CZ2013240A3 - Způsob biodegradační sanace znečištěné zeminy - Google Patents

Abstract

Způsob biodegradační sanace znečištěné zeminy inokulací mikrobiálního preparátu obsahujícího alespoň jeden alochtonní mikroorganismus, zejména alespoň jeden bakteriální kmen ze skupiny pseudomonas fluorescens, pseudomonas veronii, acinetobacter calcoaceticus, pseudomonas putida, pseudomonas stutzeri, arthrobacter protophormiae, bacillus megaterium, psychobacter sp., spočívá v tom, že v prvním kroku se mikrobiální preparát inokuluje do znečištěné zeminy, kde probíhá jeho kultivace přirozeným rozmnožováním. Ve druhém kroku se inokulovaná zemina alespoň jednou smíchá s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou v hmotnostním poměru v rozmezí od 1:20 do 1:100. Následně probíhá kultivace populace mikrobiálního preparátu v celém objemu směsi.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu biodegradační sanace znečištěné zeminy, konkrétně inokulace mikrobiálním preparátem do sanované zeminy. Vynález spadá do oblasti sanačních prací, kdy se snižuje koncentrace organického polutantu v zemině biologickými procesy in situ nebo ex situ.

Dosavadní stav techniky

Bioremediace je technologie odstraňování polutantů, která využívá biologického systému k úplnému rozkladu nebo transformaci různých nežádoucích chemických sloučenin na látky méně nebezpečné. Konečnými produkty efektivní bioremediace jsou látky netoxické, které již nejsou nebezpečím pro životní prostředí ani živé organismy, v ideálním případě na CO2 a vodu. Bioremediaci lze využít pro čištění odpadních a podzemních vod, půdy, plynů a kalů.

Současné přístupy k procesu bioremediace jsou následující:

- monitorování přirozeného biodegradačního procesu, provádění modifikace prostředí, ve kterém k biologickému procesu dochází (přídavek nutrientů, aerace apod.), přídavek mikroorganismů (tzv. bioaugmentace).

Bioremediace se provádí technologiemi, ve kterých se degradace polutantu provádí přímo v místě kontaminace (in situ), tedy půda není odtěžována a kontaminovaná spodní voda není pumpována na povrch. Tyto technologie vyžadují relativně nízké náklady, jsou však pomalejší a průběh degradace polutantu je jen těžce kontrolovatelný. Jiné technologie jsou aplikovány na odtěžený kontaminovaný materiál v místě často vzdáleném od původní lokality (ex situ). Manipulací s kontaminovaným materiálem sice vzrůstají náklady, ale celý degradační proces je pod kontrolou a veškerá rizika dalšího znečištění jsou minimalizována.

Současný bioremediační sanační trend se zabývá především intenzifikací činnosti autochtonní/alochtonní mikroflóry ve formě hledání vhodných substrátů, formou aplikace substrátu (zasakování, reakční bariery se zakotveným mikrobiálním činitelem), zlepšení dostupnosti sorbovaného polutantu pomocí detergentů, samotný výběr mikrobiálních kmenů a jejich genetická modifikace a další.

V současné době se běžně používá níže uvedený technologický postup inokulace a aplikace mikrobiálního preparátu na sanovanou zeminu, zejména v okruhu biodegradačních sanací. Postupuje se krokovým namnožením kultur v kapalném médiu v kultivačních reaktorech do potřebného objemu kapalného inokula k sanované zemině.

Podrobnější technologický postup je následující. Čisté výchozí bakteriální kmeny jsou uchovávány buď v lyofílizované formě, nebo na agarových plotnách. Je možné vycházet z firemní sbírky mikroorganismů schválené státním zdravotním ústavem nebo si požadované kmeny zakoupit v komerční sbírce mikroorganismů. Vybrané bakteriální kmeny jsou kvalifikovaným pracovníkem namnoženy nej častěji v minerálních či peptonových médiích. Z důvodu zachování degradačních vlastností mikrobiálních kmenů bývají růstová média obohacena typem cíleného kontaminantu, např. nafta, fenol.

Na přípravu mikrobiálního preparátu/inokula se nejčastěji používá sekvenční submersní kultivace ve vsádkových reaktorech (v laboratorním měřítku se jedná o kultivační baňky, reakční lahve apod., dále pak biorcaktory, fermentory), kdy se postupně zvyšuje objem daného média (scale up). Bioreaktory je nezbytné udržovat v čistotě. Vnitřek bioreaktoru se myje tlakovou vodou. V případě silného znečištění se čistí mechanicky vhodným detergentem a kartáčem. Vždy následuje důkladné omytí čistou vodou. Před napuštěním vymytého bioreaktoru technologickou vodou se zkontroluje její pH. V případě, že hodnota pH je nižší než 6, nebo vyšší než 9, je nutné vodu neutralizovat přídavkem hydroxidu nebo roztokem kyseliny.

Dalším nezbytným krokem pro zachování sterilního prostředí je sterilizace celého objemu reaktoru včetně připraveného živného média, které obsahuje dostatečný zdroj C, P, N a ostatních minerálů. Obecně je možná chemická sterilizace, kdy se nej častěji používají prostředky na bázi chloru. Odstranění chloru se provádí thiosírenem sodným. Úspěšné provedení zákroku se kontroluje zkumavkovým testem s o-toulidinem do vymizení reakce na chlornan. V průmyslovém měřítku se dále používá sterilace ohřevem do 100°C, popřípadě sterilizace vlhkou parou za teploty 121°C a tlaku 101,5 kPa. Sterilizace fermentoru se provádí před každou kultivací preparátu. V závislosti na typu sterilizace a přidávaných růstových substrátů se sterilizace provádí před nebo po přídavku substrátu.

Všechny tyto dílčí kroky představují časově i investičně náročné operace, včetně kontrolních a nápravných opatření, jejichž výsledek je často ovlivněn i lidským faktorem. Minimalizace či úplná eliminace těchto kroků tak znamená optimalizaci celého procesu. Po namnožení v malém laboratorním fermentoru je inokulum následně naředěno v poměru 1:100 a přeneseno do velkých bioreaktorů, kde probíhá příprava biopreparátu za stejných podmínek.

v/

Biopreparát se v bioreaktorů kultivuje nejméně 24 h^d| při 25 a 30 °C za neustálého intenzivního provzdušňování. Po ukončení kultivace se do sterilní nádobky odebere vzorek a doručí se co nejdříve do laboratoře, kde je provedena mikrobiologická kontrola. Koncentrace takto narostlé mikrobiální populace dosahuje hodnot řádově 10⁸ až 10⁹ kolonií v 1 mililitru inokula (stanovení heterotrofních kultivovatelných bakterií).

Aplikace připraveného média na biodegradační plochu se provádí několika známými způsoby. V zásadě se na kontaminované pole aplikuje kapalný bakteriální preparát o dávkování zhruba 10 1 na 1 tunu kontaminované zeminy, což představuje mnohdy nutnost přípravy/přepravy/aplikace mikrobiálního preparátu v objemech desítek až stovek m .

Aplikace za použití stabilního rozvodu napojeného přímo na fermentor se provádí napojením rozprašovacích trysek na výstupy ze stabilního rozvodu biopreparátu. V případě nedostatečného dosahu jednotlivých trysek pro aplikaci na celé ploše, jsou na přípojná místa připojeny požární hadice „C“ a postřik je prováděn proudnicí s jemným rozstřikem. Další možností je použití cisternového vozu, požárního či podobného vozidla. Vždy je nutné dodržovat čisté a sterilní prostředí v zásobních nádobách. Pro aplikaci je používáno čerpadlo o dostatečném výkonu a tlaku. Aplikace je prováděna pomocí požární hadice s připojenou proudnicí a vyžaduje práci minimálně jednoho technika. Po aplikaci biopreparátu je nutné vyčistit zásobní nádoby včetně hadic, potrubí apod.

V současné době je způsob rozmnožení mikrobiálních kmenů v kapalném médiu závislá především na aktuálních podmínkách jednotlivých biodegradačních lokalit, kde je nej výhodnější mít bioreaktory v místě aplikace a pomocí potrubí daný biopreparát rozstříkat. Bohužel v praxi tato situace není automatická a je třeba začlenit krok kultivace na technologicky vybaveném místě s následným nákladným převozem a rozstříkání biopreparátu, především při aplikaci in situ.

Z podstaty pomalé biologické degradace bývají sanační práce dlouhodobého charakteru a proces inokulace musí být prováděn z pravidla 1 x za měsíc podle mikrobiologických a chemických analýz v časovém horizontu měsíců až roků podle typu polutantu. Napěstování a rozsev alochtonních kmenů tak představuje technologicky významnou část.

Dokument WO 2011/1^1291 popisuje způsob dekontaminace pevných matric vnesením externího pevného nosiče s imobilizovanými mikrobiálními degradéry nebo nosiče impregnovaného kapalinou usnadňující biodegradační proces (např. zdroj nutrietů). Tento nosič je po stanovenou dobu ponechán v kontaktu s kontaminovanou matricí a následně vyjmut.

Výhody v současné době používaných technologických postupů metody inokulace spočívají v tom, že je možné přesné vedení optimálních podmínek růstu zanášené mikrobiální kultury před aplikací biopreparátu do celého objemu sanované zeminy (temperace optimální teploty, pH, složení růstového média, aseptické prostředí).

Nevýhody současných známých postupů jsou následující:

Při rozsáhlých bioremediačních sanačních pracích je nutné připravit kapalné inokulum v objemu řádově desítek až stovek m³ v bioreaktorech. Tento technologický krok se pojí s nezanedbatelnou spotřebou elektrické energie (temperace teploty během kultivace na 25^30^0, aerace), lidské práce (čištění zařízení, příprava médií, sterilace, inokulace, monitoring kultivace), časovou náročností (scale up do potřebného objemu), velká spotřeba primárních mikrobiálních substrátů, technologické vody, chemikálií na sterilaci procesu, apod.

Převoz a aplikace mikrobiálního preparátu na sanovanou lokalitu, který je taktéž spojen se zajištěním cisteren, hasicích vozů, požárních hadic, potrubních zařízení apod., pojící se na spotřebu pohonných hmot, přítomnost technika a pravidelné čištění veškeré techniky.

. V případě kultivací náročných čistých kultur v objemech řádově jednotek až desítek m³ biopreparátu pro provozní potřeby, se zvyšuje neúměrně jednotková cena biopreparátu vzhledem k nutnosti kultivovat inokulum ve specializovaných (investičně náročných) bioreaktorech.

Kultivace mikrobiálních konsorcií, kdy ve velkém objemu často dochází ke kultivaci jednoho kmene na úkor ostatních.

. Vzhledem k faktu, že alochtonní mikroflora je do poslední chvíle řízeně kultivována v bioreaktorech, je zde minimální aklimatizační interval na reálné podmínky (fyzikálněchemický a chemický charakter zeminy, přítomnost autochtonní mikroflóry, meteorologické podmínky, apod.), může dojít k inhibici biodegradaění aktivity vnesených mikroorganismů.

Úkolem vynálezu je odstranit výše uvedené nedostatky stávajících známých postupů biodegradaění sanace a vytvořit takový způsob biodegradaění sanace, který by odstranil náročné kroky předkultivace mikrobiálního preparátu pro inokulaci znečištěné zeminy, odstranil fázi převozu předkultivovaného preparátu a zvýšil dobu aklimatizace na reálné podmínky, tj. na fyzikálně-chemický a chemický charakter zeminy.

Podstata vynálezu

Tento úkol je vyřešen vytvořením způsobu biodegradaění sanace znečištěné zeminy inokulaci mikrobiálního preparátu podle předloženého vynálezu, kdy mikrobiální preparát obsahuje alespoň jeden alochtonní mikroorganismus, zejména bakteriální kmeny ze skupiny pseudomonas fluorescens, pseudomonas veronii, acinetobacter calcoaceticus, pseudomonas putida, pseudomonas stutzeri, arthrobacter protophormiae, bacillus megaterium, psychobacter sp.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v prvním kroku se mikrobiální preparát inokuluje do znečištěné zeminy, kde probíhá jeho kultivace přirozeným rozmnožováním, a ve druhém kroku se inokulovaná zemina alespoň jednou smíchá s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou v hmotnostním poměru v rozmezí od 1 : 20 do 1 : 100 a následně probíhá kultivace populace mikrobiálního preparátu v celém objemu směsi. Roznesení alochtonních biodegradačních mikrobiálních kmenů novou metodou inokulace je potvrzeno na základě provedených biodegradačních testů (zvýšení degradační rychlosti daného polutantu) a na základě vyhodnocení z amplikonů DNA bakterií a jejich separace pomocí denaturační gradientově gelové elektroforézy (DGGE) z kolonií vyrostlých na agarových plotnách, jak je uvedeno v příkladu III.

Mikrobiální preparát je v prvním kroku aplikován v množství 5 až 15 ml na 1 kg sušiny znečištěné zeminy. Ve vzorku zeminy se mikrobiální preparát nechá namnožit. Indikátorem dostatečného oživení půdy je výsledek výsevu heterotrofních mikroorganismů nad 1,00 E + 0,6 CFU/gsuj, kterého je obvykle dosaženo během jednoho týdne kultivace.

V jakékoli fázi během prvního kroku či druhého kroku se znečištěná zemina provzdušňuje a/nebo hnojí a/nebo zvlhčuje, aby bylo dosaženo dostatečného rozšíření alochtonních mikroorganismů.

Je výhodné, že se provádí homogenizace přidávaného hnojivá se znečištěnou zeminou a zároveň provzdušnění znečištěné zeminy během druhého kroku. Pracuj e-li se ve velkých objemech na biodegradačních plochách, jek těmto účelům používána těžká technika (rypadla, bagry), kterou se sanovaná zemina homogenizuje (rovnoměrný přísun živin a vody, provzdušnění). Druhý krok zahrnující míšení oživené a neoživené zeminy je tedy výhodné provádět současně, což přináší další úsporu času a energie.

V případě nedostatku živin v inokulované zemině se v průběhu prvního kroku do inokulované znečištěné zeminy přidává minerální hnojivo NP (K) v množství 0,5 % hmotn. a v inokulované znečištěné zemině se upravuje obsah sušiny na maximálně 80 % hmotn..

Kultivace populace mikrobiálního preparátu v inokulované zemině ve druhém kroku probíhá až do doby, kdy je dosaženo mikrobiální osídlenosti heterotrofními kultivovatelnými organismy alespoň na hodnotu 1,00 E + 0,6 CFU/g_SUš, kde zkratka „suš“ označuje sušinu ve sledovaném vzorku půdy, čímž je dosaženo sanace znečištěné zeminy. Přidání vzorku inokulované půdy je možné opakovat až do dosažení rozšíření alochtonních mikrobiálních organismů v celém objemu sanované zeminy.

Po ukončení druhého kroku se sanovaná zemina smíchá s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou v hmotnostním poměru v rozmezí od 1 : 20 do 1 : 100 a následně probíhá kultivace populace mikrobiálního preparátu v celém objemu směsic

Míchání sanované zeminy s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou se cyklicky opakuje až do dosažení sanace celého objemu znečištěné zeminy určeného k biodegradaění sanaci v dané lokalitě. Míchání zeminy v druhém kroku se provádí pomocí těžké zemní techniky zejména bagru, nakladače, traktoru s radlicí nebo buldozeru.

Výhody způsobu biodegradaění sanace znečištěné zeminy podle vynálezu jsou následující:

Nová metoda vnesení mikrobiálních činitelů představuje výhodu vynechání kultivace mikrobiálních kmenů ve velkoobjemových bioreaktorech následovanou aplikací rozstřikem kapalného mikrobiálního preparátu, a tím i odstranění veškerých nevýhod těchto technologických kroků vyjmenovaných v oddílu dosavadní stav techniky.

Technologický krok míšení zeminy za účelem homogenizace zeminy s alochtonními mikrobiálními kmeny se zeminou bez alochtonních kmenů v určitém hmotnostním poměru lze provádět současně s provzdušňováním zeminy, homogenizací přidávaných minerálních hnojiv a zajištěním rovnoměrné vlhkosti. Podpora mikrobiální růstové a degradaění aktivity je nutná ve všech případech biodegradaěních sanací ex situ/in situ bez závislosti na způsobu inokulace. Nová metoda inokulace tedy nepředstavuje nutnost pořizování dalšího technického zařízení a zajištění dalších pracovních sil.

Zkrácení aklimatizaění periody vnášených mikroorganismů. Mikrobiální kultura je aklimatizována na dané sanační podmínky od začátku inokulace, >^5/ / / ' ! 3 < i

ObiasnenívykresukY

Vynález bude blíže objasněn pomocí obrázků na výkresech, na nichž znázorňují obr. 1 graf koncentrace PAU (polyaromatických uhlovodíků) se 3 a 4 aromatickými kruhy - I. stupeň inokulace, obr. 2 graf koncentrace PAU se 3 a 4 aromatickými kruhy - II. stupeň inokulace, obr. 3 graf koncentrace PAU v uměle kontaminované zemině - L stupeň inokulace, obr. 4 graf koncentrace PAU v uměle kontaminované zemině - II. stupeň inokulace a obr. 5 dendogram DGGE gelu reálně kontaminované zeminy.

Příklady uskutečnění vynálezu

Rozumí se, že jednotlivá uskutečnění vynálezu jsou představována pro ilustraci, nikoli jako omezení vynálezu na výčet zde uvedených příkladů provedení. Odborníci znalí stavu techniky najdou nebo budou schopni zjistit za použití rutinního experimentování mnoho ekvivalentů ke specifickým uskutečněním vynálezu, která jsou zde speciálně popsána. I tyto ekvivalenty budou zahrnuty v rozsahu následujících patentových nároků.

Příklad I

Příklad I je proveden na reálně znečištěné zemině označené JČP (Jihočeská Plynárenská, odkud byla znečištěná zemina odebrána), zatížené polyaromatickými uhlovodíky (PAU) s počáteční koncentrací 7 399 mg/kg_SUš. Příklad je založen na sledování míry degradace PAU, kdy byla aplikována nová metoda inokulace mikrobiálním preparátem do sanované zeminy v porovnání s kontrolní variantou.

Příprava výchozí zeminy na experimentální pokus a postup provedení příkladu:

kg znečištěné zeminy bylo sušeno při laboratorní teplotě, proseto přes síto (velikost ok 2 mm) a homogenizováno. Množství znečištěné zeminy bylo voleno tak, aby bylo dostatečné množství zeminy na jednotlivé varianty pro dva stupně míšení zeminy + rezerva.

Ze 100 g takto připravené zeminy bylo připraveno základní inokulum, kdy bylo přidáno hnojivo NPK (zdroj dusíku N, fosforu P a draslíku K) (3 g/kg zeminy) a bakteriální směs definovaná v lab. 1. Bakteriální směs byla napěstována v peptonovém médiu a byla aplikována v množství 10 ml na 1 kg_suš zeminy. Takto upravená zemina byla kultivována v termostatu za teploty 22°C za stálého vlhčení a přístupu vzduchu. Mikrobiální nárůst byl kvantitativně hodnocen výsevem na plotny (DEV agar) a při hodnotách 1 · 10⁶ - 1 · 10⁹ CFU/gSUš (10 dnů) byl proveden L stupeň inokulace míšením zemin, a to přenosem 10 g mikrobiálně oživené zeminy do 200 g, 500 $ a 1000 g neinokulované znečištěné zeminy vždy ve dvou paralelách (AI 200g, BI 200g, AI 500g, BI 500g, AI 1000g, BI 1000g). Následovala kultivace za totožných podmínek do dosažení mikrobiálního osídlení 110⁶ - 1Ί0⁹ CFU/gsuj (16 dnů). Poté byl stejným způsobem jako I. stupeň inokulace proveden II. stupeň inokulace přenosem 10 g zeminy z I. stupně do výchozí neinokulované zeminy s následným značením All 200g, BII 200g, All 500g, BII 500g, All 1000g, BII 1000g . Celý experiment probíhal v termostatu při 22^C za stálého vlhčení a přístupu vzduchu. Před každým přenosem byla zemina odebrána a uchována pro pozdější izolaci DNA. Z narostlých agarových ploten byla DNA izolována průběžně. V průběhu celého experimentu byly pravidelně odebírány vzorky na monitoring degradačního trendu PAU vždy ve třech paralelách, s jejichž průměrem a odchylkami je následně pracováno.

Kontrolní varianta byla připravena z 1000 g znečištěné zeminy, která byla souběžně s ostatními experimentálními variantami vlčena, hnojena a kultivována za stejných podmínek. Nebyly přidávány žádné alochtonní mikroorganismy.

Tab. 1: Preparáty použité pro inokulaci kontaminovaných zemin

Biopreparát	označení	Bakteriální kmen
BIOTECH I+III	6	Pseudomonas fluorescens
	145	Pseudomonas veronii
	147	Acinetobacter calcoaceticus
	161	Pseudomonas putida
	171	Pseudomonas stutzeri
BIOTECH-ARL	PM1	Arthrobacter protophormiae
	PM2	Bacillus megaterium
	PM3/2	Psychrobacter sp.

Výsledky degradace PAU

Ze vzorků zemin JČP byly extrahovány PAU na přístroji ASE 200 (Dionex). Supernatant byl přečištěn 3x destilovanou vodou, nanesen na kolonku se síranem sodným a následně eluován 4 ml hexanu. Extrakty byly převedeny do ethyl acetátu, ředěny acetonitrilem a analyzovány metodou HPLC.

Na obr. 13 a 14 je graficky znázorněn pokles PAU se 3 a 4 aromatickými kruhy. Vlivem přídavku minerálního hnojivá, vlhčení a provzdušňování je patrný pokles PAU u všech experimentálních variant včetně kontroly, což potvrzuje pozitivní aktivaci autochtonních mikroorganismů. Porovnáním kontroly a všech mikrobiálně obohacených variant A, B, zjistíme vyšší pokles všech PAU vlivem probíhající degradační aktivity alochtonních bakteriálních kmenů.

Naftalen nebyl detekován ani v případě vstupní zeminy, což bylo zřejmě zapříčiněno přípravou zeminy. Při sušení došlo pravděpodobně k jeho vytékání.

V Tabulce 2 jsou shrnuty procentuální míry poklesu jednotlivých PAU detekovaných na konci pokusu, tj. po 4 měsících po II. stupni inokulace. Nejvýraznější rozdíl kontroly a oživených variant v porovnání se vstupní hodnotou byl zjištěn pro chrysen, který v kontrole dosáhl pouze 6.3% poklesu oproti nejlepší variantě IIA 1000g: 59, L%. Naproti tomu antracen ' h A v kontrolní variantě klesl o 72,4% a u nej lepší varianty IIA 1000g o 87,2%.

Tabulka 2: procentuální míry poklesu jednotlivých PAU

	acenaftylen ______	fluoren	fenantren	antracen	acenaften	fluoranten	pyren	benzo(a)antracen	chrysen
Vstup 7399 mg/kg	0.0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
Kontrola	28,7	51,5	25,4	72,4	98,4	19,7	22,1	12,3	6,3
IIA 200 g	60,9	71,2	52,9	79,8	100,0	46,9	50,3	39,7	30,9
IIB 200 g	64,7	72,3	53,7	79,8	100,0	47,1	50,6	40,2	31,4
IIA 500 g	67,5	73,8	52,2	80,7	100,0	49,2	53,2	45,1	37,8
IIB 500 g	67,4	73,3	53,4	80,6	100,0	46,6	52,6	42,4	34,7
IIA 1000 g	76,2	82,0	68,2	87,2	100,0	67,6	69,6	64,4	59,1
IIB 1000 g	73,3	80,3	66,5	85,7	100,0	64,2	66,8	60,6	55,4

Důležitou informací byla dále degradační aktivita v závislosti na poměru míchané inokulované/neinokulované zeminy. Pozitivní vliv alochtonní mikroflóry byl zřejmý u všech hmotnostních poměrech 10:200, 10:500 a 10:1000. Nej výraznějšího výsledku bylo dosaženo při postupném míchání zeminy v poměru 10:1000 (1:100), ovšem všechny poměry jsou v praxi použitelné.

Příklad II

Příklad II byl proveden na uměle znečištěné modelové zemině, kdy byly přidány jednotlivé PAU o výsledné koncentraci každé z látek 500 mg/kg_suš (naftalen, fluoranten, pyren a fenantren). Postup a příprava experimentu byl proveden totožně jako u příkladu I. Jediným rozdílem byl odlišný postup extrakce PAU, kdy v příkladu II byla zemina extrahována směsí hexan:aceton (2:1) po dobu 1 h v ultrazvukové lázni. Následná analýzy PAU probíhala totožně.

U uměle znečištěné zeminy byly záměrně zvoleny nižší koncentrace kontaminantů z důvodu případné rychlejší adaptace vnesených degradérů a snížení toxického vlivu zeminy na tyto činitele.

Výsledky míry degradace PAU příkladu II

Významný pokles koncentrace PAU byl zaznamenán v případě uměle znečištěné zeminy, a to v obou stupních inokulace, viz obr. 3 a 4. Byla potvrzena podpora autochtonní mikroflóry patrná z výsledků degradace u kontroly bez přídavku bakteriálního preparátu. Ve všech variantách byl ovšem potvrzen výrazný pozitivní vliv vnesených bakteriálních činitelů, y

K degradaci docházelo u všech přítomných PAU. V případě fenantrenu byl pokles 90.^93%, V v bez přítomnosti preparátu 77% (vztaženo k hodnotám koncentrace vstupní zeminy). Hodnoty Λ ·ιτί c ' koncentrace fluorantenu a pyrenu poklesly o 65r75% vůči vstupu, u kontrol o 30U5%. U varianty 1000 g v II. stupni inokulace docházelo k nepatrně vyšší degradaci pyrenu. Již při procesu umělé kontaminace došlo k vytékání 50% naftalenu. Není možné určit, zda byl naftalen degradován mikroorganismy, které tento polutant upřednostňují jako nejjednodušší substrát nebo byl výsledný pokles zapříčiněn volatilizací.

U příkladu II nebyl potvrzen zásadní vliv na poměr míchané inokulované/neinokulované zeminy v jednotlivých stupních inokulace. Všechny vyzkoušené hmotnostní poměry 10:200, 10:500 a 10:1000 potvrdily intenzifikaci degradačních procesů.

Závěr příkladu I a II

V příkladu I a II byla prokázána úspěšná metoda vnesení biologického činitele do sanované zeminy na základě porovnání degradačních aktivit experimentálních variant příkladu, kdy varianty obohacené speciálními bakteriálními kmeny schopnými rozkládat PAU vykazovaly rychlejší rozklad těchto látek. Zároveň byla potvrzena účinnost hmotnostních poměrů během míšení inokulovaných a neinokulovaných zemin 10:200, 10:500 a 10:1000. V rámci metody vnesení biologického činitele do sanované zeminy se tedy používá hmotnostní poměr v rozmezí 1:20 až 1:100.

Příklad III

Příklad III je zaměřený na potvrzení přítomnosti vnesených mikrobiálních činitelů do experimentálních zemin příkladu I na základě molekulární metody DGGE (denaturační gradientová elektroforéza). Touto metodou byla stanovena míra osídlenosti jednotlivých vnesených bakterií ve vzorcích výchozí zeminy a na konci experimentu.

Gely z denaturační gradientově elektroforézy byly vyhodnoceny metodou shlukové (klastrové) analýzy (BioNumerics 7.0, Applied Maths, USA). Podobnost, či odlišnost jednotlivých skupin vzorků (klastrů) na základě „proužků“ bakteriální 16S rDNA je vizualizována pomocí dendrogramu. Na horizontální ose je zobrazen koeficient podobnosti [%] a na vertikální ose jsou vyneseny objekty (vzorky).

Z dendrogramu na Qbr.5 je patrná odlišnost znečištěné zeminy a kontroly (bez přídavku bakt. izolátů) od vzorků zemin s přidanými bakteriemi. Tato skutečnost potvrzuje pozitivní vliv přidaných izolátů na bakteriální společenství ve znečištěné zemině a zároveň schopnost adaptace těchto kmenů na přítomné podmínky. Tuto schopnost vykazuje především vnesený bakteriální kmen Acinetobacter calcoaceticus, jehož přítomnost byla zaznamenána pouze u inokulovaných zemin. Pomocí klastrové analýzy byla prokázána také vysoká genomová příbuznost bakterií rodu Pseudomonas, která zároveň znemožňuje odlišení kmenů P. putida od P. veronii, které jsou pravděpodobně v inokulované i znečištěné zemině přítomné. Ve znečištěné i inokulované zemině se také pravděpodobně vyskytuje P. fluorescens, P. stutzeri a Arthrobacter protophormiae, jejichž přítomnost nebyla zaznamenána v kontrole. Nedochází tedy k negativnímu vlivu vnesených mikroorganismů na původní mikroflóru, spíše naopak.

Přítomnost uměle vnesené bakterie Acinetobacter calcoaceticus metodou vnesení biologického činitele do sanované zeminy na konci experimentu jednoznačně potvrzuje účinnost této metody. Metodou DGGE bohužel nebylo možné prokázat přítomnost dalších inokulováných bakterií, protože jejich odezva se kryla s autochtonními kmeny.

Průmyslová využitelnost

Způsob biodegradaění sanace znečištěné zeminy podle vynálezu lze využít pro bioremediační odstraňovaní polutantů, zejména PAU ex situ a in situ.

i

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY /iCc

   1. Způsob biodegradační sanace znečištěné zeminy inokulací mikrobiálního preparátu obsahujícího alespoň jeden alochtonní mikroorganismus, zejména alespoň jeden bakteriální kmen ze skupiny pseudomonas fluorescens, pseudomonas veronii, acinetobacter calcoaceticus, pseudomonas putida, pseudomonas stutzeri, arthrobacter protophormiae, bacillus megaterium, psychobacter sp., vyznačující se t i m , že v prvním kroku se mikrobiální preparát inokuluje do znečištěné zeminy, kde probíhá jeho kultivace přirozeným rozmnožováním, a ve druhém kroku se inokulovaná zemina alespoň jednou smíchá s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou v hmotnostním poměru v rozmezí od 1 : 20 do 1 : 100 a následně probíhá kultivace populace mikrobiálního preparátu v celém objemu směsi.
2. 2. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 3, vyznačující se t i m , že mikrobiální preparát je v prvním kroku aplikován v množství 5 až 15 ml na 1 kg sušiny znečištěné zeminy.
3. 3. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že v jakékoli fázi během prvního kroku či druhého kroku se znečištěná zemina provzdušňuje a/nebo hnojí a/nebo zvlhčuje.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se provádí homogenizace přidávaného hnojivá se znečištěnou zeminou a zároveň provzdušnění znečištěné zeminy během druhého kroku,
5. 5. Způsob podle nároků 3 nebo 4, vyznačující se tím, že v průběhu prvního kroku se do inokulované znečištěné zeminy přidává minerální hnojivo NP (K) v množství 0,5 % hmotn.
6. 6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 3 až 5, vyznačující se t i m , že v průběhu prvního kroku se v inokulované znečištěné zemině upravuje obsah sušiny na maximálně 80 % hmotn.
7. 7. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m , že kultivace populace mikrobiálního preparátu v inokulované zemině v druhém kroku probíhá až do doby, kdy je dosaženo mikrobiální osídlenosti heterotrofními kultivovatelnými organismy alespoň na hodnotu 1,00 E + 0,6 CFU/g_suš, kde zkratka „suš označuje sušinu ve sledovaném vzorku půdy, čímž je dosaženo sanace znečištěné zeminy.
8. 8. Způsob podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m , že po ukončení druhého kroku se sanovaná zemina smíchá s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou v hmotnostním poměru v rozmezí od 1 : 20 do 1 : 100 a následně probíhá kultivace populace mikrobiálního preparátu v celém objemu směsi.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že míchání sanované zeminy s dosud neinokulovanou znečištěnou zeminou se cyklicky opakuje až do dosažení sanace celého objemu znečištěné zeminy určeného k biodegradační sanaci v dané lokalitě.
10. 10. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 9, vyznačující se t í m , že míchání zeminy v druhém kroku se provádí pomocí těžké zemní techniky zejména bagru, nakladače, traktoru s radlicí nebo buldozeru.