CZ2007571A3 - Prirozené brassinosteroidy pro použití pri léceníhyperproliferace, lécení proliferativních onemocnení a redukci nepríznivých úcinku steroidních disfunkcí u savcu, farmaceutické prostredky je obsahující a jejich použití - Google Patents

Abstract

Rešení se týká prirozených brassinosteroidu a jejich derivátu a farmaceutických prostredku je obsahující pro použití pri lécení savcích bunek, ruzných stavu snížení rustu nebo úplné inhibici proliferacní kapacity bunek. Vynález také zahrnuje zastavení bunecného cyklu pomocí prirozených brassinosteroidu vedoucích k apoptickým zmenám v nádorových bunkách. Dále se predložené rešení týká použití brassinosteroidu pro lécení nepríznivých úcinku hyperproliferace u savcích bunek in vitro a in vivo.

Description

(57) Anotace:

Řešení se týká přirozených brassinosteroidů a jejich derivátů a farmaceutických prostředkuje obsahující pro použití při léčení savčích buněk, různých stavů snížení růstu nebo úplné inhibici proliferační kapacity buněk. Vynález také zahrnuje zastavení buněčného cyklu pomocí přirozených brassinosteroidů vedoucích k apoptickým změnám v nádorových buňkách. Dále se předložené řešení týká použití brassinosteroidů pro léčení nepříznivých účinků hyperproliferace u savčích buněk in vitro a in vivo.

• · · · ·· * · · ·· • · ·· ··«··· • · ♦ · · · · · · ··· • · · · · · · *· φ ·* ·· «·· ·« ·« * ί ř

Přirozené brassinosteroidy pro použití při léčení hyperproliferace, léčeníj proliferativních onemocnění a redukci nepříznivých účinků steroidních dysfunkcí u savců, farmaceutické prostředky je obsahující a jejich použití

Oblast techniky jt

Vynález se týká brassinosteroidů a jejich derivátů pro použití při léčení hypeproliferace savčích buněk, léčení proliferativních onemocnění u savců aΊ regulaci nepříznivých efektů steroidních dysfunkcí u savčích buněk a savců.)

Vynález rovněž zahrnuje použití přirozených brassinosteroidů a jejich derivátů v protinádorové terapii.

Dosavadní stav techniky

Tento vynález se týká přirozených brassinosteroidů, farmaceutických přípravků obsahující tyto sloučeniny a jejích využití, především v protinádorové . terapii.

Brassinosteroidy jsou rostlinné hormony steroidní povahy s důležitými regulačními funkcemi ve fyziologických procesech zahrnujících růst, diferenciaci a prodlužování kořene i stonku, rezistenci vůči chorobám a odolnost rostlin vůči stresu a senescenci (Bajguz a spol., Phytochemistry 2003, 62, 1027-1046). Tato skupina rostlinných steroidů zahrnuje více než 70 sloučenin vyskytujících se od nižších po vyšší rostliny. Byly objeveny a izolovány ze semen, plodů, listů, hálek a pylu (Sasse J., v: Brassinosíeroids: Steroidal Planí Hormones·, Springer-Verlag, Tokyo, 1999;

str. 219-262; Khripach a spol., A new class of Planí Hormones, Academie Press; San Diego, 1999, str. 456). Brassinosteroidy jsou strukturně velmi podobné živočišným steroidním hormonům. Stejně jako jejich živočišná analoga regulují expresi četných genů, ovlivňují aktivitu komplexních metabolických drah a přispívají k regulaci dělení a diferenciaci buněk. Jsou rovněž zapojeny v regulaci fotomorfogeneze a buněčného růstu (Clouse, Current Biol. 2002,12,485-487). Právě vysoká biologická aktivita brassinosteroidů přilákala pozornost řady specialistů z oblasti chemie, biologie, farmakologie a zemědělství.

« * · · ···· · · · • · *« ··« · · ♦ • · · · · · · · ♦ · · ♦ « * « « · ♦ · « * « ·· ·· ··· ·· ·· ·

Brassinolíd (1), brassinosteroid s nej vyšší biologickou aktivitou, byl poprvé izolován v roce 1979 z pylu řepky (Brassica napus) (Grove a spol., Nátuře 1979, 281, 216-217). Do dnešní doby byl brassinolíd vzorce 1 identifikován ve všech dosud studovaných rostlinných druzích (Bajguz a spol., Phytochemistry 2003, 62, 1027-1046; Zullo a spol., Braz. J. Plant Physiol. 2002,14,143-181). Barssinolid (1) je přítomný v rostlinných pletivech ve velmi nízkých koncentracích (pmol/g čerstvé váhy) a jeho syntéza je velmi obtížně realizovatelná. Z tohoto důvodu je současný výzkum zaměřen převážně na vývoj stejně účinných ale snadněji dostupných sloučenin. Některé ze synteticky připravených brassinosteroidů byly později nalezeny i v přírodě (Soeno a spol., Biosc. Biotechnol. Biochem. 2000, 64, 702709). Příklad takové sloučeniny, která je poměrně snadno synteticky dostupná v porovnání s brassiniolidem, je jeho 24-epimer, 24-epíbrassinolid (vzorce 6) (Back a spol., J. Org. Chem. 1997, 62, 1179-1182). Tento brassinosteroid je proto nejstudovanější sloučeninou a je nejlepším kandidátem pro praktické využití.

Prozatím byly popsány značně protikladné účinky brassinosteroidů na buněčné dělení u různých rostlinných druhů a kultivovaných buněčných linií. Účinek brassinosteroidů na buněčné dělení byl prokázán jako převážně podpůrný. Nahrazují účinky cytokininů (brassínosteroidy a cytokininy indukují expresi genu cycD3) a podporují buněčné dělení v průběhu časných fází růstu buněčných kultur, což naznačuje, že brassinosteroídy jsou limitujícím faktorem indukce buněčného cyklu (Hu a spol., Plant J. 2000,24, 693-701, Miyazawa a spol. J. Exp. Bot. 2003, 54,2669-2678).

V dnešní době jsou již také známy některé léčebné aplikace brassinosteroidů. Wachsman a spol. (Antivir. Chem. Chemother. 2000, 11, 71-77; Chemother. 2002, 13, 61-66) popsal in vitro antivirální účinek některých přirozených brassinosteroidů (28-homocastasteronu - 9 , 28-homobrassinolidu - 2) a jejich syntetických analog proti několika patogenním virům, např. herpes simplex viru typu 1 (HSV-1), arenaviru a spalničkovému viru (MV). Některá analoga brassinolidu mají 10 až 18krát vyšší účinek než ribavirin (používaný jako srovnávací lék) pro HSV-1 a arenaviiy. Jsou však nutné ještě další studie k přesnému popisu antivirálního mechanismu účinku těchto brassinosteroidů in vitro a korelaci vztahů molekulární struktury a bíoaktivity. Franěk a spol. (Franěk a spol., Coll. Czech Chem. Commun. 2003, 68, 2190-2200) popsali možný účinek 24-epibrassinolidu (6) na kultivované • φφ • · · · * · · · ♦ · ·· • » · φ · · φ · · · ·· ·· ··· «· ♦* « buňky myšího hybridomu. Typické účinky látky 6 byly: a) nárůst hodnoty mitochondriálního membránového potenciálu, b) snížení intracelulámího množství protilátek, c) nárůst počtu buněk v Go/Gi fázi buněčného cyklu a d) více versa snížení počtu buněk v S-fázi, Kromě toho byla hustota živých buněk významně vyšší po aplikaci 24-epibrassinolidu v rozmezí koncentrací 10 až 10' M (Franěk a spol., Coll. Czech Chem. Commun, 2003,68,2190-2200.).

Zjistili jsme, že řada přirozených brassinosteroidů efektivně ínhibuje růst mnoha různých nádorových buněčných linií v mikromolámích koncentracích, přestože mají minimální účinek na normální buňky. Cytotoxická aktivita může alespoň částečně souviset s interakcemi se steroidními receptory. Brassinosteroidy jsou zcela novou skupinou látek, u kterých dosud není zcela objasněn mechanismus jejich účinku na molekulární úrovni. Prokázali jsme však, že aplikace brassinosteroidů indukuje cytotoxicitu a způsobuje inhibici růstu buněk karcinomu prsu a prostaty. Proto mohou být použity jako antimitotické a apoptické léky, především v protinádorové terapii.

Podstatou tohoto vynálezu jsou protinádorové sloučeniny na bázi přirozených brassinosteroidů, které mají vysoký index selektivity a efektivity, tzn. jsou méně toxické avšak účinnější než dříve známá analoga.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I

R znamená CH2 nebo O-CH2 skupinu,

R znamená atom vodíku nebo hydroxyl,

R³ znamená hydroxyl,

I * « * ··* · *· ® · ·> «·«·«· • · · · · · · · · · ·· • · · · · · ♦ · ♦· «· ·· ♦·* ♦· ·· ·

R²⁴ znamená alkyl nebo alkenyl vybrané ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, methylen, ethylen a propylen, a

R znamená alkyl vybraný ze skupiny zahrnující methyl a ethyl, a jejich farmaceuticky použitelné soli, pro použití při léčení hyperproliferace savčích buněk aplikací účinného množství uvedených přirozených brassinosteroidů.

Vynález zahrnuje přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I a jejich použití k inhibicí buněčné proliferace a indukci apoptosy.

Předmětem vynálezu jsou rovněž přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I pro použití při léčení proliferace a indukce apoptosy u savčích buněk, podle kterého se podává terapeuticky účinné množství uvedených brassinosteroidů obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky použitelné soli. Přirozené brassinosteroidy jsou využitelné zejména pro použití při lečem onemocnění, z nichž některé zahrnují buněčnou proliferaci a mezi které patří nádory, Alzheimerova choroba, Huntingtonova choroba, steroidy-indukovaná osteoporóza, poruchy sexuální diferenciace, hyperadrenokorticismus asociovaný s přebytkem sexuálních steroidů, androgen insenzitivni syndrom, glukokortikoid-insenzitivní astma, steroidy-indukovaná katarakta a deficience P450 oxidoreduktasy.

Předmětem vynálezu je rovněž použití přirozených brassinosteroidů obecného vzorce I jako růstových regulátorů při regulací proliferace a morfogeneze živočišných a lidských buněk v tkáňových kulturách.

Předmětem vynálezu jsóU také deriváty brassinosteroidů podle nároku 1 obecného vzorce I pro použití jako léčiva.

Předmětem vynálezu jsou rovněž farmaceutické přípravky, které zahrnují substituované přirozené brassinosteroidy a nebo jejich substituované analogy a farmaceuticky přijatelné nosiče.

Další předmětem vynálezu jsou farmaceutické přípravky, které zahrnují v příměsi jeden nebo více farmaceutických kompozit.

Vynález rovněž zahrnuje deriváty brassinosteroidů ve formě volné sloučeniny obecného vzorce I nebo ve formě farmaceuticky přijatelných solí. Farmaceuticky přijatelná sůl může být sůl takovéto sloučeniny s alkalickým kovem, amoniakem či aminem ve formě racemátu nebo opticky aktivního isomeru, nebo jeho adiční sůl s kyselinou, včetně pomocných látek.

Předmětem vynálezu jsou dále brassinosteroídy nebo jejich deriváty pro použití při léčení hyperproliferativních onemocnění savčích buněk, zahrnující aplikaci efektivního množství přirozených brassinosteroídů nebo jejich derivátů pro potřeby takové ošetření savčích buněk.

Podrobný popis vynálezu

Předmětem vynálezu jsou přirozené brassinosteroídy obecného vzorce I

OH R²⁴

v němž

R znamená CHj nebo O-CH2 skupinu,

R² znamená atom vodíku nebo hydroxyl,

R³ znamená hydroxyl,

R²⁴ znamená alkyl nebo alkenyl vybraný ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, methylen, ethylen a propylen, a se

R znamená alkyl vybraný ze skupiny zahrnující methyl a ethyl, a jejich farmaceuticky využitelné soli, pro použití při léčení nádorových onemocnění.

Výše uvedené dosud nevymezené generické skupiny mají významy uvedené v následující legendě, přičemž alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, alkenyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkenylovou skupinu obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methylen, ethylen, propylen, isopropylen, « «· vodík znamená H a hydroxyl znamená skupinu -OH.

Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou přirozené brassinosteroidy shora uvedeného obecného vzorce I zahrnující sloučeniny 1 až 47

3-Eplcastasterone

2,3-Diepl-29-methyl· důllchosterone

24-EplbFaeslnollde

10-Hyd roxyeastaste roně

28-Homůtyphasterol

2-Deoxybraeslnoltde

2,3-Dleplcastasterone

J-Epi-1a-hydroxycastaeterone

28-HomoteasterĎfie

2-Epl-25-methyldoUchosterona

2-Deoxy-3S-ntethyl* ddlchosterone

3-Ept-2-deoxy-26-methyl· doUchosterone hoXAJ 33

6-Deoxocastasterone

3-Oehydrrteasterone

24-Eplsecasíerorte

B-Deoxo-28<ior* eastasterone

OH . x#

6-Deoxotyphasterol

3-Epl-ťWeoxo· eastasterone

B-Deoxo-24-epl· eastasterone

e-Deoxo-2(knethyldolichosterone ·

23O-0-D^iucopyranoeyÍ·

25-methyldollehosterone

2304O43lucdpyraňosyl-2-epl' 2S4nethyldollchosterone

3-0-0-D-fllucopyranosylteastercne a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Mimořádně výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou sloučeniny vybrané ze skupiny zahrnující kastasteron, 28-homokastasteron, 24-epibrassinolid, dolichosteron, 2-deoxykastasteron, typhasterol, teasteron, 3-oxoteasteron, kathasteron, 6-deoxotyphasterol, 3-dehydro-6-deoxoteasteron, homotyphasterol, homo10 teasteron, homodolichosteron, 25-methylkastasteron, 25-methyldolichosteron, 2deoxy-25-methyldolichosterona3-epi-2-deoxy-25-methyldolíchosteron.

· · «·*» * ·4 « to ·· ·· · · ♦· « · · ·· ·« · * a ·· « · « · a a a aa «· ·· »·· ·· ·· ·

TERAPEUTICKÁ APLIKACE

Vhodné cesty pro aplikaci jsou orální, rektální, místní (zahrnující okulámí, bukální a sublinguální), vaginální a parenterální (zahrnující subkutánni, intramuskulámí, intravitreózní, nitrožilní, intradermální, intrathekální a epidurální). Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, a dalších faktorech známých klinickému odborníkovi.

Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují s výhodou od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují s výhodou od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.

Farmaceutické přípravky tohoto vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofílizačními procesy.

S výhodou jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, zvláště izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem, jako je manitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány anebo obsahují látky neutrální pováhy, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku anebo pufiy. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofílízací. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.

Olejové suspenze obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být použity, jsou zvláště kapalné estery mastných kyselin, které jako kyselou složku obsahují mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem s 8 až 22, s výhodou s 12 až 22 atomy uhlíku, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené ·· * · * · « · ·· ·««·«« • · ♦ · · · · ··· · · » · · · ··· t » « • · ·· ··· ·· ·· · kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-ter/butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a znamená alkohol s jednou nebo více hydroxylovými skupinami, např. s jednou, dvěma nebo třemi, jako je methanol, ethanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, s výhodou glykol a glycerol.

Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl-oleát, isopropyl-myristát, isopropyl-palmitát, „Labrafil M 2375“ (trioleát polyoxyethylenglycerolu, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolylované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolylované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylenglykolu; Gattefoseé, Paříž), „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cg až C12 od Húls AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje, jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový olej, sezamový olej, sojový olej a olej z podzemnice olejné.

Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.

Např. farmaceutické přípravky pro orální použiti se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více pevnými nosiči, případnou granulací výsledné směsi a, pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.

Vhodné nosiče jsou zvláště plnidla jako cukry, např. laktosa, sacharosa, manitol nebo sorbitol, celulosové preparáty anebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá, jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a polyvinylpyrrolidin a, pokud požadováno, desintegrátory, jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylovaný škrob, zesíťovaný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další použitelné neutrální látky jsou regulátory toku a mazadla, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli, jako stearát hořečnatý nebo vápenatý, polyethylenglykol nebo jeho deriváty.

φ Φ Φ · ·· · ♦ φ ·Φ φ · φ« · · φ · ·· φ ·φ φ φ · · · · φφ» φ φ φ φ φ φ φ · ·· φ* ·♦ ··♦ ·♦ φφ ·

Jádra potahovaných tablet mohou být vybavena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylenglykol a nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulosových preparátů, jako ftalát acetylcelulosy nebo ftalát hydroxypropylmethylcelulosu. Barviva nebo pigmenty jsou přimíchávána do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.

Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně, jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla, jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např, s plnidly, jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo mazadly, jako talek nebo stearát hořečnatý, a se stabilizátory. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy, jako je mazací tuk, parafinový olej nebo kapalný polyethylen glykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylenglykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty, např. typu esterů polyethylensorbitanových mastných kyselin.

Ostatní formy orálního podávání jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např. v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, s výhodou ókolo 10 % nebo podobných koncentrací, které umožňuji vhodnou individuální dávku, např. když se odměřuje 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.

Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahují kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafinové uhlovodíky, polyethylenglykoly nebo vyšší alkoholy.

Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethyl11

4	♦ «	•	«4 4 ·	4	4	4
4	4		♦ ·	4 4 ·	4	4	4
•	•	•	• 4	4 4 « 4	4	4	4
•	4	•	4	4 4 4	4	4	4
*	4		4*	444 44	4	4	4

celulosy, sorbítol nebo dextran, a stabilizátory tam, kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofilizátu společně s neutrálními látkami, kde je to vhodné, a může být rozpuštěna před parenterálm aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. pro iníuzní roztoky. Preferovaná konzervo vadla jsou s výhodou antioxidanty, jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy, jako je kyselina sorbová či benzoová.

Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny, jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetylalkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin, pro zlepšení schopnosti vázat vodu. Emulgátory jsou odpovídající lipofilm sloučeniny, jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou oleát sorbitanu nebo isostearát sorbitanu. Přísady k vodné fázi jsou např. smáčedla, jako polyalkoholy, např. glycerol, propylenglykol, sorbitol a polyethylenglykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.

Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako základ hlavně uhlovodíky, např. parafín, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricinový olej nebo podzemnicový olej, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. mono- a distearát glycerolu. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a přísady zmíněné v souvislosti s mastmi, která zvyšuji příjem vody.

Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou mastné alkoholy, např. isopropyl-myristát, lanolin, včelí vosk nebo uhlovodíky, s výhodou vazelína (petrolatum) a parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxyadukty, např. polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen-sorbitanové estery či kyselé estery polyglycerických mastných kyselin (Tween), dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako jsou alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, φ' · · ··

Φ ♦·· • 4 44 4 • 44* 44 444· ·· ·· 444 4444 φ cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl-stearyl-alkoholu nebo stearylalkoholu. Přísady k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrám krémy před vyschnutím, např. polyaíkoholy, jako glycerol, sorbitol, propylenglykol a polyethylenglykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.

Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či křemičitany hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.

Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako chlorfluor-(nižší)alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N₂O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jak shora uvedeno pro masti a také jsou používány přísady tam uvedené.

Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-ethanolický základ, ke kterému jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyaíkoholy, např. glycerol, glykoly a polyethylenglykol, dále mazadla, jako jsou estery mastných kyselin a nižších polyethylenglykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže ethanolem a, pokud je to nutné, i ostatní neutrální látky a přísady.

Tento patent dále poskytuje veterinární přípravky obsahující nejméně jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikací přípravku. Mohou to být látky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.

Vynález se týká také postupu a způsobu léčení nemocí uvedených výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství, které je účinné proti uvedeným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 50 g, s výhodou 0,5 až 10 g.

φ · ♦ · »4 4 ' ' · · ” ·« t··· ··· · ♦♦ · · · · 4 ♦ 4*444 · · · 4 4 · 4 ·4 ·♦ «· 44» ·· ···

Stručný popis obrázků

Obr.l ukazuje inhibiční účinek 28-homokastasteronu (28-homoCS; 9; A) a 24-epibrassinolidu (24-epiBL; 6; B) na buněčnou viabilitu u nádorových liní RPMI8226 a CEM. Data reprezentují výsledky ze 3 nezávislých experimentů, z nichž byla určena směrodatná odchylka.

Obr. 2 znázorňuje vliv 28-homoCS (9; A) a 24-epiBL (6; B) na viabilitu buněčné linie MCF-7 odvozené od karcinomu mléčné žlázy sledovaný na základě MTT testu buněčné viability. Hodnoty vyjádřené v procentech jsou vztaženy ke kontrolním buňkám. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů prováděných v triplikátech, z nichž byla určena směrodatná odchylka. * představuje hodnoty p < 0,05 významně odlišné od kontroly.

Obr. 3 znázorňuje výsledky analýzy buněčného cyklu u linie MDA-MB-468 odvozené od karcinomu mléčné žlázy pomocí průtokové cytometrie. A) - kontrolní neošetřené buňky; B) - buňky ošetřené 28-homoCS; C) - buňky ošetřené 24-epiBL. Oblast Mi reprezentuje buňky v Gi, S, a G2/M fázi buněčného cyklu a oblast M2 představuje apoptické buňky s redukovaným obsahem DNA (subGl frakce buněčného cyklu). V pokusu byly srovnávány histogramy neošetřených kontrolních buněk s histogramy buněk ošetřených testovanými brassinosteroidy, přičemž horizontální osa představuje relativní množství jaderné DNA a vertikální osa vyjadřuje počet buněk.

Obr. 4 znázorňuje Western blot analýzu proteinů (p53, MDM-2, pl6, p21, p27, cyklin Dj, pRb-P) uplatňujících se při regulaci buněčného cyklu u mammámích (A) a prostatických (B) nádorových linií. Exprese proteinů u buněk ošetřených 28homocastasteronem (9) (28-homoCS 6; 28-homoCS 12; 28-homoCS 24) a 24epibrassinolidem (6) (24-epÍBL 6; 24-epiBL 12; 24-epiBL 24) v koncentraci IC50 po dobu 6, 12 a 24 hodin byla porovnávána s proteinovou expresí neošetřených kontrolních buněk(C 6 - kontrola, 6 h; C 12 - kontrola, 12 h; C 24 - kontrola, 24 h). Exprese proteinů mcm-7 nebo α-tubulinu byla použita jako vnitřní kontrola množství proteinů vzorku.

Obr. 5 znázorňuje detekci zlomů v jádrech apoptických buněk metodou TUNEL u prostatických nádorových buněk LNCaP po jejich ošetření 28-homoCS

• · Φ · • φ ·Φ	ΦΦ · • Φ	• φ Φ • · Φ
« · · ·	Φ · ·	φ φ Φ
•Φ ··	Φ»	• Φ Φ

nebo 24-epiBL v koncentraci IC30 po dobu 24 hodin vzhledem ke kontrolním neošetřeným buňkám.

Obr. 6 reprezentuje výsledky Western blot analýzy zaměřené na expresi proteinů (Bcl-2, Bc1-Xl, Bax, Bid, kaspasy-3) zapojených do regulace apoptosy u mammámích (A) a prostatických (B) nádorových linií. Exprese proteinů u buněk ošetřených 28-homocastasteronem (9) (28-homoCS 6; 28-homoCS 12; 28-homoCS 24) a 24-epibrassinolidem (6) (24-epiBL 6; 24-epiBL 12; 24-epiBL 24) v koncentraci IC50 po dobu 6,12 a 24 hodin byla porovnávána s proteinovou expresí neošetřených kontrolních buněk (C 6 - kontrola, 6 h; C 12 - kontrola, 12 h; C 24 - kontrola, 24 h). Exprese proteinů mcm-7 nebo a-tubulinu byla použitá jako vnitřní kontrola množství proteinů vzorku.

Následující příklady slouží pouze pro ilustraci použití brassinosteroidů, aniž by se tím jakkoliv omezoval tento vynález.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Obecný postup

Zásobní roztoky testovaných látek (10 pmol/l) byly připraveny rozpuštěním ekvivalentního množství látky v dimethylsulfoxidu. Kultivační média (DMEM, RPMI 1640, F-12), fetální telecí sérum, L-glutamin, penicilín a streptomycin byly zakoupeny u firmy Sigma (MO, USA), 3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromid (MTT) u firmy Serva Electrophoresis (Heidelberg, Germany) a Calcein AM u firmy PAA Laboratories GmbH (Pasching, Austria). Myší monoklonální protilátka proti bromdeoxyuridinu (BrdU) byla získána od firmy

DakoCytomation (Glostrup, Denmark). Calcein AM byl získán od PAA Laboratories GmbH (Rakousko). Všechny použité buněčné linie (T-lymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, buněčné linie odvozené od karcinomu mléčné žlázy

MCF-7 (estrogen-senzitivní) a MDA-MB-468 (estrogen-nesenzitivní), buněčné linie

LNCaP (androgen-senzitivní) a DU-145 (androgen-nesenzitivní) odvozené od karcinomu prostaty, buněčná linie plicního adenokarcínomu (A 549), lidská

*	• ·.	·· ♦ ·	♦ 9	9
* ·			• ·
« ·	• ·	9 · ·	9 ·	•
·			«*	•

erythroleukemie K562, buňky lidského mnohočetného myelomu RPMI 8226, buňky cervikálního karcinomu HELA, buňky G361 lidského maligního melanomu, buněčná linie plicního adenokarcinomu (A 549), buněčná linie lidského osteosarkomu (HOS) a normální lidské fibroblasty (BJ) byly získány z registru Američan Type Culture Collection (Manassas, VA, USA. Buňky linie MCF7 byly pěstovány v F-12 médiu (Sigma, MO, USA). LNCaP byly kultivovány v médiu RPMI 1640(GIBCO, USA). Všechny ostatní buňky byly kultivovány v DMEM kultivačním médiu (Sigma, MO, USA). Všechny používaná média byla doplněna 10% teplne.inaktivovaného fetálního telecího séra, 2 mmol/L L-glutaminu, 1% penicilin/streptomycinu. Buněčné linie byly udržovány ve standardních kultivačních podmínkách při 37°C, v atmosféře 5%CO2 a vlhké atmosféře.. Buněčné linie byly pasážovány standardní trypsinizační procedurou (Sigma, USA) dvakrát až třikrát týdně.

PŘÍKLAD 1

Testování in vitro cytotoxické aktivity

Buněčná suspenze o koncentraci přibližně 1,25 x 10⁵ buněk/ml byla přenesena do 96-jamkových mikrotitračních destiček a po 12h stabilizaci byly přidány testované brassinosteroídy o různé koncentraci. Brassinosteroidy byly rozpuštěny v DMSO. Kontrolní buňky byly ošetřeny pouze pomocí DMSO. Finální koncentrace DMSO nepřesáhla v reakčním prostředí 1 %. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20μ1 alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle se sloučeniny vyhodnocovaly v šesti koncentracích v čtyřnásobné ředící řadě. Při rutinním testování byla nej vyšší koncentrace v jamce 50μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 96 hodin při 37 °C, 100% vlhkosti a v atmosféře CO₂. Na konci inkubační periody byly buňky analyzovány po přidání roztoku Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence (OD) byla měřena pomocí Fluoroscan Ascent (Microsystems). Přežití nádorových buněk (IC50) bylo spočítáno podle následujícího vztahu: IC50 ” (ODj_amk_y • · • ♦ f· ·*· • · ·· · • · ·· ·· ·· s léčivem /střední ODkontroiní jamky) ^x 100 %· Každá sloučenina byla testována ve třech pokusech, test byl opakován alespoň třikrát. Hodnota IC50, která odpovídá koncentraci látky, kdy je usmrceno 50 % nádorových buněk, byla vypočtena ze získaných křivek závislosti na dávce.

Byl sledován vliv brassinosteroidů na životaschopnost normálních a rakovinových buněčných linií rozdílného histopathologického původu. Lidská Tlymfoblastická leukemická buněčná linie CEM, buněčné linie prsního karcinomu MCF-7, buněčná linie plicňího adenokarcinomu A 549, lidská erythroleukemie K562, buněčná linie odvozená od mnohočetného myelomu RPMI 8226, buňky cervikálního karcinomu HeLa, buňky G361 lidského maligního melanomu, buněčná linie lidského osteosarkomu HOS a normální lidské fibroblasty BJ byly použity pro rutinní screening cytotoxických vlastností brassinosteroidů a jim příbuzných steroidů. Buňky byly vystaveny 6 koncentracím ve Čtyřnásobných ředících řadách pro každou látku po dobu 72 h pro určení množství přeživších buněk. Hodnoty IC50 získané pomocí Calcein AM testu jsou prezentovány v tabulce č. 1.

Tabulka 1

IC50 (pmol/L) hodnocené pomocí Calcelin AM testu přežívajících buněk. Data reprezentují průměr ± SD ze 3 nezávislých experimentů prováděných v triplikátech, z nichž byla určena směrodatná odchylka.

Brassinosteroidy č.	Sloučenina. =. (ICjo; gmol/l)	CEM	Buněčné linie	BJ
RPMI 8226	G361
	Cholesterol	>50	38 ±2,9	>50	>50
	β-Ekdyson	>50	>50	>50	>50
	5a-Cholestane	>50	>50	>50	>50
	Brasicasterol	>50	>50	>50	>50
	Stigmasterol	>50	32 ± 0,6	>50	>50
	Sitosterol	>50	32 ±1,6	>50	>50
1	Brassinolid	>50	>50	>50	>50
2	28-Homobrassinolid	48 ±1,3	>50	>50	>50
	22S,23S-2S- Homobrassinolid	35 ±2,2	31 ±7,3	>50	>50
6	24-Epibrassín.oIíd	44 ±2,2	>50	>50	>50
	22S,23S-24-	>50	>50	>50	>50

•	• 9~	9	a·
9	9	99		a	9	a	• 9	9
9	9	9	9 1?	9	9	9	« 9	9
9	9	•	a	•	•	9		*	9
99		*9		• 9a	9*		9

Epibrassinolid

Kastasteron	16 ±5,3	33 ±1,3	>50	>50
28-Homokastasteron	13 ±2,8	26 ±1,4	>50	>50
22S,23S-28-
Homokastasteron	24 ±1,5	25 ±4,7	45 ± 2,2	>50
24-Epikastasteron	>50	>50	>50	>50
22S,23S-24-
Epikastasteron	49 ±1,8	>50	>50	>50

Ošetření sloučeninami 9 a 6 mělo za následek na dávce závislé snížení životaschopnosti buněk linií CEM a RPMI 8226, ačkoliv na různé úrovni (Obr. 1). Látka 9 byla nejúčinnější na buněčné linii CEM (ICjo: 13 pmol/l, zatímco její 22S,23S-isomer byl nejúčinnější na nádorové linii RPMI 8226 (IC50: 25 pmol/l). Navíc byla pozorována i zvýšená cytotoxicita po aplikaci kastasteronu a jeho SShomologu. Brassinolid (1), který je obvykle nejúčinnější brassinosteroid v rostlinných biotestech, nebyl cytotoxicky aktivní nebo prokazoval téměř nulovou cytotoxíckou aktivitu, zatímco synteticky připravený analog 22S,23S-28homobrassinolid vykazoval cytotoxíckou aktivitu v rozmezí IC₅₀: 31-35 gmol/l. Nebrassinosteroidní rostlinné steroly, jako cholesterol, stigmasterol, brassicasterol, 5a-cholestan, β-ekdyson a β-sitosterol, byly v rozmezí testovaných koncentrací (ařž k 50 pmol/l) neúčinné; cholesterol, stigmasterol a β-sitosterol vykazovaly minimální protinádorovou aktivitu (IC50 > 30 pmol/l) pouze na linii RPMI 8226. Na buněčných liniích K 562, A 549, HeLa a HOS byly všechny testované sloučeniny neaktivní. Překvapujícím zjištěním bylo, že nemaligní buněčná linie, lidské fibroblasty BJ, byla vůči cytotoxickému působení brassinosteroidů rezistentní. Tyto výsledky naznačují rozdílnou odpověď v působení steroidů na nádorové a nenádorové buněčné linie. Do dnešní doby je známo jen několik přírodních látek, které by selektivně působily pouze na nádorové buňky bez ošetření buněk normálních. Tato studie také přinesla první důkaz brassinosteroidů jako protirakovinových sloučenin s antiproliferačnimi vlastnostmi. Doposud je znám pouze pozitivní, efekt sloučeniny 6 na růst myších hybridomových linií v rozmezí koncentrací 10' -10 mol/1.

Jak vyplývá ze studia vztahů mezi chemickou strukturou a biologickou aktivitou, mezi cytotoxicky nejaktivnější brassinosteroidy patří látka 9. Změna skupiny 6-oxo-7-oxalakton na. funkční skupinu 6-oxo vede k výraznému zvýšení • · · · <·« · * · Φ · · · ·»«··· φ · · · 4·· · * Φ

ΦΦ ·· ··· ·· ·· Φ růstové inhibiční aktivity. Proto je sloučenina 9 asi 3krát účinnější než 28homobrassinolid 2. Flexibilnější konformace v poloze 24R na postranním řetězci u 24-epikastasteronu (13) při srovnání s kastasteronem (8). jak vyplývá ze studií NMR, je kritickou vlastností pro snížení protinádorových účinků. Konformace 24R 5 na postranním řetězci je také rozhodující pro snížení cytotoxícké aktivity brassinosteroidů. Ethylová skupina na uhlíku C24 na postranním řetězci u 9 a 2 je poněkud efektivnější než odpovídající analogy s methylovou skupinou na C24. Z minimální inhibiční aktivity β-ekdysonu obsahujícího 2p,3P,22a-funkčm uspořádaní lze usoudit, že 3a-hydroxylová skupina, 2a,3a-vicinální dioly nebo 3a,4a-vicinální 10 dioly budou důležité pro protínádorovou aktivitu brassinosteroidů.

PŘÍKLAD 2

Vliv nových sloučenin na mammámí a prostatické nádorové linie

Nejnadějnější a snadno dostupné brassinosteroidní analogy se zajímavými protinádorovými účinky byly vybrány k dalším experimentům na buněčných linií MCF 7 (estrogen-senzitivní) a MDA-MB-468 (estrogen-nesenzitivní) odvozených od karcinomu mléčné žlázy a u buněčných linií LNCaP (androgen-senzitivní) a DU20 145 (androgen-nesenzitivní) odvozených od karcinomu prostaty.

Karcinom prostaty u lidí představuje mnohastupňový proces, který je Žpóčátku u většiny nádorů prostaty závislý na androgenech a většina pacientů úspěšně odpovídá na terapeutickou androgenní blokádu. U části nemocných nádory po určité době mohou přecházet do stádia růstu na androgenech nezávislého. Tyto 25 androgen-independentní nádory prostaty jsou potom rezistentní na konvenční terapii. Zatímco androgen-dependentní nádorové buňky podléhají během androgenové ablace apoptické buněčné smrti, androgen-independentní buňky mají schopnost obejít apoptické dráhy během androgenové deprivace, aniž by došlo k narušení této dráhy. Vývoj a progrese karcinomu prostaty souvisí s akumulací změn genů 30 podílejících se na udržení normální buněčné proliferace a homeostázy. Podobný model hormonální responsibility představují estrogen-senzitivní nebo estrogennesenzitivní nádory mléčné žlázy. Na studium vzniku a vývoje těchto nádorů je ···· ·· · · · · · • · ·· «·*··« • · · · « ♦ · « * · • · ·♦ ····· · · v dnešní době zaměřeno intenzívni výzkumné úsilí, které by přineslo nové přístupy v terapii nádorových onemocnění.

Buněčná viabilita byla v tomto případě sledována pomocí MTT testu za použití 3-(4,5-dimethylthiozol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromidu (MTT) k určení koncentrací IC50 studovaných látek, jak bylo popsáno dříve. Buňky byly vysety v počtu 4,5.10³ (MCF-7, DU-145) nebo 5.10³ (MDA-MB-468, LNCaP) buněk na jamku v médiu prostém steroidů do 96-jamkových mikrotitračních destiček. Buňky rostly 24 h (MCF-7, MDA-MB-468, DU-145) popřípadě 48 h (u buněk LNCaP). Buňky (konfluence 70 až 80 %) byly ošetřeny brassinosteroidy po dobu 6,12 a 24 h v kultivačním médiu. Buňky, které byly použity jako kontroly, byly inkubovány jen s maximálním možným množstvím steroidního rozpouštědla DMSO. Koncentrace vedoucí k 50% inhibicí buněčného růstu (IC50) byla určena po 24 h pomocí měření MTT reduktasové aktivity. Absorbance byla změřena pomocí ELISA readeru Labsystem Multiscan RC při 570 nm. Viabilita ošetřených buněk testovanými brassinosteroidy byla vztažena ke kontrolním buňkám představující 100% víabilitu. Experiment byl proveden v triplikátech a nejméně čtyřikrát nezávisle zopakován.

Tabulka 2

Koncentrace IC₅₀ (pmol/l) látek 9 a 6 byly stanoveny MTT testem cytotoxicity. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů prováděných v triplikátech, z nichž byla určena směrodatná odchylka (SD)

Buněčná linie	IC50 (μηποί/ΐ)
9	6
MCF-7	40 ±1,5	60 ±1,8
MDA-MB-468	65 ±2,8	68 ± 2,5
LNCaP	45 ±2,3	60 ±3,1
DU-145	45 ±2,8	65 ± 0,9

K vyhodnocení vlivu vybraných brassinosteroidů (9 a 6) na víabilitu hormonálně senzitivních a nesenzitivních nádorových buněčných linií (MCF-7, MDA-MB-468, LNCaP a DU-145) jsme použili MTT test cytotoxicity. Cytotoxické koncentrace byly stanoveny pro všechny analoga na 4 nádorových buněčných linií. Brassinosteroid 9 inhiboval buněčný růst v závislosti na aplikovaném množství ve • · 4 4 4 · · · 4 44 • 4 · · ·»···· • · · · · · · · 4«

4· ·* »4» *44·* všech nádorových buněčných liniích podobně jako 6. Buňky MCF-7 byly k působení 9 nejcitlivější v porovnání s dalšími třemi buněčnými liniemi. Brassinosteroid 6 vykazuje cytotoxický účinek při vyšších koncentracích (Obr. 2). Na základě MTT testu jsme našli koncentrace obou brassinosteroidů, které 5 způsobovaly 50% inhibici růstu buněk (IC50) po 24 h (Tab. 2). Zajímavé je, že zde byly malé rozdíly mezi účinností 9 a 6 na různých buněčných liniích, přičemž se hodnoty IC_ÍO shodně pohybovaly kolem 43,3±2,4 gmol/l, případně 61,7±1,7 pmol/l. Výjimkou byly mammámí estrogen-necitlivé buňky MDA-MB-468, které byly k aplikaci obou brassinosteroidů rezistentnější (9IC₅₀ : 65±2,8 pmoUl, 6IC50: 68±2,5 10 pmol/l).

PŘÍKLAD 3

Buněčná proliferace na základě bromdeoxyuridm inkorporačního testu

Ke zjištění, zda ínhibice buněčné viability je dána sníženou proliferací buněk, jsme měřili syntézu DNA za přítomnosti brassinosteroidů. Efekt brassinosteroidů 6 nebo 9 na buněčnou proliferací a replikaci DNA nádorových buněk byl měřen pomocí BrdU inkorporačního testu. Tato metoda je založena na 20 schopnosti modifikované nukleotidové báze BrdU začlenit se do DNA v místě thymidinu během S-fáze buněčného cyklu pomocí primární monoklonální protilátky proti BrdU (Gratzner, Science. 1982, 218, 474-475). Buňky (v koňflúenči 60 až 70 %) adherované na krycích sklech byly v 60mm kultivačních miskách ošetřeny brassinosteroidy (IC50) po dobu 6, 12 a 24 h. BrdU (0,1 mmol/1) byl přidán do 25 kultivačního média s buňkami na dobu 4 h v CO2 inkubátoru při 37 °C. Poté byly buňky třikrát promyty ve fosfátovém pufru a fixovány vychlazenou směsí aceton:methanol (1:1, obj./obj.) 10 minut. Buňky byly denaturovány kyselinou chlorovodíkovou (1:5; Lachema, Česká republika) a inkubovány se specifickou protilátkou proti BrdU (ředěnou 1:100 ve fosfátovém pufru; klon Bu20a, 30 DakoCytomation, Dánsko) po 60 min ve tmě. Poté byly buňky třikrát promyty ve fosfátovém pufru (10 mM, pH7,4) a inkubovány skozí anti-myší sekundární protilátkou značenou FITC (Sigma, MO, USA) po dobu 60 min ve tmě. Buňky byly opět 3x promyty ve fosfátovém pufru a následně inkubovány s 4'-6-diamidino-221 fenylindolem (DAPI; 50 pg/mL; Sigma, MO, USA) 10 min ve tmě. Krycí sklíčka s buňkami byla opláchnuta v deionizované vodě a ponořena do vodného média Mowiol (Calbiochem, CA, USA) naředěného v roztoku glycerolu a fosfátového pufru (1:3, obj./obj.) určeného pro fluorescenci. Buňky byly vizualizovány pomocí mikroskopu a byl spočítán počet BrdU pozitivních buněk (buňky v S fázi buněčného cyklu) a vztažen k celkovému počtu všech buněčných jader v nejméně 25 polích.

Tabulka 3

Buněčná proliferace stanovená na základě detekce inkorporace BrdU. Buňky MCF7, MDA-MB-468, LNCaP a DU-145 byly ošetřeny brassinosteroidy 9 nebo 6 v koncentraci IC50 po dobu 6/12/24 h a srovnávány s buňkami kontrolními (K). Výsledky představují procenta (%) BrdU pozitivních buněk. Výsledky byly získány ze tří nezávislých experimentů, z nichž byla určena směrodatná odchylka. * představuje p < 0,05 signifikantně odlišné od kontroly.

Kontrola / BRs (1C5O)	Buněčná linie
MCF-7	MDA-MB-468	LNCaP	DU-145
K(6 h)	50 ± 3,6	64 ±1,5	44 ± 6,0	51 ±3,8
?(6h)	46 ± 2,5	55 ± 5,0	•25 ±3,0*	41 ±4,5
6(6 h)	42 ±3,2	53 ±4,4*	36 ±5,5	32 ±3,8*
K (12 h)	53 ±3,5	58 ± 3,0	52 ± 7,6	54 ±4,2
9(12 h)	31 ±3,8*	48 ± 4,6	28 ± 4,6*	36 ± 4,4*
6(1211)	40 ±7,1	55 ± 3,5	31 ±2,0*	27 ±5,3*
K (24 h)	69 ±4,5	64 ±5,6	59 ± 8,0	56 ± 6,5
9(24 h)	29 ± 4,0*	28 ±4,6*	27 ±2,1*	38 ±4,0*
6 (24 h)	36 ±5,5*	43 ±3,6*	29 ±4.7*	16 ±1,5*

Buňky mammámích a prostatických nádorových linií byly ošetřeny látkami 9 a 6 v koncentracích IC50 po dobu 6,12 a 24 h a porovnány s buňkami kontrolními. Oba brassinosteroidy inhibovaly u všech linií buněčnou proliferaci jak v závislosti na koncentraci látky, tak na čase působení (Tab. 3). Ošetření brassinosteroidy snížilo procenta BrdU pozitivních buněk. Aplikace sloučeniny 9 (IC50 pro 24 h) vedla k výraznému poklesu počtu proliferujících buněk MCF-7 (z 69±4,5 % u kontrolních buněk na 29±4,0 % u buněk ošetřených látkou 9) (Tab. 3). Tyto výsledky naznačují, že brassinosteroidy mají schopnost redukovat buněčný růst u některých mammárních a prostatických nádorových linií. Zůstává stále nejasné, zda hormon-depen22 • · · · ·· to · to to· • ••to · to to ··to • · · toto toto to · to·· • · · · «·· * to· ·* ·· ··· ·· ·· · dentní buněčné linie jsou citlivější k aplikaci látek nebo zda je cytotoxický účinek brassinosteroidů ošetřen jejich interakcí se steroidními receptory. Poznatky o korelaci estrogenového receptoru (ER) u nádorů a pozitivní odpovědí na endokrinní terapii by mohly přispět k vývoji estrogenových antagonistů.

.5

PŘÍKLAD 4

Brassinosteroidy regulují buněčný cyklus

U buněčné linie MCF-7 odvozené od karcinomu mléčné žlázy, která se řadí mezi nejčastěji používaný experimentální buněčný model, bylo zjištěno, že typicky růstově inhibiční odpověď na antiestrogeny vede k typickému poklesu buněk syntetizujících DNA (S-fáze) po ošetření antiestrogenem. Tento pokles buněk v Sfázi je doprovázen zvýšeným zastoupením buněk v Go/Gi fázi buněčného cyklu. Je známo, že aktivita androgenového receptoru (AR), která obvykle nastává vazbou ligandu k receptoru, může být rovněž regulována změnami buněčné signalizace. Již dříve bylo popsáno, že aktivace AR nezávislá na ligandu může být u nádorových buněk prostaty zprostředkována různými růstovými faktory. Jelikož AR může být aktivován i za nepřítomnosti daných hormonů, zdá se, že podmínky aktivace mohou být omezenější, než je tomu u ER. Při experimentech hraje rozhodující význam použití fyziologických dávek ligandu (dihydrotestosteron; DHT), jelikož buňky LNCaP mohou proliferovat pouze v koncentraci DHT 10'^θ M a nižší. Vyšší dávky proliferaci inhibují. Na rozdíl od proliferace, transaktivace cílových genů přímo regulovaných AR (např. PSA, prostatický specifický gen) byla po ošetření buněk 25 DHT v koncentraci ΙΟ’¹⁰ M a vyšší stimulována. Jedním zmožných vysvětlení výrazných cytotoxických účinků brassinosteroidů 9 a 6 by mohl být vliv na steroidní receptory ER a AR u buněčných linií hormonálně dependentních (MCF-7, LNCaP) v porovnání s buněčnými liniemi hormonálně independentnich (MDA-MB-468 a

DU-145). Naším cílem bylo zjistit vliv brassinosteroidů na průběh buněčného cyklu u různých nádorových buněčných linií. Na základě průtokové cytometrie bylo sledováno procentuální zastoupení buněk ve fázích cyklu včetně detekce subGi buněčné frakce. Kontrolní a ošetřené buňky byly dvakrát promyty vychlazeným fosfátovým pufrem, centrifugovány při 360 x g a teplotě 4 °C po dobu 10 min a následně fixovány ledovým ethanolem (70%; obj./obj.) za pomalého míchání. Obsah DNA byl stanoven po obarvení buněčných jader propidiumbromidem. Buňky byly analyzovány průtokovým cytometrem FACS Calibur (Becton Dickinson Bioscience, USA).

Tabulka 4

Distribuce buněčného cyklu u buněk MCF-7, MDA-MB-468, LNCaP a DU-145 analyzovaná průtokovou cytometrií. Histogramy buněk ošetřených brassinosteroidy byly srovnávány s histogramy buněk kontrolních. Data představují procentuální zastoupení buněk subGi frakce a v jednotlivých fázích buněčného cyklu Gj, S, G2/M

Buněčná linie	Kontrola/BRs . (IC10;24h)	Apoptická subGi	Distribuce buněčného cyklu
Gi	S	G/M
MCF-7	K	17%	60%	14 %	26%
	9	15%	80%	11%	9%
	6	13%	81%	7%	12%
MDA-MB- 468	K	10%	52%	31%	17%
	9	35%	74%	17%	9%
	6	75%	88%	10%	2%
LNCaP	K	8%	70%	14%	16%
	9	18%	94%	2%	4%
	6	47%	86%	5%	9%
DU-145	K	20%	62%	15%	23%
	9 -	28% '	46 %	8 % '	' 46%
	6	24%	53%	8%	39%

Průtoková cytometrie prokázala blokaci buněčného cyklu v Gi fázi u buněk MCF-7, MDA-MB-468 and LNCaP ošetřených brassinosteroidy 9 nebo 6 (Tab. 4). U všech buněčných linií brassinosteroidy snížily procentuální zastoupení buněk v Sfázi buněčného cyklu. Po ošetření buněk DU-145 testovanými brassinosteroidy byl zaznamenán nárůst buněk v G?/M fázi za současného poklesu buněk v ostatních fázích buněčného cyklu (Tab. 4).

• 4 • · • ··

PŘÍKLAD 5

Vliv brassinosteroidů 9 a 6 na expresi proteinů buněčného cyklu

Sledovali jsme účinek brassinosteroidů 9 a 6 na expresi inhibitorů cyklindependentních kinas (cdk) p21^Wafl/Cipl a p27^Kipl, které představují klíčové regulátory progrese buněčného cyklu a inhibují aktivity cyklin/cdk. Po ošetření buněk MCF-7 látkou 9 po 6 h byl zjištěn nárůst exprese p21^Wafl/c,pl ap27^Klpl, zatímco u buněk MDA-MB-468 nebyly zjištěny žádné signifikantní změny. Po ošetření buněk MCF7 látkou 6 zůstala exprese p21^Wafl/Cipl nezměněna, exprese p27^Kipl byla po 6 a 12 h expozici látky 6 snížena. Po 12 a 24h ošetření buněk MDA-MB-468 látkou 6 došlo . k signifikantnímu zvýšení hladiny inhibitoru cdk p21^Wafl/C,pl (Obr. 4A). Oproti tomu exprese proteinu p27^Kipl byla u těchto buněk ve všech časových intervalech snížena. U buněk LNCaP jsme zaznamenali snížení hladiny p21^Wafl/C,pl p₀ 12 h a zvýšení hladiny p27^Kipl po 24 h vlivem látky 9 í 6. Dále toto ošetření brassinosteroidy vedlo u buněk LNCaP k poklesu exprese p21^Wafl/Clpl po 6 a 24 h a p27^Klpl po 6 a 12h. Oba typy brassinosteroidů vedly u buněk DU-145 ke zvýšeni exprese p21^Wafl/Clpl and p27^Kipl po 12 a 24 h (Obr. 4B).

Exprese proteinu p53 byla u buněk MCF-7 mírně zvýšena po 6h působení látky 9 i 6 za současného snížení exprese MDM-2, regulátoru degradace p53, ve všech sledovaných časových intervalech. U buněk MDA-MB-468 zůstala hladina proteinů p53 i MDM-2 po ošetření oběma typy brassinosteroidů nezměněna (Obr. 4A). U buněk LNCaP byl zjištěn pokles exprese p53 po ošetření buněk brassinosteroidy 9 i 6 12h a 24h po aplikaci, zatímco u buněk DU-145 nebyly změny exprese p53 prokázány. Exprese MDM-2 byla u buněk LNCaP ošetřených látkou 9 zvýšena (6 h) a po ošetření látkou 6 nezměněna. U buněk DU-145 ošetřených brassinosteroidy 9 i 6 došlo ke snížení hladiny MDM-2 ve všech časových intervalech (Obr. 4B).

Ošetření obou mammámích nádorových linií látkou 24-epiBL 6 (6/12/24 h) vedla ke snížení exprese cyklinu Dp Exprese obou fosforylovaných a defosforylovaných forem retinoblastomového proteinu (Rb) byla u buněk MCF-7 a MDA-MB-468 po aplikaci brassinosteroidů 9 a 6 snížena (Obr. 4A). U buněk LNCaP ošetřených oběma typy BRs byla hladina cyklinu D] snížena, zatímco u « · ·· •A ··

A · 9· « · A· ·* ♦♦ · A* • · ·A • 9 9 99 • A AA

999·

buněk DU-145 nebyla hladina tohoto cyklinu ovlivněna. Exprese proteinu Rb byla u buněk LNCaP léčených BRs mírně snížena, U buněk DU-145 nebyly žádné změny zaznamenány (Obr. 4B).

PŘÍKLAD 6

Detekce apoptosy u nádorových buněk

Detekce apoptosy pomocí průtokové cytometrie. Některé studie uvádějí, že indukce apoptosy může být závislá na buněčném cyklu. Proto jsme se v následujících experimentech zaměřili na,možnost, zda jsou brassinosteroidy 9 nebo 6 schopny indukovat apoptosu karcinomu buněk mléčné žlázy a prostaty prostřednictvím blokace buněčného cyklu. Z tohoto důvodu byla provedena analýza buněčného cyklu průtokovou cytometrií, která je založena na detekci endonukleolytické degradace DNA vedoucí k extrakci nízkomolekulámí DNA z buněk. Průtoková cytometrie, používaná jako konvenční technika k detekci specifické formy buněčné smrti, umožňuje výskyt subGi maxima v hypodiploidní oblasti buněčného cyklu DNA histogramů. Analýzy prokázaly, že oba typy brassinosteroidů zvyšovaly u buněk MDA-MB-468 (Obr. 3), LNCaP a mírně i u buněk DU-145 procenta subGi buněčné frakce v porovnání s kontrolními buňkami (Tab. 4). U buněk MCF-7 nebylo subGj maximum obsahující apoptické buňky zaznamenáno. Brassinosteroidy zprostředkovaná apoptická buněčná smrt je významným zjištěním,' jelikož molekulární analýzy využívané u lidských nádorů odhalily, že regulátory buněčného cyklu jsou často mutovány u většiny maligních onemocnění.

Detekce apoptického indexu metodou TdT-Mediated dUTP nick end labeling (TUNEL), K detekci apoptických buněk byla použita metoda TUNEL, Buňky rostoucí na krycích sklech v 60mm Petriho kultivačních miskách byly kultivovány se sloučeninou 9 a 6 (IC50) po dobu 6, 12 a 24 h. Po časové periodě ošetření byly následně buňky opláchnuty roztokem PBS a fixovány na sklíčkách po dobu 10 min chlazenou směsí aceton:methanol (1:1, obj./obj.). Fragmentace jaderné DNA indukovaná apoptosou byla detekována na základě vazby terminálm deoxynukleotidyl-transferasy (TdT) metodou TUNEL dle protokolu výrobce (In Šitu

* · • 4	* 9 »4	·» 4 4 4 4 4	4 4 4 4 4
* ·	* 4	• 4 4	• 4 4
44	44	♦ •4 «4	4» 4

Cell Death Detection Kit; Roche Diagnostics, Mannheim, Německo). Po dalším trojnásobném oplachu buněk v PBS byla jádra dobarvena 4',6-diamino-2fenylindolem (DAPI; 50 pg/ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) po dobu 10 min ve tmě. Poté byla krycí sklíčka opláchnuta v deionizované vodě a přiložena na skla pomocí hydrofilního média Mowiolu (Calbiochem, Fremont, CA, USA) naředěného v roztoku glycerolu a PBS (1:3, obj./obj.) určeného pro fluorescenci. Ošetřené buňky byly vizualizovány fluorescenční mikroskopií a srovnávány s buňkami kontrolními. Na základě metody TUNEL byla zjištěna apoptosa buněk všech buněčných linií. Ošetření buněk brassinosteroidy ve všech časových intervalech (IC50; 6/12/24 h) vedlo k mírnému, ale ne příliš signifikantnímu zvýšení TUNEL pozitivních buněk (Tab. 5). Výrazné zvýšení procentuálního zastoupení apoptických TUNEL pozitivních buněk bylo zaznamenáno u buněk LNCaP po ošetření látkou 9 (IC50 po 24 h) na 25,8 % a látkou 6 (IC50 po 24 h) na 21,9 % vzhledem ke kontrolním buňkám. Obrázek 5 znázorňuje účinek látky 9 a 6 u buněk LNCaP vzhledem ke kontrolním buňkám.

Tabulka 5

Detekce DNA zlomů v jádrech apoptických buněk stanovená na základě metody TUNEL. Buňky MCF-7, MDA-MB-468, LNCaP a DU-145 byly po dobu 6,12 a 24 h ošetřovány sloučeninou 9 a 6 v IC50 koncentraci a detekovány metodou TUNEL ve srovnání s kontrolními neošetřenými buňkami. Buňky byly promyty v PBS a fixovány na krycí skla s vychlazenou směsí aceton/methanol (1:1, obj./obj.), jak bylo popsáno výše. K (6 h), K (12 h), K (24 h) -kontrolní neošetřené buňky 6,12 a 24 h; 9 (6 h), 9 (12 h), 9 (24 h) - vzorky buněk Ošetřené sloučeninou 9’(ICso; po dobu 6,12 a 24 h); 6 (6 h), 6 (12 h), 6 (24 h) - vzorky buněk ošetřené sloučeninou 6 (IC50; po dobu 6, 12 a 24 h). Data udávají procentuální zastoupení TUNEL pozitivních buněk ze tří nezávislých pokusů. Výsledky představují průměr + SD. * představuje p < 0,05 signifikantně odlišné od kontroly.

Kontrola! BRs (IC50)	MCF-7	Buněčná linie	DU-145
MDA-MB-468	LNCaP
K(6h)	0,0 ± 0,0	0,0 ±0,0	0,3 ±0,6	0,0 ±0,0
9 (6 h)	10,6 ±1,5*	1,7 ±0,6	7,3 ±2,1*	6,0 ±2,0*
6 (6 h)	2,7 ±1,2*	4,7 ±0,6*	10,7 ±4,0*	4,7 ±2,5*
K(12h)	0,0 ±0,0	0,0 ± 0,0	0,6 ± 0,6	0,0 ±0,0
9 (12 h)	13,7 ±3,8*	2,3 ± 0,6	15,7 ±2,5*	7,5 ±4,0*
6 (12 h)	8,3 ±3,1*	16,7 ±4,7*	12,2 ±5,1*	5,6 ±2,0*

K (24 h)	0,3 ± 0,6	0,0 ± 0,0	0,6 ± 0,6	0,0 ± 0,0
9 (24 h)	13,7 ±2,6*	4,3 ±0,6*	25,8 ±2,5*	8,0 ±4,0*
6 (24 h)	11,7 ±3,8*	18,3 ±3,0*	21,9 ±3,0*	5,1 ±5,6*

PŘÍKLAD 7

Western blot analýza pro- a anti-apoptických proteinů

Pro přípravu vzorků byly buňky nasazeny v počtu 1,6.10⁴ buněk/cm² (LNCaP), 1,4.10⁴ buněk/cm² (DU-145, MDA-MB-468 a MCF-7) do lOOmm kultivačních Petriho misek a po dosažení konfluence 70 až 80 % byly ošetřeny testovanými sloučeninami 9 a 6 v koncentraci IC50 stanovené na základě MTT testu, který byl popsán výše. Kontrolní buňky byly připraveny inkubací s příslušným objemem DMSO jako vehikulem. Po 6, 12 a 24 h byly buňky opláchnuly vychlazeným PBS a uvolněny z misek škrabáním do extrakčního puíru (50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 2,5 mM EGTA; 10 % glycerolu; 0,1 % Tweenu 20) s proteasovými a fosfatásovými inhibitory (aprotinin 2,5 μΐ/ml; leupeptin 2,5 μΐ/ml;_: fenylmethansulfonylfluorid aprotíninu 25 μΐ/ml, lOmM βglycerolfosfát; 0,1 mM NaýVOi a 1 mM dithiotreitol).. Lysáty byly posbírány do mikrocentrifugačmch zkumavek a pak inkubovány na ledu 1 h. Buňky byly v protein extrakčním pufru- inkubovány 60 min za občasného třepání při 4 °C. Po centrifugaci (45 000 ^x g, 4 °C, 30 min) byl supematant odebrán, rozdělen na alikvoty a zmražen při -80 °C. V supematantu byla změřena celková koncentrace proteinů Bredfordovou metodou dle protokolu výrobce (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Při Western blot analýzách bylo naneseno alikvoty proteinů (1530ug/jamku) na 10%, případně na 12% SDS-PAGE gelu. Elektroforeticky separované proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Amersham Biosciences, Rakousko) pomocí „semi-dry“ metody. Pro určení molekulové hmotnosti byl použit barevný molekulový hmotnostní standard (Rainbow™, Amersham Biosciences, Rakousko). Nespecifická vazebná místa byla blokována inkubací blotu 2h v 5% roztoku sušeného mzkotučného mléka v PBS. Poté byla provedena inkubace membrány přes noc při 4 °C s příslušnou primární protilátkou, která detekuje zájmové protein a nakonec promyta vychlazeným v PBS s 0,1 % Tweenem20) po dobu 1 h„ Poté byly membrány inkubovány s naředěnou sekundární kozí anti-myší IgG protilátkou konjugovaná s křenovou peroxidasou (ředění 1:6000, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) nebo kozí anti-králíčí IgG protilátkou konjugovaná s křenovou peroxidázou (ředění 1:2000, DakoCytomation, Glostrup, Denmark) po dobu 45 min při 4°C. Závěrečně byla membrána promyta vychlazeným v PBS s 0,1 % Tweenem 20) po dobu 1 h. Proteiny byly detekovány chemiluminiscenčmm detekčním systémem (Amersham Biosciences, Vídeň, Rakousko) dle protokolu výrobce. Srovnatelnost proteinů přenesených na membránu byla potvrzena barvením pomocí Ponceau S (Sigma, St. Louis, MO, USA) a detekcí pomocí protilátek proti α-tubulinu (Sigma, USA) nebo mcm-7 (Santa Cruz, USA). Experimenty byly třikrát zopakovány. Exprese proteinů u buněk ošetřených a s kontrolních byly srovnávány.

Na základě Western blot analýzy byly sledovány změny exprese proteinů uplatňujících se během apoptózy u buněčných linií prsu a prostaty. Ke zjištění změn během 24 h ošetření byly odebírány buňky ošetřené brassínosteroidy po dobu 6,12 a 24 h v koncentracích IC50 stanovených dle MTT testu. Změny exprese proteinů regulujících apoptickou buněčnou smrt po ošetření buněk brassínosteroidy znázorňuje Obr. 6. Western blot analýzou nebyly u mammámích nádorových buněk MCF-7 a MDA-MB-468 zjištěny signifikantní změny v expresi apoptických proteinů po ošetření buněk testovanými brassínosteroidy (Obr. 6A). Exprese‘antiapoptického proteinu Bcl-2 u buněk LNCaP aDU-145 klesla po 6, 12 i 24 h působení 9 a po 6 a 24 h aplikaci 6, zatímco při sledovaní exprese dalšího antiapoptického proteinu Bcl-X_L nebyla zjištěna žádná změna po ošetření studovanými brassínosteroidy ve všech Časových intervalech (Obr. 6B). Exprese pro-apoptického proteinu Bax byla zvýšena u buněk LNCaP ošetřených 9, zejména po 6 a 12 h působení, a snížena exprese pro-apoptického neštěpeného proteinu Bíd po 6 a 12 h ošetření oběma typy BRs. Tento pokles exprese proteinu Bid může představovat jeho štěpení vlivem brassinosteroidů. U buněk DU-145 nebyla exprese proapoptických proteinů Bax a Bid změněna. Po ošetření buněk LNCaP látkou 9 jsme detekovali štěpné aktivní fragmenty kaspasy-3 po 6, 12 a 24h aplikací. Ošetření buněk LNCaP sloučeninou 6 po 24 h rovněž vedlo k aktivaci kaspasy-3. Na druhé

*			- ·	·· * a	a a	«
• ·	ta	a a a	a	a	a
	*	•	a a	• a a	• a	a	a
•	*	•	*	a a a	♦	a	a
• a	··	• t · ··	v·	a

straně u linie DU-145 nebyla žádná změna kaspasy-3 zjištěna. Positivní exprese poly-(ADP-ribosa)-polymerasy (PARP) byla zjištěna pozitivní exprese u kontrolních buněk prostatických nádorových linií, ovšem brassinosteroidy neměly žádný efekt na expresi ani na jeho degradaci ve všech časových intervalech 6/12/24 h (Obr. 6B).

V této studii jsme zjistili, že ošetření sloučeninou 9 vyvolalo výrazný pokles hladiny anti-apoptického proteinu Bcl-2 a nárůst pro-apoptického proteinu Bax u buněčné linie LNCaP. Dále bylo u těchto buněk zjištěno štěpení pro-kaspasy-3 na její aktivní formu ve všech časových intervalech po ošetření látkou 9 a po 24 h aplikace u látky 6. Toto zjištění svědčí o iniciaci apoptických změn u buněk LNCaP. Již dříve bylo popsáno, že v efektorové fázi apoptosy hraje důležitou roli aktivace kaspasové kaskády (Budihardjo a spol., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 269-290, 1999). Kaspasa-3 představuje exekuční proteasu, která se podílí na štěpení proteinů PARP a následné DNA degradace a apoptické smrti (Allen a spol., Cell. Mol. Life Sci. 54, 427-445,1998; Cain a spol., Biochimie 84, 203-214, 2002). Tyto výsledky naznačují, že brassinosteroidy 9 a 6 mohou u buněčných linií odvozených od karcinomu prostaty podpořit apoptosu cestou aktivace kaspasy-3 a modulací proteinů rodiny Bcl-2.

U mammámích nádorových buněčných linií Western blot analýza nepotvrdila signifikantní změny v expresi proteinů rodiny Bcl-2 ani aktivaci kaspasy-3 po ošetření brassinosteroidy 9 a 6.

PŘÍKLAD 8 ^{= r}

Suché tobolky

5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I uvedených shora v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 1250 g

Talek 180 g

Pšeničný škrob 120 g

Magnesium stearát 80 g

Laktosa 20 g

Postup přípravy: Rozemleté složky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.

PŘÍKLAD 9

Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné zé sloučenin obecného vzorce I uvedených shora v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g

Lauroglykol 2 litry

Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (laurát propylenglykolu, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozemele se ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o hmotnosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

PŘÍKLAD 10

Měkké tobolky

5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I uvedené shora v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:

Složení

Aktivní složka 250 g

PEG400 1 litr

Tween 80 1 litr

Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o molekulové hmotnosti mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tweenu® 80 (monolaurát polyoxyethylensorbitanu, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o hmotnosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I v němž

   R znamená CH2 nebo 0-0¾ skupinu,

   R² znamená atom vodíku nebo hydroxyl,

   R³ znamená hydroxyl,

   R²⁴ znamená alkyl nebo alkenyl vybrané ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, methylen, ethylen a propylen, a

   R²⁵ znamená alkyl vybraný ze skupiny zahrnující methyl a ethyl, a jejich farmaceuticky použitelné soli, pro použití při léčení hyperproliferace savčích buněk vyznačující se tím, že se savčím buňkám aplikuje účinné množství uvedených přirozených brassinosteroidů.
2. 2. Přirozené brassinosteroidy podle nároku 1 obecného vzorce I pro použití při léčení proliferativních onemocnění savců, vyznačující se tím, že se podává terapeuticky efektivní množství přirozených brassinosteroidů savčím hyperproliferujícím buňkám, které toto podání potřebují, při čemž přirozené brassinosteroidy jsou vybrány ze skupiny zahrnující následující sloučeniny: kastasteron, 28-homokastasteron, 24-epibrassinolid, dolichosteron, 2deoxykastasteron, typhasterol, teasteron, 3-oxoteasteron, kathasteron, 6deoxotyphasterol, 3-dehydro-6-deoxoteasteron, homotyphasterol, • φ φ φ φ · » · «*· ·· *« · homoteasteron, homodolichosteron, 25-methylkastasteron, 25methyldolichosteron, 2-deoxy-25- methyldolichosteron a 3-epi-2-deoxy-25methyldolichosteron.
3. 3. Přirozené brassinosteroidy podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že R², R³, R²⁴, a R²⁵ mají nezávisle na sobě (R) nebo (S) konfiguraci.
4. 4. Přirozené brassinosteroidy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli pro použití při inhibici proliferace savčích buněk, vyznačující se tím, že se podává terapeuticky efektivní množství uvedených přirozených brassinosteroidů spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
5. 5. Přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I pro použití jako růstové regulátory ve zvířecích a lidských buněčných tkáňových kulturách pro regulaci jejich proliferace a morfogeneze.
6. 6. Přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až

   3 nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli pro použití při léčení rakoviny, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky efektivního množství· v kombinaci s běžně používanými cytostatiky, jako je mitoxantron, cis-platina, methotrexát, taxol nebo doxorubicih. =
7. 7. Přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli pro použití při indukci apoptosy v savčích buňkách, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky efektivního množství při spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
8. 8. Přirozené deriváty brassinosteroidů podle kteréhokoliv· 7 nároků 1 až 3 obecného vzorce I pro použití při léčení rakoviny, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky efektivního množství derivátů brassinosteroidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.' • ' · *
9. 9. Přirozené brassinosteroidy podle nároku 8 pro použití při léčení, vyznačující se tím, že rakovina znamená rakovinu prsu, dělohy nebo prostaty.
10. 10. Přirozené brassinosteroidy obecného vzorce I

    R znamená CH₂ nebo O-CH₂ skupina,

    R² znamená atom vodíku nebo hydroxyl,

    R³ znamená hydroxyl,

    R²⁴ znamená alkyl nebo alkenyl vybrané ze skupiny sestávající z methylu, ethylu, propylu, isopropylu, methylenu, ethylenu a propylenu,.a

    R²⁵ znamená alkyl vybraný ze skupiny sestávající z methylu a ethylu, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, pro použití při regulaci nepříznivých účinků steroidních dysfunkcí v savčích buňkách, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky efektivního množství shora uvedených přirozených brassinosteroidů obecného vzorce I savčím buňkám.
11. 11. Přirozené brassinosteroidy podle nároku 10, v němž R², R³, R²⁴, a R²⁵ mají nezávisle na sobě (R) nebo (S) konfiguraci.
12. 12. Přirozené brassinosteroidy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo farmaceuticky přijatelné soli takových sloučenin pro použití při regulaci

    ▼▼ ▼ TV ▼ v 9 * « ·· ♦ 4 * • « 4 ·· • ♦ · 1 β « • * • • * • t · · • • • • • • • ♦ ♦ 4 • • ·« >« ·· •

    nepříznivých účinků steroidnich dysfunkcí u savců, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky efektivního množství uvedených sloučenin spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem
13. 13. Přirozené brassinosteroídy podle nároku 12, v němž steroidní disfunkce znamená osteoporózu, defekty metabolismu cholesterolu, Huntingtonovu nemoc, Alzheimerovu nemoc, steroidy indukovaná katarakta, deficienci P450 oxidoreduktasy, mužskou neplodnost a poruchy sexuálního chování a diferenciace.
14. 14. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje efektivní množství přirozených brassinosteroidů obecného vzorce I podle nároků 1 až 3 a 10 až 11.
15. 15. Farmaceutický prostředek podle nároku 14 pro použití při léčení savčích buněk a lidí.