CZ20041105A3 - Novel quantification method of nucleic acids - Google Patents
Novel quantification method of nucleic acids Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20041105A3 CZ20041105A3 CZ20041105A CZ20041105A CZ20041105A3 CZ 20041105 A3 CZ20041105 A3 CZ 20041105A3 CZ 20041105 A CZ20041105 A CZ 20041105A CZ 20041105 A CZ20041105 A CZ 20041105A CZ 20041105 A3 CZ20041105 A3 CZ 20041105A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- semi
- sequences
- allelic
- sequence
- quantification
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Název vynálezu:Title of the invention:
Novy způsob kvantifikace nukleovych kyselinA new way to quantify nucleic acids
Oblast techniky: Biotechnologie - molekulárně genetické diagnostické postupy založené na analýze nukleových kyselin.Biotechnology - molecular genetic diagnostic procedures based on nucleic acid analysis.
Charakteristika dosavadního stavu:Characteristics of the current state:
Nutnost přesné, rychlé a automatizovatelné kvantifikace vybraných terčů nukleových kyselin (terč = sledovaný úsek DNA nebo RNA jakéhokoliv původu a typu) v biologickém materiálu je stále naléhavěji pociťována jak v experimentální, tak i v praktické, například medicínské praxi.The need for accurate, rapid and automated quantification of selected nucleic acid targets (target = DNA or RNA of any origin and type of interest) in biological material is increasingly felt both in experimental and practical, for example medical, practice.
Kvantifikace DNA či RNA terčů v biologickém vzorku není přímočarým procesem. Tato potíž je způsobena více faktory, dva nejmarkantnější jsou 1) vysoce komplexní, individuálně odlišná sekvence jednotlivých polymerů nukleových kyselin samých a b) vysoká variabilita v kvalitě samotných biologických vzorků.Quantification of DNA or RNA targets in a biological sample is not a straightforward process. This difficulty is due to several factors, the two most prominent being 1) a highly complex, individually different sequence of the individual nucleic acid polymers themselves and b) a high variability in the quality of the biological samples themselves.
Například terč DNA 350 nukleotidů (nt) dlouhý tvoří jen 0,00001% z délky lidského genomu; pro množinu lidské buněčné mRNA je terč jedné průměrné mRNA o počtu 100 molekul v buňce jen 0,0036% zlomek. Pro zkoncentrování je nutné použít amplifikační krok, kdy je vybraný terč selektivně amplifikován na úroveň, kdy je jeho odečitatelný signál zřetelně rozlišitelný od pozadí (1-8).For example, a DNA target of 350 nucleotides (nt) long is only 0.00001% of the length of the human genome; for a set of human cell mRNA, the target of one average 100 mRNA cell in a cell is only 0.0036% fraction. To concentrate, it is necessary to use an amplification step where the selected target is selectively amplified to a level where its readable signal is clearly distinguishable from the background (1-8).
Pokud je jako vstupní materiál použit biologický vzorek odebraný od dvou různých individuí anebo od téhož individua, ale s časovým odstupem, nelze téměř nikdy garantovat stejnou historii takovýchto dvou vzorků v důsledku řady faktorů: individuálních genetických rozdílů neimbredních osob, aktuálního zdravotního stavu pacienta tj. poskytovatele vzorku, způsob transportu, způsob a aktuální provedení izolace nukleových kyselin, vlastní provedení amplifikační reakce a její vyhodnocení a v neposlední řadě momenty vnesení pipetovacích chyb. Jedinou možností je pak tyto faktory co nejvíce omezit použití souběžného kontrolního systému kvantifikování a srovnání výsledku pro testovaný a kontrolní templát.If a biological sample taken from two different individuals or from the same individual but with a time lag is used as input, it is almost never possible to guarantee the same history of such two samples due to a number of factors: individual genetic differences of non-immbred persons; sample, method of transport, method and actual performance of nucleic acid isolation, actual amplification reaction and its evaluation and last but not least moments of pipetting errors. The only option is to limit these factors as much as possible by using a concurrent quantification control system and comparing the result for the test and control templates.
Výběr kontrolního systému je zásadním počinem a protože předkládaná patentová přihláška řeší právě tento problém, je nutné tuto problematiku detailněji analyzovat. Kontrolní systémy je možné rozdělit na:The choice of a control system is a fundamental step and since the present patent application solves this problem, it is necessary to analyze this issue in more detail. Control systems can be divided into:
O interní nebo externí,About internal or external,
Θ jednozkumavkové čí dvouzkumavkové,Θ single or double tube,
Θ templátově semiidentické anebo neidentické.Semi template semi-identical or non-identical.
Ad O: Interní kontroly jsou kvalitnější než externí, nicméně je jich možno použít pouze tam, kde v biologickém vzorku můžeme jednoznačně nalézt molekulu, jejíž koncentraci buď můžeme považovat za konstantní a tím například úměrné objemu vzorku apod. anebo ji nějakým způsobem přesně změřit. Externě můžeme tuto situaci navodit tak, že do zpracovávaného biologického vzorku přesné množství nějakého terče přidáme. Kvalita nukleových kyselin takovéto externí kontroly však nemusí být stejná jako vysoce variabilní kvalita nukleových kyselin v biologickém vzorku, proto je dávána přednost interním kontrolám.Ad O: Internal controls are better than external controls, however, they can be used only where the biological sample can clearly find a molecule whose concentration can either be considered constant and thus proportional to the sample volume, etc., or accurately measured in some way. Externally, we can add the exact amount of a target to the biological sample to be processed. However, the quality of the nucleic acids of such an external control need not be the same as the highly variable quality of the nucleic acids in the biological sample, so internal controls are preferred.
Ad Θ: Optimální je, když je kontrolní a testovaný templát amplifikován ve stejné zkumavce. Odpadají především pipetovací chyby. Některé amplifikační postupy však nedovolují amplifikaci několika terčů najednou anebo je víceterčová amplifikace zatížena sníženou citlivostí či specificitou (9). Pokud je přesná kvantifikace nutná, je třeba provést více reakcí z jednoho biologického vzorku najednou a výsledek statisticky ošetřit.Ad Θ: Optimally, the control and test templates are amplified in the same tube. In particular, pipetting errors are eliminated. However, some amplification procedures do not allow the amplification of several targets at the same time, or multi-amplification amplification is burdened with reduced sensitivity or specificity (9). If accurate quantification is required, multiple reactions from one biological sample should be performed at one time and statistically treated.
Ad ©: Samotný enzymatický amplifikační systém využívá bez^zýjimky hybridizačních vlastností nukleových kyselin - schopnosti tvořit dvouřetězové konjugáty na základě komplementarity adenosinu s thyminem, cytosinu s guanosinem. Optimální kontrolní systém je tedy takový, který má nukleotidovou sekvenci shodnou nebo jen nepatrně odlišnou (semiidentickou). Tato semiidentita se týká jak vlastní sekvence, tak i olégonukleotidových primerů použitých při enzymatických amplifikacích. Přímočaré je využití přirozené alelické semiidentity DNA polymorfismů nebo mutací ke kvantifikaci aneuploidií či mutací samotných. Požadovaná a nutná alelicita je však jedním z limitujících faktorů - pro některé úseky nukleových kyselin (např. mRNA) nelze nalézt alelicky odlišné sekvence, u řady dalších je nutné zařadit předcházející vyhodnocovací krok, kdy je u sledovaného individua zjišťován genotyp vytypovaných alel a teprve na základě tohoto šetření provedeno testování (10,11). Sekvenčně semidentické kontrolní molekuly lze připravit uměle a do měřeného roztoku je přidat jako například u kompetitivních kvantifikačních variant (12), pak ale vstupují v účinnost omezení popsané v případě O.Ad: The enzymatic amplification system itself utilizes, without exception, the hybridization properties of nucleic acids - the ability to form double-stranded conjugates based on the complementarity of adenosine with thymine, cytosine with guanosine. Thus, an optimal control system is one having a nucleotide sequence identical or only slightly different (semi-identical). This semi-identity relates both to the sequence itself and to the oligonucleotide primers used in the enzymatic amplifications. The use of the natural allelic semi-identity of DNA polymorphisms or mutations to quantify aneuploidy or mutations themselves is straightforward. However, the required and necessary allelicity is one of the limiting factors - for some stretches of nucleic acids (eg mRNA) allelically different sequences cannot be found, in many others it is necessary to include the previous evaluation step where the monitored individual is genotyped of alleles and only of this investigation carried out testing (10,11). Sequentially-sequential control molecules can be prepared artificially and added to the measured solution as for example in competitive quantification variants (12), but then the limitations described in the case of O come into effect.
V souhrnu lze konstatovat, že nejpřesnější a nejuniverzálnější kvantifikační systém využívá vnitřní, jednozkumavkový a semiidentický kontrolní systém. V praxi je pak preferováno provedení se značením fluorescenčními márkry a přímým měřením v reálném čase a/nebo vyhodnocení fluorescence na sekvenátoru. Hranice přesnosti v těchto uspořádáních dosahují i standardní odchylku měření na úrovni 0,5% (13-15).In summary, the most accurate and versatile quantification system uses an internal, single-tube and semi-identical control system. In practice, it is preferred to carry out fluorescence labeling and direct real-time measurement and / or evaluation of fluorescence on a sequencer. The accuracy limits in these configurations also reach a standard deviation of 0.5% (13-15).
Podstata vynálezu:SUMMARY OF THE INVENTION:
Podstatou vynálezu je nalezení zcela nového, originálního způsobu, jakým by bylo možné jednak univerzálně zajistit optimální kontrolní kvantifikační systém: vnitřní, jednozkumavkový a semiidentický a jednak, aby byl robustní, přesný a jednoduchý natolik, aby byl zužitkoýíeíný i v klinických podmínkách. Řešení vychází z toho, že kompletní lidská genomická sekvence je od roku 2001 známa a veřejně přístupná, ale také z faktu, že i genomické sekvence klinicky nejdůležitějších patogenních organizmů jsou determinovány. Dále vychází z příznivého výsledku teoretického výpočtu, který ukazuje jaká je statisticky vypočítaná délka sekvenčně identického či semiidentického fragmentu mezi dvěma nezávislými řetězci DNA nebo RNA (kvantifikačně sledovaného a kontrolního) podle vzorce:SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to find an entirely new, original way of providing an optimal control quantification system universally: internal, single-tube and semi-identical, and to be robust, accurate and simple enough to be utilized in clinical conditions. The solution is based on the fact that the complete human genomic sequence has been known and publicly accessible since 2001, but also on the fact that the genomic sequences of the clinically most important pathogenic organisms are also determined. It is also based on a favorable theoretical calculation that shows the statistically calculated length of a sequence-identical or semi-identical fragment between two independent DNA or RNA strands (quantified and control) according to the formula:
A x B x 2 = 4n (1-1) kde A je délka vytcene kvantifikované sekvence, B jsou délka srovnávané sekvence a n je teoretická délka shodné, nepřerušené sekvence. Podmínkou je, aby B»A, faktor 2 je odrazem skutečnosti, že lze použít ke srovnání jak sekvencí čtenou v 5'-3' směru, tak i v 3'-5' směru.A x B x 2 = 4 n (1-1) where A is the length of the quantified sequence, B is the length of the compared sequence and n is the theoretical length of the same, uninterrupted sequence. The condition is that B »A, factor 2 reflects the fact that it can be used to compare both the 5'-3 'direction and the 3'-5' direction.
Stringence rovnice (1-1) může být zmírněna nejméně dvěma parametry:The stringency of equation (1-1) can be mitigated by at least two parameters:
Jelikož cílem hledání není 100% shodná sekvence, nýbrž nalezení semiidentické sekvence, takové, jež obsahuje mezi dvěma sekvencemi nějakou neshodu. Pouze semiidentická sekvence je pak ve výsledném amplifikátu rozeznatelná. Do rovnice (1-1) je tedy třeba zanést parametr „p“, který udává, jak dlouhá může být sekvence, která přerušuje kdekoliv souvislou sekvenci homologní - tato nehomologie zastupuje buď 3 zbývající nukleotidy anebo jeho úplné chybění (Obr. 1) - tedy 4 možnosti a tím je vložený zmírňující parametr dán faktorem 4P.Since the aim of the search is not a 100% identical sequence, but the search for a semi-identical sequence, one that contains some mismatch between the two sequences. Only the semi-identical sequence is then recognizable in the resulting amplification. In equation (1-1) it is necessary to enter the parameter "p", which indicates how long the sequence that interrupts anywhere in the continuous sequence can be homologous - this nonhomology represents either the 3 remaining nucleotides or its complete lack (Fig. 1) - ie 4 options and thus the embedded mitigation parameter is given by a factor of 4 P.
Druhým zmírňujícím faktorem je odraz faktu, že pro návrh amplikačních oligonukleotidů pro obě - kontrolní i měřenou sekvenci - je akceptovatelná i 20% nehomologie, tedy zhruba každých 5 nukleotidů může být do uměle připravovaného oligonukleotidu inkorporovány oba nukleotidy. Tím se parametr 4n mění na 4°'8 a výsledná rovnice na tvar:The second mitigating factor is the reflection of the fact that 20% inhomology is acceptable for the design of amplification oligonucleotides for both control and measured sequences, ie approximately every 5 nucleotides both nucleotides can be incorporated into an artificially prepared oligonucleotide. This changes parameter 4 n to 4 ° ' 8 and the resulting equation to form:
A x B x 2 x 4P = 4θδη čili A x B = 21'6n-2p’1 (1-2)A x B x 2 x 4 = P θδη 4 or A x B = 2 1 '6n - 2p-1 (1-2)
Tento výpočet je teoretický, nicméně v praktickém případě je situace příznivější v tom, že porovnávané sekvence A a B mají obvykle stejnou evoluční historii, tj. lze předpokládat výskyt semiidentických sekvencí v důsledku evolučního procesu. Na druhou stranu je cílem většiny kvantifikací sekvence unikátní a tudíž je nutné alespoň vzít v patrnost, že jen 60% sekvencí v eukaryotním genomu je unikátních, zbytek tvoří repetitivní sekvence, pro semiidentickou kvantifikaci nevyužitelné. Vzorec (1-2) tak poskytuje ten krajní hodnotu v praxi i o řád překračovanou (viz Příklady uskutečnění vynálezu).This calculation is theoretical, but in practical terms the situation is more favorable in that the compared sequences A and B usually have the same evolutionary history, ie the occurrence of semi-identical sequences due to the evolutionary process can be assumed. On the other hand, most of the quantification sequences are unique and therefore it is necessary to at least bear in mind that only 60% of the sequences in the eukaryotic genome are unique, the rest being repetitive sequences, unusable for semi-quantitative quantification. Thus, formula (1-2) provides that extreme value in practice even by an order of magnitude exceeded (see Examples).
PŘÍKLADY USKUTEČNĚNÍ VYNÁLEZU:EXAMPLES OF THE INVENTION:
I. kvantifikace exprese mRNA a hnRNAI. Quantification of mRNA and hnRNA expression
II. kvantifikace virů lil. kvantifikace fetální DNA ve směsi s mateřskou v mateřské plazměII. quantification of IIIa viruses. quantification of fetal DNA mixed with maternal DNA in maternal plasma
I. Kvantifikace exprese informačních RNA (mRNA) a heteronukleární RNA (hnRNA) vůči expresi house-keeping genů nebo genomické DNA.I. Quantification of expression of information RNA (mRNA) and heteronuclear RNA (hnRNA) against expression of house-keeping genes or genomic DNA.
V lidském genomu je asi 30 000 genů. Z těchto je exprimována odpovídající hnRNA, potažmo mRNA a její hladina v různých podmínkách je předmětem experimentálního či klinického sledování. Průměrná délka mRNA je asi 3300 nt (= hodnota A), započteny jsou 5'a 3' netranslatované úseky. Celkově tedy tvoří sekvence mRNA délku 3300 x 30 000 = 108 nukleotidů (tj. asi 3,3% z celkové délky lidského genomu). Pro srovnávací sekvenci B lze zařadit buď spojenou množinu tzv. house-keeping genů, jichž je v buňce asi 1%, tj o celkové délce asi 106 nukleotidů anebo zařadit i celkovýgenom - u lidí asi 2x109 unikátních sekvencí. Délka n podle rovnice (1-1) pro daný parametr p = 14 je rovnáThere are about 30,000 genes in the human genome. Of these, the corresponding hnRNA or mRNA is expressed and its level under various conditions is subject to experimental or clinical monitoring. The average length of the mRNA is about 3300 nt (= A value), 5 'and 3' untranslated regions are included. Overall, therefore, consisting of the sequence of the mRNA length 3300 x 30 = 000 10 8 nucleotides (i.e. about 3.3% of the total length of the human genome). For comparison sequence B, either a pool of so-called house-keeping genes, about 1% in the cell, about 10 6 nucleotides in length, or a total genome - about 2x10 9 unique sequences in humans, can be included. The length n according to equation (1-1) for the given parameter p = 14 is equal
AxB = 21,6n'2p_1 AxB = 2 1.6n ' 2p_1
300 x 106 = 21,6n_28‘1 300 x 10 6 = 2 1,6n_28 -1
9.52 = 0.3 (1,6n - 29) = 0,48n - 8,79.52 = 0.3 (1.6n - 29) = 0.48n - 8.7
18.22 = 0.48n (rovnice 1-1)18.22 = 0.48n (Equation 1-1)
Hhkg = 38 to znamená, že pro danou mRNA lze v alespoň jedné „house keeping“ mRNA nalézt semidentickou sekvenci dlouhou asi 38 nt, přerušenou uvnitř až 14ti nukleotidovým ostrovem nehomologie včetně gapu. Z této semidentícké sekvence lze pak navrhnout dva oligonukleotidy, které budou pro obě mRNA společné.Hhkg = 38 means that, for a given mRNA, at least one house keeping mRNA can be found to be a semi-permanent sequence of about 38 nt, interrupted within a 14 nucleotide island of inhomology, including a gap. From this semidentic sequence, two oligonucleotides can be designed that will be common to both mRNAs.
Pro situaci, kdy je kompetitorem genomická DNA je tatáž rovnice ve tvaru:For a situation where the genomic DNA competitor is the same equation:
300 x 2 x 109 = 21,6-28-1 300 x 2 x 10 9 = 2 1.6 - 28 - 1
3.52 + 9,3 = 0,48n - 8,73.52 + 9.3 = 0.48n - 8.7
21.52 = 0,48n ng = 45 a návrh oligonukleotidových primerů je ještě pohodlnější, přičemž je realizovatelný i návrh nested primerů pro amplífikace z jedné buňky nebo omezeného množství vstupního templátu.21.52 = 0.48n n g = 45 and the design of the oligonucleotide primers is even more convenient, and nested primers for single cell amplification or a limited amount of input template are feasible.
Příklad kvantifikace hnRNA genu WDR9 v leukocytech vůči genomické DNA.Example of quantification of hnDR of WDR9 gene in leukocytes against genomic DNA.
Nalezená semiidentita mezi WDR9 hnRNA a genomickou DNA :Found semi-identity between WDR9 hnRNA and genomic DNA:
FAMWDR9GA 5' CCT GTA CAC TCT ATT AAA GAA CAC 3' FAM WDR9GA 5 'CCT GTA CAC
WDR9GB 5' GGG ATT TAA CCA AAA TCT TGC TCT 3'WDR9GB 5 'GGG ATT TAA CCA AAA TCT TGC TCT 3'
Provedení RT-PCR (reverzně-transkriptázové polymerázové řetězové reakce):RT-PCR (reverse-transcriptase polymerase chain reaction):
Izolace RNA ze vzorku jaderných buněk periferní krve byla provedena lýzou červených krvinek pomocí pomocí Qiagen Mini RNA kit, kdy byl použit pouze 1. krok. Izolované bílé krvinky byly naředěny do fyziologického roztoku NaCI s přibližnou koncentrací 100 buněk v μΙ izolátu. 2 μΙ pak byly použity do 5 nezávislých reakcí standardní jednozkumavkové RTPCR reakce pomocí Qiagen OneTube kitu ve složení:RNA isolation from a peripheral blood nuclear cell sample was performed by lysing red blood cells with the Qiagen Mini RNA kit, using only step 1. The isolated white blood cells were diluted into physiological NaCl solution with an approximate concentration of 100 cells per μΙ of isolate. 2 μΙ were then used in 5 independent reactions of a standard single tube RTPCR reaction using the Qiagen OneTube kit consisting of:
ml voda ml 10x pufr ml hrubého izolátu bílých krvinek ml OneTube RT-polymerázyml water ml 10x buffer ml coarse white blood cell isolate ml OneTube RT-polymerase
0,4 ml 10 mM dNTPs0.4 ml of 10 mM dNTPs
0,4 ml prímer WDR9GA (300 ng/ml)0.4 ml WDR9GA primer (300 ng / ml)
0,4 ml primer WDR9GB (300 ng/ml) provedení PCR sledovalo teplotní a časový profil:0.4 ml WDR9GB primer (300 ng / ml) PCR performed to observe the temperature and time profile:
(50°C/10 min)1x - (94°C/12/< 53°C/12yť^ 72°C/12yf)40x.(50 ° C / 10 min) 1x - (94 ° C / 12 / <53 ° C / 12y > 72 ° C / 12yf) 40x.
0,5 výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 a zaznamenány výšky a plochy píků (WDR9 hnRNA = 102 bp, genomické DNA = 106 bp).0.5 of the resulting amplification was tested on an ABI Prism 310 automated sequencer and peak heights and areas recorded (WDR9 hnRNA = 102 bp, genomic DNA = 106 bp).
II. Kvantifikace cizího genomu ve vzorcích hostitelských organizmů.II. Quantification of foreign genome in host organism samples.
Zcela obdobně jako u popisu a výpočtů kvantifikace mRNA lze postupovat u sekvencí cizího genomu. Pokud jde o viry, baktérie nebo nižší eukaryota, pak délka jejich genomu je dosaditelná do vzorce (1-2) a pro jeden z nejmenších virů - viru hepatitidy B pak můžeme dosadit do výpočtů jeho délku = 3200 nukleotidů jako parametr A a tudíž můžeme hodnotu ng vypočítanou pro kvantifikace mRNA vůči genomické DNA přímo použít (tj. hodnota ng = 45). Pro viry o větších rozměrech - papilomavirus, virus hepatitidy C atd., je situace ještě příznivější - nalezené semidentické sekvence budou delší a bude jich více. Pro baktérie s genomy o velikosti asi 1 000 000 nukleotidů pak bude možno nalézt téměř vždy semiidentickou sekvenci vhqdnou ke kvantifikaci a tudíž je možné kvantifikační reakci zpřesnit-mmfcpUkaeípj. několika nezávislými kvantifikacemi v jedné zkumavce najednou. Situaci ještě příznivě ovlivní přítomnost interních sekvencí velmi podobných sekvencím virovým, známý je i fenomén konzervativnosti některých genů a to i mezi eukaryotními a prokaryotnímu organizmy.Similarly to the description and calculation of mRNA quantification, the foreign genome sequences can be used. As for viruses, bacteria or lower eukaryotes, the length of their genome is substitutable to formula (1-2) and for one of the smallest viruses - hepatitis B virus, we can substitute its length = 3200 nucleotides as a parameter in the calculations and thus we can n g calculated for mRNA quantitation against genomic DNA directly used (ie value of n g = 45). For larger-sized viruses - papillomavirus, hepatitis C virus, etc., the situation is even more favorable - the semidentic sequences found will be longer and more. For bacteria with genomes of about 1,000,000 nucleotides, it will then almost always be possible to find a semi-identical sequence suitable for quantification, and thus the quantification reaction can be refined. several independent quantifications in one tube at a time. The situation is positively influenced by the presence of internal sequences very similar to viral sequences, and the phenomenon of conservation of some genes is also known, including among eukaryotic and prokaryotic organisms.
I zde je standardizace vůči genomické DNA výhodná, protože systémy determurjjící koncentraci genomické DNA jsou nejpropracovanější a jejich užití jako kontrolních pak účelně zužitkuje tento fakt.Here too, standardization against genomic DNA is advantageous, since systems that determine the concentration of genomic DNA are the most sophisticated, and their use as a control then effectively utilizes this fact.
Kvantifikace genomické DNA cytomegaloviru vůči lidské genomické DNA z krve pacientů. Semidentická sekvence CMV a lidské DNA:Quantification of cytomegalovirus genomic DNA to human genomic DNA from patient blood. Semidentic sequence of CMV and human DNA:
CMVGA 5' CATCGGGCTGTGTTTCGA 3' = 104 bp produkt (Tm = 51 °C)CMVGA 5 'CATCGGGCTGTGTTTCGA 3' = 104 bp product (Tm = 51 ° C)
CMVGB 5' GGACTCAAACCTGCAGCA 3' = 92 bp produkt (Tm = 51 °C)CMVGB 5 'GGACTCAAACCTGCAGCA 3' = 92 bp product (Tm = 51 ° C)
Provedení RT-PCR (reverzně-transkriptázové polymerázové řetězové reakce):RT-PCR (reverse-transcriptase polymerase chain reaction):
Izolace RNA ze vzorku jaderných buněk periferní krve byla provedena lýzou červených krvinek pomocí pomocí Qiagen Mini RNA kit, kdy byl použit pouze 1. krok. Izolované bílé krvinky byly naředěny do fyziologického roztoku NaCI s přibližnou koncentrací 100 buněk v μΙ izolátu. 2 μΙ pak byly použity do 5 nezávislých reakcí standardní jednozkumavkové RTPCR reakce pomocí Qiagen OneTube kitu ve složení:RNA isolation from a peripheral blood nuclear cell sample was performed by lysing red blood cells with the Qiagen Mini RNA kit, using only step 1. The isolated white blood cells were diluted into physiological NaCl solution with an approximate concentration of 100 cells per μΙ of isolate. 2 μΙ were then used in 5 independent reactions of a standard single tube RTPCR reaction using the Qiagen OneTube kit consisting of:
μΙ voda 2 μΙ 10x pufr μΙ hrubého izolátu bílých krvinek 1 μΙ OneTube RT-polymerázyμΙ water 2 μΙ 10x buffer μΙ coarse white blood cell isolate 1 μΙ OneTube RT-polymerase
0,4 μΙ WmMdNTPs0.4 μΙ WmMdNTPs
0,4 μΙ primer CMVGA (300 ng/ml) 0,4 μΙ primer CMVGB (300 ng/ml)0.4 μΙ primer CMVGA (300 ng / ml) 0.4 μΙ primer CMVGB (300 ng / ml)
0,5 μΙ výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 a zaznamenány výšky a plochy píků.0.5 μΙ of the resulting amplification was tested on an ABI Prism 310 automatic sequencer and peak heights and areas were recorded.
III. Kvantifikace fetálního genomu v mateřské plazmě - detekce aneuploidií.III. Quantification of fetal genome in maternal plasma - detection of aneuploidy.
V praktické medicínské rovině je nejúčelnější strategií léčby prevence. Z tohoto důvodu jsou prováděny či připravovány preventivní zdravotnické programy, jedním z nich je preventivní skrínink aneploidických plodů - konkrétně trizomie 21 (tvoří 95% záchytů). Zde je nejmodernější metodou vyšetření fetálního materiálu vyplavovaného od časných stádií těhotenství do mateřského krevního oběhu. Patentovaný postup ošetření krve těhotných umožňuje to, aby již pro těhotné I. trimestru (do 13. týdne těhotenství) byl zajištěn poměr fetální/maternální DNA v plazmě matky >5%. Pokud je takovýto materiál zpracován např. technikou popsanou vjPatentu České republiky č. 293497, pak je možné garantovat pro 95% těhotných výsledek s 99% přesností (citlivost = 95%, specificita = 99%), což jsou údaje plně akceptovatelné (srv. citlivost a specificitu masově prováděného biochemického skríninku II. trimestru odhadované na 70% a 80%).On the practical medical level, prevention is the most effective treatment strategy. For this reason, preventive health programs are being implemented or prepared, one of which is the preventive screening of aneploid fetuses - specifically trisomy 21 (accounting for 95% of seizures). Here, the most modern method is to examine fetal material washed away from the early stages of pregnancy to maternal circulation. The patented procedure for the treatment of pregnant blood allows for a fetal / maternal DNA ratio in the maternal plasma of> 5% to be ensured for the first trimester of pregnancy (up to the 13th week of pregnancy). If such material is processed, for example, by the technique described in Czech Patent No. 293497, then it is possible to guarantee a 95% accuracy result with 99% accuracy (sensitivity = 95%, specificity = 99%), which is fully acceptable data (cf. sensitivity) and the specificity of the mass performed second trimester biochemical screening estimated at 70% and 80%).
Vynalezený způsob kvantifikace fetálního příspěvku dále navyšuje oba parametry, které pak mohou dosáhnout až k 99% v obou hodnotách. Hlavním přínosem nově vynalezeného kvantifikačního postupu je však výrazné zjednodušení celé operace, kdy, při zachování vysoké přesnosti citlivosti, není třeba s výjimkou vlastního izolačního a amplifikačního kroku žádná další operace ohrožující přesnost (restrikce restrikčními endonukleázami, post-amplifikační inkorporace značených (di)deoxynukleotidů, případně nutné purifikační kroky. Proto je možná přímá automatizace procesu, nemyslitelná v žádném dosud publikovaném postupu.The inventive method of quantifying fetal contribution further increases both parameters, which can then reach up to 99% in both values. The main benefit of the newly invented quantification procedure, however, is a significant simplification of the whole operation, where, while maintaining high precision of sensitivity, with the exception of the isolation and amplification step itself, no other precision endangering operations (restriction by restriction endonucleases, post-amplification Therefore, direct automation of the process is not possible in any published process.
Teoretický výpočet pro nejmenší lidský chromozóm 21 (A = 4,8 x 107) a jeho srovnání vůči zbytku genomu je, při nastavení parametru p = 3, následující:The theoretical calculation for the smallest human chromosome 21 (A = 4.8 x 10 7 ) and its comparison to the rest of the genome is as follows when the p = 3 parameter is set:
4,8 x 107 x 2 x 109 = 21·6“6'1 4.8 x 10 7 x 2 x 10 9 = 2 1 · 6 “ 6 ' 1
18,98 = 0,3(1,6n -7) ng = 4418.98 = 0.3 (1.6 n -7) n g = 44
Semidentická DNA sekvence lidských chromozómů 21 (kvantifikovaný) a 12 (kontrolní): fam12-21F 5’ TGTTGAGCAAGRGTTGTATAG 3’Semidentic DNA sequence of human chromosomes 21 (quantified) and 12 (control): fam 12-21F 5 'TGTTGAGCAAGRGTTGTATAG 3'
12-21R 5 ’ CATTTACAAAACACTGTAATGAAAAA 3'12-21R 5 'CATTTACAAAACACTGTAATGAAAAA 3'
Provedení amplifikační reakce:Perform amplification reaction:
Izolace DNA ze vzorku plazmy periferní krve byla provedena z objemu 1 ml krve dárce s karyotypem 46,XY a také z 1 ml krve pacienta s Downovým syndromem (47, XY,+21) standardním izolačním postupem kitu Qiagen DNA Mini kit s výslednou elucí do 50 μΙ destilované vody. Výsledný výtěžek DNA byl pečlivě určen densitometrickou triplikovanou kvantifikací 5 μΙ izolátu na agarózové elektroforéze a adjustován na koncentraci 100 ng/μΙ. Z obou DNA pak byl vytvořen směsný vzorek s 0, 5, 10, 15 a 20, 25% aberantní DNA v DNA normální. Amplifikační krok byl proveden triplikátně:DNA isolation from the peripheral blood plasma sample was performed from 1 ml of donor karyotype 46, XY blood as well as 1 ml of Down Syndrome patient (47, XY, + 21) by standard Qiagen DNA Mini kit isolation procedure with final elution to 50 μΙ distilled water. The resulting DNA yield was carefully determined by densitometric triplicated quantification of 5 μΙ isolate on agarose electrophoresis and adjusted to a concentration of 100 ng / μΙ. Both DNAs were then pooled with 0, 5, 10, 15 and 20, 25% aberrant DNA in normal DNA. The amplification step was performed in triplicate:
135 μΙ voda μΙ 10x pufr μΙ HotStart DNA polymerázy 4 μ110 mM dNTPs 4 μΙ primer 12-21A (300 ng/μΙ) μΙ primer 12-21B (300 ng/μΙ) a po 7x bylo pipetováno po 25 μΙ a k tomuto roztoku přidáno buď 5 μΙ z každého mixu DNA (tj. 0-25% aberantní DNA) a také 5 μΙ vody jako negativní kontroly.135 μΙ water μΙ 10x buffer μΙ HotStart DNA polymerase 4 μ110 mM dNTPs 4 μΙ primer 12-21A (300 ng / μΙ) μΙ primer 12-21B (300 ng / μΙ) and pipetted 7 times at 25 μΙ and added either 5 μΙ of each DNA mix (ie 0-25% aberrant DNA) as well as 5 μΙ of water as a negative control.
Provedení PCR sledovalo teglotní a časoyý profil:The PCR performed the teglot and timing profile:
(94°C/15 min)1x - (94°C/12yf- 53°C/12yf- 72°C/12yt)40x.(94 ° C / 15 min) 1x - (94 ° C / 12yf- 53 ° C / 12yf- 72 ° C / 12y) 40x.
0,5 μΙ z každého výsledného amplifikátu bylo testováno na automatickém sekvenátoru ABI Prism 310 a zaznamenány výšky a plochy píku. Přesně byly identifikovány všechny smíšené vzorky a to detekcí adjustovaných píků v poměru 1,00 pro 0% (aktuální naměřený poměr byl 1,07, ale tato hodnota byla vzata j^ko základní poměrová a definována jako 1,00); 1,027 pro 5%; 1,050 pro 10%; 1,073 pro 15%; 1,098 pro 20% a 1,125 pro 25% poměr DNA.0.5 μΙ of each resulting amplitude was tested on an ABI Prism 310 automatic sequencer and peak heights and areas were recorded. All mixed samples were accurately identified by detecting adjusted peaks at a ratio of 1.00 for 0% (the actual measured ratio was 1.07, but this value was taken as the basic ratio and defined as 1.00); 1.027 for 5%; 1.050 for 10%; 1.073 for 15%; 1.098 for 20% and 1.125 for 25% DNA ratio.
Velkou výhodou postupu s použitím vynalezené kvantifikace při identifikaci počtu fetálníťí^X chromozómů v plazmatické DNA mateřského oběhu je kromě vysoké přesnosti a jednoduchosti i to, že k testu není třeba otcovského vzorku a tedy žádných předcházejících vyšetření. Tím je otevřena cesta k automatizaci a přenesení testu do ambulantních podmínek.The great advantage of the inventive quantification procedure for identifying the number of fetal? X chromosomes in the plasma DNA of the maternal circulation is that, in addition to the high accuracy and simplicity, the test does not require a paternal sample and therefore no prior examination. This opens the way to automation and transfer of the test to outpatient conditions.
Reference:Reference:
(1) Saiki R.K. et al. Science 230: 1350 (1985) (2) Notomi T. et al. Nucleic Acids Research 28: e63 (2000) (3) WalkerG.T. etal. Nucleic Acids Research 20: 1691 (1992) (4) Guatelli J.C. et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990) (5) Erice A. et al. J. Clin. Microbiol. 38: 2837 (2000) (6) Lyamichev V. et al. Nátuře Biotechnology 17: 292 (1999) (7) Lee H.H. Biologicals 24: 197-9 (1996) (8) Lizardi P.M. et al. Nátuře Genetics 19: 225 (1998) (9) Randěn I., et al. Vox Sang. 85: 300-6 (2003) (10) Caskey-C.T. US patent č. 5364759 (1994) (11) Mansfield J. US Patent č. 5994057 (1999) (12) Han J. US Patent č. 5888740 (2001) (13) Žďárský E., Patent České republiky č. 293497 (2004) (14) Robledo R. et al. Genomics 82: 580-2 (2003) (15) Tse C. et al. Ann Biol Clin (Paris) 61: 279-93 (2003) (16) Dhallan R. etal. JAMA. 291: 1114-9 (2004)(1) Saiki R.K. et al. Science 230: 1350 (1985). (2) Notomi T. et al. Nucleic Acids Research 28: e63 (2000) (3) by Walker G.T. etal. Nucleic Acids Research 20: 1691 (1992) (4). Guatelli J.C. et al. Why. Nati. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990). (5) Erice A. et al. J. Clin. Microbiol. 38: 2837 (2000). (6) Lyamichev V. et al. Nature Biotechnology 17: 292 (1999) (7) Lee H.H. Biologicals 24: 197-9 (1996) (8). Lizardi P.M. et al. Nature Genetics 19: 225 (1998) (9) Randen I., et al. Vox Sang. 85: 300-6 (2003). (10) Caskey-C.T. US Patent No. 5364759 (1994) (11) Mansfield J. US Patent No. 5994057 (1999) (12) Han J. US Patent No. 5888740 (2001) (13) Zdarsky E., Czech Republic Patent No. 293497 ( (14) Robledo R. et al. Genomics 82: 580-2 (2003). (15) Tse C. et al. Ann Biol Clin (Paris) 61: 279-93 (2003). (16) Dhallan R. et al. PIT. 291: 1114-9
Způsob průmyslového využití vynálezu:Method of industrial application of the invention:
Analýza trendů poptávky po kvantifikačních reakcích, zaměřených na nukleové kyseliny, má zřetelně dynamický a náběhový charakter. Přesné, jednoduché, ekonomické a pokud možno automatizované uspořádání kvantifikačních reakcí nukleových kyselin je stále častějším požadavkem jak experimentální, tak i praktické sféry - hlavně klinické.The analysis of trends in demand for nucleic acid quantification reactions has a distinctly dynamic and lead-in character. Accurate, simple, economical and, if possible, automated ordering of nucleic acid quantification reactions is an increasingly frequent requirement in both the experimental and practical spheres - especially the clinical one.
V experimentální sféře je spektrum požadavků velmi pestré, od základního po aplikovaný výzkum biologických, medicínských, potravinářských i zemědělských věd. Je-li vzat v úvahu dokument 6. rámcového projektu Evropské Unie o hlavních směrech směrování podpory vědy, je výzkum kvantitativní a kvalitativní analýzy nukleových kyselin vůdčí.In the experimental sphere, the spectrum of requirements is very varied, from basic to applied research in biological, medical, food and agricultural sciences. Taking into account the document of the 6th European Union Framework Project on Guidelines for the Orientation of Science Support, research into quantitative and qualitative analysis of nucleic acids is leading.
V praktické sféře je možné doložit rozsáhlé aplikace vynálezu při medicínském sledování koncentrace patogenních organizmů v biologickém vzorku - například virů v krvi, baktérií v moči a jiných tělních tekutinách. Jen v České republice je ročně provedeno asi 5000 testů viru hepatitidy C a B v krvi krevních dárců a z diagnostických příčin. Při dané citlivosti a specificitě detekce aneuploidií neinvazivním způsobem je možné očekávat plošné nasazení, což jen v České republice znamená 95 000 testů ročně. Při násobení faktorem 45x, postihující poměr populace České republiky a populace ve státech, v nichž lze předpokládat podobné ekonomické podmínky a tím i zdravotnickou praxi, je možný odhadovaný počet testů až 4 500 000 ročně. Tento předpoklad je nejnověji podpořen i nálezem Dhallana a spolupracovníků (též patentováno (16)), který umožní, aby námi vynalezená metodologie byla spolehlivě uplatněna u přesného určení fetálního karyotypu pro více než 95% těhotenství již před skončením I. trimestu.In practice, extensive applications of the invention can be illustrated in the medical monitoring of the concentration of pathogenic organisms in a biological sample - for example, viruses in blood, bacteria in urine, and other body fluids. In the Czech Republic alone, approximately 5000 tests of hepatitis C and B virus in blood donors and diagnostic causes are performed annually. Given the sensitivity and specificity of aneuploidy detection in a non-invasive way, it is possible to expect an area-wide deployment, which means 95,000 tests per year in the Czech Republic alone. When multiplied by a factor of 45, affecting the ratio of the population of the Czech Republic to the population in countries where similar economic conditions and hence medical practice can be expected, an estimated number of tests of up to 4,500,000 per year is possible. This assumption is most recently supported by the finding of Dhallan and co-workers (also patented (16)), which will allow the methodology we invented to be reliably applied to accurately determine fetal karyotype for more than 95% of pregnancies before the end of the first trimester.
Claims (6)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ20041105A CZ296587B6 (en) | 2004-11-09 | 2004-11-09 | Novel quantification method of nucleic acids |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ20041105A CZ296587B6 (en) | 2004-11-09 | 2004-11-09 | Novel quantification method of nucleic acids |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20041105A3 true CZ20041105A3 (en) | 2006-04-12 |
CZ296587B6 CZ296587B6 (en) | 2006-04-12 |
Family
ID=36972582
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20041105A CZ296587B6 (en) | 2004-11-09 | 2004-11-09 | Novel quantification method of nucleic acids |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ296587B6 (en) |
-
2004
- 2004-11-09 CZ CZ20041105A patent/CZ296587B6/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ296587B6 (en) | 2006-04-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4683922B2 (en) | Gene expression quantification method | |
EP2660331B1 (en) | Method for single cell genome analysis and kit therefor | |
US20050191636A1 (en) | Detection of STRP, such as fragile X syndrome | |
JP6302048B2 (en) | Noninvasive early detection of solid organ transplant rejection by quantitative analysis of mixtures by deep sequencing of HLA gene amplicons using next-generation systems | |
US20210123102A1 (en) | Single Nucleotide Polymorphism in HLA-B*15:02 and Use Thereof | |
CA2707296A1 (en) | Method for relative quantitation of chromosomal dna copy number in a single or few cells | |
EP2964780B1 (en) | Discrimination of blood type variants | |
EP2450443B1 (en) | Target sequence amplification method, polymorphism detection method, and reagents for use in the methods | |
EP2222872B1 (en) | Method of pooling samples for performing a bi0l0gical assay | |
EP1964929B1 (en) | Hla-b genotyping method and kit based on real-time pcr | |
US9994893B2 (en) | Compositions and methods for functional quality control for human blood-based gene expression products | |
Li et al. | Pyrosequencing of a short fragment of the amelogenin gene for gender identification | |
CZ20041105A3 (en) | Novel quantification method of nucleic acids | |
WO2010126356A1 (en) | Method of pooling samples for performing a biological assay | |
US20200377930A1 (en) | Methods and kits for determining the efficiency of plasma separation from whole blood | |
KR20170049768A (en) | Single nucleotide polymorphism markers for determining of skin color and melanism sensitivity and use thereof | |
US20130210012A1 (en) | Method for assessing breast cancer susceptibility | |
KR102511596B1 (en) | A single nucleotide polymorphism marker composition for diagnosing an adverse reactions with angiotensin converting enzyme inhibitor and a method using the same | |
RU2556808C2 (en) | METHOD FOR DETERMINING HUMAN GENOTYPE BY POLYMORPHOUS POSITION rs1613662 IN GP6 GENE CODING GLYCOPROTEIN VI | |
WO2022010917A1 (en) | Methods, compositions, and systems for detecting pnpla3 allelic variants | |
KR20210122017A (en) | Genetic polymorphic markers for determining type of skin pigmentation and use thereof | |
Suomalainen et al. | Quantitative analysis of DNA sequences by PCR and solid-phase minisequencing | |
Suomalainen et al. | Quantitative analysis of human DNA sequences by PCR and solid-phase minisequencing | |
US20110117547A1 (en) | Target dna detection method and target dna detection kit | |
JP2009089687A (en) | Method for discriminating gene polymorphism |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20041109 |