CZ2008606A3 - Recombinant protein adapted for direct radioiodination, preparation and use thereof - Google Patents

Abstract

Rekombinantní protein obsahující polypeptidový segment vážící radionuklid. Proteinem je s výhodou imunoglobulin nebo jeho funkcní fragment a polypeptidovým segmentem vážícím radionuklid je segment bohatý na tyrosin, který je výhodne pripojen na C-konec nebo N-konec proteinu. Rešení zahrnuje dále zpusob výroby rekombinantního proteinu a jeho znacení radionuklidem, zejména halogenem s výhodou jódem, a také kódující molekulu nukleové kyseliny. Znacený rekombinantní protein lze použít k výrobe radiofarmaceutického cinidla.A recombinant protein comprising a radionuclide binding polypeptide segment. Preferably, the protein is an immunoglobulin or a functional fragment thereof and the radionuclide-binding polypeptide segment is a tyrosine-rich segment which is preferably attached to the C-terminus or N-terminus of the protein. The invention further includes a method of producing a recombinant protein and labeling it with a radionuclide, especially a halogen, preferably iodine, as well as a coding nucleic acid molecule. The labeled recombinant protein can be used to make a radiopharmaceutical agent.

Description

Rekombinantní protein upravený pro přímou radiojodaci a jeho výroba a použitíRecombinant protein modified for direct radioiodination and its production and use

OBLAST TECHNIKYTECHNICAL FIELD

Proteiny, obzvláště protilátky, značené radioaktivním jódem jsou užitečnými nástroji zaměřenými k biologickým cílovým molekulám jako k předmětu zájmu v diagnostickém, zobrazovacím nebo terapeutickém směru. Tento vynález se týká rekombinantních bílkovin, jež obsahují vnesený segment polypeptidového řetězce bohatý na tyrosin, schopný vytvářet chemické vazby s užitečnými radionuklidy jódu. Konvenční značení radionuklidy jež chemicky patří k halogenům, jmenovitě jódu, zahrnuje připojení atomů halogenu ktyrosinovým zbytkům bílkoviny, jež je předmětem zájmu. Tento vynález ukazuje, že bílkovina, jež je předmětem zájmu, může být ve svém rekombinantním formátu upravena tak, že váže podstatně zvýšené množství radionuklidu, tj. že vnesený segment bílkoviny bohatý na tyrosin dává upravené bílkovině žádoucí zvýšení kapacity pro značení. V jiném ohledu: Použití limitujícího množství radionuklidu jódu vede ke značení na hladinu blízkou blízkou hladině, jíž je značena původní bílkovina. V tomto případě lze ale očekávat, že budou sníženy škodlivé účinky značení, jež normálně provázejí připojení radionuklidu jódu k esenciálním tyrosinovým zbytkům původní bílkoviny, protože část značení proběhne na vnesených tyrosinových zbytcích. V dalších ohledech vynález zahrnuje molekulární klonování nukleových kyselin kódujících upravené proteiny, jejich rekombinantní expresi a použití značených upravených rekombinantních bílkovin.Proteins, especially antibodies, labeled with radioactive iodine are useful tools targeted to biological target molecules as a subject of interest in diagnostic, imaging or therapeutic direction. The present invention relates to recombinant proteins comprising an inserted tyrosine-rich polypeptide chain segment capable of forming chemical bonds with useful iodine radionuclides. Conventional labeling of radionuclides that chemically belong to halogens, namely iodine, involves the attachment of halogen atoms to the tyrosine residues of the protein of interest. The present invention shows that the protein of interest can be engineered in its recombinant format to bind substantially increased amounts of radionuclide, i.e., the introduced tyrosine-rich protein segment gives the modified protein the desired increase in labeling capacity. In another aspect: Use of a limiting amount of iodine radionuclide results in labeling at a level close to that of the parent protein. In this case, however, it is expected that the deleterious effects of the labeling that normally accompany the attachment of iodine radionuclide to the essential tyrosine residues of the original protein will be reduced, as part of the labeling will take place on the introduced tyrosine residues. In other aspects, the invention includes molecular cloning of nucleic acids encoding engineered proteins, their recombinant expression, and the use of labeled engineered recombinant proteins.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKYBACKGROUND OF THE INVENTION

Radioaktivně značené bílkoviny jsou široce využívány v mnoha oborech, jež zahrnují, ale bez omezení, biologický výzkum a experimentální a klinickou medicínu. Z radioaktivně značených bílkovin jsou běžně využívány radioaktivně značené protilátky protože typicky poskytuji pevnou a specifickou vazbu k jiným bílkovinám, svým antigenům, jež mohou mít značný biologický nebo lékařský význam. Takovéto významné antigeny zahrnuji, ale bez omezení, složky rakovinných buněk, jež se • · · • ·Radiolabeled proteins are widely used in many fields, including but not limited to biological research and experimental and clinical medicine. Of the radiolabeled proteins, radiolabeled antibodies are commonly used because they typically provide strong and specific binding to other proteins, their antigens, which may have considerable biological or medical significance. Such significant antigens include, but are not limited to, cancer cell components that

* ♦ • · · ·,< ·· ·» ♦· ·· vyskytují méně v normálních buňkách (antigeny často nazývané „nádorové markéry“) nebo složky dalších patogenů, např. virových (viz Ekaterina Dadachova, Mahesh C. Patel, Sima Toussi, Christos Apostolidis, Alfred Morgenstern, Martin W. Brechbiel, Miroslaw K. Gorny, Susan Zolla-Pazner, Artura Casadevall, Harris Goidstein: Targeted Killing of Virally Infected Celíš by Radiolabeled Antibodies to Viral Proteins, PLOS Medicíně 3:2094-2103, 2006). Radioaktivně značené protilátky proti žádoucím antigenům a s dalšími žádoucími vlastnostmi představují radiofarmaceutická činidla pro diagnostické, zobrazovací a terapeutické účele (viz např. přehledy Gary J. Kelloff, Kenneth A. Krohn, Steven M. Larson, Ralph Weissleder, David A. Mankoff, John M. Hoffman, Jeanne M. Link, Kathryn Z. Guyton, William C. Eckelman, Howard I. Scher, Joyce 0’Shaughnessy, Bruče D. Cheson, Caroline C. Sigman, James L. Tatum, George Q. Mills, Daniel C. Sullivan, and Janet Woodcock: The Progress and Promise of Molecular Imaging Probes in Oncologic Drug Development. Clin Cancer Res 11: 7967-7985, 2005; and Manuel J. Koppe, Ernst J. Postema, Frits Aarts, Wim J.G. Oyen, Robert P. Bleichrodt and Otto C. Boerman: Antibody-guided radiation therapy of cancer. Cancer and Metastasis Reviews 24: 539-567,2005).They occur less in normal cells (antigens often called "tumor markers") or components of other pathogens, eg viral (see Ekaterina Dadachova, Mahesh C. Patel, Sima Toussi) Christos Apostolidis, Alfred Morgenstern, Martin W. Brechbiel, Miroslaw K. Gorny, Susan Zolla-Pazner, Artura Casadevall, Harris Goidstein: Targeted Killing of Virally Infected Celise by Viral Proteins, PLOS Medicine ). Radiolabeled antibodies against desirable antigens and other desirable properties are radiopharmaceutical agents for diagnostic, imaging and therapeutic purposes (see, eg, Gary J. Kelloff, Kenneth A. Krohn, Steven M. Larson, Ralph Weissleder, David A. Mankoff, John M Hoffman, Jeanne M. Link, Kathryn Z. Guyton, William C. Eckelman, Howard I. Scher, Joyce O'Shaughnessy, Bruce D. Cheson, Caroline C. Sigman, James L. Tatum, George Q. Mills, Daniel C. Sullivan, and Janet Woodcock: The Progress and Promise of Molecular Imaging Probes in Oncologic Drug Development Clin Cancer Res 11: 7967-7985, 2005, and Manuel J. Koppe, Ernst J. Postema, Frits Aarts, Wim JG Oyen, Robert P. Bleichrodt and Otto C. Boerman: Antibody-guided radiation therapy of cancer (Cancer and Metastasis Reviews 24: 539-567,2005).

Pro vývoj radiofarmaceutických činidel k diagnostickým, zobrazovacím ne terapeutickým účelům je potřebný racionální výběr radionuklidu. Různé β-záriče jsou radionuklidy výhodné k terapeutickému použití, např. k ozáření trapeutického cíle rozeznávaného značenou protilátkou. Radionuklidy často vybrané pro takovéto použití zahrnují, avšak bez omezení, ^13ll; ⁹⁰Y; ¹⁸⁸Re; ¹⁷⁷Lu; and ⁶⁷Cu (k popisu jejich výhod a nevýhod viz Koppe et al., 2005, supra). Pro zobrazovací a diagnostické účele se často používají jiné β-zářiče nebo γ-zářiče, např. ¹²³l; ¹²⁵l; ¹⁸⁶Re; nebo ^99mTc: tyto radionuklidy umožňují vysledování cílů jakými jsou např. maligní tkáně nebo metastázy.Rational selection of radionuclide is required for the development of radiopharmaceutical agents for diagnostic, imaging or therapeutic purposes. Various β-emitters are radionuclides useful for therapeutic use, eg, to irradiate a trapeutic target recognized by a labeled antibody. Radionuclides often selected for such use include, but are not limited to, ¹³ L; ⁹⁰ Y; ¹⁸⁸ Re; ¹⁷⁷ Lu; and ⁶⁷ Cu (for a description of their advantages and disadvantages, see Koppe et al., 2005, supra). Other β-emitters or γ-emitters are often used for imaging and diagnostic purposes, eg ¹²³ l; ¹²⁵ l; ¹⁸⁶ Re; or ^99m Tc: these radionuclides allow tracing of targets such as malignant tissues or metastases.

V závislosti na chemické povaze radionuklidu a na metodách známých v oboru kolísá pracnost a výtěžek značení. Postupy nepřímého značení zahrnují krok tvorby kovalentní vazby (vazeb) chemické skupiny (skupin) s proteinem předcházející značení jako takové. Krok vytváření kovalentní vazby mezi proteinem a chemickou skupinou reagující s radionuklidem se běžně nazývá „konjugace“. Běžná nepřímá metoda radiojodace používá acylační činidlo (/V-succinimidyl-3[4-hydroxyfenyl] propionát, Boltonovo a Hunterovo činidlo), komerčně dostupné též ve radiojódované formě, které se kovalentně váže k bílkovině, jež má být značena. Boltonovo a Hunterovo činidlo za produkce značené bílkoviny reaguje převážně • · · • 4 s aminoskupinami bočních řetězců lysinových zbytků. Jde zde o nejlepší metodu značení bílkovin jež nemají tyrosinové a histidinové zbytky nebo u nichž reakce s těmito zbytky ovlivňuje biologickou aktivitu (Graham S. Bailey: The Bolton and Hunter Method for Radiolabeling Protein, in The Protein Protocols Handbook, 2. vydání; Ed.: J. M. Walker. Humana Press lne., Totowa, NJ, 2002). V oboru byla zveřejněna též jiná činidla umožňující kovalentní připojení jódu k ne-aromatickým zbytkům (např. Zhenping Zhu, Tarunendu Ghose, Yaroslav Královec and Chunzheng Yang: Immunoreactivity, Stability, Pharmacokinetics and Biodistribution of a Monoclonal Antíbody to Human Leukemic B Celíš after Three Different Methods of Radioiodination. Nud. Med. Biol. 21:873-882,1994).Depending on the chemical nature of the radionuclide and the methods known in the art, the laboriousness and yield of the label varies. Indirect labeling procedures include the step of forming the covalent bond (s) of the chemical moiety (s) with the protein preceding the label itself. The step of forming a covalent bond between a protein and a radionuclide-reactive chemical moiety is commonly called "conjugation". A conventional indirect method of radioiodination uses an acylating agent (N-succinimidyl-3 [4-hydroxyphenyl] propionate, Bolton and Hunter reagents), also commercially available in radioiodinated form, which covalently binds to the protein to be labeled. The Bolton and Hunter reagents react predominantly with the amino groups of the side chains of the lysine residues to produce labeled protein. This is the best method of labeling proteins that do not have tyrosine and histidine residues, or whose reaction with these residues affects biological activity (Graham S. Bailey: The Bolton and Hunter Method for Radiolabeling Protein, in The Protein Protocols Handbook, 2nd Ed., Ed. : JM Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2002). Other reagents have been disclosed in the art to allow the covalent attachment of iodine to non-aromatic residues (e.g., Zhenping Zhu, Tarunendu Ghose, Yaroslav Kralovec and Chunzheng Yang: Immunoreactivity, Stability, Pharmacokinetics and Biodistribution of a Monoclonal Antibody to Human Leukemic B). Methods of Radioodination (Nud. Med. Biol. 21: 873-882, 1994).

Přímé metody radiojodace zahrnují připojení radionuklidu jódu ke zbytkům aromatických aminokyselin cílového proteinu. Protože radionuklidy jódu jsou komerčně dodávány jako roztoky soli Nal a protože jodid (I ) je neraktivní formou jódu, musí být aktivován oxidačním činidlem na reaktivní kationickou formu (Γ), což umožní spontánní elektrofilní substituci na aromatických kruzích s odcházející skupinou jako je H⁺ u p-kre$ol (tyrosin) nebo 4-methylimidazol (histidin). Místo jodace je určováno pH. Tyrosin je převážně značen při pH kolem 7,5 zatímco při pH kolem 8,5 je značen hlavně histidin, i když s mnohem menším výtěžkem. Tyrosinový zbytek může být značen dvakrát; druhý krok, poskytující di-jódovaný tyrosylový zbytek, probíhá rychleji než mono-jodační reakce. Následkem stechiometrie reakčních složek převažují obvykle v bílkovinách monojód-tyrosynové zbytky (Martin Béhé, Martin Gotthardt, and Thomas M. Behr: Radioiodination of Proteins and Peptides. v Cell Biology: a Laboratory Handbook (třetí vydání, Julio Celíš, ed.) Elsevier, lne., 2006. str. 149-154). Jodace s Chloraminem-T (p-toluen sulfonochloramidem) je široce používaným jodačním postupem a účinným způsobem značení rozmanitých proteinů. Postup zahrnuje vystavení substrátu Chloraminu-T v přítomnosti radionuklidu (jako Nal) na krátký čas, což produkuje při značení beznosičovým radioaktivním jódem vysoké specifické aktivity. Jodace s lodogenem se považuje obecně za mírnější, protože reakce probíhá na povrchu oxidačního činidla, což minimalizuje vystaveni substrátu. U této metody se k omezeni poškozeni proteinu oxidací během radioaktivního značeni používá ve vodě nerozpustné oxidační činidlo [1,3,4,6tetrachloro-3a,6a-difenyl glykoluril, lodogen]. Oxidační činidlo, jež je komerčně dostupné, se rozpustí v organickém rozpouštědle a pokryjí se jim stěny reakční zkumavky. Radiojodace se pak spouští přidáním proteinu a Nal ve vodném roztoku a • · · po určitém čase je zastavena odebráním reakční směsi (Graham S. Bailey: The lodogen Method for Radiolabeling Protein.The Protein Protocols Handbook (Editor: John M. Walker). Springer, 1996. str. 673-674).Direct methods of radioiodination include attaching iodine radionuclide to the aromatic amino acid residues of the target protein. Since iodine radionuclides are commercially available as Nal salt solutions, and since iodide (I) is an inactive form of iodine, it must be activated by an oxidizing agent to reactive cationic form (Γ), allowing spontaneous electrophilic substitution on aromatic rings with a leaving group such as H ⁺ . p-Kreol (tyrosine) or 4-methylimidazole (histidine). The iodine site is determined by pH. Tyrosine is predominantly labeled at a pH of about 7.5, while at a pH of about 8.5, histidine is mainly labeled, albeit with a much lower yield. The tyrosine residue may be labeled twice; the second step, providing the di-iodinated tyrosyl residue, proceeds faster than the mono-iodination reaction. Due to the stoichiometry of the reactants, mono-iodine-tyrosyn residues usually predominate in proteins (Martin Béhé, Martin Gotthardt, and Thomas M. Behr: Radioiodination of Proteins and Peptides. In Cell Biology: a Laboratory Handbook (third edition, Julio Celis, ed.) Elsevier, Inc., 2006. pp. 149-154). Iodination with Chloramine-T (p-toluene sulfonochloramide) is a widely used iodination process and an efficient way of labeling a variety of proteins. The procedure involves exposing the Chloramine-T substrate in the presence of a radionuclide (such as NaI) for a short period of time, which produces high specific activity when labeled with radioactive radioactive iodine. Iodination with lodogen is generally considered to be milder since the reaction takes place on the surface of the oxidizing agent, minimizing exposure to the substrate. In this method, a water-insoluble oxidizing agent [1,3,4,6-tetrachloro-3α, 6α-diphenyl glycoluril, lodogen] is used to reduce protein damage by oxidation during radiolabeling. The oxidizing agent, which is commercially available, is dissolved in an organic solvent and covered with the walls of the reaction tube. Radio iodination is then triggered by the addition of protein and NaI in aqueous solution and, after a period of time, is stopped by removing the reaction mixture (Graham S. Bailey: The Logogen Method for Radiolabeling Protein. The Protein Protocols Handbook (Editor: John M. Walker). Springer). , 1996, pp. 673-674).

Žádoucí je, aby pozice připojení radionuklidu nezahrnovaly aminokyselinové zbytky esenciální pro radiofarmaceutickou funkci značené bílkoviny. To je předmětem obav při konjugaci pro rozpouštědlo dostupných lysinových zbytků, protože ty se mohou nacházet např. v oblastech určujících komplementaritu protilátek (complementarity determining regions, CDR) a riziko oslabení imu no reaktivity může být vysoké (viz Paul Carter a A Margaret Merchant: Engineering antibodies for imaging and therapy. Current Opinion in Biotechnology 8: 449-454, 1997). V oboru byly již poznány určité výhody přímého značení před nepřímým, jako např. v Carter a Merchant, supra; a Neri D, Petrul H, Winter G, LightY, Marais R, Britton KE, Creighton AM: Radioactive labeling of recombinant antibody fragments by phosphorylation using human casein kinase II and [y-³²P-ATPj. Nat Biotechnol 14:465-490,1996).It is desirable that the radionuclide attachment positions do not include amino acid residues essential for the radiopharmaceutical function of the labeled protein. This is a concern for solvent conjugation of available lysine residues, as these may be found, for example, in the complementarity determining regions (CDRs) and the risk of immunosuppression may be high (see Paul Carter and A Margaret Merchant: Engineering antibodies for imaging and therapy (Current Opinion in Biotechnology 8: 449-454, 1997). Certain advantages of direct labeling over indirect labeling have already been recognized in the art, such as in Carter and Merchant, supra; and Neri D, Petrul H, WinterY, Marais R, Britton KE, Creighton AM: Radioactive labeling of recombinant antibody fragments by phosphorylation using human casein kinase II and [γ- ³² P-ATPj. Nat Biotechnol 14: 465-490, 1996).

Proteinové inženýrství poskytující danému proteinu žádoucí vlastnosti je v oboru dobře známé. Co se týče rekombinantnich protilátek, přehled Cartera a Merchantové, 1997 (supra) odkazuje k inženýrství humanizovaných protilátek, imunotoxinú, bispecifických protilátek a jednovláknových fragmentů variabilní oblasti (scFv) stabilizovaných disulfidovou vazbou, vedle již zmíněného inženýrství protilátek k lepšímu radioaktivnímu značení (Neri et al., 1996, supra). Získávání rekombinantnich bílkovin rekombinantni expresí je v oboru rovněž dobře známo. Pro produkci protilátek v jejich rekombinantnich formátech scFv je běžná rekombinantni exprese v bakteriích (viz např. Mi-Ae Heo, Su-Hyun Kim, So-Yeon Kim, Yu-Jin Kim, Junho Chung, Min-Kyu Oh, Sun-Gu Lee: Functional expression of single-chain variable fragment antibody against c-Met in the cytoplasm of Escherichia coli. Protein Expression and Purification 47. 203-209, 2006, a odkazy tamtéž). Imunoglobulinové (Ig) molekuly jsou běžně exprimovány v eukaryotních buňkách jako jsou buňky vaječníků čínského křečka (Chinese hamster ovary, CHO, viz např. Gary R. McLean, Antonio Nakouzi, Arturo Casadevall, and Nancy S. Green: Human and murine immunoglobulin expression vector cassettes. Molecular Immunology 37: 837-845, 2000, a odkazy tamtéž).Protein engineering providing a given protein with desirable properties is well known in the art. Concerning recombinant antibodies, a review by Carter and Merchant, 1997 (supra) refers to the engineering of humanized antibodies, immunotoxins, bispecific antibodies, and disulfide-stabilized single-stranded variable region (scFv) fragments, in addition to the aforementioned antibody engineering for better radiolabeling (Neri et al. , 1996, supra). Obtaining recombinant proteins by recombinant expression is also well known in the art. Recombinant expression in bacteria is common for the production of antibodies in their recombinant scFv formats (see, e.g., Mi-Ae Heo, Su-Hyun Kim, So-Yeon Kim, Yu-Jin Kim, Junho Chung, Min-Kyu Oh, Sun-Gu Lee : Functional expression of single-chain variable antibody fragment against c-Met in the cytoplasm of Escherichia coli. Protein Expression and Purification 47, 203-209, 2006, and references therein). Immunoglobulin (Ig) molecules are commonly expressed in eukaryotic cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, see, e.g., Gary R. McLean, Antonio Nakouzi, Arturo Casadevall, and Nancy S. Green: Human and murine immunoglobulin expression vector cassettes, Molecular Immunology 37: 837-845, 2000, and references therein).

Použití radioaktivně značených monoklonálnich a rekombinantnich protilátek v radioimunoterapii (RIT) je popsáno např. v přehledu Manuel J. Koppe, Ernst J.The use of radiolabeled monoclonal and recombinant antibodies in radioimmunotherapy (RIT) is described, for example, in a review by Manuel J. Koppe, Ernst J.

• · ·• · ·

Postema, Frits Aarts, Wim J.G. Oyen, Robert P. Bleichrodt, and Otto C.Boerman: Antibody-guided radiation therapy of cancer. Cancer and Metastasis Reviews 24: 539-567, 2005. Použití vzorových radiofarmaceutických činidel pojmenovaných ¹³¹l-Tositumomab, ⁹⁰Y-lbritumomab alias ⁹⁰Y-Zevalin alias Tiuxetan, ⁹⁰Y-epratuzumab (hLL2), a ¹³¹l-Lym-1 popisuje např. David M. Goldenberg: The role of radiolabeled antibodies in the treatment of non-Hodgkin’s lymphoma: the coming of age of radioimmunotherapy. Critical Reviews in Oncology/HematologyW:195-201,2001.Postema, Frits Aarts, Wim JG Oyen, Robert P. Bleichrodt, and Otto C. Boerman: Antibody-guided radiation therapy of cancer. Cancer and Metastasis Reviews 24: 539-567, 2005. Use of exemplary radiopharmaceutical agents named ¹³¹ L-Tositumomab, ⁹⁰ Y-lbritumomab alias ⁹⁰ Y-Zevalin alias Tiuxetan, ⁹⁰ Y-epratuzumab (hLL2), and ¹³¹ L-Lym-1 describes eg David M. Goldenberg: The role of radiolabeled antibodies in the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: the coming of age of radioimmunotherapy. Critical Reviews in Oncology / HematologyW: 195-201, 2001.

Je potřebné pochopit, že literatura pokrývající dosavadní stav v relevantních oborech je velice obsáhlá: Pro “antibodies, radioiodination” je např. možné elektronicky shromáždit víc než 100 000 odkazů. Informace navíc ktém, jež jsou uvedeny shora, přináší mnoho dalších odkazů, včetně např. US Patent 7147856 Stable radioiodine conjugates and methods of their synthesis (2006); US Patent 4735792 - Radioiodinated maleimides and use as agents for radiolabeling antibodies (1988); EP 1 964 847 A2 - Method and apparatus for continuous large-scale radiolabeling of proteins (2004); US Patent 6998106 - Radioconjugation of internalizing antibodies (2006); Irving L. Spař, William F. Bale, David Marrack, William C. Dewey, Robert J. McCardle, Paul V. Harper: ¹³¹l-labeled antibodies to human fibrinogen. Diagnostic studies and therapeutic trials. Cancer 20: 865-870 (2006); Patel, Sunil J.; Shapiro, William R.; Laske, Douglas W.; Jensen, Randy L.; Asher, Anthony L.; Wessels, Barry W.; Carpenter, Susan P.; Shan, Joseph S.: Safety and Feasibility of Convection-enhanced Delivery of Cotara for the Treatment of Malignant Glioma: Initial Experience in 51 Patients. Neurosurgery 56:1243-1253 (2005).It is necessary to understand that the literature covering the state of the art in the relevant fields is very extensive: For example, more than 100,000 references can be collected electronically for “antibodies, radioiodination”. In addition, the above information provides many other references, including, for example, US Patent 7147856, Stable Radioiodine Conjugates and Methods of Their Synthesis (2006); US Patent 4,735,792 - Radioiodinated Maleimides and Use as Agents for Radiolabeling Antibodies (1988); EP 1 964 847 A2 - Method and apparatus for continuous large-scale radiolabeling of proteins (2004); U.S. Patent 6998106 - Radioconjugation of internalizing antibodies (2006); Irving L. Spar, William F. Bale, David Marrack, William C. Dewey, Robert J. McCardle, Paul V. Harper: ¹³¹ l-labeled antibodies to human fibrinogen. Diagnostic studies and therapeutic trials. Cancer 20: 865-870 (2006); Patel, Sunil J .; Shapiro, William R .; Laske, Douglas W .; Jensen, Randy L .; Asher, Anthony L .; Wessels, Barry W .; Carpenter, Susan P .; Shan, Joseph S .: Safety and Feasibility of Convection-Enhanced Delivery of Cotara for the Treatment of Malignant Glioma: Initial Experience in 51 Patients. Neurosurgery 56: 1243-1253 (2005).

PODSTATA VYNÁLEZUSUMMARY OF THE INVENTION

Tento vynález poskytuje rekombinantní bílkoviny upravené pro přímou radiojodaci tak, že obsahují vložený segment polypeptidového řetězce schopného vytvářet kovalentní vazby mezi svými tyrosinovými zbytky a užitečným radionuklidem jódu. Konkrétněji: Dodatečné tyrosinové zbytky obsažené ve vloženém segmentu polypeptidového řetězce poskytují upravené rekombinantní bílkovině vyšší kapacitu k radiojodaci v porovnání s původní bílkovinou, jež je předmětem zájmu. V důsledku toho se dosahuje vyšší specifické radioaktivity. Specifická radioaktivita vykazujeThe present invention provides recombinant proteins adapted for direct radioiodination such that they contain an inserted segment of a polypeptide chain capable of forming covalent bonds between its tyrosine residues and a useful iodine radionuclide. More specifically, the additional tyrosine residues contained in the inserted segment of the polypeptide chain provide the engineered recombinant protein with a higher capacity for radioiodination compared to the parent protein of interest. As a result, higher specific radioactivity is achieved. It exhibits specific radioactivity

·.: ϊ . ί · · *; ; ί·. ί · · *; ; ί

·..··..· ·· ·· závislost ne počtu tyrosinů v proteinové molekule a závislost může být blízká přímé úměrnosti. Jiným aspektem vynálezu je možné snížení škodlivých účinků jodace esenciálních aminokyselinových zbytků pokud se použije limitující množství radionuklidu jódu: V tomto případě bude specifická radioaktivita zvýšena méně nebo vůbec, ale část radioaktivního označení proběhne na přidaných tyrosinových zbytcích vneseného polypeptidového segmentu místo na „citlivých“ tyrosinových zbytcích původního proteinu. Úprava zahrnuje několik důležitých kroků: V prvním kroku je vybrána struktura polypeptidového řetězce jenž má být vnesen, s výhodou z databáze proteinových struktur, a pak je získán v materiální formě z reprezentativní banky cDNA. Druhý krok úpravy zahrnuje konstrukci rekombinantní bílkoviny tak, aby obsahovala vnesený segment polypeptidového řetězce funkční v radiojiodaci ve žádoucí pozici polypeptidového řetězce bílkoviny, jež má být jódována a případně tak, aby obsahovala násobně vnesené sekvence aminokyselin funkčních v radiojodaci.The dependence on the number of tyrosines in the protein molecule and the dependence may be close to direct proportionality. Another aspect of the invention is to reduce the harmful effects of iodination of essential amino acid residues when a limiting amount of iodine radionuclide is used: In this case, specific radioactivity will be increased less or not at all, but part of the radiolabel will take place on added tyrosine residues. of the original protein. The treatment involves several important steps: In the first step, the structure of the polypeptide chain to be introduced, preferably from a database of protein structures, is selected and then obtained in material form from a representative cDNA bank. The second treatment step involves the construction of a recombinant protein to contain a radioactive iodinated polypeptide chain segment inserted at the desired position of the polypeptide chain of the protein to be iodinated and optionally to contain multiple amino acid functional amino acid sequences introduced.

Dosavadní znalosti v oboru nepopisovaly ani nenavrhovaly rekombinantní bílkovinu upravenou podle předkládaného vynálezu. Každému, byť jen poněkud zběhlému v oboru, bude zřejmé, že limitace výsledku přímé radiojodace počtem tyrosinových zbytků v bílkovinné molekule byla v oboru jíž drive implicitně chápána; navzdory tomuto pochopeni, myšlenka účelového zvýšení počtu tyrosinových zbytků pomocí technologie rekombinantních bílkovin nebyla dříve vzata do úvahy.The prior art has not described or suggested a recombinant protein modified in accordance with the present invention. It will be apparent to those of ordinary skill in the art that limiting the result of direct radioiodination to the number of tyrosine residues in a protein molecule has been implicitly understood in the art; Despite this understanding, the idea of purposefully increasing the number of tyrosine residues using recombinant protein technology has not been considered before.

Předkládaný vynález nabízí různé výhody proti jiným přístupům. Zvýšení specifické radioaktivity při použití konvenčních metod přímé radiojodace je zřejmě žádoucí. Na problém škodlivých účinků radiojodace se naráží často: tento vynález umožňuje snížení nežádoucích důsledků značení za použití sníženého množství radionuklidu, ale udržení hladiny značení stejně vysoké jako u původní bílkoviny samotné. V tomto směru může být praktické rovněž zkrácení reakční doby nebo použití mírnějších reakčních podmínek. Je důležité uvědomit si, že úprava bílkoviny, jež je předmětem zájmu, se provádí v laboratorním měřítku zatímco konjugace a nepřímé postupy se nutně provádějí ve výrobním měřítku. Další aspekty výhod budou patrné z následujícího podrobného popisu vynálezuThe present invention offers various advantages over other approaches. An increase in specific radioactivity using conventional direct radioiodination methods is desirable. The problem of the harmful effects of radioiodination is frequently encountered: the present invention allows for the reduction of the undesirable consequences of labeling using a reduced amount of radionuclide, but keeping the labeling level as high as the original protein itself. In this regard, it may also be practical to shorten the reaction time or use milder reaction conditions. It is important to note that the protein treatment of interest is carried out on a laboratory scale, while conjugation and indirect procedures are necessarily carried out on a production scale. Other aspects of the advantages will be apparent from the following detailed description of the invention

PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZUDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Určité často používané výrazy mají následující významy:Certain frequently used terms have the following meanings:

“Upravený se používá ve smyslu „účelově konstruovaný“ rekombinantní protein o žádoucích vlastnostech;"Modified is used in the sense of a" purpose-designed "recombinant protein of desirable properties;

„polypeptidový segment“ nebo „segment polypeptidového řetězce“ označuje souvislou část rekombinantní bílkoviny, jež netvoří nutně doménu; z jiného pohledu může být nazírán jako „tag“ nebo „tail“ pokud je umístěn na karboxylovém konci rekombinantní bílkoviny; pokud je tento segment představován aminokyselinovou sekvencí přirozeně se vyskytující bílkoviny nebo její podstatné části, pak může být na rekombinantní protein nahlíženo jako na „fúzní protein“;"Polypeptide segment" or "polypeptide chain segment" refers to a contiguous portion of a recombinant protein that does not necessarily form a domain; in another aspect, it can be viewed as a "tag" or "tail" when placed at the carboxyl terminus of a recombinant protein; if this segment is represented by the amino acid sequence of a naturally occurring protein or a substantial part thereof, then the recombinant protein can be regarded as a "fusion protein";

„původní bílkovina/protein“ je bílkovina/protein, jež je předmětem zájmu a u níž je zamýšlena modifikace (prováděna přidáním proteinového segmentu bohatého na tyrosin s použitím technologie rekombinantních proteinů) s cílem zvýšit její kapacitu k radiojodaci;'Parent protein / protein' means a protein / protein of interest which is intended to be modified (by adding a tyrosine-rich protein segment using recombinant protein technology) in order to increase its capacity for radioiodination;

„bohatý na tyrosin“ znamená takový protein, jenž je označen v databázi proteinových struktur jako bohatý na tyrosin (jako je např. lidský heterogenní ribonukleoprotein Q3) nebo jehož obsah tyrosinových zbytků je podstatně vyšší než průměrný;'Tyrosine rich' means a protein that is identified as tyrosine rich in the protein structure database (such as human heterogeneous ribonucleoprotein Q3) or whose tyrosine residue content is significantly higher than average;

„TRS“ se používá jako zkratka pro segment bohatý na tyrosin a „scFv“ znamená jednovláknový formát variabilní domény protilátky (jako např. u „TU20 scFv“ označující tento formát protilátky se známou specifitou a vazebnou afinitou, pojmenovanou TU20)."TRS" is used to abbreviate the tyrosine-rich segment and "scFv" refers to the single-stranded format of an antibody variable domain (such as "TU20 scFv" indicating this antibody format with known specificity and binding affinity, named TU20).

Stručný popis obrázků:Brief description of pictures:

Obrázek 1 ukazuje profily radioaktivity měřené na chromatogramech alikvotů radiojodačních směsí.Figure 1 shows the radioactivity profiles measured on chromatograms of aliquots of radioiodine mixtures.

Obrázek 2 je graf in silico hydrofobicity scFv TU20-TRS.Figure 2 is a graph of silico hydrophobicity of scFv TU20-TRS.

Tento vynález poskytuje vylepšenou radiojodaci užitečných bílkovin, jež jsou předmětem zájmu. Prokázáno je, že takováto bílkovina může být vybrána, ale bez omezení, z protilátek, s výhodou z jejich rekombinantních formátů. Základním krokem úpravy je přidání segmentu bohatého na tyrosin k bílkkovině, jež je předmětem zájmu, a to tak, aby neinterferoval s biologickou aktivitou původní bílkoviny. Těm, kteří jsou zběhlí v oboru, bude zřejmé, že je výhodné prodloužit původní bílkovinu na jejím karboxylovém konci, podobně jak je tomu u jiných extensí (Jags, tafte“) nebo pro bílkovinné fúze; v tomto vynálezu je demonstrováno, že i další extense s odlišnou funkcí mohou ve struktuře upravené rekombinantní bílkoviny zůstat zachovány. V tomto vynálezu je rovněž demonstrováno, že protein, o nějž je zájem zachová svou biologickou aktivitu po přidání segmentu bohatého na tyrosin (jak je stanoveno například pro scFv s ELISA testy vazebné afinity) a že protein může být produkován rekombinantní expresí a purifikací s použitím postupů v podstatě stejných jako u původního proteinu. I bez příklonu k některé teorii se u přímé radiojodace obecně soudí, že radionuklid jódu se napojuje na tyrosinové zbytky přístupné solventu. Tento vynález ukazuje, že pro správně vybraný segment bohatý na tyrosin vykazuje profil hydrofobicity upraveného rekombinantního proteinu nízké hodnoty v oblasti segmentu bohatého na tyrosin což napovídá hydrofilní kontext přidaných tyrosinových zbytků, respektive jejich dobrou přístupnost k solventu. Předmět vynálezu je dále osvětlen pomocí následujících příkladů provedení vynálezu.The present invention provides improved radioiodination of useful proteins of interest. It is shown that such a protein can be selected, but not limited to, from antibodies, preferably from their recombinant formats. The basic treatment step is to add a tyrosine-rich segment to the protein of interest so that it does not interfere with the biological activity of the original protein. Those skilled in the art will appreciate that it is preferable to extend the original protein at its carboxyl terminus, as is the case with other extensions (Jags, tafte) or for protein fusions; in the present invention it is demonstrated that other extensions with different functions can be retained in the recombinantly engineered protein structure. It is also demonstrated in the present invention that a protein of interest retains its biological activity upon addition of a tyrosine rich segment (as determined, for example, for scFvs with ELISA binding affinity assays) and that the protein can be produced by recombinant expression and purification using procedures essentially the same as the parent protein. Even without being bound by theory, it is generally believed in direct radioiodication that iodine radionuclide attaches to solvent-accessible tyrosine residues. The present invention shows that for a correctly selected tyrosine-rich segment, the hydrophobicity profile of the modified recombinant protein exhibits low values in the region of the tyrosine-rich segment, suggesting the hydrophilic context of the added tyrosine residues, respectively, their good solvent accessibility. The invention is further illustrated by the following examples.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZUEXAMPLES OF EMBODIMENTS OF THE INVENTION

PŘÍKLAD 1: Konstrukce scFv odvozeného z myší monklonální anti-tubulinové protilátky TU20 prodloužením o segment bohatý na tyrosin odvozený od lidského cytoplasmatického proteinu interagujícího s RNA, včetně přehledu postupů exprese v E. coli a purifikace produktu.EXAMPLE 1: Construction of scFv derived from murine monclonal anti-tubulin antibody TU20 by extension of a tyrosine rich segment derived from human cytoplasmic protein interacting with RNA, including an overview of E. coli expression procedures and product purification.

Molekulární klonování se provádělo podle protokolů uváděných v J. Sambrook a D. Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (třetí vydání), CSHL Press, 2001.Molecular cloning was performed according to the protocols reported by J. Sambrook and D. Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), CSHL Press, 2001.

Pro konstrukci scFv TU20 fragmentu byla napřed izolována celková RNA z hybridomových buněk produkujících myší monklonální protilátku TU20 proti β-ΙΙΙtubulinu (dodavatel: EXBIO Praha, a.s.). Molekuly cDNA kódující variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce byly získány dvěma kroky RT-PCR: cDNA byla připravena z celkové RNA a posloužila jako templát vPCR reakcích. N-koncové primery odpovídaly experimentálně zjištěným aminokyselinovým sekvencím EVQLQQSG pro těžký (H) řetězec a DVLMTQTP pro lehký (L) řetězec. C-koncové primery pro oba řetězce odpovídaly konstatní oblasti bezprostředně přilehlé k příslušné variabilní doméně (tj. aminokyselinovým pozicím 115-123 pro H řetězec a 109-116 pro L řetězec; číslování podle Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, Η. M., Gottesmann K. S, and Foeller, C. 1991. Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication No.91-3242). PCR produkty s ověřenou sekvencí byly re-amplifikovány s primery obsahujícími restrikční místa umožňující kompletaci scFv z kódujících oblastí těžkého a lehkého řetězce.To construct the scFv TU20 fragment, total RNA was first isolated from hybridoma cells producing mouse monclonal anti-β-tubulin TU20 antibody (supplier: EXBIO Praha, a.s.). CDNA molecules encoding the heavy and light chain variable regions were obtained by two RT-PCR steps: cDNA was prepared from total RNA and served as a template in PCR reactions. The N-terminal primers corresponded to the experimentally determined amino acid sequences of EVQLQQSG for the heavy (H) chain and DVLMTQTP for the light (L) chain. The C-terminal primers for both chains corresponded to the constant regions immediately adjacent to the respective variable domain (i.e., amino acid positions 115-123 for the H chain and 109-116 for the L chain; numbering according to Kabat, EA, Wu, TT, Perry, M). , Gottesmann, K. S, and Foeller, C. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH Publication No.91-3242). Sequence-verified PCR products were re-amplified with primers containing restriction sites allowing the assembly of scFvs from the coding regions of the heavy and light chains.

(Těžký N-koncový: 5' GAA GTG CAG CTG CAG CAG TCA GG; těžký C-koncový: 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC; lehký N-koncový: 5' GCC GAT ATC GTG ATG ACA CAG TCT CC: lehký C-koncový: 5' CCG TTT GAT CTC GAG CTT GGT CCC).(Heavy N-terminal: 5 'GAA GTG CAG CTG CAG CAG TCA GG; Heavy C-terminal: 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC; Light N-terminal: 5 'GCC GAT ATC GTG light C-terminal: 5 'CCG TTT GAT (CTC GAG CTT GGT CCC).

Takto je těžký řetězec oklopen restrikčními místy Pstl a BStlI a lehkýb řetězec restrikčními místy EcoRV a Xhol; obě variabilní domény se propojí do scFv polypeptidu flexibilní spojkou (Gly₄Ser)₃ v orientaci V_L-linker-V_H. Pak scFv je na svém C-konci doplněn myc epitopem (aminokyselinovou sekvencí EQKLISEEDL) jež umožňuje detekci pomocí anti-myc protilátky. Fragmenty produkované do periplasmatického prostoru hostitelských bakterii obsahují navíc C-terminální sekvenci pěti histidinových zbytků k umožněni purifikace IMAC na Nl-agarose. Směrování syntetizovaného scFv fragmentu do periplasmatického prostoru je zajištěno signální sekvencí pelB lídru (MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA) na N-konci fragmentu. V sekvenci scFvThus, the heavy chain is flanked by the restriction sites PstI and BstIII and the light chain is restriction sites EcoRV and XhoI; both variable domains are linked to the scFv polypeptide by a flexible linker (Gly ₄ Ser) ₃ in the V _L -linker-V _H orientation. Then the scFv is complemented at its C-terminus with a myc epitope (amino acid sequence EQKLISEEDL) which allows detection with an anti-myc antibody. Fragments produced into the periplasmic space of the host bacteria additionally contain a C-terminal sequence of five histidine residues to allow the purification of IMAC on N1-agarose. The targeting of the synthesized scFv fragment into the periplasmic space is provided by the pelB leader signal sequence (MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA) at the N-terminus of the fragment. In the scFv sequence

MDIVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGTGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGSMDIVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGTGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLEIK GGGGSGGGS

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKDTFMHWVKERPEQGLEWIGRIDPAN GNTKYDPKFQGKATITADTFSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGSRYAWFVYWGQ GTTVTVSS jsou sekvence oblasti určujících komplementaritu, CDR, zvýrazněny podtržením.EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTGSGFNIKDTFMHWVKERPEQGLEWIGRIDPAN GNTKYDPKFQGKATITADTFSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARGSRYAWFVYWGQ GTTVTVSS are sequences of complementarity determining regions under CDR, CDR.

Doména bohatá na tyrosin z lidského heterogenního ribonukleoproteinu 03 (známého též jako Synaptotagmin binding, cytoplasmic RNA interacting protein; Glycine- and tyrosine-rich RNA binding protein) byla získána z lidské cDNA pomocí PCR s použitím párů příměrů přímý 5’- TATGGTCCACCTCATATGCCCCCTCCAAC-3’ zpětný 5’- TCTCTGTGAATAACCGGCTCTACCGCGGG-3’ navržených podle nukleotidové sekvence (AY034481 in NCBI; Mourelatos, Z., Ábel,Tyrosine-rich domain from human heterogeneous ribonucleoprotein 03 (also known as Synaptotagmin binding, cytoplasmic RNA interacting protein) was obtained from human cDNA by PCR using primer primers 5'- TATGGTCCACCTCATATGCCCCCTCCAAC-3 reverse 5'- TCTCTGTGAATAACCGGCTCTACCGCGGG-3 'designed according to nucleotide sequence (AY034481 in NCBI; Mourelatos, Z., Abel,

L., Yong, J., Kataoka, N., and Dreyfuss, G. 2001, EMBO J. 20, 5443-5452). Reakce PCR poskytla 279 bp fragment, jenž byl klonován do pUC18 Smál s následným ověřením sekvence.L., Yong, J., Kataoka, N., and Dreyfuss, G. 2001, EMBO J. 20, 5443-5452). The PCR reaction yielded a 279 bp fragment that was cloned into pUC18 SmaI followed by sequence verification.

Tento plasmid posloužil jako templát pro PCR re-amplifikaci s použitím primerů nevržených tak, aby byl získán sub-fragment délky 37 aminokyselinových zbytků kódující segment bohatý na tyrosin obklopený BspE1 místy (TCCGGA) potřebnými pro následné klonování:This plasmid served as a template for PCR re-amplification using primers not designed to obtain a sub-fragment of 37 amino acid residues in length encoding the tyrosine-rich segment flanked by BspE1 sites (TCCGGA) required for subsequent cloning:

přímý 5’- AACTCCGGAGGTGGTTATGGATATCCT-3’ zpětný 5’- GGGTCCGGAATAACCATAGTATGGATC -3’ *♦direct 5 '- AACTCCGGAGGTGGTTATGGATATCCT-3' back 5 '- GGGTCCGGAATAACCATAGTATGGATC -3' *

Produkt re-amplifikace byl klonován do pUC18 Smál a po ověření sekvence byl použit jako zdroj insertu BspE1-BspE1 obsahujícího segment bohatý na tyrosin (16 Tyrz 37 aminokyselin).The re-amplification product was cloned into pUC18 SmaI and, after sequence verification, used as the source of the BspE1-BspE1 insert containing a tyrosine rich segment (16 Tyrz 37 amino acids).

Tento insert byl pak klonován do vektoru kódujícího TU20 scFv, v němž bylo unikátní BspE1 místo vytvořeno cílenou mutagenesou na konci těžké variabilní domény.This insert was then cloned into a vector encoding a TU20 scFv in which a unique BspE1 site was created by targeted mutagenesis at the end of the heavy variable domain.

Po ligaci byla pomoci sekvenování určena orientace insertu; byly identifikovány tři produkty jež měly insert(y) ligován(y) ve správné orientaci a to produkty, v nichž byl segment bohatý na tyrosin přítomen v jedné, dvou nebo třech kopiíchAfter ligation, the orientation of the insert was determined by sequencing; three products were identified that had the insert (s) ligated in the correct orientation, namely products in which the tyrosine-rich segment was present in one, two or three copies

Finální konstrukty tedy kódovaly TU20 scFv v následujících formátech L-15AA spojka-H-TRS-myc-Hiss;Thus, the final constructs encoded the TU20 scFv in the following L-15AA linker-H-TRS-myc-Hiss formats;

L-15AA spojka-H-TRS-TRS-myc-His₅; a L-15AA spojka-H-TRS-TRS-TRS-myc-His₅.L-15AA-H-TRS-TRS-myc-His ₅ linker; and L-15AA linker-H-TRS-TRS-TRS-myc-His ₅ .

Tyto TU20 scFv ve všech třech shora popsaných formátech byly produkovány identickým postupem rekombinantní exprese v E. coli BL21 (DE3) směrované do bakteriálního periplasmatického prostoru. Inokulum transformovaných bakteriálních buněk bylo typicky přeneseno do dvanácti baněk na třepáni, z nichž každá obsahovala 500 ml kompletního růstového média. Kultivace probíhala při 37 °C do dosažení hustoty Assonm kolem 1,0 a pak byla teplota snížena na 20 °C a kultury byly indukovány ethylthiogalactosidem (ETG) a ponechány růst dalších 3 až 5 hodin. Periplasmatické bílkoviny byly izolovány z buněk podrobených osmotickému šoku; afinitní chromatografii na kolonách Ni-CAM HC Resin (Sigma) byla podrobena jak periplasmatické tekutina, tak solubilizované periplasmatické inkluze. Kolony byly eluovány pufry obsahujícícmi imidazol a frakce obsahující produkt byly případně dále purifikovány jontoměničovou chromatografii na Mono Q HR. Typické výtěžky homogenních bílkovin byly kolem 0,5 mg na litr kultivačního média.These TU20 scFvs in all three formats described above were produced by an identical recombinant expression procedure in E. coli BL21 (DE3) directed to the bacterial periplasmic space. The inoculum of transformed bacterial cells was typically transferred to twelve shake flasks each containing 500 ml of complete growth medium. Cultivation was carried out at 37 ° C to an Assonm density of about 1.0 and then the temperature was lowered to 20 ° C and the cultures were induced with ethylthiogalactoside (ETG) and allowed to grow for an additional 3-5 hours. Periplasmic proteins were isolated from cells subjected to osmotic shock; Ni-CAM HC Resin (Sigma) affinity chromatography was subjected to both periplasmic fluid and solubilized periplasmic inclusions. The columns were eluted with buffers containing imidazole and the product containing fractions were optionally further purified by ion exchange chromatography on Mono Q HR. Typical yields of homogeneous proteins were about 0.5 mg per liter of culture medium.

PŘÍKLAD 2: Vazebná afinita TU20 scFv, TU20 scFv-TRS, a jódovaných TU20 scFv a TU20 scFv-TRS k β-lll-tubulinovému epitopovému peptidu.EXAMPLE 2: Binding affinity of TU20 scFv, TU20 scFv-TRS, and iodinated TU20 scFv and TU20 scFv-TRS to the β-III-tubulin epitope peptide.

Porovnání vazebných afinit TU20 scFv, TU20 scFv-TRS, a jódovaných TU20scFv a TU20 scFv-TRS k β-lll-tubulinovému epitopovému peptidu bylo provedeno s použitím postupů ELISA v oboru dobře známých. Bílkoviny TU20 scFv a • « · • ···Comparison of the binding affinities of the TU20 scFv, TU20 scFv-TRS, and the iodinated TU20 scFv and TU20 scFv-TRS to the β-III-tubulin epitope peptide was performed using ELISA procedures well known in the art. Proteins TU20 scFv and • «· • ···

TU20 scFv-TRS byly získány jak je shrnuto shora a jejich jodace byla provedena v podstatě tak, jak je popsáno níže sub Příklad 4, ale s neradioaktivním („studeným“) Nal.TU20 scFv-TRS were obtained as summarized above and their iodination was performed essentially as described below under Example 4 but with non-radioactive ("cold") NaI.

Na všechny jamky ELISA destičky bylo naneseno 200 ng β-111-tubulinového epitopového peptidu CESESQGPK konjugovaného k bovinnímu sérovému albuminu a ponecháno reagovat sTU20 scFv proteiny jak ukazuje následující znázornění (v negativních kontrolách nebyla přidána žádná bílkovina):200 ng of β-111-tubulin epitope peptide CESESQGPK conjugated to bovine serum albumin was loaded on all wells of the ELISA plate and allowed to react with TU20 scFv proteins as shown in the following illustration (no protein was added in negative controls):

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 A AND B (B) 500 ng I scFv 500 ng I scFv 500 ng scFv 500 ng scFv 500 ng IscFvTRS 500 ng IscFvTRS 500 ng scFv TRS 500 ng scFv TRS IgG kontrola IgG control C C 500 ng I scFv 500 ng I scFv 500 ng scFv 500 ng scFv 500 ng IscFvTRS 500 ng IscFvTRS 500 ng scFv TRS 500 ng scFv TRS IgG kontrola IgG control D D 100 ng I scFv 100 ng I scFv 100 ng scFv 100 ng scFv 100 ng I scFv TRS 100 ng I scFv TRS 100 ng scFv TRS 100 ng scFv TRS IgG kontrola IgG control E E 100 ng I scFv 100 ng I scFv 100 ng scFv 100 ng scFv 100 ng IscFvTRS 100 ng IscFvTRS 100 ng scFv TRS 100 ng scFv TRS IgG kontrola IgG control F F 20 ng I scFv 20 ng I scFv 20 ng scFv 20 ng scFv 20 ng IscFvTRS 20 ng IscFvTRS 20 ng scFv TRS 20 ng scFv TRS negativní kontrola negative control G G 20 ng I scFv 20 ng I scFv 20 ng scFv 20 ng scFv 20 ng IscFvTRS 20 ng IscFvTRS 20 ng scFv TRS 20 ng scFv TRS negativní kontrola negative control

Bílkoviny TU20 scFv byly vyvíjeny druhou protilátkou prostřednictvím c-myc úseku (anti-cmyc/Px konjugovanou myší monoklonální protilátkou, Roche) a positivní kontroly konjugátem králičí polyklonální protilátky (RAM/Px, Sigma).The TU20 scFv proteins were developed by the second antibody through the c-myc region (anti-cmyc / Px conjugated mouse monoclonal antibody, Roche) and the positive control with rabbit polyclonal antibody conjugate (RAM / Px, Sigma).

Následující tabulka ukazuje odečty absorbance při 492 nm:The following table shows the absorbance readings at 492 nm:

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 A AND B (B) 1,516 1,516 1,155 1,155 1,198 1,198 0,977 0,977 1,031 1,031 C C 1,453 1,453 1,028 1,028 1,237 1,237 0,967 0,967 1,229 1,229 D D 0, 524 0, 524 0,722 0,722 0,476 0.476 0,447 0.447 0,724 0,724 E E 0,526 0.526 0,697 0,697 0,452 0.452 0,406 0.406 0,744 0.744 F F 0,263 0.263 0,361 0.361 0,164 0.164 0,075 0,075 -0,011 -0.011 G G 0,266 0.266 0,349 0.349 0,163 0.163 0,056 0,056 -0,014 -0.014

Data ve sloupcích ukazují, že úprava TU20 scFv vnesením segmentu bohatého na tyrosin není provázena žádnou ztrátou vazebné afinity (při vztažení na molární množství použitá v testu). Porovnání dat ve sloupcích 2 vs. 3 a 4 vs. 5 ukazuje, že s jodací nedochází k žádnému poklesu vazebné afinity.The data in the columns indicate that treatment of the TU20 scFv by introducing a tyrosine-rich segment is not accompanied by any loss of binding affinity (based on the molar amounts used in the assay). Compare data in columns 2 vs. 3 and 4 vs. 5 shows that there is no decrease in binding affinity with iodination.

PŘÍKLAD 3: ¹²⁵l-radiojodační kapacity původního TU20 scFv a upravených rekombinantních bílkovin TU20 scFv-TRS a TU20 scFv-TRS-TRS stanovené za použití postupu s Chloraminem T.EXAMPLE 3: ¹²⁵ l-radioiodinating capacity of the original TU20 scFv and the modified recombinant TU20 scFv-TRS and TU20 scFv-TRS-TRS proteins determined using the Chloramine T procedure.

Radiojodační reakce v tomto příkladu obsahovaly následující množství reakčních složekThe radioiodination reactions in this example contained the following amounts of reactants

scFv scFv scFv-TRS scFv-TRS scFv-TRS-TRS scFv-TRS-TRS 1251 (MBq) 1251 (MBq) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,32 2.32 Protein (pg) Protein (pg) 0,094 0,094 0,094 0,094 0,095 0,095 Molekulová hmotnost (Da) Molecular weight (Da) 28 450 28 450 33 033 33 033 37 908 37 908 Protein (nmol) Protein (nmol) 0,0033 0,0033 0,00284 0.00284 0,0025 0,0025

v konečném objemu 100 plin a final volume of 100 µl

V tomto příkladě představoval počet atomů ¹²⁵l v 2 - 2,32 MBq beznosičového radionuklidu použitých v reakci mírný přebytek nad počtem tyrosinových zbytků v 0,094 pg přítomného TU20 scFv a o trochu méně než ekvivalent k počtu tyrosinových zbytků v 0,094 pg TU20 scFv-TRS.In this example, the number of atoms of ¹²⁵ lv 2-2.32 MBq of the carrierless radionuclide used in the reaction represented a slight excess over the number of tyrosine residues in 0.094 pg of TU20 scFv present and slightly less than the equivalent of the number of tyrosine residues in 0.094 pg TU20 scFv-TRS.

Reakce byly nastartovány přidáním činidla s Chloraminem T, ponechány probíhat 1 minutu a pak ukončeny přidáním Na₂S2O₃. Vzorky reakčních směsí byly podrobeny TLC chromatografii s ethanolem jako mobilní fází (Obr. 1).Reactions were started by adding the reagent with Chloramine T, allowed to proceed for 1 minute and then terminated by the addition of Na ₂ S ₂ O ₃ . Samples of the reaction mixtures were subjected to TLC chromatography with ethanol as the mobile phase (Fig. 1).

Zvýšené radiojodační kapacity odpovídající vnesení segmentu bohatého na tyrosin do bílkovinných struktur se projevuji v Obr. 1 jako zvětšené plochy vrcholů příslušných bílkovině. Kvantitativní výsledky byly získány přepočtem na úplné reakční objemy a molární množství proteinů a jsou shrnuty v následující tabulceIncreased radioiodination capacities corresponding to the introduction of a tyrosine-rich segment into protein structures are shown in FIG. 1 as enlarged areas of the respective protein peaks. Quantitative results were obtained by recalculating to total reaction volumes and molar amounts of proteins and are summarized in the following table

protein protein Celk. MBq v proteinu Total MBq in protein Výtěžek % Yield% MBq na nmol proteinu MBq per nmol protein počet Tyr zbytků number of Tyr residues MBq na Tyr zbytek MBq to Tyr Rest TU 20 scFv TU 20 scFv 0,87 0.87 43 43 264 264 11 11 24 24 TU 20 scFvTRS TU 20 scFvTRS 1,32 1.32 61 61 465 465 27 (11+16) 28 (11 + 16) 17.2 17.2 TU 20 scFvTRS-TRS TU 20 scFvTRS-TRS 1,35 1.35 58 58 540 540 43 (11+16+16) 43 11 + 16 + 16 12,6 12.6

Jak je vidět, rekombinantní bílkoviny obsahující TRS nebo TRS-TRS jsou značeny na vyšší specifickou radioaktivitu (MBq/nmol) a se zvýšeným výtěžkem v porovnání s původním proteinem.As can be seen, recombinant proteins containing TRS or TRS-TRS are labeled for higher specific radioactivity (MBq / nmol) and with increased yield compared to the parent protein.

Podstatný nárůst je zjištěn při porovnání výsledků s TU20 scFv a TU20 scFvTRS a radioaktivita kalkulovaná „na tyrosinový zbytek“ se zde příliš neliší. Méně příznivý je další zvyšování, jaké je pozorováno při porovnání značení TU20 scFv-TRS a TU20 scFv-TRS-TRS: Zde radioaktivita braná „na tyrosinový zbytek“ vykazuje podstatný pokles. Toto pozorování lze vysvětlit několika způsoby, např. tím, že množství radionuklidu v reakci není dostatečné nebo tím, že v prostorové struktuře proteinu TU20 scFv-TRS-TRS existují sterické překážky.A significant increase is found when comparing the results with TU20 scFv and TU20 scFvTRS and the radioactivity calculated "on the tyrosine residue" does not differ much here. Less favorable is the further increase observed when comparing the TU20 scFv-TRS and TU20 scFv-TRS-TRS labels: Here, the radioactivity taken "to the tyrosine residue" shows a significant decrease. This observation can be explained in several ways, for example by the fact that the amount of radionuclide in the reaction is not sufficient or that steric hindrances exist in the spatial structure of the scFv-TRS-TRS TU20 protein.

PŘÍKLAD 4: ¹²⁵l-radiojodace původního TU20 scFv a upravených rekombinantních proteinů TU20 scFv-TRS a TU20 scFv-TRS-TRS s použitím různých limitujících množství ¹²⁵l (lodogenová metoda).EXAMPLE 4: ¹²⁵ l-Radioiodization of the original TU20 scFv and the modified recombinant TU20 scFv-TRS and TU20 scFv-TRS-TRS proteins using various limiting amounts of ¹²⁵ L (the lodogen method).

K radiojodačním reakcím bylo smícháno 10 μς proteinu s Na[¹²⁵l] ve zkumavce pokryté 20 gg of lodoGenu a inkubováno po 10 min při laboratorní teplotě. Ke značení byly použity aktivity ¹²⁵l od 18,5 do 75 MBq. Volný ¹²⁵l byl odstraněn chromatografií na koloně PD-10 s použitím eluentu 0,01 % BSA v 0,01 M Tris, pH 7,4. Radioaktivní značení proteinu bylo stanoveno pomoci instantní chromatografie na tenké vrstvě (ITLC) s 0,1 M citrátovým pufrem (pH 6,0) jako mobilní fází.For radioiodination reactions, 10 μς of protein was mixed with Na [ ¹²⁵ L] in a tube coated with 20 gg of lodoGen and incubated for 10 min at room temperature. ¹²⁵ l activities from 18.5 to 75 MBq were used for labeling. Free ¹²⁵ L was removed by PD-10 column chromatography using 0.01% BSA eluent in 0.01 M Tris, pH 7.4. Radiolabeling of the protein was determined by Instant Thin Layer Chromatography (ITLC) with 0.1 M citrate buffer (pH 6.0) as the mobile phase.

Výsledky jsou shrnuty v následujících tabulkáchThe results are summarized in the following tables

TU20 scFv:TU20 scFv:

¹Ί aktivita [MBq] ¹ Ί activity [MBq] 18.5 18.5 37 37 74 74 Výtěžek značení [%] Labeling yield [%] 73.6 73.6 81,8 81.8 74 74 Specifická aktivita [MBq/nmol proteinu] Specific activity [MBq / nmol of protein] 25.4 25.4 54 54 118.2 118.2 Specifická aktivita [nmol ¹l/nmol proteinu]Specific activity [nmol ¹ l / nmol protein] 0,3 0.3 0,67 0.67 1,46 1.46

TU20 scFv-TRS:TU20 scFv-TRS:

¹²Ί aktivita [MBq] ¹² Ί activity [MBq] 18.5 18.5 37 37 74 74 Výtěžek značení [%] Labeling yield [%] 84.9 84.9 87.4 87.4 89.2 89.2 Specifická aktivita [MBq/nmol proteinu] Specific activity [MBq / nmol of protein] 34.5 34.5 89.8 89.8 152,7 152.7 Specifická aktivita [nmol ¹²® l/nmol proteinu]Specific activity [nmol ¹² ® l / nmol protein] 0,4 0.4 1,1 1.1 1,9 1.9

TU20 scFv-TRS-TRSTU20 scFv-TRS-TRS

¹²⁵l aktivita [MBq] ¹²⁵ l activity [MBq] 18.5 18.5 37 37 74 74 Výtěžek značení [%] Labeling yield [%] 81,8 81.8 71,7 71.7 80,4 80.4 Specifická aktivita [MBq/nmol proteinu] Specific activity [MBq / nmol of protein] 38.6 38.6 84.3 84.3 156.3 156.3 Specifická aktivita [nmol ¹²M/nmol proteinu]Specific activity [nmol ¹² M / nmol protein] 0,5 0.5 1,1 1.1 1,9 1.9

Tyto výsledky s různými limitujícími množstvími radionuklídu ukazují a) že výtěžky značení jsou obecně vysoké; b) že specifická radioaktivita se zvyšuje zhruba úměrně zvyšujícímu se množství radionuklídu; a c) že je pozorováno zvýšení specifické radioaktivity diky přítomnosti tyrosinových zbytků v TRS nebo TRS-TRS (i když typicky menší než zvýšeni kapacity jak je stanovována v Příkladu 3 s vysokým množstvím radionuklídu). Pro rekombinantní proteiny TU20 scFv-TRS a TU20 scFvTRS-TRS tyto výsledky napovídají, že jejich TRS segmenty jsou značeny přednostně na úkor značení oblasti původního proteinu.These results with various limiting amounts of radionuclide show a) that labeling yields are generally high; (b) that the specific radioactivity increases approximately in proportion to the increasing amount of radionuclide; and c) that an increase in specific radioactivity is observed due to the presence of tyrosine residues in TRS or TRS-TRS (although typically less than the capacity increase as determined in Example 3 with a high amount of radionuclide). For the recombinant TU20 scFv-TRS and TU20 scFvTRS-TRS proteins, these results suggest that their TRS segments are preferably labeled at the expense of labeling the region of the parent protein.

PŘÍKLAD 5: Profil hydrofobicity proteinu TU20 scFv-TRS.EXAMPLE 5: Hydrophobicity profile of TU20 protein scFv-TRS.

Profil hydrofobicity byl získán z veřejně dostupného serveru s použitím programu ExPASy a následující aminokyselinové sekvence TU20 scFv-TRS (scFv zbytky 1 až 246, TRS zbytky 248 až 283)The hydrophobicity profile was obtained from a publicly available server using the ExPASy program and the following TU20 scFv-TRS amino acid sequence (scFv residues 1-246, TRS residues 248-283)

10 10 20 20 May 30 30 40 40 50 50 60 60 MDIVMTQSPL MDIVMTQSPL SLPVSLGDQA SLPVSLGDQA SISCRSSQSI SISCRSSQSI VHSNGNTYLE WYLQKPGQSP VHSNGNTYLE WYLQKPGQSP KLLIYKVSNR KLLIYKVSNR 70 70 80 80 90 90 100 100 ALIGN! 110 110 120 120 FSGVPDRFSG FSGVPDRFSG TGSGTDFTLK TGSGTDFTLK ISRVEAEDLG ISRVEAEDLG VYYCFQGSHV VYYCFQGSHV PLTFGAGTKL PLTFGAGTKL EIKGGGGSGG EIKGGGGSGG 130 130 140 140 150 150 160 160 170 170 180 180 GGSGGGGSEV GGSGGGGSEV QLQQSGAELV QLQQSGAELV KPGASVKLSC KPGASVKLSC TGSGFNIKDT TGSGFNIKDT FMHWVKERPE FMHWVKERPE QGLEWIGRID QGLEWIGRID 190 190 200 200 210 210 220 220 230 230 240 240 PANGNTKYDP PANGNTKYDP KFQGKATITA KFQGKATITA DTFSNTAYLQ DTFSNTAYLQ LSSLTSEDTA LSSLTSEDTA VYYCARGSRY VYYCARGSRY AWFVYWGQGT AWFVYWGQGT 250 250 260 260 270 270 280 280 290 290 300 300 TVTVSGGGYG TVTVSGGGYG YPPDYYGYED YPPDYYGYED YYDYYGYDYH YYDYYGYDYH NYRGGYEDPY NYRGGYEDPY YGYSGEQKLI YGYSGEQKLI SEEDLNGTHH SEEDLNGTHH

hhh (délka sekvence: 303).hhh (sequence length: 303).

Pro analýzu byly jako výpočetní parametry použity škála Hphob./Chotia s individuálními hodnotami pro 20 aminokyselin podle následující tabulkyFor analysis, the Hphob./Chotia scale was used as calculation parameters with individual values for 20 amino acids according to the following table

Ala: 0.380 Ala: 0.380 Arg: 0.010 Arg: 0.010 Asn: 0.120 Asn: 0.120 Asp: 0.150 Asp: 0.150 Cys: Cys: 0.500 0.500 Gin: 0.070 Gin: 0.070 Glu: 0.180 Glu: 0.180 Gly: 0.360 Gly: 0.360 His: 0.170 His: 0.170 lle: lle: 0.600 0.600 Leu: 0.450 Leu: 0.300 Lys: 0.030 Lys: 0.030 Met: 0.400 Met: 0.400 Phe: 0.500 Phe: 0.500 Pro: For: 0.180 0.180 Ser: 0.220 Ser: 0.220 Thr: 0.230 Thr: 0.230 Trp: 0.270 Trp: 0.275 Tyr: 0.150 Tyr: 0.150 Val: Wall: 0.540 0.540

a vážení pro posice v okénku 1......9 modelem lineárního vážení variací.and weighing for positions in window 1 ...... 9 by a linear variation weighing model.

Profil hydrofobicity je ukázán v Obr. 2: Vykazuje minimální hodnotu 0,152 a maximální hodnotu 0,359. Profil široce vykazuje nízké hodnoty hydrofobicity v oblasti segmentu bohatého na tyrosin.The hydrophobicity profile is shown in FIG. 2: Shows a minimum value of 0.152 and a maximum value of 0.359. The profile broadly shows low hydrophobicity values in the region of the tyrosine-rich segment.

Každé osobě zběhlé v oboru bude zřejmé, že tento vynález umožňuje mnohá další provedení a modifikace, jež nezmění jeho rozsah a smysl: Všechna jsou zde zahrnuta odkazem.It will be apparent to those skilled in the art that many other embodiments and modifications are possible in the present invention without departing from the spirit and scope thereof.

Claims (18)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Rekombinantní protein upravený pro přímou radioojodaci obsahující polypeptidový segment vážící radionuklid.CLAIMS 1. A recombinant protein adapted for direct radioiodination comprising a radionuclide binding polypeptide segment. 2. Rekombinantní protein podle nároku 1, vyznačující se tím, že rekombinantním proteinem je imunoglobulin nebo jeho funkční fragment.Recombinant protein according to claim 1, characterized in that the recombinant protein is an immunoglobulin or a functional fragment thereof. 3. Rekombinantní protein podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že polypeptídvý segment vážící radionuklid je bohatý na tyrosin.Recombinant protein according to claim 1 or 2, characterized in that the radionuclide-binding polypeptide segment is rich in tyrosine. 4. Rekombinantní protein podle kteréhokoli z nároků 1-3, vyznačující se tím, že polypeptidový segment vážící radionuklid je na C-konci nebo na N-konci rekombinantního proteinu.Recombinant protein according to any one of claims 1-3, characterized in that the radionuclide binding polypeptide segment is at the C-terminus or at the N-terminus of the recombinant protein. 5. Rekombinantní protein podle kteréhokoli z nároků 1-4, vyznačující se tím, že polypeptidový segment vážící radionuklid obsahuje tyrosin a jiné kódované aminokyseliny.The recombinant protein of any one of claims 1-4, wherein the radionuclide binding polypeptide segment comprises tyrosine and other encoded amino acids. 6. Rekombinantní protein podle kteréhokoli z nároků 1-5, vyznačující se tím, že počet tyrosinových zbytků v rekombinantním proteinu je řečeným polypeptidovým segmentem zvýšen na dvojnásobek, s výhodou na trojnásobek nebo více.Recombinant protein according to any one of claims 1-5, characterized in that the number of tyrosine residues in the recombinant protein is increased by two, preferably three or more, by said polypeptide segment. φ Φ·φ Φ · 7. Rekombinantní protein podle kteréhokoli z nároků 1-6, vyznačující se tím, že polypeptidový segment je složen z 20 až100 aminokyselinových zbytků.Recombinant protein according to any one of claims 1-6, characterized in that the polypeptide segment is composed of 20 to 100 amino acid residues. 8. Rekombinantní protein podle kteréhokoli z nároků 1-7, vyznačující se tím, že aminokyselinová sekvence polypeptidového segmentu je sekvence přirozeně se vyskytujícího proteinu, s výhodou přirozeně se vyskytujícího lidského proteinu.Recombinant protein according to any one of claims 1-7, characterized in that the amino acid sequence of the polypeptide segment is a naturally occurring protein sequence, preferably a naturally occurring human protein. 9. Rekombinantní protein podle kteréhokoli z nároků 1-8, vyznačující se tím, že je značen radionuklidem.Recombinant protein according to any one of claims 1-8, characterized in that it is labeled with a radionuclide. 10. Rekombinantní protein podle kteréhokoli z nároků 1-9, vyznačující s e tím, že přímé značení radionuklidem zahrnuje tvorbu kovalentní vazby.10. The recombinant protein of any one of claims 1-9, wherein direct labeling with a radionuclide involves the formation of a covalent bond. 11. Rekombinantní protein podle kteréhokoli z nároků 1-10, vyznačující s e tím, že řečený radionuklid je halogen, s výhodou jód, výhodněji jód-131 nebo jód-125 nebo jód-123.Recombinant protein according to any one of claims 1-10, characterized in that said radionuclide is halogen, preferably iodine, more preferably iodine-131 or iodine-125 or iodine-123. 12. Způsob přímého značení rekombinantniho proteinu podle kteréhokoli z nároků 9-11,vyznačující se tím, že zahrnuje přidání radion uklidu k rekombinantnímu proteinu.A method for direct labeling a recombinant protein according to any one of claims 9-11, comprising adding radion scavenger to the recombinant protein. β · ·β · · 13. Způsob přímého značení rekombinantniho proteinu podle kteréhokoli z nároků 9-12, vyznačující se tím, že zahrnuje přidání radionuklidu k rekombinantnímu proteinu v přítomnosti oxidačního činidla.A method for direct labeling a recombinant protein according to any one of claims 9-12, comprising adding radionuclide to the recombinant protein in the presence of an oxidizing agent. 14. Způsob výroby rekombinantniho proteinu podle kteréhokoli z nároků 1 -A method for producing a recombinant protein according to any one of claims 1 - 13, vyznačující se tím, že zahrnuje rekombinantní expresi.13, comprising recombinant expression. 15. Nukleová kyselina kódující rekombinantní protein podle kteréhokoli z nárokůA nucleic acid encoding a recombinant protein according to any one of the claims 1-8.1-8. 16. Způsob produkce nukleová kyseliny podle nároku 15, vyznačující se tím, že zahrnuje molekulární klonování.16. A method of producing a nucleic acid according to claim 15 comprising molecular cloning. 17. Použití značeného rekombinantniho proteinu podle kteréhokoli z nároků 9 13 k výrobě radiofarmaceutického činidla.Use of a labeled recombinant protein according to any one of claims 9 13 for the manufacture of a radiopharmaceutical agent. 18. Použití značeného rekombinantniho proteinu podle kteréhokoli z nároků 9 -Use of a labeled recombinant protein according to any one of claims 9 - 13 a 17 k zaměření diagnostických, zobrazovacích nebo terapeutických cílů.13 and 17 to target diagnostic, imaging, or therapeutic targets.