tak se poměrně často dochází k odlišným výsledkům, jak je například patrné na stanovení K známého inhibitoru 2-PMPA. V práci popsané v (Jackson et al. 1996, Journal of Medicinal Chemistry, str. 619-622) bylo K, 2-PMPA stanoveno na 0,3 nmol.1’1, zatímco v (Kozikowski et al. 2004, Journal of Medicinal Chemistry, str. 1729-1738) bylo stanovené Kt rovné
1,4 nmol.r1. V našem stanovení byla oproti enzymové kinetice použita jiná pufrovací látka a jiný detergent, navíc ve vyšší koncentraci, což mohlo přispět k pozorované malé odlišnosti výsledků.
Tabulka 8: Srovnání hodnot K, a procentního množství obsazených aktivních míst zjištěných metodou dle vynálezu a referenční metodou měření enzymové kinetiky
Avi-PSMA Avi-GCPIII
název koncentrace látky, pmol.l'1 Procenta obsazených aktivních míst K stanovené, nmol.l'1 Kj (enzymová kinetika), nmol.l'1 Procenta obsazených aktivních míst K stanovené, nmol.l'1
látka 1 1 99,86 0,7 0,4 96,4 24
látka 2 1 99,964 0,2 0,2 99,18 5
látka 3 1 89 56 40 54 570
látka 4 1 99,982 0,09 0,06 86 110
látka 5 1 99,991 0,04 0,09 95,0 35
látka 6 1 92,9 36 50 40 1 000
látka 7 1 99,915 0,4 0,3 95,5 31
látka 8 1 99,63 2 2 87 96
látka 9 1 99,81 1 1 96,3 26
látka 10 113 99,0 550 260 88 10 000
látka 11 85 75 13 000 4 200 85 9 900
látka 12 1 000 60 310 000 230 000 22 ~2 400 000
látka 13 1 000 86 76 000 31 000 60 440 000
látka 14 1 000 94,9 25 000 12 000 38 ~1 100 000
látka 15 1 000 82 100 000 23 000 64 380 000
Různý počet platných číslic u procent obsazených aktivních míst (testovanou látkou) odpovídá různé přesnosti stanovení při různém procentu obsazenosti. K, odvozené od procent obsazenosti méně než 50 procent jsou brána jako méně spolehlivá. Důležité je také to, že pomocí uvedeného testování byly nalezeny první inhibitory selektivní pro Avi-PSMA oproti Avi-GCPIII, přičemž inhibiční potence látky 4 vůči AviGCPIII byla ověřena pomocí enzymové kinetiky (naměřené K, = 140 nmol.l'1).
Skutečnost, že testované látky bývají rozpuštěné v různých organických rozpouštědlech, vedla k otestování spolehlivost předkládaného způsobu v přítomnosti acetonitrilu, metanolu, dimethylsulfoxidu (DMSO) a detergentu Tween 20. Postup byl shodný s výše popsaným, jen na začátku byl místo roztoku neutravidinu do jamek nanesen roztok protilátky 2G7 o koncentraci 5 ng.pl'1 v TBS pufru. Místo Avi-tagovaných proteinů byl pak nanesen roztok rhPSMA o známé koncentraci 2 pg.pl'1 v TBST’. Pro detekci byl použit roztok sondy ssPSMA o koncentraci 60 pmol.l'1 v TBST’ nebo v TBST’ s různě koncentrovaným organickým rozpouštědlem, nebo v TBS s různou koncentrací Tween 20. Nulové kontroly bez antigenů byly zahrnuty pro každý použitý roztok detekční sondy, vše bylo měřeno ve dvou vyhotoveních. Porovnáním naměřených Cq v jamkách s antigenem i bez něj byl určen případný vliv daného složení ředícího roztoku sondy na stanovení. Bylo shledáno, že DMSO, acetonitril ani metanol neměly na naměřené výsledky vliv v koncentracích 0,1%, 1% ani 10% (obj./obj.). Stejně tak různá koncentrace Tween 20 v rozmezí 0% až 1% (obj./obj.) v ředícím roztoku neměla na stanovení žádný vliv. Otestováno bylo rovněž přidání tří inhibujících látek v různých koncentracích, přičemž inhibiční konstanty těchto látek byly postupně v řádu stovek pmol.l'1, desítek nmol.l'1 a desítek μιηοΙ.Γ1, a bylo zjištěno, že v rozmezí dynamického rozsahu stanovení se, nehledě na použitou koncentraci testované látky, získá velmi podobná hodnota Kt.
Postup popsaný v předchozím odstavci umožňuje testování inhibiční potence látek i vůči endogennímu enzymu, proto byly stejným postupem jako v předchozím odstavci určeny inhibiční konstanty sady 36 látek nejen vůči rhPSMA, ale i vůči endogennímu PSMA obsaženému v lidské krevní plasmě. Pro stanovení inhibičních potencí vůči rhPSMA byl do jamek nanesen roztok rhPSMA o koncentraci 2 pg-μΓ1 v TBST’ a použita detekční sonda ssPSMA o koncentraci 60 pmol.l·1 v TBST’, zatímco pro stanovení inhibičních potencí vůči endogenním PSMA byla do jamek nanesena desetinásobně v TBST’ naředěná citrátová krevní plasma a použita detekční sonda ssPSMA o koncentraci 300 pmol.l'1 v TBST’. Opět byl měřen pokles navázané detekční sondy pouze při jediné koncentraci každé z testovaných látek. Z naměřených dat bylo vypočteno ACq, procento obsazenosti aktivních míst enzymu testovanými látkami a Kt testovaných látek stejným postupem jako bylo popsáno výše (Kd = 60 pmol.l'1 pro ssPSMA a rhPSMA v TBST’; Kd = 300 pmol.l'1 pro ssPSMA a endogenní PSMA v TBST’, obojí stanoveno v příkladu le). Koncentrace testovaných látek při stanovení, procenta jimi obsazených aktivních míst daného enzymu a jejich naměřené inhibiční konstanty vůči rhPSMA či endogennímu PSMA jsou shnruty v tabulce 9, samotné porovnání inhibičních konstant naměřených pro rhPSMA a endogenní PSMA je graficky vyneseno na obrázku 12. Rozsah naměřených K, byl v rozmezí desítek pmol.l'1 až stovek μιηοΙ.Γ1, dvě testované látky neinhibovaly vůbec. Z grafu je jasně patrná velmi dobrá korelace mezi inhibičními konstantami pro oba proteiny, hodnota spolehlivosti R2 přímé úměry mezi K, určenými pro obě formy PSMA byla 0,93. Přesto jsou hodnoty Kt naměřené pro endogenní PSMA v průměru pětkrát vyšší než pro rhPSMA, což je ale patrně dáno tím, že se jedná o trochu odlišnou formu proteinu, která je produkována v hmyzích buňkách a které chybí intracelulámí a transmembránová část. Rozdíly v K, jsou v souladu s tím, že Kd detekční sondy bylo pro endogenní PSMA přibližně pětkrát vyšší než pro rhPSMA. Větší rozdíly pozorované pro subnanomolámí inhibitory jsou dané překročením dynamického rozsahu stanovení endogenního PSMA, které je menší v důsledku velmi malého množství PSMA v krevní plasmě. Přesnějších výsledků pro endogenní PSMA by se u těchto inhibitorů dosáhlo použitím jejich menší koncentrace anebo většího množství krevní plasmy.
Tabulka 9: Naměřené inhibiční konstanty látek vůči rhPSMA či endogennímu PSMA
rhPSMA endogenní PSMA
název koncentrace látky, nmol.l'1 Procent obsazených aktivních míst Kj stanovené, nmol.l'1 Procent obsazených aktivních míst Kj stanovené, nmol.l'1
látka 1 1000 99,959 0,21 99,65 1,8
látka 2 1000 99,966 0,17 99,73 1,3
látka 3 1000 95,9 22 88 70
látka 4 1000 99,968 0,16 99,70 1,5
látka 5 1000 99,932 0,34 99,36 3,2
látka 6 1000 96,9 16 94,0 32
látka 7 1000 99,915 0,43 98,5 7,9
látka 8 1000 99,84 0,81 neurčeno neurčeno
látka 9 1000 99,928 0,36 99,55 2,3
látka 10 100000 99,57 220 98,7 650
látka 11 100000 89 6100 78 14000
látka 12 1000000 57 380000 55 410000
látka 13 1000000 73 180000 83 100000
látka 14 1000000 86 80000 94,8 28000
látka 15 1000000 91,7 45000 87 78000
látka 16 1000 99,961 0,19 99,48 2,6
látka 17 1000 99,49 2,5 98,3 8,7
látka 18 1000 98,7 6,4 96,3 19
látka 19 1000 98,6 7,0 95,9 21
látka 20 1000 99,56 2,2 98,3 8,4
látka 21 1000 99,938 0,31 99,52 2,4
látka 22 1000 99,962 0,19 99,60 2,0
látka 23 1000 99,86 0,72 99,31 3,5
látka 24 1000 98,1 9,4 94,1 31
látka 25 1000 98,9 5,5 97,1 15
látka 26 1000 99,903 0,48 99,45 2,8
látka 27 1000 99,930 0,35 99,35 3,3
látka 28 1000 99,73 1,37 98,8 5,9
látka 29 1000 99,967 0,16 99,67 1,7
látka 30 1000 99,85 0,75 99,69 1,6
látka 31 1000 99,60 2,0 98,9 5,7
látka 32 1000 99,80 1,0 98,7 6,7
látka 33 1000 99,941 0,30 99,60 2,0
látka 34 1000000 94,9 27000 91,7 45000
látka 35 100000 0 neinhibuje 0 neinhibuje
látka 36 100000 0 neinhibuje 0 neinhibuje
Označení látek odpovídá označení v předchozí tabulce. Různý počet platných číslic u procent obsazených aktivních míst (testovanou látkou) odpovídá různé přesnosti stanovení při různém procentu obsazenosti.
Ij: Stanovení PSMA v roztoku pomocí chemiluminiscenční detekce
Do jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky Nunc Maxisorb (kat. č. 437111) bylo naneseno 100 μΐ roztoku protilátky 2G7 o koncentraci 2,5 ng.pl’1 v pufru TBS a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo do jamek naneseno 200 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 18 hodin a 30 minut při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo do jamek přidáno 100 μΐ roztoku standardu rhPSMA o různých známých koncentracích v TBST’, v rozmezí celkových nanášených množství 1 ng až 1 pg. Zahrnuty byly také nulové kontroly bez rhPSMA, vše ve dvou replikátech. Po 2 hodinách a 45 minutách inkubace při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Nakonec bylo do jamek přidáno 100 μΐ roztoku detekční sondy NeuHRP dsbiotPSMA o koncentraci 600 pmol.l'1 v CaSDS. Detekční sonda NeuHRP dsbiotPSMA byla připravena smícháním 6,1 μΐ roztoku neutravidin-HRP konjugátu (Pierce, kat. č. 31001) o koncentraci 1 mg.mr1 s 10 μΐ roztoku biotinylované detekční sondy dsbiotPSMA o koncentraci 10 μιηοΙ.Γ1 (odpovídající čtyřnásobnému molámímu přebytku oproti neutravidin-HRP konjugátu) v pufru TBS. Vzniklý komplex byl po inkubaci přes noc na ledu přečištěn od případného přebytku volné sondy dsbiotPSMA ultrafíltrací na membráně s limitem propustnosti 100 KDa, přičemž původní roztok byl naředěn celkem stonásobně. Výsledná koncentrace detekční sondy v komplexu byla stanovena pomocí qPCR porovnáním s ředící řadou standardu ssPSMA dle popisu v příkladu Id. Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti byl následně obsah jamek vyklepnut a jamky desetkrát promyty 200 μΐ TBST. Do jamek pak bylo přidáno 160 μΐ chemiluminiscenčního substrátu (vodný roztok 4-iodofenolu (Acros Organics; kat. č. 122390100) o koncentraci 2 mmol.l·1; luminolu (5-amino-2,3-dihydro-l,4-phthalazinedion, Sigma Aldrich, kat. č. A8511) o koncentraci 2,5 mmolT1; 3,2% DMSO (obj./obj.); 0,02% (hm./obj.) peroxidu vodíku a 0,1 mol.r' Tris-HCI o pH 8,0) a luminiscence byla v jednotlivých jamkách změřena pomocí čtečky Tecan infinite Ml000.
Dynamický rozsah detekce byl pozorován v rozmezí nanášených množství rhPSMA 1 ng až 1 pg. Limit detekce 1 pg znamená, že jde o citlivější stanoveni než v dnešní době nejcitlivější dostupné stanovení PSMA pomocí ELISA (Sokoloff et al. 2000, Prostate, str. 150-157). Naměřené hodnoty luminiscence z duplikátů měření jsou shrnuty v tabulce 10.
Tabulka 10: Stanovení rhPSMA v roztoku pomocí chemiluminiscenční detekce
množství rhPSMA, pg luminiscence (1), relativní jednotky luminiscence (2), relativní jednotky
0 2071 2011
1 2455 2477
10 17055 16840
100 308210 320440
1000 4059300 4351800
Příklad 2: Detekce HIV-1 proteasy, testování potence inhibitorů HIV-1 proteasy 2a: Příprava inhibitoru HIV-1 proteasy s linkerem a aktivovaným NHS esterem
Byl připraven jak inhibitor s linkerem a navázaným NHS esterem pro připojení na aminoskupinu oligonukleotidu, tak tato sloučenina zreagovaná s etanolaminem. Druhá látka sloužila jako referentní látka pro zjištění vlivu připojení DNA k inhibitoru v inhibičních testech. Obecné poznámky k postupu čištění a charakterizace látek jsou uvedeny v příkladu la.
Ritonavir (RTV, komerční název Norvir; výrobce Abbott laboratories) byl isolován z komerčně dostupných kapslí, ve kterých je RTV rozpuštěný v nepolární olejovité směsi. 50 tablet (100 mg RTV v každé) byly rozřezány a olejovitý obsah byl vytlačen do baňky s kulatým dnem o objemu 2 1. Poté bylo do baňky přidáno 200 ml hexanu spolu s 500 ml diethyletheru. Výsledná suspenze byla triturována, roztírána a dezintegrována ultrazvukem (sonikována) 3 hodiny, dokud se všechna olejovitá hmota nepřeměnila v bílý precipitát nebo se nerozpustila. Tento precipitát byl následně získán filtrací na fritě (S3) a poté znovu triturován a sonikován v čistém diethyletheru. Po další filtraci získaný precipitát představoval čistý RTV. Takto bylo získáno 3,6 g RTV (výtěžek isolace 72 %). Čistota získaného RTV, určená pomocí analytického HPLC, výrazně přesahovala 99 %.
Příprava sloučeniny 5, thiazol-S-ylmethylflžSJS.JSJ-S-amino-S-hydroxy-Ló-diphenylhexan-Z-yljkarbamátu, částečnou hydrolysou RTV: 1,00 g RTV bylo rozpuštěno v 50 ml dioxanu v baňce s kulatým dnem. Poté bylo přidáno 50 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a výsledná směs byla míchána 20 hodin při 65 °C (odlišná teplota a/nebo odlišný čas inkubace vede k odlišným štěpným produktům). Po 20 hodinách byla směs nechána vychladnout na teplotu místnosti. Směs byla dále neutralizována přidáváním K2CO3 dokud nebylo dosaženo bazického pH roztoku. Rozpouštědla byla koncentrována v rotační odparce na přibližně 50 ml, výsledná směs naředěna 150 ml vody a poté třikrát vytřepána 100 ml ethylacetátu (EtOAc). Organická fáze byla vysušena a odpařena. Takto bylo získáno 885 mg surové směsi produktů, která byla použita v dalším kroku bez další purifikace. Přibližná čistota, určena pomocí analytického HPLC, byla 80%.
Pro spektrální analýzy bylo 50 mg produktu vyčištěno pomocí preparativního HPLC (gradient 20-50 % (obj./obj.) ACN během 40 minut, retenční čas produktu 15 minut):
Výsledky analýzy Ή NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 9,06 (d, 4J = 0,8; 1H, N-CH-S); 7,84 (q, V= 0,8; 1H,
S-C-CH-N); 7,81 (bs, 3H, NH3 +); 7,32-7,15 (m, 10H, 2xPh-); 7,20 (bs, 1H, NH); 5,50 (bs, 1H, OH); 5,15 (dd, Jgem = 13,2; 4J = 0,8; O-CH2); 5,11 (dd, 1H, Jgem = 13,2; 4J = 0,8; COO-CH2); 3,69 (m, 1H, HO-CH); 3,67 (m, 1H, HO-CH-CH-NH); 3,50 (bm, 1H, NH3+-CH); 2,87 (dd, 1H, Jgem = 14,0; J= 6,4; NH3 +-CH-CH2Ph); 2,80 (dd, 1H, Jgem = 14,0; J = 7,3; 1H, NH3+-CH-CH2-Ph); 2,79 (dd, 1H, Jgem = 13,7; J = 3,T, 1H, NHCH-CH2-Ph); 2,79 (dd, Jgem = 13,7; J= 10,5; 1H, NH-CH-CH2-Ph); 1,58 (bs, 2H, OH-CH-CH2-CH).
Výsledky analýzy 13C NMR (125,7 MHz, DMSO-d6): δ 155,39 (O-C-N); 155,77 (N-CH-S); 143,23 (S-CCH-N); 139,52 (Ph); 136,37 (Ph); 134,14 (S-C-CH-N); 129,61 (Ph); 129,18 (Ph); 128,81 (Ph); 128,23 (Ph);
127,07 (Ph); 126,12 (Ph); 69,81 (HO-CH); 57,49 (COO-CH2); 56,94 (HO-CH-CH-NH); 50,87 (NH3 +-CH); 38,71 (NH3+-CH-CH2-Ph); 35,69 (NH-CH-CH2-Ph); 34,66 (CH-CH2-CH).
Výsledek analýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C23H28O3N3S [M]+ 426,18459, naměřená hmotnost 426,18454.
Retenční čas produktu při analytickém HPLC byl 17,3 min.
Příprava sloučeniny 6, (S)-1-(((25,4S,5S)-4-hydroxy-l,6-diphenyl-5-(((thiazol-5-ylmethoxy)karbonyl)amino) hexan-2-yl)amino)-3-methyl-l-oxobutan-2-aminium 2,2,2-trifluoroacetátu: 526 mg (1,64 mmol; 1,0 ekv.) TBTU bylo přidáno k 356 mg (1,64 mmol; 1,0 ekv.) BOC-Val rozpuštěného v 1,5 ml DMF s 690 μΐ DIEA (3,94 mmol; 2,4 ekv.). K této směsi byl po 5 minutách míchání přidán najednou surový hydrolysát RTV (700 mg, 1,64 mmol; 1,0 ekv.) rozpuštěný v 1 ml DMF. Reakce byla ponechána přes noc a následně bylo DMF odpařeno. Výsledná směs byla rozpuštěna v 50 ml EtOAc a dvakrát vytřepána nasyceným roztokem NaHCO3, poté dvakrát roztokem 10% (hm./obj.) KHSO4 a nakonec jednou nasyceným roztokem NaCl. Organická fáze pak byla vysušena pomocí síranu hořečnatého a odpařena. Produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografií (TLC analýza: čistý EtOAc, Rf = 0,65). Získaný produkt byl následně rozpuštěn v 5 ml horkého EtOAc, ke kterému pak bylo přidáno 5 ml diethyletheru. Vzniklý gel byl přefiltrován a vysušen, přičemž bylo získáno 250 mg velmi čistého produktu (>99 % dle analytického HPLC). Následně byla odstraněna BOC chránící skupina rozpuštěním v čisté TFA a sonikováním po dobu 10 minut. TFA byla následně odfoukána proudem dusíku, vzniklá olejová hmota byla rozpuštěna ve směsi vody a ACN a následně přelyofilizována pro odstranění zbývající TFA. Celkový výtěžek byl 200 mg, tzn. 25 % hmotn. (nízký výtěžek byl způsoben vyřazením nečistých frakcí při sloupcové chromatografií).
Výsledky analýzy Ή NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ 9,06 (d, 4J = 0,8; 1H, N-CH-S); 8,24 (d, J= 8,2; 1H, -NH-CO); 8,00 (bd, J= 5,2; 3H, -NH3+); 7,85 (q, V = 0,8; 1H, S-C-CH-N); 7,28-7,13 (m, 10H, 2xPh-); 6,94 (d, J= 9,4; 1H, NH-CO-O); 5,12 (d, 4J = 0,8; 2H, O-CH2); 4,16 (m, 1H, CH-NH-CO); 3,78 (m, 1H, CHNH3 +; částečný překryv se signálem vody); 3,58 (td, J = 6,8; J= 2,0; 1H, CH-OH); 3,48 (m, 1H, Ph-CH2CH-NH); 2,72-2,67 (m, 4H, 2xCH-CH2-Ph); 2,00 (m, 1H, CH-(CH3)2); 1,50 (m, 1H, OH-CH-CH2); 1,43 (m, 1H, OH-CH-CH2); 0,89 (d, J = 6,8; 3H, -CH3); 0,84 (d, J= 6,8; 3H, -CH3);
Výsledky analýzy 13C NMR (125,7 MHz, DMSO-d6): δ 167,33 (CO Val); 158,33(q, JC,F = 34,4; CF3COO-); 155,79 (O-C-N); 155,71 (N-CH-S); 143,23 (S-C-CH-N); 139,50 (Ph); 138,55 (Ph); 134,23 (S-C-CH-N); 129,56 (Ph); 129,17 (Ph); 128,30 (Ph); 128,25 (Ph); 126,26 (Ph); 126,09 (Ph); 116,44 (q, Λ·,/ = 294,8; CF3COO’); 68,90 (HO-CH); 57,56 (CO-CH-NH3); 57,44 (COO-CH2); 55,74 (HO-CH-CH-NH); 47,98 (CONH-CH); 39,75 (NH-CH-CH2-Ph); 37,77 (-CH2-CH-CH-); 37,33 (Ph-CH2-CH-NH); 30,04 (CH(CH3)2); 17,26 a 18,69 (2xCH3).
Výsledek analýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C28H37O4N4S [M]+ 525,25300, naměřená hmotnost 525,25292.
Retenční čas produktu při analytickém HPLC byl 17,4 min.
Příprava sloučeniny 7, (5S,6S,<SS,//5)-2,5-dioxopyrrolidin-l-yl,5,8-dibenzyl-6-hydroxy-ll-isopropyl3,10,13-trioxo-l-(thiazol-5-yl)-2,16,19,22,25,28-hexaoxa-4,9,12-triazahentriacontan-31-oátu: 50 mg (78,3 pmol; 1,0 ekv.) NHS-PEG5-NHS (Broadpharm) bylo rozpuštěno v 0,5 ml DMF s 30 μί (172 μπιοί; 2,2 ekv.) DIEA. K reakční směsi bylo postupně během 30 minut přikapáno 46 mg (86,1 pmol; 1,0 ekv.) sloučeniny 6 rozpuštěné v 0,5 ml DMF a poté byla nechána reagovat přes noc. Konverze reakce byla zkontrolována pomocí analytického HPLC a dosahovala téměř 100 %. Směs byla poté odpařena na rotační odparce a surový produkt byl purifíkován pomocí preparativního HPLC (gradient 20-50 % (obj./obj.) ACN během 40 minut, retenční čas produktu 32 minut). Po lyofílizaci bylo získáno 30 mg produktu o čistotě vyšší než 99 % (dle analytického HPLC). Výtěžek představoval 40 % hmotn.
Výsledek analýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C46H63O14N5S [MNa]+ 964,39844, naměřená hmotnost 964,39922.
Retenční čas produktu při analytickém HPLC byl 21,2 min.
Příprava sloučeniny 8, thiazol-5-ylmethyl ((245,2 7S, 29S, 30S)-27-benzyl-1,29-dihydroxy-24-isopropyl4,22,25-trioxo-31-fenyl-7,10,13,16,19-pentaoxa-3,23,26-triazahentriacontan-30-yl)karbamátu: Ke 4 mg (4,25 pmol, 1 ekv.) sloučeniny 7 rozpuštěné v 200 μί DMF byly přidány 3 μί (49,7 pmol, 12 ekv.) ethanolaminu (Sigma) spolu se 7 μί (42,5 pmol, 10 ekv.) DIEA, směs byla ponechána přes noc za stálého míchání. Následně bylo rozpouštědlo odpařeno a zbylá směs byla rozpuštěna ve směsi vody a ACN a třikrát po sobě lyofilizována (pro odstranění zbylého ethanolaminu). Tato sloučenina byla používána pro inhibiční testy bez další purifikace. Jediné znečištění představuje NHS, odhlédnuto od něj byla čistota produktu více než 98%.
Výsledek analýzy HRMS (ESU-): vypočtená hmotnost C44H65O12N5S [MNa]+ 910,42426, naměřená hmotnost 910,42479.
Retenční čas produktu při analytickém HPLC byl 19,0 min.
2b: Příprava detekční sondy pro selektivní vazbu HIV-1 proteasy
Detekční sonda pro kvantifikaci HIV-1 proteasy byla připravena reakcí oligonukleotidu iqPCRamino se sloučeninou 7 v modifikačním pufru: k 10 μί oligonukleotidu v modifikačním pufru (10,2 nmol; 1 ekv.) bylo přidáno 8 μί DMSO a po promíchání byl vzniklý roztok přidán k 2 μί roztoku sloučeniny 7 (205 nmol; 20 ekv.) v bezvodém DMSO. Tato směs byla inkubována 4,5 hod při teplotě místnosti a poté bylo přidáno 480 μί TBS a inkubace pokračovala při stejné teplotě přes noc.
Výsledná detekční sonda (znázorněna na obr. 13) byla od produktů hydrolýzy sloučeniny 7 vyčištěna ultrafiltrací na kolonce Amicon Ultra 0,5 ml 3K, objem retenátu byl devětkrát po sobě desetinásobně naředěn v TBS a koncentrace detekční sondy změřena spektrofotometricky. Takto připravená sonda byla použita pro stanovení inhibiční konstanty v enzymové eseji (dále jen ssHIVl/TBSy, pro charakterizaci pomocí LC-MS byla sonda znovu purifikována na kolonce Amicon Ultra 0,5 ml 3K, přičemž objem retenátu byl znovu pětkrát po sobě desetinásobně naředěn v destilované vodě (dále jen ssHIVl). Pro stanovení koncentrace
HIV-1 proteasy a testování inhibitorů HIV-1 proteasy byla sonda ještě znovu přečištěna ultrafiltrací na kolonce Amicon Ultra 0,5 ml 10K tak, že objem retenátu byl nejprve sedmkrát po sobě desetinásobně naředěn v dvojitě destilované vodě a poté ještě pětkrát po sobě desetinásobně v pufru TBS a koncentrace detekční sondy byla změřena spektrofotometricky (1 OD= 1744 pmol). Nakonec byla sonda naředěna na koncentraci 5 pmol.l·1 v TBS a v objemu 50 μΐ vystavena teplotnímu párování podle postupu popsaného v příkladu lb.
Pro ověření účinnosti konjugace byl vzorek ssHIVl analyzován pomocí LC/ESI-MS, postup byl identický jako u výchozího oligonukleotidu iqPCRamino a detekční sondy ssPSMA (popsáno v příkladu lb). Výsledkem bylo jedno intenzivní absorbční maximum (dále pík) při 260 nm s retenčním časem 5,18 min a dva spojené píky malé intenzity s retenčními časy 4,94 a 4,99 min a odpovídajícími hmotnostmi 17035,34 a 17085,99 (rozdíly hmotností oproti výchozímu oligonukleotidu 53,47 a 104,12). Původní hmota okolo 16981,87 nebyla v m/z spektrech těchto píků zastoupena. Tyto dvě nové hmotnosti byly zastoupeny v malé intenzitě také na začátku a na konci (časy 4,92 a 5,00 min) píku při analýze ssPSMA ale nikoliv v píku původního iqPCR amino. Jedná se tedy pravděpodobně o sůl nebo adukt vytvořený s nečistotou v DMSO, neboť použití tohoto rozpouštědla je jediným společným znakem obou modifikovaných oligonukleotidů, pro rozpuštění původního oligonukleotidu však použito nebylo. K. intenzivnímu píku byla jednoznačně přirazena hmotnost 17809,07 a rozdílem hmotnosti oproti původnímu iqPCR amino 827,20. Nejhojnější předpovězená hmota je 17806,29 při molekulové hmotnosti 17810,29 a předpokládaný rozdíl hmotností konjugátu ssHIVl a výchozího iqPCR amino je přitom 826,38 (dle programu ChemBioDraw). Čistota detekční sondy ssHIVl (konverze reakce) byla dle integrace absorbancí píků při 260 nm ze zmíněné analýzy LC-MS přibližně 80%. Taková konverze je plně dostačující pro další využití a vzorek nebyl dále čištěn.
2c: Stanovení inhibičních konstant připravených součenin a detekční sondy
HIV-1 proteasa používaná v enzymové eseji byla exprimována, refoldována a purifikována dle postupu popsaného v (Kožíšek et al. 2008, Journal of Virology, str. 5869-5878; Weber et al. 2002, Journal of Molecular Biology, str. 739-754). Koncentrace HIV-1 proteasy ve finálním preparátu byla určena pomocí titrace aktivního místa inhibitorem brecanavir, před použitím byl enzym skladován v zamražených alikvotech při -20 °C. Koncentrace ssHIVl/TBS byla určena spektrofotometricky, koncentrace sloučeniny 8 byla odvozena z navážky na analytických vahách.
Inhibiční analýzy byly prováděny s použitím chromogenního peptidového substrátu KARVNle*NphEANleNH2 podle postupu popsaného v (Weber et al. 2002, Journal of Molecular Biology, str. 739-754). Reakce probíhaly v 100 mmol.l·1 acetátu sodném a 300 mmol.l·1 NaCl o pH = 4.7 v celkovém objemu 1 ml. Výsledná koncentrace substrátu byla udržována v blízkosti KM (tzn. 16 pmol.l·1), celkové množství proteasy v reakci bylo 6 až 8 pmol. Do směsi byly přidávány různé koncentrace sloučeniny 8 (rozpuštěné v DMSO) nebo ssHIVl/TBS. Výsledná koncentrace DMSO byla vždy nižší než 2,5% (obj./obj.). Hydrolýza substrátu byla sledována pomocí poklesu absorbance při 305 nm vUV-Vis spektrometru UNICAM UV500 (Thermo Scientific). Data byla následně analyzována využitím rovnice pro kompetitivní inhibici dle Williamse a Morrisona v programu GraFit. Pro sloučeninu 8 byla takto naměřena K, = 2,3 ±0,1 nmolT1, zatímco pro ssHIVl/TBS byla K, = 0,23 ± 0,03 nmolT1.
2d: Detekce HIV-1 proteasy a testování inhibitorů HIV-1 proteasy přímou sorpcí na pevný nosič
V tomto uspořádání byl zásobní roztok purifikované HIV-1 proteasy o koncentraci 244 ng.pl'1 v 10% glycerolu (obj./obj.) naředěn na koncentraci proteasy 10 ng-μΓ1 v TBS a 10 μΐ bylo naneseno na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96; v nulových kontrolách byl do jamek nanesen stejný objem pouze čistého TBS. Po inkubaci 15 minut při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 200 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 1 hodinu při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo přidáno 10 μΐ roztoku detekční sondy ssHIVl ve vodném roztoku 20 mmolT1 MES s 750 mmolT1 NaCl a 0,05% Tween 20 (obj./obj.) o pH 6,0 (dále jen MEST). Po 45 minutách inkubace při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky osmkrát promyty 200 μΐ TBST. Na dno jamky pak bylo přidáno 10 μΐ směsi pro qPCR o stejném složení jako v případě beztemplátové kontroly v příkladu Id a následně bylo stanoveno množství navázané detekční sondy pomocí qPCR stejně jako je popsáno v příkladu Id.
Popsaným postupem bylo změřeno množství navázané detekční sondy v závislosti na koncentraci, v níž byla nanášena a bylo zjištěno, že disociační konstanta sondy je pro imobilizovanou HIV proteasu vyšší než nejvyšší použitá koncentrace sondy, tj. 32 nmolT1. Při použité koncentraci detekční sondy 3,2 nmolT1 byl rozdíl v naměřeném Cq v jamkách nulových kontrol a v jamkách se sorbovanými 100 ng HIV-proteasy přibližně osm cyklů, což odpovídá rozdílu dvou řádů v množství navázané sondy. Ve stejných podmínkách bylo ověřeno, že přidání DMSO v koncentraci 0,1%, 1% ani 10% (obj./obj.) do roztoku sondy neovlivnilo selektivní ani neselektivní vazbu sondy.
Nakonec byly do roztoků detekční sondy nanášených do jamek přidávány různé koncentrace celkem 12 různých inhibitorů HIV-1 proteasy a postupem popsaným v příkladu li byly určeny jejich inhibiční konstanty. Pro výpočet byly použity pouze hodnoty obsazenosti aktivních míst v rozmezí 50 až 99 % a jim odpovídající koncentrace inhibitoru. Pro kvalitativní informaci o síle inhibice testovaných látek stačilo vyzkoušet jedinou, vysokou koncentraci dané látky, nicméně pro kvantitativní informaci bylo vzhledem k dynamickému rozsahu dvou řádů nutné vyzkoušet řadu koncentrací, lišících se navzájem desetinásobně. Získané hodnoty Kt byly nakonec porovnány s referenčními hodnotami Á;ref získanými metodou enzymové kinetiky popsanou v příkladu 2c, přičemž bylo zjištěno, že hodnoty z obou metod spolu velmi dobře korelují, jak je vidět z grafického porovnání výsledků obou metod na obrázku 14; hodnota spolehlivosti R2 lineární úměry mezi K, určenými předkládanou metodu a Kt určenými referenční enzymovou kinetikou byla 0,97.
Přesto jsou v průměru K, naměřené způsobem podle vynálezu podstatně vyšší než Á)ref (v průměru více než desetinásobně), což patrně plyne z odlišného pH obou metod, neboť je známo, že i při stanovení K,ref enzymovou kinetikou v pH 4,7 (v takovém určeny referenční hodnoty) a v pH 6,0 (v takovém určeny hodnoty námi předkládaným způsobem) vede k rozdílným výsledkům. Kref určené v pH 6,0 bývá výrazně vyšší než v pH 4,7, přesně stejně jako bylo pozorováno při porovnání námi určených hodnot. Hodnoty K,ref a naměřené hodnoty Kt ze dvou nezávislých experimentů jsou shrnuty v tabulce 11.
Tabulka 11: Srovnání hodnot Kt inhibitorů, naměřených ve dvou nezávislých pokusech, a příslušných K,ref
Inhibitory HIV PR K, (1), nmol.l'1 K (2), nmol.l'1 K(ref, nmol.l'1
saquinavir 0,61 1,7 0,04
ritonavir 0,16 0,11 0,015
indinavir 1,3 1,5 0,12
amprenavir 0,80 0,44 0,184
lopinavir 0,18 0,41 0,018
atazanavir 0,11 0,18 0,024
tipranavir 1,3 2,9 0,14
darunavir 0,03 0,11 0,0053
brecanavir 0,04 0,05 0,001
látka 37 600 380 116
látka 38 neurčeno 110 10
látka 39 40 neurčeno 0,3
Kt (1) a Kj (2) značí inhibiční konstanty určené postupně ve dvou nezávislých pokusech (pH 6,0), Kref pak referenční hodnotu získanou enzymovou kinetikou (pH 4,7).
2e: Detekce HIV-1 proteasy a testování jejích inhibitorů vazbou na imobilizovanou protilátku
V dalším uspořádání bylo na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96 naneseno 10 μΐ roztoku polyklonální protilátky vázající HIV-1 proteasu (MyBiosource, MBS536030) v koncentraci 5 ng.pl’1 v TBS a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 45 minut. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 200 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 3 hodiny při teplotě místnosti, poté byl obsah jamek vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Následně bylo na dno jamek naneseno 10 μΐ roztoku purifikované HIV-1 proteasy o různých koncentracích v TBST. Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo přidáno 10 μΐ roztoku detekční sondy ssHIVl v TBST. Další postup byl shodný jako v příkladu 2d.
Popsaným postupem bylo zjištěno, že rozsah detekce zahrnoval při nanesení detekční sondy v koncentraci 10 nmol.l'1 rozmezí 100 ng až 1 ng HIV-1 proteasy, přičemž ACq mezi jamkami se 100 ng proteasy a bez ní byl devět cyklů. Bylo také zjištěno, že přidáním kaseinového blokačního činidla do roztoku detekční sondy ve finálním ředění dvoutisícinásobně se ACq mezi jamkami se 100 ng proteasy a bez ní zvýší na dvanáct cyklů, což odpovídá tisícinásobnému rozdílu v navázané sondě; pro další stanovení byla tedy sonda ředěna v TBST pufru s přídavkem kaseinového blokačního činidla. V případě, že byl místo roztoku detekční sondy použit roztok výchozího oligonukleotidu bez ligandové části iqPCR amino, nebyla ani při nanášeném množství 100 ng HIV-1 proteasy pozorována žádná vazba, což potvrzuje selektivitu vazby detekční sondy prostřednictvím ligandové části. Zmíněným postupem byl také vyzkoušen vliv rozpouštědel přidaných do roztoku detekční sondy, při finálních koncentracích 0,1%, 1% a 10% (obj./obj.) neměl ani DMSO, ani acetonitril či metanol vliv na vazbu detekční sondy, ať už selektivní na proteasu nebo neselektivní na povrch bez proteasy.
Nakonec byly do roztoků detekční sondy nanášených do jamek přidávány různé koncentrace celkem 12 různých inhibitorů HIV-1 proteasy a postupem popsaným v příkladu li určeny jejich inhibiční konstanty. (Použity pouze hodnoty obsazenosti aktivních míst v rozmezí 50 až 99,9 % a jim odpovídající koncentrace inhibitoru). Pro kontrolu správnosti testování bylo postupně přidáno ve vysoké koncentraci (1 mmol.T1) několik látek, které HIV-1 proteasu neinhibují, žádná z nich však nevedla k poklesu množství navázané detekční sondy, tj. nebyly pozorovány falešně postitivní výsledky. Pro kvalitativní informaci o síle inhibice testovaných látek postačila jediná vysoká koncentrace dané látky, nicméně pro kvantitativní informaci bylo vzhledem k dynamickému rozsahu stanovení dva až tři řády nutné vyzkoušet řadu koncentrací, lišících se navzájem desetinásobně. Získané hodnoty Kt byly porovnány s referenčními hodnotami K,ref získanými metodou enzymové kinetiky popsanou v příkladu 2c, přičemž bylo zjištěno, že hodnoty z obou metod velmi dobře korelují, jak je zjevné z grafického porovnání výsledků obou metod na obrázku 15; hodnota spolehlivosti R2 lineární úměry mezi K, určenými předkládanou metodu a Kt určenými referenční enzymovou kinetikou byla 1,00.
Přesto jsou v průměru Kj naměřené způsobem podle vynálezu podstatně vyšší než Á,ref (v průměru více než stonásobně), což patrně plyne z odlišného pH obou metod, jak již bylo diskutováno v příkladu 2d. V tomto případě je rozdíl v pH v enzymové kinetice (4,7) a v našem způsobu (7,4) zásadní; odpovídající rozdíl v koncentraci H3O+ iontů je téměř tři rády. Tento rozdíl může být příčinou stonásobné odlišnosti naměřených hodnot. pH 4,7 se přitom v enzymové kinetice používá z praktických důvodů, neboť v takovém pH je HIV proteasa nej aktivnější, zatímco v pH 7,4 je její aktivita příliš malá pro praktické měření a je tak obtížné určit hodnoty Á,ref v pH 7,4. V tomto ohledu přináší naše metoda vylepšení, neboť měření při fyziologickém pH je zřejmě bližší biologickému kontextu klinického nasazení inhibitorů HIV proteasy. Hodnoty ^,ref a naměřené hodnoty X, jsou shrnuty v tabulce 12.
Tabulka 12: Srovnání naměřených hodnot Kt inhibitorů a příslušných Á,ref
Inhibitory HIV-1 PR Ki, nmol.I'1 Á',ref, nmol.!'1
saquinavir 1,1 0,04
ritonavir 3,0 0,015
indinavir 8,7 0,12
amprenavir 3,5 0,184
lopinavir 1,3 0,018
atazanavir 1,4 0,024
tipranavir 14 0,14
darunavir 0,44 0,0053
brecanavir 0,41 0,001
látka 37 neurčeno 116
látka 38 830 10
látka 39 19 0,3
K, značí určené inhibiční konstanty (pH 7,4), X,ref pak referenční hodnotu získanou enzymovou kinetikou (pH 4,7).
Příklad 3: Detekce karbonických anhydras II a IX a testování jejich inhibitorů
3a: Příprava společného inhibitoru karbonických anhydras II a IX a jeho NHS esteru.
Obecné poznámky k postupu čištění a charakterizace látek jsou uvedeny v příkladu la.
Příprava sloučeniny 9, methyl 4-(4-((/erc-butoxykarbonyl)amino)butoxy)benzoátu: k roztoku 161 mg (1,06 mmol; 1,0 ekv.) methyl 4-hydroxybenzoátu, 300 mg (1,59 mmol; 1,5 ekv.) íerc-butyl (4hydroxybutyl)karbamátu a 400 mg (1,59 mmol; 1,5 ekv.) trifenylfosfmu v 10 ml THF bylo najednou přidáno 312 μΐ (1,59 mmol; 1,5 ekv.) DIAD a směs byla míchána přes noc. Rozpouštědlo z reakční směsi pak bylo odpařeno a surový produkt byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (TLC analýza: He:EtOAc 4:1; Rf = 0,25; methyl-4-hydroxybenzoát má identické Rf jako produkt, proto byl použit nadbytek ostatních reaktantů). Bylo získáno 260 mg bílého prášku, což odpovídá 75% výtěžku.
Výsledky analýzy Ή NMR (400 MHz, CDC13) δ 7,95 (d, J = 8,9 Hz, 2H); 6,87 (d, J = 8,9 Hz, 2H); 4,71 (s, 1H); 3,99 (t, J= 6,2 Hz, 2H); 3,85 (s, 3H); 3,17 (dd, 7= 12,8; 6,3 Hz, 2H); 1,86 - 1,75 (m, 2H); 1,69 - 1,61 (m, 2H); 1,42 (s, 9H).
Výsledky analýzy 13C NMR (101 MHz, CDC13) δ 166,92 (s); 162,78 (s); 156,10 (s); 131,64 (s); 122,57 (s); 114,12 (s); 79,20 (s); 67,73 (s); 51,89 (s); 40,29 (s); 28,49 (s); 26,86 (s); 26,49 (s).
Výsledek analýzy MS (ESU-): vypočtená hmotnost C17H25O5N [MNa]+ 346,17; naměřená 346,2.
Příprava sloučeniny 10; 4-(4-((terc-butoxykarbonyl)amino)butoxy)benzoové kyseliny: 270 mg sloučeniny 9 bylo rozpuštěno v 5 ml metanolu a poté bylo přidáno 5 ml 5 mol.l'1 NaOH. Směs byla refluxována dokud se pomocí TLC analýzy neprokázalo úplné vymizení sloučeniny 9 (6 hodin). Poté byla reakční směs naředěna 20 ml EtOAc, vodná fáze byla okyselena 10% (hm./obj.) KHSO4 až do kyselého pH a dvakrát extrahována do ml EtOAc. 240 mg olejovitého produktu se změnilo v bílý krystalický po odstranění zbytků rozpouštědla vysokým vakuem (95% výtěžek).
Výsledek analýzy ’H NMR (400 MHz, CDC13) δ 8,03 (d, J= 8,9 Hz, 2H); 6,91 (d, 9,0 Hz, 2H); 4,65 (s,
1H); 4,04 (t, J = 6,2 Hz, 2H); 3,27-3,20 (m, 2H); 1,91 - 1,78 (m, 2H); 1,69 (dd, J= 14,8; 7,2 Hz, 2H); 1,44 (s, 9H).
Výsledek analýzy 13C NMR (101 MHz, CDC13) δ 171,51 (s); 163,46 (s); 156,20 (s); 132,42 (s); 121,92 (s); 114,28 (s); 79,42 (s); 67,86 (s); 40,36 (s); 28,56 (s); 26,89 (s); 26,53 (s).
Výsledek analýzy MS (ESI-): vypočtená hmotnost Cié^OsN [M]' 308,16; naměřená 308,2.
Příprava sloučeniny 11, terc-butyl (4-(4-(3-(4-sulfamoylfenyl)ureido)fenoxy)butyl)karbamátu: 720 mg (2,33 mmol; 1,0 ekv.) sloučeniny 10 bylo rozpuštěno v 15 ml bezvodého toluenu a přidáno 810 μΐ (4,65 mmol; 2,0 ekv.) DIEA. Ktomu bylo najednou přidáno 552 μΐ DPPA (2,56 mmol; 1,1 ekv.) a výsledná směs byla zahřáta na 90 °C a ponechána dvě hodiny při této teplotě. Rozpouštědlo pak bylo odpařeno a reakční směs rozpuštěna v bezvodém acetonitrilu; následně bylo jednorázově přidáno 601 mg (3,49 mmol; 1,5 ekv.) sulfanilamidu. Směs byla poté zahřáta na 60 °C a ponechána za stálého míchání přes noc. Všechny těkavé látky byly po 12 hodinách odpařeny a surový produkt byl purifikován sloupcovou chromatografií na silikagelu (TLC analýza: He: EtOAc; 2:5; RF = 0,25). Bylo získáno 340 mg produktu s 30% výtěžkem.
Výsledky analýzy ’H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8,98 (s, 1H); 8,59 (s, 1H); 7,71 (d, J= 8,8 Hz, 2H); 7,59 (d, J = 8,9 Hz, 2H); 7,34 (d, J= 9,0 Hz, 2H); 7,20 (s, 2H); 6,91 - 6,81 (m, 3H); 3,91 (t, J = 6,4 Hz, 2H); 2,96 (dd, J= 12,9; 6,7 Hz, 2H); 1,71 - 1,61 (m, 2H); 1,51 (dt, J= 13,1; 6,5 Hz, 2H); 1,37 (s, 9H).
Výsledky analýzy 13C NMR (101 MHz; DMSO) δ 155,37 (s); 154,02 (s); 152,16 (s); 142,99 (s); 136,40 (s); 132,04 (s); 126,61 (s); 120,14 (s); 117,12 (s); 114,50 (s); 77,06 (s); 67,05 (s); 40,35 (překryv špikem rozpouštědla) 27,77 (s); 26,85 (s); 25,73 (s).
Výsledek analýzy MS (ESI+): vypočtená hmotnost C22H30O6N4S [MNa]+ 501,17; naměřená 501,2.
Příprava sloučeniny 12; 4-(4-(3-(4-sulfamoylfenyl)ureido)fenoxy)butan-l-aminium 2,2,2-trifluoroacetátu: k 500 mg sloučeniny 11 byl přidán 1 ml TFA a reakční směs byla střídavě sonikována a míchána po dobu 15 minut. TFA byla poté odfoukána proudem dusíku a získaný produkt byl použit v dalších krocích bez purifikace a charakterizace. Bylo získáno 502 mg čistého produktu s více než 95% výtěžkem.
Příprava sloučeniny 13; 2,5-dioxopyrrolidin-l-yl 19-oxo-24-(4-(3-(4-sulfamoylfenyl)ureido)fenoxy)4,7,10,13,16-pentaoxa-20-azatetracosan-l-oátu: 33 mg (67 pmol; 1,0 ekv.) sloučeniny 12 bylo přidáváno po dobu 1 hodiny do roztoku bisNHS-PEG5 (36 mg; 1,0 ekv.; 67 pmol; Broadpharm) a DIEA (22 μΐ; 2,5 ekv.; 168 pmol) v 1 ml DMF. Reakční směs byla míchána 3 hodiny a poté byly odpařeny všechny těkavé látky. Výsledný produkt byl purifikován pomocí preparativní HPLC (gradient: 15 %-50 % (obj./obj.) ACN za 40 min, RT = 30 min). Bylo získáné 15 mg produktu ve více než 99% čistotě, což odpovídá 28% výtěžku.
Výsledek analýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C^HjoOmNsS [MH]+ 796,30695; naměřená 796,30678. Retenční čas při analytickém HPLC byl 18,7 min.
Příprava sloučeniny 14; 18-oxo-23-(4-(3-(4-sulfamoylfenyl)ureido)fenoxy)-3,6,9,12,15-pentaoxa-19azatricosan-l-aminium 2,2,2-trifluoroacetátu: 46 mg (112 pmol; 1,0 ekv.) Boc-PEG5-COOH bylo spolu s 36 mg (112 pmol; 1,0 ekv.) TBTU a 49 μΐ (279 μπιοί; 2,5 ekv.) DIEA rozpuštěno v 0,5 ml DMF. Do této směsi bylo přidáno 55 mg (112 pmol; 1 ekv.) sloučeniny 12 a ponecháno za stálého míchání přes noc. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno a surový produkt rozpuštěn v 10 ml EtOAc. Organická fáze byla dvakrát promyta nasyceným roztokem bikarbonátu sodného, 2x 10% (hm./obj.) roztokem hydrogensíranu draselného a předsušena jedním promytím nasyceným roztokem chloridu sodného. Poté byla organická fáze vysušena síranem hořečnatým a odpařena. Takto bylo získáno 53 mg, ke kterým byl přidán 1 ml TFA a směs byla střídavě míchána a sonikována po dobu 15 minut. TFA byla poté odfoukána proudem dusíku a produkt byl purifikován pomocí preparativní HPLC (gradient: 10 %-50 % (obj./obj.) ACN za 40 min, RT = 22 min). Takto bylo získáno 17 mg produktu, což odpovídá 31% výtěžku.
Výsledek analýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C30H48O10N5S [MH]+ 670,31164; naměřená 670,31164. Retenční čas při analytickém HPLC byl 16,5 min.
3b: Příprava detekční sondy pro selektivní vazbu karbonických anhydras
Detekční sonda pro selektivní vazbu karbonických anhydras byla připravena reakcí oligonukleotidu iqPCRamino a sloučeniny 13 v modifikaěním pufru: k 10 μΐ oligonukleotidu v modifikačním pufru (8,2 nmol, 1 ekv.) byly nejprve přidány 2 μΐ vodného roztoku 1 mol.l'1 HEPES o pH 8,0. Po promíchání bylo přidáno 8,2 μί roztoku sloučeniny 13 o koncentraci 50 mmol.l·1 v bezvodém DMSO (410 nmol, 50 ekv.) a znovu promícháno. Nakonec bylo ke směsi ještě přidáno 5 μί bezvodého DMSO a po promíchání inkubováno přes noc při teplotě místnosti. Poté byla směs naředěna v 900 μί vodného roztoku 0,1 mmol.l'1 HEPES o pH 8,0 a inkubována další den při teplotě místnosti.
Výsledná detekční sonda (dále jen ssCA, obr. 13) byla od produktů hydrolýzy sloučeniny 13 vyčištěna ultrafiltrací na Amicon Ultra 0,5 ml 10K, objem retenátu obsahující sondu byl pětkrát po sobě desetinásobně naředěn v dvojitě destilované vodě a poté pětkrát po sobě desetinásobně naředěn v TBS. Koncentrace sondy ssCA pak byla určena spektrofotometricky (1 OD = 1744 pmol).
Vzorek ssCA byl analyzován pomocí LC/ESI-MS metody na stroji Agilent 6230 TOF LC/MS stejným způsobem jako je popsáno v příkladu lb, pouze jako mobilní fáze byl místo HFIP s TEA použit 0,05% (hm./obj.) vodný roztok octanu amonného. Výsledkem analýzy byl majoritní absorbční pík při 260 nm s retenčním časem 5,14 min a odpovídající hmotností 17663,28, přičemž předpovězená molekulová hmotnost je 17663,86. Rozdíl naměřených hmotností ssCA a výchozího iqPCR amino je 681,40 oproti předpokládanému rozdílu 680,30. Čistota produktu byla přibližně 80%.
Pro použití při detekci karbonických anhydras a testování jejich inhibitorů byl připraven komplex neutravidinu s detekční sondou, Neu dsbiotCA·. nejprve bylo 750 pmol sondy ssCA spolu s 500 pmol iqPCR amino naředěno v 50 μί TBS a teplotně zpárováno dle postupu v příkladu lb; 10 μί vzniklého roztoku bylo smícháno se 3 μΐ neutravidinu o koncentraci 1 mg.ml·1 a po promíchání inkubováno nejprve 3 hodiny při teplotě místnosti a poté přes noc na ledu. Vzniklý komplex NeudsbiotCA byl přečištěn ultrafiltrací na Amicon Ultra 0,5 ml 100K, objem retenátu obsahující komplex byl dvakrát po sobě desetinásobně naředěn v TBS. Výsledná koncentrace detekční sondy v komplexu byla stanovena pomocí qPCR porovnáním s ředící řadou standardu ssPSMA dle popisu v příkladu Id.
3c: Detekce CA-II a testování inhibitorů CA-II
Purifikovaný standard lidské karbonické anhydrasy II byl objednán od firmy Sigma-Aldrich (kat. č. C6165). Po rozpuštění lyofilizovaného proteinu v dvojitě destilované vodě byl protein naředěn v TBS na finální koncentrace v rozmezí 10 ng.pl·1 až 10 pg.pl·1 a 10 μΐ těchto roztoků bylo naneseno na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96; u kontrol bylo do jamek nanesenolO μΐ čistého TBS. Po inkubaci 40 minut při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 100 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 2 hodiny při teplotě místnosti. Obsah jamek byl následně vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo přidáno 10 μΐ roztoku detekční sondy Neu dsbiotCA o koncentraci 1 nmol.l'1 v roztoku 20 mmol.l·1 Tris, 200 mmol.l·1 NaCl a 0,05% Tween 20 (obj./obj.) o pH = 7,4 (dále jen pufr TBST200) s přidaným, výsledně tisícinásobně naředěným kaseinovým blokátorem. Další postup byl stejný jako v příkladu 2d.
Popsaným postupem bylo možné detekovat jak 100 ng proteinu CA-II (JC9 oproti nulové kontrole = 9 cyklů), tak 10 ng (ACq oproti nulové kontrole = 5 cyklů). Bylo také zjištěno, že přidání DMSO do výsledné koncentrace 1% (obj./obj.) v roztoku nanášené sondy nevedlo ke změně selektivní vazby detekční sondy na imobilizovaný protein CA-II, ani neselektivní vazby na povrch v nulové kontrole. Nakonec bylo do roztoků detekční sondy nanášených do jamek přidáno postupně 12 různých známých inhibitorů CA-II ve výsledné koncentraci 100 pmol.l·1. Tím bylo naším způsobem kvalitativně ověřeno, že všech 12 látek inhibuje CA-II, tzn., že u všech testovaných inhibitorů byl pozorovatelný pokles navázané detekční sondy.
3d: Detekce CA-IX a testování inhibitorů CA-IX
Na dno jamek 96 jamkové destičky FrameStar 480/96 bylo naneseno 10 μΐ roztoku purifikované protilátky M75 (Zavada et al. 2000, British Journal of Cancer, str. 1808-1813) v koncentraci 10 ng.pl·1 v TBS a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 75 minut. Obsah jamek byl poté vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBS. Poté bylo na dno jamek naneseno 100 μΐ v TBS pětkrát naředěného kaseinového blokačního činidla a inkubováno 2 hodiny při teplotě místnosti, poté byl obsah jamek vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Následně bylo na dno jamek naneseno 10 μΐ roztoku purifikované karbonické anhydrasy IX v různých koncentracích v TBST200. Použitý konstrukt obsahující katalytickou doménu a PG doménu karbonické anhydrasy IX (aminokyseliny 55 až 390, dále nazýván CA-IX s PG) byl připraven rekombinantní expresí v hmyzích S2 buňkách a vyčištěn dle popisu v (Mader 2010, disertační práce, Karlova univerzita v Praze). Po dvouhodinové inkubaci při teplotě místnosti byl obsah jamek vyklepnut a jamky třikrát promyty 200 μΐ TBST. Poté bylo přidáno 10 μΐ roztoku detekční sondy Neu dsbiotCA v různé koncentraci v TBST200 s přidaným, výsledně dvoutisícinásobně naředěným, kaseinovým blokátorem. Další postup byl stejný jako v příkladu 2d.
Popsaným postupem bylo nejprve po nanesení 1 ng CA-IX sPG do jamky změřeno množství navázané detekční sondy v závislosti na její koncentraci a bylo zjištěno, že disociační konstanta sondy je výrazně vyšší než nejvyšší použitá koncentrace sondy, tj. 50 nmol.l·1. Dále, při použité koncentraci detekční sondy 5 nmol.l·1 byl rozdíl v naměřené Cq v jamkách nulových kontrol a v jamkách s 1 ng CA-IX s PG přibližně deset cyklů, což odpovídá rozdílu více než dvou řádů v množství navázané sondy. Dynamický rozsah stanovení CA-IX s PG byl za stejných podmínek 50 pg až 1 ng, viz tabulka 13. Stejným způsobem bylo ověřeno, že přidání DMSO do roztoku detekční sondy v koncentracích 0,1% až 10% (obj./obj.) nijak neovlivní selektivní či neselektivní vazbu sondy.
Tabulka 13: Dynamický rozsah stanovení CA-IX s PG
Množství v ng G(D Ce(2)
10 10,32 10,21
3,2 9,95 10,03
1,0 10,61 10,33
0,50 11,40 11,25
0,25 12,31 12,26
0,10 15,69 15,51
0,05 18,71 18,24
0,025 18,10 19,74
0,010 20,35 19,86
0,005 20,55 20,36
žádné 20,92 20,70
Nakonec byly do roztoků detekční sondy nanášených do jamek přidávány různé koncentrace celkem 12 různých inhibitorů CA-IX (stejné sloučeniny byly testovány i pro CA-II výše) a postupem popsaným v příkladu li určeny jejich inhibiční konstanty; pro výpočet byly použily pouze hodnoty obsazenosti aktivních míst v rozmezí 40 až 99,5 % a jim odpovídající koncentrace inhibitoru. Pro kvalitativní informaci o síle inhibice testovaných látek postačilo vyzkoušet jedinou vysokou koncentraci dané látky (100 pmol.l·1). Pro kvantitativní informaci bylo vzhledem k dynamickému rozsahu stanovení dva až tři řády nutné vyzkoušet řadu koncentrací, lišících se navzájem desetinásobně, přičemž v rozsahu metody byla vždy u dvou až tří po sobě následujících ředěních inhibitoru naměřena prakticky shodná hodnota Kt. Získané hodnoty K, byly nakonec porovnány s referenčními hodnotami K(ref získanými pomocí enzymové kinetiky. Hodnoty získané oběma způsoby jsou shrnuty v tabulce 14, enzymovou kinetikou bylo také určeno, že K,ref sloučeniny 13, tj.
samotné ligandové části detekční sondy, je přibližně 400 nmol.l'1. Jak je patrné z tabulky i grafického porovnání výsledků obou metod na obrázku 16, tak spolu hodnoty určené oběma metodami velmi dobře korelovaly a dokonce se shodovaly i v absolutní hodnotě, hodnota spolehlivosti R2 lineární úměry mezi Kt určenými předkládanou metodu a K,ref určenými referenční enzymovou kinetikou byla 0,96.
Pouze u několika látek byl pozorován výraznější rozdíl mezi Kt a K,ref (pěti až desetinásobný), přesný důvod těchto odlišností není jasný. Může plynout jak z chyb stanovení v jedné či druhé metodě, ale může plynout také ze zásadních odlišností obou stanovení. Nejprve, enzymová kinetika byla měřena s konstruktem CA-IX bez PG domény, která obsahuje velké množství nabitých aminokyselin, a s bodovou mutaci N346D zamezující N-glykosylaci na tomto místě; příprava a purifikace tohoto konstruktu stejně jako stanovení E,ref je popsáno v (Brynda et al. 2013, Angewandte Chemie-Intemational Edition, str. 13760-13763). Lze předpokládat, že absence strukturní domény, stejně jako bodové mutace mohou ovlivnit vlastnosti karbonické anhydrasy a tím vést k rozdílným výsledkům. Navíc, stanovení enzymovou kinetikou je založené na měření změny pH reakce v důsledku katalýzy CA-IX z počátečních deseti na výsledných sedm pomocí pH indikátoru. Ke změně pH přitom dojde při sycení CO2 i bez aktivity enzymu, takže se neměří afinita inhibitoru při definovaném pH, ale spíše průměr afinity přes rozmezí pH 10 až 7. Naproti tomu, při námi předkládaném způsobu se afinita inhibitoru (testované látky) měří při definovaném pH 7,4, které se v průběhu měření nemění, což velmi pravděpodobně může být důvodem odlišných hodnot určených Kt.
Tabulka 14: Srovnání K, inhibitorů CA-IX s příslušnými hodnotami K,ref
název Kt stanovené, pmol.T1 E,ref. pmol.T1
CB4 0,50 0,06
CB5 0,12 0,026
CB7 130 161
CB8 3,6 0,43
CB10 50 90,7
CB12 8,1 32,7
CB19 0,22 1,2
CB20 0,077 0,23
CB21 6,8 6,5
CB31 0,0022 0,0016
Příklad 4: Univerzální detekční sonda pro selektivní vazbu do aktivních míst aspartátových proteas
4a: Příprava NHS esteru pepstatinu
Obecné poznámky k postupu čištění a charakterizace látek jsou uvedeny v příkladu la.
Příprava sloučeniny 15 (NHS-PEG5-pepstatin); (2/S,24S,27S,2SS,32S,35S,365)-1-((2,5-dioxopyrrolidin-lyl)oxy)-28,36-dihydroxy-27,35-diisobutyl-21,24-diisopropyl-32-methyl-l,19,22,25,30,33-hexaoxo4,7,10,13,16-pentaoxa-20,23,26,31,34-pentaazaoctatriacontan-38-ové kyseliny: pepstatinový inhibitor byl připraven standardní peptidovou syntézou na pevné fázi za použití 2-chlortritylové pryskyřice (Iris-Biotech). První aminokyselina (Fmoc-Sta-OH) byla na pevnou fázi připojena podle pokynů výrobce; pryskyřice byla ponechána reagovat s Fmoc-Sta-OH (0,6 ekv. vůči substituci pryskyřice) v přítomnosti 4 ekvivalentů DIEA po dobu 2 hodin v 5 ml dichlormethanu (DCM). Zbylé aktivní skupiny byly neutralizovány směsí DCM/MeOH/DIEA (17:2:1) po dobu 15 minut. Všechny další aminokyseliny byly přidány pomocí HOBt/DIC metody. Výsledný peptid byl z pevné fáze uvolněn 95% TFA (2,5% voda; 2,5% triisopropyl silan, vše obj./obj.) a surový produkt byl použit v dalším kroku bez purifikace (čistota peptidu byla po odštěpení z pryskyřice více než 95%).
mg (33 pmol; 1,1 ekv.) bis-PEG5-NHS esteru (Broadpharm) bylo spolu s 25 μΐ (165 pmol; 5,0 ekv.) DIEA rozpuštěno v 0,25 ml DMF. Poté bylo za stálého míchání roztoku během 1 hodiny pomalu přikapáno 20 mg (30 pmol; 1,0 ekv.) peptidu rozpuštěného v 0,5 ml DMF a směs ponechána reagovat 3 hodiny. Těkavé látky byly poté odpařeny a výsledný produkt purifikován pomocí preparativní HPLC (gradient: 15 %-50 % (obj./obj.) ACN za 40 min, RT = 31 min). Bylo získáno 10 mg produktu ve více než 99% čistotě, což odpovídá 33% výtěžku.
Výsledek analýzy HRMS (ESI-): vypočtená hmotnost C47H810i8N6 [M]‘ 1017,56128; naměřená 1017,56079. Retenční čas produktu při analytické HPLC byl 19,5 min.
4b: Příprava detekční sondy pro selektivní vazbu aspartátových proteas
Detekční sonda pro selektivní vazbu asparátových proteas byla připravena reakcí oligonukleotidu iqPCR amino a sloučeniny 15 v modifikačním pufru: k 20 μΐ oligonukleotidu v modifikačním pufru (16,3 nmol, 1 ekv.) bylo nejprve přidáno 4 μΐ vodného roztoku 1 mol.l·1 HEPES o pH 8,0. Po promíchání bylo přidáno 16,3 μΐ roztoku sloučeniny 15 o koncentraci 20 mmol.l·1 v bezvodém DMSO (326 nmol, 20 ekv.) a znovu promícháno. Nakonec bylo ke směsi ještě přidáno 15 μΐ DMSO a po promíchání byla směs inkubována přes noc při teplotě místnosti.
Výsledná detekční sonda (dále jen ssAP, obr. 13) byla od produktů hydrolýzy sloučeniny 15 vyčištěna ultrafíltrací na Amicon Ultra 0,5 ml 10K, reakční směs byla před nanesením na kolonku naředěna do 1 ml v dvojitě destilované vodě a objem retenátu obsahující sondu byl poté během ultrafiltrace desetkrát po sobě desetinásobně naředěn v dvojitě destilované vodě. Koncentrace sondy ssAP byla určena spektrofotometricky (1 OD = 1744 pmol).
Vzorek ssAP byl analyzován pomocí LC/ESI-MS metody na stroji Agilent 6230 TOF LC/MS stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 3b, pouze gradient ACN byl 5-60 % (obj./obj.) za 6 min. Výsledkem analýzy byl majoritní absorbční pík při 260 nm s retenčním časem 4,54 min a odpovídající hmotností 17887,10 (předpovězená molekulová hmotnost je 17887,20). Rozdíl naměřených hmotností ssAP a výchozího iqPCR amino byl 905,23 oproti předpokládanému rozdílu 904,20. Čistota produktu byla více než 95%.
4c: Stanovení inhibiční potence připravené detekční sondy pro lidský Katepsin D
Inhibiční potence detekční sondy ssAP k lidskému katepsinu D byla stanovena pomocí enzymové kinetiky. Postup byl obdobný, jako je popsáno v (Masa et al. 2006, Biochemistry, str. 15474-15482), katepsin D byl připraven dle postupu v (Fušek et al. 1992, Journal of Molecular Biology, str. 555-557). Do jamek na 96 jamkové bílé destičce s kónickým dnem (NUNC V96) bylo postupně přidáno 93,5 μΐ acetátového pufru o pH 4,0 (lOOmM CH3COONa a 300mM NaCl), 0,5 μΐ roztoku katepsinu D a 1 μΐ roztoku detekční sondy o známé koncentraci. Těsně před měřením bylo přidáno 5 μΐ roztoku fluorogenního substrátu (Abz-Lys-Pro-Ala-GluPhe-Nph-Ala-Leu; Abz, aminobenzoová kyselina; Nph, 4-nitrofenylalanin) o koncentraci 40 μπιοΙ.Γ1 ve 2% (obj./obj.) DMSO a rychlost štěpení substrátu byla následně pozorována pomocí čtečky Tecan infinite Ml000 (při excitaci 330 nm a měřené emisi 410 nm). Ze závislosti poměru v,/v0 na koncentraci detekční sondy byla určena hodnota IC50 na přibližně 1 nmol.l'1. Taková afinita sondy je dostatečná pro velmi citlivou detekci katepsinu D.
Příklad 5: Detekční sonda pro selektivní vazbu do aktivních míst chřipkových neuraminidas. 5a: Příprava selektivního inhibitoru chřipkových neuraminidas s připojenou azidovou skupinou Sloučenina 17; l-(6-Azidohexyl)-l-methyl-(3R,4R,5S)-4-acetylamino-5-N-terc-butoxykarbonyl-amino-3-(lethylpropoxy)-l-cyklohexen-l-fosfonátu; byla připravena analogicky postupu popsanému v (Carbain 2010, Disertační práce, University of Sussex).
Příprava sloučeniny 18; 1 -(6-Azidohexy 1)-(3R,4R, 5 S)-4-acetylamino-5-N-terc-butoxykarbonyl-amino-3 -(1 ethylpropoxy)-l-cyklohexen-l-fosfonátu: směs diastereomerů sloučeniny 17 (0,068 g; 0,12 mmol) byla rozpuštěna ve 4 ml v suchého THF a do tohoto roztoku byl přidán thiofenol (0,05 ml; 0,66 mmol) a triethylamin (0,15 ml; 1,08 mmol). Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti dva dny, poté byl znovu přidán thiofenol (0,05 ml; 0,66 mmol) a triethylamin (0,15 ml; 1,08 mmol). Druhý den byla reakční směs zakoncentrována na rotační vakuové odparce a rozdělena sloupcovou chromatografií (silikagel; eluent ethylacetát:metanol/3:l až 1:2). Bylo získáno 0,042 g demethylovaného produktu.
Výsledek anlýzy HRMS (ESI-): vypočtená hmotnost C24H43O7N5P 544,2906; naměřená 544,2902.
Příprava sloučeniny 19; l-(6-Azidohexyl)-(3R,4R,5S)-4-acetylamino-5-amino-3-(l-ethylpropoxy)-lcyklohexen-l-fosfonátu: sloučenina 18 (0,04 g; 0,073 mmol) byla rozpuštěna v 3 ml trifluoroctové kyseliny a po dvou hodinách míchání při teplotě místnosti byla reakční směs odpařena do sucha a odparek byl přečištěn preparativním HPLC na reverzní koloně (stacionární fáze: C-18 modifikovaný silikagel; mobilní fáze acetonitril/voda s 0,1% (obj./obj.) trifluorocové kyseliny). Bylo získáno 0,02 g finálního produktu.
Výsledek anlýzy HRMS (ESI+): vypočtená hmotnost C19H37O5N5P 446,2527; naměřená 446,2527.
5b: Příprava detekční sondy chřipkových neuraminidas
Příprava oligonukleotidů s dibenzylcyklooktynovou skupinou (dále jen ssAD): k oligonukleotidů iqPCRamino (20,2 nmol; 1 ekv.) rozpuštěnému v 48 μΐ dvojitě destilované vody bylo nejprve přidáno 50 μΐ 2x koncentrovaného modifikačního pufru. Poté bylo přidáno 50,4 μΐ NHS-esteru dibenzylcyklooktynu (Sigma, kat. č. 761524) o koncentraci 20 mmol.r1 (1,008 pmol; 50 ekv.) v bezvodém DMSO a promícháno. Protože byla pozorována precipitace, bylo následně přidáno dalších 70 μΐ DMSO a promícháno. Po inkubaci dva dny při teplotě místnosti byl vzniklý modifikovaný oligonukleotid (ssAD) přečištěn ultrafiltrací na kolonce Amicon Ultra 0,5 ml 10K, reakční směs byla před nanesením na kolonku naředěna do 1 ml v dvojitě destilované vodě a poté byl během ultrafiltrace objem retenátu desetkrát po sobě desetinásobně naředěn v dvojitě destilované vodě. Koncentrace oligonukleotidů v retenátu byla určena spektrofotometricky (1 OD = 1744 pmol). Vzorek produktu byl analyzován pomocí LC/ESI-MS metody na stroji Agilent 6230 TOF LC/MS způsobem popsaným v příkladu 4b. Výsledkem analýzy byl absorbční pík při 260 nm s retenčním časem 4,47 min s odpovídající hmotností 17269,75, hmotnost výchozího iqPCR amnino nebyla nalezena, z čehož vyplývá úplná konverze reakce. Rozdíl naměřených hmotností ssAD a výchozího iqPCR aminojc 278,88 oproti předpokládanému rozdílu 287,40.
Příprava detekční sondy chřipkových neuraminidas (dále jen ssADNA: obr. 13): k oligonukleotidů ssAD (3,0 nmol; 1 ekv.) rozpuštěnému v 7,3 μΐ dvojitě destilované vody bylo nejprve přidáno 8,8 μΐ 2x koncentrovaného modifikačního pufru. Po promíchání bylo přidáno 1,5 μΐ roztoku sloučeniny 19 o koncentraci 20 mmol.r1 (30 nmol; 10 ekv.) v bezvodém DMSO a znovu promícháno. Po inkubaci tři dny při teplotě místnosti byla vzniklá detekční sonda ssAD_NA přečištěna ultrafiltrací na kolonce Amicon Ultra 0,5 ml 10K, reakční směs byla před nanesením na kolonku naředěna do 1 ml v dvojitě destilované vodě a poté byl během ultrafiltrace objem retenátu desetkrát po sobě desetinásobně naředěn v dvojitě destilované vodě. Koncentrace sondy v retenátu byla určena spektrofotometricky (1 OD = 1744 pmol). Vzorek sondy byl analyzován pomocí LC/ESI-MS metody na stroji Agilent 6230 TOF LC/MS způsobem popsaným v příkladu 4b. Výsledkem analýzy byl absorbční pík při 260 nm s retenčním časem 4,73 min s odpovídající hmotností 17715,25, hmotnost výchozího ssAD nebyla nalezena, z čehož vyplývá úplná konverze reakce. Rozdíl naměřených hmotností ssAD_NA a výchozího ssAD je 445,50 oproti předpokládanému rozdílu 445,50.
5c: Stanovení inhibiční konstanty připravené detekční sondy
Testovaná Neuraminidasa typu NI pocházela z pandemického viru A/Califomia/07/2009 (GenBank CY121682). Kódující sekvence katalytické domény (aminokyseliny 82-469) byla nasyntetizována firmou Genscript, překlenována do pMT BiP vektoru, výsledný konstrukt obsahoval kromě signálního peptidu N-koncový Avi-tag a thrombinové štěpné místo pro odštěpení tágu. Neuraminidasa byla exprimována v hmyzích S2 buňkách, sekretovaný protein byl z media SF900 (komerčně dostupné médium firmy Invitrogen, USA) purifikován srážením síranem ammonným. Rozpustná frakce vzniklá padesátiprocentním nasycením síranem byla předialyzována do 50 mmol.l'1 Tris, 150 mmol.r1 NaCl o pH 8,0; zakoncentrována a rozdělena gelovou permeační chromatografií na koloně Superdex 200. Frakce s neuraminidasovou katalytickou aktivitou byly spojeny, byl k nim přidán roztok chloridu vápenatého na finální koncentraci 10 mmol.l’1 a Thrombin-Agarosa (Sigma-Aldrich, USA), a směs byla inkubována 12 hodin při 4 °C. Tato směs byla poté dělena pomocí gelové permeační chromatografie na koloně Superdex 75. Frakce obsahující aktivní Neuraminidasu bez Avi-tagu (určeno podle SDS polyakrylamidové elektroforézy a Western Blotu) byly zamraženy pro kinetické experimenty.
Enzymová aktivita neuraminidasy byla měřena pomocí fluorimetrické eseje s použitím fluorescenčního substrátu 2'-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminové kyseliny (4-MUNANA) v 100 mmol.l’1 MES, 150 mmol.l’1 NaCl, 10 mmolT1 CaCl2 o pH 6,15. Výsledné koncentrace v reakční směsi byly: neuraminidasy 16 nmol.l’1, substrátu 4-MUNANA 500 μιηοΙ.Γ1 (při KM = 1,1 mmolT1) a DMSO 2% (obj./obj.). Štěpení substrátu bylo sledováno při excitačních a emisních vlnových délkách 7CXC = 365 nm a/<m = 450 nm na čtečce Tecan Infinite Ml000, reakce byla inkubována 20 minut při 37 °C a poté zastavena přidáním roztoku uhličitanu sodného na finální koncentraci 0,5 mol.1’1. Hodnoty zdánlivých K, a K, byly získány vyhodnocením poměrů rychlostí inhibovaných a neinhibovaných reakcí vt/v0 dle Williamse a Morrisona.
Naměřené K, klinicky používaného oseltamiviru bylo 24 nmolT1 (± 4 nmol.l'1), K, sloučeniny 19 bylo 24 nmol.l'1 (±5 nmol.l'1) aKl detekční sondy ssAD_NA bylo 0,79 nmol.l'1 (± 0,09 nmol.l'1). Zdálnivá Kt pro sloučeninu 19 a detekční sondu ssAD_NA byla stanovena také ve fyziologickém pH 7,4 v 100 mmol.l'1 Tris, 150 mmol.l’1 NaCl, 10 mmol.l'1 CaCl2; Ký sloučeniny 19 bylo přibližně 40 nmol.l'1, zatímco sondy ssAD_NA přibližně 2 nmol.l'1. Připojením oligonukleotidu ke sloučenině 19 se tedy získala látka s přinejmenším dvacetinásobně vyšší afinitou k neuraminidase v porovnání jak se sloučeninou 19, tak s Oseltamivirem.
Průmyslová využitelnost
Popsaný způsob nabízí široké uplatnění v medicině. Vzhledem k výjimečné citlivosti v řádu pouze několika desítek molekul poskytuje možnost stanovení proteinových markérů v krvi v dosud neměřitelném množství (například PSA po operaci prostaty).
Nadto lze díky sondě vázající se do aktivního místa analytu měřit sílu vazby dalších testovaných látek do stejného aktivního místa. Ve spojení s velkým dynamickým rozsahem umožňuje zde uvedený způsob stanovit hodnotu inhibiční konstanty těchto testovaných látek z pouze jediného měření a za použití jediné koncentrace testované látky. Vzhledem k velké citlivosti a selektivitě metody postaěí pouze minimální množství analytu obsažený v biologické matrici, např. krvi nebo buněčném ěi tkáňovém lysátu.

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů, vyznačující setím, že zahrnuje kroky, v nichž:
    a. se na povrch pevného nosiče imobilizuje analyt nebo skupina analytů ze vzorku nespecifickou nekovalentní adsorpcí, nebo kovalentní vazbou zvolených povrchových funkčních skupin analytu a odpovídajících funkčních skupin na pevném nosiči;
    b. pevný nosič s takto imobilizovaným analytem či skupinou analytů se inkubuje s detekční sondou, která se prostřednictvím sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu selektivně naváže na analyt či skupinu analytů; přičemž se tato sonda skládá ze
    - sloučeniny pro selektivní vazbu do aktivního místa analytu;
    - oligonukleotidové značky, případně s kovalentně připojeným fluoroforem, haptenem či chemickou skupinou a;
    - chemického linkeru, kovalentně spojujícího sloučeninu pro selektivní vazbu a oligonukleotidovou značku;
    c. poté se pevný nosič promyje k odstranění nenavázané detekční sondy;
    d. nakonec se stanoví množství navázané detekční sondy, přičemž toto množství je přímo úměrné množství daného analytu či skupiny analytů v testovaném vzorku.
  2. 2. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároku 1,vyznačující setím, že analyt nebo skupina analytů ze vzorku se imobilizuje v kroku a) prostřednictvím na povrch pevného nosiče předem navázané molekuly, schopné během inkubace se vzorkem selektivně vázat v něm obsažený analyt či skupinu analytů; následující další kroky b) až d) způsobu jsou stejné jako v nároku 1.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že před krokem a) se testovaný vzorek obsahující analyt nebo skupinu analytů nejprve inkubuje s detekční sondou a způsob pokračuje kroky c) a d).
  4. 4. Způsob podle nároku laž3,vyznačující setím, že v kroku inkubace detekční sondy s analytem, ať imobilizovaným na pevném nosiči nebo přítomným v testovaném vzorku, se přidá v různé koncentraci testovaná látka potenciálně se vázající do aktivního místa, či směs takových látek.
  5. 5. Způsob podle nároku 1 až 4, v y z n a č u j í c í s e t í m, že se navázaná detekční sonda před vlastním stanovením, tedy mezi krokem c) a d), uvolní z vazby na imobilizovaný analyt vymytím a poté se stanoví její koncentrace ve vymývacím roztoku.
  6. 6. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároku 1 až 5,vyznačující setím, že analyt je zvolen ze skupiny, zahrnující enzym nebo skupinu enzymů přičemž sloučeninou pro selektivní vazbu do aktivního místa je selektivní inhibitor tohoto enzymu nebo skupiny enzymů; receptor nebo skupinu receptorů přičemž sloučeninou pro selektivní vazbu do aktivního místa je selektivní agonista nebo antagonista daného receptorů či skupiny receptorů; a přenašeč nebo skupinu přenašečů kdy sloučeninou pro selektivní vazbu do aktivního místa je látka schopná selektivní vazby daného přenašeče nebo skupiny přenašečů v místě vazby přenášených molekul;
    oligonukleotidová značka je jednovláknová či dvouvláknová DNA, přičemž na jedno nebo obě vlákna oligonukleotidové značky je případně na definovaném místě pomocí dalšího chemického linkeru kovalentně připojena jedna nebo více modifikujících skupin zvolených ze skupiny, zahrnující fluorofor, hapten, nebo reaktivní chemickou skupinu;
    haptenem je biotin;
    testovanou látkou je látka potenciálně se vázající do aktivního místa analytu a detekční sonda případně zahrnuje i konjugát detekční sondy jak je popsána v nároku 1, sestávající ze čtyř molekul sondy s připojeným biotinem, a avidinu, neutravidinu či streptavidinu, na který jsou případně kovalentně připojeny fluorofory nebo enzymy.
  7. 7. Způsob podle nároků 1 až 6, vyznačující se t í m, že množství navázané detekční sondy se stanoví pomocí kvantitativní polymerasové řetězové reakce.
  8. 8. Způsob podle nároků 1 až 6, v y z n a č u j í c í se t í m, že množství navázané detekční sondy se stanoví fluorescenčně nebo pomocí spřažené enzymové reakce spektrofotomericky či chemiluminiscenčně.
  9. 9. Způsob podle nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že v kroku inkubace detekční sondy s pevným nosičem, popřípadě v kroku inkubace vzorku s pevným nosičem, se přidá do inkubovaného roztoku přídavná látka, zvolená ze skupiny, zahrnující iontové detergenty, neiontové detergenty, kasein a zněj připravená kaseinová blokační činidla, sérové albuminy, DNA, či immunoglobuliny.
  10. 10. Způsob podle nároků 2 až 6, v y z n a č u j í c í s e t í m, že molekula schopná selektivně vázat analyt ze vzorku, se zvolí ze skupiny, zahrnující protilátky či jejich fragmenty, proteinové molekuly mimikující protilátky jako jsou affibodies, antikaliny či DARPiny, a dále lektiny, avidin, neutravidin, streptavidin, oligopeptidy a chelatační činidla.
  11. 11. Způsob podle nároků 2 až 6, vyznačující se tím, že v kroku (a) se selektivní navázání sledovaného analytu nebo skupiny analytů na molekulu imobilizovanou na pevném nosiči uskuteční prostřednictvím haptenu, biotinu, univerzálního epitopu, afinitního nebo purifikačního tágu, který se na sledovaný analyt nebo skupinu analytů kovalentně připojí.
  12. 12. Způsob podle nároků 2až 6, vyznačující setím, že se jako vzorek se použije komplexní biologická matrice, případně obsahující interferující protilátky, zvolená ze skupiny, zahrnující krev, krevní plasmu, krevní sérum, mozkomíšní mok, moč, bakteriální, kvasinkový, tkáňový nebo buněčný lysát, zabydlené bakteriální, kvasinkové nebo buněčné kultivační medium, synoviální tekutinu, plodovou vodu, ascites, pleurální tekutinu, perikardiální tekutinu, extrakt stolice, sliny, pot a semennou plasmu.
  13. 13. Způsob stanovení síly vazby testované látky do aktivního místa analytu podle nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že z rozdílu množství navázané detekční sondy po inkubaci bez testované látky a po inkubaci s pouze jedinou koncentrací testované látky se určí hodnota vazebné konstanty pro vazbu této látky do aktivního místa analytu, která v případě, že analytem je enzym, odpovídá inhibiční konstantě.
  14. 14. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároků lažl3,vyznačující se tím, že analytem je lidský prostatický specifický membránový antigen, známý též jako glutamátkarboxypeptidasa II, a sloučeninou pro selektivní vazbu je inhibitor lidského prostatického specifického membránového antigenu.
  15. 15. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že analytem je lidský prostatický specifický antigen a sloučeninou pro selektivní vazbu je inhibitor lidského prostatického specifického antigenu.
  16. 16. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároků 1 až 13, v y z n a č u j í c í se t í m, že analytem je lidská glutamátkarboxypeptidasa III a sloučeninou pro selektivní vazbu je inhibitor lidské glutamátkarboxypeptidasy III.
  17. 17. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že analytem je lidská karbonická anhydrasa IX a sloučeninou pro selektivní vazbu je inhibitor lidské karbonické anhydrasy IX.
  18. 18. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že analytem je chřipková neuraminidasa a sloučeninou pro selektivní vazbu je inhibitor chřipkové neuraminidasy.
  19. 19. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároků 1 až 13, vyznačující setím, že analytem je lidský fíbroblast-aktivující protein a sloučeninou pro selektivní vazbu je inhibitor lidského fibroblastaktivujícího proteinu.
  20. 20. Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti testovaných látek vázat se do aktivních míst těchto analytů podle nároků lažl 3, vyznačující se tím, že analytem je lidská dipeptidylpeptidasa 4 a sloučeninou pro selektivní vazbu je inhibitor lidské dipeptidylpeptidasy 4.
CZ2014-527A 2014-08-05 2014-08-05 Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů CZ2014527A3 (cs)

Priority Applications (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2014-527A CZ2014527A3 (cs) 2014-08-05 2014-08-05 Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů
ES17184901T ES2773056T3 (es) 2014-08-05 2015-08-04 Método de detección de formas activas de analito
CA2957286A CA2957286C (en) 2014-08-05 2015-08-04 Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites
PCT/CZ2015/000084 WO2016019929A2 (en) 2014-08-05 2015-08-04 Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites
EP15767081.1A EP3177931B1 (en) 2014-08-05 2015-08-04 Method of determination of the ability of substances to bind to analyte active sites
DK15767081.1T DK3177931T3 (da) 2014-08-05 2015-08-04 Fremgangsmåde til bestemmelse af stoffers evne til at binde til analytaktive steder
UAA201701964A UA119466C2 (uk) 2014-08-05 2015-08-04 Спосіб виявлення активних форм аналіту та визначення здатності речовин зв'язуватися з активними центрами аналіту
SG11201700589YA SG11201700589YA (en) 2014-08-05 2015-08-04 Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites
AU2015299447A AU2015299447B2 (en) 2014-08-05 2015-08-04 Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites
CA3006186A CA3006186C (en) 2014-08-05 2015-08-04 Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites
EP17184901.1A EP3264091B1 (en) 2014-08-05 2015-08-04 Method of detection of analyte active forms
US15/500,970 US10718772B2 (en) 2014-08-05 2015-08-04 Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites
JP2017506677A JP6462851B2 (ja) 2014-08-05 2015-08-04 分析物の活性型の検出および分析物の活性部位に結合する、物質の能力の決定の、方法
IL25043417A IL250434B (en) 2014-08-05 2017-02-05 A method for identifying active forms of an analyte and determining the ability of substances to bind with active sites of an analyte
AU2018202250A AU2018202250B2 (en) 2014-08-05 2018-03-29 Method of detection of analyte active forms and determination of the ability of substances to bind into analyte active sites
JP2018245748A JP6677793B2 (ja) 2014-08-05 2018-12-27 分析物の活性型の検出および分析物の活性部位に結合する、物質の能力の決定の、方法
IL26571219A IL265712B (en) 2014-08-05 2019-03-28 A method for identifying active forms of an analyte and determining the ability of substances to bind with active sites of an analyte

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2014-527A CZ2014527A3 (cs) 2014-08-05 2014-08-05 Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2014527A3 true CZ2014527A3 (cs) 2016-02-17

Family

ID=54151039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2014-527A CZ2014527A3 (cs) 2014-08-05 2014-08-05 Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů

Country Status (12)

Country Link
US (1) US10718772B2 (cs)
EP (2) EP3264091B1 (cs)
JP (2) JP6462851B2 (cs)
AU (2) AU2015299447B2 (cs)
CA (2) CA2957286C (cs)
CZ (1) CZ2014527A3 (cs)
DK (1) DK3177931T3 (cs)
ES (1) ES2773056T3 (cs)
IL (2) IL250434B (cs)
SG (1) SG11201700589YA (cs)
UA (1) UA119466C2 (cs)
WO (1) WO2016019929A2 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10114014B2 (en) 2015-01-14 2018-10-30 Ustav Organicke Chemie A Biochemie Av Cr, V.V.I. Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11208527B2 (en) 2016-04-15 2021-12-28 Beckman Coulter, Inc. Photoactive macromolecules and uses thereof
CN110736736B (zh) * 2018-07-18 2022-10-14 上海索昕生物科技有限公司 一种均相化学发光poct检测方法及利用该检测方法的装置
BR102019025989A2 (pt) 2018-12-14 2020-06-23 Beckman Coulter, Inc. Modificação de corantes poliméricos e aplicações
AU2022216619A1 (en) 2021-02-05 2023-09-07 Beckman Coulter, Inc. Compositions and methods for preventing non-specific interactions between polymer dyes-antibody conjugates
WO2023056460A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Beckman Coulter, Inc. Water-soluble tetrahydropyrene based fluorescent polymers
CN115524481A (zh) * 2022-09-30 2022-12-27 南京岚煜生物科技有限公司 通过荧光免疫层析检测技术测定单克隆抗体亲和力的方法
CN115414703B (zh) * 2022-11-03 2023-01-17 百力格生物科技(上海)股份有限公司 染料修饰后的核酸探针纯化方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05149949A (ja) 1991-11-26 1993-06-15 Nisshin Flour Milling Co Ltd 新規な微量物質測定法
CA2129444A1 (en) 1992-02-04 1993-08-05 Richard C. Ebersole Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
JPH06235727A (ja) * 1993-02-10 1994-08-23 Canon Inc バイオ情報変換素子及びそれを用いた生物種検出方法
ATE196911T1 (de) 1993-06-10 2000-10-15 Abbott Lab Haptene, tracer, immunogene und antikörper für 3- phenyl-1-adamantanessigsäuren
JPH08178922A (ja) * 1994-12-22 1996-07-12 Sekisui Chem Co Ltd 低分子化合物の定量方法
US5770176A (en) 1995-12-08 1998-06-23 Chiron Diagnostics Corporation Assays for functional nuclear receptors
KR19990087449A (ko) * 1996-03-01 1999-12-27 리차드 웨드레이 인플루엔자 바이러스의 검출방법 및 이에 이용되는 화합물
JP3910798B2 (ja) * 1998-10-23 2007-04-25 インスティトゥート オブ ヴァイロロジー Ｍｎ遺伝子およびタンパク質
DE10041766A1 (de) * 2000-08-25 2002-03-14 Friz Biochem Gmbh Verfahren zur Markierung chemischer Substanzen
WO2003031591A2 (en) * 2001-10-10 2003-04-17 Superarray Bioscience Corporation Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
DE10200374A1 (de) * 2002-01-08 2003-07-24 Friz Biochem Gmbh Verfahren zur qualitativ und quantitativ vergleichenden Detektion chemischer Substanzen
WO2003083435A2 (en) * 2002-03-29 2003-10-09 Nugen Technologies, Inc. Single primer isothermal nucleic acid amplification-enhanced analyte detection and quantification
JP2005257641A (ja) * 2004-03-15 2005-09-22 Geneticlab Co Ltd Ｒｎａポリメラーゼを用いて複数の蛋白質を同時に検出する方法
US20090163371A1 (en) * 2005-05-31 2009-06-25 Stern Andrew M Anchor-Assisted Fragment Selection and Directed Assembly
EP1898899A4 (en) * 2005-07-05 2009-07-29 Tufts College ALPHA PROTEIN INHIBITORS FOR FIBROBLAST ACTIVATION
US20080085508A1 (en) * 2006-05-11 2008-04-10 Nanosphere, Inc. Non-nucleic acid based biobarcode assay for detection of biological materials
WO2009012220A2 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 Agilent Technologies Inc. Analyte detection assays
US8309306B2 (en) * 2008-11-12 2012-11-13 Nodality, Inc. Detection composition
ATE523603T1 (de) 2008-11-21 2011-09-15 Chimera Biotec Gmbh Konjugatkomplexe zum analytnachweis
US9687572B2 (en) 2010-12-06 2017-06-27 Molecular Insight Pharmaceuticals, Inc. PSMA-targeted dendrimers

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10114014B2 (en) 2015-01-14 2018-10-30 Ustav Organicke Chemie A Biochemie Av Cr, V.V.I. Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018202250B2 (en) 2019-12-19
IL250434A0 (en) 2017-03-30
IL265712A (en) 2019-05-30
JP6462851B2 (ja) 2019-01-30
EP3264091B1 (en) 2019-11-13
ES2773056T3 (es) 2020-07-09
CA3006186A1 (en) 2016-02-11
US20170219583A1 (en) 2017-08-03
CA2957286A1 (en) 2016-02-11
AU2015299447A1 (en) 2017-02-16
WO2016019929A3 (en) 2016-03-31
IL265712B (en) 2019-10-31
EP3264091A1 (en) 2018-01-03
AU2018202250A1 (en) 2018-04-26
CA3006186C (en) 2019-07-30
EP3177931B1 (en) 2019-05-01
IL250434B (en) 2019-11-28
JP6677793B2 (ja) 2020-04-08
EP3177931A2 (en) 2017-06-14
JP2017524133A (ja) 2017-08-24
JP2019068838A (ja) 2019-05-09
CA2957286C (en) 2019-08-06
AU2015299447B2 (en) 2018-04-26
SG11201700589YA (en) 2017-02-27
UA119466C2 (uk) 2019-06-25
DK3177931T3 (da) 2019-07-08
US10718772B2 (en) 2020-07-21
WO2016019929A2 (en) 2016-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2014527A3 (cs) Způsob detekce aktivní formy analytů ve vzorku a stanovení schopnosti dalších látek vázat se do aktivních míst těchto analytů
Eneroth et al. Evaluation of a vincristine resistant Caco-2 cell line for use in a calcein AM extrusion screening assay for P-glycoprotein interaction
Franke et al. Targeting heat-shock-protein 90 (Hsp90) by natural products: geldanamycin, a show case in cancer therapy
ES2320431T3 (es) Compuestos de captura, colecciones de los mismos y metodos para analizar el proteoma y composiciones complejas.
US9279805B2 (en) Small molecule-dependent split aptamer ligation
WO2009155420A1 (en) Multi-ligand capture agents and related compositions, methods and systems
CZ308807B6 (cs) Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk
Hattori et al. Multiplex bead binding assays using off-the-shelf components and common flow cytometers
CN106714908A (zh) 原位自组装的毒性rna抑制剂
US20220389486A1 (en) Probe assay for the detection of biomolecules
JP6770750B2 (ja) チロシンホスファターゼ及びチロシンキナーゼ活性の測定方法
US20170276671A1 (en) Receptor linked regenerated cellulose membrane and methods for producing and using the same
van Ameijde et al. Real‐Time Monitoring of the Dephosphorylating Activity of Protein Tyrosine Phosphatases Using Microarrays with 3‐Nitrophosphotyrosine Substrates
JP2007516973A (ja) 金属イオン介在性蛍光スーパークエンチングアッセイ、キット及び試薬
EP4239335A1 (en) Biomolecule structure detection probe, biomolecule structure detection kit, and method for detecting biomolecule structure
Cermakova et al. Sensitive quantification of fibroblast activation protein and high-throughput screening for inhibition by FDA-approved compounds
WO2022099216A1 (en) Systems and methods for high throughput screening of molecular interactions
Unger-Angel Developing fluorescent molecular sensors for detecting protein isoforms and glycoforms in their native environments
Geurink et al. A Small-Molecule Activity-Based Probe for Monitoring UCHL1 Activity in Live Cells and Zebrafish Embryos
WO2004089295A2 (en) Homogeneous and heterogeneous assay methods using nucleation centers and novel covalent chemistries for the rapid measurement of phosphorylation and de-phosphorylation